effet protecteur des bactéries du yaourt sur la muqueuse

Devant le Jury composé de :

Président : SAIDI Djamel Professeur, Université d’Oran

Examinateurs : KHEROUA Omar Professeur, Université d’Oran

: BENSOLTANE Ahmed Professeur, Université d’Oran

Rapporteur : CHEKROUN Abdallah Maître de conférences, Université d’Oran

Intitulé :

Effet protecteur des bactéries du yaourt sur la muqueuse

intestinale de souris BALB/c sensibilisées au lait de vache.

Université d’Oran Es senia Faculté des Sciences, Département de Biologie, Laboratoire de Physiologie de la Nutrition et de la Sécurité Alimentaire

جامعة وھران السانية كلية العلوم

قسم البيولوجياائيذالغ ية و ا�منذر فسيولوجيا التغمخب

MEMOIRE DE MAGISTER

Option : Physiologie de la Nutrition et Sécurité Alimentaire

Présenté par

Mademoiselle TBAHRITI Hadja Fatima

Soutenu le :

Je dédie ce travail à ceux et celles qui me sont cher(e) s : A mes parents qui veillent toujours sur mon bien-être ;

A mes sœurs et mes frères qui sont toujours présents pour moi ; A ma très chère amie Samira pour son soutien et ses

encouragements.

Remerciement Ce travail a été réalisé au laboratoire de Physiologie de la Nutrition et Sécurité Alimentaire, dont le mérite revient à toutes les personnes qui ont participé à sa réalisation et auxquelles d’ailleurs j’exprime ma profonde reconnaissance. La réussite de ce travail ne saurait être possible sans le grand apport de mon rapporteur Mr Abdellah CHEKROUN, Maître de conférence de physiologie à l’Université d’Oran. Votre efficacité, compétence et gentillesse ma guidées tout le long de ces années. Je vous remercie d'avoir participé à mon développement scientifique et de m'avoir donné tant de conseils judicieux qui m'ont aidé à mener à terme ce travail. Vous trouverez ici l'expression de mon admiration et de ma reconnaissance. A Mr Djamel SAIDI, Professeur de physiologie à l’Université d’Oran. Votre dynamisme, rigueur scientifique et vos qualités ont toujours suscités en nous la plus vive admiration. Vous nous faites l’honneur d’accepter de présider ce jury, nous vous en remercie et tenant à vous assurer de notre attachement respectueux. A Mr Omar KHEROUA, Professeur de physiologie à l’Université d’Oran. Vos qualités morales et intellectuelles, vos conseils précieux, vos orientations scientifiques, ainsi que votre optimisme affiché ont toujours soulevé notre respect. Veuillez trouver dans ce travail que vous avez accepté de juger le témoignage de notre profonde estime. A Mr Ahmed BENSOLTANE, Professeur de microbiologie à l’Université d’Oran. Recevez aujourd’hui le témoignage de notre reconnaissance et nos sincères remerciements d’avoir accepté d’examiner ce modeste travail. J’aimerai remercier énormément Melle Wafaa DIB et Melle Samia SALAH pour leur disponibilité, leur aide fournis et leur gentillesse. Je n’oublierai jamais vos conseils précieux, vos encouragements et soutien, je vous souhaite tout deux une bonne continuation. Je tiens à remercier chaleureusement toutes mes amies de ma promotion de Magister : Abir HADDI, Souad BOUDALI, Nacera LAHOUAL, Amina IBRAHIM et Malika GENDOUZ. Je vous exprime ma profonde sympathie, je n’oublierai jamais les moments de loisir et d’humeur agréables qu’on a partagé ensembles, ainsi que vos aides, conseils et encouragements. Je remercie par ailleurs les différents membres de l’équipe de chercheur du Laboratoire de Physiologie de la Nutrition et Sécurité Alimentaire : Melle Hanane KADDOURI, Mme Nabila MEHEDI, Mme Samia ADDOU, Mme Hanane BELARBI, Mr Fateh MEZMAZ, Mr Khaled NAMAN, Mr Kamel Eddine EL MECHERFI. Je n’oublierai évidemment pas de remercier ma chère amie qui ma accompagné tout au long de ces années Melle Hassina RABEHI, tous les mots n’exprime pas ma profonde reconnaissance, je te souhaite une bonne continuation.

J'adresse mes derniers mots à mes parents, qui m'ont soutenu tout le long de mes études et qui m'ont toujours encouragé à aller jusqu'au bout de mes rêves. Je vous serai éternellement reconnaissante pour votre soutien, votre confiance et votre fierté. Je remercie aussi mes sœurs, mes frères, mes nièces et neveux pour leur soutien, et leur encouragement. J'ai la chance de vous avoir tous, je vous aime tant. Je remercie tout mes ami(e)s et les personnes qui ont participé de prêt ou de loin à la réalisation de ce mémoire de magister.

Résumé Lors de ces dernières décennies, un grand intérêt a été porté aux bactéries lactiques probiotiques ayant des effets bénéfiques sur la santé. Le but de notre travail est de fermenter le lait de vache avec les bactéries du yaourt prises en association et individuellement ; ces laits fermentés vont servir à la colonisation du tube digestif de souris BALB/c prises comme modèle d’étude de l’allergie, pour évaluer leurs effets protecteurs sur la muqueuse intestinale de ces dernières, quand elles sont sensibilisées par le lait entier de vache. La caractérisation microbiologique, biochimique, immunologique des laits fermentés préparés nous permettra de qualifier leurs propriétés hypoallergiques et de savoir s’ils peuvent constituer une alternative chez les enfants allergiques au lait de vache. Le lait de vache fraîchement collecté est écrémé et stérilisé à 105°C pendant 10 min puis fermenté à 45°C jusqu’à l’obtention d’un caillé par l’action des bactéries prises individuellement ou en association. Un lait LF1 (yaourt) fermenté avec la culture mixte contenant 17.107ufc/ml de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb) et 9.107ufc/ml de Streptococcus salivarius subsp. thermophilus (St), les laits LF2 et LF3 fermenté avec des cultures pures contenant respectivement 7.107ufc/ml de (Lb) pour LF2 et 4.107ufc/ml de (St) pour LF3. Après 480min de fermentation, la cinétique de croissance bactérienne la plus élevée est obtenue au niveau du lait fermenté LF1, révélant une augmentation hautement significative (p≤0.001), la concentration moyenne est de 3.108ufc/ml pour (Lb) et 9.108ufc/ml pour (St), ce qui explique la présence d’une synergie entre les 2 espèces bactériennes. Le taux d’acide lactique produit est significativement élevé (p≤0.001) dans LF1 (78.01±4.81°D) comparé à celui du lait stérile (20±0.04°D); cette activité se traduit par une baisse hautement significative de pH (p≤0.001) dont les valeurs sont de (4.66±0.13), (6.59±0.01) respectivement pour LF1 et LS. L’activité protéolytique (protéines totales, α-NH2) montre que c’est l’association (Lb+St) qui donne le meilleur profil protéique (140.44±0.53µg/mg, 18.52± 0.08µM/mg) (p≤0.01) par rapport à LS (419.72±1.85µg/mg, 9.53±0.36µM/mg) et aux autres laits fermentés. L’électrophorèse des protéines des 3 laits préparés a montré des bandes claires identifiables aux protéines natives du lait : concluant une protéolyse partielle. Après une colonisation intestinale des souris avec LF1, LF2 et LF3 suivie d’une sensibilisation au lait entier de vache, un dénombrement bactérien est effectué au niveau de la muqueuse et des fèces fraiches. Nos résultats révèlent que la meilleure survie des bactéries est observée chez les souris colonisées par la culture mixte constituée de 7.106ufc/g pour (Lb) et 12.106ufc/g pour (St) dans la muqueuse et 107ufc/g pour (Lb) et 3.107ufc/g pour (St) dans les fèces par rapport aux souris colonisées par LF2 et LF3. Les titres en IgG sériques anti β-Lg sont significativement diminués chez les souris colonisées avec LF1 (1/2400ème), par rapport au groupe témoin (1/46600ème) sensibilisé au lait de vache. Le test de provocation, in vitro, en chambre de Ussing révèle l’absence d’un choc anaphylactique en enregistrant des valeurs plus au moins stables de l’Isc, pour les protéines sensibilisantes testées (β-Lg, α-La et LF1) chez le groupe de souris colonisées par le yaourt (LF1) puis sensibilisé au lait de vache en comparaison avec le groupe témoin intubé avec une solution saline suivie d’une sensibilisation au lait de vache dont les résultats montrent une augmentation de l’Isc hautement significative (p≤0.001) pour les antigènes testés. L’étude histologique de la muqueuse intestinale montre que l’induction de la tolérance orale à la β-Lg est évidente chez les souris colonisées par LF1 (le yaourt) ; ceci est prouvé par des villosités intestinales longues (52.7±0.98µm) avec un aspect fin et une infiltration des lymphocytes intra-épithéliaux peu marquée, comparés au groupe témoin positif, qui présente une atrophie partielle des villosités avec un décollement du chorion et une infiltration dense des lymphocytes intra-épithéliaux. Ces résultats confirment que le yaourt prévient les allergies aux protéines la β-Lg, et l’α-La via l’induction de la tolérance orale, en exerçant un effet protecteur sur la muqueuse intestinale par la stimulation du système immunitaire. Mots clés : Yaourt, Tolérance orale, β-Lactoglobuline, Allergénicité, Lait de vache, souris BALB/c, chambre de Ussing, IgG sérique.

Abstract In recent decades, much interest has been focused on probiotic lactic acid bacteria with beneficial effects on health. The aim of our work is fermented cow's milk with yogurt bacteria taken in combination and individually, these fermented milks are used to the colonization of the gastrointestinal tract of the mouse BALB / c taken as a model for study of allergy, to assess their protective effects on the intestinal mucosa of the past, when they are aware of the whole milk. The microbiological characterization, biochemical, immunological fermented milk prepared we will describe their hypoallergenic properties and whether they can be an alternative for children allergic to cow's milk. Cow's milk freshly collected is skimmed, and sterilized at 105 ° C for 10 min and then fermented at 45 ° C until a curd by the action of bacteria taken individually or in combination. LF1 milk (yogurt), fermented with mixed culture containing 17.107ufc/ml Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb) and 9.107ufc/ml Streptococcus salivarius subsp. thermophilus (St), the LF2 and LF3 milk fermented with pure cultures containing respectively 7.107ufc/ml of (Lb) for LF2 and 4.107ufc/ml of (St) for LF3 After 480min of fermentation kinetics of bacterial growth is the highest level obtained from milk fermented LF1, revealing a highly significant increase (p≤0.001), the average concentration is 3.108ufc/ml for (Lb) and 9.108ufc/ml (St), which explains the presence of synergy between the two bacterial species. The lactic acid produced is significantly higher (p≤0.001) in LF1 (78.01±4.81°D) compared with sterile milk (20 ±0.04°D), this activity results in a highly significant decrease in pH (p≤0.001) with values of (4.66±0.13) (6.59±0.01) respectively for LF1 and LS. The proteolytic activity (total protein, α-NH 2) shows that the combination (Lb + St) which gives the best protein profile (140.44±0.53µg/mg, 18.52±0.08µM/mg) (p≤0.01) compared to LS (219.72±1.85µg/mg, 9.53±0.36µM/mg) and other fermented milks. Protein electrophoresis of the 3 milks prepared showed clear bands identifiable with native milk proteins: finding a partial proteolysis. After intestinal colonization of mice with LF1, LF2 and LF3 followed by sensitization to whole milk, a bacterial count is conducted at the mucosa and fresh faeces. Our results show that the improved survival of bacteria was observed in mice colonized by the mixed culture consisting of 7.106ufc/g (Lb) and 12.106ufc/g (St) in the mucosa and 107ufc/g (Lb) and 3.107ufc/g (St) in feces compared to mice colonized by LF2 and LF3. Titles in serum IgG anti-β-Lg were significantly reduced in mice colonized with LF1 (1/2400ème) compared to the control group (1/46600ème) sensitized to cow's milk. The provocation test, in vitro, in Ussing chamber revealed the absence of anaphylactic shock in recording values more or less stable in Isc for sensitizing proteins tested (β-Lg, α-La and LF1) among the group of mice colonized with yogurt (LF1) and then sensitized to cow's milk compared with the control group intubated with saline followed by sensitization to cow's milk and the results show an increase in Isc highly significant (p≤0.001) for the antigens tested. The histological study of the intestinal mucosa showed that the induction of oral tolerance to β-Lg is evident in mice colonized by LF1 (yogurt) and this is proved by long intestinal villi (52.7±0.98µm) with look fine and infiltration of intraepithelial lymphocytes were not strong, compared to positive control group, which has a partial atrophy of the villi with a detachment of the chorion and a dense infiltration of intraepithelial lymphocytes. These results confirm that yogurt prevents allergies to the protein β-Lg, and α-La via the induction of oral tolerance, exerting a protective effect on the intestinal mucosa by stimulating the immune system. Keywords: Yoghurt, oral tolerance, β-lactoglobulin, Allergenicity, milk cow, mouse BALB / c, Ussing chamber, IgG serum.

ملخص

الھدف من عملنا ھو . ةمفيدة على الصحال آثارهمع بروبيتيك اللبنيحمض المن ا�ھتمام انصب على بكتيريا الكثير BALB/cالفأر لتقييم أثارھا الوقائية على أمعاء اتخمير حليب البقر مع بكتيريا الزبادي المتخذة جمعا و إنفراد ي

الكيميائية الحيوية و المناعية للحليب المخمر تمكننا ، الخصائص الميكروبيولوجية. ج لدراسة الحساسيةذالمتخذة كنمو .كان ھدا ا;خير بدي: لحليب البقر ل9طفال دوى الحساسية إنمن معرفة

درجة 45لك يخمر في ذدقائق وبعد 10درجة مئوية لمدة 105معقم في درجة حرارة ، حليب البقر منزوع الدسم/ mlو على ) bL( bulgaricus .Lمن ufc/ml 717.10يحتوى على ) الزبادي( 1LF حليب. حرارة حتى يخثر

cfu 79.10 منsluthermophil .S )tS( , 2الحليبLF يحتوى علىml/cfu 77.10 منbulgaricus .L )Lb (3 و الحليبLF يحتوى علىml /ufc 74.10 منthermophillus.S )St .( دقيقة من التخمر 480بعد

) ml /cfu 83.10 )bL(, ml /cfu 89.10 )Stبمعدل LF 1أعلى مستوى من النمو البكثيرى لوحظ في بالمقارنة) Dº 4.81 ± 01.78 ( المنتج تقدر بمعدل كمية الحمض اللبني .تآزر بين البكتيريتينمما يفسر وجود مقارنة مع ) 4.66 ±0.13 ( درجة الحموضة إلى انخفاض إلىمما يؤذي ) Dº 0.04 ±20( مع الحليب المعقم

.) 6.59 ±0.01( الحليب المعقمنقول أن الحليب مما يمكننا بأن , )mg/gµ 0.53 ±140.44( نشاط تفكك البروتينات في الحليب المخمر يقدر ب

..لھو أعلى درجة تحلل و تفكك بروتيني) الزباذي(المخمر تم حساب , ھذه ا;خيرة بحليب البقر وتحسيس, 1LF2, , LF3LF المعوية للفئران بالحليب المخمر ا�ستعماربعد

لوحظ عند الفئران للبكتيريانتائجنا تبين أن أفضل بقاء . الموجود بالغشاء المخاطي و البراز الطازج البكتيريامعدل في ) St(من g/cfu 612.10 و) bL( من g /ufc 67.10بمعدل 1LF المستعمرة بالزبادي

. في البراز الطازج) tS(من g /ufc 73.10 و) bL( من g/ufc 710الغشاء المخاطي و على بصفة جد ملحوظة عند الفئران Lg -β الحليبمعدل مستويات الغلوبولين المناعي المضادة لبروتين أنخفض

مقارنة مع مجموعة الفئران المراقبة) 1FL )éme 1/2400 المستعمرة بالحليب المخمر الزبادي )éme 1/46600 (المحسسة لحليب البقر.

المحسسة للبروتينات صدمة فرط الحساسية غيابتبين (chambre de Ussing) ا�ستفزاز في المختبر اختبارالمحسسة لحليب البقر مقارنة بالمجموعة المراقبة و 1LF المختبرة عند مجموعة الفئران المستعمرة بالزبادي

مستضداتللالكھربائي س كبيرا لتيار الماالمحسسة لحليب البقر أين لوحظ ارتفاعا الشاربة للمحلول الملحي و . المختبرة

واضح gL-βلبروتين الحليب الحث على التسامح عن طريق الفمتبين أن ا;معاءالدراسة النسيجية لمخاطية لمفاوي غير الھيكل الناعم مع ارتشاح ذاتبالزبادي ھذا ما تثبته الزوائد المعوية الطويلة المغذاتعند الفئران

و ارتشاح لمفاوي المشيمة�حظنا ضمور زغبي، مفرزة من أينللمراقبة ةا�يجابيملحوظ، بالمقارنة مع المجموعة ..ركبي

نتائجنا تؤكد أن الزبادي يحول دون حساسية لبروتينات حليب البقر عن طريق الحث على التسامح عن طريق الفم .مما له تأثير وقائي على مخاطية ا;معاء عن طريق تنشيط الجھاز المناعي

،c/BALB لكتوجلوبيلين، الحساسية، حليب البقر، فئران βالزبادي، التسامح عن طريق الفم، : الكلمات المفتاحية .chambre de Ussing، .مصل الغلوبين المناعي

Sommaire

Introduction

1

Rappels bibliographiques 3

1. Ecosystème gastro-intestinal : composition et évolution 3

1.1. Description générale 3

1.2. La microflore intestinale 3

1.3. Les facteurs majeurs influençant la microflore intestinale 5

2. Système immunitaire de l’hôte 7

2.1. Description générale 7

2.2. Le système immunitaire de la muqueuse intestinale 9

3. Tolérance orale 11

3.1. Définition et sites d’induction de la tolérance orale 11

3.2. Mécanismes cellulaires de la tolérance orale 11

3.2.1. La délétion clonale 11

3.2.2. L’anergie clonale 11

3.2.3. L’immunosuppression active 12

3.3. Interactions entre les différents mécanismes 13

3.4. Facteurs influençant la tolérance orale 14

4. Les allergies alimentaires 14

4.1. Définition et mécanismes des allergies alimentaires 14

4.2. La β-Lactoglobuline bovine 15

4.3. Stratégies de prévention des allergies aux protéines laitières 18

4.3.1. Allaitement et régime d’éviction des protéines laitières 18

4.3.2. Hydrolyse des allergènes par des enzymes digestives 18

4.3.3. Hydrolyse des allergènes par des enzymes bactériennes 20

5. Les probiotiques 21

5.1. Composition, évolution et rôle de la microflore intestinale résidente 21

5.2. Définition d’un probiotique 22

5.3. Les microorganismes utilisés comme probiotiques 24

5.3.1. Les bactéries lactiques et leur action probiotique 24

5.3.1.1. Les lactobacilles 25

5.3.1.2. Les streptocoques thermophiles 28

5.4. Mécanisme d’action des probiotiques

28

Sommaire

5.4.1. L’inhibition des bactéries indésirables 29

5.4.2. Neutralisation des produits toxiques 29

5.4.3. Amélioration de la digestibilité de la ration alimentaire 30

5.4.4. Effets sur la muqueuse intestinale 30

5.4.5. Influence sur la réponse immunitaire 31

5.4.5.1. Effets sur les cellules immunitaires impliquées dans les mécanismes de défense non spécifique

32

5.4.5.2. Effets sur les cellules impliquées dans les mécanismes de défense immunitaires spécifique

32

5.4.6. Effets sur le système immunitaire sécrétoire 32

5.4.7. Traitement et prévention des allergies 33

5.4.8. Stimulation de l’induction de la tolérance orale 34

5.5 Critères de sélection des souches probiotiques 35

Matériels et Méthodes 36

1. Provenance des bactéries 36

1.1. Préparation des bactéries 36

1.2. Revivification des souches 36

2. Préparation du lait 36

3. Caractérisation morphologique des bactéries 38

3.1. Identification morphologique 38

3.2. Coloration de Gram 38

3.3. Mobilité ou non des bactéries 38

3.4. Recherche de l’enzyme catalase 38

4. Préparation des ferments 38

4.1. Préparation de l’inoculum 38

4.2. Préparation des ferments 39

5. Protocole de préparation des différents laits fermentés 39

6. Etude de quelques caractères physicochimiques de la culture mixte et des bactéries prises individuellement, au cours de la fermentation du lait à 45°C

39

6.1. Profil fermentaire des bactéries 39

6.1.1. Mesure de la cinétique de variation du pH 39

6.1.2. Mesure de la cinétique de production d’acide 39

6.2. Cinétique de croissance des bactéries 40

7. Caractères biochimiques des laits fermentés 40

Sommaire

7.1. Préparation des échantillons 40

7.1.1. Constitution des échantillons de laits fermentés 40

7.2. Mesure de l’activité protéolytique des bactéries 41

7.2.1. Dosage des protéines totales 41

7.2.2. Dosage des fonctions α-NH2 libérées 43

7.2.3. Détection, par électrophorèse, des protéines résiduelles natives dans les laits fermentés

43

8. Etude de l’effet protecteur des bactéries du yaourt sur la muqueuse intestinale de souris BALB/c sensibilisées au lait de vache

48

8.1. Animaux et Nursing 48

8.2. Constitution des lots 48

8.3. Prélèvement des échantillons sanguins 49

8.4. Dénombrement des bactéries testées, dans les différentes parties de l’intestin et dans les fèces fraîches des animaux

50

9. Evaluation du degré de sensibilisation des animaux 50

9.1. Titrage des anticorps IgG sériques anti β-Lg 50

10. Etude histologique de l’intestin de souris colonisées par les bactéries du yaourt apportées par les laits fermentés puis sensibilisées au lait entier de vache

54

10.1. La fixation 54

10.2. Inclusion et coupe des tissus 54

10.2.1. Les procédés d’inclusion 54

10.2.2 Inclusion à la paraffine 54

10.2.3. Déshydratation 54

10.2.4. Imprégnation par la paraffine 55

10.3. Microtomisation et étalement des coupes 56

10.4. Coloration 56

10.4.1. Déparaffinage 56

10.4.2. Réhydratation 56

10.4.3. Technique de coloration 56

10.4.3.1. Coloration nucléaire 56

10.4.3.2. Coloration topographique générale 57

10.5. Mesure des villosités

58

10.5.1. Principe de la mesure 58

Sommaire

10.5.2. Calcul 58

10.6. Dénombrement des lymphocytes intra-épithéliaux 60

11. Etude, in vitro, de l’allergénicité résiduelle de la β-Lg et de l’α-La sur le muqueuse intestinale de souris colonisées avec les bactéries du yaourt puis sensibilisées au lait de vache

60

11.1. Etude, in vitro, en chambre de Ussing 60

11.1.1. Principe de la chambre de Ussing 60

12.1.1. Montage des fragments de jéjunum de souris en chambre de Ussing 61

11.1.2.1. Préparation de l’animal 61

12.2. Etude de l’effet de la β-Lg, de l’α-La et du lait fermenté (yaourt) sur les paramètres électrophysiologiques du jéjunum des souris sensibilisées au lait de vache

62

11.3. Expression des résultats 64

12. Analyse statistique 64

Résultats 65

1. Etude microbiologique 65

1.1. Identification des souches bactériennes 65

1.1.1. Observation macroscopique 65

1.1.2. Observation microscopique 65

1.1.3. Test de la catalase 65

1.2. Cinétique de croissance bactérienne 67

1.3. Evaluation de la colonisation de l’intestin des souris par les bactéries contenues dans les laits fermentés LF1, LF2 et LF3

70

2. Etude biochimique des laits fermentés 76

2.1. Cinétique d’acidification au cours de la fermentation 76

2.1.1. Mesure du pH 76

2.1.2. Mesure de l’acidité titrable 76

2.2. Mesure de l’activité protéolytique des bactéries au cours de la fermentation du lait de vache

81

2.2.1. Teneur en protéines totales des laits fermentés par les bactéries prises individuellement et en association

81

2.2.2. Fonctions α-NH2 libérées dans les laits LF1, LF2 et LF3 au cours de la

fermentation

81

2.3. Electrophorèse des protéines du lait stérile et des laits fermentés 84

3. Etude immunologique 86

Sommaire

3.1. Titrage des anticorps sériques IgG anti β-Lg 86

3.2. Etude, in vitro, de l’allergénicité résiduelle de la β-Lg et de l’α-La sur les muqueuses de souris colonisées par les bactéries du yaourt puis sensibilisées au lait de vache

89

3.2.1. Effet de la β-Lg, de l’α-La et du LF1 sur l’Isc 89

3.2.2. Effet de la β-Lg, de l’α-La et du LF1 sur la DDP 90

3.2.3. Effet de la β-Lg, de l’α-La et du LF1 sur la conductance (G) 90

3.2.4. Etude comparative des paramètres physiologiques mesurés, exprimés par les trois laits fermentés LF1, LF2 et LF3

94

3.2.4.1. Effet de LF1, LF2 et LF3 sur l’Isc 94

3.2.4.2. Effet de LF1, LF2 et LF3 sur la DDP 94

3.2.4.3. Effet de LF1, LF2 et LF3 sur la conductance (G) 94

3.2.5. Effet du glucose 98

3.3. Etude histologique de l’intestin des souris colonisées avec les laits fermentés comparée à celle des souris sensibilisées au lait de vache

100

3.3.1. Effet de la colonisation du tube digestif par les bactéries du yaourt sur la structure de la muqueuse intestinale des souris sacrifiées au 18ème jour

100

3.3.2. Effet de la sensibilisation par le lait de vache sur la structure de la muqueuse intestinale des souris sacrifiées au 50ème jour

100

3.3.3. Evaluation de la hauteur des villosités intestinales des souris 107

3.3.4. Dénombrement des lymphocytes intra-épithéliaux 111

3.3.4.1. Dénombrement des lymphocytes intra-épithéliaux chez les souris sacrifiées au 18ème jour

111

3.3.4.2. Dénombrement des lymphocytes intra-épithéliaux chez les souris sacrifiées au 50ème jour

111

Discussion 113

Conclusion 121

Références bibliographiques 122

Liste des tableaux

Tableau 1 : Principaux facteurs influençant la composition et la fonction de la microflore intestinale

6

Tableau 2 : Utilisations commerciales et effets bénéfiques de quelques souches de Lactobacillus probiotiques

27

Tableau 3 : Principaux critères de sélection des probiotiques 35

Tableau 4 : Composition du milieu de culture MRS (Man Regosa Scharpe) spécifique pour la culture de Lactobacillus bulgaricus

37

Tableau 5 : Composition du milieu de culture M17 spécifique pour la culture de Streptococcus thermophilus

37

Tableau 6 : Composition des solutions utilisées pour le dosage des protéines totales selon la technique de Lowry et al. 1951.

42

Tableau 7 : Composition des gels de polyacrylamide-sodium dodecylsulfate 45

Tableau 8 : Composition de la solution de tampon. 46

Tableau 9 : Composition de la solution de migration 46

Tableau 10 : Poids moléculaire des protéines de références 47

Tableau 11 : Composition de la solution de coloration. 47

Tableau 12 : Composition de la solution de décoloration. 47

Tableau 13: Composition du tampon phosphate salin (1 M), pH=7,4 52

Tableau 14 : Composition des solutions tampons d’ELISA. 52

Tableau 15: Composition du tampon citrate pH=4. 53

Tableau 16: Composition de la solution de révélation d’orthophénylène diamine (OPD). 53

Tableau 17 : Composition du colorant à l’hématoxyline de Harris (Hould, 1984) 59

Tableau 18 : Composition de la solution de Ringer 63

Liste des figures

Figure 1 : Colonisation microbienne du tractus gastro-intestinal humain. 4

Figure 2 : Organisation fonctionnelle tripolaire des cellules T helper et de l’équilibre Th1/Th2

8

Figure 3 : Description schématique générale du système immunitaire associé à la muqueuse intestinal

10

Figure 4 : Localisation des séquences allergéniques sur la structure primaire du variant B de la β-Lactoglobuline bovine. Séquences allergéniques

17

Figure 5 : Aspect microscopique de Streptococcus salivarius subsp. thermophilus (St) après 48H d’incubation à 45°C sur milieu spécifique M17 et coloration de Gram (Gx40)

66

Figure 6 : Aspect microscopique de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb) après 48H d’incubation à 37°C sur milieu spécifique MRS et coloration de Gram (GX40

66

Figure 7 : Cinétique de croissance des bactéries du yaourt Streptococcus salivarius subsp. thermophilus et Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, exprimée en Log (ufc/ml), mises en association pour la fermentation du lait LF1 à 45°C.

68

Figure 8 : Cinétique de croissance bactérienne, exprimée en Log (ufc/ml), des bactéries testées individuellement Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Streptococcus salivarius subsp. thermophilus au cours de la fermentation des laits LF2 et LF3 à 45°C

69

Figure 9 a : Dénombrement bactérien de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb), exprimé en Log (ufc/g), dans la muqueuse et les fèces fraîches des souris colonisées avec le lait LF1

72

Figure 9 b : Dénombrement bactérien de Streptococcus salivarius subsp. thermophilus. (St) exprimé en Log (ufc/g) dans la muqueuse et les fèces fraîches des souris colonisées avec le lait LF1

73

Figure 10 : Dénombrement bactérien de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb), exprimé en Log (ufc/ml), au niveau de la muqueuse intestinale et les fèces fraîches des souris colonisées avec le lait LF2

74

Figure 11 : Dénombrement bactérien de Streptococcus salivarius subsp.thermophilus (St), exprimé en Log (ufc/ml), dans la muqueuse et les fèces fraîches des souris colonisées avec le lait LF3

75

Figure 12 : Cinétique de variation du pH par l’association des deux espèces bactériennes au cours de la fermentation du lait LF1 et LS à 45°C

77

Figure 13 : Cinétique de variation du pH par les deux espèces prises individuellement au cours de la fermentation des laits LF2, LF3 et LS à 45°C

78

Figure 14 : Cinétique de production d’acide lactique par l’association des deux espèces au cours de la fermentation du lait LF1 et LS à 45°C

79

Figure 15 : Cinétique de production d’acide au cours de la fermentation de laits LF2, LF3, LS par les deux espèces prises individuellement à 45°C

80

Figure 16 : Teneur en protéines totales (µg/mg) dans les laits LF1, LF2, LF3 et LS au cours de la fermentation à 45°C

82

Figure 17 : Fonctions α-NH2 libérées (µM/mg) au cours de la fermentation des laits LF1, LF2, LF3 et LS à 45°C

83

Liste des figures

Figure 18 : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide-Sodium dodécyl sulfate en gradient (5-12%) des protéines des laits fermentés LF1, LF2, LF3 et LS à 45°C

85

Figure 19 : Titre en anticorps IgG sériques anti β-Lg, mesurés chez les trois lots expérimentaux de souris colonisé chacun par un type de lait fermenté et chez les groupes témoins sacrifiés au 18ème jour

87

Figure 20 : Titre en anticorps IgG sériques anti β-Lg, mesurés chez les trois lots expérimentaux de souris colonisés chacun par en type de lait fermenté et sensibilisés avec le lait de vache et chez les groupes témoin sacrifiés au 50ème jour.

88

Figure 21 : Effet de la β-Lg, de l’α-La et de LF1 sur le courant de court circuit (Isc) mesuré en chambre de Ussing sur des fragments jéjunaux des souris sensibilisées au lait de vache par voie orale

91

Figure 22 : Effet de la β-Lg, de l’α-La et de LF1 sur la différence de potentiel (DDP) mesurée en chambre de Ussing sur des fragments jéjunaux des souris sensibilisées au lait de vache par voie orale

92

Figure 23 : Effet de la β-Lg, de l’α-La et de LF1 sur la conductance (G) mesuré en chambre de Ussing sur des fragments jéjunaux des souris sensibilisées au lait de vache par voie orale

93

Figure 24 : Effet de LF1 LF2 et LF3 sur le courant court circuit (Isc) mesuré en chambre de Ussing sur des fragments jéjunaux des souris sensibilisées au lait de vache par voie orale

95

Figure 25 : Effet de LF1 LF2 et LF3 sur la différence de potentiel (DDP) mesurée en chambre de Ussing sur des fragments jéjunaux des souris sensibilisées au lait de vache par voie orale

96

Figure 26 : Effet de LF1 LF2 et LF3 sur le conductance (G) mesurée en chambre de Ussing sur des fragments jéjunaux des souris sensibilisées au lait de vache par voie orale

97

Figure 27 : Effet du glucose sur l’évolution du courant de court circuit (Isc) mesuré en chambre de Ussing sur des fragments jéjunaux des souris sensibilisées par voie orale

99

Figure 28 : Observation microscopique (G x 10) d’un fragment de jéjunum coloré à l’hémalun-écosine d’une souris témoin négatif, sacrifiée au 18ème jour

102

Figure 29 : Observation microscopique (G x 10) d’un fragment de jéjunum coloré à l’hémalun-écosine d’une souris témoin négatif, sacrifiée au 50ème jour

102

Figure 30 : Observation microscopique (G x 10) d’un fragment de jéjunum coloré à l’hémalun-écosine d’une souris témoin positif intubée avec une solution saline, sacrifiée au 18ème jour

103

Figure 31 : Observation microscopique (G x 10) d’un fragment de jéjunum coloré à l’hémalun-écosine d’une souris témoin positif intubée avec une solution saline puis sensibilisée au lait entier de vache, sacrifiée au 50ème jour

103

Figure 32 : Observation microscopique (G x 10) d’un fragment de jéjunum coloré à l’hémalun-écosine d’une souris colonisée avec le lait LF1, sacrifiée au 18ème jour

104

Figure 33 : Observation microscopique (G x 10) d’un fragment de jéjunum coloré à l’hémalun-écosine d’une souris colonisée avec le lait LF1 puis sensibilisée au lait entier de vache, sacrifiée au 50ème jour

104


105

Liste des figures


105


106


106

Figure 38 : Evaluation de la hauteur villositaire des fragments jéjunaux des souris colonisées avec les laits fermentés comparée à celle des souris témoins négatif et positif, sacrifiées au 18ème jour

108

Figure 39 : Evaluation de la hauteur villositaire des fragments jéjunaux des souris colonisées avec les laits fermentés puis sensibilisées au lait de vache, comparée à celle des souris témoins négatif et positif, sacrifiées au 50ème jour

109

Abréviations

ADN : Acide Désoxyribose Nucléique. APLV : Allergie aux Protéines du Lait de Vache. α-La : alpha Lactalbumine. β-Lg : Béta Lactoglobuline. °C : degré Celsus. cm : centimètre. CMH : Complexe Majeur d’Histocompatibilité. CPA : Cellules Présentatrices d’Anticorps. DDP : Différence De Potentiel. °D : degré Dornic. ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay. GALT : Gut Associated Lymphoid Tissue. G : Conductance. Gx : Grossissement. H : Heure. H2O2 : Peroxyde d’Hydrogène. J : Jour. Ig : Immunoglobuline. IgA : Immunoglobuline de type A. IgE : Immunoglobuline de type E. IgG : Immunoglobuline de type G. IgM : Immunoglobuline de type M. IL : Interleukine. Isc : Courant à court circuit. INF-γ : Interféron gamma. IPLV : Intolérance aux Protéines du Lait de Vache. KDa : Kilo Dalton. Lb : Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. LF1 : Lait Fermenté par : Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus +

Streptococcus salivarius subsp. thermophilus. LF2 : Lait Fermenté par : Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. LF3 : Lait Fermenté par : Streptococcus salivarius subsp. thermophilus. LIE : Lymphocytes intra-épithéliaux. LS : Lait Stérile. LV : Lait de Vcahe mg : milligramme. µg : microgramme. µm : micromètre. µM : micromole. min : minutes MRS : Man Regosa Scharpe. ml : millilitre. mV : millivolt. NaOH : hydroxyde de sodium NK : Natural Killer (cellule tueuse). O2 : Oxygène. OPD : Orthophénylène diamine. PBS : Tampon Phosphate Salin. pH : potentiel d’Hydrogène.

Abréviations

PLV : Protéines du Lait de Vache. PM : Poids Moléculaire. SAB : Sérum Albumine Bovine. St : Streptococcus salivarius subsp. thermophilus. TGF-β : Transforming Growth Factor. Th : Cellule T helper. Th1 : Lymphocyte T helper 1. Th2 : Lymphocyte T helper 2. TLR : Toll Like Receptor. TNF-α : Tumor Necrosis Factor α. Tps : Temps. Tr : Cellule T régulatrice. Trs : Tours. UFC : Unité Formant Colonie. V : Volume.

INTRODUCTION

Introduction

1

Les populations occidentales ont connu au cours des deux derniers siècles des évolutions

sans précédent de leur mode de vie en général et de leur alimentation en particulier. Dans ce

paysage et suite à des conséquences négatives de ces évolutions sur la santé avec l’apparition des

maladies dites de civilisation telles que les allergies alimentaires et les intolérances aux

protéines du lait de vache.

La réflexion sur la prévention de la santé devient indissociable de la réflexion sur

l’alimentation. En effet, l’alimentation est susceptible de moduler diverses fonctions de

l’organisme et peut aussi contribuer à diminuer le risque de certaines pathologies.

Ces dernières années plusieurs études ont été entreprises afin d’évaluer l’impact sur la

santé de certaines composantes de l’alimentation à caractère non nutritionnel tels que les

micronutriments, les probiotiques et les prébiotiques.

La définition des probiotiques a connu des évolutions au cours du temps, les probiotiques

sont généralement définis en tant que microorganismes vivants exerçant une action bénéfique sur

la santé de l’hôte qui les ingère en améliorant l’équilibre de la flore intestinale (Fuller, 1991).

Bien que les probiotiques représentent seulement une faible proportion de la masse microbienne

du système gastro-intestinal de l’hôte, ils semblent y jouer des rôles biologiques déterminants par

des mécanismes qui doivent être élucidés. Ils établissent ainsi des interactions avec la barrière

intestinale physique (interactions avec le mucus, action trophique sur la muqueuse, modulation

de la perméabilité paracellulaire) et fonctionnelle (immunomodulation locale et systémique)

(Boirivant & Strober, 2007).

D’une manière générale, les bactéries lactiques et les formules fermentées font parties de

la famille des probiotiques et sont considérés comme des agents protecteurs vis-à-vis des risques

d’apparitions de pathologies digestives. Parmi les effets les mieux documentés figurent l’effet

anti-diarrhéique dans le cadre d’une antibiothérapie (Surawicz et al., 1989 ; Gill, 2003), ou

encore l’amélioration des troubles intestinaux associés à l’intolérance au lactose (Pettoello et al.,

1989).

Récemment, des études expérimentales et cliniques ont montré une efficacité des

traitements par les probiotiques dans le cadre des colites expérimentales (Matsumoto et al.,

2001) et des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (Venturi et al., 1999 ; Gupta et al.,

2000).

Depuis la dernière guerre mondiale, le yaourt a connu un remarquable essor industriel et

commercial et il est devenu un lait fermenté très populaire dans divers pays. Les revues récentes

entièrement consacrées au yaourt et à la place qu'il occupe dans les revues plus générales traitant

des laits fermentés, témoignent bien de l'intérêt que suscite ce produit.

Introduction

2

Parmi les applications thérapeutiques récentes, attribuées aux laits fermentés en général et

au yaourt en particulier, qui pourraient être envisagées sont la maintenance de l’induction de la

tolérance orale aux aliments responsables de l’apparition des allergies alimentaires, les

traitements des diarrhées persistantes et du syndrome de l’intestin irritable (Boudraa et al.,

2001), dans les traitements des altérations de la barrière intestinale et de la réponse immunitaire

ainsi lors d’un déséquilibre de la flore intestinale (Mick Bailey, 2009).

Dans ce contexte, il semble évident qu’un effort considérable doit être fourni pour la

compréhension et la détermination des mécanismes d’action impliqués dans les effets exercés

par le yaourt à l’aide de modèle préclinique approprié, même si la transposition des résultats à

l'homme reste difficile, en particulier à cause de la spécificité de l'écologie microbienne de

chaque espèce. De plus, les évaluations des effets exercés par le yaourt par des études, in vitro et

in vivo, pourrait constituer une approche plus rationnelle dans la sélection de ses agents

microbiens afin de préjuger de sa potentialité thérapeutique.

Le présent travail vise à étudier le yaourt en tant que lait fermenté et évaluer le taux de

réduction de l’antigénicité de ses protéines quand les ferments sont pris en association ou

individuellement pour fermenté le lait de vache.

Voir si les bactéries du yaourt résistent au stress de l’acidité gastrique et aux sels biliaires ?

Evaluer la surie des ferments du yaourt tout au long du tube digestif et leur implantation sur les

muqueuses intestinales ?!

Mesurer l’intensité de l’induction et le maintien de la tolérance orale aux protéines du lait de

vache chez des souris conventionnelles de race BALB/c, in vivo quand elles sont colonisées par

les bactéries du yaourt puis sensibilisées par le lait de vache par:

i) Evaluation du degré d’allergénicité, après colonisation de l’intestin par les bactéries

testées et une sensibilisation au lait de vache, en mesurant la production des IgG sériques

anti β-Lg et une étude histologique de l’épithélium intestinal;

ii) Evaluer l’allergénicité des protéines résiduelles du yaourt grâce au test de

provocation, in vitro, en chambre de Ussing sur la muqueuse intestinale des souris

colonisées par les bactéries du yaourt puis sensibilisées au lait entier de vache.

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES

Rappels bibliographiques

3

1. Ecosystème gastro-intestinal : composition et évolution

1.1. Description générale

Le tractus gastro-intestinal est un écosystème complexe et ouvert aux microorganismes

exogènes. De par sa surface totale (muqueuse) estimée à 200-300m2, il représente la plus grande

surface du corps en contact avec l’environnement (Holzapfel et al., 1998).

L’écosystème gastro-intestinal est généré par une alliance stable entre l’épithélium

gastro-intestinal, le système immunitaire et une importante flore microbienne. Ces trois

composants sont continuellement liés entre eux et évoluent ensemble en assurant une fonction et

une activité normales de l’écosystème. Si l’un des trois composants de l’écosystème est

défaillant, l’alliance est altérée et par conséquent diverses pathologies s’y installent (McCracken

& Lorenz, 2001).

Une des fonctions principales de la muqueuse intestinale est la formation d’une barrière

physique séparant le milieu extérieur (lumière intestinale) du milieu intérieur (compartiment

systémique). La muqueuse intestinale est en contact permanent avec la microflore intestinale

résidente et des quantités massives d’antigènes d’origine alimentaire (plus d’une tonne

d’aliments par année pour un adulte). Pour préserver l’homéostasie, la muqueuse doit développer

des stratégies de défense afin d’empêcher les antigènes intestinaux de pénétrer dans le

compartiment systémique. Cette protection est assurée par des mécanismes de défenses non

spécifiques, tels que des facteurs physiques (péristaltisme) et chimiques (métabolites anti-

microbiens, acidité stomacale), et par des mécanismes de défenses spécifiques avec, entre autres,

la production d’anticorps sécrétoires et l’activation du système immunitaire associé à la

muqueuse (Silbernagl & Despopoulos, 1992; Salminen et al., 1998).

1.2. La microflore intestinale

Selon la définition de Isolauri et al. (2002), la flore intestinale normale est une collection

complexe et en équilibre de microorganismes qui habitent normalement le tractus gastro-

intestinal et remplissant un rôle dans la nutrition, la physiologie et le contrôle du système

immunitaire de l’hôte. Après une colonisation complète, la microflore intestinale est considérée

comme un organe acquis après la naissance. Il est constitué d’une grande diversité d’espèces

microbiennes assurant différentes fonctions pour l’hôte. La microflore du tractus gastro-intestinal

a été estimée à près de 1013-1014 cellules microbiennes représentant 400 à 500 espèces et sous

espèces. Cette microflore représente environ 10 fois le nombre total de cellules du corps humain

(Moore & Holdeman, 1974; Bjorksten, 2004). La figure1 montre la colonisation bactérienne

dans les différents compartiments constituant le tractus gastro-intestinal de l’homme.


4

Figure 1 : Colonisation microbienne du tractus gastro-intestinal humain.

Adapté et modifié par Ouwehand & Vesterlund (2003).

La prévalence des bactéries dans le tractus gastro-intestinal dépend des conditions

régnant dans le compartiment du tractus. Deux catégories de bactéries ont été identifiées : les

bactéries autochtones ou indigènes se trouvant dans des niches particulières, et les bactéries

allochtones ou transitoires rencontrées dans d’autres habitats du tractus. La majorité des bactéries

Estomac et Duodénum (101 – 103ufc/ml)

Lactobacilles Streptocoques

Levures

Jéjunum et Iléon (104 – 108ufc/ml)

Lactobacilles Bacteroides Entérobactéries Bifidobactéries

Streptocoques Fusobactéries

Côlon (1010 – 1012ufc/g) Bacteroides Clostridiae Pseudomonas Bifidobactéries Veillonella Levures Streptocoques Lactobacilles Protozoaires Fusobactéries Proteus Entérobactéries Staphylocoques


5

pathogènes sont allochtones et vivent normalement en harmonie avec l’hôte, excepté lorsque

l’équilibre du système est rompu (Hao & Lee, 2004).

1.3. Les facteurs majeurs influençant la microflore intestinale

La composition et les fonctions de la microflore du tractus gastro-intestinal sont

influencées par divers facteurs liés au changement des conditions physiologiques de l’hôte (âge,

état de santé,...), de la composition du régime alimentaire et des circonstances environnementales

(contamination par les pathogènes, antibiothérapie, chimiothérapie, climat, stress, hygiène...)

(Mitsuoka, 1989; Hopkins et al., 2002).

Selon, Holzapfel et al. (1998), les facteurs majeurs influençant la microflore gastro-

intestinale sont résumés dans le tableau1. Ces divers facteurs peuvent perturber l’équilibre de

l’écosystème intestinal en favorisant des espèces particulières par rapport à d’autres. Dans

certains cas, ce déséquilibre peut être très favorable à la prolifération de microorganismes

opportunistes pathogènes pouvant compromettre la santé et le bien-être de l’hôte. Il serait donc

impératif de rechercher des solutions alternatives permettant la restauration de l’équilibre de la

microflore intestinale de l’hôte. L’utilisation des probiotiques et/ou des prébiotiques

(préparations microbiennes ou à base de certaines substances) s’est avérée une alternative

prometteuse.


6

Facteurs médiés par l’hôte Facteurs microbiens

- pH, secrétions (immunoglobulines, bile,

sels, enzymes),

- Motilité (péristaltisme),

- Physiologie (variable selon les

compartiments),

- Cellules détachées, mucines, exsudats

de tissus.

- Adhésion

- Motilité

- Flexibilité nutritionnelle

- Spores, capsules, enzymes,

composants antimicrobiens

- Temps de génération.

Interactions microbiennes

Synergie Antagonisme/ stimulation

- Coopération métabolique

- Excrétion de vitamines et facteurs

de croissance

- Changement de Eh (potentiel

d’oxydoréduction),

- pH et tension d’O2.

- Acides gras de courte chaîne, amines.

- Changement de Eh, pH et tension d’O2

- Composants antimicrobiens,

siderophores,

- Besoins nutritionnels, etc.

Régime alimentaire

Composition, fibres non digestibles, drogues, etc.

Tableau 1 : Principaux facteurs influençant la composition et la fonction de la microflore

intestinale. Adapté par Holzapfel et al. (1998).

2. Système immunitaire de l’hôte

2.1. Description générale

L’organisme humain ou animal met en œuvre divers mécanismes de défense pour se

protéger contre l’invasion massive des microorganismes ou matières étrangères. La nature de la

réponse de l’organisme dépend du type de particules étrangères (virus, bactéries, parasites,

champignons, pollen...) et de la voie d'entrée (peau, poumons, épithélium...).

Le système immunitaire répond par deux types de mécanismes : l’immunité non

spécifique (naturelle ou innée) et l’immunité spécifique (acquise ou adaptative) impliquant des

facteurs cellulaires et humoraux qui régulent la réponse à l’antigène. Les cellules du système


7

immunitaire inné permettent l’initiation de la réponse immunitaire de l’hôte et l’orientation du

système immunitaire adaptatif (Fritz et al., 2008).

Les cellules qui méditent l’immunité sont représentées par les lymphocytes et les cellules

accessoires tels que les macrophages, les cellules présentatrices d’antigène et dans certains cas

les cellules épithéliales. Les lymphocytes se trouvent dans le système lymphoïde constitué

d’organes primaires (thymus et moelle osseuse) et secondaires (rate, ganglions lymphoïdes...).

La rate produit une réponse contre les antigènes venant du sang, alors que, les nodules

lymphoïdes agissent contre les antigènes provenant de la lymphe (Fritz et al., 2008).

Les antigènes sont principalement absorbés via la peau ou les muqueuses. Le tissu

lymphoïde associé à la muqueuse (ex. : plaques de Peyer, tissu lymphoïde urogénital) répond aux

antigènes franchissant la barrière mucosale (Erickson & Hubbard, 2000).

La réponse du système immunitaire implique trois processus: la reconnaissance de la

particule étrangère, sa destruction et enfin la régulation de la réponse immunitaire à l’aide de

cellules spécialisées et médiateurs (cytokines).

La réponse immunitaire non spécifique est réalisée par les phagocytes (monocytes/

macrophages et les neutrophiles) qui reconnaissent, neutralisent et détruisent les

microorganismes pathogènes.

La réponse spécifique est produite par les lymphocytes B sécrétant des anticorps et les

lymphocytes T produisant des cytokines.


8

Figure2 : Organisation fonctionnelle tripolaire des cellules T helper et de l’équilibre Th1/Th2.

Adaptée et modifiée par Bot et al. (2004).


9

2.2. Le système immunitaire de la muqueuse intestinale

La muqueuse intestinale est le centre immunologique du corps ; elle héberge 80% de la

population des leucocytes du corps. Ces leucocytes sont indispensables pour l’homéostasie du

corps avec l’immense population bactérienne de l’intestin. La dérégulation de cette homéostasie

entraîne de nombreux désordres, notamment les maladies de l’inflammation de l’intestin comme

la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn (Schiffrin & Blum, 2002 ; Velazquez et al., 2004).

En effet, le maintien de l’intégrité de l’intestin et de sa fonction digestive dépend en

partie de la capacité du système immunitaire de sa muqueuse à faire la distinction entre les

antigènes offensifs et inoffensifs et de produire une réponse appropriée: une immunité active ou

une tolérance (Brandzaeg, 1996). Le système immunitaire de la muqueuse intestinale, à l’instar

des autres muqueuses, est doté de deux armes de défense contre les antigènes ou agents

pathogènes (Brandzaeg, 2002 ; Newberry & Lorenz, 2005 ; Mick Bailey, 2009):

a) l’exclusion de l’antigène à l’aide d’anticorps sécrétoires IgA et IgM en modulant ou en

inhibant la colonisation de l’hôte par les microorganismes et la pénétration d’antigènes solubles

dangereux;

b) les mécanismes de suppression de la réponse afin d’éviter une réaction locale ou périphérique

excessive (hypersensibilité) contre des substances inoffensives atteignant la surface de la

muqueuse. La suppression de la réponse induite par des antigènes alimentaires via l’intestin est

désignée sous le nom de ‘’tolérance orale’’.

Du point de vue anatomique, le système lymphoïde de l’intestin comprend les plaques de

Peyer ou des follicules isolés, la Lamina propria enrichie en cellules plasmatiques (cellules

dendritiques...), les ganglions lymphatiques mésentériques et les plaques cryptiques. Ces

compartiments constituent les sites d’induction et les effecteurs de l’immunité intestinale. La

figure 3 montre une description schématique générale du système immunitaire de l’intestin. Les

voies d’entrée de l’antigène au niveau intestinal sont: les cellules épithéliales intestinales

(jonctions) via l’interaction des cellules dendritiques de Lamina propria, des cellules épithéliales

et des cellules M (Spahn & Kucharzik, 2004).

Selon Monteleone et al. (2002), la distribution phénotypique des cellules T CD4 + et CD8

+

est similaire à celle des lymphocytes du sang périphérique, avec la prédominance des cellules

CD4+ et αβTcR+. Les lymphocytes B sont très abondants dans la muqueuse intestinale,

particulièrement dans les follicules isolés et les plaques de Peyer ; elles méditent la première

réponse immunitaire, de type humorale, protégeant l’organisme des pathogènes entériques ou


10

autres organismes infectieux. Une des propriétés remarquables des lymphocytes B est la

maturation des cellules B productrices d’IgM en cellules productrices des IgA.

Figure3 : Description schématique générale du système immunitaire associé à la muqueuse

intestinal. Tiré et traduit de Magalhaes et al. (2007).


11

3. Tolérance orale

3.1. Définition et sites d’induction de la tolérance orale

La tolérance orale est un état de non réponse immunologique face aux antigènes ingérés

de nature protéique. Toutefois, l’induction de la tolérance orale est un phénomène

immunologique dynamique dont les sites d’induction sont la Lamina propria et les plaques de

Peyer (tolérance locale), les ganglions et la rate (tolérance en périphérie).

Il a été observé que la réponse humorale et la réponse cellulaire (prolifération

lymphocytaire, hypersensibilité retardée) sont réprimées suite à l’ingestion d’un antigène

(Kaminogawa, 1996).La réponse cellulaire est cependant plus facilement réprimée que la

réponse humorale (Strobel & Fergusson, 1987) et la prolifération des lymphocytes Th1 et Th2 est

affectée (Mowat et al., 1996).

3.2. Mécanismes cellulaires de la tolérance orale

Plusieurs mécanismes cellulaires semblent être impliqués dans l’induction et le maintien

de la tolérance orale. Initialement, il était suggéré qu’une déviation immune des cellules Th1 vers

les cellules Th2 était à la base de la tolérance, mais des travaux récents ont démontré que ces

cellules ne sont pas les seules impliquées (Shi et al., 1999). Les mécanismes cellulaires

impliqués sont l’anergie clonale (Melamed & Friedman, 1993), la délétion clonale (Chen et al.,

1995) et l’immunosuppression active (Lundin et al., 1999).

3.2.1. La délétion clonale

La délétion clonale représente la mort par apoptose des lymphocytes T CD4+,

reconnaissant l’antigène administré oralement. Ce mécanisme est certainement à l’origine du

maintien de la tolérance au cours du temps (Bu et al., 2001). Les mécanismes de la mort par

apoptose sont encore mal connus, mais la délétion clonale semble dépendre de la voie du

Fas/FasL (Marth et al., 1999) en présence de TGF-β (Chen et al., 2001a). Les cellules Th1 et Th2

sont susceptibles à la mort par apoptose médiée par Fas, mais les cellules Th1 sont plus sensibles

(Zhang et al., 1997). Cette observation explique pourquoi la réponse spécifique de type Th1 est

plus facilement réprimée suite à l’administration orale d’ovalbumine chez la souris (Sudo et al.,

1997). Il semblerait également que la délétion en périphérie soit la mort des cellules ayant subi

l’anergie clonale.

3.2.2. L’anergie clonale

L’anergie clonale est un état de non réponse lymphocytaire caractérisé par une absence de

prolifération et une faible production d’IL-2 (Schwartz, 1990). Deux mécanismes sont proposés

pour expliquer l’anergie clonale : l’absence de molécules de co-stimulation (B7.1 et B7.2) à la


12

surface des cellules présentatrices d’antigènes et la liaison de B7.2 au CTLA-4 qui génère un

signal inhibiteur aux cellules T activées.

Au niveau mucosal, les cellules de l’épithélium intestinal et les cellules dendritiques sont

les principales cellules présentatrices d’antigènes. Les cellules de l’épithélium présentent les

antigènes aux cellules TCD8+ et TCD4

+ de la Lamina propria, mais elles sont incapables de les

stimuler en raison de l’absence de molécules de co-stimulation à leur surface (Hershberg &

Mayer, 2000). Les cellules TCD8+ semblent avoir un rôle important au niveau mucosal puisque

l’administration orale d’un antigène induit une faible réponse IgA en périphérie mais pas au

niveau mucosal chez des souris TCD8+ (Grdic et al.,1998). Parallèlement, les cellules

dendritiques jouent un rôle central, car une augmentation de leur nombre dans l’intestin et les

organes lymphoïdes améliorent l’induction de la tolérance (Viney et al., 1998). La majorité des

cellules dendritiques localisées dans les muqueuses sont immatures à cause de l’environnement

riche en IL-10. Ceci signifie qu’elles ont la faculté de capturer et présenter très efficacement les

antigènes aux cellules TCD4+ naïves, mais qu’elles sont incapables de les stimuler en raison de la

faible expression des molécules B7.1 et B7.2 (Lipscomb & Masten, 2002).

En périphérie, les cellules dendritiques induisent l’anergie clonale des cellules T activées

suite à l’engagement des molécules B7.2 au CTLA-4 (Perez et al.,1997). Les cellules de

l’épithélium intestinal agissent en périphérie par la formation de petites particules (tolérosomes)

présentant des fragments antigéniques via le CMH classe II, mais n’exprimant pas les molécules

de co-stimulation (Karlsson et al., 2001).

Hormis leur phénotype immature et l’engagement avec le CTLA-4, les cellules

dendritiques jouent un rôle dans l’induction de la tolérance orale grâce à leur faculté de sécréter

des cytokines immunosuppressives, impliquées dans le troisième mécanisme de la tolérance

orale, soit l’immunosuppression active (Bilsborough et al., 2003).

3.2.3. L’immunosuppression active

Cette voie fait intervenir des cellules TCD4+ régulatrices (Tr1 et Th3) spécifiques de

l’antigène et secrétant des cytokines suppressives comme le TGF-β et l’IL-10 (Weiner, 2001a et

b; Zhang et al., 2001). L’effet de ces cytokines est non spécifique puisqu’elles suppriment la

prolifération lymphocytaire dans le microenvironnement proche des cellules dendritiques ayant

pris en charge l’antigène (effet ‘bystander’), c’est-à-dire au niveau des plaques de Peyer et de la

Lamina propria (Strober et al., 1998). Les cellules régulatrices générées au niveau mucosal

peuvent migrer dans les organes lymphoïdes périphériques et supprimer la réponse en inhibant la


13

génération de cellules T spécifiques effectrices (MacDonald, 1982). Les mécanismes cellulaires

générés par le TGF-β et l’IL-10 sont différents.

Le TGF-β (Transforming Growth Factor-β), principalement secrété par les lymphocytes

Th3 (Weiner, 2001a et b), induit la commutation isotypique produisant des IgA (van Vlasselaer

et al., 1992), supprime la prolifération des cellules Th1 et Th2 et stimule les cellules Th3

(Takeuchi et al., 1998; Weiner 2001a et b). Les mécanismes impliqués sont l’altération de

l’expression des molécules accessoires (CD40) sur les CPA (Takeuchi et al., 1998), et une

augmentation de l’expression du CTLA-4 sur les lymphocytes T (Chen & Wahl, 2003). Les

cellules productrices de TGF-β sont particulièrement nombreuses au niveau du GALT, où

l’environnement cytokinique est de type Th2 (IL-4, IL-10), contrairement à la rate où les cellules

Th1 sont principalement stimulées (Everson et al., 1997). Ces cellules Th3 jouent un rôle

important dans l’induction de la tolérance orale, car un lien a récemment été établi entre le faible

niveau de cellules Th3 dans la Lamina propria et le développement des allergies chez les enfants

(Pérez-Machado et al., 2003).

Dans le cas de l’IL-10, principalement secrétée par les lymphocytes Th2 et les cellules T

régulatrices (Tr1) (Wakkach et al., 2000), elle est la principale cytokine immunosuppressive qui

inhibe l’activation et la prolifération des lymphocytes Th0, Th1 et Th2 (Wakkach et al., 2000).

Cette inhibition résulte du blocage de la maturation des cellules dendritiques (Steinbrink et al.,

1997) et de l’induction de l’anergie locale, mais durable (Groux et al., 1996).

Les lymphocytes T régulateurs Tr1 sont des cellules principalement localisées au niveau

des muqueuses produisant de grandes quantités d’IL-10, ayant une faible capacité de

prolifération (Roncarolo, 2001) et inhibant la réponse Th2 spécifique (Cottrez et al., 2000).

Récemment, il a été démontré que leur différenciation est induite par une sous population de

cellules dendritiques, hautement productrice d’IL-10. Ces cellules dendritiques sont capables

d’induire la tolérance orale à l’ovalbumine chez la souris en stimulant spécifiquement les cellules

Tr1 (Wakkach et al., 2003).

3.3. Interactions entre les différents mécanismes

Bien que les mécanismes de la délétion, de l’anergie et de l’immunosuppression active

aient été présentés séparément, leur implication, in vivo, peut être conjointe ou coopérative

(Pecquet et al., 1999; Jutel et al., 2003), en particulier grâce au TGF-β. En effet, hormis son effet

immunosuppresseur, le TGF-β joue un rôle important dans l’induction de la mort par apoptose

(Chen et al., 2001a) et dans l’induction de l’anergie en stimulant l’expression du CTLA-4 (Chen


14

& Wahl, 2003). De plus, les cellules mourant par apoptose peuvent libérer du TGF-β qui

contribue au développement de l’immunosuppression active (Chen et al., 2001b).

3.4. Facteurs influençant la tolérance orale

Plusieurs facteurs interviennent dans l’induction de la tolérance orale, mais la quantité

d’antigènes administrée semble déterminer la voie par laquelle la tolérance orale est induite. Des

faibles doses d’antigènes (< 0.1mg/g de poids corporel) favorisent la suppression active, alors

que de fortes doses (> 1mg/g de poids corporel) favorisent l’anergie et la délétion clonale

(Friedman & Weiner, 1994 ; Chen & Weiner, 1996; Kaminogawa, 1996).

La nature de l’antigène (natif ou hydrolysé) joue aussi un rôle important dans le

développement de la tolérance. En effet, plus les protéines sont hydrolysées, moins elles

induisent la tolérance (Fritsché et al., 1997; Pecquet et al., 2000). L’efficacité de l’utilisation des

formules infantiles partiellement hydrolysées pour prévenir les allergies a été prouvée dans de

nombreuses études cliniques, avec des enfants classés à risque (Exl, 2001; Von Berg et al.,

2003). Cet effet protecteur peut être expliqué par l’induction de la tolérance orale aux protéines

laitières, combinée à une diminution de l’allergénicité des protéines suite à leur hydrolyse.

D’autres facteurs semblent jouer un rôle important dans l’induction et le maintien de la

tolérance orale : l’âge auquel l’antigène est administré (Kato et al., 1999 ; Moreau & Gaboriau-

Routhiau, 1996), la fréquence d’administration (Strober et al., 1998), le patrimoine génétique

(Kiyono et al., 1982), la nature de l’antigène (Fritsché et al., 1997; Gaboriau-Routhiau &

Moreau, 1996) et la composition de la microflore intestinale. Ce dernier facteur semble être un

des plus importants et fait l’objet d’une attention particulière ces dernières années,

principalement depuis l’émergence des probiotiques et les études menées sur ces

microorganismes pouvant modifier la composition de la flore intestinale.

4. Les allergies alimentaires

4.1. Définition et mécanismes des allergies alimentaires

Les allergies se définissent comme étant des réponses immunes exagérées ou

inappropriées vis-à-vis de substances étrangères, normalement bien tolérées, appelées allergènes.

Les réactions d’hypersensibilité face aux denrées alimentaires ont été classées en quatre

catégories (I, II, III et IV) suivant leurs effets cliniques et leurs mécanismes d’action. Les

réactions allergiques qui surviennent rapidement sont appelées des réactions d’hypersensibilité

immédiate de type I à médiation IgE. La plupart des allergies alimentaires chez l’homme sont de

type I et sont provoquées par l’ingestion de faibles quantités d’allergènes de nature protéique

(Coombs & Gell, 1975 ; Moreno, 2007).


15

Lors du premier contact avec un allergène (étape de sensibilisation), une production

d’anticorps IgE spécifiques de l’allergène est induite en présence d’IL-4 et d’IL-13, secrétées par

les lymphocytes Th2 (Vercelli et al., 1990). Ces anticorps se fixent à des récepteurs

membranaires sur des cellules cibles (mastocytes, éosinophiles) localisées principalement au

niveau de la peau, des poumons et du tube digestif. Au cours des ingestions subséquentes, les

parties réactives de l’allergène (épitopes) sont reconnues par les IgE fixées. Les cellules cibles

réagissent alors en libérant des médiateurs chimiques (histamine, leucotriènes) à l’origine des

manifestations allergiques (Nowak-Wegrzyn, 2003 ; Hamar et al., 2008).

À l’échelle mondiale, environ 6 à 8% des enfants de moins de trois ans et 2% de la

population adulte souffrent d’allergies alimentaires (Schäfer et al., 2001; Anonyme, 2003;

Moneret-vautrin & Kanny, 2007). Les principaux aliments incriminés sont les arachides, le lait,

les poissons et crustacés, les œufs et les céréales (Sampson, 1999).

L’allergie au protéines du lait de vache est l’une des plus importantes et touche 2 à 3% de

la population infantile dans les pays industrialisés (Pelto et al., 1999; Høst, 2002). Toutefois,

l’allergie au lait est une maladie infantile transitoire, car les symptômes d’allergies disparaissent

avant l’âge de trois ans dans 80% des cas (Rancé & Bidat, 2000).

Le lait de vache contient de nombreuses protéines à l’origine des réactions allergiques (β-

lactoglobuline, caséines, sérum albumine, α-lactalbumine), mais la β-lactoglobuline est

considérée comme la protéine la plus allergénique (Wal, 1998).

4.2. La β-Lactoglobuline bovine

La β-Lactoglobuline bovine (β-Lg) représente 10% de la fraction protéique du lait de

vache et 50% de celle du lactosérum. Elle est présente dans les laits de nombreux ruminants et de

quelques monogastriques (truie, jument, chienne, ânesse) (Sawyer & Kontopidis, 2000). Elle est

normalement absente de la composition du lait humain, bien que de faibles quantités aient été

trouvées (Kilshaw & Cant, 1984).

Au pH du lait égal à 6.8, la β- Lg est un dimère de 36kDa; chaque unité est composée de

162 acides aminés. Plusieurs variants génétiques ont été mis en évidence (12 au total).

Cependant, les plus couramment présents dans le lait de vache sont les variants A et B, qui se

trouvent en proportions égales. La différence entre les deux variants provient de la substitution

des résidus Asp64 et Val118 dans le variant A, par les résidus Gly64 et Ala118 dans le variant B.

Chaque monomère contient deux ponts disulfures localisés entre les résidus Cys66 et Cys160,

Cys106 et Cys119 ou Cys121. Un groupement thiol libre (-SH) se trouve positionné sur le résidu

Cys119 ou Cys121. La structure secondaire de la β-Lg est constituée de 10-15% d’hélice-α, 43%


16

de feuillets-β (8 feuillets-β anti-parallèles) et 47% de structures désordonnées. Les feuillets-β

forment une cavité centrale hydrophobe, d’où sa classification dans la famille des lipocalines

(Sawyer & Kontopidis, 2000). Cette structure tertiaire lui confère une bonne résistance à

l’hydrolyse acide et à la pepsine gastrique (Reddy et al., 1988 ; Asselin et al., 1989). La β-Lg est

alors adsorbée au niveau de l’intestin à l’état natif ou légèrement hydrolysée, ce qui explique, en

partie, sa forte allergénicité (Schmidt et al., 1995).

L’allergénicité d’une protéine se définit par la faculté d’induire la production d’IgE,

d’être reconnue par ces mêmes immunoglobulines et de stimuler les lymphocytes Th2 (Merja et

al., 2007). L’allergénicité dépend du nombre d’épitopes et de leur composition en acides aminés.

Les épitopes conformationnels (acides aminés rapprochés dans la structure tertiaire de la

protéine) sont reconnus par les IgE, alors que les épitopes linéaires (acides aminés adjacents dans

la structure secondaire) sont reconnus par les récepteurs sur les lymphocytes T (TCR).

De nombreuses études ont été menées pour déterminer les épitopes allergéniques sur la

molécule de β-Lg. La principale approche utilisée consiste à hydrolyser la β-Lg, puis à mesurer

la capacité de chaque peptide à se lier à des IgE issues de sérums de patients allergiques au lait

(Sélo et al., 1998; Wal 2002). Ainsi, Sélo et al. (1999) ont identifié cinq peptides allergéniques

dans un hydrolysat trypsique de β-Lg. Ces peptides sont les fragments 1-8, 25-40, 41-60, 102-

124 et 149-162, reconnus par 58, 72, 92, 97 et 89% des sérums testés. Les séquences 21-40, 41-

60, 107-117 et 148-162 ont aussi été identifiées comme les plus allergéniques chez le rat (Miller

et al., 1999). Une autre approche, basée sur l’utilisation de peptides synthétiques, a permis de

valider la présence de séquences linéaires allergéniques sur la β-Lg. Un peptide allergénique

majoritaire (séquence 95-113) et deux minoritaires (séquences 12-27 et 124-135) ont été

déterminés par Heinzmann et al. (1999). La séquence 97-108 a aussi été rapportée comme très

allergénique par Ball et al. (1994). Järvinen et al., (2001) ont rapporté sept séquences

allergéniques, dont quatre sont en accord avec celles déterminées par Sélo et al. (1999). Dans la

structure tridimensionnelle de la β-Lg, trois épitopes majoritaires décrits par Sélo et al. (1999)

sont disposés à la surface de la molécule, ce qui explique qu’à l’état natif, la β-Lg soit très

allergénique.

Les épitopes allergéniques sont responsables de l’apparition des symptômes d’allergies.

La modification et/ou la destruction de ces épitopes font partie des stratégies intéressantes pour

prévenir les allergies.


17

Figure 4 : Localisation des séquences allergéniques sur la structure primaire du variant B de la

β-lactoglobuline bovine. Séquences allergéniques déterminées par Sélo et al. (1999) (en gris),

Heinzmann et al. (1999) (trait plein), et Järvinen et al. (2001) (trait pointillé).


18

4.3. Stratégies de prévention des allergies aux protéines laitières

4.3.1. Allaitement et régime d’éviction des protéines laitières

L’allaitement prolongé au-delà de six mois est la meilleure stratégie pour prévenir les

allergies au lait de vache chez le nouveau-né (Saarinen & Kajosaari, 1995). En effet, les enfants

ne développent pas d’allergies vis-à-vis du lait maternel. De plus, durant la période

d’allaitement, le système immunitaire du nouveau-né se développe et la perméabilité intestinale

diminue, ce qui lui permet de tolérer les protéines allergéniques à un âge plus avancé (Morein et

al., 2002). Toutefois, des traces de protéines bovines dans le lait maternel peuvent induire une

sensibilisation (Restani et al., 1999; Järvinen et al., 1999). Pour remédier à ce problème,

l’exclusion de toutes sources de protéines laitières dans l’alimentation de la femme allaitante est

conseillée (Chandra et al., 1986; Schmitz, 1997).

Quand l’allaitement n’est pas possible, le lait maternel peut être remplacé par des

formules infantiles à base de lait de vache, mais certains enfants y sont allergiques (Exl, 2001).

Dans ce cas, la méthode la plus efficace pour prévenir les symptômes d’allergies est l’éviction

totale de toutes sources de protéines laitières, mais cette approche peut engendrer des retards de

croissance (Isolauri et al., 1998). L’utilisation de formules infantiles hypoallergéniques est alors

une alternative intéressante. Pour produire ces formules, les épitopes allergéniques doivent être

détruits ou modifiés. Les méthodes traditionnelles sont le traitement thermique et l’hydrolyse

enzymatique, mais cette dernière est la plus utilisée et la plus efficace (Besler et al., 2001).

4.3.2. Hydrolyse des allergènes par des enzymes digestives

L’hydrolyse enzymatique consiste à couper les protéines en plusieurs fragments de plus

faibles poids moléculaires. Ces coupures détruisent la structure tertiaire des protéines et

dissocient les épitopes conformationnels et linéaires. L’hydrolyse de la β-Lg par la

chymotrypsine, seule ou associée à la trypsine, et l’hydrolyse par la pepsine suivie de la

chymotrypsine, diminuent de façon significative l’allergénicité de la β-Lg, mais sans la réduire

totalement (Asselin et al., 1988 et 1989). Un traitement thermique de la β-Lg avant l’hydrolyse

enzymatique améliore la réduction de l’allergénicité (Bonomi et al., 2003). Toutefois, bien que

l’hydrolyse déstabilise certains épitopes allergéniques, il a été démontré que les IgE de certains

patients allergiques se fixaient plus efficacement à la β-Lg hydrolysée qu’à la β-Lg native

(Haddad et al.,1979). Ceci suggère que l’hydrolyse enzymatique dissocie les épitopes

conformationnels et démasque des épitopes initialement enfouis dans la cavité hydrophobe.

Cependant, il a aussi été observé que plus le degré d’hydrolyse des protéines est élevé, plus

l’allergénicité résiduelle est faible (Oldaeus et al., 1999; Giampietro et al., 2001; Fritsché, 2003).


19

Basée sur cette observation, de nombreuses formules hypoallergéniques à base de protéines

laitières hydrolysées ont été développées. Différents degrés d’hydrolyse génèrent des formules

plus ou moins hypoallergéniques (Lombardo et al., 1998; Moneret-Vautrin et al., 2001;

Giampietro et al., 2001).

Dès leur plus jeune âge, les enfants sont classés dans trois catégories suivant leur aptitude

à développer des allergies aux protéines laitières. Ces trois catégories sont : les enfants sains, les

enfants classés à risque (enfants ayant des antécédents familiaux allergiques) et les enfants

sensibilisés. Différentes formules infantiles sont administrées à ces enfants (Tableau 2). Pour

prévenir les allergies chez les enfants sensibilisés, des formules fortement hydrolysées ou à base

d’acides aminés libres sont prescrites. Les formules fortement hydrolysées contiennent 85% de

peptides ayant un poids moléculaire inférieur à 1500 Da (Rancé & Bidat, 2000). De nombreuses

études cliniques démontrent que ces formules sont tolérées par plus de 90% des patients

allergiques, alors que les formules partiellement hydrolysées sont tolérées par moins de 55%

d’entre eux (Besler et al., 2001). Cependant, quelques réactions sévères, type choc

anaphylactique, ont aussi été rapportées avec ces formules (Besler et al., 2001), alors que les

formules à base d’acides aminés libres n’induisent aucune réaction de ce type (Isolauri et al.,

1995).

Quant aux formules partiellement hydrolysées, elles sont recommandées aux enfants

classés à risque (Exl, 2001). Dans ces formules, les peptides ont des poids moléculaires

supérieurs à 8kDa (Lombardo et al., 1998). Bien que l’utilisation de ces formules soit encore

controversée, la dernière étude clinique rapporte un effet protecteur de celles-ci dans la

prévention des allergies chez les enfants à risque (von Berg et al., 2003).

Les principales enzymes utilisées à l’échelle commerciale pour produire les formules

hypoallergéniques sont la trypsine et la chymotrypsine d’origine porcine (Fritsché, 2003). Ces

deux enzymes sont synthétisées par les cellules acineuses du pancréas et secrétées dans le

duodénum; la trypsine étant deux fois plus abondante que la chymotrypsine (Goldberg et al.,

1973). Elles ont un poids moléculaire similaire, avoisinant 24 kDa. La trypsine hydrolyse les

liens peptidiques du coté C-terminal au niveau de la lysine (Lys) et de l’arginine (Arg).

La chymotrypsine hydrolyse principalement les liens peptidiques du coté C-terminal des

acides aminés aromatiques comme la phénylalanine (Phe), la tyrosine (Tyr) et le tryptophane

(Trp), avec parfois des coupures après la méthionine (Met) et la leucine (Leu). L’analyse de la

structure primaire de la β-Lg révèle 52 sites de coupures théoriques pour ces deux enzymes, mais

seulement 30 peptides ont été détectés expérimentalement (Groleau et al., 2003).


20

Des enzymes d’origine bactérienne et fongique sont de plus en plus utilisées pour la

production de formules infantiles (Fritsché, 2003). Dans ce contexte, les enzymes bactériennes

sont utilisées à l’état purifié. Cependant, l’activité protéolytique des bactéries lactiques au cours

des procédés de fermentation est une autre voie importante pour la dégradation des protéines

laitières ( Chekroun et al., 2007).

4.3.3. Hydrolyse des allergènes par des enzymes bactériennes

Au cours des procédés de fermentation, les protéines laitières sont hydrolysées par les

enzymes des bactéries lactiques. Le système protéolytique des bactéries lactiques se compose de

protéases membranaires, qui hydrolysent les protéines du milieu environnant et libèrent des

peptides et des peptidases intra-cytoplasmiques qui dégradent les peptides. Les peptidases

peuvent être des endopeptidases (site de coupure intra-chaîne) ou des exopeptidases (site de

coupure en extrémité de chaîne). On distingue les carboxypeptidases des aminopeptidases, qui

coupent du coté C- et N-terminal, respectivement. Ces enzymes peuvent libérer un, deux ou trois

acides aminés, d’où l’appellation de di- ou tri-peptidyl carboxypeptidases ou aminopeptidases

(Kunji et al., 1996). La majorité des peptidases sont intracellulaires, mais une certaine activité

aminopeptidasique a été mesurée à l’extérieur des cellules (Shihata & Shah, 2000).

L’activité protéolytique des lactobacilles est de plus en plus étudiée pour son importance

dans la fabrication laitière et fromagère et le développement d’arômes (Bintsis et al., 2003). Le

contenu intracellulaire en peptidases est spécifique de chaque souche bactérienne (Kunji et al.,

1996). Cependant, plusieurs souches de L. paracasei ssp. paracasei montrent le même profil

d’activité protéolytique (Bintsis et al., 2003). Leurs activités endopeptidasique et dipeptidyl

aminopeptidasique sont faibles et inférieures aux activités carboxypeptidasique,

aminopeptidasique et dipeptidasique (Bintsis et al., 2003).

L’activité protéolytique des bifidobactéries a été peu étudiée. Toutefois, elle semble assez

faible et inférieure à celle observée avec les lactobacilles (Shihata & Shah, 2000). Leur

caractéristique générale est une activité aminopeptidasique, bien que des activités dipeptidasique,

tripeptidasique et carboxypeptidasique aient été observées (El-Soda et al., 1992).

De nombreuses études mentionnent un effet anti-allergique des produits laitiers

fermentés, mais peu d’auteurs précisent si cet effet est relié à l’hydrolyse des épitopes

allergéniques des protéines laitières, ou à une modulation de la réponse immune par les bactéries

lactiques à l’origine de la fermentation (Cross et al., 2001). De nombreux cas d’allergies ont été

rapportés suite à l’ingestion de différents fromages faits à partir de lait de vache, de chèvre ou de

brebis (Umpierrez et al., 1999 ; Besler et al., 2001 ; Hol et al., 2008), mais aucune étude n’a été


21

réalisée sur la modification de l’allergénicité des protéines laitières au cours de la fabrication

fromagère. Par contre, Chekroun et al. (1998), Jedrychowski & Wróblewska, (1999) ont rapporté

que la fermentation du lait de vache par des bactéries lactiques mésophiles et thermophiles induit

une diminution significative de l’antigénicité de l’α-La et de la β-Lg, alors qu’elle n’affecte pas

l’allergénicité mesurée par des tests sous cutanés. La diminution de l’allergénicité par

l’hydrolyse bactérienne a également été réalisée de façon indirecte, en mesurant la production

d’IL-4, in vitro, en présence d’hydrolysat. Ainsi, Sütas et al. (1996a) ont rapporté une

suppression de la synthèse d’IL-4 par les cellules mononuclées du sang, en présence de caséine

hydrolysée par les enzymes intra-cytoplasmiques de Lactobacillus rhamnosus GG.

La diminution de l’allergénicité des protéines par l’hydrolyse enzymatique constitue une

stratégie intéressante pour la prévention des allergies aux protéines du lait de vache. Cependant,

l’apparition des symptômes d’allergie dépend de nombreux autres facteurs, dont la

prédisposition génétique, de facteurs environnementaux (tabac, animaux domestiques etc.) et du

système immunitaire des individus. Il est maintenant accepté que les allergies alimentaires

apparaissent quand la tolérance orale n’est pas induite ou maintenue dans le temps. Ainsi, en

stimulant l’induction de la tolérance orale, on peut prévenir le développement des allergies.

5. Les probiotiques

5.1. Composition, évolution et rôle de la microflore intestinale résidente

À la naissance, les nouveaux-nés sont dépourvus de microorganismes, mais ils

deviennent rapidement colonisés par une microflore dense et complexe venant de la mère (Brook

et al., 1979) et du milieu environnant (Lennox-King et al., 1976). Cette flore est appelée

résidente ou autochtone et la distribution des espèces bactériennes diffère dans les

compartiments du tube digestif. Une population moins dense est observée dans l’estomac et le

duodénum (103-105ufc/g de contenu) en raison des conditions acides, alors qu’une population

plus diversifiée et plus dense est observée dans le jéjunum et l’iléum (108ufc/g). Le colon est la

partie la plus colonisée du tractus digestif. Sa population bactérienne a été estimée à 1011ufc/g et

plus de 400 espèces ont été isolées (Salminen et al., 1995). La composition de la microflore

intestinale d’un adulte, qui est relativement stable au cours du temps, est spécifique de chaque

individu (Mackie et al., 1999).

De nombreux facteurs influencent l’établissement de la flore intestinale. Parmi eux, on

trouve le mode d’accouchement, l’excès d’hygiène, l’utilisation d’antibiotiques, le type

d’allaitement, la situation géographique et la diversification alimentaire (Kirjavainen & Gibson,

1999). Plus de 12 groupes bactériens sont dénombrés dans les voies génitales de la femme


22

enceinte. Ces bactéries sont les premières auxquelles les enfants sont exposés (Mackie et al.,

1999). Quelques minutes après la naissance, on retrouve principalement des coliformes et des

streptocoques, mais les bifidobactéries et les bactéroïdes deviennent rapidement majoritaires. À

un âge plus avancé, la flore se diversifie et les lactobacilles, les eubactéries, les clostridies et les

fusobactéries augmentent en proportion, bien que les bifidobactéries et les bactéroides demeurent

majoritaires (Mackie et al., 1999). La composition de la flore intestinale est spécifique de chaque

espèce animale. La flore des souris comprend plus de clostridies et de lactobacilles que la flore

humaine, alors que les bifidobactéries n’y sont pas détectées (Ducluzeau & Raibaud, 1979).

Le rôle de la microflore intestinale n’est pas encore bien connu, mais elle semble avoir

des fonctions nutritionnelles, métaboliques, immunologiques et protectrices (Roberfroid et al.,

1995). En effet, par la fermentation de sucres (digestibles ou non), elle libère principalement des

gaz (H2, CO2), de l’acide lactique et des acides gras à courtes chaînes (acétate, butyrate et

propionate) (Macfarlane & Macfarlane, 2003). Ces derniers, particulièrement le butyrate, sont

absorbés au niveau du colon et sont utilisés comme source d’énergie par les cellules humaines

(Pryde et al., 2002). Le butyrate stimule également la prolifération des cellules épithéliales et

favorise l’absorption du Ca2+, Mg2+ et Fe2+ (Delzenne & Roberfroid, 1994).

La microflore joue aussi un rôle de protection contre les bactéries potentiellement

pathogènes, en empêchant leur translocation dans la circulation sanguine (effet barrière), en

inhibant leur prolifération (production de bactériocines) et en empêchant leur implantation dans

le tractus digestif (compétition pour les nutriments et les sites d’adhésion).

La composition de la flore intestinale résidente peut être modifiée par l’ingestion de

microorganismes qui transitent dans le tractus digestif, sans trouver de niche écologique pour se

développer. Ces microorganismes constituent la flore allochtone.

5.2. Définition d’un probiotique

Parmi les additifs alimentaires susceptibles de remplacer l’utilisation des antibiotiques

comme facteurs de croissance pour l’amélioration des performances ou en prophylaxie pour la

prévention des maladies, les probiotiques suscitent beaucoup d’intérêt.

Les microorganismes les plus fréquemment utilisés dans les préparations de probiotiques

en alimentation animale sont principalement des souches bactériennes appartenant à divers

genres, par exemple, Lactobacillus, Enterococcus, Pediococcus, et Bacillus. D’autres

probiotiques sont des champignons microscopiques incluant des levures du genre

Saccharomyces. Certains microorganismes probiotiques font partie du tube digestif de l’hôte

normal, alors que d’autres n’ont sont pas (Guillot, 2001).


23

Les mécanismes d’action des probiotiques sont encore incomplètement élucidés, mais il

est clair qu’ils permettent, par le biais de la flore intestinale selon (Doyle, 2001 ; Faowho, 2004 ;

Oyetayo & Oyetayo, 2005) :

1. la suppression ou l’élimination d’entéro-pathogènes,

2. l’inhibition de l’activité métabolique des bactéries indésirables,

3. la stimulation des mécanismes de défense non spécifiques et immunitaires.

Le concept des probiotiques provient d’un chercheur et Prix Nobel Russe, Elie

Metchnikoff (1900), qui avait pour théorie que la longévité des paysans bulgares était

directement liée à leur consommation de laits fermentés (Sanders, 1999 ; Mercenier et al., 2002 ;

Chukeatirote,2003 ; Fuller, 2004 ; Rastall & Gibson, 2004 ; Edelman, 2005). Le terme

probiotique dérive des deux mots grecs “pros“ et “bios“ qui signifient littéralement “pour la vie“

contrairement au terme antibiotiques signifiant “contre la vie“ (Andrieu, 1995 ; Catanzaro &

Green, 1997). Ce terme a été introduit pour la première fois par Lilly & Stillwell en 1965 pour

décrire des substances produites par un microorganisme et stimulant la croissance d’autres

microorganismes (Soomro et al., 2002). Depuis, plusieurs définitions ont été données aux

probiotiques dépendamment de leurs effets sur la santé. Selon Paker (1974), “probiotiques“

désigne les microorganismes et les substances qui contribuent au maintien de l’équilibre de la

flore intestinale (Sanders, 2000 ; Foocks & Gibson, 2002 ; Mercenier et al., 2002 ; Prioult,

2003 ; Callaway et al., 2003 ; Krehbiel et al., 2003 ; Fuller, 2004 ; Crittenden et al., 2005).

Fuller (1991) a défini les probiotiques de la façon suivante : “préparations microbiennes

vivantes, utilisées comme additif alimentaire, ayant une action bénéfique sur l’animal hôte en

améliorant la digestion et l’hygiène intestinale“.

Récemment, selon la définition adaptée par le groupe de travail mixte formé par

l’Organisation des Nations Unies pour l’agriculture (ONU) et l’alimentation (FAO) et

l’Organisation Mondiale pour la santé (OMS) : “Un probiotique est un microorganisme vivant

qui, une fois ingéré en certaine quantité, exerce des effets bénéfiques au-delà des fonctions

nutritionnelles de base“ (Casas & Dobrogosz, 2000 ; Klaenhammer, 2000 ; Gusils, 2002 ; Jones,

2002 ; Faowho, 2004 ; Amuradha & Rajeshwari, 2005 ; Moreira et al., 2005 ; Grajek et al.,

2005).

De façon plus spécifique, pour qu’un organisme soit considéré comme étant

potentiellement probiotique, il doit présenter les caractéristiques suivantes:

• Etre un habitant naturel de l’intestin,

• Etre capable de coloniser le milieu intestinal, persister et se multiplier,


24

• Adhérer aux cellules intestinales et exclue ou réduit l’adhérence des pathogènes,

• Avoir un métabolisme actif et produire des substances inhibant les bactéries pathogènes

(acides, H2O2, bactériocines...),

• Non invasif, non carcinogène et non pathogène,

• Etre capable de co-agréger pour former une flore normale équilibrée,

• Survivre aux différents procédés technologiques de production,

• Garder sa viabilité dans l'aliment et durant le transit intestinal (Salminen et al., 1996,

Tannock, 1999a, b; Stanton et al., 2001).

Dans toutes les définitions prononcées, la notion de viabilité apparaît comme un critère

de sélection important. Cependant, cette notion demeure très controversée puisque des études

récentes, ont clairement démontré que même les souches non viables de probiotiques sont

capables d’exercer certains effets positifs sur la santé entre autres la stimulation de certaines

fonctions immunitaires, l’inhibition de l’adhésion et l’invasion de certains pathogènes (Coconier

et al., 1993; Ouwehand et al., 1999).

L’histoire souligne donc que la définition actuelle pourrait encore évaluer, car les champs

de recherche pour mieux connaître et comprendre l’action des probiotiques sont encore

nombreux : rôle en termes de régulation et l’interaction avec la flore intestinale, facteur de

diversité chez les individus et espèces, facteurs d’établissement et de maintien, notion de

viabilité qui sera à considérer…etc.

5.3. Les microorganismes utilisés comme probiotiques

Les principaux microorganismes probiotiques connus à ce jour sont des bactéries

(Lactobacilles, Bifidobactéries, Propionibactéries, Escherichia Coli et Entérocoques) et des

levures (Saccharomyces boulardii) (Andrieu, 1995 ; Gibson & Fuller, 2000 ; Malinen, 2002 ;

Mercenier et al., 2002 ; Herzig et al., 2003 ; Cummings & Kong, 2004 ; Anuradha &

Rajeshwari, 2005).

Un probiotique peut être fait hors d’une tension bactérienne seule ou ce peut être un

consortium aussi (Rolfe, 2000 ; Zhang, 2004 ; Oyetayo, 2005). En fonction de la viabilité et du

type de microorganisme utilisé, les formes d’apport s’effectuent dans l’aliment granulé

(résistance à la température et à la pression), sous forme liquide, ou sous forme encapsulée

(protection chimique et mécanique) (O’Sullivan et al., 2005).

5.3.1. Les bactéries lactiques et leur action probiotique

Les bactéries lactiques comptent parmi les principaux probiotiques. Leur nom génétique

vient du fait qu’elles ont la propriété de produire de l’acide lactique.


25

Les bactéries lactiques sont des bactéries à Gram-positif qui regroupent 12 genres

bactériens dont les plus étudiés sont : Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc,

Entérococcus et Pediococcus (Salminen et al., 1998; Drouault & Corthier, 2001 ). Ces bactéries

peuvent avoir des formes de bâtonnet ou de coque, elles sont immobiles et ne sporulent pas.

Elles ont également un métabolisme aérobie facultatif et ne produisent pas de catalase. Les

bactéries lactiques ont en commun la capacité de fermenter les sucres en acide lactique (Sanders,

2001 ; Fooks & Gibson, 2002). Certaines sont dites homofermentaires car elles produisent très

majoritairement de l’acide lactique, alors que d’autres sont dites hétérofermentaires et produisent

de l’acide lactique en même temps que d’autres composés (acétate et éthanol en général)

(Sillanpaa, 2001 ; Fooks & Gibson, 2002 ; Klaenhammer et al., 2002 ; Beasley, 2004).

Les bactéries lactiques sont ubiquistes et on les trouve dans différentes niches

écologiques comme le lait et les produits laitiers, les végétaux, la viande, les poissons, les

muqueuses humaines et animales et dans le tractus digestif.

Les bactéries lactiques utilisées dans l’alimentation sont considérées comme non

pathogènes et se voient attribuer le qualificatif anglo-saxon d’organismes GRAS (Generally

Regarded As Safe) (Aguirre & Collins, 1993 ; Adams & Marteau, 1995 ; Salminen et al., 1998).

Cependant, quelques membres du genre Streptococcus et Enterococcus ainsi que d’autres

bactéries lactiques sont considérées comme pathogènes opportunistes (Aguirre & Collins, 1993).

Les bactéries lactiques possèdent des propriétés antitumorales qui pourraient être dues

selon (Sanders, 1999 ; Brady et al., 2000 ; Salminen, 2001 ; Chukeatirote, 2003 ; Land et al.,

2005) à:

♦ L’inactivation ou l’inhibition des composés carcinogènes dans le tractus gastro-intestinal,

♦ A la stimulation de la réponse immunitaire,

♦ A la réduction des activités enzymatiques des bactéries intestinales telles que la β-

glucoronidase, l’azoréductase et la nitroréductase qui convertissent des précarcinogènes

en carcinogènes. Les Lactobacillus retarderaient, par exemple chez le rat, la formation

des tumeurs du colon (Suvarna & Boby, 2005).

Grâce à l’action qu’elles ont sur le système immunitaire, les bactéries lactiques pourraient être

utilisées :

1. à des buts préventifs dans les infections intestinales,

2. comme protection contre autres dommages impliquant le système immunitaire.

5.3.1.1. Les lactobacilles


26

Les bactéries du genre Lactobacillus ont des aspects variés allant du bacille long et fin au

coccobacille en passant par la forme bâtonnet court ou légèrement flexueux. Elles sont Gram

positif, non sporulées, fréquemment associées en chaînettes et habituellement immobiles. Les

lactobacilles se montrent généralement plus résistants au stress acide que les lactocoques

(Siegumfeldt et al., 2000). Cette différence pourrait s’expliquer par un pH optimal plus faible

pour l’enzyme chargée, de réguler le pH intracellulaire (translocation de protons par une

ATPase) chez les lactobacilles (Nannen & Huntkins, 1991). Le métabolisme des sucres chez

Lactobacillus est hétéro- ou homofermentaire. Certaines souches sont thermophiles, d’autres

mésophiles.

Parmi le genre Lactobacillus, la sous espèce delbrueckii bulgaricus, indispensable à la

préparation du yaourt selon la définition du Codex Alimentarius de 2003, est la plus utilisée en

industrie laitière.

Les souches probiotiques commerciales sont majoritairement véhiculées à travers les

produits laitiers (Tableau 2). Différentes raisons peuvent expliquer ce choix pour le

consommateur (Heller, 2001) :

♦ les produits laitiers fermentés sont perçus comme bénéfiques pour la santé,

♦ les consommateurs sont habitués au fait que les produits fermentés contiennent des

microorganismes vivants,

♦ les probiotiques utilisés comme agent de fermentation combinent les images positives :

probiotique et fermentation.

♦ l’image bénéfique pour la santé des produits de type yaourt facilite la recommandation

d’une consommation quotidienne

D’un point de vue technologique, les procédés utilisés pour la préparation des produits

laitiers fermentés sont déjà optimisés pour permettre la croissance des microorganismes

nécessaires à la fermentation. Par conséquent, la technologie existante ne nécessite pas de

changements majeurs afin de garantir la survie des probiotiques dans le produit.


27

Souches Produits Effets observés chez

l’humain

Références

L. rhammosus GG Yaourt à boire Prévention des allergies Kallliomäki et al., 2001;

Rautava et al., 2002

L. delbrueckii bulgaricus Yaourt

Capsules

Prévention des allergies

Stimulation de la production

d’IL-10

Diminution de l’incidence des

diarrhées

Diminution des diarrhées à

rotavirus

Majamaa et al., 1997;

Isolauri et al., 2000

Pessi et al., 2000

Vanderhoof et al., 1999

Majamaa et al., 1995

L. johnsonii La1 (Lj1) Yaourts à boire

Yaourts

Inhibition du développement

d’Helicobacter pylori

Stimulation de l’activité

phagocytaire

Michetti et al., 1999

Schiffrin et al., 1997

L. casei Shirota Yaourts à boire

Laits fermentés

Augmentation de l’activité des

cellules NK

Diminution des diarrhées à

rotavirus

Nagao et al., 2000

Marteau et al., 2001

L. acidophilus NCFM Laits fermentés

Yaourts Formules

infantiles

Capsules

Diminution des diarrhées

infantiles

Facilite la digestion du lactose

Sanders et al., 2001

Sanders et al., 2001

L. plantarum 229v Jus de fruits Prévention des maladies

cardiovasculaires

Naruszewicz et al., 2002

L. casei DN-114 001 Yaourts à boire Stimulation de la production

d’IgA

Diminution de l’incidence des

diarrhées

Faure et al., 2001

Pedone et al., 2000

Tableau 2 : Utilisations commerciales et effets bénéfiques de quelques souches de Lactobacillus

probiotiques. Adapté par Prioult (2003).


28

5.3.1.2. Les streptocoques thermophiles

Les streptocoques lactiques, par définition, sont formés de bactéries à Gram positif dont

les cellules, en forme de coques, sont associées par paires ou en chaînettes de longueur variable.

Elles sont dépourvues de catalase et ne sont pas capables d’utiliser l’oxygène mais se multiplient

en sa présence (anaérobies aérotolérantes) (Sherman, 1937).

Elles sont utilisées traditionnellement dans la fabrication des yaourts et beaucoup de

fromages à pâte dure comme l’Emmental et le Gruyère et sont capables de se développer à des

températures de 45°C (Delorme, 2008). Des cultures mixtes de S. thermophilus ont des effets

positifs sur la diarrhée chez les enfants en bas âge, sur les colites chez les nouveaux-nés

prématurés et sur les maladies intestinales inflammatoires (Shamir et al.., 2005). Il a été

démontré que les S. thermophilus améliorent l’efficacité des bifidobactéries dans les diarrhées à

rotavirus (Bin-Nun et al., 2005). Cette bactérie est considérée comme agent acidifiant et

accélérateur de la fermentation (Shihata & Shah, 2000 ; Moreau, 2005). Elle est associée à L.

delbrueckii ssp. bulgaricus lors de la fermentation du yaourt (De Water & Naiyanetr, 2008). Des

études décrivant le devenir de S. thermophilus démontrent que leur survie est faible dans les

parties hautes du tube digestif (Marteau et al., 1993), alors qu’elles ont été toutefois retrouvées

dans les selles (Brijidi et al., 2005).

5.4. Mécanisme d’action des probiotiques

De façon générale, l’efficacité des probiotiques est liée à leur durée de présence dans le

tube digestif ce qui n’implique pas forcément qu’ils puissent le coloniser ou s’y développer, ainsi

que, leurs effets bénéfiques sur la santé humaine sont associés à leur quantité consommée. Les

probiotiques agissent comme des régulateurs de la flore intestinale en exerçant selon

(Netherwood et al., 1999 ; Rolfe, 2000 ; Guillot, 2001 ; Simon, 2005 ; Kelly et al., 2007) soit:

a. Un effet prophylactique (antagonisme contre certains pathogènes par production de

substances antimicrobiennes, compétition avec les pathogènes pour certains nutriments

ou pour les récepteurs de la muqueuse intestinale);

b. Un effet nutritionnel (augmentation de la digestibilité, production de nutriments

favorables) ;

c. Un effet de détoxification (moindre production d’ammoniac, d’amines ou de

cytotoxines) ;

d. Certains effets d’activation du système immunitaire et la modification de la structure et

les fonctions de l’épithélium intestinal.


29

Ces effets bénéfiques dus à l’administration de probiotiques pourraient s’expliquer par plusieurs

mécanismes.

5.4.1. L’inhibition des bactéries indésirables

La répression du développement de germes indésirables ou pathogènes peut se faire de

plusieurs façons :

♦ La production d’acides organiques à partir des glucides de la ration alimentaire (l’acide

lactique, l’acide acétique, l’acide propionique, l’acide butyrique) limite en abaissant le

pH, le développement des Escherichia coli et des Salmonella, ainsi que, la production de

peroxyde d’hydrogène et le diacetyl (Salminen, 1999 ; Krehbiel et al., 2003 ; Grajek et

al., 2005). De plus, l’acidification favoriserait le péristaltisme intestinal.

♦ Les souches probiotiques pourraient également réprimer la croissance des bactéries

pathogènes par production des peptides antimicrobiens (Percival, 1997 ; Van Belkum &

Stiles, 2000) de type bactériocine (Casas & Dobrogosz, 2000 ; Lima & Andreatti Fillo et

al., 2005 ; Callaway et al., 2003 ; Lima & Andreatti Filho, 2005).

♦ Certaines souches utilisées comme probiotiques possèdent la capacité de déconjuguer les

sels biliaires : les formes déconjuguées ont un pouvoir inhibiteur plus important sur le

développement des bactéries que les formes conjuguées (Bezkorovany, 2001; Marteau,

2001).

♦ Compétition pour les nutriments entre les probiotiques et les bactéries indésirables

(Schrezenmeir & De Vrese, 2001 ; Fooks & Gibson, 2002).

♦ Agrégation des bactéries probiotiques et pathogéniques (Casas & Dobrogosz, 2000 ;

Edelman, 2005 ; Simon, 2005).

♦ Les souches probiotiques pourraient aussi agir en inhibant l’implantation des germes

pathogènes par compétition pour la colonisation : l’adhésion des bactéries probiotiques

aux cellules intestinales permettrait une colonisation rapide et dirigée du tube digestif

(Soomro et al., 2002 ; Chandra, 2004 ; Zhang, 2004 ; Moreira et al., 2005).

5.4.2. Neutralisation des produits toxiques

Les probiotiques interviennent très certainement dans la neutralisation de produits

toxiques. Ils provoqueraient une atténuation du catabolisme intra-digestif et une orientation de la

microflore intestinale pour réduire l’absorption des substances toxiques (ammoniac, amines et

indoles) et diminuer les biotransformations des sels biliaires et des acides gras en produits

toxiques. Les bactéries probiotiques auraient aussi la capacité de produire des métabolites


30

susceptibles de neutraliser, in situ, certains toxines bactériennes (Percival, 1997 ; Schezenmeir &

De Vrese, 2001 ; Kung, 2001).

Les probiotiques auraient aussi la capacité de produire des métabolites susceptibles de

neutraliser certains toxines : Sccharomyces boulardii secrète une enzyme «Protéase» empêchant

l’absorption des toxines, ce qui améliore les paramètres hématologiques (Agawane, 2004).

5.4.3. Amélioration de la digestibilité de la ration alimentaire

Les souches probiotiques produisent des enzymes digestives (Ghadban, 2002 ; Lee et al.,

2006), ce qui favoriserait la digestion des glucides et des protéines : tel que les Lactobacillus qui

excrètent la β-galactosidase souvent déficiente dans le tractus digestif de l’hôte et facilitent donc

la digestion du lactose (Salminen et al., 1998 ; Netherwood et al., 1999).

Les mécanismes de l’effet favorable des probiotiques sur la digestion du lactose sont

selon (Afssa, 2005) :

a. Principalement, l’ajout intra-luminale de la lactase d’origine bactérienne (lactase résistant

probablement à l’hydrolyse enzymatique intra-luminale) libérée par la lyse cellulaire

notamment sous l’effet de l’acidité gastrique et des sels biliaires dans le grêle proximal,

et/ou produite par les corps bactériens vivants et en transit ;

b. L’activité de la perméase bactérienne (du probiotique), permettant l’entrée du lactose

dans la cellule probiotique et son hydrolyse lactasique, ce qui implique la conservation,

au moins partielle, de l’intégrité bactérienne.

Les probiotiques peuvent améliorer l’utilisation de la ration alimentaire de manière

indirecte en agissant sur la microflore intestinale ou au niveau des cellules épithéliales du tractus

digestif. La digestibilité de la ration alimentaire peut être également augmentée par la

prédigestion des facteurs antinutritionnels, tels que, l’acide phytique et les glucosinates en

substrats assimilables par l’hôte (Herzig et al., 2003).

Les souches probiotiques permettent aussi, d’améliorer l’assimilation des acides aminés

essentiels par l’hôte soit en les synthétisant, soit en inhibant l’action des désaminases et des

décarboxylases bactériennes excrétées par la microflore du tube digestif. De nombreuses

bactéries utilisées comme probiotiques synthétisent des vitamines pouvant être assimilées par

l’hôte (Choct, 2001 ; Grajek et al., 2005).

5.4.4. Effets sur la muqueuse intestinale

L’amélioration de la perméabilité intestinale (fonction- barrière) causée par une infection,

toxines ou autres facteurs, favorise un transfert aberrant d’antigènes (y compris la microflore


31

locale) à travers l’intestin en engendrant des réponses immunitaires inappropriées (réaction

inflammatoire ou auto-immunes).

Plusieurs probiotiques ont un effet favorable, à l’instar de la flore commensale, sur la

fonction barrière de l’intestin, augmentant la résistance transépithéliale et diminuant la

perméabilité notamment aux macromolécules. Selon Lan et al., (2004), la consommation de

Lactobacillus agilis JCM 1048 et Lactobacillus salivarius subsp salicinius JCM 1230

s’accompagnait d’une élévation significative des comptes de lactobacilles dans le jéjunum et le

caecum.

L’effet des probiotiques sur la barrière muqueuse non-immune semble être la conjonction

selon (Mahida & Rolfe, 2004 ; Lealy et al., 2005) :

a. d’effets directs sur l’expression des mucines, sur le maintien (structure, localisation,

phosphorylation) des protéines du cytosquelette et des jonctions serrées intercellulaires,

donc sur la résistance électrique, la perméabilité et les flux hydro-ioniques

transépithéliaux ;

b. et d’une probable interface de ces effets avec le versant immun de la barrière muqueuse

(adhérence bactérienne et interférence avec les pathogènes, translocation, réponse

immune non spécifique et de type humoral, interférence avec l’inflammation et réponse

cytotoxique).

Dock et son équipe, (2004), ont montré chez les rats que les deux souches probiotiques :

Streptococcus thermophilus et Lactobacillus helveticus influencent positivement la restauration

d’atrophie intestinale résultant d’une mal nutrition.

5.4.5. Influence sur la réponse immunitaire

La muqueuse du tractus intestinal représente la plus importante interface entre l’hôte et

son environnement. Pour assurer la protection de l’hôte contre l’invasion d’organismes nocifs,

les propriétés fonctionnelles de la muqueuse doivent donc être optimales. L’optimisation de ces

fonctions est assurée par des mécanismes non spécifiques incluant, entre autre, la microflore

intestinale et la production de molécules, soit par des bactéries désirables ou par l’hôte, qui

contrôlent la croissance des bactéries et leur adhérence à la muqueuse intestinale. Ces

mécanismes constituent une première ligne de défense. Quant aux fonctions immunitaires

intestinales, elles font intervenir différents types de cellules qui interagissent ensemble pour

surveiller et contrôler les agents infectieux qui n’ont pas pu être arrêtés complètement par les

mécanismes non spécifiques (Sanders, 1999).


32

Aucun organe n’héberge plus de cellules immunitaires que le tissu intestinal. Ces cellules

peuvent être regroupées dans deux catégories principales : les lymphocytes et les phagocytes. Le

premier groupe inclut les lymphocytes T et B et le second inclut les monocytes, les macrophages

et les neutrophiles. Une fois ces cellules du système immunitaire activées par la présence d’un

agent infectieux, elles produisent plusieurs facteurs nommées cytokines. Les cytokines jouent un

rôle dans l’orchestration des mécanismes de défense qui seront activées pour combattre l’agent

infectieux (Krehbiel et al., 2003 ; Chiang et al., 2000 citée par Tuohy et al., 2003).

Tout comme la flore résidente, les probiotiques peuvent interférer avec le système

immunitaire de l’hôte. Ils transitent dans la lumière intestinale et sont normalement séparés du

système immunitaire local par la barrière épithéliale. Ils peuvent communiquer avec les cellules

de la Lamina propria, soit indirectement en envoyant des signaux (cytokines) via les entérocytes,

soit directement par contact, en cas de translocation vers la Lamina propria et les ganglions

mésentériques. Ce phénomène de translocation est minime en condition normale (Sanders,

1999 ; Isolauri et al., 2001 ; Mercenier et al., 2002 ; Chandra, 2004 ; O’Sullivan et al., 2005 ;

Anuradha & Rajeshwari, 2005).

Les probiotiques peuvent aussi libérer des composés dans la lumière intestinale, qui sont

susceptibles d’être absorbés par l’épithélium intestinal et d’agir sur les cellules immunitaires.

5.4.5.1. Effets sur les cellules immunitaires impliquées dans les mécanismes de

défense non spécifique

La phagocytose, réalisée essentiellement par les macrophages, est le principal mécanisme

de défense non spécifique de l’organisme en réponse à la pénétration d’une substance étrangère.

L’état d’activation des macrophages est une mesure de la réponse immunitaire naturelle de

l’hôte. Les probiotiques stimuleraient l’activation des macrophages (Herich & Levkut, 2002).

L’administration orale de Lactobacillus acidophilus et Bifidobactérium bifidum active les

macrophages (Schriffin et al., 1995 ; cité par Salminen et al., 1998).

5.4.5.2. Effets sur les cellules impliquées dans les mécanismes de défense

immunitaires spécifique

Le système immunitaire spécifique comprend à la fois deux système : l’un agit par

l’intermédiaire des anticorps secrétés par les lymphocytes B (immunité humorale) et l’autre agit

par l’intermédiaire direct des lymphocytes T (immunité à médiation cellulaire). Les deux

systèmes communiquent entre eux par des substances chimiques telles que les interleukines.

L’augmentation de la réponse immunitaire spécifique provoquée par les probiotiques se

traduit par une activation des lymphocytes T et B, provoquant une augmentation du taux


33

d’interleukines et des anticorps circulants (IgM et IgG) et augmente les IgG à la surface de la

paroi intestinale (Corpet, 2000 ; Mercenier et al., 2002 ; Herich & Levkut, 2002 ; O’Sullivan et

al., 2005).

5.4.6. Effets sur le système immunitaire sécrétoire

La présence de microorganismes probiotiques favorise la production d’anticorps,

notamment des IgA sécrétoires dans la lumière intestinale. Directement en contact avec

l’antigène présent dans le contenu digestif, les IgA sont importantes dans le tractus digestif ;

elles font partie, comme au niveau des appareils respiratoire et génital, des premières défenses de

l’organisme contre l’infection. Les IgA peuvent inhiber l’adhésion des bactéries pathogènes à la

surfaces des muqueuses selon (Sanders, 1999 ; Isolauri et al., 2001 ; Peterson et al., 2007) :

♦ En agglutinant les bactéries ;

♦ En se fixant sur les adhésines qui sont les facteurs d’adhésion présent à la surface des

bactéries ;

♦ En interférant avec les interactions adhésines/récepteurs cellulaires.

5.4.7. Traitement et prévention des allergies

La composition de la microflore intestinale des enfants allergiques diffère

quantitativement et qualitativement de celle des enfants sains (Björksten et al., 2001; Kalliomaki

et al., 2001a; Kirjavainen et al., 2002; Watanabe et al., 2003). La flore des enfants allergiques

contient moins de bifidobactéries et plus de clostridies que les enfants sains, et cette différence se

maintient jusqu’à l’âge adulte (Apostolou et al., 2001a). De plus, la souche B. adolescentis

(caractéristique de la flore des adultes) est majoritairement retrouvée dans la flore des enfants

allergiques, alors que B. bifidum prédomine dans la flore des enfants sains (He et al., 2001). La

composition de la flore intestinale, en particulier la présence de bactéries du genre

Bifidobactérium, jouent donc un rôle important dans la prévention des allergies, mais

l’administration orale de certaines souches probiotiques semble aussi avoir un effet bénéfique.

En effet, l’administration quotidienne par voie orale de Lactobacillus rhamnosus à des

femmes enceintes et à leurs nourrissons, jusqu’à l’âge de six mois, diminue de moitié la

fréquence de l’eczéma atopique chez les enfants âgés de deux ans (Kalliomäki et al., 2001b). Cet

effet protecteur est d’ailleurs maintenu chez les enfants jusqu’à l’âge de quatre ans (Kalliomäki

et al., 2003). De plus, une récente étude dévoile que l’administration orale d’une souche

probiotique de Escherichia coli à des bébés, durant une semaine, diminue de façon significative

la fréquence des allergies à l’âge de 20 ans (Lodinová-Zádniková et al., 2003).


34

Ces effets sont en partie expliqués par une diminution de la production d’IL-4 (Sütas et

al., 1996a), la stimulation de la production d’IL-10 (Pessi et al., 2000), l’augmentation de la

production de TGF-β dans le lait maternel (Rautava et al., 2002), la diminution de la réponse

inflammatoire chez les patients allergiques (Pelto et al., 1998) et la suppression de la

prolifération lymphocytaire (Pessi et al., 1999).

Ces résultats obtenus, in vivo, peuvent être en partie expliqués par une étude réalisée in

vitro, démontrant la capacité de nombreux lactobacilles à réduire la sécrétion de cytokines type

Th2 par les cellules mononuclées de patients allergiques (Pochard et al., 2002 ).

En effet, une étude clinique de Mastrandrea et al., (2004) effectuée sur des sujets humains

(âgés de 6 à 48 ans) présentant des symptômes d’allergie alimentaire et du syndrome de l’intestin

irrité, a montré les effets positifs des probiotiques dans le traitement des maladies allergiques.

Selon cette étude, une administration quotidienne d’un mélange (1.109 bactéries vivantes) de L.

acidophilus, L. delbrueckii bulgaricus et S. thermophilus permet de réduire significativement le

taux de précurseurs circulants de lymphocytes CD34+ impliqués dans l’inflammation allergique

systémique. Wang et al., (2004) ont rapporté que l’ingestion de lait fermenté contenant L.

paracasei-33 ( 2.109ufc/pot) pendant 30 jours, permet d’améliorer la qualité de vie chez des

patients souffrant d’une rhinite allergique. Ces résultats montrent que l’administration de

certaines bactéries probiotiques améliore la réponse immune vis-à-vis des antigènes alimentaires.

5.4.8. Stimulation de l’induction de la tolérance orale

La microflore intestinale semble être un facteur important pour l’induction et le maintien

de la tolérance orale. En effet, il a été démontré que la tolérance orale n’est pas induite chez des

souris axéniques en réponse à divers antigènes, alors qu’elle l’est chez des souris

conventionnelles ayant une flore intestinale riche et variée (Wannemuehler et al., 1982; Sudo et

al., 1997; Maeda et al., 2001).

Les travaux récents de Prioult et al. (2003) ont mis en évidence l’effet des probiotiques

sur l’induction et le maintien de la tolérance orale à la β-Lg bovine chez la souris

conventionnelle. L’effet observé au niveau humoral et cellulaire dépendait de la souche

probiotique utilisée. L. paracasei s’est avéré plus efficace que B. lactis et L. johnsonii.

Kankaanpa et al. (2003) ont mentionné que Lactobacillus GG, Bifidobactérium Bb-12 et L.

acidophilus inhibent la prolifération des cellules mononuclées du sang périphérique humain,

l’expression des marqueurs cellulaires CD25, CD69 et de HLA-DR (système CMH-Antigène

humain) sur les lymphocytes T stimulées avec la phytohémagglutinine et la production d’IL-2 et

d’ IL-4. Par ailleurs, Ulisse et al. (2001) et Morita et al. (2002) ont démontré que des souches


35

probiotiques appartenant au genre Lactobacillus induisent, in vitro, et, in vivo, une production

significative de cytokines anti-inflammatoires notamment l’IL-10.

5.5 Critères de sélection des souches probiotiques

Afin de satisfaire à la définition des probiotiques, les micro-organismes doivent posséder

diverses propriétés de survie, d’activité et de persistance dans le tractus digestif qui leurs

permettront d’exercer des effets bénéfiques sur l’hôte. Ces propriétés sont propres à chaque

souche et ne peuvent pas être extrapolées d’une souche à l’autre même au sein d’une seule

espèce (Dunne et al., 2001). Plusieurs critères majeurs de sélection in vitro et in vivo ont été

établis et retenus par différents auteurs (Tableau 3).

Critères de sécurité Critères fonctionnels Critères technologiques

• Identification taxonomique précise • Origine humaine pour utilisation chez l’humain • Souche caractérisée par des techniques

phénotypiques et génotypiques • Historique de non pathogénicité et non-invasion

de l’épithélium intestinal • Pas de transmission possible de gènes de

résistance aux antibiotiques

• Tolérance à l’acidité, à la bile et aux enzymes digestives

• Adhésion aux cellules intestinales et persistance dans le tractus intestinal

• Production de substances antimicrobiennes (bactériocines, acides organiques, peroxyde d’hydrogène ou autres composés inhibiteurs) et antagonisme envers les pathogènes

• Immunomodulation • Aptitude à produire des effets bénéfiques sur la

santé

• Stabilité au cours des procédés de production et dans le produit fini

• Conservation des propriétés probiotiques après production

• Non modification des propriétés organoleptiques du produit fini

Tableau 3 : Principaux critères de sélection des probiotiques.

Adapté de Klaenhammer et Kullen (1999); Saarela et al. (2000); Ouwehand et al. (2002a et b);

Gueimonde & Salminen (2006).

MATERIELS ET METHODES

Matériels et méthodes

36

1. Provenance des bactéries

Les bactéries utilisées dans ce protocole proviennent d’un ferment commercialisé par

CSL (Centre Sperimentale del Latte) ; elles ont été régénérées dans des milieux nutritifs

spécifiques (MRS et M17) puis dans du lait de vache (Masle & Morgan, 2001). Ces bactéries

vont servir à fermenter le lait de vache. Il s’agit de :

- Lactobacillus delbruekii subsp. bulgaricus (Lb).

- Streptococcus salivarius subsp. thermophilus (St)

1.1. Préparation des bactéries

Les bactéries utilisées dans ce protocole vont servir à la préparation d’un lait fermenté :

le yaourt (quand elles sont mises en association) et de 2 autres laits fermentés par les souches

prises individuellement.

Elles ont été revivifiées dans des milieux de cultures liquides spécifiques à chaque espèce

de bactéries (MRS et M17) puis sur milieux solides pour l’isolement.

1.2. Revivification des souches

Les souches lyophilisées sont revivifiées par ensemencement dans des milieux liquides.

La milieu MRS (De Man et al., 1960) (Tableau 4) pour Lactobacillus delbruekii subsp.

bulgaricus (Lb). Le milieu M17 (Terzaghi & Sandine, 1975) (Tableau 5) pour Streptococcus

salivarius subsp thermophilus (St). Ces deux milieux ensemencés sont incubés à 37°C pendant

48H en aérobiose pour (St) et en anaérobiose pour (Lb)

2. Préparation du lait

Le lait cru de vache, fraîchement obtenu dans une ferme de la région d’Oran, est

préalablement écrémé à 4°C par une centrifugeuse (SIGMA 4K 10) à 3500trs/min pendant

20min ; cette opération est destinée à éliminer la matière grasse, source potentielle de radicaux

libres. Le lait est ensuite stérilisé à 105°C pendant 10min.


37

Tableau 4 : Composition du milieu de culture MRS (Man Regosa Scharpe) spécifique pour la

culture de Lactobacillus bulgaricus (De Man et al., 1960).

Composition Quantité

Polypeptone

Extrait de levure Extrait de viande

Acétate de sodium

Citrate d’ammonium

Glucose

KH2PO4

MgSO4

MnSO4

Tween 80

Agar-agar

Eau distillée

10 g

5 g 10 g

5 g

2 g

20 g

2 g

0,25 g

0,05 g

1 ml

15 g

qsp 1000 ml

Après avoir ajusté le pH à 5,4, le milieu est stérilisé à 120°C pendant 20 minutes.

Tableau 5 : Composition du milieu de culture M17 spécifique pour la culture de Streptococcus

thermophilus (Terzaghi et al., 1975).

Composition Quantité

Peptone trypsique de caséine

Peptone pepsique de viande

Peptone papaïnique de soja

Extrait de levure

Extrait de viande

b-glycerophosphate de sodium Sulfate de magnésium

Lactose

Acide ascorbique

Agar-agar

Eau distillée

10 g

5 g

10 g

5 g

2 g

20 g 2 g

0,25 g

0,05 g

1 ml

15 g

qsp 1000 ml

Après avoir ajusté le pH à 7,2, le milieu est stérilisé à 120°C pendant 20 minutes.


38

3. Caractérisation morphologique des bactéries

L’authenticité des espèces étudiées est vérifiée par les tests suivants :

3.1. Identification morphologique

Elle se fait par une observation macroscopique, qui décrit l’aspect des colonies et une

observation microscopique avec une coloration de Gram, qui décrit la morphologie cellulaire et

le mode d’association (Larpent et al., 1990; Ventura & Zink, 2002).

3.2. Coloration de Gram

La coloration de Gram est faite selon (Larpent & Laprent, 1990; Ventura & Zink, 2002).

Après séchage et fixation des frottis, nous recouvrons la lame avec le violet de gentiane

pendant une minute, puis nous jetons le colorant et la préparation est recouverte de lugol pendant

30 secondes. Nous jetons le réactif, la préparation est recouverte d’éthanol à 95° pendant 10

secondes afin de décolorer les bactéries Gram-. Après lavage à l’eau distillée, nous déposant sur

la lame quelques gouttes d’un deuxième colorant appelé fuchsine de ziehl, et nous laissons agir

pendant une minute. Enfin, nous lavons la lame avec de l’eau distillée, puis nous observons après

séchage à l’immersion.

Les bactéries à Gram négatif apparaissent roses et les bactéries à Gram positif violettes.

3.3. Mobilité ou non des bactéries

Elle est déterminée par simple observation au microscope photonique (Ayad et al., 2004).

3.4. Recherche de l’enzyme catalase

Cette méthode consiste à émulsionner une partie de la colonie de bactérie avec une goutte

d’eau oxygénée, une réduction positive est révélée par le dégagement de bulles gazeuses

(Marchal et al., 1991).

4. Préparation des ferments

Pour l’étude des caractéristiques d’intérêt technologique des bactéries utilisées, nous

avons procédé, dans une première étape, à la préparation de l’inoculum et des ferments pour

chaque espèce utilisée.

4.1. Préparation de l’inoculum

Les précultures, en milieu lait, sont réalisées à partir de cultures cellulaires âgées de 24

heures. Les espèces (une ou 2 colonies) sont repiquées dans le lait de vache écrémé stérile,

L’incubation s’effectue à 37°C pour le lactobacille et à 45°C pour le Streptocoque pendant 18H.

Les précultures ou inoculums obtenues sont utilisées pour la préparation des ferments


39

4.2. Préparation des ferments

Pour chaque espèce bactérienne, la culture pure est obtenue en ensemençant le lait avec 1%

de l’inoculum correspondant.

5. Protocole de préparation des différents laits fermentés

Le lait stérile est ensemencé par une culture mixte, à partir de 2 cultures pures âgées de

18 heures ou par une culture pure, à la concentration de 5% chacune. L’ensemble est

homogénéisé et incubé à 45°C jusqu’à coagulation du lait.

A partir de l’association bactérienne réalisée en culture mixte, nous avons pu préparer le

yaourt:et pour les bactéries prise individuellement, un lait fermenté

- Streptococcus thermophilus +Lactobacillus bulgaricus (LF1)

- Lactobacillus bulgaricus (LF2)

- Streptococcus thermophilus (LF3)

Pour l’analyse statistique, chaque opération a été répétée 5 fois, permettant ainsi d’obtenir

5 échantillons de laits fermentés.

6. Etude de quelques caractères physicochimiques de la culture mixte et des bactéries

prises individuellement, au cours de la fermentation du lait à 45°C

6.1. Profil fermentaire des bactéries

6.1.1. Mesure de la cinétique de variation du pH

Le pH, indice de l’acidité développée dans le lait au cours du processus de fermentation,

est mesuré en fonction du temps à l’aide d’un pH-mètre (Kiba Labotechnik).

6.1.2. Mesure de la cinétique de production d’acide

Le taux de production d’acide est considéré comme le reflet de l’activité du ferment

(Stadhouders, 1986).

Principe de mesure

L’expression "acidité titrable" désigne l’acidité mesurée par la méthode classique de la

réaction acide-base selon la méthode décrite par Accolas et al. (1977). Cette méthode permet de

neutraliser l’acide produit par la fermentation par une solution de NaOH (N/9) en présence de

phénophtaléine (à 1% dans de l’alcool). La solution d’hydroxyde de sodium (NaOH) utilisée est

dite soude dornic.

La mesure de l’acidité titrable est faite au début de la fermentation du lait (T=0) puis

toutes les 30min jusqu’à coagulation du lait. Les mesures sont effectuées dans le lait fermenté,


40

par les cultures prises en association et individuellement. Nous pouvons ainsi estimer la vitesse

d’acidification du lait (mM/h) au cours de la fermentation.

Procédure

A 10ml de lait, contenant la culture mixte sont ajoutées 5 gouttes de phénolphtaléine.

Puis, à l’aide d’une burette graduée et sous agitation, nous ajoutons de la soude dornic jusqu’à ce

que la couleur blanche vire au rose. Le volume (V) de la soude utilisée est noté.

Les résultats sont exprimés en degré dornic (°D) en utilisant la relation :

Acidité=Vx10,

Il faut savoir aussi que : 1°D= 0,1 g d’acide lactique produit dans un litre de lait.

6.2. Cinétique de croissance des bactéries

La cinétique de croissance (ufc/ml) est réalisée sur des échantillons de 10ml de lait

fermenté par les cultures testées. 1ml de chaque échantillon est traité, par dilution décimale, dans

de l’eau physiologique stérile contenant 1g de peptone et 8,5 g de NaCl par litre. 0,1ml des

dilutions (10-4, 10-6, 10-8) sont ensemencés par étalement sur chaque milieu spécifique.

Le dénombrement de Lactobacillus bulgaricus est effectué sur le milieu MRS à 37°C

pendant 72H (Tableau 4) (Ghoddusi & Robinson, 1996).

Le dénombrement de Streptococcus thermophilus est effectué sur le milieu M17 à 45°C

pendant 72H (Tableau 5) (Ghoddusi & Robinson, 1996).

Le dénombrement est effectué dans des boîtes de pétri contenant un nombre de colonies

compris entre 30 et 300 (Ghoddusi & Robinson, 1996).

7. Caractères biochimiques des laits fermentés

7.1. Préparation des échantillons

Après obtention des différents laits fermentés, nous avons procédé à leur caractérisation

biochimique selon la procédure suivante.

7.1.1. Constitution des échantillons de laits fermentés

Chaque lait fermenté, constitué de 5 échantillons, est homogénéisé, congelé à -72°C et

déshydraté par lyophilisation à l’aide d’un lyophilisateur (Speed Vac Concentator 100H) et

conservé pour les dosages ultérieurs.


41

7.2. Mesure de l’activité protéolytique des bactéries

7.2.1. Dosage des protéines totales (Lowry et al. 1951)

La détermination des teneurs en protéines totales dans les laits fermentés est effectuée par

la technique de Lowry et al. (1951).

Le principe consiste en l’addition successive, à une solution protéique diluée, d’un sel de

cuivre en milieu alcalin, puis d’un réactif de phénol de folin-cieucalteus (Merck) qui donne une

coloration bleue qui résulte de la réduction de l’acide phospho-tungsto-molybdique (réactif de

Folin) par la tyrosine, le tryptophane et la cystéine contenues dans les protéines. Il se développe

une coloration bleue, dont l’intensité est proportionnelle à la quantité de protéines de

l’échantillon. La composition des solutions utilisées pour le dosage des protéines totales figure

dans le tableau 6.

Procédure

Le dosage des protéines s’effectue sur les échantillons de laits fermentés après dilution

dans de l’eau distillée. La lecture est faite au spectrophotomètre (Jasco V-530), dans une cuve en

quartz à 750 nm.

La concentration des protéines est mesurée par comparaison à une gamme étalon obtenue

avec le sérum albumine bovine.


42

Tableau 6 : Composition des solutions utilisées pour le dosage des protéines totales selon la

technique de Lowry et al. 1951.

Solution A NaCO3 anhydre 2% dans la solution de la soude 0,1 N

Solution B1 CuSO4 5%

Solution B2 Tartrate de K+ et de Na+

anhydre

10%

Solution à préparer extemporanément : Solution B : 1 ml de la solution B1 + 1 ml de la solution B2 + 8 ml d’eau distillée. Solution C : 1 ml de la solution B + 50 ml de la solution A. Solution E : Réactif de Folin dilué au demi (V/V) dans de l’eau distillée.


43

7.2.2. Dosage des fonctions α-NH2 libérées (Doi et al., 1981)

La protéolyse bactérienne, dans les laits fermentés, est évaluée par le dosage des

fonctions α-NH2 libérées grâce à la méthode de Doi et al.(1981). Les enzymes protéolytiques des

bactéries dégradent les protéines en peptides et libèrent des fonctions α-NH2 dont le taux est

déterminé par mesure colorimétrique, après réaction avec la ninhydrine. Les concentrations des

peptides sont exprimées par rapport à une courbe étalon d’un mélange équimolaire de leucine

exprimée en (mM/l).

Principe

Le dosage de ces fonctions α-NH2 nécessite une solution où sont dissous 0,8g de

ninhydrine dans un mélange de 80ml d’éthanol à 99,5%, 10 ml d’acide acétique glacial suivi par

l’addition de 1g de chlorure de cadmium. Cette solution peut être conservée, dans un flacon

coloré recouvert de papier aluminium pour éviter l’action de la lumière, 1 mois à l’obscurité et à

la température de 4°C.

La procédure consiste à mettre dans des tubes Sovirel, successivement, 500µl de

l’échantillon à doser et 1ml de la solution de ninhydrine; l’ensemble est bien mélangé et le tube

est chauffé pendant 5min à 84°C dans un bain marie pour révéler la couleur pourpre. Les tubes

sont ensuite refroidis dans de la glace.

La lecture se fait au spectrophotomètre à l’aide d’une micro cuve en quartz, à 540nm. La

concentration en fonctions α-NH2 libérées des échantillons est calculée à l’aide de la courbe

étalon leucine établie à l’aide de standards traités dans les mêmes conditions.

7.2.3. Détection, par électrophorèse, des protéines résiduelles natives dans les laits

fermentés

L’effet de la stérilisation à 105 °C et des enzymes bactériennes sur les protéines du lait au

cour de la fermentation est apprécié par électrophorèse sur gel d’Acrylamide-Bisacrylamide en

présence de sodium dodécyl sulfate (SDS).

Cette technique est rapide, sensible et capable d’un haut degré de résolution ; elle nous

permet la détection des protéines résiduelles (caséines, β-Lg, α-La, SAB) dans les différents laits

fermentés.

Le mélange de protéines est dissout dans une solution de SDS, détergent anionique qui

rompe presque toutes les interactions non covalentes présentes dans les molécules natives. Le

mercaptoéthanol est ajouté afin de réduire les liaisons disulfures. Les anions du SDS se lient aux

chaînes principales dans le rapport d’environ une molécule de SDS pour deux résidus acide

aminé, donnant au complexe SDS-protéine dénaturé une charge négative importante


44

approximativement proportionnelle à la masse de la protéine. La charge négative acquise par la

fixation du SDS est habituellement beaucoup plus grande que la charge de la protéine native;

cette charge native est ainsi rendue négligeable.

Les complexes SDS-protéines sont ensuite soumis à une électrophorèse dans le gel de

polyacrylamide.

Mode opératoire

Les gels sont préparés selon la méthode de Laemmli, (1970) qui utilise deux gels

superposés de composition différente en acrylamide et bis-acrylamide : un gel de concentration

(5%) et un gel de séparation (12,5%). La composition et la préparation des gels sont présentées

dans le tableau 7.

Dépôt des échantillons

Les échantillons, dissous dans du tampon d’échantillons, sont déposés dans des puits

formés dans le gel (Tableau 8 et 9).

La migration se fait sous tension de 75 volts pendant 1h 45 min.

Les peptides et les acides aminés, dont le poids moléculaire est inférieur à 14KDa, vont

traverser le gel et passer dans la solution. Les protéines résiduelles, dont le poids moléculaire est

compris entre 64 et 14KDa vont être piégées par le gel et identifiées par rapport aux protéines de

référence (Tableau 10). La migration des protéines est arrêtée lorsque le front de migration,

constitué de bleu de Coomassie contenu dans le tampon de l’échantillon, atteint le bas du gel.

Le gel est démoulé et mis dans une solution d’acide trichloroacétique TCA à 10%.

Les protéines sont visualisées par le bleu de Coomassie contenu dans la solution de

coloration (Tableau 11) qui révèle une série de bandes. L’excès de colorant est éliminé par des

rinçages, dans une solution décolorante (Tableau 12), qui met en évidence des bandes visibles à

l’œil nu. Le temps de trempage est indéterminé.

Les marqueurs protéiques de l’électrophorèse (tableau 14) sont la sérum albumine bovine

(PM= 67KDa), la caséine native (PM variant de 25,2 à 19KDa) (caséine alpha S1 = 23,6KDa,

caséine alpha S2 = 25,2KDa, caséine béta = 24KDa, caséine kappa = 19,2KDa, caséine gamma =

19KDa), la β-Lactoglobuline (PM= 18,3KDa), l’α-Lactalbumine (PM= 14,4KDa),


45

Tableau 7 : Composition des gels de polyacrylamide-sodium dodecylsulfate

Gel de concentration 5% Gel de séparation

12,5%

Tris pH 8,8

Tris pH 6,8

----------------

0,625 ml

4,05 ml

-------------

Polyacrylamide

Acrylamide (30 %)

Bisacrylamide (0,8 %)

0,83 ml 4,405 ml

Eau distillée 3,25 ml 1,935 ml

Dégazage sous vide pendant 5 min

Temed (5%) 0,025 ml 0,050 ml

SDS (10%) 0,050 ml 0,105 ml

Persulfate (10%) (Merck) 0,050 ml 0,100 ml


46

Tableau 8 : Composition de la solution de tampon.

constituants Quantités

Tris HCl (1N) pH 6,8 6,25ml

β- mercaptoétanol 5ml

Glycérol 10ml

SDS 2,3g

Bleu de Brome phénol 1ml

Eau distillée Qsp 100ml

Tableau 9 : Composition de la solution de migration


Glycine 14,4g

Tris 3,3g

SDS 1g

Eau distillée (Qsp) 1000 ml


47

Tableau 10 : Poids moléculaire des protéines de références.

protéines de références Poids moléculaire

β-Lg (sigma) 18,3 KDa

α-La (sigma) 14,2 KDa

Caséine (sigma) 19 à 25,2 KDa

SAB (sigma) 66,3 KDa

Tableau 11 : Composition de la solution de coloration.


Bleu de coomassie R250 0,2 ml

Ethanol 96% 90 ml

Acide acétique 20 ml

Eau distillée 90 ml

Tableau 12 : Composition de la solution de décoloration.


Ethanol 96% 90 ml

Acide acétique glacial 10 ml

Glycérol 10 ml

Eau distillée 90 ml


48

8. Etude de l’effet protecteur des bactéries du yaourt sur la muqueuse intestinale de

souris BALB/c sensibilisées au lait de vache

8.1. Animaux et Nursing

50 souris femelles de souches BALB/cBYJlco (BALB/c) d’un poids moyen de 17 ± 0,4g

âgées de 3 à 5 semaines seront utilisées dans ce protocole. Cette souche est caractérisée par une

bonne réponse immunitaire aux différents antigènes. Les animaux sont acquis auprès de l’Institut

Pasteur d’Alger. Ils sont maintenus, pendant toute la durée de l’expérimentation, dans des

conditions d’animalerie du Laboratoire de Physiologie de la Nutrition et Sécurité Alimentaire ;

ils sont répartis dans des cages appropriées munies chacune d’un biberon et sont nourris ad

libbitum avec des granulés (aliment conventionnel) et de l’eau supplémentée de quelques gouttes

d’une solution polyvitaminique (Groupe SAIDAL). Les manipulations sur les animaux sont

effectuées en respectant le bien-être de l’animal, excluant tout état de stress susceptible

d’interférer avec les résultats

8.2. Constitution des lots

Les souris sont réparties en 5 lots expérimentaux :

1er lot expérimental : témoin négatif

Il est composé de 10 souris qui ne reçoivent pas de laits fermentés pour la colonisation de

l’intestin et sont intubées avec une solution de NaCl 9°/00 à raison de 0,3ml pendant toute la

durée de l’expérimentation.

Les 10 souris sont réparties en 2 groupes dont 5 sont sacrifiées au 18ème jour et les 5

autres au 50ème jour.

2ème lot expérimental : témoin positif

Il est composé de 10 souris qui ne reçoivent pas de laits fermentés pour la colonisation de

l’intestin et sont intubées avec une solution de NaCl 9‰ à raison de 0,3ml pendant 18 jours puis

elles subissent une sensibilisation au lait de vache par intubation gastrique à raison de 0,3ml tous

les 3 jours durant le reste de l’expérimentation.



3ème lot expérimental : LF1

Il est composé de 10 souris qui subissent quotidiennement une colonisation du tube

digestif avec le lait fermenté (LF1) pendant 18 jours ; La colonisation de l’intestin se fait par

voie orale avec 0,3ml de ce dernier fluidifié par brassage (Yaourt à boire), ce lot subit ensuite

une sensibilisation au lait de vache par intubation gastrique à raison de 0,3ml tous les 3 jours

pendant la durée restante de l’expérimentation.


49



4ème lot expérimental : LF2

Il est composé de 10 souris et la colonisation de leur tube digestif se fait avec le lait

fermenté par Lactobacillus bulgaricus (LF2); 0,3ml/j de cette solution sont introduits dans le tube

digestif de l’animal pendant 18 jours; ce lot subit une sensibilisation au lait de vache à raison de

0,3ml tous les 3 jours pendant le reste de l’expérimentation.



5ème lot expérimentale : LF3

Il est composé de 10 souris et la colonisation de leur tube digestif se fait avec le lait

fermenté par Streptococcus thermophilus (LF3); 0,3ml/j de cette solution sont introduits dans le

tube digestif de l’animal pendant 18 jours; ce lot subit ensuite une sensibilisation au lait de vache

à raison de 0,3ml tous les 3 jours pendant le reste de l’expérimentation.



8.3. Prélèvement des échantillons sanguins

Au cours de l’expérimentation, des prélèvements sanguins sont effectués avant la

colonisation bactérienne (J0) puis aux jours (J18) et (J50) juste avant le sacrifice des animaux.

Le sang est prélevé à l’aide d’une pipette pasteur, par ponction retroorbitaire. Il est

centrifugé à 3500trs/min pendant 15min à 4°C et les sérums sont mis en parties aliquotes et

conservés à -20°C, pour le dosage des immunoglobulines spécifiques IgG.

Après le sacrifice des animaux, la partie jéjunum de l’intestin est prélevée pour le test en

chambre de Ussing et l’étude histologique.

Des prélèvements de chyme intestinal sont réalisés à différents niveaux de l’intestin pour

un dénombrement des bactéries testées.


50

8.4. Dénombrement des bactéries testées, dans les différentes parties de l’intestin et

dans les fèces fraîches des animaux

Pour évaluer la colonisation du tube digestif par les bactéries testées contenues dans les

laits fermentés chez les 3 lots d’animaux, un dénombrement bactérien est effectué dans les fèces

fraîches et dans le chyme intestinal fraîchement collecté des souris, sur milieu MRS acidifié pour

Lactobacillus bulgaricus et sur milieu M17 pour Streptococcus thermophilus.

Chaque échantillon de fèces (1g) et de chyme intestinal a été mis dans un tube contenant

9 ml d’eau physiologique stérile. La suspension a été homogénéisée pendant 2min. Une série de

dilutions décimales a été effectuée et 0,1ml de chaque dilution (104, 105,106) sont ensemencés,

par étalement sur milieu spécifique pour chaque genre bactérien et incubés à 37°C pour les

lactobacilles et 45°C pour les Streptocoques (Beerens, 1990).

Les boites de Pétri contenant un nombre de colonies compris entre 30 et 300 sont

retenues.

9. Evaluation du degré de sensibilisation des animaux

9.1. Titrage des anticorps IgG sériques anti β-Lg

Afin d’apprécier le degré de sensibilisation des animaux à la β-Lg, nous avons effectué

des titrages d’IgG sériques par une méthode immuno-enzymatique (ELISA) selon un procédé

non compétitif inspiré de la technique de Engvall & Perlmann (1971).

Principe

Le principe de cette technique est basé sur un procédé dans lequel les anticorps à doser

réagissent dans un premier temps avec l’antigène immobilisé par adsorption sur une phase

solide. Dans un deuxième temps, la quantité d’anticorps fixé par l’antigène est mesurée à l’aide

d’un deuxième anticorps (anti-immunoglobuline) marqué à l’aide d’une enzyme.

Dans le cadre de notre travail, nous avons utilisé des plaques de microtitration en

polystyrène (NUNC Maxisorb, 96 puits à fond plat), qui permettent d’adsorber la plupart des

antigènes dilués en phase alcaline. Après dépôt de l’immunosérum contenant les anticorps

spécifiques, la phase solide est lavée et nous révélons la présence de ces anticorps par l’addition

d’un conjugué qui correspond à des anti-IgG de souris (Sigma) suivi d’un ligand spectravidine

peroxydase (Sigma). La dernière étape correspond au dosage de l’enzyme marqueur et cette

phase est essentielle, car du plus petit nombre de molécules d’enzymes que l’on pourra détecter,

dépendra le seuil de sensibilité.

Le substrat de la peroxydase que nous avons utilisé est le peroxyde d’hydrogène (H2O2). Au

cours de la réaction enzymatique, un radical O se forme. Pour le détecter, nous avons ajouté à la

solution un chromogène, l’orthophénylène diamine (OPD).


51

Cette technique est sensible et très spécifique des IgG; elle rend compte surtout de

l’intensité de la réponse immune secondaire aux antigènes.

Mode opératoire

� Les microplaques sont sensibilisées par 10µg/ml de β-Lg diluée dans du PBS 0,01M

(tampon phosphate salin) à pH 7,4 et sont incubées pendant au moins une nuit à + 4°C.

� Après un lavage avec du PBS-Tween 20, 0,05% (PBS/Tw 20), 200µL de PBS-BSA 3%

(pour la β-Lg) sont déposés dans les puits et la plaque est incubée à 37°C pendant 1

heure pour saturer les sites non spécifiques.

� La plaque est ensuite rincée avec du PBS/Tw 2O et les échantillons de sérum de souris

immunisées à la β-Lg, sont diluées dans du PBS BSA 1% Tween 0,05% (tampon de

dilution) à raison de 10-2 à 10-7 sont déposés dans les puits (100µl par puits). La plaque

est incubée à 37°C pendant 2 heures.

� Un autre lavage est effectué avec du PBS/Tw20 avant le dépôt de l’anticorps (anticorps

polyclonal B9904 Sigma pour les IgG totales spécifiques des souris). Les microplaques

sont incubées pendant 1 heure à + 37°C.

� Après lavage avec du PBS/Tw20, la Streptavidine peroxydase E-2886 (Sigma) est diluée

au 1/5000 et déposée à raison de 100µl par puits ; la plaque est incubée à 37°C pendant

30min.

� Après lavage avec le PBS/Tw20, l’eau oxygénée (H2O2) associé à un chromogène :

l’orthophénylène diamine (OPD), dans du tampon citrate de sodium (0,05M à pH 5,1) est

déposé à raison de 200µl/puits. La réaction colorée se développe en 30 minutes à

température ambiante et à l’abri de la lumière. L’ajout de H2SO4 2N a permis de stopper

la réaction (Tableaux 13, 14, 15 et 16).

� L’intensité de la réaction colorimétrique est mesurée à 492nm à l’aide d’un lecteur (ELx

800).

� Des témoins positifs et négatifs sont inclus dans chaque plaque afin de contrôler la

spécificité et la sensibilité de chaque mesure.


52

Tableau 13: Composition du tampon phosphate salin (1 M), pH=7,4

Solutions Quantités

Na2HPO4,12 H2O

KH2PO4

NaCl

Kcl

Thymérosal

Eau ultra pure

29g

2g

80g

2g

1g

1000ml

PBS : Phosphat Buffered Saline

Nous effectuons une dilution de 1/10ème de cette solution pour obtenir à la fin une solution de

phosphate salin PBS (0,01M) pH = 7,4.

Tableau 14 : Composition des solutions tampons d’ELISA.

Tampons Produits

Tampon de capture NaHCO3 (0,1 M) pH=9,6

Tampon de lavage PBS (0,01M) pH = 7,4

Tween 20 0,05%

Tampon de saturation PBS (0,01M) pH = 7,4

BSA 3%

Tampon de dilution PBS (0,01 M) pH = 7,4

BSA 3%

Tween 20 0,1%


53

Tableau 15: Composition du tampon citrate pH=4.

Solution Mode de préparation

Tampon citrate pH=4 294mg citrate + 472µl acide acétique + H2O jusqu’à obtention du pH=4

Tableau 16: Composition de la solution de révélation d’orthophénylène diamine (OPD).

Solution Composition

Solution de révélation (OPD) 60mg OPD + 20ml Tampon citrate pH=5,1 + 30µl H2O2 .


54

10. Etude histologique de l’intestin de souris colonisées par les bactéries du yaourt

apportées par les laits fermentés puis sensibilisées au lait entier de vache

Cette étude a pour but de vérifier l’existence d’une infiltration lymphocytaire au niveau

de la muqueuse intestinale ainsi que la présence d’une atrophie villositaire en réponse à la

colonisation de l’intestin par les bactéries du yaourt suivie de la sensibilisation par le lait de

vache. Elle est faite sur des fragments isolés d’intestin de souris ayant constituées les 3 lots.

Les fragments intestinaux ont été étudiés selon le protocole suivant :

Dés leur prélèvement, les fragments de jéjunum sont mis directement dans du ringer

glacé. Ils sont rincés puis découpés en petits morceaux et mis dans du phormol à 10% tamponné

avec du CaCl2 à raison de 1g/100ml de phormol à 10%.

10.1. La fixation

La fixation a pour but essentiel d’assurer une immobilisation des constituants cellulaires

ou tissulaires dans un état aussi voisin que possible de l’état vivant (Nzelof, 1972). C’est une

phase importante ; son but est de ne pas endommager les composants du tissu que nous voulons

fixer telles que les cellules immunitaires.

10.2. Inclusion et coupe des tissus

10.2.1. Les procédés d’inclusion

En technique d’histologie courante, les tissus fixés ne sont pas coupés tels quels, mais

après inclusion dans un milieu solide qui maintient les structures, leur donne une consistance qui

empêche la fragmentation des tissus lors de la coupe et assure l’obtention de sections très fines,

régulières et homogènes. Le plus couramment utilisé de ces milieux est la paraffine, mais il en

existe d’autres.

10.2.2. Inclusion à la paraffine

Les paraffines n’étant pas solubles dans l’eau, il n’est pas possible d’y plonger un tissu

fixé. Toujours très chargé d’eau, il est donc nécessaire d’effectuer au préalable une

déshydratation à l’alcool absolu.

10.2.3. Déshydratation

La déshydratation permet l’élimination de l’eau du fragment d’intestin en plongeant

celui-ci dans de l’alcool choisi (alcool éthylique) pendant un temps suffisant à degré croissant :

alcool à 70°, 90° et alcool absolu 99,9°. La durée de la déshydratation est fonction du volume des

fragments tissulaires. La déshydratation complète du fragment d’intestin a suivi les étapes

suivantes :

• Bain d’alcool à 70° pendant 25 minutes.




55

• Bain de toluène pendant 10 minutes.

• Bain de toluène pendant 15 minutes.

Il faut ensuite passer le fragment déshydraté dans un milieu intermédiaire, soluble à la

fois dans l’alcool et la paraffine (par exemple : toluène, xylène, chloroforme….).

10.2.4. Imprégnation par la paraffine

Elle s’effectue dans un premier bain de paraffine à l’état liquide par séjour dans une étuve

dont la température est réglée légèrement au dessus de son point de fusion, 56° durant une heure.

Chimiquement, les paraffines sont des mélanges d’hydrocarbures solides à poids

moléculaire élevé (parum affinis ; faible affinité ; ces substances sont en effet caractérisées par

leur indifférence aux agents chimiques). Elles se présentent sous forme de substances blanches,

légèrement translucides, inodores, onctueuses au toucher.

Etant donné que la qualité des coupes est en grande partie fonction de l’absence de toute

trace de solvant dans la paraffine de la coupe, nous imprégnons les fragments d’intestins dans 2

bains successifs de paraffine : le premier bain durant une heure et le deuxième bain durant 2

heures. Ces bains doivent être fréquemment changés car ils se chargent progressivement de

solvant. La persistance de toluène abaisse le point de fusion de la paraffine rendant donc celle-ci

plus molle et moins propre à la coupe.

A la sortie du dernier bain de paraffine, l’échantillon est déposé dans la paraffine fondue

vierge que nous coulons dans un moule constitué par des barres métalliques (barres de Leuckart)

disposées sur une lame de verre ; on peut utiliser également des moules tous préparés en

plastique.

Le refroidissement de cette paraffine amène sa solidification en un bloc prêt à être coupé.

Ce refroidissement est généralement obtenu en laissant reposer la paraffine à la température du

laboratoire.

Remarque

Les blocs obtenus peuvent se conserver durant de très longues périodes.


56

10.3. Microtomisation et étalement des coupes

Les échantillons d’intestin sont coupés à l’aide d’un microtome. Les coupes obtenues ont

une épaisseur de 4µm. Le microtome comporte :

• Un support de rasoir,

• Un porte-objet où sera inséré le bloc,

• Un système d’avance mécanique permettant le déplacement de l’objet en direction du

rasoir fixé et dont l’angle de coupe est vertical.

• Un bouton gradué de 0 à 20µm pour régler l’épaisseur de la coupe.

L’étalement des coupes se fait sur une lame de verre qui est recouverte d’une solution

d’albumine (2g d’albumine + 50ml de glycérine dans 1000ml d’eau distillée). Cette lame est

placée sur une plaque chauffante réglée à une température convenable, inférieure à celle du point

de fusion de la paraffine. L’ensemble coupe lame de verre est retiré de la platine, égoutté et mis

à sécher pendant au moins une heure avant d’être coloré ou conservé à l’étuve à la température

ambiante jusqu’au moment de la coloration.

10.4. Coloration

Avant de procéder à la coloration des coupes, il faut déparaffiner et réhydrater

l’échantillon.

10.4.1. Déparaffinage

Pour déparaffiner les coupes, il suffit de les placer sur une plaque chauffante à 56°C et les

mettre ensuite dans 2 bains successifs de toluène durant 2 minutes pour chaque bain.

10.4.2. Réhydratation

L’hydratation de l’échantillon se fait dans 3 bains successifs d’alcool éthylique d’ordre

décroissant (100°, 95°, 70°) durant 2 minutes par bain ; le rinçage de la coupe se fait à l’eau

courante.

10.4.3. Technique de coloration

10.4.3.1. Coloration nucléaire

Les colorations nucléaires que nous avons utilisées sont simples. La plupart sont

progressives mais certaines colorations par l’hématoxyline nécessitent une différenciation.

Les colorants nucléaires les plus utilisés en histologie courante sont les hématoxylines qui

colorent les noyaux en bleu-noir, brun-noir ou noir.

L’hématoxyline est une matière colorante naturelle extraite à l’éther de certains bois

d’Amérique du Sud qui ne se trouvent que dans la zone tropicale.


57

Les propriétés colorantes de l’hématoxyline n’apparaissent qu’après une oxydation par

l’oxygène atmosphérique ou par adjonction d’un agent oxydant (eau oxygénée, Permanganate de

potassium,…).

L’hématéine, substance colorante de l’hématoxyline, ne peut colorer correctement les

noyaux des fragments d’intestins de nos souris que si elle est additionnée d’alun de potassium ou

d’alun de fer ; l’hématéine possède une forte charge positive et se comporte comme un puissant

colorant basique.

10.4.3.2. Coloration topographique générale

Coloration à l’hémalun-éosine

Nos lames ont été colorées à l’hémalunéosine : c’est la plus simple des colorations

«combinées». Nous avons fait agir successivement un colorant nucléaire «basique» l’hématéine

et un colorant cytoplasmique «acide», l’éosine. La coloration du noyau est bleu-noir et le

cytoplasme rose à rouge.

L’hématoxyline de Harris (Hould, 1984) est utilisée pour colorer les noyaux. La

préparation de ce produit se fait comme suit :

• Dissoudre 5g d’hématoxyline dans 50ml d’éthanol

• Dissoudre 100g d’alun de potassium dans 1000ml d’eau distillée en chauffant légèrement

et retirer la solution du feu.

• Mélanger les 2 solutions

• Faire bouillir le mélange, le retirer du feu.

• Ajouter avec précaution, par petites quantités 2,5g d’oxyde mercurique

• Chauffer de nouveau jusqu’à ce que la solution acquière une couleur pourpre foncée

• Retirer immédiatement du feu et refroidir aussitôt dans un grand récipient rempli d’eau.

• Filtrer avant usage.

• Ajouter, si nécessaire avant usage, 2 à 4% d’acide acétique glacial pour augmenter la

précision de la coloration de nos lames comme suit :

• Mettre les lames dans l’hématoxyline de Harris durant 2 à 3 minutes.

• Laver les lames à l’eau ordinaire.

• En cas de surcoloration, les lames sont trempées légèrement dans l’alcool chlorhydrique

(100ml d’alcool à 95° + 5 gouttes d’HCl à 1%) pendant quelques secondes.

• Bleuir dans une solution aqueuse saturée de carbonate de lithium (rinçage).

• Laver les lames à l’eau ordinaire.

• Mettre les lames dans un bain d’alcool éthylique 1 à 2 minutes.


58

• Colorer les lames à l’éosine alcoolisée (2g d’éosine dans 100ml d’alcool éthylique)

pendant 5minutes.

• Rinçage des lames dans 2 bains successifs d’alcool éthylique à 70° puis à 95°.

• Mettre les lames dans du toluène pendant 1 minute.

• Mettre entre lame et lamelle une goutte de baume de Canada ou d’eukitt.

• Laisser sécher puis observer au microscope.

10.5. Mesure des villosités

Le relief villositaire au niveau du jéjunum est apprécié suivant différents critères,

essentiellement la hauteur des villosités.

10.5.1. Principe de la mesure

Les mensurations des hauteurs des villosités sont effectuées sous un microscope optique

muni d’un micromètre oculaire. Pour déterminer le nombre de microns correspondant pour

chaque objectif, nous plaçons sous le microscope un micromètre objectif qui est une sorte de

lame présentant des graduations. Nous déterminons le nombre de divisions sur le micromètre

objectif. Ce nombre correspond à un nombre précis de microns. Nous avons utilisé un

micromètre à 200 divisions qui correspondent à 2mm.

Le micromètre oculaire comporte 100 divisions. Ces 100 divisions correspondent à 128

divisions sur le micromètre pour l’objectif (x10).

Puisque les 200 divisions sur le micromètre objectif correspondent à 2000µm, donc les

128 divisions correspondent à 1280µm.

Les 100 divisions du micromètre oculaire correspondent à 1280µm, donc une division

correspond à 12,8µm pour l’objectif (x10). Le même principe de calcul est appliqué pour les

autres objectifs.

10.5.2. Calcul

Nous procédons aux calculs des moyennes des hauteurs villositaires des échantillons

d’intestin des 4 lots de souris.


59

Tableau 17 : Composition du colorant à l’hématoxyline de Harris (Hould, 1984)

Hématoxyline 5g

Ethanol 50ml

Alun de potassium 100ml

Eau distillée 1000ml

Faire bouillir le mélange

Oxyde mercurique 2,5g

Chauffer la solution et filtrer avant usage.


60

10.6. Dénombrement des lymphocytes intra-épithéliaux

Nous utilisons la méthode préconisée par Rouquette (1980) que nous adaptons à la souris.

Pour chaque tissu, nous réalisons 3 comptages en procédant, dans un premier temps, à une

numération de 100 entérocytes, et nous déterminons le nombre de lymphocytes intra-épithéliaux

(LIE). Cette méthode est la plus souvent utilisée chez le rat et le lapin. Le dénombrement des

lymphocytes dans 100 entérocytes recouvre une étendue épithéliale suffisamment importante.

Pour obtenir un comptage fiable des (LIE), 2 conditions doivent être réunies :

• Effectuer la rénumération sur 100 entérocytes contigus.

• Renouveler ce comptage sur 3 champs différents et si possible sur des fragments

d’intestins différents.

Remarque

Ce comptage permet de comparer le nombre des (LIE) dans les échantillons d’intestin.

11. Etude, in vitro, de l’allergénicité résiduelle de la β-Lg et de l’α-La sur le muqueuse

intestinale de souris colonisées avec les bactéries du yaourt puis sensibilisées au lait de

vache

Dans cette partie de notre travail, nous avons étudié, in vitro, l’allergénicité des laits

fermentés par les bactéries du yaourt.

11.1. Etude, in vitro, en chambre de Ussing

11.1.1. Principe de la chambre de Ussing

La chambre de Ussing est une méthode fondamentale pour l’étude et la compréhension

des mécanismes du transport intestinal. Ce dispositif expérimental a été conçu à l’origine par

Ussing & Zerahn, (1951) pour la mesure des flux ioniques au travers d’un épithélium, puis par la

suite, il a été adapté à l’intestin par Schultz & Zalusky, (1964 a,). Depuis, cette méthode a été

appliquée à de nombreux modèles animaux de laboratoire et est utilisée pour des fragments

d’intestin humain, prélevés au cours d’interventions chirurgicales ou lors de biopsies intestinales

(Khéroua et al.,1987; Marcon-Genty et al.,1989; Saidi et al., 1995; Terpend et al.,1999).

Un fragment de muqueuse intestinale est monté à plat entre deux demi-chambres de lucite

dont l’ouverture, déterminant la surface exposée, est adaptée à la taille du fragment à étudier (0,1

à 0,2 cm2). Les deux faces du tissu, déterminant un compartiment muqueux (représentant la

lumière intestinale) et un compartiment séreux (représentant la circulation sanguine) sont

baignées par des solutions identiques (pression, température, osmolarité) maintenues à 38°C,

brassées et oxygénées continuellement par un courant de carbogène (O2 : 95 %, CO2 : 5 %)

maintenant le pH à 7,4.


61

Le principe même de la chambre de Ussing est qu’il ne doit exister aucun gradient

électrochimique permettant à une solution donnée, i, de traverser le tissu. Cette condition est

remplie lorsque les deux faces du tissu sont baignées par des solutions ayant la même

composition chimique, la même température, le même pH et la même osmolarité.

11.1.2. Inclusion à la paraffine Montage des fragments de jéjunum de souris en

chambre de Ussing

11.1.2.1. Préparation de l’animal

Les souris sensibilisées à la β- Lg et à l’α- La et les souris témoins, sont maintenues à

jeûne depuis la veille au soir. Elles sont anesthésiées à l’aide d’un coton imbibé d’éther, puis

l’abdomen est ouvert et le segment jéjunal entier est prélevé délicatement de la cavité

abdominale, vidée de son contenu par 2 ou 3 rinçages au Ringer froid (Tableau 18).

Après l’avoir délicatement débarrassé des mésentères, une légère incision est pratiquée le

long du bord mésentérique, puis à l’aide d’une pince fine, la séreuse ainsi que la couche

musculaire longitudinale externe sont enlevées. Le segment jéjunal est ensuite incisé selon le

bord mésentérique puis découpé en fragments qui sont maintenus dans du ringer froid et

oxygénés par un courant de carbogène (CO2 :5%, O2 :95%). A chaque fois, un fragment

d’intestin de souris, ouvert longitudinalement, est monté entre deux demi-chambres définissant

un compartiment muqueux et un compartiment séreux. Un dispositif de clamp électrique permet

de mesurer, en continu, les paramètres électrophysiologiques du tissu.

Les fragments sont montés à plat entre deux chambres de lucite dont l’ouverture

détermine la surface de la muqueuse intestinale exposée (0,1 cm2). Les deux faces du tissu,

délimitant de chaque côté un compartiment muqueux et un compartiment séreux, sont baignées

par des solutions identiques de ringer (140mM de Na+, pH= 7,4). La température, l’osmolarité, le

pH et la pression sont identiques des deux côtés. Les solutions sont thermostatées à 38°C par un

bain circulant (Radiometer, Copenhagen). Les compartiments muqueux et séreux sont

continuellement oxygénés par un mélange gazeux (O2 : 95 %, CO2 : 5 %). Le bullage du mélange

gazeux assure le brassage permanent du milieu et maintient le pH à 7,4.

Après montage du tissu, 30 minutes sont nécessaires pour stabiliser les paramètres

électrophysiologiques de base. Au terme de cette période, nous déposons 20µg/ml de l’antigène

que nous voulons tester (β-Lg, α-La ou poudre de lait fermenté : yaourt) dans le compartiment

séreux de la chambre. Les différents paramètres électrophysiologiques sont alors mesurés dans

un premier temps, toutes les minutes durant les 5 premières minutes, puis une fois toutes les 5

minutes, durant 15 minutes d’expérimentation.


62

Les compartiments muqueux et séreux sont reliés à une paire d’électrodes au calomel, via

des ponts d’agar (4g/100ml de KCl, 3M) aux 2 faces du tissu et permettent de mesurer la

différence de potentiel (DDP) spontanée du tissu (séreuse positive). Il est possible de supprimer

cette DDP, de l’amener à 0 mV, grâce à un système d’électrodes Ag/AgCl reliées à une source

de courant et permettent de faire passer le courant de faible intensité (10µA) à travers le tissu. Ce

courant est appelé courant de court-circuit ; il représente la somme des flux nets ioniques,

principalement de Na+ et de Cl- et un flux résiduel de HCO3-.

Isc=JNa+ net + JCl-

net+ Jr

L’application de la loi de Ohm (U=RI) permet de déterminer la résistance du fluide (Rf)

en absence du tissu et la résistance du tissu (RT) une fois celui-ci monté dans la chambre, ou son

inverse : la conductance G (G=1/R=1/U).

11.2. Etude de l’effet de la β-Lg, de l’α-La et du lait fermenté (yaourt) sur les

paramètres électrophysiologiques du jéjunum des souris sensibilisées au lait de

vache

Le dispositif permet l’étude de l’interaction des protéines sensibilisantes avec les

fragments de muqueuses de souris sensibilisés au lait de vache

Procédure

� Stabilisation des paramètres électrophysiologiques

Après montage du tissu, 2ml de ringer sont déposés dans chaque compartiment de la

chambre de Ussing. 20 minutes sont nécessaires pour stabiliser les paramètres

électrophysiologiques de base.

� Dépôt de l’antigène sensibilisant

Au terme de cette période, le yaourt ou la protéine native à tester (β-Lg et α-La), sont

déposés dans le compartiment séreux de la chambre. Cette étape dure 15 minutes durant laquelle

les paramètres physiologiques sont recueillis.


63

Tableau 18 : Composition de la solution de Ringer

Na+ 140mM Cl - 120mM

K + 5,2mM HCO3- 25mM

Ca++ 1,2mM HPO4 2,4mM

Mg++ 1,2mM H2PO4 0,4mM


64

11.3. Expression des résultats

Les résultats sont présentés sous forme de la moyenne ± erreur standard (X ± Es).

Les moyennes sont comparées à l’aide du test "t" de Student pour des données appariées

et non appariées. Le seuil de signification retenu est celui qui est habituellement considéré, soit

5%.

Le degré de signification est représenté de la manière suivante :

NS : non significatif *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001

12. Analyse statistique

L’analyse statistique utilisée dans notre travail pour comparer les résultats obtenus est :

La comparaison de deux moyennes par le test « t » de student.

La comparaison de plusieurs moyennes par l’analyse de variance ANOVA

Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± erreur standard.

Le seuil de signification retenu est celui qui est habituellement considéré, soit 5%.

Les différentes données sont analysées à l’aide d’un logiciel STATISTICA version 6,0.

.

RESULTATS

Résultats

65

1. Etude microbiologique

1.1. Identification des souches bactériennes

1.1.1. Observation macroscopique

L’observation macroscopique nous a permis de décrire l’aspect des colonies comme suit:

La bactérie Streptococcus salivarius subsp. thermophilus (St), cultivée sur milieu M17

gélosé et incubée en aérobiose à 45°C pendant 48H, montre des colonies crémeuses avec un

diamètre de 0.8 à 1mm.

La bactérie Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb), cultivée sur milieu MRS

gélosé et incubée en anaérobiose à 37°C pendant 48H, révèle des colonies blanchâtres.

1.1.2. Observation microscopique

L’observation microscopique décrit la morphologie des bactéries et leur mode

d’association après la coloration de Gram :

Les résultats montrent que la bactérie Streptococcus salivarius subsp. thermophilus (St)

est une bactérie Gram positif, en forme de cocci ; les bactéries sont associées en chaînettes

(Figure 5); La bactérie Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb) se présente sous forme

de bâtonnets de différents types ; elle est Gram positif et les bactéries sont arrangées en petites

chaînettes (Figure 6).

1.1.3. Test de la catalase

Les deux souches bactériennes ont montré une réaction négative au test de la catalase.

Résultats

66

Figure 5 : Aspect microscopique de Streptococcus salivarius subsp. thermophilus (St) après

48H d’incubation à 45°C sur milieu spécifique M17 et coloration de Gram (Gx40)

Figure 6 : Aspect microscopique de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb) après

48H d’incubation à 37°C sur milieu spécifique MRS et coloration de Gram (GX40)

Résultats

67

1.2. Cinétique de croissance bactérienne

Le dénombrement des bactéries, exprimé en ufc/ml, dans le lait fermenté LF1 par les deux

espèces bactériennes mises en association, révèle une synergie active au cours de la

fermentation. Au temps T0 les concentrations sont respectivement de 9.107ufc/ml pour (St) et de

17.107ufc/ml pour (Lb). Après 4H de fermentation à 45°C, c'est-à-dire au moment de l’obtention

du caillé, le taux de croissance est de 9.108ufc/ml pour (St) et 3.108ufc/ml pour (Lb)

respectivement (Figure 7).

Le dénombrement bactérien effectué au cours de la fermentation du lait de vache par les

espèces Streptococcus salivarius subsp. thermophilus et Lactobacillus delbrueckii subsp.

bulgaricus cultivées individuellement a donné les résultats suivants:

Au temps T0, le chiffre est de 7.107ufc/ml pour (Lb) cultivé sur milieu MRS (LF2) et de

4.107ufc/ml pour (St) cultivé sur milieu M17(LF3). Au temps de la coagulation (T=240min), la

concentration bactérienne dans LF2 et LF3 atteint respectivement un maximum qui est de

5.108ufc/ml pour (Lb) et 3.108ufc/ml pour (St) (Figure 8).

Résultats

68

Figure 7 : Cinétique de croissance des bactéries du yaourt Streptococcus salivarius subsp.

thermophilus et Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, exprimée en Log (ufc/ml), mises en

association pour la fermentation du lait LF1 à 45°C.

Les valeurs mentionnées sont des moyennes ± erreur standard (n=5)

Nous remarquons que :

- La croissance bactérienne montre une augmentation rapide et importante quand les

espèces sont mises en association par apport aux espèces pures testées individuellement.

- La différence de la croissance bactérienne est hautement significative (p≤0.001) à la fin

de la fermentation du lait LF1.

5

5,5

6

6,5

7

7,5

8

8,5

9

9,5

10

0 60 120 180 240

Croissance (Log ufc/ml)

Tps (min)

Lb St

**

****

** **

**

***

***

Résultats

69

Figure 8 : Cinétique de croissance bactérienne, exprimée en Log (ufc/ml), des bactéries testées

individuellement Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus et Streptococcus salivarius subsp.

thermophilus au cours de la fermentation des laits LF2 et LF3 à 45°C


Nous constatons que :

- La croissance des espèces cultivées individuellement progresse modérément

- La différence est très significative (p≤0.01) entre le début et la fin de la fermentation des

deux laits LF2 et LF3.

Conclusion

Le graphe de la figure 7 montre que la croissance, des 2 espèces bactériennes mise en

association pour préparer le lait LF1, est rapide et plus importante comparée à la croissance des

espèces pures prises individuellement (figure 8) pour fermenter les laits LF2 et LF3 dans les

mêmes conditions expérimentales.

6

6,5

7

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8

8,5

9

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0 60 120 180 240

Croissance (Log ufc/ml)

Tps (min)

Lb St

**

**

****

**

****

**

Résultats

70

1.3. Evaluation de la colonisation de l’intestin des souris par les bactéries contenues

dans les laits fermentés LF1, LF2 et LF3

L’évaluation de la colonisation intestinale des souris expérimentales par l’association des

deux espèces bactériennes Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb) (Figure 9a) et

Streptococcus salivarius subsp. thermophilus. (St) (Figure 9b), et par la culture de ces mêmes

espèces pures prises individuellement Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb) (Figure

10) et Streptococcus salivarius subsp. thermophilus. (St) (Figure 11) a été réalisée, grâce au

dénombrement bactérien sur milieux de culture spécifiques aux deux bactéries, à deux étapes de

l’expérimentation: au 18ème et au 50ème jour de l’expérimentation.

Avant la sensibilisation au lait de vache

Les souris, au nombre de 10 par lot, ont reçu quotidiennement pendant 18 jours un

volume de 0.3ml de lait fermenté contenant 9.108ufc/ml de (St) et 3.108ufc/ml de (Lb) présentes

dans le lait fermenté LF1 et 5.108ufc/ml de (Lb) dans LF2 et 3.108ufc/ml de (St) dans LF3. Les

bactéries ayant servi pour la fermentation du lait vont servir pour la colonisation de l’intestin des

souris. A la fin de cette étape, 5 souris de chaque lot sont sacrifiées et un dénombrement

bactérien de chaque espèce testée est réalisé au niveau de la muqueuse intestinale et dans les

fèces fraîches des animaux.

Les résultats du dénombrement bactérien montrent que le nombre en (ufc/g) des deux

espèces a augmenté pendant ces 18 jours au niveau de la muqueuse par apport aux fèces

atteignant une concentration maximale de 7.108ufc/g pour (St) et 2.108ufc/g pour (Lb) dans le 1er

lot expérimental colonisé par l’association de ces deux bactéries (LF1), tandis qu’au niveau des

fèces, les concentrations sont de : 9.106ufc/g pour (St) et 12.106ufc/g pour (Lb).

Le dénombrement effectué dans le 2ème et le 3ème lot expérimental, colonisé chacun d’eux

par une seule espèce cultivée individuellement a révélé les résultats suivants : au niveau de la

muqueuse, les concentrations sont de : 4.108ufc/g pour (Lb) présente dans LF2 et 2.108ufc/g

pour (St) dans LF3, alors que dans les fèces fraîches, les chiffres obtenus sont : 25.106ufc/g pour

(Lb) présente dans LF2 et 14.106ufc/g pour (St) présente dans LF3.

Après la sensibilisation au lait de vache

Après le J18, les 5 souris restantes des trois lots ont été sensibilisées par 0.3ml de lait de

vache, à raison de un jour sur 3 (1J/3) durant le reste de la période expérimentale.

Au J50 de l’expérimentation, juste après le sacrifice des souris, le dénombrement

bactérien effectué dans les muqueuses intestinales et dans les fèces fraîches a donné les résultats

suivants :

Résultats

71

Dans le 1er lot (LF1), la concentration des bactéries colonisantes au niveau de la

muqueuse est de 7.106ufc/g pour (Lb) et 12.106ufc/g pour (St), alors qu’au niveau des fèces

fraîches, la concentration est de 107ufc/g pour (Lb) et 3.107ufc/g pour (St)

Chez les souris du 2ème lot (n=5), colonisées uniquement par Lactobacillus delbrueckii

subsp. bulgaricus (Lb) pure (LF2), la concentration de cette dernière est de 5.106ufc/g au niveau

de la muqueuse intestinale et de 8.107ufc/g au niveau des fèces fraîches.

Chez les souris du 3ème lot (n=5), colonisées par Streptococcus salivarius subsp.

thermophilus (St) pure (LF3), le dénombrement effectué sur milieu (M17) spécifique révèle une

concentration de la bactérie de 8.106ufc/g au niveau de la muqueuse et de 2.107ufc/g au niveau

des fèces fraîches.

Résultats

72

Figure 9 a : Dénombrement bactérien de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb),

exprimé en Log (ufc/g), dans la muqueuse et les fèces fraîches

de souris colonisées avec le lait LF1


6,6

6,7

6,8

6,9

7

7,1

7,2

7,3

7,4

7,5

J18 J50

Croissance (Log ufc/g)

Jours (J)

Muqueuse Selles

***

**

Résultats

73

Figure 9 b : Dénombrement bactérien de Streptococcus salivarius subsp. thermophilus. (St)

exprimé en Log (ufc/g) dans la muqueuse et les fèces fraîches



Nous notons :

- Que la différence du dénombrement bactérien des deux espèces mises en association au

niveau de la muqueuse est hautement significative (p≤0.001) au 50ème jour

- Que le dénombrement bactérien de l’association des deux espèces au niveau des fèces

fraîches a une différence très significative (p≤0.001) au 50ème jour

6,7

6,8

6,9

7

7,1

7,2

7,3

7,4

7,5

J18 J50


Jours (J)

Muqueuse Selles

***

**

Résultats

74

Figure 10 : Dénombrement bactérien de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb),

exprimé en Log (ufc/ml), au niveau de la muqueuse intestinale et dans les fèces fraîches


Les valeurs mentionnées sont des moyennes ± erreur standard (n= 5)

Nous notons que :

- La différence du dénombrement de (Lb) dans la muqueuse au 50ème jour est hautement

significative (p≤0.001) par rapport au 18ème jour

- La différence du dénombrement de (Lb) dans les fèces fraîches au 50ème jour est très

significative (p≤0.01) par rapport au 18ème jour

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

J18 J50


Jours (J)

Muqueuse Selles

***

**

Résultats

75

Figure 11 : Dénombrement bactérien de Streptococcus salivarius subsp. thermophilus (St),

exprimé en Log (ufc/ml), dans la muqueuse et les fèces fraîches

de souris colonisées avec le lait LF3.

Les valeurs mentionnées sont des moyennes ± erreur standard (n= 5)

Nous notons que :

- La différence du dénombrement de (St) au niveau de la muqueuse au 50ème jour est

hautement significative (p≤0.001) par rapport à celui du 18ème jour

- La différence du dénombrement de (St) dans les fèces fraîches au 50ème jour est

significative (p≤0.05) par rapport à celui du 18ème jour

Conclusion

- D’après les figures 9 (a, b), 10 et 11, les bactéries du yaourt ont une survie plus au moins

longue au niveau de la muqueuse intestinale et des fèces fraîches.

- La concentration des bactéries durant la période de colonisation est plus importante au

niveau de la muqueuse qu’au niveau des fèces fraîches, contrairement, au dénombrement

effectué juste après la période de sensibilisation, où le nombre des bactéries été plus élevé

dans les fèces fraîches par rapport à la muqueuse intestinale.

- Les bactéries du yaourt survivent au stress des acides gastriques et biliaires et colonisent

le tube digestif.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

J18 J50


Jours (J)

Muqueuse Selles

*** *

Résultats

76

2. Etude biochimique des laits fermentés

2.1. Cinétique d’acidification au cours de la fermentation

2.1.1. Mesure du pH

La croissance des cultures bactériennes dans le lait au cours de la fermentation, entraîne

un abaissement du pH par l’hydrolyse du lactose en acide lactique et/ou acide acétique.

La cinétique d’abaissement du pH du lait de vache fermenté par l’association des espèces

bactériennes (Figure 12) ou leur culture pure prise individuellement (Figure 13), ont été suivies

au cours de la fermentation à 45°C et sont comparées avec le lait de vache stérile, sans ferments,

traité dans les mêmes conditions. Les résultats obtenus montrent une baisse du pH dans les trois

laits fermentés qui traduit l’activité métabolique des espèces utilisées.

Au temps initial d’incubation (T0), les valeurs du pH sont de 6.10±0.04, 5.88±0.009,

5.88±0.02 et 6.59±0.01respectivement pour le lait LF1, LF2, LF3 et LS. Les résultats obtenus

après 4H d’incubation montrent une baisse hautement significative (p≤ 0.001) du pH dans les

trois types de laits fermentés et les valeurs sont de 4.66±0.13, 4.81±0.01 et 4.99±0.01

respectivement pour le lait LF1, LF2 et LF3, tandis que le pH du lait stérile reste stable avec une

diminution non significative. Nos résultats montrent qu’après 4H d’incubation, le pH des laits

LF1, LF2 et LF3 a baissé d’une façon hautement significative par rapport au lait stérile.

2.1.2. Mesure de l’acidité titrable

La transformation du lactose du lait en acide lactique est due à l’action d’enzymes

provenant des micro-organismes des levains. La quantité d’acide produite, exprimée en degré

dornic par litre de lait (°D/l), intervient comme facteur de la coagulation du lait; elle est le reflet

de l’acidité du ferment.

La cinétique de production d’acide lactique en fonction du temps par l’association des

bactéries fermentables du lait LF1 (Figure 14) ou leur utilisation individuellement pour la

fermentation des laits LF2 et LF3 (Figure 15), est comparé avec celle du lait stérile pris comme

témoin.

Au temps initial, la quantité d’acide produite est de: 35.4±1.08°D, 41±0.28°D,

36.6±1.08°D et 20±0.04°D respectivement pour les laits LF1, LF2, LF3 et LS. Après 4H de

fermentation, la quantité maximale d’acide produite atteint 78.01±4.81°D pour LF1, 74.6±1.15°D

pour LF2 et 67.4 ±0.67°D pour LF3.

Les résultats enregistrés après 4H de fermentation à 45°C révèlent une augmentation très

significative (p≤0.01) de l’acide produit dans le lait LF1 par rapport au début de la fermentation.

La quantité d’acide produite dans les deux laits LF2 et LF3 était hautement significative

(p≤0.001), alors que dans le lait stérile, la quantité d’acide produite reste stable et aucune

différence significative n’est établie entre le début et la fin de l’incubation.

Résultats

77

Figure 12 : Cinétique de variation du pH par l’association des deux espèces bactériennes

au cours de la fermentation du lait LF1 et LS à 45°C

LS : Lait Stérile

LF1 : Lait fermenté par l’association de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus et

Streptococcus salivarius subsp. thermophilus

Les valeurs mentionnées sont des moyennes ± erreurs standard (n=5)

Nous notons :

- Qu’il n’existe aucune différence significative entre T0 et T240 dans le lait stérile

- La différence est hautement significative (p≤0.001) entre LF1 et LS à la fin de la

fermentation

- La différence est aussi hautement significative (p≤0.001) entre le début et les différents

temps de la fermentation de LF1

4,5

5

5,5

6

6,5

7

0 60 120 180 240

pH

Tps (min)

LS LF1

***

***

***

***

Résultats

78

Figure 13 : Cinétique de variation du pH par les deux espèces prises individuellement

au cours de la fermentation des laits LF2, LF3 et LS à 45°C

LS : Lait Stérile

LF2 : Lait fermenté par Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

LF3 : Lait fermenté par Streptococcus salivarius subsp. thermophilus


Nous notons :

- Qu’il n’y a pas de différence significative entre T0 et T240 dans le lait stérile

- Qu’il n’existe aucune différence significative de pH entre les deux espèces cultivées

individuellement à la fin de la fermentation

- Que la différence est hautement significative (p≤0.001) entre le début et la fin de la

fermentation des laits LF2, LF3.

Conclusion

- Le pH du lait LF1 fermenté par l’association des deux espèces a diminué d’une façon

rapide et plus importante par rapport aux pH des laits LF2 et LF3.

- La diminution du pH est plus importante lorsque les souches sont associes que

lorsqu’elles sont cultivées individuellement

4,5

5

5,5

6

6,5

7

0 60 120 180 240

pH

Tps (min)

LS LF2 LF3

***

***

***

***

***

***

***

***

Résultats

79

Figure 14 : Cinétique de production d’acide par l’association des deux espèces bactériennes

au cours de la fermentation du lait LF1 et LS à 45°C

LS : Lait Stérile



Les valeurs mentionnées sont des moyennes ± erreurs standard (n=5)

Nous notons :

- Qu’il n’existe aucune différence significative entre T0 et T240 dans le lait stérile

- La différence est hautement significative (p≤0.001) entre LF1 et LS à la fin de la

fermentation

- La différence est très significative (p≤0.001) entre le début et les différents temps de la

fermentation de LF1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 60 120 180 240

Acidité titrable (°D)

Tps (min)

LS LF1

**

**

**

**

Résultats

80

Figure 15 : Cinétique de production d’acide au cours de la fermentation de laits

LF2, LF3, LS par les deux espèces prises individuellement à 45°C

LS : Lait Stérile




Nous notons :

- Qu’il n’y a pas de différence significative entre T0 et T240 dans le lait stérile

- Que la différence est hautement significative (p≤0.001) entre le début et la fin de la

fermentation des laits LF2, LF3

- Que la différence est non significative à la fin de la fermentation entre LF2 et LF3

- La production d’acide lactique était très élevée dans le lait LF1 comparée à celle des laits

LF2 et LF3.

Conclusion

- Le taux de la production d’acide lactique est plus important lorsque les espèces

bactériennes sont associées que lorsqu’elles sont cultivées individuellement.

- Les bactéries du yaourt ont un pouvoir acidifiant très élevé lorsqu’elles sont associées

pour fermenter le lait de vache.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 60 120 180 240

Acidité titrable (°D)

Tps (min)

LS LF2 LF3

***

***

******

***

******

***

Résultats

81

2.2. Mesure de l’activité protéolytique des bactéries au cours de la fermentation du lait

de vache

2.2.1. Teneur en protéines totales des laits fermentés par les bactéries prises

individuellement et en association

La caractérisation physiologique des bactéries après la fermentation du lait est réalisée

grâce à l’évaluation de la protéolyse par la quantification des teneurs en protéines totales.

Pour assurer leur croissance, les bactéries dégradent obligatoirement les protéines du lait en

peptides et acides aminés qu’elles utilisent comme source d’azote au cours de la fermentation

grâce à leurs enzymes spécifiques (exopeptidases et endopeptidases).

La teneur en protéines totales (µg/mg) des laits fermentés (LF1, LF2 et LF3) est comparée

à celle du lait stérile (témoin), les valeurs sont représentées dans la figure 16.

Nos résultats montrent une diminution régulière de la teneur en protéines totales au cours de la

fermentation dans les trois laits fermentés. Aucune diminution de la teneur en protéines n’a été

enregistrée dans le lait stérile pris comme témoin.

Au début de la fermentation (à T0), les teneurs en protéines totales sont de

348.28±0.67µg/mg, 264.76±1.05µg/mg, 228.36±0.39µg/mg et 419.72±1.85µg/mg

respectivement pour les laits LF1, LF2, LF3 et LS. Après 4H d’incubation à 45°C, nous avons

enregistré dans les trois laits fermentés une diminution significative des taux de protéines totales

et les valeurs obtenues sont de 140.44±0.53µg/mg (p≤0.001) dans le lait LF1, 125.84±0.46µg/mg

(p≤0.001) dans LF2 et 134.56±0.55µg/mg dans LF3 (p≤0.001).

2.2.2. Fonctions α-NH2 libérées dans les laits LF1, LF2 et LF3 au cours de la

fermentation

La dégradation des protéines par les enzymes bactériens libère des fonctions α-NH2

caractéristiques de la protéolyse. Cette dernière est mesurée par l’évaluation des fonctions α-NH2

libérées après la fermentation du lait à 45°C ; elle est exprimée en µM/mg de l’échantillon.

Les résultats (Figure 17) représentent le taux des fonctions α-NH2 libérées dans les laits

fermentées LF1, LF2, LF3 ainsi que dans le lait stérile. Nos résultats révèlent une libération

croissante des fonctions α-NH2 au cours de la fermentation comparée à celle du lait stérile qui est

resté moyennement stable.

Au début de la fermentation (T0), les teneurs des fonctions α-NH2 libérées sont de

14.57±0.12µM/mg, 18.51±0.08µM/mg, 16.83±0.07µM/mg et 9.53±0.36µM/mg respectivement

pour les laits LF1, LF2, LF3 et LS. Après 4H de la fermentation à 45°C, nous avons obtenus les

teneurs suivantes : 18.52±0.08µM/mg (p≤0.01) pour le lait LF1, 26.53±0.27µM/mg (p≤0.01)

pour le lait LF2 et 23.65±0.09µM/mg (p≤0.01) pour le lait LF3.

Résultats

82

Figure 16 : Teneur en protéines totales (µg/mg de l’échantillon ) dans les laits LF1, LF2, LF3

et LS au cours de la fermentation à 45°C.

LS : Lait Stérile






$$$ : LF1 à T0 vs LF1 à T240 (p≤0.001)

*** : LF2 à T0 vs LF2 à T240 (p≤0.001)

£££ : LF3 à T0 vs LF3 à T240 (p≤0.001)

Nous remarquons :

- Qu’il n’y a aucune différence établie entre T0 et T240 du LS

- Que la différence est hautement significative (p≤0.001) entre T0 et T240 des laits LF1, LF2

et LF3

- La différence est aussi hautement significative (p≤0.001) entre LS et LF1, LF2 et LF3

- La diminution de la teneur en protéines totales est plus importante dans le lait LF1 par

rapport aux laits LF2 et LF3.

50

100

150

200

250

300

350

400

450

0 60 120 180 240

protéines totales (µg/mg)

Tps (min)

LS LF1 LF2 LF3

***

£££

$$$

Résultats

83

Figure 17 : Fonctions α-NH2 libérées (µM/mg de l’échantillon) au cours de la fermentation

des laits LF1, LF2, LF3 et LS à 45°C.

LS : Lait Stérile






Nous notons :

- Aucune différence significative établie entre T0 et T240 du LS

- Une différence hautement significative (p≤0.001) entre T0 et T240 des laits LF1, LF2 et

LF3

- La différence est hautement significative (p≤0.01) entre LS et LF1, LF2 et LF3

- La libération la plus élevée des fonctions α-NH2 est obtenue dans le lait fermenté LF1.

0

10

20

30

0 60 120 180 240

α-NH2 libérées (µM/mg)

Tps (min)

LS LF1 LF2 LF3

***

***

***

Résultats

84

2.3. Electrophorèse des protéines du lait stérile et des laits fermentés

L’aspect qualitatif de l’activité protéolytique des bactéries lactiques est montré par

l’électrophorèse des échantillons déshydratés des laits fermentés. La concentration en protéines

de l’échantillon (lait fermenté) est estimée approximativement par des bandes plus au moins

claires et l’intensité de la coloration bleue de la bande est fonction de la quantité de la protéine.

Le profil protéique des échantillons est comparé à celui du lait stérile obtenu dans les

mêmes conditions expérimentales et à des protéines natives de commerce de poids moléculaire

connu servant comme référence (Figure 18).

Résultats

85

Figure 18 : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide-Sodium dodécyl sulfate en gradient

(5-12%) des protéines des laits fermentés LF1, LF2, LF3 et LS à 45°C

Puit 1 : Protéines de référence

Puit 2 : Lait stérile (LS)

Puit 3 : (Lb) + (St)

Puit 4 : (Lb) pure

Puit 5 : (St) pure

L’analyse des résultats obtenus par électrophorèse montre :

- La présence d’une bande qui s’identifie aux protéines natives résiduelles.

- L’apparition dans le puit du lait stérile des bandes de différentes caséines avec des traces

identifiables à la β-Lg, l’α-La et la SAB.

- Pour les laits fermentés, nous remarquons que lorsque les deux espèces sont en

association dans le lait fermenté LF1, les différentes bandes de caséines, de la β-Lg et de

l’ α-La sont mois denses et claires par rapport aux puits 4 et 5 contenant les laits

fermentés par les bactéries prises individuellement (Lb, St) respectivement dans les laits

fermentés LF2 et LF3.

- Nous notons l’absence de la SAB dans les trois puits contenant les trois laits fermentés.

α-La (18,3KDa)

+

-

SAB (66,2KDa)

Caséine (19 à 25,2

Β-Lg (18,3KDa)

1 2 3 4 5

Résultats

86

3. Etude immunologique

3.1. Titrage des anticorps sériques IgG anti β-Lg

Une technique de dosage spécifique des anticorps a été utilisée pour mesurer la réponse

immunologique des souris après la colonisation de l’intestin par les laits fermentés et la

sensibilisation par voie orale au lait de vache. Il s’agit de la méthode ELISA qui permet

d’évaluer la réponse immune systémique par la mesure des titres IgG spécifiques dirigés contre

l’antigène sensibilisant la β-Lg.

Nos résultats montrent que, les souris sacrifiées au 18ème jour, ont différents titres en IgG

sériques anti β-Lg. Ces derniers sont de 1/4600ème, 1/6500ème, 1/4500ème et de 1/5600ème

respectivement chez les groupes intubés avec une solution saline, colonisés avec les laits LF1,

LF2 et LF3 (Figure 19). Les résultats obtenus sont comparés à ceux du témoin positif, intubé avec

une solution saline puis sensibilisé avec du lait de vache.

Les titres en IgG sériques anti β-Lg des souris colonisées par LF1, LF2 ou LF3 sont

significativement augmentées (p≤0.001) par rapport à celles intubées par la solution saline

(témoin positif). Par ailleurs, nous ne notons aucune différence significative des titres en IgG

entre les trois groupes. Les IgG sériques anti β-Lg ne sont pas détectables chez le groupe non

sensibilisé (témoin négatif).

Au 50ème jours, les titres en IgG sériques des souris sacrifiées sont de 1/46600ème,

1/2400ème, 1/3300ème et de 1/3400ème respectivement chez les groupes intubés avec la solution

saline, LF1, LF2 et LF3 et sensibilisés avec du lait de vache (Figure 20). Les résultats obtenus

révèlent une diminution hautement significative (p≤0.0001) des titres IgG sériques anti β-Lg

chez les trois lots de souris par rapport à celui obtenu chez le lot témoin positif qui a enregistré

une augmentation remarquable.

Résultats

87

Figure 19 : Titres en anticorps IgG sériques anti β-Lg mesurés chez les trois lots expérimentaux

de souris colonisées chacun par un type de lait fermenté et chez les groupes témoins

sacrifiés au 18ème jour.

TN : Témoin négatif, intubé avec solution saline et non sensibilisé

TP : Témoin positif, intubé avec solution saline puis sensibilisé au lait de vache

LF1 : Lait fermenté par Streptococcus salivarius subsp. thermophilus + Lactobacillus delbruekii

subsp. bulgaricus

LF2 : Lait fermenté par Lactobacillus delbruekii subsp. bulgaricus


Les valeurs indiquées sont des moyennes ± erreurs standard (n=6)

Nous notons que :

- Les IgG sériques anti β-Lg ne sont pas détectables chez le groupe témoin négatif.

- Les titres en IgG sériques, anti β-Lg chez les trois groupes de souris, sont plus élevés que

chez le groupe témoin positif.

- Les titres en IgG sériques anti β-Lg, chez les trois lots expérimentaux, sont hautement

significative élevés (p≤0.001) par rapport au témoin positif.

- La différence n’est pas significative en titres IgG sériques anti β-Lg entre les trois lots

expérimentaux.

0

1

2

3

4

5

6

TN TP LF1 LF2 LF3

IgG (Log1/titre))

Souris

** ** **

Résultats

88

Figure 20 : Titres en anticorps IgG sériques anti β-Lg mesurés chez les trois lots expérimentaux

de souris colonisés chacun par un type de lait fermenté puis sensibilisés au lait de vache

et chez les groupes témoin sacrifiés au 50ème jour.

TN : Témoin négatif, intubé avec solution saline et non sensibilisé

TP : Témoin positif, intubé avec solution saline et sensibilisé par le lait de vache

LF1 : Lait fermenté par Streptococcus salivarius subsp. thermophilus + Lactobacillus delbruekii

subsp. bulgaricus




Nous notons que :

- Les IgG sériques anti β-Lg ne sont pas détectables chez le groupe témoin négatif.

- Le titre en IgG sérique anti β-Lg chez le groupe témoin positif a augmenté par rapport à

ceux des trois groupes expérimentaux.

- Les titres en IgG sériques anti β-Lg chez les trois lots expérimentaux sont diminués d’une

façon hautement significative (p≤0.001) par rapport au lot témoin positif.

- La différence n’est pas significative en titres IgG sériques anti β-Lg entre les trois lots

expérimentaux.

0

1

2

3

4

5

6

7

TM TP LF1 LF2 LF3

IgG(Log 1/titre)

Souris

*** ***

***

Résultats

89

3.2. Etude, in vitro, de l’allergénicité résiduelle de la β-Lg et de l’α-La sur les

muqueuses de souris colonisées par les bactéries du yaourt puis sensibilisées au lait

de vache

L’objectif de cette partie de notre travail est de vérifier l’existence d’une éventuelle

réponse anaphylactique locale, en chambre de Ussing, après stimulation de la muqueuse jéjunale

des souris sensibilisées au lait de vache.

Pour rappel, le dispositif de la chambre de Ussing permet de mesurer les paramètres

électrophysiologiques: courant de court-circuit (Isc, µA/cm2), différence de potentiel (DDP, mV)

et la conductance (G, mmho/cm2) qui exprime un index de l’intégrité épithéliale, en particulier

au niveau des jonctions cellulaires. Il est à noter que dans ces tests, chaque tissu représente son

propre témoin. Il est impératif de n’effectuer des mesures de perméation qu’une fois l’état

stationnaire des trois paramètres électriques est rétabli, soit 20 à 30min après le montage des

tissus ; ensuite les différents paramètres sont recueillis après dépôt de la protéine sensibilisante

dans le compartiment séreux pendant 15min.

3.2.1. Effet de la β-Lg, de l’α-La et du LF1 sur le courant de court circuit (Isc)

Après stimulation des fragments jéjunaux des souris sensibilisées au lait de vache (témoin

positif), ainsi que, les souris colonisées par LF1 et sensibilisées au lait de vache (1er lot) montés

en chambre de Ussing par 10µg/ml pour les protéines sensibilisantes (β-Lg et l’α-Lac) et

20µg/ml pour le lait fermenté (LF1) les résultats obtenues n’enregistrent aucune différence

significative dans les valeurs de l’Isc pour la β-Lg, l’α-La et LF1 chez les souris du 1er lot, les

valeurs restent plus au moins stables pendant tout le temps de la stimulation en passant de

31.95±4.09µA/cm2 à 33±4.28µA/cm2 pour la β-Lg et de 55.67±4.24µA/cm2 à

59.37±4.05µA/cm2 pour l’α-La et de 53.91±3.38µA/cm2 à 57.02±3.42µA/cm2 pour LF1.

Comparées avec les valeurs de l’Isc obtenues chez le groupe témoin, nous avons noté une

augmentation hautement significative de ces dernières (p≤0.001) qui passent des valeurs de bases

de 37.65±3.41µA/cm2 à 57.57±3.39µA/cm2 pour la β-Lg, de 47.57±0.83µA/cm2 à

61.53±1.42µA/cm2 pour l’α-La et de 38.34±2.90µA/cm2 à 44.59±2.82µA/cm2 pour LF1 (Figure

21).

Ces résultats suggèrent l’existence :

- Chez le 1er lot, d’une induction à une tolérance orale due à la colonisation du tube digestif

par les bactéries du yaourt. Nous pouvons considérer, d’après nos résultats, que le yaourt

est un lait hypoallérginique.

- Chez le lot témoin, d’une réaction anaphylactique locale qui est due à l’interaction

directe des anticorps sensibilisants avec le système immunitaire associe au tube digestif

et à la protéine.

Résultats

90

3.2.2. Effet de la β-Lg, de l’α-La et du LF1 sur la différence de potentiel (DDP)

Après montage des fragments jéjunaux et leurs stimulations avec soit la β-Lg, l’α-La ou

le lait fermenté LF1, les valeurs obtenues ne révèlent aucune variation significative de la DDP

tout au long de l’expérimentation (Figure 22).

3.2.3. Effet de la β-Lg, de l’α-La et du LF1 sur la conductance (G)

Les valeurs de la conductance, mesurées après dépôt des protéines sensibilisantes (β-Lg

et α-La) ainsi que le yaourt (LF1) dans le compartiment séreux sont représentées dans la figure

23. Ces valeurs n’indiquent aucune différence significative que se soit de la β-Lg, de l’ α-La ou

bien de LF1 chez le 1er lot (colonisé avec le yaourt puis sensibilisé au lait de vache). En revanche,

les valeurs de G indiquent une augmentation hautement significative (p≤0.001) de la β-Lg, de

l’ α-La et de LF1 chez lez souris sensibilisées au lait de vache (lot témoin positif).

A T0, lors du dépôt de l’antigène, les valeurs de base de G chez le lot témoin sont de:

19.15±0.72mmho/cm2, 15.90±1.45mmho/cm2 et 16.27±1.30mmho/cm2, respectivement pour la

β-Lg, l’α-La et LF1.

A T15, les valeurs de G atteignent un maximum de 28.82±2.06mmho/cm2 pour la β-Lg

(p≤0.001), 20.61±1.97mmho/cm2 pour l’α-La (p≤0.001) et 19.69±1.47mmho/cm2 pour LF1

(p≤0.001).

L’augmentation de la conductance chez le lot témoin qui est l’index de l’intégrité

épithéliale nous renseigne sur l’état de l’épithélium intestinal des souris sensibilisées au lait de

vache, suggérant une atteinte des jonctions de leur épithélium intestinal. Contrairement aux

souris colonisées avec LF1 (yaourt) dont nous avons enregistré des valeurs plus au moins stables

tout au long de l’expérimentation. Les résultas obtenus, nous ont permis de conclure que

l’intégrité de l’épithélium intestinal a été conservée durant la période de notre protocole.

Résultats

91

Figure 21 : Effet de la β-Lg, de l’α-La et de LF1, sur le courant de court circuit (Isc)

mesuré en chambre de Ussing, sur des fragments jéjunaux des souris sensibilisées

au lait de vache, par voie orale.

Les valeurs exprimées sont des moyennes et leur erreur standard. (n = 6)

Avant stimulation, les valeurs de l’Isc sont recueillies pendant 20min.

A T=0, l’antigène sensibilisant (β-Lg, α-La et LF1) est déposé dans le versant séreux aux

concentrations respectives de 10µg/ml, 10µg/ml et 20µg/ml.

Nous notons :

- Aucune différence significative de l’Isc entre T0 et T15 pour la β-Lg, l’α-La et LF1 chez

le 1er lot colonisé par les bactéries du yaourt et sensibilisé au lait de vache par voie orale.

- La différence de l’Isc est hautement significative (***p ≤0.001) entre T0 et T15 pour les

deux protéines sensibilisantes (β-Lg, et α-La) et le lait fermenté LF1 chez le lot témoin

sensibilisé au lait de vache par voie orale.

0

20

40

60

80

-20 -15 -10 -5 0 5 10 15

Isc (µA/cm2)

Tps (min)

β-Lg Témoi β-Lg α-La Témoin α-La LF1 Témoin LF1

Antigène

- 20

Résultats

92

Figure 22 : Effet de la β-Lg, de l’α-La et de LF1, sur la différence de potentiel (DDP)

mesurée en chambre de Ussing, sur des fragments jéjunaux des souris sensibilisées



Avant stimulation, les valeurs de la DDP sont recueillies pendant 20min.



Nous notons :

- Aucune différence significative de la DDP entre T0 et T15 pour la β-Lg, α-La et LF1 chez

le 1er lot colonisé par les bactéries du yaourt puis sensibilisé au lait de vache par voie

orale, ainsi que chez le lot témoin.

0

2

4

-20 -15 -10 -5 0 5 10 15

DDP (mV)

Tps (min)

β-Lg Témoin β-Lg α-La Témoin α-La LF1 Témoin LF1

Antigène

- 20

Résultats

93

Figure 23 : Effet de la β-Lg, de l’α-La et de LF1, sur la conductance (G)




Avant stimulation, les valeurs de G sont recueillies pendant 20 min.



Nous notons :

- Aucune différence significative de G entre T0 et T15 pour la β-Lg, l’α-La et LF1 chez le

1er lot colonisé par les bactéries du yaourt puis sensibilisé au lait de vache par voie orale.

- La différence de G est hautement significative (***p≤0.001) entre T0 et T15 pour les deux

protéines sensibilisantes (β-Lg, et α-La) et le lait fermenté LF1 chez le lot témoin

sensibilisé au lait de vache par voie orale.

0

20

40

-20 -15 -10 -5 0 5 10 15

G (mmho/cm2)

Tps (min)

β-Lg Témoin β-Lg α-La Témoin α-La LF1 Témoin LF1

Antigène

- 20

Résultats

94

3.2.4. Etude comparative, des paramètres physiologiques mesurés, exprimés par les

trois laits fermentés LF1, LF2 et LF3

3.2.4.1 . Effet de LF1, LF2 et LF3 sur l’Isc

La stimulation, des fragments jéjunaux montés en chambre de Ussing de souris

sensibilisées au lait de vache par 20µg/ml pour chaque lait fermenté, a produit une augmentation

hautement significative de l’Isc (p≤0.001) entre le début et la fin de l’expérimentation (Figure

24).

A T0, les valeurs de base de l’Isc sont de 38.34±2.90µA/cm2, 54.05±4.27µA/cm2 et

49.82±4.07µA/cm2 respectivement pour LF1, LF2 et LF3.

A T15, les valeurs de l’Isc sont de : 44.59±2.82µA/cm2 pour LF1, 70.14±5.64µA/cm2 pour

LF2 et de 66.51±4.96µA/cm2 pour LF3.

3.2.4.2. Effet de LF1, LF2 et LF3 sur la DDP

Après montage des fragments jéjunaux et leurs stimulations avec un des laits fermentés

(LF1, LF2 ou LF3), aucune variation significative de la DDP n’a été observée tout au long de

l’expérimentation (Figure 25).

3.2.4.3. Effet de LF1, LF2 et LF3 sur la conductance (G)

Les valeurs de la conductance ont été mesurées après le montage des fragments jéjunaux

en chambre de Ussing et leur stimulation par le dépôt de un des laits fermentés sont rapportées

dans la figure 26.

A T0, les valeurs de base sont de 16.27±1.30mmho/cm2 pour LF1, 21.30±0.80mmho/cm2

pour LF2 et 21.53±1.92mmho/cm2 pour LF3.

Après 15 min de l’expérimentation, les valeurs enregistrées sont: 19.69±1.47mmho/cm2,

28.48±0.95mmho/cm2 et 25.93±2.33mmho/cm2, respectivement pour LF1, LF2 et LF3.

Résultats

95

Figure 24 : Effet de LF1, LF2 et LF3 sur le courant court circuit (Isc)

mesuré en chambre de Ussing, sur des fragments jéjunaux des souris sensibilisées

au lait de vache par voie orale


*p≤0.05

**p ≤0.01

***p ≤0.001

Avant stimulation, les valeurs de l’Isc sont recueillies pendant 20 min.

A T0 l’antigène sensibilisant (LF1, LF2 ou LF3) est déposé dans le versant séreux à la

concentration de 20µg/ml.

Nous notons :

- Que la différence de l’Isc est hautement significative (p≤0.001) entre T0 et T15 pour

chaque lait fermenté.

- La différence de l’Isc à T15 est très significative (p≤0.01) entre LF1 et LF2, ainsi que entre

LF1 et LF3.

- La différence de l’Isc à T15 est significative (p≤0.05) entre LF2 et LF3.

0

40

80

-20 -15 -10 -5 0 5 10 15

Isc (µA/cm2)

Tps (min)

LF1 LF2 LF3

Antigène

***

***

***

******

***

**

******

**

*

*

- 20

Résultats

96

0

1,5

3

-20 -15 -10 -5 0 5 10 15

Tps (min)

DDP (mV)LF1 LF2 LF3

Antigène

- 20

Figure 25 : Effet de LF1, LF2 et LF3 sur la différence de potentiel (DDP)


au lait de vache par voie orale.


Avant stimulation, les valeurs de la DDP sont recueillies pendant 20 min.

A T0 l’antigène sensibilisant (LF1, LF2 ou LF3) est déposé dans le versant séreux à la


Nous notons :

- Aucune différence significative de la DDP entre T0 et T15 pour LF1, LF2 et LF3 chez le

groupe de souris sensibilisées au lait de vache par voie orale.

Résultats

97

Figure 26 : Effet de LF1, LF2 et LF3 sur la conductance (G)


au lait de vache par voie orale.


*p≤0.05

**p ≤0.01

***p ≤0.001

Avant stimulation, les valeurs de G sont recueillies pendant 20 min.

A T0 l’antigène sensibilisant (LF1, LF2 ou LF3) est déposé dans le versant séreux, à la


Nous notons que :

- La différence de G est hautement significative (p≤0.001) entre T0 et T15 pour LF1 et LF2.

- La différence de G est très significative (p≤0.01) entre T0 et T15 pour LF3.

- La différence de G à T15 est très significative (p≤0.01) entre LF1 et LF2, ainsi que entre

LF1 et LF3.

- La différence de G à T15 est significative (p≤0.05) entre LF2 et LF3.

Conclusion

0

10

20

30

40

-20 -15 -10 -5 0 5 10 15

G (mmho/cm2)

Tps (min)

LF1 LF2 LF3

Antigène

****

*

**

**

**

**

**

***

***

***

***

- 20

Résultats

98

D’après les valeurs obtenues pour les laits fermentés LF1, LF2 et LF3, nous remarquons

que l’Isc et G ont enregistré une légère augmentation pour LF1 (yaourt) par rapport à LF2 et LF3;

ces résultats nous permettent de dire que le lait LF1, fermenté par l’association des deux bactéries

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb) et Streptococcus salivarius subsp. thermophilus

(St), qui sont connues comme étant les espèces principales pour la fabrication du yaourt, est le

lait qui a donné les valeurs électrophysiologiques les plus basses. Ces valeurs montrent que la

protéolyse incomplète des protéines sensibilisantes ainsi que de leurs fragments au cours de la

fermentation révèle l’existence d’une réponse anaphylactique locale amoindrie, en chambre de

Ussing, après stimulation de la muqueuse jéjunale des souris sensibilisées au lait de vache.

L’allergénicité résiduelle des protéines antigéniques et de leurs fragments contenus dans le

yaourt nous permet de dire que c’est un lait hypoallérginique.

3.2.5. Effet du glucose

Pour vérifier l’intégrité structurale des fragments jéjunaux et leurs propriétés

physiologiques lorsqu’ils sont exposés aux protéines stimulantes, nous avons testé l’effet du

glucose sur les versants muqueux et séreux des tissus à la fin de chaque expérience réalisée en

chambre de Ussing. Le glucose a été déposé à la concentration de 10mM. Les résultats que nous

avons obtenus (Figure 27) montrent une augmentation nette et très significative de l’Isc (p≤0.01).

Les valeurs indiquent que les tissus étaient bien conservés et qu’ils ont gardé leur intégrité

structurale et fonctionnelle.

Résultats

99

Figure 27 : Effet du glucose sur l’évolution du courant de court circuit (Isc) mesuré en chambre

de Ussing sur des fragments jéjunaux des souris sensibilisées par voie orale


*p≤0.05

**p ≤0.01

***p ≤0.001

Le glucose est ajouté à la fin de l’expérience afin de vérifier l’intégrité des tissus de

souris colonisées par le yaourt puis sensibilisées au lait de vache et stimulées par la β-Lg, l’α-La

et le lait fermenté LF1.

Nous notons une augmentation de l’Isc hautement significative (p≤0.001) pour les trois

protéines sensibilisantes testées après l’ajout du glucose. Ce résultat signifie que l’intégrité des

tissus de souris a été conservée tout au long de l’expérimentation.

0

20

40

60

80

100

-20 -15 -10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35

Isn (µA/cm2)

Tps (min)

β-Lg α-La LF1

*****

***

***

***

***

***

*****

*

**

**

- 20

Glucose

Résultats

100

3.3. Etude histologique de l’intestin des souris colonisées avec les laits fermentés

comparées à celles sensibilisées au lait de vache

Cette partie de notre travail a pour objectif de vérifier les conséquences de la colonisation

de l’intestin par les bactéries ayant servi à la préparation des laits fermentés, sur la structure de

l’épithélium intestinal, particulièrement, au niveau de l’architecture des villosités, ainsi que, sur

la composition en lymphocytes intra-épithéliaux.

3.3.1. Effet de la colonisation du tube digestif par les bactéries du yaourt sur la

structure de la muqueuse intestinale des souris sacrifiées au 18ème jour

L’aspect de la muqueuse intestinale des souris témoins négatif et positif intubées avec

une solution saline, observé au microscope optique, révèle un aspect régulier avec formation de

nombreuses projections en doigts de gants ; il s’agit des villosités séparées par des sillons

intervilleux communiquant et dans le fond desquels s’ouvrent les glandes de Liberkühm (Figures

28, 30).

L’aspect de la muqueuse intestinale des souris ayant subi une colonisation avec un des

laits fermentés (Figures 32, 34, 36), n’indique aucune différence dans la structure de la

muqueuse intestinale du point de vue histologique. Sur le plan structural, les villosités sont

longues, fines et bordées par un épithélium simple, unistratifié, cylindrique. Il est formé

essentiellement de hautes cellules à plateau strié possédant des noyaux réguliers en position

basale qui correspondent aux entérocytes.

Le chorion est d’aspect fibreux et apparaît polymorphe possédant divers éléments

mononuclés, peu abondants et qui correspondent à des cellules du système immunitaire: les

lymphocytes.

3.3.2. Effet de la sensibilisation par le lait de vache sur la structure de la muqueuse

intestinale des souris sacrifiées au 50ème jour

L’aspect de la muqueuse intestinale, des souris témoin négatif intubées avec une solution

saline durant 50 jours, n’indique aucune différence dans la structure de la muqueuse intestinale.

Sur le plan structural, la hauteur des villosités est restée plus au moins stable durant la période de

l’expérimentation avec un contour régulier (Figure 29).

La muqueuse intestinale des souris ayant subi une intubation intra gastrique avec une

solution saline puis sensibilisées au lait entier de vache, présentent une atrophie villositaire

partielle (Figure 31), avec un élargissement accentué des villosités jéjunales, bordées par un

épithélium pseudostratifié et une infiltration très prononcée des lymphocytes intra-épithéliaux,

ainsi qu’un décollement partiel de l’épithélium du chorion. La hauteur villositaire a marqué une

diminution très significative chez ce groupe témoin positif par rapport à celle du groupe témoin

négatif et des autres groupes expérimentaux.

Résultats

101

Les souris ayant subi une colonisation bactérienne par les ferments du yaourt, intubées

avec le lait LF1 puis sensibilisées au lait de vache, ne montrent aucune différence sur le plan

structural ; la muqueuse intestinale est comparable à celle du groupe témoin négatif et la hauteur

des villosités n’indique aucune différence significative avec celle du groupe témoin. La figure 33

indique très clairement l’unistratification de l’épithélium avec des villosités longues, fines et

l’infiltration lymphocytaire est très peu marquée.

L’aspect de la muqueuse intestinale des souris colonisées par les laits fermentés LF2 et

LF3 puis sensibilisées au lait entier de vache, est comparable à celui des souris intubées par le

yaourt. Les villosités sont moins longues et fines, l’infiltration lymphocytaire est peu marquée,

leur hauteur villositaire indique une différence significative par rapport au groupe témoin négatif.

Résultats

102

Figure 28 : Observation microscopique (G x 10) d’un fragment de jéjunum coloré à

l’hémalun-écosine d’une souris témoin négatif sacrifiée au 18ème jour


l’hémalun-écosine d’une souris témoin négatif sacrifiée au 50ème jour

Chez ce groupe témoin négatif, l’épithélium intestinal est unistratifié et les villosités sont

longues et fines.

Villosité

Cellules caliciformes

Chorion

Résultats

103


l’hémalun-écosine d’une souris témoin positif intubée avec une solution saline

sacrifiée au 18èmejour


l’hémalun-écosine d’une souris témoin positif intubée avec une solution saline puis sensibilisée

au lait entier de vache sacrifiée au 50ème jour

Les villosités intestinales sont élargies bordées d’un épithélium pseudostratifié. Une hyperplasie

des cryptes est marquée avec un décollement accentué du chorion. L’infiltrat lymphocytaire est

dense.

Décollement du chorion

Infiltration des LIE

Plaque de Peyer avec un nombre

élevé des lymphocytes

Résultats

104


l’hémalun-écosine d’une souris colonisée avec le lait LF1 sacrifiée au 18ème jour


l’hémalun-écosine d’une souris colonisée avec le lait LF1 puis sensibilisée au lait entier de vache

sacrifiée au 50ème jour

Résultats

105

L’unistratification de l’épithélium avec des villosités longues, fines et l’infiltration

lymphocytaire est très peu marquée.






Résultats

106

Les villosités sont moins longues et fines par rapport au témoin négatif, l’infiltration

lymphocytaire est partiellement marquée.






Début d’un décollement

Infiltration lymphocytaire

Résultats

107

Les villosités sont légèrement élargies, moins longues et fines. Un début d’un décollement du

chorion avec un infiltrat lymphocytaire peu marqué.

3.3.3. Evaluation de la hauteur villositaire intestinale des souris

Au 18ème jour, la hauteur villositaire des souris témoin négatif et positif; intubées avec

une solution saline est respectivement de 56.2 ± 0.81µm, 55 ± 0.52µm, pour les trois groupes

expérimentaux, colonisés chacun par un des laits fermentés LF1, LF2 et LF3 ; la hauteur des

villosités intestinales est respectivement de 58.5 ± 0.48µm pour LF1, 46 ± 0.80µm pour LF2 et

53.4 ± 0.91µm pour LF3 (Figure 38).

La figure 39 montre l’évaluation de la hauteur des villosités intestinales des souris

sacrifiées au 50ème. Après la sensibilisation des souris au lait de vache, la hauteur villositaire chez

les groupes témoins négatif et positif est respectivement de 54.9 ± 0.81µm et 41.2 ± 1.32µm.

Chez les groupes expérimentaux, la sensibilisation au lait de vache a diminué la hauteur

villositaire ; elle est de 52.7 ± 0.98µm pour le lot LF1, 39.3 ± 0.65µm pour le lot LF2 et

48.3±0.98µm pour le lot LF3.

Résultats

108

Figure 38 : Evaluation de la hauteur villositaire des fragments jéjunaux des souris colonisées

avec les laits fermentés comparée à celle des souris témoins négatif et positif

sacrifiées au 18ème jour

n : nombre d’animaux

TN : Témoin négatif ; intubé avec solution saline et non sensibilisé

TP : Témoin positif ; intubé avec solution saline et sensibilisé par le lait de vache

LF1 : Lait fermenté par Streptococcus salivarius subsp. thermophilus +Lactobacillus delbruekii

subsp. bulgaricus




Nous notons :

- Aucune différence significative entre les groupes témoin négatif et positif

- La différence de la hauteur des villosités des souris est significative (p≤0.05) entre le

groupe témoin négatif et le groupe de souris colonisé avec LF1

- La différence de la hauteur villositaire des souris colonisées avec LF2 est hautement

significative (p≤0.001) et elle est très significative (p≤0.01) chez le groupe de souris

colonisées avec LF3 comparée a celle du témoin négatif.

- La différence de la hauteur des villosités est très significative (p≤0.01) entre le groupe de

souris colonisées avec LF1 par rapport au groupe colonisé avec LF2

0

20

40

60

TN TP LF1 LF2 LF3

Hauteur des villosités (µm)

Souris

**

***

**

Résultats

109

Figure 39 : Evaluation de la hauteur villositaire des fragments jéjunaux des souris colonisées

avec les laits fermentés puis sensibilisées au lait de vache comparée à celle des souris témoins

négatif et positif sacrifiées au 50ème jour.


n : nombre d’animaux

TN : Témoin négatif ; intubé avec solution saline et non sensibilisé

TP : Témoin positif ; intubé avec solution saline et sensibilisé par le lait de vache

LF1 : Lait fermenté par Streptococcus salivarius subsp. thermophilus +Lactobacillus delbruekii

subsp. bulgaricus



Après la sensibilisation au lait de vache, nous notons :

- La diminution de la hauteur des villosités est hautement significative (p≤0.001) chez le

groupe de souris témoin positif ; intubées avec une solution saline puis sensibilisées au

lait de vache, comparée à celle des souris témoin négatif intubées avec une solution saline

durant la période expérimentale

0

20

40

60

TN TP LF1 LF3 LF3

Hauteur des villosités (µm)

Souris

***

***

***

*

Résultats

110

- La diminution de la hauteur des villosités des souris colonisées avec les laits LF2 et LF3

puis sensibilisées au lait de vache est hautement significative (p≤0.001) par rapport à

celle du groupe témoin négatif

- La diminution de la hauteur des villosités des fragments jéjunaux des souris colonisées

avec du yaourt (LF1) puis sensibilisées au lait de vache est significative (p≤0.05) par

rapport à la hauteur des villosités des souris témoin négatif

Conclusion

Nos résultats indiquent que le meilleur modèle des trois laits fermentés testés est le lait

LF1, contenant les deux principales souches bactériennes pour la fabrication du yaourt. Le

groupe de souris colonisées avec le yaourt a conservé la structure de la muqueuse intestinale,

dont nous avons enregistré une hauteur villositaire remarquable et peu comparable avec celle du

groupe témoin négatif, dont l’observation microscopique a révélé des villosités longues et fines

avec une infiltration lymphocytaire partiellement absente.

Résultats

111

3.3.4. Dénombrement des lymphocytes intra-épithéliaux (LIE)

Le dénombrement des lymphocytes intra-épithéliaux permet de comparer le nombre de

ces derniers dans les différents échantillons d’intestin. Un nombre élevé des lymphocytes intra-

épithéliaux est un signe d’inflammation.

Le dénombrement des lymphocytes, c’est avéré difficile dans nos coupes histologiques

vu la petite taille des villosités des fragments jéjunaux, comparé à celui réalisé chez des rats ou

des lapins. Le nombre des lymphocytes intra-épithéliaux a été estimé approximativement en

pourcentage dans les différents fragments jéjunaux et nous avons comparé ce nombre en

pourcentage (%) à celui des souris témoin négatif.

3.3.4.1. Dénombrement des lymphocytes intra-épithéliaux chez les souris sacrifiées au

18ème jour

Les lymphocytes sont normalement présents dans l’épithélium de surface, ainsi que dans

le chorion. Sur l’ensemble de nos figures, nous remarquons que, l’infiltration lymphocytaire

varie selon la nature des solutions d’intubation et les fragments jéjunaux mis en contact ou non

avec l’antigène sensibilisant.

Nous notons que, le nombre des LIE des souris du groupe témoin positif est comparable à

celui du groupe de souris témoin négatif.

Chez le groupe de souris colonisées avec le lait fermenté LF1 (yaourt), le nombre des LIE

est proche de celui des souris témoin négatif, soit 2% de plus, ce qui signifie qu’il n’y a pas de

différence entre ces deux groupes.

Chez les deux groupes de souris colonisées chacun avec l’un des laits : LF2 ou LF3, le

nombre des LIE est peu abondant ; nous dénombrons 5% de plus de LIE infiltrées chez le groupe

colonisé par LF2 et 4% de plus de LIE infiltrées chez le groupe colonisé avec LF3 par rapport aux

lymphocytes des souris témoin négatif.

3.3.4.2. Dénombrement des lymphocytes intra-épithéliaux chez les souris sacrifiées au

50ème jour

L’intubation des souris avec une solution saline puis leur sensibilisation au lait de vache,

provoque non seulement une atrophie partielle des villosités, mais également une augmentation

considérable des lymphocytes intra-épithéliaux, soit 80% de LIE supplémentaires, comparée aux

lymphocytes du groupe témoin négatif. Nous avons remarqué également qu’il existe une

différence dans le nombre des LIE dans les tissus des trois groupes de souris expérimentaux,

colonisées avec l’un des laits (LF1, LF2 ou LF3) puis sensibilisées au lait de vache et les tissus du

groupe de souris intubées avec une solution saline puis sensibilisées au lait de vache (témoin

positif).

Résultats

112

Nous remarquons que, le nombre des lymphocytes des souris colonisées avec LF1

(yaourt) puis sensibilisées au lait de vache est voisin du nombre des lymphocytes des souris non

sensibilisées (témoin négatif), soit 2% de LIE supplémentaires.

Le nombre de lymphocytes intra-épithéliaux des souris colonisées avec le lait LF2 puis

sensibilisées au lait de vache est augmenté de 7% par rapport aux lymphocytes des souris non

sensibilisées.

Chez le dernier lot des souris expérimentales, colonisées avec le lait fermenté LF3 puis

sensibilisées au lait de vache, nous notons que, le nombre de lymphocytes intra-épithéliaux a peu

augmenté, soit 6% de plus par rapport aux lymphocytes des souris non sensibilisées, témoin

négatif.

DISCUSSION

Discussion

113

Depuis une époque immémoriale, l’Homme a mis à profit les principes de la fermentation

afin de conserver ses aliments, qu’ils soient à base de lait, de viande, de fruits ou de légumes. En

fait, bien avant que l’on soupçonne leur présence, les microorganismes étaient employés pour la

fabrication de produits fermentés, tels la choucroute, le yaourt et les fromages.

De nos jours, les probiotiques font l'objet de recherches intensives et on trouve de plus en

plus de preuves démontrant la variabilité des effets bénéfiques associés à la consommation de ces

microorganismes. Ces effets peuvent être répartis en deux groupes: des effets bénéfiques sur

l'équilibre de la microflore intestinale et des effets thérapeutiques.

Ce travail a été entrepris dans le but d’étudier l’effet protecteur des bactéries du yaourt

sur la muqueuse intestinale par deux modes d’action :

- Le premier mode d’action, est que les bactéries du yaourt stimulent l’induction de la

tolérance orale, en dégradant la β-Lactoglobuline.

- Le deuxième mode d’action, est que les bactéries du yaourt stimulent l’induction de la

tolérance orale, en inhibant la prolifération lymphocytaire.

Ce travail est subdivisé en trois parties :

Dans la première partie microbiologique, les souches que nous avons utilisé dans

l’expérimentation sont les deux bactéries principales pour la fabrication du yaourt, qui sont :

Streptococcus salivarius subsp. thermophilus (St) et Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

(Lb). Ces bactéries ont été ré-identifiées selon la forme de colonies, l’aspect des cellules, la

coloration de Gram et le test de catalase (Scardovi, 1986 ; Curk et al., 1994 ; Zirnstein &

Hutkins, 2000 ; Badis et al., 2004). Elles ont été utilisées en association dans le but de diminuer

le temps de fermentation (Garro et al., 2004) et il a été prouvé que des interactions entre les

bactéries lactiques provoquaient des effets stimulateurs sur la croissance et des effets

métaboliques (Altieri et al., 2008).

L’évaluation de la croissance bactérienne dans les laits fermentés, a révèlé que les

souches utilisées sont des probiotiques munies d’une activité protéolytique et acidifiante (Shihata

& Shah, 2000 ; Chekroun, 2005). La croissance bactérienne est importante et plus rapide en

culture mixte dans le lait LF1, comparée aux cultures pures dans les laits LF2 et LF3. Nos

résultats sont en accord avec ceux obtenus par Badis et al., 2004 ; Chekroun et al., 2006 ; 2007,

qui expliquent la présence d’une synergie entre les bactéries en culture mixte.

Les concentrations viables des bactéries, évaluées tout au long de la fermentation,

n’évaluent pas de la même manière, car la croissance de ces bactéries diffère selon le mode de

culture (Abu Tarbouch et al., 1998 ; Gomes et al., 1998 ; Langella et al., 2001; Garro et al.,

2004 ; Chekroun, 2005; Husinger, 2005).

Discussion

114

Après la colonisation intestinale de chaque lot de souris par un type de lait fermenté (LF1,

LF2 et LF3) pendant la période expérimentale déterminée dans notre protocole, la survie des

ferments du yaourt ingérés vivants était différente selon le type de lait fermenté.

Pour exercer une influence positive sur l’organisme, les probiotiques doivent être

ingérées vivantes, en quantités suffisantes et être capable à résister contre le stress acide de la

partie supérieure du tube digestif (Kurshand soundergaard, 2005). La survie des souches

bactériennes ingérées vivantes est indispensable pour que le yaourt soit utilisé à des fins

probiotiques ; elles doivent être présentes dans le tube digestif à un niveau supérieur ou égal à

5.107ufc/ml (Moreau et al., 1994).

Les résultats du dénombrement des espèces bactériennes sur les milieux de culture

spécifique, que nous avons effectué après 18 jours, dans la muqueuse intestinale et dans les fèces

fraîches de souris colonisées avec le lait fermenté LF1 (culture mixte des deux espèces),

confirment la survie des bactéries ingérées pendant leur passage dans le tube digestif. Nos

résultats sont en accord avec ceux obtenus par Besnier et al., 1983 et Moreau et al., 1994, qui ont

constaté une augmentation progressive des bactéries lactiques pendant la durée de consommation

du yaourt ; le nombre de (St) et (Lb) diminue d’une manière significative (p≤0.05) après l’arrêt

de la consommation de ce lait fermenté. Ces résultats ont été confirmé par d’autres chercheurs

dont Brigidi et al. (2003), qui ont retrouvé le ferment du yaourt dans les fèces d’animaux à des

concentrations de 105-6 ou 106-7ufc/g, avec une élimination fécale plus rapide de (Lb).

Dans la deuxième partie, nous avons fait une étude biochimique des laits fermentés

préparés. Au cours de la fermentation du lait de vache (écrémé et stérile) à 45°C, les bactéries

hydrolysent le lactose en glucose et en galactose grâce à la β-galactosidase (Zourari et al., 1992 ;

Tamine et al., 1995) ; ensuite, le glucose utilisé comme source d’énergie est rapidement

métabolisé en acide lactique qui abaisse le pH du milieu et précipite les caséines. La

fermentation entraine des modifications physiques, chimiques et organoleptiques du produit

(Zirnstein & Hutkins, 2000 ; Lorient, 2001 ; Amiot, 2002 ; Considine et al., 2007). L’obtention

d’un lait caillé marque la fin de la fermentation (Stadhouders, 1986).

Les bactéries du yaourt ont le pouvoir d’hydrolysé 90% de lactose (Marteau et al., 1990),

ce qui explique les différences de l’acidité titrable et du pH qui sont observées entre les laits LF1,

LF2 et LF3 comparés au lait stérile (témoin). A la fin de la fermentation, la production d’acide

dans le lait témoin demeure significativement inférieure à celle des laits LF1, LF2 et LF3. Ces

résultats sont en accord avec ceux obtenus par Chekroun, 2005, sachant que la production

d’acide est étroitement liée à la présence et à la croissance des bactéries dans le lait (Hadadji &

Bensoltane, 2006).

Discussion

115

La quantité d’acide produite par le lait LF1 est supérieure à celle des laits LF2 et LF3

fermentés par une seule espèce bactérienne, ce qui confirme que l’association des deux souches

(ferment du yaourt) est un bon exemple car chaque souche tire bénéfice de l’autre réalisant ainsi

une symbiose (Moon & Reinbold, 1976).

La production d’acide entraîne une diminution du pH du lait qui a un effet modulateur sur

la croissance des bactéries au cours de la fermentation et limite la croissance des germes

pathogènes tel que, E. coli ; Staphylococcus aureus et Bacillus cereus (Gilliland, 1985b ; Payne

et al., 1999; Rouissat & Bensoltane,2006).

Nos résultats montrent que le pH des laits fermentés est diminué au cours du temps de la

fermentation comparé a celui du lait stérile sans ferment ; cette baisse du pH est expliquée par la

croissance des cultures bactériennes. La baisse du pH du lait LF1 est significative comparée à

celle des laits LF2, LF3 et du lait stérile ; les résultats obtenus nous permettent de dire que la

diminution du pH est plus importante lorsque les souches sont mises en association que

lorsqu’elles sont cultivées individuellement c'est-à-dire en culture pure. Nos résultats sont en

accord avec ceux obtenus par Chekroun, 2005.

Selon Bahna & Gandhi (1983), les protéines du lait de vache sont sensibles différemment

à la chaleur ; les caséines sont les plus résistantes, la sérum albumine bovine est la plus sensible.

La stérilisation à 105°C ne réduit pas le taux de protéines du lait (Lorient, 2001 ; Pougheon,

2001 ; Chekroun, 2005) et d’après les mêmes auteurs, il n’y a pas de différence entre le taux de

protéines du lait cru et celui du lait stérile.

Une cinétique de l’évaluation de l’activité protéolytique des bactéries lactiques a été

réalisée sur des échantillons lyophilisés des laits fermentés LF1, LF2 et LF3 au cours de la

fermentation. Les taux de protéines totales ; trouvés dans chaque lait fermenté préparé, montrent

que l’activité protéolytique des bactéries mises en association est plus importante dans le lait

LF1 que dans les laits LF2 et LF3 fermentés avec une seule espèce prise individuellement. Ce

pouvoir est spécifique pour chaque bactérie qui possède une aptitude propre à dégrader la

protéine intacte. D’autre part, les enzymes d’origine bactérienne sont utilisées pour la production

de formules infantiles (Fritsché, 2003). Cependant l’activité protéolytique des bactéries lactiques

au cours de la fermentation est une voie importante pour la dégradation des protéines du lait.

Discussion

116

La meilleure protéolyse des protéines est obtenue par la culture mixte des ferments du

yaourt : Streptococcus salivarius subsp. thermophilus et Lactobacillus delbrueckii subsp.

bulgaricus,, comparée à celle des cultures pures des laits fermentés LF2 et LF3 ; cette protéolyse

peut s’expliquer par l’existence d’une synergie entre les deux bactéries (Tamine, 1995 ; Abu

Tarabuche et al., 1998 ; Gomes, 1998 ; Payne et al., 1999). L’activité protéolytique des

lactobacilles est de plus en plus étudiée pour son importance dans la fabrication du yaourt et le

fromage (Bintsis et al., 2003). Une activité dipeptidasique élevée est démontrée par toutes les

souches bactériennes, en particulier, L. delbrueckii ssp. bulagricus, L. acidophilus et

Bifidobactérium sp. (Shihata & Shah, 2000).

La protéolyse est caractéristique de la dégradation des protéines par les bactéries

lactiques et la libération des fonctions α-NH2 au cours de la fermentation. Cette libération est en

fonction de la quantité des protéines dégradées (Chekroun et al., 2006). La meilleure libération

des fonctions α-NH2 est obtenue dans le lait LF2 fermenté par la culture pure de Lactobacillus

bulgaricus (Lb), comparée à celles obtenues chez les laits fermenté LF1 et LF3. Nos résultats sont

en accord avec ceux obtenus par Chekroun (2005).

La séparation par électrophorèse, des protéines des échantillons de laits fermentés

préparés, montre qu’il persiste toujours des bandes correspondantes aux protéines natives

(caséines, β-Lg, α-La et SAB). Ces résultats montrent que les bactéries lactiques du yaourt,

prises individuellement ou en association dégradent partiellement les protéines du lait au cours

de la fermentationnà 45°C. Les résultats obtenus sont en accord avec ceux obtenus par (Addeo et

al., 1995 ; Chekroun et al., 2006 ; 2007) ; ces chercheurs ont démontré que les caséines et les

protéines du lactosérum résistent à de nombreuses protéases.

Dans la troisième partie de notre travail, nous avons fait une étude immunologique qui

consiste à l’évaluation de la sensibilité à la β-Lg par la voie orale, l’étude (in vitro) de

l’allergénicité des protéines du lait de vache et des laits fermentés en chambre de Ussing et

l’étude histologique de l’intestin des différents groupes de souris.

Nous avons choisi, la souris, de souche BALB/c, comme modèle d’étude, car elle est

caractérisée par un complexe d’histocompatibilité relativement proche de celui de l’homme et

par une balance Th1/Th2 plus nette et plus facile à mettre en évidence que chez l’homme

(Magnan & Vervolet, 1997). D’autre part, de nombreux modèles animaux sont cités dans la

littérature pour induire la tolérance orale. Le modèle (souris BALB/c conventionnel), utilisé dans

ce présent travail, a été étudié par Piroult et al (2003).

Discussion

117

L’étape initiale a consisté à induire une tolérance à la β-Lg chez les souris BALB/c

colonisées avec différents laits fermentés ; LF1, LF2 et LF3 ; puis sensibilisées au lait de vache.

L’évaluation du degré de la sensibilisation de ces animaux après 18 jours est effectuée par le

dosage ELISA qui a révélé des titres IgG sériques anti β-Lg moins élevés chez le groupe de

souris intubées avec une solution saline par rapport aux autres groupes ayant subi une

colonisation intestinale avec les différents laits fermentés. Nos résultats témoignent d’une

réponse immunitaire systémique prononcée chez les souris BALB/c prises comme modèle

animal d’induction à la tolérance orale et sont en accord avec les données de la littérature

(Piroult et al., 2003 ; Macpherson et al., 2005). Dans la lumière intestinale, les facteurs antigènes

alimentaires se combinent aux anticorps, formant des complexes immuns qui peuvent prévenir

l’absorption des molécules antigéniques ; ces dernières peuvent aussi réagir avec les cellules T

helper et les cellules T suppressive, ces cellules régulent la production des IgG, IgA et IgE

(Murphy & Walker, 1991 ; Sorenson et al., 1993).

De nombreuses études mentionnent l’effet anti-allergique des produits laitiers fermentés,

mais peu d’auteurs précisent si cet effet est lié à l’hydrolyse des épitopes allergéniques des

protéines laitières, ou à une modulation de la réponse immune par les bactéries lactiques à

l’origine de la fermentation (Cross et al., 2001). Jedrychowski & Wróblewska (1999) et

Chekroun (2005), ont rapporté que la fermentation du lait de vache à 45°C par des bactéries

lactiques mésophiles et thermophiles induit une diminution significative de l’antigénicité vis-à-

vis de l’α-Lactalbumine, de la β-Lactoglobuline et de la sérum albumine bovine.

Après 50 jours, l’évaluation des titres sériques anti β-Lg, chez le groupe de souris

intubées avec solution saline et sensibilisées au lait de vache, a noté une augmentation

significative par rapport aux autres groupes de souris colonisées par les bactéries des laits

fermentés testés puis sensibilisées au lait de vache. En comparant les trois groupes de souris

colonisés chacun par un seul lait fermenté, nous avons constaté que, le plus faible taux d’IgG

sériques anti β-Lg est obtenu chez le groupe de souris colonisées par le ferment du yaourt

(culture mixte des bactéries) par rapport aux autres groupes de souris colonisées par les laits

fermentés chacun par une culture pure.

La meilleure induction de la tolérance orale est observée chez le groupe de souris

colonisées par le lait fermenté LF1 (yaourt) ; ce groupe a produit des taux bas d’IgG sériques anti

β-Lg. Ces résultats sont en accord avec des études réalisées par (Piroult et al., 2003 ; Tanaka &

Ishikawa, 2004; Macpherson et al., 2005 ; Ouwehand, 2007) qui montrent que les probiotiques

stimulent l’induction de la tolérance orale et préviennent les allergies en dégradant la β-

Lactoglobuline.

Discussion

118

Enfin, dans une étude contrôlée en double aveugle, l’ingestion journalière de 200g du

yaourt «vivant» pendant 1 an, a conduit a une diminution du taux d’IgG totales chez les jeunes

adultes (n=20) et à un degré moindre, chez les personnes âgées (n=20), bien que les taux sériques

d’IgG spécifiques d’allergènes individuels n’aient pas été modifiés (Van de Water et al., 1999;

Scoh et al., 2008).

Dans une deuxième étape, nous avons évalué le degré de l’allergénicité des protéines

résiduelles des laits fermentés comparé à celui des protéines natives du lait de vache sur les

fragments jéjunaux des souris sensibilisées au lait de vache. Cette approche a été réalisée, in

vitro, en chambre de Ussing ; elle nous a permit d’étudier l’interaction des antigènes

sensibilisants (β-Lg, α-La et les laits fermentés) avec les cellules immunocompétentes de

l’intestin et de préciser cette action sur les mouvements des électrolytes (sodium et chlore) par la

mesure du courant de court circuit (Isc) (Gumbiner, 1987).

Après avoir exposé la muqueuse intestinale des souris colonisées par le ferment du

yaourt aux antigènes sensibilisants, aucune augmentation significative du courant de court circuit

(Isc) n’a été enregistrée, ce résultat signifie l’absence d’une réponse anaphylaxique locale, ce qui

explique la non activation des cellules immunocompétentes spécifiques (IgE-dépendantes)

A titre comparatif, chez le groupe de souris témoin sensibilisées au lait de vache, n’ayant

pas subi de colonisation bactérienne par les laits fermentés, nous avons enregistré une

augmentation significative de l’Isc pour tous les antigènes testés, ce qui suggère que, la

fermentation du lait de vache par les bactéries lactiques diminue le pouvoir allergénique des

protéines du lait. Ces résultats sont en accord avec les travaux réalisés par Chekroun, (2005).

Différentes études ont montré, que le choc anaphylactique local se traduit par une

augmentation de l’Isc. Ainsi, les résultats de travaux antérieurs ont montré que la stimulation, in

vitro, de l’intestin d’animaux sensibilisés par différentes protéines du lait de vache, entraîne une

augmentation de l’Isc (Curtis et al., 1990 ; Crowe et al., 1993 ; Saidi et al., 1995 ; Groot, 1998).

Cette stimulation de l’Isc est provoquée par la présence d’autres protéines du lait se liant aux IgE

(ayant des titres antigéniques en IgE≥1.64) qui lient les récepteurs de haute affinité présents à la

surface des mastocytes, des basophiles, des macrophages et des cellules dendritiques (Gould et

al., 1991 ; Nissin et al., 1991 ; Metzger , 1992 ; Heyman, 1999 ; Rytkonen et al., 2006).

L’activation des mastocytes entraîne la libération d’histamine et de médiateurs qui interviennent

dans l’altération de la perméabilité intestinale (Rytkönen et al., 2002 ; Addou et al., 2004).

Discussion

119

La dernière étape de cette partie consiste à l’étude de l’aspect histologique des muqueuses

intestinales en réponse à la colonisation de l’intestin par les bactéries du yaourt et à la

sensibilisation au lait de vache des souris BALB/c, sachant que, l’épithélium gastro-intestinal

constitue la première ligne de défense de l’hôte (Basset et al., 2003). Les mucines sécrétées à la

surface par les cellules caliciformes sont variables à la fois dans leur quantité, mais aussi dans

leur nature.

L’aspect histologique et la hauteur des villosités jéjunales sont deux paramètres cruciaux

dans l’interprétation de l’effet de la sensibilisation à la β-Lg des souris colonisées par des laits

fermentés et des souris intubées avec une solution saline. Les résultats obtenus montrent qu’en

présence de l’antigène sensibilisant, la β-Lg modifie considérablement la structure de la

muqueuse intestinale des souris intubées avec une solution saline puis sensibilisées au lait da

vache par rapport aux souris non sensibilisées ; témoin négatif. Ces résultats sont en accord avec

ceux obtenus par Addou et al. (2004).

Chez les souris sensibilisées au lait de vache et n’ayant pas subi de colonisation

bactérienne, les coupes histologiques présentent une atrophie partielle des villosités avec une

importance infiltration lymphocytaires au niveau du chorion et de l’épithélium due à une réaction

immunitaire vis-à-vis de la β-Lg, accompagnée par la disparition de la bordure en brosse.

D’après Phillips et al. (1987), le nombre des lymphocytes intra-épithéliaux augmente

dans l’intestin grêle des enfants intolérants aux protéines du lait de vache de façon significative

par rapport aux enfants témoins intolérants au gluten. Lorsque l’antigène sensibilisant est éliminé

de l’alimentation des deux groupes d’enfants, il a été constaté une diminution des lymphocytes

intra-épithéliaux (Kaczmarski et al., 1989). Nos résultats sont en accord avec ces auteurs qui

justifient que l’augmentation des LIE serait caractéristique de l’intolérance à la β-Lg.

Chez les groupes de souris colonisées avec les laits fermentés LF1, LF2 et LF3, puis

sensibilisées au lait de vache, l’aspect et la structure des villosités n’ont pas été modifiés d’une

façon considérable. Les valeurs de la hauteur villositaire sont plus au moins rapprochées avec

celles des souris témoin négatif. Nos résultats sont en accord avec ceux obtenus par (Simon et

al., 2003 ; Dalloul et al., 2003 ; Jijon et al., 2004 ; Mazmanian et al., 2008), qui ont montré que,

l’administration des bactéries probiotiques influence l’établissement des lymphocytes T dans la

muqueuse intestinale des différentes espèces animales.

L’effet des probiotiques a un rôle crucial dans l’induction de la tolérance orale pour un

antigène donné (Sudo et al., 1997). Il a été prouvé que, dans des conditions normales, les

bactéries commensales abritent la lumière intestinale et modulent activement la fonction des

lymphocytes intra-épithéliaux, sans induction de réponses inflammatoires (Artis, 2008).

Discussion

120

En réponse à l’inflammation, l’épithélium intestinal libère le chimiokine IL-8 et d’autres

molécules inflammatoires qui provoquent une réponse inflammatoire aiguë (Frick et al., 2007),

une infiltration considérable des neutrophiles et le dysfonctionnement de la barrière intestinale

(Rona et al., 2007).

Il est admis que l’intolérance à la β-Lg chez certains enfants, se caractérise par une

perméabilité intestinale élevée à cette protéine (Saidi et al., 1995 ; Molkhou, 2002 ; Heyman &

Henvelin, 2006).

Addou et al. (2004), ont montré que la présence de la β-Lg modifie considérablement la

structure de la muqueuse intestinale chez le lapin. Une étude similaire réalisée sur des biopsies

intestinales d’enfants allergiques aux protéines du lait de vache, révèle une atrophie villositaire

subtotale (Paupe et al., 2001 ; Dupont & Boissieu, 2002 ; Buts, 2003 ; Moneret-Vautrin et al.,

2006).

Ces divers modèles expérimentaux semblent indiquer que, l’activation lymphocytaire

pourrait être responsable des lésions histologiques de l’allergie alimentaire. Des études utilisant

des cultures intestinales fœtales, démontrent que l’activation des cellules T et les cytokines

libérées par ces cellules induisent l’atrophie villositaire et l’hyperplasie des cryptes (Mc Donald

& Spencer, 1988 ; Evans et al., 1992 ; ; Sartor, 2008).

CONCLUSION

Conclusion

121

Conclusion générale

Dans le présent travail, nous nous somme intéressés à la préparation d’un lait de vache

fermenté par le ferment du yaourt utilisé comme outil pour réduire l’allergénicité de ces

protéines. Ce lait fermenté peut constituer une alternative nutritionnelle pour les nourrissons

allergiques.

La purification, l’identification et les tests physiologiques réalisés sur ces bactéries, qui

ont confirmé leur appartenance au groupe des bactéries lactiques et intestinaux. Ces bactéries ont

été utilisées individuellement et en association pour fermenter le lait de vache à 45°C jusqu'à sa

coagulation.

Le profil fermentaire des trois laits fermentés a montré que le meilleur pouvoir acidifiant

et protéolytique, ainsi que, la croissance bactérienne sont assurés par la culture mixte des

bactéries du yaourt. La colonisation intestinale des souris par les trois laits fermentés a permis de

dire que ces souches ont le pouvoir de transiter l’intestin et de survivre jusqu’aux fèces à des

concentrations variables.

L’évaluation de la production d’anticorps sériques spécifiques anti β-Lg, le test, in vitro,

en chambre de Ussing et l’étude histologique ont montré que les bactéries du yaourt sont des

probiotiques qui permettent l’induction et le maintien de la tolérance orale, ainsi qu’elles

exercent un effet protecteur sur l’épithélium intestinal en limitant les lésions histologiques.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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