ETUDE IN VITRO DE LA SENSIBILITE DES BACTERIES AUX ANTIBIOTIQUES

Dr Vincent CATTOIRLaboratoire de Bactériologie-Virologie-Hygiène

Vendredi 17 Novembre 2006 - Amphi 3

Cours de DCEM1 - Faculté de Médecine de Créteil

Définitions

= atteinte de la croissance bactérienne

= destruction des bactéries

CI50 = Concentration Inhibitrice 50 :CI50 = Concentration Inhibitrice 50 :Conc. d’ATB qui ↓ de 50 % le nbre de bactéries Peu utilisée en pratique

CMI = Concentration Minimale Inhibitrice :CMI = Concentration Minimale Inhibitrice :Conc. d’ATB la plus faible inhibant tte croissancebactérienne visibleTrès utilisée en pratique

CMICMI 5050 et CMI et CMI 9090 : :Conc. minimales inhibant la croissance de 50 % ou90 % des souches testées

CMI modale :CMI modale :Valeur de CMI la plus fréquente dans un panel de souches testées

Paramètres de bactériostase

CMB = Concentration Minimale Bactéricide :CMB = Concentration Minimale Bactéricide :Conc. d’ATB laissant subsister moins de 0,01 % (0,1 % chez les anglo-saxons) de survivants Soit n.10-4 de bactéries viables survivantes

Rapport CMB/CMI :Rapport CMB/CMI :Utilisé pour distinguer - ATB bactéricides (CMB/CMI < 2)

- ATB bactériostatiques (CMB très éloignée de la CMI)

Définit la tolérance d’une souche (CMB/CMI 32)≥Ex. Bactéries à Gram positif et ATB actifs sur la paroi (Streptocoques et β-lactamines)

Cinétique de bactéricidie :Cinétique de bactéricidie :Epreuve dynamique qui prend en compte du facteur tempsMéthode lourde

Paramètres de bactéricidie

ATB temps-dép.ATB temps-dép. : vitesse de bactéricidie indép. de la conc. ; conc. sérique doit êtremaintenue élevée en permanence

ATB conc.-dép.ATB conc.-dép. : vitesse de bactéricidie dép. de la conc. ; pics sériques élevés doivent être obtenus régulièrement

Effet post-ATBEffet post-ATB : Mesuré par le temps mis par une souche à retrouver une croissance normale après arrêt de l’ATB

Cinétiques de croissance/bactéricidie

Evaluation des paramètres de bactériostase :Evaluation des paramètres de bactériostase :Suffisante pour les infections aiguës chez les ICFaite par la mesure directe ou indirecte de la CMI

Evaluation de la bactéricidie :Evaluation de la bactéricidie :Parfois nécessaire pour infections sévères (endocardites, septicémies), chroniques (ostéites) ou sur terrain fragilisé (aplasiques)

NB : ATB les + bactéricides :NB : ATB les + bactéricides : β-lactamines Aminosides (rapides +++) Quinolones Glycopeptides

Utilité en pratique courante

Basée sur le choix de valeurs critiques dép. de la CMI

Valeurs proposées par des comités nationaux : CA-SFM en France, CLSI (ex-NCCLS) aux E-U, BSAC au R-U, DIN en Allemagne…

Selon l’OMS : 2 définitions de la R :Selon l’OMS : 2 définitions de la R :. Souche capable de supporter une conc. d’ATB notablement plus élevée que celle qui inhibe la majorité des autres souches de la même espèce

Catégories de populations bactériennes

. Souche capable de supporter une conc. d’ATB notablement plus élevée que celle qu’il est possible d’atteindre in vivo

Catégories cliniques

Catégorisation clinique SIR (1)

1.1. Bactériologiques :Bactériologiques : Distribution de CMI pour des populations de souches définies et appartenant à chacune des espèces bactériennes impliquées en pathologie humaine

5.5. Pharmacocinétiques :Pharmacocinétiques : Conc. sériques et tissulaires obtenues aux posologies usuelles (RCP) A comparer à la CMI de la souche

9.9. Cliniques :Cliniques : Confrontation des résultats obtenus in vitro et des résultats obtenus in vivo

(essais cliniques) avec notion de succès ou d’échec thérapeutique

PROPOSITION DE CONCENTRATIONS CRITIQUES : PROPOSITION DE CONCENTRATIONS CRITIQUES : BASSE (c) ET HAUTE (C)BASSE (c) ET HAUTE (C)

Catégorisation clinique SIR (2)

Critères

3 catégories de souches :3 catégories de souches :. Sensible S : Probabilité de succès thérapeutique acceptable dans le cas d’un traite- ment systémique avec la posologie recommandée (RCP)

. Résistante R : Forte probabilité d’échec thérapeutique

. Intermédiaire I : Succès thérapeutique imprévisible (ensemble hétérogène qui sert de zone tampon)

En pratique :En pratique :

Catégorisation clinique SIR (3)

CMI > CRc < CMI ≤ CICMI ≤ cSCMI (µg/ml)Catégorie

Antibiogramme standard (1)

Techniques de bactériologie courante (1)

Technique simple, rapide, fiable et visuelle

Protocole :Protocole :Utilisation de disques imprégnés d’une conc. donnée d’ATB (en µg)

Dépôt de ces disques à la surface d’une gélose uniformément ensemencée avec une suspension calibrée de bactéries à étudier

Diffusion concentrique de l’ATB dans la gélose pendant l’incubation

Lecture à 18-24 h (zones d’inhibition) :

Plus ce Ø est grand, plus la bactérie est S à l’ATBPlus ce Ø est petit, plus la bactérie est R à l’ATB

= Méthode par diffusion en milieu gélosé ou méthode des disques

Antibiogramme standard (2)

Techniques de bactériologie courante (2)

. Corrélation du Ø avec la CMI avec une courbe de concordance

. Catégorisation de la souche étudiée selon les Ø critiques (d, D) :

CMI > Cc < CMI ≤ C

CMI ≤ c

CMI (µg/ml)

Ø < dd ≤ Ø < D

Ø ≥ D

Ø (mm)

RIS

Catégorie

Antibiogramme standard (3)

Techniques de bactériologie courante (3)

Exemples d’antibiogrammes :Exemples d’antibiogrammes : Ex. Proteus mirabilis résistant à l’amoxicilline (AMX)et Ticarcilline (TIC) ; Résistant aux aminosides (KTG), aux cyclines (TE) et au Bactrim

Résistant naturellement à la colistine (CS) et aux furannes (FT)

Antibiogramme automatisé

Techniques de bactériologie courante (4)

Micro-galeries avec cupules contenant ≠ conc. d’ATB adaptées aux groupes bactériens (staphylocoques, BGN,…)

Ensemencement avec inoculum standard

Résultats rapides (ex. 4-6 h pour les entérobactéries)

Couplage à un système informatique d’expertise

Détermination de la CMI

Techniques de bactériologie courante (5)

3 méthodes principales :3 méthodes principales :. Dilution en milieu gélosé : Appareil de Steers

. Méthode E-Test (bandelettes imprégnées d’un gradient de conc. d’ATB)

. Dilution en milieu liquide :

Macrodilution

Microdilution

CMI = 4 µg/ml

Recherche de β-lactamase

Techniques de bactériologie courante (6)

Détection de Détection de ββ-lactamase par test chromogénique :-lactamase par test chromogénique :Pour la détection de pénicillinase (TEM) de certaines espèces comme Haemophilus, Neisseria, Moraxella ou StaphylococcusUtilisation de disque avec substrat chromogénique (si hydrolyse virage de couleur) :

Ex. Nitrocéfine (Oxoïd), Céfinase (bioMérieux), Padac (Bio-Rad)

Détection de Détection de ββ-lactamases à spectre élargi (BLSE) :-lactamases à spectre élargi (BLSE) :BLSE = Dérivées des pénicillinases capables d’hydrolyser la quasi-totalité des β-lactamines (sauf imipénème et céphamycines)Souvent R associées (plasmide) aux aminosides, phénicolés

Utilisation du test de synergie entre inhibiteurs de β-lactamases et C3G :

IMAGE EN « BOUCHON DE CHAMPAGNE »

Lecture interprétative de l’ATBg

Techniques de bactériologie courante (7)

D’après les connaissances des mécanismes de résistance (supports génétiques et moléculaires) :

. Inactivation enzymatique

. Diminution d’affinité par modification de la cible

. Imperméabilité / Efflux actif

Existence de phénotypes de résistance bien individualisés

MAIS nécessite une identification correcte de la bactérie étudiéeMAIS nécessite une identification correcte de la bactérie étudiée

Se déroule en 3 étapes :- lecture brute des résultats- détermination des mécanismes de R- établissement de la R clinique

Associations d’antibiotiques (1)

Elargissement du spectreElargissement du spectre (traitement d’urgence, d’infection mixte) Infections sévères souvent chez patients en USI, onco-hémato.

Prévention de l’émergence de mutants RPrévention de l’émergence de mutants R Ex. tuberculose

Obtention d’une synergieObtention d’une synergie Ex. endocardites infectieuses, infections sévères à P. aeruginosa, infections à BMR…

Diminution de la durée du traitementDiminution de la durée du traitement Ex. endocardites (pénicilline + aminoside vs pénicilline seule)

Association de 2 ATB pour leur diffusionAssociation de 2 ATB pour leur diffusion Ex. péfloxacine + rifampicine dans infections osseuses

Indications

Associations d’antibiotiques (2)

Nombreuses méthodes (certaines simples et d’autres compliquées)

Résultats parfois difficiles à interpréter voire discordants

2 catégories : . méthodes en point fixé. méthodes cinétiques

4 effets antibactériens observables :- indifférence : AB = A + B- addition : AB # A + B- synergie : AB > A + B- antagonisme : AB < A + B

Associations d’antibiotiques (3)

Méthodes en point fixé :Méthodes en point fixé :

Techniques d’étude (1)

Dilution en milieu liquide Dilution en milieu liquide (« carré », « échiquier », « damier »)

Diffusion en géloseDiffusion en gélose (disques ou bandelettes)

Associations d’antibiotiques (4)

Méthodes cinétiques :Méthodes cinétiques :Dénombrement à intervalles réguliers (2 h) les bactéries survivantes dans 4 tubes :

. Tube contenant l’association

. 2 tubes contenant un seul ATB

. Tube sans ATBNB : Synergie = % survivants < 2 log10

Appréciation de la bactéricidie quantitative et la vitesse de bactéricidie

Ex. d’associations synergiques :Ex. d’associations synergiques :β-lactamines + aminosides Glycopeptides + aminosidesSulfamides + Triméthoprime = Cotrimoxazole (BACTRIM)

Techniques d’étude (2)

Méthodes génotypiques

Mise en évidence des gènes de résistance (mais expression ?)

Méthodes basées sur la PCR

Détection par RFLP, séquençage, sonde

Méthodes rapides mais chères et limitées

Intéressantes pour les germes à croissance lente ou difficile

Exemples d’applications : Exemples d’applications : - Mycobactéries (BK) : R à la rifampicine, à l’isoniazide- Helicobacter pylori : R à la clarithromycine- Staphylococcus aureus : R à la méticilline (mecA)

Choix d’une antibiothérapie probabiliste

Choix initial guidé par :Choix initial guidé par :

Données cliniques précoces :- site du foyer- sévérité de l’infection- terrain (ID, n-né, femme enceinte, personnes âgées…)

Données bactériologiques précoces :- ED +++ (bactéries, leucocytes, PNN)

Données de la littérature, recommandations de consensus :- spectre d’activité (SIRSIR)- diffusion- taux de R

Surveillance bactériologique d’un traitement ATB (1)

Détermination des concentrations sériques et tissulaires :Détermination des concentrations sériques et tissulaires :Prélèvement au pic (30’ après adm. IV) et en résiduelle (5’ avant adm.)NB : POUR ETRE ACTIF : IL FAUT CONC. LOCALE > CMI +++o Dosage par méthodes immuno-enzymatiques :

Ex. Aminosides Glycopeptides

< 10< 35Isépamicine2x/j

< 25-12Tobramycine2x/j

< 2< 1

5-1212-25

Gentamicine2x/j1x/j

< 4< 2

25-3545-60

Amikacine2x/j1x/j

Résiduelle (µg/ml)

Pic (µg/ml)

Aminoside

20-35

Situations particulières :. Endocardites. Méningites. Ostéites. Souche de sensibilité diminuée (CMI > 4)

15-20Situations usuelles

Résiduelle (µg/ml)Glycopeptide

Surveillance bactériologique d’un traitement ATB (2)

Détermination des concentrations sériques et tissulaires (suite) :Détermination des concentrations sériques et tissulaires (suite) :o Dosage par méthodes chromatographiques : Ex. certaines β-lactamines (ceftazidime)

o Dosage par méthodes microbiologiques : moins rapide (18-24 h) mais adaptée à tous les ATB

NB : Foyers où les ATB ne diffusent pas ou peu : foyers enkystés,collection purulente (anaérobiose et acidité pour les aminosides)

Rq : Surveillance de la toxicité (ex. néphrotoxicité pour les aminosides)

Surveillance bactériologique d’un traitement ATB (3)

Etude du pouvoir inhibiteur :Etude du pouvoir inhibiteur :Sur le sérum (ex. pouvoir bactéricide du sérum ou PBS)Sur le LCRSur les urines

Série de tubes avec dilutions du sérum (raison 2) + inoculum bactérienIncubation 18-24 h à 37°CDétermination de l’effet bactériostatique puis bactéricide

NB : Effet inhibiteur valable si la plus grande dilution NB : Effet inhibiteur valable si la plus grande dilution ≥≥ 1/8e 1/8e

Possibilité d’étude de la cinétique de bactéricidie