les techniques disponibles en 2012 pour le diagnostic ... · aider à ”finir ” le travail du...

Les techniques disponibles en 2012 pour le diagnostic rapide des IOA

Frédéric Laurent

Laboratoire de bactériologie, Centre de Biologie Nord, Hospices Civils de Lyon, Centre National de Référence des Staphylocoques Inserm U851 Equipe ”Pathogénie bactérienne et immunité innée” CRIOAc Rhône Alpes Auvergne

INTRODUCTION

savoir si infection ou pas

si infection : optimisation / adaptation de l’antibiothérapie aider à ”finir ” le travail du chirurgien diminuer le risque de rechute/récidive - limiter la reconstitution foyer infectieux - bloquer la (re)formation biofilm sur matériel réimplanté - empêcher l’internalisation des bactéries ”résiduelles” dans le tissu sain

choix prise en charge chirurgicale 1 temps vs 2 temps

”Rapide” pourquoi ?

INTRODUCTION

IOA aiguë : bactéries classiques/croissance rapide gain limité

vs IOA chronique: bactéries ”moins” classiques/croissance plus difficile

gain ++

patient ayant reçu une ATBthérapie (<15 jours ?) . bactéries à croissance ”retardée” . pas de croissance du tout

bactéries qui ne cultivent pas bien ou … pas . Propionibacterium acnes . SCV ”small colony varianty” . Kingella kingae, Borrelia, Mycobacterium tuberculosis, ….

48H, 24H, ”extemporané” + cela dépend des moyens que l’on se donne (personnel, consommables)

”Rapide” comment ?

SCV

Approche culturale

”plus vite, plus haut, plus fort”

Approche culturale


”plus vite, plus riche, plus facile à détecter”

Approche culturale

ensemencer rapidement

+ ensemencer des milieux riches

+ ensemencer les bons milieux avec croissance facile à lire

. meilleure capacité de culture et détection précoce

. détection précoce de la positivité IOA

. sert de milieu de transport si fait au bloc (liq. articulaire)

Attention si polymicrobisme car ”concurrence” bactérienne


”plus vite, plus riche, plus facile à détecter”

Identifier plus vite, plus précisément : MALDI-Tof

S. aureus 38

K. kingae 25

S. Pyogenes 4

S. Agalactiae 3

S. Pneumoniae 6

H. influenzae 2

Others 8

1+ Gélose sang

12+ Flacon Hémoc ana

24+ Flacon Hémoc aéro

Bilan Kingella kingae Culture gélose 1/190 Culture gélose + flacon hémoculture 25/190

190 prélèvements

Positif : 86 Negatif : 104

Culture

Un exemple: ostéo-arthrite de l’enfant

Approche moléculaire

PCR universelle

PCR spécifique . maison . commerciale PCR multiplex multi-cibles Puces à ADN

on ne cherche plus à mettre en évidence la croissance d’une bactérie mais directement son ADN

Approche moléculaire PCR universelle


Séquençage produit PCR

Alignement avec banque de données

Identification

Broyage/Lyse

Extraction

PCR universelle


Séquençage produit PCR

Alignement avec banque de données

Identification

Broyage/Lyse

Extraction

PCR universelle

Les + : . approche sans à priori . PCR unique pour toutes les espèce

Les - : . détection de toute bactérie donc attention contaminations . sensibilité < PCR spécifique . plurimicrobisme ?? . parfois non discriminante . délais : 2 jours minimum

Mais ne pas attendre de miracle . gain de diagnostic 5 à 10% . très variable / contexte (ATB, …) Un résultat négatif n’exclut pas une IOA … Un résultat négatif n’exclut pas une IOA …

Approche moléculaire PCR universelle: pour le futur

PlexID

Approche moléculaire PCR spécifique

Broyage/Lyse

Extraction

amplification ciblée sur un gène spécifique et détection

concomitante de l’ADN amplifié

Délai minimum 24h

Les + : . plus rapide . plus sensible mais …

Les - : . une PCR par espèce . coût . algorithme pour l’ordre des PCR

Amorces spécifiques d’un gène cible spécifique d’un genre ou d’une espèce

PCR Gènes cibles - amorces Références

universelle ADNr 16S

13BS – 91E

PCR conventionnelle –

Séquençage

REMIC 2007*

Staphylococcus spp. tuf

Stat1 – Stat2


Séquençage

Benito, non publié

Streptococcus spp. tuf

tuf146 – tuf544


Séquençage

Benito, non publié

Kingella kingae cnp60

kk1 – kk2

Lightcycler Chometon et al, Pediatr

Infect Dis J. 2007

Staphylococcus

aureus

gyrA

gyrA1 -gyrA2

Lightcycler Chometon et al, Pediatr

Infect Dis J. 2007

Streptococcus

pneumoniae

lytA

Pno1 – Pno2

Lightcycler Ploton et al, Pathol Biol.

54 (2006) 498-50.

Propionibacterium

acnes

Mise au point en cours Lightcycler Boisset et al.

Borrelia burgdorferi recA

L194 - L415R

Lightcycler ou kit

commercial

Mäkinen et al Rapid

Cycle Real-Time PCR.

Methods and Appli.

Microbiology and food

analysis

Techniques de PCR spécifique – HCL Lyon

S. aureus 38

K. kingae 25

S. Pyogenes 4

S. Agalactiae 3

S. Pneumoniae 6

H. influenzae 2

Others 8

1+ Gélose sang



Bilan Kingella kingae Culture gélose 1/190 Culture gélose + flacon hémoculture 25/190

190 prélèvements


Culture

Un exemple: ostéo-arthrite de l’enfant

S. aureus 38

K. kingae 25

S. Pyogenes 4

S. Agalactiae 3

S. Pneumoniae 6

H. influenzae 2

Others 8

1+ Gélose sang



Bilan Kingella kingae Culture gélose 1/190 Culture gélose + flacon hémoculture 25/190 Culture gélose + flacon hémoculture + PCR 54/190

29 + 60

29 K. Kingae

N. meningitidis W13 (1)

S. pyogenes (1)

S. constellatus (1)

S. aureus (1)

Streptococcus spp. (1)

Enterobacteria (2)

Pseudomonas spp. (1)

8 + 52

PCR Universel

16SrDNA

89 des 104 prélèvements culture négative

PCR spécifique

K. kingae

<4 ans >4 ans

190 prélèvements


Culture

Un exemple: ostéo-arthrite de l’enfant D’après A_M Freydière (données personelles)

Approche moléculaire PCR multiplex commerciale

Ecouvillonnage – 1 min

Pus, liquides

articulaires

Vortex – 1 min

Muscles, os,

synoviales

Broyage – 1 min

Décharge de

l’écouvillon dans le

diluant - Vortex


Pus, liquides

articulaires

Vortex – 1 min

Muscles, os,

synoviales

Broyage – 1 min

Pus, liquides

articulaires

Vortex – 1 min

Muscles, os,

synoviales

Broyage – 1 min

Décharge de


diluant - Vortex

Décharge de


diluant - Vortex

Résultat en

58 minutes

Approche moléculaire PCR multiplex commerciale : un exemple Genexpert


Pus, liquides

articulaires

Vortex – 1 min

Muscles, os,

synoviales

Broyage – 1 min

Décharge de


diluant - Vortex


Pus, liquides

articulaires

Vortex – 1 min

Muscles, os,

synoviales

Broyage – 1 min

Pus, liquides

articulaires

Vortex – 1 min

Muscles, os,

synoviales

Broyage – 1 min

Décharge de


diluant - Vortex

Décharge de


diluant - Vortex

Résultat en

58 minutes

Approche moléculaire PCR multiplex commerciale : un exemple Genexpert kit pour détection S. aureus / SARM pour SSTI/Hémoc

GeneXpert Cepheid

• Evaluer le kit de PCR en temps réel GeneXpert MRSA-SA SSTI (Cepheid) pour :

la détection du Staphylococcus aureus (SA)

la détection de sa résistance à la méticilline (SARM)

directement sur les prélèvements ostéo-articulaires

• Etude rétrospective sur 91 prélèvements conservés congelés (76 patients)

• 72 positifs à S. aureus en culture (63 SASM, 9 SARM)

• 19 négatifs

• Comparaison avec résultats obtenus en routine en culture dans les laboratoires participants

Approche moléculaire PCR multiplex commerciale GeneXpert MRSA-SA SSTI (Cepheid)

SA positif en

culture

Culture stérile

ou autres

germes

Total

SA positif en

GeneXpert

68

dont 59 SASM

+ 9 SARM

3 71

SA négatif en

GeneXpert 4 16 20

Total 72 19 91

Prélèvements négatifs pour SA en culture, détectés positifs par le GeneXpert mais . autres prélèvements osseux + à S. aureus pour ces trois patients . sensibilité > de GeneXpert . exclus du calcul de Se

Résultats concordants GeneXpert / culture = 84 prélèvements

Prélèvements + à SASM en culture, non détectés par le GeneXpert : FN mais étude rétrospective sur prélèvements avec congélation/décongélation


SA positif en

culture

Culture stérile

ou autres

germes

Total

SA positif en

GeneXpert

68

dont 59 SASM

+ 9 SARM

3 71

SA négatif en

GeneXpert 4 16 20

Total 72 19 91


Sensibilité = 68/72 = 94.4% Spécificité = 16/16 = 100%

Temps de réalisation laboratoire : 25 min vs 2 min Délai de rendu moyen : 79 hrs vs 75 min Dubouix et al., JCM 2011

Etude prospective

A. Dubouix et al., ECCMID 2011

patients + à SA en culture sur d’autres échantillons

137 échantillons (95 patients) . 77 liquides articulaires . 39 biopsies osseuses . 21 biopsies tissulaires

SASM/SARM/SCNMR

+ en culture

SASM/SARM/SCNMR

- en culture Total

SASM/SARM/

SCNMR GX+

44

dont 18 SASM

+ 26 SCNMR

2 46

SA/SARM/SC

NMR GX- 0 91 91

Total 44 93 137

Mean time-to-results Culture 79 h vs Xpert® 75 min Mean hands-on-time Culture 25 min vs Xpert® 2 min



Se = Sp= VPP=VPN=100%


• Facilité de réalisation +++ (extraction, PCR, lecture, interprétation)

• Diagnostic en < 1H des IOA à SASM et SARM

directement à partir des prélèvements ostéo-articulaires

• Sensibilité et spécificité excellentes

• Preuve de concept de cette approche

• Nécessité d’études complémentaires prospectives

– Determination VPP, VPN

– Impacts clinique et économique dans le cadre des IOA

• Futurs tests multi-espèces : 100 espèces détectables dans une cartouche

Ouvre la porte au diagnostic bactériologique ”extemporané”

Approche moléculaire PCR multiplex commerciale : GeneXpert MRSA-SA SSTI (Cepheid)

Approche moléculaire Puces à ADN

• Prove-itTM Sepsis – Amplification des gènes gyrB, parE,

mecA par PCR multiplex avec des amorces biotinylées

– Détection et identification de 50 espèces bactériennes

+ mecA

– Développée pour les hémocultures positives

Bactéries à Gram positif Bactéries à Gram négatif

Identification à l’espèce Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus pyogenes Streptococcus agalactiae Streptococcus dysgalactiae subsp.

equisimilis Streptococcus pneumoniae Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Listeria monocytogenes Clostridium perfringens

Identification taxonomique Staphylococcus à coagulase Négative :

S. capitis S. haemolyticus S. hominis S. lugdunensis S. saprophyticus S. warneri S. Xylosus

Marqueur de résistance Gène de résistance à la méthicilline mecA

Identification à l’espèce Acinetobacter baumannii Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Escherichia coli Haemophilus influenzae Klebsiella oxytoca Klebsiella pneumoniae Neisseria meningitidis Proteus mirabilis Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa Serratia marcescens Stenotrophomonas maltophilia Salmonella enterica subsp. Enterica

Identification taxonomique Groupe Bacteroides fragilis Campylobacter jejuni/coli Enterobacteriaceae

Citrobacter freundii Citrobacter amalonaticus Citrobacter koseri Enterobacter hormaechei Enterobacter sakozakii Morganella morganii Pantoea agglomerans Yersinia enterocolitica Yersinia pseudotuberculosis


Amplification : PCR multiplex avec amorces biotinylées

ADN

(105 min)

Hybridation sur la puce (45 min)

Lecture et interprétation (quelques secondes)



Hybridation sur la puce

Lecture et interprétation

(105 min)

(45 min)

(quelques secondes)

ADN Approche moléculaire Puces à ADN


Hybridation sur la puce

Lecture et interprétation

ADN

Staphylococcus aureus Escherichia coli

Spots jaunes = bactéries

Spots verts = contrôles internes

(105 min)

(45 min)

(quelques secondes)

< 3h


Prove-itTM Sepsis et infections ostéo-articulaire • Analyse rétrospective

• 130 prélèvements – 67 liquides articulaires

– 63 biopsies osseuses

16 négatifs C-/PCR16S-

114 positifs C+ et/ou PCR16S+ Sélection des prélèvements selon les

sondes bactériennes disponibles sur la puce

• 31 C+/PCR16S+

• 22 C+/PCR16S-

• 61 C-/PCR16S+

• Protocole identique à celui des hémocultures

Bactéries testées dans l’étude

Staphylococcus spp (n=63)

S. aureus (n=35)

S. epidermidis (n=20)

Streptococcus spp (n=29)

Entérobactéries (n=19)

Bacteroides spp (n=6)

Pseudomonas spp (n=3)

Puces à ADN


Culture (n) PCR16S (n) Prove-itTM

+ -

C- (77) PCR- (16) 1 15

PCR+ (61) 39 22

C+ (53) PCR+ (31) 27 4

PCR- (22) 5 17

130 72 58

Prove-itTM Sepsis et infections ostéo-articulaire



+ -

C- (77) PCR- (16) 1 15

PCR+ (61) 39 22

C+ (53) PCR+ (31) 27 4

PCR- (22) 5 17

130 72 58

• C-/PCR16S- n=16

– 15 Prove-it –

– 1 Prove-it + : S. epidermidis

Confirmation ultérieure au laboratoire par PCR tuf et séquençage

Confirmation clinique : arthrite septique (genou) à S. epidermidis traitée




+ -

C- (77) PCR- (16) 1 15

PCR+ (61) 39 22

C+ (53) PCR+ (31) 27 4

PCR- (22) 5 17

• C+ et/ou PCR16S+ n=114

– 70 Prove-it + Identification concordante (61,4%)

7 diagnostics plurimicrobiens

Détection du gène mecA

• 16 Staphylococcus spp C+/Prove-it+ : 5mecA+,11mecA-

• 28 C-/PCR16S+ : 12 mecA en plus

Meilleure discrimination/PCR16S

• S. aureus vs S. aureus/S. haemolyticus

• K. pneumoniae vs K. pneumoniae/K. oxytoca

• …

114




+ -

C- (77) PCR- (16) 1 15

PCR+ (61) 39 22

C+ (53) PCR+ (31) 27 4

PCR- (22) 5 17



– 1 Prove-it + Identification discordante par rapport à la culture

puce = E. coli + S. enteritidis versus culture = B. fragilis

patient avec IOA plurimicrobienne documentée : E. coli + B. fragilis

114




+ -

C- (77) PCR- (16) 1 15

PCR+ (61) 39 22

C+ (53) PCR+ (31) 27 4

PCR- (22) 5 17



– 1 Prove-it + Identification discordante par rapport à la culture

– 43 Prove-it -

17 C+/PCR16S-

22 C-/PCR16S+

4 C+/PCR16S+

114 Extraction?

Faible inoculum?

Congélation/ décongélation?

Défaut de sensibilité?

Interférence ADN humain/ADN bactérien?

Dilution 1/10 des extraits d’ADN (n=10) :

récupération de 6 positifs :

5 Staphylococcus spp + 1 S. pneumoniae

ou algorithmes d’interprétation?

18 Prove-it - présentaient des spots d’hybridation mais sous le seuil de positivité



• Résultats prometteurs – Principales espèces responsables d’IOA – Infections polymicrobiennes – Résistance à la méthicilline

• Méthode simple et rapide

• Manque de sensibilité – Optimisations en cours – Etude prospective

• Extension du thesaurus

• Nouvelle génération de puce en cours d’évaluation – Système de barrettes (StripArrayTM) – Nouvelles espèces : Kingella kingae et Propionibacterium acnes


Autres approches Microcalorimétrie Mesure du flux de chaleur produit par les bactéries Microcalorimètre spécifique Identification possible sur la base des caractéristiques thermiques

Autres approches Microcalorimétrie Mesure du flux de chaleur produit par les bactéries Microcalomrimètre spécifique Identification possible sur la base des caractéristiques thermiques

Recherche Ag : Test binax Pneumocoque urinaire et liq. Articulaire Sérologie: en cours de développement Biomarqueurs: Ag bactériens, cytokines, … Sonication prothèse : délai croissance/PCR/Maldi-Tof

Ne pas tout (ou trop attendre) de la biologie moléculaire surtout quand BM maison Nouveaux outils de diagnostic rapide - existants ou en développement - prometteurs Mais: . Impact clinico-économique à évaluer . Quels moyens est-on prêt à mettre pour le diagnostic ? . coût réactifs ! (pour le labo) . coût personnel ! (pour le labo) mais versus coût total d’une IOA … Place de diagnostic pré-opératoire (plus besoin d’être rapide en per ou post-op)

controversé / peu réalisé en France à de rares exceptions

Conclusion

REMERCIEMENTS

Pr Vandenesch / Pr Etienne Anne –Marie Freydière Sandrine Boisset

Pr Lina / Pr Flandrois Michèle De Montclos

Dr Tigaud Jean-Philippe Rasigade

et l’ensemble de nos collègues cliniciens des 3 sites …

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