rÉplication de l’adn chez les procaryotes : (ex. e. coli
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II/ LA RÉPLICATION DE L’ADN CHEZ LES PROCARYOTES
RÉPLICATION DE L’ADN CHEZ LES PROCARYOTES : (ex. E. coli)
1) L’origine de réplication :
- Le chromosome d’E. coli possède une seule origine de réplication : OriC. Il
s’agit d’une séquence d’environ 245 pb.
- OriC est caractérisée par la présence de séquences répétées de 9 et 13
nucléotides (appelées séquences 9-mères et 13-mères respectivement). Ces
séquences constituent les sites de liaison de la protéine DnaA.
- De part et d’autre d’OriC se trouve une séquence riche et paires A-T qui
favorise le déroulement de la double hélice de l’ADN.
2) Les protéines et enzymes impliquées dans la réplication chez E. coli : (voir tableau ci-après)
2.1) DnaA : reconnait OriC et initie la réplication.
2.2) Hélicase : sépare les deux brins d’ADN (ouvre la
double hélice de l’ADN)
2.3) SSB (single strand binding protein) : protéine
se liant à l’ADN simple brin ; empêche la
fermeture de l’ADN (maintient les deux brins
d’ADN séparés)
2.4) Primase : synthétise les amorces d’ARN
2.5) ADN gyrase : introduit des super-enroulements
négatifs dans l’ADN (et élimine les super-
enroulements positifs diminuant ainsi la tension
générée par la séparation des deux brins de l’ADN
en aval de la fourche de réplication).
2.6) ADN polymérase III :
- L’ADN ploymérase III est l’enzyme principale de la réplication chez E. coli.
- Comme toutes les ADN polymérases, la séquence de l’ADN synthétisée par l’ADN ploymérase III est dictée par le brin
parental (matrice) suivant les règles de complémentarité (A-T et G-C).
- L’ADN ploymérase III catalyse la synthèse d’ADN sur les deux brins (avancé et retardé) dans le sens 5’→3’ : elle
possède une activité 5’→3’ polymérase. La vitesse de synthèse par l’ADN polymérase III est de 1000 à 1500 nucléotides
par seconde.
- L’ADN ploymérase III possède une fonction d’édition (correction sur épreuve) qui permet la correction des erreurs
d’incorporation. Elle vérifie si le nucléotide qu’elle vient d’ajouter est correct (selon les règles de complémentarité A-T
et G-C), et en cas d’erreur, elle élimine le nucléotide ajouté par son activité 3’→5’ exonucléase et le remplace par le
bon. Cette activité de correction est à l’origine de la grande fidélité de la réplication de l’ADN.
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* Structure de l’ADN ploymérase III :
- L’holoenzme de l’ADN ploymérase III est un dimère asymétrique, elle est constituée de 10 polypeptides différents
(voir tableau ci-après). Chaque monomère contient un cœur catalytique.
- Chaque cœur catalytique (ou core) est formé par trois protomères : α, ε et θ (les rôles de ces sous unités sont illustrés
dans le tableau). Le core abrite les activités catalytiques de l’ADN polymérase III (activité 5’→3’ polymérase et
3’→5’ exonucléase).
- Le core catalytique a une nature distributive ; c’est-à-
dire qu’il est incapable de rester attaché à l’ADN ; il
se détache de l’ADN après avoir polymérisé de courts
segments de 10 à 50 nucléotides.
- Le rôle du reste de l’enzyme et de convertir le core
catalytique de sa nature distributive en une enzyme
processive. Cette dernière est capable de synthétiser
un fragment de pas moins de 105 nucléotides avant de
se détacher de l’ADN. Cette propriété processive est
indispensable pour la synthèse du brin avancé.
- Le caractère processif est assuré par le protomère β qui
forme un dimère appelé « clamp béta » qui se fixe
fortement à l’ADN et agit comme une bride mobile
entraînant avec lui le cœur catalytique.
- Le protomère τ assure la dimérisation des deux cores
de la polymérase
- Les cinq autres protomères (γ, δ, δ’, χ et ψ) constituent
le complexe γ ; ce complexe place le clamp bêta
autour de chaque brin d'ADN matrice comme des
pinces pour permettre à l'holoenzyme qui lui est liée
de glisser sur le brin matrice.
2.7) ADN polymérase I :
- Indispensable pour la réplication de l’ADN
- Elimine les amorces d’ARN des fragments d’Okazaki et les remplace par de l’ADN, elle possède aussi
une fonction de correction
- Possède donc les activités catalytiques suivantes :
a) 5’→3’ exonucléase (élimination des amorces dans le sens 5’→3’) ;
b) 5’→3’ polymérase (ajouter de l’ADN le sens 5’→3’ pour remplacer les amorces) ; et
c) 3’→5’ exonucléase (assure la fonction de correction).
Remarque : L’ADN polymérase III ainsi que l’ADN polymérase I sont douées de fonction d’édition (elles peuvent agir
comme des exonucléases 3’→5’). Elles relisent le dernier nucléotide mis en place. S’il existe par hasard une faute
d’appariement, elles retirent ce dernier nucléotide (grâce à leurs propriétés exonuclasiques 3’→5’), et rajoutent le
nucléotide approprié. C’est pour cette raison que les ADN polymérases ne peuvent pas commencer une chaîne d’ADN
et ont besoin d'une extrémité 3'-OH préexistante. Elles doivent obligatoirement vérifier que le dernier nucléotide mis en
place est bien complémentaire au nucléotide du brin antiparallèle avant d’ajouter un nouveau nucléotide. Ce mécanisme
assure une très bonne fidélité à la réplication.
2.8) ADN ligase : Elle crée une liaison phosphodiester entre l’extrémité 3’-OH et 5’-phosphate de deux fragments
d’Oazaki adjacents.
2.9) Topoisomérase IV : A la fin de la réplication d’un chromosome circulaire, il se forme deux molécules filles
circulaires entremêlées (caténanes). La topoisomérase IV permet la séparation des deux ADN fils, un
processus appelé « décaténation ».
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3) Mécanisme de la réplication chez E. coli :
3.1) Initiation : la réplication chez E. coli est contrôlée par
l’état de méthylation de l’ADN. Pour que la réplication
puisse commencer, les deux brins d’ADN doivent être
méthylés sur l’adénine des séquences GATC.
- L’ADN gyrase introduit des superenroulements négatifs
permettant le déroulement de la double hélice ; ceci est
nécessaire à l’assemblage du complexe d’initiation.
- La réplication est initiée par fixation de plusieurs copies de
la DnaA sur le site OriC, plus précisément sur chacune des
4 séquences 9-mères. Ceci crée une tension qui force
l’ADN s’ouvrir au niveau des régions 13-mèrs adjacentes
riches en paires A-T.
- l’hélicase (DnaB) vient par la suite se fixer sur l’ADN, cette
fixation est assurée par la protéine DnaC.
- l’hélicase commence à se déplacer tout au long de l’ADN
comme un curseur d’une fermeture éclair séparant ainsi les
deux brins de l’ADN. Les protéines SSB viennent
immédiatement se fixer sur les deux ADNs simple brins
empêchant leur réassociation.
- La primase intervient ensuite et synthétise les amorces
d’ARN. Le complexe [Hélicase+SSB+Primase] est appelé
« primosome » ; il assure (1) la séparation des 2 brins
d’ADN et (2) l’attachement de l’ADN polymérase III en
fournissant les amorces.
- Au niveau du site d’initiation se forme une structure appelée
« bulle de réplication » ou « œil de réplication ». A chacune
des extrémités de la bulle, se trouve ce que l'on appelle une
fourche de réplication. Les deux fourches de réplication
progressent simultanément et dans deux sens opposés : on
parle de réplication bi-directionnelle.
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3.2) Elongation :
- Dans chaque fourche de réplication, les deux brins d’ADN (brin avancé et brin retardé) sont synthétisés
simultanément par l’ADN polymérase III.
- La réplication des deux brins doit se faire dans le même sens global de la progression de la fourche de réplication.
Or, les deux brins d’ADN sont anti-parallèles, et l’ADN polymérase synthétise l’ADN uniquement dans le sens
5’→3’. Le brin matrice 3’→5’ est répliqué sans problème car le sens de synthèse (5’→3’) coïncide avec la
direction de la progression de la fourche de réplication (sens général de réplication), il est synthétisé d’une
manière continue. Le problème se pose pour l’autre brin dont le sens de synthèse est l’inverse du sens global de
la progression de la fourche de réplication. Ce brin (retardé) doit être synthétisé par morceaux d’une manière
discontinue.
a) Synthèse du brin avancé : Le brin servant de
matrice pour cette synthèse est le brin parental
3’→5’. Une seule amorce est nécessaire pour
initier la synthèse. L’ADN polymérase ajoute des
nucléotides sur le 3’-OH de l’amorce dans le sens
5’→3’ continuellement sans avoir à se détacher de
l’ADN matrice.
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b) Synthèse du brin retardé : Le brin servant de matrice pour cette
synthèse est le brin parental 5’→3’. La synthèse du brin retardé
se fait également dans le sens 5’→3’, mais son sens ne coïncide
pas avec la direction de la progression de la fourche de
réplication. Sa synthèse est donc discontinue selon la séquence
d’événements suivante :
1) Le primosome synthétise une amorce ;
2) L’ADN polymérase III s’attache à l’ADN matrice par le
clamp bêta et allonge l’amorce par de l’ADN dans le sens
5’→3’ ;
3) La synthèse d’ADN se poursuit (1000 à 2000 nucléotides)
jusqu’à ce que l’ADN ploymérase III rencontre une zone
d’ADN double brin, le clamp bêta s’ouvre et l’ADN
polymérase quitte l’ADN. Le fragment ainsi généré est appelé
« fragment d’Okazaki » ;
4) L’ADN polymérase III se fixe sur la prochaine amorce pour
commencer un autre cycle de synthèse ;
5) En parallèle, l’ADN polymérase I intervient pour dégrader
l’amorce du fragment d’Okazaki et remplacer les
ribonucléotides éliminés par des désoxyribonucléotides ;
6) Une ADN ligase intervient ensuite pour souder les extrémités
libres
- Les étapes (1) à (6) sont répétées jusqu’à ce que les fourches
de réplication se joignent.
* Synthèse simultanée sur les brins avancé et retardé
- Dans une fourche de réplication, la synthèse du brin avancé et du
brin retardé se fait par la même ADN polymérase III. Le brin avancé
étant synthétisé par un core catalytique, et le brin retardé par l'autre
core.
- La dimérisation des deux cores est nécessaire à leur activité
enzymatique (c'est à dire que si les deux cores sont séparés leur
activité est perdue).
- La synthèse des brins avancé et retardé se fait
dans deux sens opposés, les deux cores de l'ADN
polymérase III ne peuvent pas progresser dans
deux sens opposés puisqu'ils doivent rester
attachés l'un à l'autre pour être actifs. Les études
ont montré que le brin parental 5'→ 3' (brin
servant de matrice pour la synthèse du brin
retardé) tourne à 180° sur
lui-même formant une
boucle, pour que le sens de
polymérisation du brin
retardé coïncide avec le
sens global de réplication.
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3.3) Terminaison :
La réplication du chromosome circulaire d’E. coli se termine
lorsque les deux fourches se rencontrent, dans une région
diamétralement opposée au site d’initiation de la réplication
oriC. La région terminale de la réplication chez E. coli, de même
que chez plusieurs autres bactéries, possède des séquences
spécifiques d’arrêt de réplication. Ces séquences appelées
« Ter » sont reconnues par une protéine « Tus » qui, en se fixant
sur les sites Ter, arrête la progression de la fourche de réplication.
A la fin de la réplication du chromosome circulaire d’E. coli, il en résulte deux molécules filles entremêlées
qui doivent être décaténées (séparées par mécanisme dit décaténation). Cette réaction est réalisée par la
topoisomérase IV. Les chromosomes sont alors répartis dans les deux futures cellules filles, processus qui est
couplé la division cellulaire.
LA RÉPLICATION UNI-DIRECTIONNELLE (en cercle roulant)
Chez certains plasmides, comme le plasmide F, et certains virus, comme le bactériophage lambda, la réplication
de l'ADN se fait de manière "Unidirectionnelle" en "Cercle roulant" :
- Un des deux brins d'ADN est coupé créant une extrémité 3'-OH et une extrémité 5'-P.
- Une ADN polymérase ajoute les nucléotides sur l'extrémité 3'-OH libre du brin coupé, en utilisant le brin intact
comme matrice. Ceci déplace à fur et à mesure l'extrémité 5'-P qui ressort comme une queue.
- Lorsque la polymérase fait un tour complet l'ADN est coupé pour libérer le brin d'ADN simple brin déplacé.
- La synthèse peut se poursuivre au-delà d'un seul cercle et le cycle peut être répété plusieurs fois.
- L'ADN linéaire libéré après chaque cycle de réplication peut être circularisé puis converti en duplex par la
synthèse d'un brin complémentaire.
RÉGULATION DE LA RÉPLICATION CHEZ LES PROCARYOTES
Chez E. coli, la réplication est contrôlée à deux niveaux :
- Au début de la phase d'initiation : Par la quantité et l’activité de la protéine DnaA (DnaA existe sous forme
active ou inactive).
- Au début de la phase d'élongation : Par l’état de méthylation de l’ADN : L'origine de réplication est hémi-
méthylée (la méthylation du brin néosynthétisé n'est pas immédiate) ; cet état empêche sa réutilisation immédiate.