réplication de l’adnwalidou.free.fr/replication-transcription.pdf · et du mécanisme de la...
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-Cultive E.Coli sur milieu contenant uniquement de l’isotope lourd N15, pendant
plusieurs générations.
-Bactéries sont lavées et mises à cultiver sur milieu contenant uniquement N14
pendant une génération.
Parental N15/N15
1ière génération N15/N14
Replication de l’ADN est semie-conservative
Expérience de Meselson et Stahl :1958
Arthur Kornberg (père) a réalisé la première synthèse d’ADN in vitro:
-ADN
-dNTP marqué au P32 pour montrer l’incorporation de la radioactivité dans la
chaine néoformée. L’idée étant de ne pas utiliser des dNMP pourtant constituant de
La chaine d’ADN.
-DNApol de E.coli à partir d’extrait grossier
-Précipitation des macromolécules par ajout d’un acide organique (sépare l’ADN
ayant incorporé de la radioactivité des dNTP P32.
Il s’est avéré que Kornberg a utilisé la DNApol I
Cette expérience prouve que qu’une synthèse in vitro d’ADN peut être effectuée
mais ne démontre pas le mécanisme semi-conservatif et que l’ADN néo synthétisé
est « actif ».
IIa] Synthèse in vitro
-actif? Capacité d’infection d’un ADN de bactériophage FX174.
ADN SB circulaire de 5000 nucléotides (brin+).
-But recréer in vitro le cycle du bactériophage.
-1 problème: comment lier le brin- après synthèse.
Ligase.
-2 problème : comment séparer brin+ et brin-
5-bromodésoxy-uridine.
-3 problème: le brin- n’étant pas infectieux, il faut resynthétisé un brin+ à partir de ce
brin-.
Après purification seul le brin+ néoformé est infectieux.
IIb] Synthèse in vitro d’un ADN
biologiquement actif par un mécanisme
semi-conservatif
Ic] ADN polymérases eucaryotes supérieurs
-DNApol b: réparation de l’ADN, pas d’activité exonucléase.
Levure ADN pol II
-DNApol e: synthèse du brin continu. réparation
-DNApol g: ADN mitochondrial.
-DNApol a-primase: complexe qui synthétise des amorces d’ARN-ADN pour
le brin avancé (précoce), synthétise les fragments d’Okazaki du brin retardé
(tardif). Pas d’activité exonucléase. Primase
Levure ADN pol I
-DNApol d: principale, brin retardé, possède une activité 3’ 5’ exonucléase.
(Pol III ). Intervient également dans la réparation.
Levure ADN pol III
Régions d’ADN
reconnues par
l’ARN pol
Régions de s
interagissant
avec l’ADN
II] promoteur et facteur s
ARN polymérases eucaryotes
Enzyme Position Produit Activité relative
ARN polymérase I Nucléole ARN ribosomal 50-70%
ARN polymérase II Nucléoplasme ARN hétérogéne nucléaire 20-40%
ARN polymérase III Nucléoplasme ARNt, petits ARN ~10%
Facteurs auxiliaires
-Facteurs généraux: nécessaires à l’initiation de la synthèse des ARNm au niveau de
Tous les promoteurs.
Facteurs généraux + ARNpol: appareil de transcription élémentaire
-Facteurs en amont: reconnaissent de courtes séquences d’ADN.
Activité non régulée.
-Facteurs inductibles: reconnaissent de courtes séquences d’ADN appelées éléments
de réponse.
III] Méthodes d’étude d’un promoteur
1) Utilisation d’un gène rapporteur
a) Principe
b) CAT: Chloramphénicol Acétyl Transférase
c) Luciférase
d) Béta-Galactosidase et GFP: étude in vivo
2) Exemples
Promoteur
Gène
rapporteur
Principe du gène rapporteur
Analyse de l’expression
du gène rapporteur
Transfection
transitoire
III] Méthodes d’étude d’un promoteur
1) Utilisation d’un gène rapporteur
a) Principe
b) CAT: Chloramphénicol Acétyl Transférase
c) Luciférase
d) Béta-Galactosidase et GFP: étude in vivo
2) Exemples
III] Méthodes d’étude d’un promoteur
1) Utilisation d’un gène rapporteur
a) Principe
b) CAT: Chloramphénicol Acétyl Transférase
c) Luciférase
d) Béta-Galactosidase et GFP: étude in vivo
2) Exemples
III] Méthodes d’étude d’un promoteur
1) Utilisation d’un gène rapporteur
a) Principe
b) CAT: Chloramphénicol Acétyl Transférase
c) Luciférase
d) Béta-Galactosidase et GFP: étude in vivo
e) Exemple d’étude: promoteur de la b-Globine
2) Technique de Footprinting
3) Technique de retard sur gel
Méthodes d’étude des facteurs de
transcription
1) Technique de Footprinting
2) Technique de retard sur gel
Méthodes d’étude des facteurs de
transcription
1) Technique de Footprinting
2) Technique de retard sur gel
Dépots
Piste A: fragment d’ADN* sans extrait nucléaire
Piste B: mélange de l’ADN* et des protéines nucléaires
Technique du retard sur gel
L’Enhancer est situé souvent à plusieurs
kpb du promoteur, la question est donc
de savoir:Comment un Enhancer peut-il
stimuler l’initiation de la transcription?
Site consensus d’épissage nucléaire chez les
eucaryotes supérieurs
(A/C)AGGU(A/G)AGU UAUAAC YnN(C/U)AGG(G/U)
Boite de branchement
Le spliceosome
-RNP (ribonucléoprotéines) contenant les ARNsn (small nucleus)
-50-60 RNPsn/spliceosome
-RNPsn directement impliquées dans l’épissage: U1, 2, 4, 5 et 6
-RNPsn: les ARNsn lie au moins 1 protéine appartenant
à la famille des Pt Sm sauf ceux de U6 (Lsn)
-Autres protéines non Sm: facteurs d’épissage.