réplication de l’adnwalidou.free.fr/replication-transcription.pdf · et du mécanisme de la...

88
Réplication de l’ADN

Upload: vuhuong

Post on 15-Sep-2018

215 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Réplication de l’ADN

Réplication de l’ADN:

expériences historiques

I] Expérience de Meselson et Stahl

-Cultive E.Coli sur milieu contenant uniquement de l’isotope lourd N15, pendant

plusieurs générations.

-Bactéries sont lavées et mises à cultiver sur milieu contenant uniquement N14

pendant une génération.

Parental N15/N15

1ière génération N15/N14

Replication de l’ADN est semie-conservative

Expérience de Meselson et Stahl :1958

II] Mise en évidence des ADN polymérases

et du mécanisme de la réplication: in vitro

Arthur Kornberg (père) a réalisé la première synthèse d’ADN in vitro:

-ADN

-dNTP marqué au P32 pour montrer l’incorporation de la radioactivité dans la

chaine néoformée. L’idée étant de ne pas utiliser des dNMP pourtant constituant de

La chaine d’ADN.

-DNApol de E.coli à partir d’extrait grossier

-Précipitation des macromolécules par ajout d’un acide organique (sépare l’ADN

ayant incorporé de la radioactivité des dNTP P32.

Il s’est avéré que Kornberg a utilisé la DNApol I

Cette expérience prouve que qu’une synthèse in vitro d’ADN peut être effectuée

mais ne démontre pas le mécanisme semi-conservatif et que l’ADN néo synthétisé

est « actif ».

IIa] Synthèse in vitro

-actif? Capacité d’infection d’un ADN de bactériophage FX174.

ADN SB circulaire de 5000 nucléotides (brin+).

-But recréer in vitro le cycle du bactériophage.

-1 problème: comment lier le brin- après synthèse.

Ligase.

-2 problème : comment séparer brin+ et brin-

5-bromodésoxy-uridine.

-3 problème: le brin- n’étant pas infectieux, il faut resynthétisé un brin+ à partir de ce

brin-.

Après purification seul le brin+ néoformé est infectieux.

IIb] Synthèse in vitro d’un ADN

biologiquement actif par un mécanisme

semi-conservatif

Expérience de Cairns

III] Notion de fourche de réplication

Réplication de l’ADN

-ADN pol I

-ADN pol II

-ADN pol III: réplicase

I] ADN polymérases

Ia] E. Coli

Activitées

-Activité 5’-3’ polymérase

-Activité 3’-5’ exonucléase

-Activité 5’-3’ exonucléase

Ib] Phages

Ic] ADN polymérases eucaryotes supérieurs

-DNApol b: réparation de l’ADN, pas d’activité exonucléase.

Levure ADN pol II

-DNApol e: synthèse du brin continu. réparation

-DNApol g: ADN mitochondrial.

-DNApol a-primase: complexe qui synthétise des amorces d’ARN-ADN pour

le brin avancé (précoce), synthétise les fragments d’Okazaki du brin retardé

(tardif). Pas d’activité exonucléase. Primase

Levure ADN pol I

-DNApol d: principale, brin retardé, possède une activité 3’ 5’ exonucléase.

(Pol III ). Intervient également dans la réparation.

Levure ADN pol III

Domaines catalytiques des ADN pol

Différent types

d’amorces utilisées

par les ADN pol

Id] Amorces

Synthèse discontinue et synthèse continue

I] Synthèses

Ligation des

fragments

d’Okazaki

II] ligase

III] Autres protéines

IV] Procaryotes

ADN pol III

Replication

V] Eucaryotes

VI] Terminaison

-Procaryotes

-Eucaryotes ?

VII] Origine de la fourche

de réplication: procaryotes

Ori C

VII] Origine de la fourche

de réplication: eucaryotes

Transcription

I] Mécanisme général

II] Synthèse des ARNs

III] Différentes étapes

de la transcription

ARN polymerase et transcription:

procaryote (E. Coli)

I] ARN polymérase

Régions d’ADN

reconnues par

l’ARN pol

Régions de s

interagissant

avec l’ADN

II] promoteur et facteur s

Facteurs s et exemple d’infection par le

phage SPO1

III] Autres enzymes

IV] Terminaison

-Intrinséque

-Rho dépendante

-Facteur antiterminaison

ARN polymerase et transcription:

eucaryote

ARN polymérases eucaryotes

Enzyme Position Produit Activité relative

ARN polymérase I Nucléole ARN ribosomal 50-70%

ARN polymérase II Nucléoplasme ARN hétérogéne nucléaire 20-40%

ARN polymérase III Nucléoplasme ARNt, petits ARN ~10%

Facteurs auxiliaires

-Facteurs généraux: nécessaires à l’initiation de la synthèse des ARNm au niveau de

Tous les promoteurs.

Facteurs généraux + ARNpol: appareil de transcription élémentaire

-Facteurs en amont: reconnaissent de courtes séquences d’ADN.

Activité non régulée.

-Facteurs inductibles: reconnaissent de courtes séquences d’ADN appelées éléments

de réponse.

Facteurs de transcription

I] ARN polymérase II

II] Transcription

par l’ARN pol II:

reconnaissance-

initiation

II] Transcription

par l’ARN pol II:

initiation-élongation

III] Méthodes d’études des promoteurs

III] Méthodes d’étude d’un promoteur

1) Utilisation d’un gène rapporteur

a) Principe

b) CAT: Chloramphénicol Acétyl Transférase

c) Luciférase

d) Béta-Galactosidase et GFP: étude in vivo

2) Exemples

Promoteur

Gène

rapporteur

Principe du gène rapporteur

Analyse de l’expression

du gène rapporteur

Transfection

transitoire

III] Méthodes d’étude d’un promoteur

1) Utilisation d’un gène rapporteur

a) Principe

b) CAT: Chloramphénicol Acétyl Transférase

c) Luciférase

d) Béta-Galactosidase et GFP: étude in vivo

2) Exemples

Chloramphénicol Acétyl Transférase

Gamme étalon

III] Méthodes d’étude d’un promoteur

1) Utilisation d’un gène rapporteur

a) Principe

b) CAT: Chloramphénicol Acétyl Transférase

c) Luciférase

d) Béta-Galactosidase et GFP: étude in vivo

2) Exemples

Luciférase

Luciférine

III] Méthodes d’étude d’un promoteur

1) Utilisation d’un gène rapporteur

a) Principe

b) CAT: Chloramphénicol Acétyl Transférase

c) Luciférase

d) Béta-Galactosidase et GFP: étude in vivo

e) Exemple d’étude: promoteur de la b-Globine

2) Technique de Footprinting

3) Technique de retard sur gel

Gènes rapporteurs: b-Galactosidase et GFP

2) Etudes de promoteurs:exemples

Méthodes d’étude des facteurs de

transcription

1) Technique de Footprinting

2) Technique de retard sur gel

Footprinting

SP1

SP1

Promoteur: WT Muté

Exemple de Footprinting: site SP1

Méthodes d’étude des facteurs de

transcription

1) Technique de Footprinting

2) Technique de retard sur gel

Dépots

Piste A: fragment d’ADN* sans extrait nucléaire

Piste B: mélange de l’ADN* et des protéines nucléaires

Technique du retard sur gel

Technique du gel super retard

Dépots

ADN*

ADN*+ Protéines

ADN*+ Protéines+ Anticorps

Exemple de l’élément en cis: Muc1

IV] Facteurs de transcription et inhibitions

V] Mécanisme d’action des

facteurs de transcription

-Mécanisme général

-Exemple de la protéine TAT

V] Mécanisme d’action des

facteurs de transcription

-Notion de co-activateur

V] Mécanisme d’action des

facteurs de transcription

L’Enhancer est situé souvent à plusieurs

kpb du promoteur, la question est donc

de savoir:Comment un Enhancer peut-il

stimuler l’initiation de la transcription?

Rôle d’un Enhancer

VI] Mécanisme de terminaison

de la transcription

Gènes morcelés

Exemple du gène de la globine

Epissage alternatif

Epissage alternatif

Coiffe

Site consensus d’épissage nucléaire chez les

eucaryotes supérieurs

(A/C)AGGU(A/G)AGU UAUAAC YnN(C/U)AGG(G/U)

Boite de branchement

Principe général

Mécanisme:

in vitro

UAUAAC

UAUAAC

UAUAAC

UAUAAC

Réactions chimiques:

estérifications

Le spliceosome

-RNP (ribonucléoprotéines) contenant les ARNsn (small nucleus)

-50-60 RNPsn/spliceosome

-RNPsn directement impliquées dans l’épissage: U1, 2, 4, 5 et 6

-RNPsn: les ARNsn lie au moins 1 protéine appartenant

à la famille des Pt Sm sauf ceux de U6 (Lsn)

-Autres protéines non Sm: facteurs d’épissage.

Exemple :

RNPsn U1

Mécanisme:

in vivo

Exon1-Exon2Intron

Autres types d ’épissage

eucaryotes

Exemple de mécanisme de l’épissage

alternatif

Si ASF/SF2

Si SF5

Notion d’épissage en Trans

Epissage des ARNt

Mécanisme d’épissage des ARNt

Mécanisme de

terminaison des ARNm

polyA+

Mécanisme de terminaison des ARNm polyA-