Enzymologie

Intéret de lʼenzymologie : Activité enzymatique dʼun liquide biologique : - symptome biochimique (lyse cellulaire) : les enzymes sont intracellulaires- surveillance dʼune maladie - explication pathogénique de la maladie- détection de la présence dʼune enzymeOutil analytique permettant le dosage dʼun substrat.

I- Définition- Nomenclature

Définitions : cʼest un catalyseurs biologiques qui a une vitesse de réaction élevée et une spécificité qui va lui permettre dʼéliminer la formation de sous-produits. Pratiquement toutes les réactions biochimiques sont catalysées par les enzymes.

Classification et nomenclature : Par le substrat de lʼenzyme : - Amidon Amylase - Lipides Lipase- Protéines Protéases Par le type de réaction catalysée : - Déshydorgénases- Oxydases- Décarboxylases

Classification internationale (UIBBM)Classe 1 : oxydo-réductases (un substrat va sʼoxyder et une autre molécule va se réduire et inversement : réaction dʼoxydo-réduction)Classe 2 : transférases (enzymes qui vont transférer des groupements chimiques)Classe 3 : hydrolases (hydrolyse dʼun substrat, intervention de lʼeau)Classe 4 : lyases (enzymes qui vont enlever au substrat un groupe et vont créer une double liaison et inversement)Classe 5 : isomérases (transformation dʼun substrat en son isomère)Classe 6 : ligaes (liaisons C-S, C-C, C-N, C-O)

Ces classes sont divisées en sous-classes et en sous-sous-classes.

EX : Créatine Kinase : CK Réaction catalysée : ATP + Créatine ↔ ADP + Créatine phosphate Enzyme : ATP Créatine Phosphotransférase (EC 2 7 3 2) CK2 : classe des transférases 7 : sous classe des phosphotransférases 3 : sous classe des phos fonctionnant avec un accepteur azoté (la créatine)2 : numéro de lʼenzyme à lʼintérieur de la sous-sous classe

L-lactate deshydrogénase : LDH Réaction catalysée : S-lactate + NAD+ ↔ pyruvate + NADH + H+ Enzyme : L-lactate desyhdrogénase (EC 1 1 1 27) ldh

1 : classe des oxydoréductases 1 : agissant sur les groupe : CH-OH 1 : sous sous classe fonctionnant avec la NAD+ (NADP+) comme accepteur 27 : numéro de lʼenzyme à lʼintérieur de la sous-sous classe

II- Constitution dʼune enzyme

Enzyme entièrement protéiques (ribunucléase)Enzyme formées en deux partie : - Apoenzyme (nature protéique)- Coenzyme (nature non protéique-Apoenzyme + coenzyme = holoenzyme

Coenzyme : Second substrat : - Récation stoechiométrique entre substrat et coenzyme- Physiologie : la réaction avec le coenzyme est souvent plus importante que celle avec le

substrat

Les sites de fixation du substrat - Le site catalytique de lʼenzyme

Les sites de fixation du substrat

!"#$%&'(#')!#*+,-.+/+0#Il faut que ces molécules se rencontrent donc quʼelles soient solubles dans lʼeau.

III- Propriétés générales des enzymes

Lʼactivité enzymatique EX : Une mole de catalase décompose 5 000 000 moles de H2O2 en une minute et à 0°C. Anhydrase carbonique : CO2 + H2O ↔ H2CO3Catalyse enzymatique : 10^7 fois plus rapide

La catalyse enzymatique La catalyse enzymatique

A

B

Gf

Avancement de la réaction

Ener

gie

libre

du

syst

ème

Energie libre

de la réaction non

Catalysée

S

P

Gi

Etat initial

Modification

libre G

Energie libre

de la réaction catalysée

!"#$%&'(#')!#*+,-.+/+0#

On va fournir au système moins dʼénergie.

Spécificité : - Spécificité de la réaction - Spécificité de substrat

Spécificité de réaction

C H N H 2 R

C O O H

!"#$%&'(#')!#*+,-.+/+0#

: Spécificité de réaction (décarboxylase et désaminase)

Spécificité de substrat : Etroite : trypsine Large : pronase Stéréospécificité : - Acides aminés de série L ou D - Saturation des doubles liaisons (cis ou trans) (Fumarase : catalyse lʼhydratation de

lʼacide fumarique (trans) en acide L-malique, inactive sur lʼacide maléique (isomère cis de lʼacide fumarique))

Les unités : Dans les conditions optimales de réaction : - Unité usuelle : U = μmole/min- Lʼunité internationale : 1 kat = 1 mole/seconde- Lʼactivité spécifique : activité / mg de protéine. Plus lʼactivité sera élevée plus lʼenzyme

sera à lʼétat pur.

Cinétique enzymatique : E + S ↔ ES → E + P

Cinétique enzymatique

!"#$%&'(#')!#*+,-.+/+0#Au cours du temps le substrat va diminuer et le produit va augmenter, on a donc bien eu un complexe enzyme-substrat, et ce complexe se dissocie pour revenir à lʼétat initial. Cette réaction doit etre rapide et la plus faible possible. La réaction enzyme-substrat est réversible, on va donc avoir un équilibre.

Influence de la température : Influence de la température

Activation

Dénaturation (Vitesse de la réaction)

!"#$%&'(#')!#*+,-.+/+0#

(enzyme = protéine) Quand on augmente la température, lʼagitation moléculaire du milieu augmente, augmente donc les chances de collision entre enzyme et substrat et sa va passer par un maximum qui sera la température optimale de la réaction. A un moment donné on a une dénaturation de la protéine, lʼenzyme perd son activité, donc la courbe de la vitesse de la réaction à partir de cette température va décroitre. On observe la résultante de ces 2 courbes (phénomène dʼactivation et de dénaturation).

Influence du pHInfluence du pH

!"#$%&'(#')*#+,-./,0,1#pH dʼarret qui va stopper la réaction.

Influence des concentrations : réactif : enzymeConditions optimales : pH optimum et T optimale

Influence des concentrations: réactif: enzyme

Conditions optimales, [S] = constante

!"#$%&'(#')"#*+,-.+/+0#Les réactifs sont le substrat et lʼenzyme. Concentration en substrat constante. On va faire varier la concentration en enzyme. Le produit P en fonction du temps. Pour une première concentration en enzyme E1 on a une première courbe si on double la concentration en enzyme la courbe est haute, si on triple ... On considère quʼau temps t0 on a aucun produits formés, donc la vitesse initiale est proportionnelle a la concentration en enzyme.

Influence des concentrations : réactif : substrat

Influence des concentrations: réactif: substrat

Conditions optimales, [E] = constante

!!"#$%&'"&()"*+,-.+/+0"Lorsquʼon double la concentration substrat la pente de la réaction va augmenter au fur et à mesure que la concentration augmente. La vitesse est proportionnelle a la concentration substrat. Lʼasymptote correspond a la vitesse maximum, on sera alors à une concentration saturante, on peut donc évaluer la concentration en enzyme.

Hypothèse de Michaelis

Hypothèse de Michaelis

k-1

k1 k2

!"#$%&'(#')*#+,-./,0,1#

Dans le milieu on a lʼenzyme et le substrat. A partir des lois dʼactions de masse on peut déterminer la formule ci dessus. La constante de Michaelis traduit lʼaffinité de lʼenzyme pour son substrat. Elle sʼexprime dans les mêmes termes que la concentration substrat, elle sera dʼautant plus élevée que la dissociation du complexe enzyme substrat est élevée et que lʼaffinité sera faible.

Détermination expérimentale de la constante de Michaelis

Détermination expérimentale de la constante de Michaelis

Courbe de Michaelis-Menten

!"#$%&'(#')*#+,-./,0,1#Une fois que la vitesse max est déterminée, on peut prendre la vitesse max la divisée par deux, et la concentration de substrat est égale au Km. Grace a Vi on peut aussi retrouver cette valeur.

Equation de Michaelis

Equation de Michaelis

!"#$%&'(#')*#+,-./,0,1#

Détermination de Km en coordonnées double inverse

Détermination de Km en coordonnées double inverse

Représentation dite de Lineweaver - Burck

!"#$%&'(#')*#+,-./,0,1#

Signification de la constante de Michaelis Km caractérise lʼaffinité enzyme-substrat. Les concentrations physiologiques en substrat sont voisines des Km. - Modifications des vitesses de voies métaboliques entières- Modification des Km par des effecteurs (activateurs ou inhibiteurs)

IV- Les activateurs de la cinétique enzymatique

- Les ions métalliques (capable de phosphoriler, réactions qui vont exiger de lʼénergie, ces kinases sont activés par Mg2+ par exemple, la trypsine par le calcium ..., ils doivent etre trouvés dans lʼalimentation)

- Activation des pro-enzymes (coagulation : cascade enzymatique dʼun produit qui va déclenché une première réaction puis une deuxième ... fabrication de la fibrine) : ils sont sécrétés sous forme de pro-enzymes activés par dʼautres enzymes

- Fixation covalente dʼun groupe chimique (la sérine par ex groupement hydroxyle qui peut etre phosphoriler ou desphophoriler on va retrouver cette réaction dans le métabolisme du glycogène)

V- Les inhibiteurs de la cinétique enzymatique

(notions d'irréversibilité ou réversibilité de la réaction) perte des propriétés catalytiques de lʼenzyme- Modification de la conformation spatiale de lʼenzyme- Interaction au niveau du site actif de lʼenzyme : il va y avoir une compétition entre

lʼinhibiteur et lʼactiveur qui veulent se fixer sur le site actif de lʼenzyme

1- Lʼinhibition compétitive !

Inhibition COMPETITIVE

Compétition entre I et S / site actif

!"#$%&'(#')*#+,-./,0,1#Sans inhibiteur le substrat se fixe sur le site actif : complexe enzyme substrat. Si on met un inhibiteur, il a une portion de sa molécule qui peut venir se loger dans le site actif, compétition avec le substrat : complexe enzyme inhibiteur.

Les inhibiteurs compétitifs Les inhibiteurs compétitifs

S ES

E

I EI

E + P

!"#$%&'(#')"#*+,-.+/+0#Cette réaction est réversible, si on augmente la concentration en substrat on retrouve une vitesse de réaction quasi-normale.

Traduction graphique de lʼinhibition compétitive

Traduction graphique de

Sans inhibiteur

Avec inhibiteur

Km augmente Vmax ne change pas Réversible

!"#$%&'(#')*#+,-./,0,1#

Avec un inhibiteur le Km va augmenter mais la vitesse maximale ne change pas (par contre on mettra un temps plus important pour atteindre cette vitesse maximale), réaction réversible.

2- Lʼinhibition non compétitive !

Inhibition NON COMPETITIVE

site actif

!!"#$%&'"&()"*+,-.+/+0"

On va modifier la structure de lʼenzyme. En absence dʼinhibiteur on a lʼenzyme et le substrat : affinité Km. Si on met lʼinhibiteur, il va se loger sur son site de fixation différent du site actif, quand le substrat arrive on a un complexe qui va comprendre a la fois le substrat et lʼinhibiteur. Le fonctionnement de lʼenzyme va etre perturbé parce que lʼinhibiteur est présent. Le Km ne change pas.

Les inhibiteurs non compétitifs

Les inhibiteurs non compétitifs

Km ne change pas Vmax diminue Irréversible

Sans inhibiteur

Avec inhibiteur

!"#$%&'(#')*#+,-./,0,1#

La vitesse maximum diminue en revanche lʼaffinité du substrat pour lʼenzyme nʼa pas changé.

VI- Les effecteurs allostériques

Ils vont agir ailleurs sur dʼautres sites. Les cinétiques observées ne sont plus des cinétiques michaeliennes. On parlera de constante apparente. Ce sont des petites molécules qui vont moduler lʼactivité de lʼenzyme. Ils vont servir de régulateurs de réactions métaboliques. La petite molécule qui est fabriquée en fin de chaine va servir de régulateur : effecteur allostérique. Si la petite molécule est produite en grosse quantité, elle va venir se fixer sur le premier enzyme et la chaine métabolique va sʼarreter. La petite molécule nʼétant plus sur le premier enzyme il va reprendre son activité. Ces enzymes ont une structure quaternaire.

1- Activateurs allostériques

La conformation de lʼenzyme va etre modifiée. Le site actif va aussi subir une modification, on aura une diminution de la constante apparente ce qui va traduire une augmentation de lʼaffinité de lʼenzyme pour son substrat.

2- Inhibiteurs allostériques

La conformation de lʼenzyme sera modifiée. Le site actif sera modifié dʼune manière défavorable du site actif, on aura une augmentation de la constante apparente et une diminution de lʼaffinité.

3- Schéma dʼune transition allostérique

!"#$%&'(#')*#+,-./,0,1#

!"#$%&'(#')*#+,-./,0,1#

!

Forme ACTIVE

Forme INACTIVE

site ALLOSTERIQUE site ACTIF

Produit, P Sous unité

REGULATRICE Sous unité

CATALYTIQUE

Substrat, S

site ALLOSTERIQUE site ACTIF

Produit, P X

Inhibiteur ALLOSTERIQUE

!"#$%&'(#')*#+,-./,0,1#

4- Cinétique allostériqueCinétique allostérique

SANS EFFECTEUR

!"#$%&'(#')"#*+,-.+/+0#

K app K app K app

Ce sont des trétramères (enzymes), tous les sites allostériques ne sont pas occupés en meme temps. Lʼinhibiteur va augmenter la constante donc on modifie le site actif mais Vm et Vm/2 ne change pas. A force de mettre un activateur on va se rapprocher dʼune cinétique michaelienne.

Modification de lʼactivité : fixation covalentePhosphorylation est caractérisée par une kinase. Déphosphorylation est faite avec une phosphatase. => transmission de lʼinflux nerveux => métabolisme du glycogène