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Études Fonctionnelles sur modèles cellulaires

I- Les techniques de fractionnement tissulaire et cellulaires!→ objectifsLe problème est comment on va pouvoir séparer les cellules différentes. !Un organe est constitué d'un ensemble de cellules différentes (ex : cœur, rein, vaisseau). Ex : Dans un ventricule il y a pratiquement autant de cellules cardiaques que de fibroblastes. Il va donc falloir séparer la cellule cardiaque du fibroblaste. 15 types de cellules différentes pour le rein.Sauf cas rares de cellules spontanément isolées, (immunologie, hématologie), les cellules ne sont jamais isolée, il faut donc préalablement dissocier l'organe ou le tissu. Il faut ensuite séparer les différents types cellulaires à partir d'un mélange cellulaire complexe. On va essayer dʼavoir une suspension cellulaire, de différents types cellulaires, a ce moment il y a donc un problème de dissociation. Ex: le cœur. On a pas que des cellules cardiaques, on a aussi des fibroblastes..

On va utiliser les méthodes classiques de séparation d'un mélange de protéines, adaptées à la survie des cellules et respectant l'intégrité des cellules en vue de leur éventuelle mise en culture. L'intérêt est d'obtenir un seul type cellulaire en biologie, pharmacologie ou en toxicologie.

Quelle différence y a t'il entre une protéine et une cellule ? (important)

Une protéine 10 000, 50 000 daltons (petit et simple) et une cellules c'est des milliers, millions de cellules c'est beaucoup plus grand, la cellule est vivante, ainsi séparer 2 protéines, c'est beaucoup plus facile que de séparer deux cellules car on doit respecter l'intégrité, la viabilité, la survie des cellules lors de la séparation. Il y a une différences entre séparer des protéines et séparer des cellules. Une cellule est fragile (maintenir lʼintégrité de la cellule) on va donc avoir des contraintes, à 45° et à pH adapté a la cellule.Les méthodes sur le principe sont les mêmes, mais les applications sont différentes, l'adaptation est importante car il faut que les cellules soient préservées et continuent a être vivantes.

Il faut des cellules dans un état parfait pour pouvoir les mettre en culture.

Intérêt pratique de la séparation des cellules. Domaine d'intérêt : la biochimie, la cytologie, la culture cellulaire, l'hématologie. Un organe est toujours composé de plus d'un type cellulaire, par exemple le coeur, une artère, le rein etc … Pour connaître la structure et/ou fonction d'un type cellulaire, il faut qu'elle soit isolée des autres et qu'elle constitue une population cellulaire homogène purifiée.

Principe de la séparation cellulaire

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Techniques de fractionnement tissulaire, cellulaire et sub-cellulaire : Ces techniques sont différentes suivant se que l'on veut faire et étudier.- Les techniques douces (on a pas casser de membrane cellulaire) de fractionnement

(séparation des cellules d'un mélange), attaque enzymatique et/ou mécanique ménagée (trypsine) préservent l'intégrité des cellules (cultures cellulaires)

- Les techniques plus brutales d'homogénéisation et de lyse cellulaire préservent l'intégrité des organites sub-cellulaires (REG, noyau, mitochondries ...)

- Les techniques encore plus brutale d'homogénéisation, pour les dosages biochimiques tissulaires. Disparition de la structure cellulaire ou sub-cellulaire d'origine. (par exemple appareils a ultra sons qui vont casser la cellule). Pour des études biochimiques.

Parallèle entre la séparation de protéines et la séparation de cellules, certaines techniques de séparations sont les mêmes : centrifugation, chromatographie, électrophorèse (: séparation des protéines, cytoélectrophorèse : séparation des cellules). Ces mêmes méthodes ont été adaptées a la séparation d'un mélange de cellules, en essayant de préserver la structure initiale.

1- Sédimentation

Cʼest la méthode de fractionnement la plus simple, rapide et économique avec des performances limitées. Elle utilise la gravitation universelle 1g. Il faut pouvoir séparer des cellules de grande différence de taille ou de densité. Lʼapplication, que vous connaissez tous, est la donnée biologique de base : NFVS (Numération Formule- Vitesse Sédimentation (des hématies)). (laboratoire dʼanalyse)

2- La centrifugation cellulaire

Historique : augmenter g.Formule de base et interprétation : La formule de la vitesse de déplacement V dʼune particule (une cellule par exemple) nʼest pas a connaitre par coeur :

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Quels sont les paramètres qui vont déterminer la séparation des particules ?- V est donc proportionnelle : - au carré du diamètre (a) de la particule plus une particule est grosse, plus elle va au fond. - à la différence de densité de la particule (ρρ ) et du milieu (ρ m)

- au carré de la vitesse angulaire du rotor (ω².r) vitesse avec laquelle la centrifugeuse va tourner.Plus la particule est grosse, plus la différence de densité est grande entre la particule et le milieu, plus la vitesse de séparation sera importante.- V est donc inversement proportionnelle : à la viscosité (eta) du gradient de densitéPlus la viscosité est importante, plus la particule sera retenue, se sera plus difficile a séparer.

Les différents modes de centrifugation en gradient de densité discontinu ou continu : Nous venons de voir que la séparation de deux particules (= par approximation, aux cellules) dépend de deux paramètres majeurs : le diamètre et la densité cellulaire. La séparation peut donc se faire grâce à la seule différence de densité cellulaire (centrifugation isopycnique). Ou la séparation peut se faire grâce à la différence de densité et de diamètre cellulaires (velocity centrifugation)

Deux paramètres essentiels pour séparer les cellules : on utilise soit un paramètre soit les deux paramètres.

3- L'ultracentrifugation différentielle

Définition : centrifugation à grande vitesse supérieure à 20.000g et pouvant atteindre jusqu'à 100.000 à 200.000g Principe : selon la taille et la densité, on peut séparer les sous-fractions cellulaires en en faisant varier la vitesse de rotation et le temps de rotation. Matériel : des ultra-centrifugeuses réfrigérées (échauffement avec la vitesse de rotation) à basse température, de plus en plus rapides. Résultats : c'est la méthode de référence pour séparer les organites sub-cellulaires purifiés (noyaux, mitochondries, microsomes, ribosomes, etc … ). => Risque de contamination, marqueurs spécifiques.

Préparation des échantillons : Voulant obtenir les sous-fractions cellulaires, il faut faire éclater les cellules. En règle générale, on pratique un broyage mécanique des tissus, c'est l'homogénéisation des tissus. On peut aussi procéder, par lyse osmotique ou par vibration par ultrasons, en rompant les membranes plasmiques cellulaires, tout en préservant les autres biomembranes des organites.

Importance de l'ultracentrifugation différentielle en biologie cellulaire : Couplée avec la microscopie électronique, l'ultracentrifugation a permis, dans les années 50 – 60, la découverte et la connaissance de la biochimie d'organites majeurs, comme les lysosomes, les peroxysomes ou les ribosomes (on ne pouvait pas les voir avant que en ME).

Obtention des sous – fractions cellulaires : - Prélèvement et dissection d'un échantillon tissulaire (biopsie)- Homogénéisation tissulaire par broyage mécanique - Différentes centrifugations (1000, 10 000, 100 000) - Centrifugation 1 (1000g) : noyaux et surnageant S1

- Centrifugation 2 (10.000g) : mitochondries et S2 - Centrifugation 3 (100.000g) : microsomes et S3 - Centrifugation 4 (10.000) reticulum et ribosomes. On reprend la fraction microsomes, vésicules délimitées par une membranes qui sont des fractionnement du réticulum de lʼappareil de Golgi. On ajoute un détergent pour décoller les ribosomes des membranes du réticulum. Centrifugation.

Séparation de sous-fractions cellulaire par centrifugation :

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Biologie moléculaire de la cellule Lodish, 3ème édition

Empilement suivant la taille, la densité des molécules

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On ne peut pas assurer avoir 100% dʼun type cellulaire. Si on a affaire a deux organites de tailles et de poids très différentes, Si on a des organites de taille proche, en prenant une couche on va avoir une contamination avec la couche du dessous.On refait ensuite une centrifugation avec la couche qu'on a extrait et qui est un peu contaminée. Après on est vraiment sure d'avoir 100% de l'organite que l'on veut.

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Sous fraction microsomes dʼorigine de la fraction microsomes!"#!$%$&'()*+",$-+)'"!"-.!$

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Ce sont des vésicules délimitées par une membrane qui ne renferment par grand chose. Fraction issue du REG, le détergent détache tous les ribosomes des membranes, on centrifuge pour avoir la séparation.

4- La cyto-électrophorèse (electrophorése pour les cellules)! !a- Généralités sur l'électrophorèse et la cyto-électrophorèse

On peut séparer des protéines dans un champ électrique selon leur différence de charge : c'est l'électrophorèse. De même, on peut séparer des cellules dansun champ électrique selon leur différence de charge, liée à leur surface cellulaire : c'est la cyto-électrophorèse. En règle générale, les cellules sont électro-négatives (elles migrent vers le pole positif); l'origine de cette électro-négativité est ?? Mais dans des conditions pathologiques, l'électro-négativité diminue. Cette technique est particulièrement utilisée en immunologie.

b- Techniques d'électrophorèse dans l'espace

La séparation de deux particules est, sur terre, limité par la gravité. La séparation dans un champ électrique s'accompagne d'un échauffement (effet Joule). Dommageable pour les cellules. Dans l'espace, en apesanteur, lors des vols Apollo et Soyouz, des expériences ont permis de séparer des matériaux et des cellules 500 à 700 fois plus abondants et 4 à 5 fois plus purs qu'à terre (ex : obtention de cellules neuro-endocrine, de neuromédiateurs).

5- Immunoselection cellulaire (chromatographie d'affinité cellulaire)

- Principe de la chromatographie d'affinité.- Les phases non miscible ligand/matrice - Séparation des cellules selon leur propriétés de surface membranaire - Les différents ligands pour immuno-adsorber les cellules (anticorps, hormones, lectines) - Applications

Principe : La chromatographie !"#$%#!&'(&')*'%+",-*.,/"*!+#&'

Biologie moléculaire de la cellule Alberts, 4ème édition

Permet de séparer des protéine en mettant un mélange sur une colonne remplis de substances plus ou moins poreuses.

La chromatographie d'affinité !

Biologie moléculaire de la cellule Alberts, 4ème édition

Lorsquʼon met un Ac et un Ag spécifique : il se forme un complexe avec lʼAc spécifique de lʼAg : un seul type de cellule.

Principe : La chromatographie d'affinité (moléculaire ou cellulaire) occupe une place importante dans les méthodes de séparation des molécules biologiques et des cellules d'un mélange. Le principe repose sur l'adsorption spécifique et réversible d'une substance ou d'une cellule sur un ligand immobilisé irréversiblement, lui même fixé sur un support appelé matrice. Les acteurs en présence : matrice / ligand / cellules à séparer.

Quel est le but de cette expérimentation ? Obtenir une suspension pure de cellule. Pour cela il faut détacher les cellules de leur ligand spécifique. La liaison ligand/cellule doit etre réversible. A lʼinverse la liaison matrice. ligand doit etre irréversible car la meme colonne sert plusieurs fois.

Les différents ligands pouvant immuno-adsorber les cellules : Nous venons de voir que le mélange de cellules présentant des surfaces membranaires variables va se présenter devant un ligand fixé solidement sur des billes, la matrice – support. Les ligands se lient à des constituants membranaires de la cellule, qui peuvent être par exemple : - des anticorps : (reconnus par un antigène)- des hormones (reconnues par un récepteur) - des lectines (reconnues par des sucres des glycoprotéines)

6- Tri cellulaire par cytométrie en flux (FACS) :!Quel est le critère de sélection pour les différents types de cellules ?

Principe et définition Originalité de la technique : analyse multi-paramétrique cellule par cellule d'un mélange cellulaire complexe (plusieurs critères possibles)Principe de l'appareil et principaux éléments de l'analyseur Approche qualitative (analyse) et quantitative (tri) Les paramètres cellulaires mesurables par cytofluorimétrie Traitement du signal et interprétation des résultats Quelques applications (biologie cellulaire, hématologie, cancérologie, toxicologie cellulaire)

Les principales méthodes de séparation d'un mélange de cellules et le(s) critère(s) de sélection : - la centrifugation cellulaire- et l'ultracentrifugation différentielle ! Densité, taille- la cyto-électrophorèse! Charge électrique- l'immuno-sélection cellulaire (ou chromatographie d'affinité cellulaire)! Caractères structuraux spécifiques- Cytométrie en flux! De très nombreux paramètres à la fois Plus on a de choix de critères de séparation plus on a de chances de séparer la cellule 1 de la cellule 2.

Principes et technique : Place originale parmi les méthodes de séparation cellulaire : Les caractéristiques essentielles de la technique Des capteurs spécifiques sont capables de mesurer la fluorescence de différents fluorochromes, qui peuvent se positionner à la surface (membrane) ou à lʼintérieur de la cellule.

Principe: je veux séparer deux cellules, une blanche une noire.On a un mélange de cellules isolées, séparées (suspension cellulaire). Un liquide sous pression fait que ces cellules sont aspirée et passent dans un tube capillaire microscopique. Il ne doit défiler par goutte au plus une cellule. Parfois dans la micro-goutte il nʼy a rien. La capillaire doit être suffisamment grand pour faire passer une cellule, mais assez petit pour ne pas laisser passer deux cellules. Au niveau du détecteur si on a les deux types cellulaires, elle analyse chaque fois et collectionne lʼanalyse des cellules. Elle dit au final le nombre de pourcentage de cellules. L'appareil enregistre ce qu'il reçoit.J'affiche un paramètre qui m'intéresse, ensuite on va charger les cellules (par fluorescence par exemple), pour ensuite les séparer. Les cellules acquérissent des charges électriques. Elles passent entre deux électroplaques. Les cellules + vont vers le – et les cellules – vont vers le +. A la fin on a un tube avec les cellules A et un tube avec les cellules B. Dans 99% des cas lʼopération est terminée. La goutte dʼeau tombe par lʼapesanteur (ni plus ni moins).

Principe et techniques : - Utilisation de sondes fluorescentes spécifiques- Les paramètres cellulaires mesurables- Exemple du marquage des protéines et des acides nucléiques- Principe du fonctionnement - Les principaux éléments de lʼanalyseur - Approche qualitative (analyse)- Approche quantitative (tri cellulaire)

Quelques applications de la cytométrie en flux : - étude du cycle cellulaire- analyse des chromosomes (caryotype) - viabilité cellulaire (cytotoxicité) - étude de la membrane cellulaire

- étude des cellules immunitaires - application en hématologie - application en cancérologie

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III- Les cultures cellulaires

Historique :Technique introduite, dès la fin du XIXième siècle, utilisée en histologie en embryologie, puis en cancérologie. Développement des méthodes, dites alternatives à l'expérimentation animale, dans les années 80. Essor considérable en recherche publique et privée, notamment dans l'industrie pharmaceutique, avec le développement de la pharmaco-toxicologie cellulaire. 40% dʼanimaux ont été sauvés.

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Quand sʼarrete lʼin vivo et ou commence lʼin vitro ? Lʼin vivo cʼest lʼétude dʼun organisme entier dans sa plénitude et son intégrité. A partir du moment ou lʼon prélève une partie de lʼindividu, on a une portion, on entre donc dans lʼin

vitro. Parmi les modèles in vitro on a les organes isolés (ex : les tranches dʼorganes), et la suspension cellulaire.

Principe et définition : La culture d'organes ou de tissus permet la conservation prolongée de cellules vivantes à l'extérieur d'un organisme vivant. On peut ainsi conserver des fragments de tissus prélevés aseptiquement, dans des conditions stériles, dans un milieu nutritionnel riche pendant plusieurs (dizaines) de jours, placés dans une étuve, à la température de l'organisme, chez qui a été prélevé le tissu. C'est la seule méthode qui permet de conserver pendant plusieurs dizaines de jours des cellules vivantes en dehors de l'organisme, et de leur permettre de conserver deux éléments qui sont majeurs en biologie: leur prolifération et la différenciation.

Technique de cultures cellulaires : Ensemble de techniques utilisées pour faire croitre des cellules hors de lʼorganisme.

La technique des cultures cellulaires

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Cultures primaires

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On a un tissu originel, cohérent, complexe, avec des cellules soudée.On fait des homogénéisation, on casse les cellules par des moyens physiques (mais pas de cellules intègres !) . Lorsquʼune cellule recouvre la totalité de son support on dit quʼelle

est a confluence. Les étuves sont thermostatée mais avec un gaz carbonique a 5% : CO2 + H20 => bicarbonate => le pH ne va pas varier trop vite.

donc on utilise des attaques ménagées → dissociations grâce a des enzymes (ex: trypsine pour hydrolyser les protéines) puis son obtient une suspension cellulaireon attaque des petits morceaux de tissus avec les enzymes, ce qui donne une suspension cellulaire. (paragraphe pas sur)

Les techniques de mise en culture : - prélèvement de l'échantillon- dissociation tissulaire (attaque mécanique ou enzymatique)- mise en culture (conditions de stérilité) - développement de la culture - surveillance de la culture (T°, pH, teneur en CO2, absence de virus ou de bactéries) !→ pourquoi atmosphére CO2 ?ce milieu de culture sert de nutriments aux cellules, mais tt les déchet se retrouvent aussi dans la cellule. Ces déchets sont acides. Si on ne veut pas que le pH baisse, qu'il reste a 7,3 environ, on met du CO2 car en présence d'eau, il donne du bicarbonate qui tamponne. - Etude directe, repiquage, congélation

Remarques sur la technique des cultures : - Modèle in vitro vs in vivo - Cultures histotypique et organotypique- Culture cellulaire en mono-couche (assise cellulaire unique) sur un support : lorsquʼun support est complètement saturé on est obligé de changer le support. On va détacher les cellules dʼune boite on les fait proliférer dans 3 boites. Les cellules vont recommencer a proliférer et elles vont confluer : cʼest le repiquage. - Possibilité d'observation directe sous un microscope photonique, dit inversé. → La microscopie utilise des coupes, sauf le microscope inversée, on met la boite de culture directement sous microscope.Cad que les objectifs sont dessous. Seul le microscope inversé permet d'observer les boites de cultures directement.- Grande analogie entre une culture cellulaire en mono-couche et une coup histologique (plus épaisse) pour la microscopie photonique. Mais la différence : c'est un tissu vivant non fixé. On peut directement observer des cellules grâce a la culture en mono-couche contrairement a l'histologie.

Boites de culture et boites de pétri pour la culture cellulaire comme support cellulaire :

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Documentations techniques

Exemples de différentes tailles de boite de culture selon lʼusage !"!#$%!&'(!'()**!+!,-!&'-.)%%!&'(!'

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Différentes boites multi-puits de culture-intéret pratique!"##$%$&'$()*+"'$(),-.'")/)0-"'()!$)

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Pipette multi-canaux pour ensemencer des boites multi-puits

Culture of animal cells Freshney, 4ème édition

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La pipette multicanaux va permet de renverser 8 cellules identiques, pour avoir le meme volume de la solution dans les 8.

Hotte a flux laminaire pour la mise en culture en milieu stérile!"##$%&%'()*%(&+,-&,.$%/").%(&%+,0$%

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Etuve thermostatée (37°) à CO2 pour cultiver les cellules!"#$!%"&!'()*"+"!!%,-./0%+%1)2%3)#'%

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Microscope inversé pour lʼobservation directe des cultures : !"#$%&#%'()!"#$%&$)'%*$)

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Cʼest un non sens histologique. Le faisceau vient sous la boite et de ce fait lorsquʼon regarde sous le microscope on voit directement le fond de la boite.

Cellules épithéliales en culture (avant et à confluence) Définition de la confluence

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Avant confluence A confluence Documents personnels

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Congélation de cellules cultivées pour conservation (stockage)!"#$%&'()"#*+%*!%&&,&%-*!,&().%%-*/",0*!"#-%0.'()"#*1-("!2'$%3*

Utilisation des lignées cellulaires en cultures cellulaire (intéret)

Utilisation des lignées cellulaires en cultures cellulaires (Intérêt)

Lignées cellulaires établies

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Quelques applications des cultures cellulaires (dont on peut suivre tt les jours l'évolution): - Connaissance de la structure et de la physiologie cellulaire sur tissu vivant (on peut cultiver tout les types cellulaire)- Maintient des cellules dans des conditions « physiologiques » comme in vivo. - Étude de la toxicité cellulaire.- Étude directe de la concentration cellulaire. - Utilisation future des cellules en culture pour la thérapie cellulaire.

Les inserts pour les cultures de cellules épithéliales polarisées

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Documents techniques

Cinétique de variation de taille d'une cellule musculaire en culture!"##$#"%&$'!$#()*"%"+%!$#,$*"!!


Méthodes immunohistochimie révélation des filaments dʼactine

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Culture cellulaire et thérapie cellulaire Définition : la thérapie cellulaire consiste en l'injection de cellules humaines à un patient dans le but de prévenir, traiter ou atténuer sa maladie.Son but est de remplacer les cellules déficientes de l'organisme

Applications en pathologie : Les cellules obtenues, par un prélèvement direct ou après prolifération en culture cellulaires, sont injectées au patient (=greffe cellulaire). On parlera de « cellules médicaments »

Exemples de greffes de cellules sanguines (leucémie), cutanées (greffe de peau chez les brûlés, musculaires (infarctus du myocarde) ou nerveuses (pathologies neuro-dégénératives).