Annales de pathologie (2013) 33, 375—385

Disponible en ligne sur

www.sciencedirect.com

MISE AU POINT

Effets secondaires carcinogènes etrésistances aux thérapies ciblées anti-BRAF

Cellular and molecular mechanisms of carcinogenic side effectsand resistance to BRAF inhibitors in metastatic melanoma withBRAFV600 mutation: State of the knowledge

Mathieu Capovilla

Service de pathologie, centre Francois-Baclesse, 3, avenue Général-Harris, BP 5026, 14076Caen cedex 05, France

Accepté pour publication le 4 septembre 2013Disponible sur Internet le 31 octobre 2013

MOTS CLÉSMélanomemétastatique ;Mutation BRAFV600 ;Thérapie ciblée ;Carcinogenèse ;Résistance

Résumé Le mélanome cutané fait partie des tumeurs malignes dont le potentiel métastatiqueest le plus important. Si le pronostic des mélanomes traités par exérèse précoce est favorable,le pronostic des mélanomes métastatiques reste sombre. L’essor de la caractérisation molécu-laire des cancers, avec notamment la découverte des mutations du gène BRAF dans le mélanomemétastatique, a permis le développement récent de thérapies ciblées inhibant spécifiquementla protéine BRAF mutée. Ces thérapies ciblées, ayant fait l’objet de plusieurs essais cliniquesaux résultats favorables, constituent actuellement un espoir pour les patients. Cependant, lamodulation pharmacologique de la voie de transduction du signal par les MAP kinases est àl’origine d’effets secondaires notamment carcinologiques paradoxaux cliniquement potentiel-lement délétères. L’efficacité de ces nouvelles thérapies ciblées est également limitée parl’apparition quasi inéluctable de résistances secondaires après une phase initiale de réponsetumorale. Les mécanismes cellulaires et moléculaires de ces toxicités et de ces résistancesaux thérapies ciblées anti-BRAF restent mal connus et font actuellement l’objet de nombreuxtravaux de recherche fondamentale et clinique dans le but d’améliorer le confort et la surviedes patients. Cette mise au point correspond à une revue de la littérature concernant les méca-nismes de survenue de ces effets indésirables carcinologiques et des résistances cellulaires auxthérapies ciblées anti-BRAF, dépendants majoritairement de la modulation pharmacologiquedes voies de signalisation cellulaire impliquées dans la mélanomagenèse.© 2013 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés

Adresse e-mail : m.capovilla@baclesse.unicancer.fr

0242-6498/$ — see front matter © 2013 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservéshttp://dx.doi.org/10.1016/j.annpat.2013.09.003

3

anomd witolecular characterization of cancers, notably the discovery of BRAFic melanoma, allowed to the recent development of targeted the-F protein. Despite high tumor response rates observed in clinicalassociated with frequent secondary tumor resistance occurrenceic side effects. The cellular and molecular mechanisms of thesed secondary resistance are not yet fully elucidated and are actuallyw of the literature focus on the mechanisms of these carcinogenicor resistance associated with anti-BRAF targeted therapies.. All rights reserved.

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3 gènes. Environ 30 mutations de BRAF ont été identifiéesmais la plus fréquente, représentant 90 % des cas, impliqueune transversion T→A en position 1799 du gène aboutis-sant au niveau protéique à la substitution d’une valinepar un acide glutamique en position 600 (V600E) [3]. Cesmutations entraînent une modification conformationnelledu domaine d’activation kinase conférant à la protéineanormale une activité kinase constitutive augmentée, res-ponsable de l’activation dérégulée de la voie de signalisationRAS-RAF-MEK-ERK (MAP kinases) stimulant la transformationde mélanocytes immortalisés in vitro [4,5] (Fig. 1).

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KEYWORDSMetastaticmelanoma;BRAFV600 mutation;Targeted therapy;Carcinogenesis;Resistance

Summary Cutaneous melearly treatment is associateremains poor. Advances in mgene mutations in metastatrapies against mutated BRAtrials, these new drugs areand paradoxical carcinogencarcinogenic side effects anintensely studied. This revieside effects and on the tum© 2013 Elsevier Masson SAS

e mélanome est une tumeur maligne cutanéo-muqueuseérivée des mélanocytes issus embryologiquement desrêtes neurales. L’histoire naturelle et le pronosticépendent de multiples critères histologiques, notammente l’épaisseur de l’envahissement tumoral selon Breslow. Si’évolution des mélanomes cutanés traités par exérèse pré-oce est favorable, le pronostic des mélanomes au stadeétastatique est sombre avec seulement 30 % de survie à

n an.L’essor de la caractérisation moléculaire des cancers

ssocié au développement de la recherche pharmaceutiquepermis la synthèse de molécules inhibant les enzymes

ellulaires dérégulées lors de la tumorogenèse et ciblantpécifiquement les cellules tumorales, à l’origine du concepte thérapie ciblée. Les mélanomes métastatiques pré-entant fréquemment des mutations du gène BRAF, leéveloppement récent d’inhibiteurs spécifiques ayant fait’objet d’essais cliniques de phases 1 à 3 constitue actuelle-ent un grand intérêt médico-scientifique et un espoir pour

es patients. Ces thérapies ciblées ont montré un poten-iel d’amélioration de la survie sans progression et de laurvie globale par rapport aux traitements classiques anté-ieurs dans les essais de phase 3. Ces traitements présententependant des limites du fait de la survenue d’effets indé-

irables cutanés notamment carcinologiques, d’une réponseumorale majoritairement partielle, de l’existence de résis-ances innées et de la survenue quasi inéluctable deésistances secondaires se traduisant par une durée deéponse moyenne de 6,7 mois. Ces mécanismes de résis-ance secondaire font actuellement l’objet de nombreusestudes fondamentales dans le but de proposer des alterna-ives thérapeutiques aux patients dont les tumeurs sont enchappement.

Cette mise au point correspond à une revue de la litté-ature concernant les mécanismes de survenue des effetsndésirables carcinologiques et de résistance cellulaire auxhérapies ciblées anti-BRAF, dépendants majoritairement dea modulation pharmacologique des voies de signalisationellulaire impliquées dans la mélanomagenèse.

RAF et mélanome

a mise en évidence de mutations du gène BRAF dans leélanome résulte de l’étude génétique somatique réali-

ée par l’équipe de l’institut Sanger en 2002 à partir deignées cellulaires tumorales et d’échantillons tumoraux1,2]. RAF est une sérine/thréonine kinase régulée par RASomportant 3 isoformes (ARAF, BRAF et CRAF) codés par

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M. Capovilla

a is a malignant tumor with a high metastatic potential. If anh a favorable outcome, the prognosis of metastatic melanoma

igure 1. Voie des MAP kinases. La voie des MAPK, activée par laiaison d’un facteur de croissance à son récepteur membranaire, estonstituée d’une cascade de trois kinases (RAF, MEK et ERK) physio-ogiquement régulée par RAS (voie de gauche). En présence d’uneutation de BRAF, la voie des MAPK est constitutivement et forte-ent activée indépendamment de RAS (voie centrale). Le ciblage de

a protéine BRAF mutée par le vémurafénib permet l’inhibition dea voie de transduction (voie de droite). R-TK : récepteur à activitéyrosine kinase ; MAPK : mitogen-activated protein kinase ; MEK :itogen-extracellular-signal regulated kinase ; ERK : extracellular

ignal-regulated kinase.AP kinase pathway. The MAPK pathway, activated upon ligationf tyrosine kinases receptors, consists of a 3-kinases cascade (RAF,EK and ERK) physiologically regulated by RAS (left pathway). Theccurrence of a BRAF mutation constitutively activates the MAPKathway independently of RAS requirement (middle pathway). Tar-eting mutated BRAF protein with vemurafenib inhibits the MAPKathway (right pathway).

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Effets secondaires carcinogènes et résistances aux thérapie

La fréquence estimée des mutations de BRAF seraitde 33 à 47 % des mélanomes primitifs et de 41 à 55 % desmélanomes métastatiques [6]. Une étude par CGH-arraydes différents types clinico-pathologiques de mélanomesa montré que les mutations de BRAF étaient plusfréquentes dans les mélanomes développés sur zonesavec exposition solaire intermittente [7]. Les mélanomesprimitifs BRAF mutés présenteraient des caractéris-tiques anatomo-cliniques particulières dont un jeune âgeau diagnostic, l’absence de dommages actiniques, unnombre élevé de nævi mélanocytaires et des spécificitéshistologiques (mélanocytes épithélioïdes, charge méla-nique importante et nombreuses ascensions pagétoïdes)[6].

La mutation BRAFV600E semble représenter environ 80 %des cas de mélanomes BRAF mutés selon les séries [3]. Cettemutation BRAFV600E semble également présente dans plus de80 % des nævi mélanocytaires acquis, suggérant que cetteanomalie et l’activation de la voie des MAP kinases consti-tueraient une étape précoce critique dans l’initiation dela néoplasie mélanocytaire [8]. Cependant, l’expression deBRAFV600E dans les cellules næviques bénignes aboutit à leursénescence [9], suggérant que la présence d’une mutationBRAFV600E serait insuffisante pour l’induction de mélanomes.La transformation des mélanocytes nécessiterait des modi-fications génétiques et/ou épigénétiques additionnelles àla mutation BRAFV600E, telles qu’une inactivation des gènesCDKN2A et PTEN ou une activation et/ou une amplificationdes gènes NRAS, KIT, CCND1, CDK4 et MITF [7,10—13]. Lesnouvelles techniques de séquencage génomique pourraientpermettre l’identification de nouvelles mutations géniquesaméliorant la compréhension des mécanismes de la néo-plasie mélanocytaire et pouvant éventuellement constituerdes cibles thérapeutiques ultérieures [14]. Plusieurs tra-vaux ont soulevé l’hypothèse d’une hétérogénéité tumoraleà type de polyclonalité des mutations de BRAF dans les nævimélanocytaires acquis [15] et dans les mélanomes primi-tifs [10] et métastatiques [16]. Les mélanomes pourraientainsi être constitués d’un mélange de sous-populations cel-lulaires BRAF sauvages et BRAF mutées, chacune ayantune capacité d’évolution métastatique. Cette hétérogénéité

intratumorale et entre les différents sites métastatiquespourrait nécessiter, de facon similaire au modèle du can-cer du sein, l’analyse de l’ADN tumoral circulant provenantde la globalité des sites tumoraux afin de détecter descibles éventuelles et adapter la prescription de thérapiesciblées adaptées [17]. L’ensemble de ces constatations ethypothèses nécessite cependant confirmation et analysescomplémentaires avant d’être validées en pratique cli-nique.

Les méthodes de référence de détection des muta-tions du gène BRAF restent des techniques de biologiemoléculaire. Cependant, la mise au point récente d’unanticorps spécifique de la protéine BRAFV600E (clone VE1,Spring Bioscience®) pourrait représenter à court termeune alternative intéressante pour la mise en évidence decette mutation par technique d’immuno-histochimie stan-dard [18,19] (Fig. 2).

Si le pronostic des mélanomes traités précocement estfavorable, le mélanome en phase métastatique est unemaladie agressive au pronostic sombre avec seulement 33 %de survie à 1 an en raison de l’inefficacité des traite-ments « classiques » de type interleukine 2 et dacarbazine.L’immunothérapie par anticorps anti CTLA-4 (ipililumab),approuvée en 2011 aux États-Unis, a été le premier trai-tement à démontrer une prolongation significative de la

lées anti-BRAF 377

Figure 2. Mélanome avec mutation BRAFV600E: marquageimmuno-histochimique avec l’anticorps anti-BRAFV600E (clone VE1,Spring Bioscience®) : seules les cellules tumorales sont intensémentmarquées (obj × 20) (iconographie du service de pathologie du CHUde Rouen).Melanoma with BRAF V600E mutation: immunohistochemical stai-ning with anti-BRAFV600E antibody (clone VE1, Spring Bioscience®):only tumor cells are intensely labeled (obj × 20). (courtesy of thepathology department of Rouen university hospital).

survie [20]. L’observation de la fréquence élevée des muta-tions de BRAF dans les mélanomes métastatiques a étéà l’origine d’essais cliniques testant des inhibiteurs deRAF à large spectre, notamment le sorafénib [21—23]. Cespremiers essais ayant été décevants, de nouvelles molé-cules ciblant plus spécifiquement la protéine BRAF mutée,dont le chef de file est le PLX4032/vémurafénib/Zelboraf®,ont été développées. Cette nouvelle thérapie ciblée aobtenu l’AMM en France en 2012 pour le traitement desmélanomes métastatiques avec mutation BRAFV600 aprèspublication des résultats d’essais thérapeutiques de phases1 à 3 très favorables en comparaison aux traitements clas-siques [24—28].

Effets secondaires carcinologiques desmolécules anti-BRAFV600E

Un effet inattendu des molécules anti-BRAFV600E consisteen l’activation paradoxale de la voie des MAP kinases enprésence d’une mutation de RAS. Partant du fait que laprotéine mutée BRAFV600E tend à l’homodimérisation etque l’activité de ce dimère est inhibée par les moléculesanti-BRAFV600E, plusieurs modèles ont été proposés pourexpliquer ce phénomène (Fig. 3). L’un de ces modèles seraitqu’en présence d’une mutation oncogénique de RAS sur-ajoutée à la mutation BRAFV600, la protéine BRAFV600E liée àl’inhibiteur formerait un hétérodimère avec CRAF. La trans-duction du signal serait alors médiée par CRAF via la protéineRAS mutée malgré la liaison de la protéine BRAFV600E à soninhibiteur. Un autre modèle serait qu’en présence d’unemutation oncogénique de RAS isolée, le signal médié parla protéine RAS mutée soit préférentiellement transmis viaCRAF. Les molécules anti-BRAFV600 se lieraient à la protéineBRAF sauvage maintenue dans un état conformationnel inac-tif au niveau du cytoplasme, favorisant son recrutementà la membrane plasmique où elle agirait comme cofac-teur de transactivation du signal par CRAF [29,30]. Cesdeux modèles ont en commun le fait que l’activation para-doxale de la voie des MAP kinases (responsable d’effetsindésirables et de résistances au traitement) serait princi-palement médiée par CRAF.

378

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Lniques pré-existantes ou leur potentiel d’induction de

igure 3. En présence d’une mutation isolée de RAS, la voie desAPK serait activée principalement par CRAF (voie de gauche). Deuxodèles sont proposés pour expliquer l’activation paradoxale de

a voie des MAPK dans les cellules RAS mutées exposées au vému-afénib. Dans les cellules avec mutation de BRAF, la liaison de larotéine BRAF mutée et de l’inhibiteur à CRAF permettrait la tran-activation de CRAF (voie centrale). Dans les cellules sans mutatione BRAF, la liaison de l’inhibiteur à la protéine BRAF native permet-rait son recrutement au complexe RAS muté-CRAF et favoriseraita transactivation de CRAF (voie de droite).ignalling occurs predominantly through CRAF with the occurrencef an isolated RAS mutation (left pathway). Two models are pro-osed to explain the paradoxical activation of MAPK in RAS mutantells exposed to vemurafenib. When BRAF and RAS are mutated, theinding of both CRAF and inhibited BRAF may result in transactiva-ion of CRAF (middle pathway). When BRAF is not mutated, bindingf vemurafenib to native BRAF may recruit it to the RAS—CRAF com-lex, where it acts as a scaffold for CRAF transactivation resultingn the activation of MAPK signalling (right pathway).

arcinomes épidermoïdes/kératoacanthomesutanés

es thérapies ciblées ont globalement en commun’apparition d’une toxicité cutanée majoritairementénigne (photosensibilité, rash maculo-papuleux hyper-

ératosiques, érythro-dysesthésie palmo-plantaire danse cas des anti-BRAFV600) [31—35]. Les thérapies cibléesnti-BRAFV600 entraînent l’apparition de carcinomes épi-ermoïdes cutanés chez 15 à 30 % des patients après 8 à2 semaines (au plus tôt après 3 semaines) de traitement.es observations ont abouti au concept qu’une thérapieiblée bloquant une voie oncogénique dans un type cellu-aire tumoral peut promouvoir la tumorogenèse dans unutre type cellulaire par activation paradoxale de la voiees MAP kinases dans des cellules BRAF sauvages avecAS muté et/ou activé. Des mutations activatrices de RASrobablement induites par l’exposition aux rayonnementsltraviolets ayant été décrites dans les kératoses actiniques36], une thérapie ciblée anti-BRAFV600 pourrait accélérer larogression de ces lésions pré-néoplasiques en carcinomepidermoïde.

Deux études de génotypage de carcinomes épidermoïdesutanés ont montré une sur représentation des mutationse HRAS dans les cas survenus sous thérapie ciblée anti-RAFV600 [33,37]. Cette sur représentation des mutationse HRAS chez les patients traités par anti-BRAFV600 pourraitonfirmer cet effet pro-prolifératif de la thérapie ciblée sures kératinocytes RAS mutés dans un contexte d’expositionolaire chronique.

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M. Capovilla

Des expériences de mutagenèse cutanée sur un modèleurin ont révélé que les thérapies anti-BRAFV600 seraient

nsuffisantes pour agir comme agent carcinogène et initiera promotion tumorale mais accélèreraient la progression deésions tumorales pré-cliniques. Cet effet accélérateur sur larogression tumorale des molécules anti-BRAFV600 se mani-esterait donc consécutivement aux altérations induitesar d’autres facteurs pro-carcinogènes et impliquerait’activation de la voie des MAP kinases du fait de l’effetnhibiteur des molécules anti-MEK. Ce modèle de toxicitést paradoxal par le fait qu’il représente l’effet opposé auénéfice attendu d’une thérapie ciblée [37].

Les carcinomes épidermoïdes cutanés induits semblentans tous les cas bien différenciés, ne récidivant pas aprèsxérèse chirurgicale et n’ayant pas montré d’extensionétastatique, témoignant vraisemblablement d’un faibleotentiel évolutif. Il existerait également des observationse régression tumorale spontanée à l’arrêt du traitementiblé, pouvant résulter d’une induction de la sénescenceellulaire ou du développement d’une réponse immunitairepécifique.

L’accélération du développement de ces tumeurs épi-héliales cutanées par les traitements anti-BRAFV600 posea question de leur potentiel pro-oncogénique éventuelur d’autres types tumoraux en particulier des organesrofonds, RAS étant reconnu muté dans environ 30 % des can-ers et au niveau de nombreuses lésions pré-néoplasiquesotamment les adénomes colorectaux. Ces éventuelles pro-ressions de cancers des organes profonds pourraient ne pasvoir été détectées du fait de la faible durée de traite-ent dans les études (6 à 9 mois) pouvant être insuffisante à

eur manifestation. Ces lésions pourraient également éven-uellement avoir été confondues avec une réévolution oune progression du mélanome sous traitement du fait de’absence de données concernant d’éventuelles vérificationsnatomiques des patients décédés au cours des essais cli-iques.

umeurs mélaniques

es effets des thérapies anti-BRAFV600 sur les lésions méla-

ouvelles lésions ont été récemment décrits. Une étude cli-ique a rapporté des modifications variées de l’apparencee nævi mélanocytaires à type d’involution, d’augmentatione taille et de pigmentation (induisant un aspect cliniqueatypique ») et d’apparition de multiples nouveaux nævi

38].Plusieurs études décrivant le suivi dermatologique de

atients traités pour mélanome métastatique rapportenta survenue de lésions mélaniques diagnostiquées histolo-iquement comme des nævi mélanocytaires dysplasiques oues mélanomes précoces [39—41]. Ces lésions mélaniquesemblent apparaître entre 4 et 12 semaines de traitementn moyenne et surviendraient préférentiellement sur desites d’exposition solaire importante. Toutes les lésions étu-iées génétiquement étaient BRAF sauvages à l’inverse deævi mélanocytaires témoins prélevés chez des patients nonxposés aux molécules anti-BRAFV600. L’absence de mutatione BRAF dans ces lésions mélaniques secondaires pourraitonforter l’hypothèse d’un modèle de prolifération induitear une activation paradoxale de la voie des MAP kinasesar les molécules anti-BRAFV600 dans des cellules næviquesrésentant un évènement génétique associé non déterminé.

La fréquence d’apparition ou de modification de lésionsélaniques est mal connue mais serait 10 fois moins

s cib

Effets secondaires carcinogènes et résistances aux thérapie

importante que la fréquence de survenue de carcinomesépidermoïdes cutanés selon les statistiques des centresinvestigateurs [40]. Cependant, les lésions mélanocytairesétant de diagnostic clinique plus difficile que les carcinomescutanés, leur fréquence pourrait être sous-estimée.

Une surveillance dermatologique attentive et régulièredont un examen en dermoscopie serait donc à envisager chezles patients exposés aux traitements anti-BRAFV600 [34].

Leucémie

Un cas clinique récent a rapporté le dossier d’un patienttraité par vémurafénib pour un mélanome métastatiqueBRAFV600K ayant présenté une progression accélérée d’uneleucémie myélomonocytaire chronique NRAS mutée (muta-tion G12R) probablement préexistante mais infraclinique[42]. Le vémurafénib aurait entraîné dans ce cas un effetdiscordant associant une réponse radiologique sur les lésionsde mélanome et une augmentation rapide de la leucocytosesanguine réversible à l’arrêt du traitement. Ce patient aété traité par des doses de maintenance de vémurafénibinterrompues de facon séquentielle lorsque la leucocytoseatteignait 100 000/mm3. L’hypothèse d’un effet bénéfiqued’un anti-MEK n’a pu être vérifiée cliniquement en raisonde l’indisponibilité de ce type de traitement lors de la priseen charge de ce patient.

Conséquences et perspectives

L’indication de traitement par thérapie ciblée anti-BRAFV600 nécessite en premier lieu une sélection rigoureusedes patients candidats par la mise en évidence d’une muta-tion BRAFV600 au niveau de la tumeur cible. Les effetssecondaires carcinologiques inattendus des molécules anti-BRAFV600, induisant la survenue précoce et accélérée decancers (notamment cutanés épithéliaux), pose la ques-tion de l’indication de tels traitements chez les patientsayant un antécédent ou des facteurs de risque de néo-plasie associée à une mutation ou une activation de RASet justifie une surveillance clinique et biologique attentiveau cours du traitement. La réalisation de biopsies itéra-

tives de masses tumorales évolutives accessibles afin devérifier la persistance de la mutation cible afin d’adapterla thérapeutique est également une attitude envisageable.Ces biopsies itératives pourraient être remplacées par ledéveloppement de techniques d’analyse de l’ADN tumoralcirculant, cliniquement moins invasives. Il est à noter queles tumeurs induites par ces thérapies ciblées apparaissentdans les semaines voire les jours suivant l’introduction dutraitement en comparaison aux chimiothérapies classiquesdont les effets carcinogènes se manifestent, en général, desannées ou des décennies après le traitement [43].

Ces effets indésirables pro-néoplasiques pourraient êtreévités par le développement d’une nouvelle généra-tion de molécules anti-BRAFV600 dépourvue de la propriétéd’activation paradoxale de la voie des MAP kinases dans lescellules BRAF sauvages/RAS mutées.

Mécanismes de résistance aux moléculesanti-BRAFV600

L’ère actuelle des thérapies ciblées fait face à des probléma-tiques semblables à celles rencontrées dans les chimiothé-rapies classiques. En effet, les cellules tumorales exposéesà une thérapie ciblée acquièrent fréquemment rapidement

lées anti-BRAF 379

une résistance au traitement, limitant l’efficacité thérapeu-tique. Ces mécanismes de résistance tendent à aboutir àl’engagement de signaux de survie redondants à ceux trans-mis par la voie ciblée.

Les résistances aux thérapies ciblées sont souvent liéesà l’acquisition de mutations géniques secondaires au niveaude la région codant le domaine catalytique entraînant uneimpossibilité stérique de liaison à l’inhibiteur aboutissant aumaintien ou à l’augmentation de l’activité kinase (cas desprotéines ABL, KIT, PDGFRA, EGFR et ALK). Ces mutationssecondaires peuvent également survenir soit à un niveauadjacent au site catalytique (augmentant alors l’affinitépour l’ATP malgré la présence de l’inhibiteur) soit au niveaud’un domaine déstabilisant la conformation inactive de laprotéine. Un autre mécanisme de résistance consiste enune amplification génique aboutissant à une augmentationdu nombre de protéines actives (cas de BCR-ABL, KIT etEGFR). D’autres mécanismes consistent en des altérationsgénétiques en amont de la voie ciblée (mutation de NRASpour la voie des MAPK) ou en l’activation de voies de signa-lisation alternes (récepteurs MET et IGF-1R� activant lavoie PI3 K/AKT/mTOR) [44]. Les mécanismes de résistanceacquise aux thérapies anti-BRAFV600 ne semblent pas en rap-port avec une mutation secondaire de la protéine BRAFV600E

mais avec l’activation de mécanismes moléculaires réacti-vant les différentes voies des MAP kinases et/ou la mise enœuvre de mécanismes de survie cellulaire alternes telle lavoie PI3 K/AKT/mTOR [45,46] (Fig. 4).

Une autre problématique concerne la résistance intrin-sèque aux traitements anti-BRAFV600, les essais cliniquesvalidés rapportant environ 20 % de patients non répondeursselon les critères RECIST [24,47].

Mécanismes de résistance secondaire

Mutations activatrices de NRASL’acquisition par les cellules tumorales BRAFV600E d’unemutation oncogénique de NRAS permettrait une réactiva-tion de la voie des MAP kinases via CRAF en présence dela protéine chaperonne SHOC2 et d’inhibiteurs de BRAFV600.Certaines études ont mis en évidence ces mutations de

NRAS dans des échantillons tumoraux prélevés après traite-ment alors que les tumeurs initiales étaient NRAS sauvages.Les hypothèses de l’acquisition secondaire d’une mutationRAS ou de l’existence initiale de sous-populations tumoralesminoritaires doublement mutées RAS et BRAF (les mutationsRAS et BRAF étant habituellement mutuellement exclusives)sont controversées. La preuve de l’existence de ces popu-lations tumorales doublement mutées RAS et BRAF seraitimportante sur le plan thérapeutique en raison du risqued’évolution rapide de telles lignées lors de l’induction dutraitement anti-BRAFV600E [30,48—54].

Augmentation de l’expression de BRAFV600E paramplification géniqueUne étude de deux lignées cellulaires de cancer colorectalBRAFV600E résistantes aux traitements anti-MEK et anti-BRAFa identifié une augmentation de l’expression de la pro-téine BRAFV600E résultant d’une amplification sélective del’ordre de 10 à 25 copies de l’allèle muté du gène BRAF[55]. Cette amplification de BRAFV600E, mise en évidencepar FISH, a ensuite été observée dans des sous-populationstumorales minoritaires (représentant 3 à 4 % des cellules) auniveau des lignées cellulaires parentales et d’un cas de can-cer colorectal naïfs de traitement. Au niveau des lignées

380 M. Capovilla

F émuv tions( vatioc s stroH S mu4 inasea e); 8c

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igure 4. Mécanismes hypothétiques de résistance acquise au variants d’épissage de BRAFV600 ; 4 : amplification de CRAF ; 5 : mutaPDGFR�, IGF-1R, FGFR3) et de la voie PI3 K/AKT/mTOR ; 7 : réactihromatiniennes épigénétiques ; 9 : sécrétion d’HGF par les celluleypothetical mechanisms of acquired vemurafenib resistance. 1: RA: amplification of CRAF; 5: MEK activating mutations; 6: tyrosine kctivation; 7: ERK reactivation by COT (Cancer Osaka Thyroid kinasells; 10: immune system modulation.

ellulaires, l’augmentation d’expression de BRAFV600E abou-it à une hyperactivation de MEK et d’ERK responsable d’uneimitation de l’effet des traitements anti MEK ; cette activitéhérapeutique est en revanche restaurée par l’introduction’un cotraitement par anti-BRAFV600 à faible dose, suggérantu’une telle association thérapeutique pourrait permettree prévenir le développement de ce type de résistance [55].

Une autre étude a rapporté des gains de matériel géné-

ique correspondant à la région du gène BRAFV600E danses tumeurs de 4 patients atteints de mélanomes devenusésistants au vémurafénib. Ces amplifications de BRAFV600E

ariaient d’un facteur 2 à 14 par rapport aux tumeurs naïvesorrespondantes en analyse par séquencage massif d’exonst RT-PCR quantitative [56]. Au contraire de la résistanceiée à une mutation de NRAS, le mécanisme de résistanceié à l’amplification de BRAFV600E serait indépendant deRAF et correspondrait à une accumulation de la protéineRAFV600E pouvant théoriquement être saturée par une esca-ade de dose d’anti-BRAFV600 et inhibée par un anti-MEKtype AZD6244/sélumétinib).

ariants d’épissage de BRAFV600E

ne étude portant sur des lignées cellulaires résis-antes au vémurafénib générées à partir d’un mélanomeRAFV600E a montré la présence de variants de la protéineRAFV600E caractérisés par un poids moléculaire plus faible57]. À l’électrophorèse des protéines, ces lignées résis-antes présentaient une bande supplémentaire à 61 kDap61 BRAFV600E) en plus de la bande à 90 kDa correspondantla protéine BRAFV600E native de la souche parentale. Ces

ariants, caractérisés par une perte des régions codées pares exons 4 à 8 (comportant notamment le domaine de liaison

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rafénib. 1 : mutations de RAS ; 2 : amplification de BRAFV600 : 3 :activatrices de MEK ; 6 : activation de récepteurs à tyrosine kinase

n d’ERK par COT (Cancer Osaka Thyroid kinase) ; 8 : modificationsmales ; 10 : modulations du système immunitaire.tations; 2: amplification of BRAFV600; 3: splice variants of BRAFV600;receptors (PDGFR�, IGF-1R, FGFR3) and PI3 K/AKT/mTOR pathway

: epigenetic chromatin modifications; 9: HGF secretion by stromal

RAS), présenteraient un taux de dimérisation importantn présence de bas niveaux d’activité de RAS, respon-able d’une activation d’ERK résistante aux anti-BRAFV600.’analyse ultérieure de mélanomes de 19 patients présen-ant une résistance acquise aux anti-BRAFV600 montrait larésence de variants d’épissage dans 6 tumeurs (correspon-ant à des délétions des exons 4 à 10, 4 à 8, 2 à 8 et 2 à 10).’analyse des souches tumorales naïves de traitement cor-

espondantes n’ont pas permis de mettre en évidence cesariants de BRAFV600E, n’excluant cependant pas la présencee clones minoritaires pré-existants non détectables par lesechniques usuelles.

Ces variants d’épissage semblent conserver le cadree lecture et intéressent l’allèle BRAF muté, suggérantne modification épigénétique affectant spécifiquement’épissage des ARNm BRAFV600E sans perte de fidélité globalees mécanismes d’épissage [57].

Les tumeurs avec ce mécanisme de résistance pourraientonserver une sensibilité aux anti-MEK.

ugmentation de l’expression de CRAF’étude in vitro d’une lignée cellulaire de mélanomeRAFV600E devenue résistante à un inhibiteur de RAF (AZ628)montré une réactivation d’ERK médiée par une augmen-

ation de l’expression de CRAF [58]. Cette hyper expressione CRAF semble liée à des mécanismes de régulation post-ranscriptionnelle étant donné l’absence d’amplification duène CRAF détectable par FISH et d’augmentation de laranscription des ARNm CRAF détectable par RT-PCR quan-itative. Ce mécanisme de résistance pourrait être présentu niveau de tumeurs naïves de traitement sous la formee sous-populations minoritaires représentant de l’ordre

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Effets secondaires carcinogènes et résistances aux thérapie

de 1/10 000e de la population tumorale initiale. Ces sous-populations cellulaires seraient en revanche sensibles à latanespimycine, un dérivé de la geldanamycine inhibant laprotéine chaperon HSP90 agissant par activation de la dégra-dation de CRAF et constituant une éventuelle future voiethérapeutique.

Mutations activatrices de MEKLes mutations activatrices de MEK seraient peu fréquentesdans le mélanome ; des mutations d’ERK n’ayant quantà elles pas été identifiées. Une analyse par séquencagemassif des exons de 138 oncogènes et anti-oncogènes deséchantillons d’un mélanome initialement répondeur puisréfractaire à 4 mois au traitement par anti-BRAFV600 a misen évidence la présence d’une mutation C121S du gèneMEK1 [44]. Cette mutation, soit acquise secondairement soitprésente à un niveau indétectable dans la tumeur initiale,confèrerait une résistance aux traitements anti-BRAFV600 etanti-MEK en cours de développement. La détection de tellesmutations pourrait nécessiter l’établissement d’un profilgénomique tumoral exhaustif avant de débuter un traite-ment ciblé adapté aux anomalies moléculaires présentes[44,59].

Activation de récepteurs tyrosine kinase (PDGFR�,IGF-1R, FGFR3) et de la voie de signalisationPI3 K/AKT/mTORLes mélanomes sont initialement dépendants de la voie desMAP kinases pour la survie et la croissance cellulaire. Letraitement par anti-BRAFV600 semble induire l’apparition derésistances par un mécanisme d’activation alterne de la voiePI3 K/AKT/mTOR en aval des récepteurs au PDGF� et à l’IGF-1 [49,60] ou par une réactivation de la voie des MAP kinasesen aval du récepteur au FGF [61]. L’activation de la voiede signalisation PI3 K/AKT/mTOR favoriserait la survie cellu-laire en coopération avec la voie des MAP kinases, réactivéepar recrutement de CRAF [49,60].

Le contournement de ce mécanisme de résistance néces-siterait de cibler les différentes voies de signalisation(MAP kinases et PI3 K/AKT/mTOR) par des thérapies ciblées

combinées.

Réactivation d’ERK médiée par COT (Cancer OsakaThyroid kinase)La protéine COT (MAP3K8) est une sérine/thréonine kinasesemblable à CRAF activant ERK par une voie dépendantede MEK mais indépendamment de RAS et RAF à l’état cel-lulaire de base. La protéine BRAFV600E semble agir commeantagoniste de l’expression de COT par altération de la sta-bilité protéique ; de ce fait, un traitement par anti-BRAFV600E

potentialiserait la prolifération de cellules tumorales expri-mant COT. Des expériences sur lignées cellulaires ontdémontré que l’expression de COT pouvait conférer unerésistance de novo aux anti-BRAFV600E [62]. Le ciblage spéci-fique de COT et/ou de MEK pourrait supprimer l’activationde la voie MEK/ERK dans les cellules tumorales exprimantCOT.

Modifications chromatiniennes épigénétiques etconcept de cellules souchesDes études in vitro récentes ont identifié la présence,au sein de la masse de cellules tumorales constituantun mélanome, de sous-populations mélanocytaires carac-térisées par un temps de cycle cellulaire lent, une

lées anti-BRAF 381

faible croissance, une importante capacité d’adaptation àl’environnement et un développement de résistances auxtraitements [51,63]. Cette croissance cellulaire lente ren-drait ces cellules tumorales insensibles aux chimiothérapiesdu fait de l’absence d’entrée en cycle cellulaire et d’unerésistance à l’apoptose [64,65]. Cet état de tolérance auxtraitements, transitoire et réversible, serait induit par desmécanismes épigénétiques modifiant la structure chroma-tinienne. Ces modifications chromatiniennes épigénétiquesseraient médiées par l’expression et l’activité d’histonedéméthylases de type JARID1A/B caractérisant phénotypi-quement ces sous-populations cellulaires résistantes [66].

JARID1B est un membre de la famille hautementconservée des jumonji/ARID1 (JARID1) histone 3K4 (H3K4)déméthylases impliquées dans le développement embryon-naire, la biologie des cellules souches et le cancer. Cetteprotéine, agissant comme régulateur transcriptionnel, estexprimée à l’état normal dans les tissus présentant un forttaux de renouvellement (moelle osseuse, tubes séminifèresdu testicule). Son expression dans les cellules embryon-naires aboutit au blocage de la différenciation terminalepar l’intermédiaire de la déméthylation des histones H3K4.JARID1B appartiendrait à un complexe multimoléculairecomportant les molécules d’ADN, les histones, des facteursde transcription (de type PAX9 et FOXG1B) et pRb qui seraitstabilisée sous une forme hypophosphorylée, aboutissant àun mécanisme anti-oncogénique par ralentissement du cyclecellulaire. La protéine JARID1B est fortement exprimée dansles nævi mélanocytaires (caractérisés par une sénescencecellulaire) et serait exprimée dans 5 à 10 % des cellulestumorales constituant un mélanome. Cette hétérogénéitétumorale en rapport avec un mécanisme épigénétique actiflors du développement embryonnaire pourrait représenterun modèle dynamique de transition phénotypique continueconstituant une sous-population cellulaire de maintenanceéquivalente aux cellules souches. Ce concept dynamiqueexpliquerait le potentiel tumorigène de chaque celluleconstituant un mélanome dans les modèles de xénogreffes,au contraire du concept de cellule souche unidirectionnelledéveloppé dans le cancer du sein où seules les cellulessouches sont capables d’initiation tumorale.

Ces mécanismes dynamiques régulant la structure chro-matinienne pourraient ainsi expliquer la dualité des effets

anti-prolifératif immédiat et de maintenance à long terme(avec apparition de résistance aux traitements) et lesconstatations cliniques de récupération d’une activité dethérapies ciblées devenues inefficaces après réalisationd’une pause thérapeutique [65]. En raison de la dynamiquede ces sous-populations cellulaires comparables aux cellulessouches embryonnaires, la résistance aux thérapies cibléespourrait survenir de facon instantanée (dès la premièreexposition) plutôt que par évolution progressive commeobservée avec des chimiothérapies classiques.

Une étude a montré l’effet négatif de molécules inhibi-trices de la dihydroorotate déhydrogénase (DHODH) de typeléflunomide sur la transcription des gènes impliqués dansle développement des crêtes neurales (sur un modèle depoisson zèbre) et la croissance de lignées de mélanomeshumains [67]. En l’absence de thérapeutique dirigée contreles histone déméthylases, le léflunomide (habituellementutilisé dans le traitement de la polyarthrite rhumatoïde)pourrait permettre de cibler ces sous-populations cellu-laires constituant un compartiment de cellules souches [68]et fait actuellement l’objet d’un essai clinique de phasesI/II en association avec le vémurafénib (ClinicalTrials.gov :NCT01611675).

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écrétion d’HGF et/ou de FGF2 par leicroenvironnement tumoral

a majorité des études concernant les résistances aux traite-ents anti-tumoraux restent focalisées sur les mécanismes

ntrinsèques à la cellule tumorale. Des expériences de cocul-ures in vitro ont montré que les résistances médiées par letroma seraient fréquentes, comme par exemple la résis-ance à la gemcitabine de lignées de cancers colorectaux etancréatiques induite par des fibroblastes dermiques ou laésistance aux thérapies ciblées anti-HER2 du cancer du seinnduite par les cellules stromales [69].

La réalisation de co-cultures de cellules stromalesbroblastiques et de lignées de mélanomes résistants auémurafénib a permis de sélectionner les populations deellules stromales conférant une résistance au traitement69,70]. Cette résistance apparaît médiée par la sécré-ion d’HGF (Hepatocyte Growth Factor) dans le milieuxtra-cellulaire par les cellules stromales. Des étudesmmuno-histochimiques avec un anticorps anti-HGF réali-ées sur des échantillons tumoraux naïfs de traitement ontontré que la réponse au vémurafénib était moins impor-

ante lorsque l’HGF était détecté dans les cellules du stromaumoral. De plus, cet immunomarquage anti-HGF était tota-ement négatif sur le stroma du mélanome d’un patientyant présenté une réponse tumorale complète au traite-ent. L’étude de biopsies réalisées de facon séquentielle

n cours de traitement a également montré une augmenta-ion progressive d’HGF stromal, pouvant être à l’origine dea survenue d’une résistance. Le HGF se lie au récepteurransmembranaire MET qui possède la capacité d’activerimultanément les voies MAP kinases et PI3 K/AKT/mTOR.ette capacité d’activation simultanée de deux voies deransduction du signal semble restreinte à MET dans lesignées de mélanome étudiées. Le mécanisme exact de laécrétion d’HGF, soit par recrutement de fibroblastes extra-umoraux soit par modification des fibroblastes stromauxésidents, reste à déterminer.

De facon comparable, une étude a rapporté la stimu-ation par le vémurafénib de la sécrétion de FGF2 par lesératinocytes et les fibroblastes stromaux [71]. Ce facteure croissance activerait le facteur de transcription PAX3 via

a voie STAT3, favorisant l’émergence de résistances auxhérapies ciblées.

De facon comparable aux modifications chromatiniennespigénétiques, ces interactions cellules tumorales—cellulestromales pourraient conférer une résistance innée auxnti-BRAFV600E en plus de leur probable implication dans laurvenue de résistances acquises.

Ces mécanismes de résistance pourraient être contour-és par l’instauration de traitements ciblés dirigés contre leécepteur MET ou la protéine STAT3.

ôle de l’immunitéa présence d’une mutation BRAFV600E favoriserait’échappement des cellules de mélanome au systèmemmunitaire par diminution de la présentation des anti-ènes mélanocytaires aux lymphocytes T. De ce fait,es traitements par anti-BRAFV600 et anti-MEK pourraientestaurer la présentation antigénique et ainsi favoriser laéponse immunitaire anti-tumorale [72—74]. En revanche,es anti-MEK réduiraient l’activité des lymphocytes T parnhibition d’ERK dans les cellules lymphoïdes, défavorisanta réponse immunitaire anti-tumorale. Ces effets deshérapies ciblées sur le système immunitaire et la réponsenti-tumorale seraient ainsi à explorer et à prendre en

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ompte en cas de proposition de traitement combiné aveces immunothérapies de type ipililumab (anti-CTLA-4). Cesonstatations soulignent également l’index thérapeutiquelus élevé des anti-BRAFV600 par rapport aux anti-MEK duait de l’absence d’inhibition d’ERK dans les cellules nonumorales, limitant ainsi les potentiels effets indésirables75].

écanismes de résistance intrinsèque

es mécanismes de résistance intrinsèque au vémurafénibont peu connus. Ils pourraient impliquer une surexpressione la cycline D1 favorisant l’entrée en cycle cellulaire lorse l’inhibition pharmacologique de la voie des MAP kinases11] ou l’inactivation de PTEN activant constitutivement laoie PI3 K/AKT/mTOR favorisant la surexpression de la pro-éine anti-apoptotique BIM (Bcl2-interacting mediator ofell death) [60,76]. Les rôles potentiels d’un compartimente cellules souches et des interactions entre les cellulesumorales et les cellules stromales (décrits précédemment)estent à déterminer.

onséquences et perspectives

es mécanismes de résistance intrinsèque et secondaireux thérapies ciblées anti-BRAFV600 semblent multiples etomplexes et restent mal connus in vivo malgré les nom-reuses études récemment publiées. La majorité de cesécanismes d’échappement consiste en une inefficacitéinhiber la signalisation médiée par la voie des MAP

inases et en particulier l’effecteur ERK. Le contourne-ent de ces résistances pourrait se concevoir par une

ugmentation des doses prescrites (cependant limitée para toxicité), par le développement de nouveaux inhibi-eurs ou d’inhibiteurs irréversibles ou par la combinaison’inhibiteurs ciblant plusieurs voies de signalisation et/oussociés à l’immunothérapie [77,78]. Des observations deestauration de l’activité de thérapies ciblées après uneause thérapeutique lors de l’apparition de résistancesecondaires semblent montrer l’intérêt de traitementséquentiels avec instauration de fenêtres thérapeutiques

79—81] ; cette approche reste cependant limitée para croissance tumorale potentiellement rapide lors de’apparition de résistances aux traitements. De nouvelleserspectives de développement pharmacologique sont ànvisager au niveau du contrôle des mécanismes épi-énétiques, des interactions cellules tumorales—cellulestromales et de la régulation du système immunitaire.

Le diagnostic, l’étude et la prise en charge des résis-ances à ces thérapies ciblées pourraient nécessiter enratique des prélèvements itératifs de tissu tumoral deonne qualité en pré-thérapeutique et lors des reprises évo-utives afin d’étudier les profils génomiques des tumeurs etinsi de déterminer les thérapeutiques les plus adaptées auxaractéristiques tumorales à un instant donné [44]. Le pro-able caractère hétérogène des populations cellulaires auein des diverses localisations tumorales pourrait nécessi-er à terme le développement de méthodes d’analyse de’ADN tumoral circulant afin de déterminer les différentesutations présentes et leur représentativité de la popula-

ion tumorale globale présente chez chaque patient [17].Enfin, la signification de la présence d’une mutation

RAFV600 dans les mélanomes reste à déterminer. Les casRAF mutés semblent fortement prévalents dans la popu-ation de patients métastatique et/ou jeunes et associés àne survie inférieure chez les patients métastatiques [6].

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Effets secondaires carcinogènes et résistances aux thérapie

Il n’a pas été démontré d’association entre la présenced’une mutation BRAFV600 et la survie sans progression aprèsla découverte du mélanome primitif mais cette constata-tion est controversée. La biologie tumorale des mélanomespourrait également être dépendante d’anomalies géné-tiques et/ou épigénétiques associées aux mutations deBRAF restant à découvrir et/ou à valider. En l’état actueldes connaissances, la présence d’une mutation BRAFV600 nesemble donc pas être un facteur pronostique prouvé endehors des stades métastatiques mais constituerait plutôt unpotentiel facteur prédictif de réponse aux thérapies cibléesanti-BRAFV600 [82,83].

Conclusion

Les développements de thérapies ciblées anti-BRAFV600 etde nouvelles immunothérapies représentent une avancéeimportante dans la prise en charge des patients atteints demélanome métastatique. Le pronostic global de ces patientsreste cependant défavorable en raison de l’apparition iné-luctable de résistances aux traitements. L’issue critiqueactuelle, source de nombreux travaux de recherche, estla caractérisation de ces mécanismes de résistance intrin-sèque et secondaire aux thérapies ciblées et l’élaborationde stratégies de prise en charge des échappements thé-rapeutiques afin d’obtenir des réponses efficaces durablessans augmenter la toxicité ni altérer la qualité de vie despatients. La stratégie actuellement envisagée pour contrerces résistances serait une combinaison de thérapies ciblées(anti-BRAF, anti-MEK, anti-PI3 K/AKT/mTOR et agents modi-fiants la structure chromatinienne éventuellement associésà l’immunothérapie) déterminée selon les caractéristiquesgénétiques et fonctionnelles de chaque tumeur. Les toxici-tés, les interactions médicamenteuses ainsi que l’efficacitéde telles combinaisons de traitements restent à évaluer parles différents essais cliniques actuellement ouverts.

Les anticorps spécifiques de la protéine BRAFV600E per-mettront aux pathologistes de mettre en évidence de faconindirecte les anomalies moléculaires cibles par techniqueimmuno-histochimique de routine et ainsi être fortement

impliqués dans les indications thérapeutiques au cours de laprise en charge des patients. Ces modalités diagnostiques etthérapeutiques émergentes complexes devront nécessaire-ment prendre en compte le contexte économique actuel dufait du coût élevé et du caractère prolongé des traitements.

Ces recherches fondamentales ne doivent cependantpas dévaloriser les actions de prévention et de dépistagedes mélanomes, le traitement chirurgical des lésions pré-coces restant actuellement la seule modalité thérapeutiquepotentiellement curative.

Déclaration d’intérêts

L’auteur déclare ne pas avoir de conflits d’intérêts en rela-tion avec cet article.

Remerciements

Professeur Jean-Christophe Sabourin (CHU de Rouen) pour larelecture critique du manuscrit et la mise à disposition de laFigure 2 et à Monsieur Gilles Girault (bibliothèque médicaledu centre Francois-Baclesse) pour son aide à la recherchebibliographique.

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Références

[1] Davies H, Bignell GR, Cox C, Stephens P, Edkins S, Clegg S,et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature2002;417:949—54.

[2] Brose MS, Volpe P, Feldman M, Kumar M, Rishi I, Gerrero R, et al.BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma.Cancer Res 2002;62:6997—7000.

[3] Solit D, Rosen N. Oncogenic RAF: a brief history of time. Pig-ment Cell Melanoma Res 2010;23:760—2.

[4] Sturm OE, Orton R, Grindlay J, Birtwistle M, Vyshemirsky V,Gilbert D, et al. The mammalian MAPK/ERK pathway exhi-bits properties of a negative feedback amplifier. Sci Signal2010;3:ra90, http://dx.doi.org/10.1126/scisignal.2001212.

[5] Pritchard AL, Hayward NK. Molecular pathways: mitogen acti-vated protein kinase (MAPK) pathway mutations and drugresistance. Clin Cancer Res 2013;19:1—9.

[6] Long GV, Menzies AM, Nagrial AM, Haydu LE, Hamilton AL,Mann GJ, et al. Prognostic and clinicopathologic associationsof oncogenic BRAF in metastatic melanoma. J Clin Oncol2011;29:1239—46.

[7] Curtin JA, Fridlyand J, Kageshita T, Patel HN, Busam KJ, Kutz-ner H, et al. Distinct sets of genetic alterations in melanoma.N Engl J Med 2005;353:2135—47.

[8] Pollock PM, Harper UL, Hansen KS, Yudt LM, Stark M, RobbinsCM, et al. High frequency of BRAF mutations in nevi. Nat Genet2003;33:19—20.

[9] Dhomen N, Reis-Filho JS, da Rocha Dias S, Hayward R, SavageK, Delmas V, et al. Oncogenic BRAF induces melanocyte senes-cence and melanoma in mice. Cancer Cell 2009;15:294—303.

10] Lin J, Goto Y, Murata H, Sakaizawa K, Uchiyama A, Saida T,et al. Polyclonality of BRAF mutations in primary melanomaand the selection of mutant alleles during progression. Br JCancer 2011;104:464—8.

11] Smalley KSM, Lioni M, Dalla Palma M, Xiao M, Desai B, Egyhazi S,et al. Increased cyclin D1 expression can mediate BRAF inhibi-tor resistance in BRAF V600E-mutated melanomas. Mol CancerTher 2008;7:2876—83.

12] Dankort D, Curley DP, Cartlidge RA, Nelson B, Karnezis AN, Dam-sky Jr WE, et al. BRaf V600E cooperates with Pten silencing toelicit metastatic melanoma. Nat Genet 2009;41:544—52.

13] Flaherty KT, Hodi FS, Fisher DE. From genes to drugs: targetedstrategies for melanoma. Nat Rev Cancer 2012;12:349—61.

14] Hodis E, Watson IR, Kryukov GV, Arold ST, Imielinski M, Theu-rillat JP, et al. A landscape of driver mutations in melanoma.

Cell 2012;150:251—63.

15] Lin J, Takata M, Murata H, Goto Y, Kido K, Ferrone S, et al.Polyclonality of BRAF mutations in acquired melanocytic nevi.J Natl Cancer Inst 2009;101:1423—7.

16] Yancovitz M, Litterman A, Yoon J, Ng E, Shapiro RL, Ber-man RS, et al. Intra- and inter-tumor heterogeneity ofBRAFV600E mutations in primary and metastatic mela-noma. PLoS One 2012;7:e29336, http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0029336.

17] Dawson SJ, Tsui DWY, Murtaza M, Biggs H, Rueda OM, Chin SF,et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastaticbreast cancer. N Engl J Med 2013;368:1199—209.

18] Capper D, Preusser M, Habel A, Sahm F, Ackermann U, SchindlerG, et al. Assessment of BRAF V600E mutation status by immuno-histochemistry with a mutation-specific monoclonal antibody.Acta Neuropathol 2011;122:11—9.

19] Long GV, Wilmott JS, Capper D, Preusser M, Zhang YE, Thomp-son JF, et al. Immunohistochemistry is highly sensitive andspecific for the detection of V600E BRAF mutation in mela-noma. Am J Surg Pathol 2013;37:61—5.

20] Robert C, Mateus C. Traitement du mélanome par lesinhibiteurs de BRAF. Correspondances en onco-théranostic2012;1:24—8.

21] Flaherty KT, Schiller J, Schuchter LM, Liu G, Tuveson DA, Red-linger M, et al. A phase I trial of the oral, multikinase inhibitorsorafenib in combination with carboplatin and paclitaxel. ClinCancer Res 2008;14:4836—42.

3

[

[

[

[

[

[

[

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[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

84

22] Hauschild A, Agarwala SS, Trefzer U, Hogg D, Robert C, HerseyP, et al. Results of a phase III, randomized, placebo-controlledstudy of sorafenib in combination with carboplatin and pacli-taxel as second-line treatment in patients with unresectablestage III or stage IV melanoma. J Clin Oncol 2009;27:2823—30.

23] Bollag G, Hirth P, Tsai J, Zhang J, Ibrahim PN, Cho H, et al.Clinical efficacy of a RAF inhibitor needs broad target blockadein BRAF-mutant melanoma. Nature 2010;467:596—9.

24] Flaherty KT, Puzanov I, Kim KB, Ribas A, McArthur GA, SosmanJA, et al. Inhibition of mutated, activated BRAF in metastaticmelanoma. N Engl J Med 2010;363:809—19.

25] Sosman JA, Kim KB, Schuchter L, Gonzalez R, Pavlick AC, WeberJS, et al. Survival in BRAF V600-mutant advanced melanomatreated with vemurafenib. N Engl J Med 2012;366:707—14.

26] Chapman PB, Hauschild A, Robert C, Haanen JB, Ascierto P, Lar-kin J, et al. Improved survival with vemurafenib in melanomawith BRAF V600E mutation. N Engl J Med 2011;364:2507—16.

27] Hauschild A, Grob JJ, Demidov LV, Jouary T, Gutzmer R,Millward M, et al. Dabrafenib in BRAF-mutated metastaticmelanoma: a multicentre, open-label, phase 3 randomisedcontrolled trial. Lancet 2012;380:358—65.

28] Flaherty KT, Infante JR, Daud A, Gonzalez R, Kefford RF, SosmanJ, et al. Combined BRAF and MEK inhibition in melanoma withBRAF V600 mutations. N Engl J Med 2012;367:1694—703.

29] Weeraratna AT. RAF around the edges — the paradox of BRAFinhibitors. N Engl J Med 2012;366:271—3.

30] Heidorn SJ, Milagre C, Whittaker S, Nourry A, Niculescu-Duvas I, Dhomen N, et al. Kinase-dead BRAF and oncogenicRAS cooperate to drive tumor progression through CRAF. Cell2010;140:209—21.

31] Chu EY, Wanat KA, Miller CJ, Amaravadi RK, Fecher LA, BroseMS, et al. Diverse cutaneous side effects associated with BRAFinhibitor therapy: a clinicopathologic study. J Am Acad Derma-tol 2012;67:1265—72.

32] Huang V, Hepper D, Anadkat M, Cornelius L. Cutaneous toxiceffects associated with vemurafenib and inhibition of the BRAFpathway. Arch Dermatol 2012;148:628—33.

33] Oberholzer PA, Kee D, Dziunycz P, Sucker A, Kamsukom N, JonesR, et al. RAS mutations are associated with the development ofcutaneous squamous cell tumors in patients treated with RAFinhibitors. J Clin Oncol 2012;30:316—21.

34] Mattei PL, Alora-Palli MB, Kraft S, Lawrence DP, Flaherty KT,Kimball AB. Cutaneous effects of BRAF inhibitor therapy: a caseseries. Ann Oncol 2013;24:530—7.

35] Boussemart L, Routier E, Mateus C, Opletalova K, Sebille G,

Kamsu-Kom N, et al. Prospective study of cutaneous side-effects associated with the BRAF inhibitor vemurafenib: a studyof 42 patients. Ann Oncol 2013;24:1691—7.

36] Zaravinos A, Kanellou P, Spandidos DA. Viral DNA detectionand RAS mutations in actinic keratosis and nonmelanoma skincancers. Br J Dermatol 2010;162:325—31.

37] Su F, Viros A, Milagre C, Trunzer K, Bollag G, Spleiss O, et al. RASmutations in cutaneous squamous-cell carcinomas in patientstreated with BRAF inhibitors. N Engl J Med 2012;366:207—15.

38] Haenssle HA, Kraus SL, Brehmer F, Kretschmer L, Völker B,Asper H, et al. Dynamic changes in nevi of a patient withmelanoma treated with Vemurafenib: importance of sequentialdermoscopy. Arch Dermatol 2012;148:1183—5.

39] Dalle S, Poulalhon N, Thomas L. Vemurafenib in melanoma withBRAF V600E mutation. N Engl J Med 2011;365:1448—9 [authorreply 1450].

40] Chapman PB, Hauschild A, McArthur GA. Vemurafenib in mela-noma with BRAF V600E mutation. N Engl J Med 2011;365:1450[author reply].

41] Zimmer L, Hillen U, Linvingstone E, Lacouture ME, Busam K,Carvajal RD, et al. Atypical melanocytic proliferations andnew primary melanomas in patients with advanced mela-noma undergoing selective BRAF inhibition. J Clin Oncol2012;30:2375—83.

42] Callahan MK, Rampal R, Harding JJ, Klimek VM, Chung YR, Mer-ghoub T, et al. Progression of RAS-mutant leukemia during RAFinhibitor treatment. N Engl J Med 2012;367:2316—21.

[

[

[

[

[

[

M. Capovilla

43] Cox AD, Der CJ. The RAF inhibitor paradox revisited. CancerCell 2012;21:147—9.

44] Wagle N, Emery C, Berger MF, Davis MJ, Sawyer A, PochanardP, et al. Dissecting therapeutic resistance to RAF inhibi-tion in melanoma by tumor genomic profiling. J Clin Oncol2011;29:3085—96.

45] Paraiso KH, Fedorenko IV, Cantini LP, Munko AC, Hall M, SondakVK, et al. Recovery of phospho-ERK activity allows melanomacells to escape from BRAF inhibitor therapy. Br J Cancer2010;102:1724—30.

46] Jiang X, Zhou J, Giobbie-Hurder A, Wargo J, Hodi FS. The acti-vation of MAPK in melanoma cells resistant to BRAF inhibitionpromotes PD-L1 expression that is reversible by MEK and PI3 Kinhibition. Clin Cancer Res 2013;19:598—609.

47] Smalley KSM, Sondak VK. Melanoma—an unlikely poster childfor personalized cancer therapy. N Engl J Med 2010;363:876—8.

48] Poulikakos Pl, Zhang C, Bollag G, Shokat KM, Rosen N. RAF inhi-bitors transactivate RAF dimmers and ERK signalling in cellswith wild-type BRAF. Nature 2010;464:427—30.

49] Nazarian R, Shi H, Wang Q, Kong X, Koya RC, Lee H, et al.Melanomas acquire resistance to B-RAF(V600E) inhibition byRTK or N-RAS upregulation. Nature 2010;468:973—7.

50] Hatzivassiliou G, Song K, Yen I, Brandhuber BJ, AndersonDJ, Alvarado R, et al. RAF inhibitors prime wild-type RAFto activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature2010;464:431—5.

51] Vito WR, Keiran SMS. Tumor heterogeneity and strategies toovercome kinase inhibitor resistance in cancer: lessons frommelanoma. Expert Opin Investig Drugs 2011;20:137—40.

52] Wilmott JS, Tembe V, Howle JR, Sharma R, Thompson JF, RizosH, et al. Intratumoral molecular heterogeneity in a BRAF-mutant BRAF-inhibitor-resistant melanoma: a case illustratingthe challenges for personalized medicine. Mol Cancer Ther2012;11:2704—8.

53] Sensi M, Nicolini G, Petti C, Bersani I, Lozupone F, Molla A,et al. Mutually exclusive NRASQ61R and BRAFV600E mutations atthe single-cell level in the same human melanoma. Oncogene2006;25:3357—64.

54] Kaplan FM, Kugel III CH, Dadpey N, Shao Y, Abel EV, AplinAE. SHOC2 and CRAF mediate ERK1/2 reactivation in mutantNRAS-mediated resistance to RAF inhibitor. J Biol Chem2012;287:41797—807.

55] Corcoran RB, Dias-Santagata D, Bergethon K, Iafrate AJ, Set-tleman J, Engelman JA. BRAF gene amplification can promote

acquired resistance to MEK inhibitors in cancer cells har-bouring the BRAF V600E mutation. Sci Signal 2010;3:ra84,http://dx.doi.org/10.1126/scisignal.2001148.

56] Shi H, Moriceau G, Kong X, Lee MK, Lee H, KoyaRC, et al. Melanoma whole exome sequencing identifies(V600E) B-RAF amplification-mediated acquired B-RAF inhibi-tor resistance. Nat Commun 2012;3:724, http://dx.doi.org/10.1038/ncomms1727.

57] Poulikakos PI, Persaud Y, Janakiraman M, Kong X, Ng C,Moriceau G, et al. RAF inhibitor resistance is mediatedby dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E). Nature2011;480:387—90.

58] Montagut C, Sharma SV, Shioda T, McDermott U, Ulman M, UlkusLE, et al. Elevated CRAF as a potential mechanism of acqui-red resistance to BRAF inhibition in melanoma. Cancer Res2008;68:4853—61.

59] Emery CM, Vijayendran KG, Zipser MC, Sawyer AM, Niu L, KimJJ, et al. MEK1 mutations confer resistance to MEK and B-RAFinhibition. Proc Natl Acad Sci U S A 2009;106:20411—6.

60] Villanueva J, Vultur A, Lee JT, Somasundaram R, Fukunaga-Kalabis M, Cipolla A, et al. Acquired resistance to BRAFinhibitors mediated by a RAF kinase switch in melanoma canbe overcome by cotargeting MEK and IGF-1R/PI3 K. Cancer Cell2010;18:683—95.

61] Yadav V, Zhang X, Liu J, Estrem S, Li S, Gong XQ, et al.Reactivation of mitogen-activated protein kinase (MAPK) path-way by FGF receptor 3 (FGFR3)/Ras mediates resistance to

s cib

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

and other fail. Biochem Pharmacol 2010;80:624—37.

Effets secondaires carcinogènes et résistances aux thérapie

vemurafenib in human B-RAF V600E mutant melanoma. J BiolChem 2012;287:28087—98.

62] Johannessen CM, Boehm JS, Kim SY, Thomas SR, Ward-well L, Johnson LA, et al. COT drives resistance to RAFinhibition through MAP kinase pathway reactivation. Nature2010;468:968—72.

63] Vultur A, Villanueva J, Herlyn M. Targeting BRAF in advancedmelanoma: a first step towards manageable disease. Clin Can-cer Res 2011;17:1658—63.

64] Kaplan FM, Shao Y, Mayberry MM, Aplin AE. Hyperactivationof MEK-ERK1/2 signaling and resistance to apoptosis inducedby the oncogenic B-RAF inhibitor PLX4032, in mutant N-Ras

melanoma cell lines. Oncogene 2011;30:366—71.

65] Roesch A, Fukunaga-Kalabis M, Schmidt EC, Zabierowski SE,Brafford PA, Vultur A, et al. A temporarily distinct subpopula-tion of slow-cycling melanoma cells is required for continuoustumor growth. Cell 2010;141:583—94.

66] Sharma SV, Lee DY, Li B, Quinlan MP, Takahashi F, MaheswaranS, et al. A chromatin-mediated reversible drug-tolerant statein cancer cell subpopulations. Cell 2010;141:69—80.

67] White RM, Cech J, Ratanasirintrawoot S, Lin CY, Rahl PB, BurkeCJ, et al. DHODH modulates transcriptional elongation in theneural crest and melanoma. Nature 2011;471:518—22.

68] Belden S, Flaherty KT. MEK and RAF inhibitors forBRAF-mutated cancers. Exp Rev Mol Med 2012;14:e17[doi:1017/erm.2012.11].

69] Straussman R, Morikawa T, Shee K, Barzily-Rokny M, Qian ZR, DuJ, et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance toRAF inhibitors through HGF secretion. Nature 2012;487:500—4.

70] Wilson TR, Fridlyand J, Yan Y, Penuel E, Burton L, Chan E,et al. Widespread potential for growth-factor-driven resistanceto anticancer kinase inhibitors. Nature 2012;487:505—9.

71] Liu F, Cao J, Wu J, Sullivan K, Shen J, Ryu B, et al. Stat3-targeted-therapies overcome the acquired resistance to vemu-rafenib in melanomas. J Invest Dermatol 2013;133:2041—9.

72] Boni A, Cogdill AP, Dang P, Udayakumar D, Njauw CN, Sloss CM,et al. Selective BRAFV600E inhibition enhances T-cell recog-nition of melanoma without affecting lymphocyte function.Cancer Res 2010;70:5213—9.

[

[

[

[

[

[

[

[

lées anti-BRAF 385

73] Frederick DT, Piris A, Cogdill AP, Cooper ZA, Lezcano C, Fer-rone CR, et al. BRAF inhibition is associated with enhancedmelanoma antigen expression and a more favourable tumormicroenvironment in patients with metastatic melanoma. ClinCancer Res 2013;19:1225—31.

74] Liu C, Peng W, Xu C, Lou Y, Zhang M, Wargo JA, et al. BRAFinhibition increases tumor infiltration by T cells and enhancesthe antitumor activity of adoptive immunotherapy in mice. ClinCancer Res 2013;19:393—403.

75] Inamdar GS, Madhunapantula SV, Robertson GP. Targeting theMAPK pathway in melanoma: why some approaches succeed

76] Paraiso KHT, Xiang Y, Rebecca VW, Abel EV, Chen YA, Munko AC,et al. PTEN loss confers BRAF inhibitor resistance to melanomacells through the suppression of BIM expression. Cancer Res2011;71:2750—60.

77] Wilmott JS, Scolyer RA, Long GV, Hersey P. Combined targe-ted therapy and immunotherapy in the treatment of advancedmelanoma. Oncoimmunology 2012;1:997—9.

78] Jordan EJ, Kelly CM. Vemurafenib for the treatment of mela-noma. Expert Opin Pharmacother 2012;13:2533—43.

79] Das Thakur M, Salangsang F, Landman AS, Sellers WR, Pryer NK,Levesque MP, et al. Modelling vemurafenib resistance in mela-noma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature2013;494:251—6.

80] Seghers AC, Wilgenhof S, Lebbé C, Neyns B. Successful rechal-lenge in two patients with BRAF-V600-mutant melanoma whoexperienced previous progression during treatment with aselective BRAF inhibitor. Melanoma Res 2012;22:466—72.

81] Jang S, Atkins MB. Which drug, and when, for patientswith BRAF-mutant melanoma? Lancet Oncol 2013;14:e60—9,http://dx.doi.org/10.1016/S1470-2045(12).70539-9.

82] Wilmott JS, Menzies AM, Haydu LE, Capper D, Preusser M, ZhangYE, et al. BRAFV600E protein expression and outcome from BRAFinhibitor treatment in BRAFV600E metastatic melanoma. Br JCancer 2013;108:924—31.

83] Flaherty KT. Is it good or bad to find a BRAF mutation? J ClinOncol 2011;29:1229—30.