thérapies ciblées : comment déterminer la cible? golf/remmelink golf.pdf · immunohistochimie...
TRANSCRIPT
Theacuterapies cibleacutees
comment deacuteterminer la
cible Myriam Remmelink MD PhD
Service drsquoAnatomie Pathologique Bruxelles
7 octobre 2014 2
Introduction
Le cancer du poumon est le responsable majeur du deacutecegraves par cancer
14 millions de deacutecegraves par an dans le monde
160000 morts par an aux USA
25 agrave 30 de tous les deacutecegraves lieacutes au cancer
Soit plus que les 3 cancers les plus freacutequents (colon prostate et sein)
7 octobre 2014 3
Introduction
Mais
Avanceacutees majeures dans la compreacutehension de la pathogeacutenie du cancer
du poumon surtout dans lrsquoadeacutenocarcinome
Avec les deacutecouvertes biologiques et theacuterapeutiques de lrsquoimportance des
alteacuterations geacuteneacutetiques
En particulier EGFR et ALK
Changement majeur dans la prise en charge
7 octobre 2014 4
Courtesy Pr Pauwels UZA
Introduction
Walk wwwcaporginstitute
Walk wwwcaporginstitute
7 octobre 2014 8
Plan
1 Quand les tests de biologie moleacuteculaire doivent ils ecirctre reacutealiseacutes
2 Comment tester EGFR
3 Comment tester ALK
4 Autres tests en routine
5 Comment les tests de biologie moleacuteculaires doivent ils ecirctre
impleacutementeacutes pour les adeacutenocarcinomes
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2014
7 octobre 2014 9
Le clinicien
Informations cliniques
Choix du site
Cyto histo
Fixation
Le pathologiste
Diagnostic
Qualiteacute du preacutelegravevement
Technique
Biologiste moleacuteculaire technologue
Equipe pluridisciplinaire
The right drug at the right dose to the right patient at the right time
7 octobre 2014 11
Le clinicien
Quel patient
Critegraveres cliniques Histologiques
Quel type de mateacuteriel
Cytohisto
Primitif vs meacutetastase
Quid si plusieurs primitifs
7 octobre 2014 12
Caracteacuteristiques cliniques AUCUNE
Les mutations EGFR sont plus freacutequentes chez les femmes non
fumeurs origine asiatique
Am J Clin Pathol 2012138332-346
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
7 octobre 2014 13
ALK
Quel patient
Critegraveres cliniques
Quel type de mateacuteriel
Cytohisto
Primitif vs meacutetastase
Quid si plusieurs primitifs
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
La preacutesence drsquoune translocation de ALK est plus freacutequente chez les jeunes
non fumeurs
7 octobre 2014 14
Types histologiques
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
bullAdeacutenocarcinomes (TOUS les sous types)
bullCarcinomes mixte avec une composante adeacutenocarcinome
bullExclus
bullAbsence de composante adeacutenocarcinome
bull Ex SCC purs
bull SCLC pur
bull LCC sans composante ADC en IHC
bullAttention si mateacuteriel quantitativement limiteacute (biopsie cytologie)
bullLa composante ADC ne peut ecirctre exclue
bullLes tests peuvent ecirctre reacutealiseacutes mecircme si SCC OU SCLC
bullChez un patient jeune non fumeur
7 octobre 2014 15
7 octobre 2014 16
Attention agrave lrsquoeacutepargne tissulaire
7 octobre 2014 17
La meilleure strateacutegie pour prendre en charge des preacutelegravevements de petite taille
pour des cas suspecteacutes de cancer du poumon est baseacute sur des informations
cliniques
Ces informations sont utiles pour le pathologiste pour
1 deacuteterminer les prioriteacutes dans lrsquoapproche diagnostique
2 deacuteterminer si un diagnostic speacutecifique est requis
3preacutevoir les investigations neacutecessaires et anticiper lrsquoutilisation drsquoIHC et des tests
de biologie moleacuteculaires
4 preacutevenir lrsquoutilisation inutile de tissu pour des tests qui ne sont pas requis ou
inteacuteressants eacutetant donneacute la clinique
7 octobre 2014 18
Lrsquohistoire clinique est essentielle pour
envisager si la tumeur pourrait ecirctre
meacutetastatique
Lrsquoexclusion drsquoune origine meacutetastatique
est une perte de temps de tissus et
de ressources du laboratoire
Il ne faut pas faire de laquo reflex testing raquo
pour faire un diagnostic diffeacuterentiel
entre une tumeur primitive et une
meacutetastase sans informations cliniques
pertinentes
7 octobre 2014 19
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
Discordance rare signification clinique incertaine (prob technique ds ganglion)
Le choix doit ecirctre base sur la qualiteacute (richesse tumorale)
7 octobre 2014 20
Un patient preacutesentant de multiples tumeurs primitives
Chaque tumeur doit ecirctre testeacutee
Il ne faut pas par contre tester diffeacuterentes zones drsquoune mecircme tumeur
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
7 octobre 2014 21
Au moment du diagnostic pour les stades IV
Au moment de la progression reacutecidive pour les autres stades
Ou au moment du diagnostic en fonction des deacutecisions locales
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Quel patient
7 octobre 2014 22
Les reacutesultats EGFR et ALK doivent ecirctre obtenus endeacuteans les 15 j
post arriveacutee du preacutelegravevement au laboratoire de biologie moleacuteculaire
(10 jours ouvrables)
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Timing
7 octobre 2014 23
EGFR epidermal growth factor receptor
Courtesy Pr Pauwels UZA
Mutations in exons 18-21 of the EHFR gene coding for the receptorrsquos internal TK domain activate the
receptor independently of extracelular ligand binding and are refferred as laquo activating mutations raquo
7 octobre 2014 24
Type de mateacuteriel
Fixeacute au formol (10) et enrobeacute dans la paraffine (FFEP)
Frais
Fixation agrave lrsquoalcool
PAS de deacutecalcifiant ni Bouin
Cytologie (bloc tissulaire) Histologie
Temps de fixation 6 agrave 48 h
POURCENTAGE EN CELLULES TUMORALES
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
7 octobre 2014 25
Courtesy Dr AL Trepant
7 octobre 2014 26
Avantage de la cytologie possibiliteacute de reacutealiser dans une tumeur
donneacutee des preacutelegravevements seacuterieacutes au cours du temps
But
eacutevaluer lrsquoefficaciteacute de la theacuterapie cibleacutee via la caracteacuterisation
moleacuteculaire
Identifier des laquo genetic shifts raquo drsquoADC mutants au cours du
traitement Tki (T790M)
Cytologie
Jiang SX et al Int J Cancer 2008 Gazdar AFOncogene 2009
Bean J et al Clin Cancer Res 2008
7 octobre 2014 27
Avant les analyses de biologie moleacuteculaire le contenu en cellules
tumorales de lrsquoeacutechantillon doit ecirctre deacutetermineacute afin drsquoeacutevaluer la fiabiliteacute
du reacutesultat
Crucial ratio entre le nombre de cellules malignes par rapport aux
cellules normales
Deacutetermination du pourcentage en cellules tumorales (cellulariteacute)
dissection manuelle (microdissection)
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 28
Un eacutechantillon doit contenir de 200 agrave 400 cellules tumorales
Rarement atteint en routine
50 de cellules tumorales mais des reacutesultats peuvent ecirctre obtenus
avec 10 agrave 20 de cellules tumorales
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 29
bull Le pourcentage moyen de tumeur preacutesent dans les biopsies
bronchiques est drsquoun peu plus que 20 quand un diagnostic de SCC
ou ADC est diagnostiqueacute mais de 10 pour les cas de NSCLC-
NOS
bull Il nrsquoy a pas de tumeur dans 13 agrave frac12 des tissus preacuteleveacutes par
bronchoscopie pour maligniteacute
7 octobre 2014 32
7 octobre 2014 33
Pre-preparation for molecular analysis
Selection of the tumoral zone
Evaluation of of tumoral cells
HampE Unstained
slides
Macro-
dissection
Extraction ADN Dosage ADN
Courtesy M le Mercier PhD
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 2
Introduction
Le cancer du poumon est le responsable majeur du deacutecegraves par cancer
14 millions de deacutecegraves par an dans le monde
160000 morts par an aux USA
25 agrave 30 de tous les deacutecegraves lieacutes au cancer
Soit plus que les 3 cancers les plus freacutequents (colon prostate et sein)
7 octobre 2014 3
Introduction
Mais
Avanceacutees majeures dans la compreacutehension de la pathogeacutenie du cancer
du poumon surtout dans lrsquoadeacutenocarcinome
Avec les deacutecouvertes biologiques et theacuterapeutiques de lrsquoimportance des
alteacuterations geacuteneacutetiques
En particulier EGFR et ALK
Changement majeur dans la prise en charge
7 octobre 2014 4
Courtesy Pr Pauwels UZA
Introduction
Walk wwwcaporginstitute
Walk wwwcaporginstitute
7 octobre 2014 8
Plan
1 Quand les tests de biologie moleacuteculaire doivent ils ecirctre reacutealiseacutes
2 Comment tester EGFR
3 Comment tester ALK
4 Autres tests en routine
5 Comment les tests de biologie moleacuteculaires doivent ils ecirctre
impleacutementeacutes pour les adeacutenocarcinomes
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2014
7 octobre 2014 9
Le clinicien
Informations cliniques
Choix du site
Cyto histo
Fixation
Le pathologiste
Diagnostic
Qualiteacute du preacutelegravevement
Technique
Biologiste moleacuteculaire technologue
Equipe pluridisciplinaire
The right drug at the right dose to the right patient at the right time
7 octobre 2014 11
Le clinicien
Quel patient
Critegraveres cliniques Histologiques
Quel type de mateacuteriel
Cytohisto
Primitif vs meacutetastase
Quid si plusieurs primitifs
7 octobre 2014 12
Caracteacuteristiques cliniques AUCUNE
Les mutations EGFR sont plus freacutequentes chez les femmes non
fumeurs origine asiatique
Am J Clin Pathol 2012138332-346
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
7 octobre 2014 13
ALK
Quel patient
Critegraveres cliniques
Quel type de mateacuteriel
Cytohisto
Primitif vs meacutetastase
Quid si plusieurs primitifs
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
La preacutesence drsquoune translocation de ALK est plus freacutequente chez les jeunes
non fumeurs
7 octobre 2014 14
Types histologiques
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
bullAdeacutenocarcinomes (TOUS les sous types)
bullCarcinomes mixte avec une composante adeacutenocarcinome
bullExclus
bullAbsence de composante adeacutenocarcinome
bull Ex SCC purs
bull SCLC pur
bull LCC sans composante ADC en IHC
bullAttention si mateacuteriel quantitativement limiteacute (biopsie cytologie)
bullLa composante ADC ne peut ecirctre exclue
bullLes tests peuvent ecirctre reacutealiseacutes mecircme si SCC OU SCLC
bullChez un patient jeune non fumeur
7 octobre 2014 15
7 octobre 2014 16
Attention agrave lrsquoeacutepargne tissulaire
7 octobre 2014 17
La meilleure strateacutegie pour prendre en charge des preacutelegravevements de petite taille
pour des cas suspecteacutes de cancer du poumon est baseacute sur des informations
cliniques
Ces informations sont utiles pour le pathologiste pour
1 deacuteterminer les prioriteacutes dans lrsquoapproche diagnostique
2 deacuteterminer si un diagnostic speacutecifique est requis
3preacutevoir les investigations neacutecessaires et anticiper lrsquoutilisation drsquoIHC et des tests
de biologie moleacuteculaires
4 preacutevenir lrsquoutilisation inutile de tissu pour des tests qui ne sont pas requis ou
inteacuteressants eacutetant donneacute la clinique
7 octobre 2014 18
Lrsquohistoire clinique est essentielle pour
envisager si la tumeur pourrait ecirctre
meacutetastatique
Lrsquoexclusion drsquoune origine meacutetastatique
est une perte de temps de tissus et
de ressources du laboratoire
Il ne faut pas faire de laquo reflex testing raquo
pour faire un diagnostic diffeacuterentiel
entre une tumeur primitive et une
meacutetastase sans informations cliniques
pertinentes
7 octobre 2014 19
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
Discordance rare signification clinique incertaine (prob technique ds ganglion)
Le choix doit ecirctre base sur la qualiteacute (richesse tumorale)
7 octobre 2014 20
Un patient preacutesentant de multiples tumeurs primitives
Chaque tumeur doit ecirctre testeacutee
Il ne faut pas par contre tester diffeacuterentes zones drsquoune mecircme tumeur
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
7 octobre 2014 21
Au moment du diagnostic pour les stades IV
Au moment de la progression reacutecidive pour les autres stades
Ou au moment du diagnostic en fonction des deacutecisions locales
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Quel patient
7 octobre 2014 22
Les reacutesultats EGFR et ALK doivent ecirctre obtenus endeacuteans les 15 j
post arriveacutee du preacutelegravevement au laboratoire de biologie moleacuteculaire
(10 jours ouvrables)
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Timing
7 octobre 2014 23
EGFR epidermal growth factor receptor
Courtesy Pr Pauwels UZA
Mutations in exons 18-21 of the EHFR gene coding for the receptorrsquos internal TK domain activate the
receptor independently of extracelular ligand binding and are refferred as laquo activating mutations raquo
7 octobre 2014 24
Type de mateacuteriel
Fixeacute au formol (10) et enrobeacute dans la paraffine (FFEP)
Frais
Fixation agrave lrsquoalcool
PAS de deacutecalcifiant ni Bouin
Cytologie (bloc tissulaire) Histologie
Temps de fixation 6 agrave 48 h
POURCENTAGE EN CELLULES TUMORALES
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
7 octobre 2014 25
Courtesy Dr AL Trepant
7 octobre 2014 26
Avantage de la cytologie possibiliteacute de reacutealiser dans une tumeur
donneacutee des preacutelegravevements seacuterieacutes au cours du temps
But
eacutevaluer lrsquoefficaciteacute de la theacuterapie cibleacutee via la caracteacuterisation
moleacuteculaire
Identifier des laquo genetic shifts raquo drsquoADC mutants au cours du
traitement Tki (T790M)
Cytologie
Jiang SX et al Int J Cancer 2008 Gazdar AFOncogene 2009
Bean J et al Clin Cancer Res 2008
7 octobre 2014 27
Avant les analyses de biologie moleacuteculaire le contenu en cellules
tumorales de lrsquoeacutechantillon doit ecirctre deacutetermineacute afin drsquoeacutevaluer la fiabiliteacute
du reacutesultat
Crucial ratio entre le nombre de cellules malignes par rapport aux
cellules normales
Deacutetermination du pourcentage en cellules tumorales (cellulariteacute)
dissection manuelle (microdissection)
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 28
Un eacutechantillon doit contenir de 200 agrave 400 cellules tumorales
Rarement atteint en routine
50 de cellules tumorales mais des reacutesultats peuvent ecirctre obtenus
avec 10 agrave 20 de cellules tumorales
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 29
bull Le pourcentage moyen de tumeur preacutesent dans les biopsies
bronchiques est drsquoun peu plus que 20 quand un diagnostic de SCC
ou ADC est diagnostiqueacute mais de 10 pour les cas de NSCLC-
NOS
bull Il nrsquoy a pas de tumeur dans 13 agrave frac12 des tissus preacuteleveacutes par
bronchoscopie pour maligniteacute
7 octobre 2014 32
7 octobre 2014 33
Pre-preparation for molecular analysis
Selection of the tumoral zone
Evaluation of of tumoral cells
HampE Unstained
slides
Macro-
dissection
Extraction ADN Dosage ADN
Courtesy M le Mercier PhD
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 3
Introduction
Mais
Avanceacutees majeures dans la compreacutehension de la pathogeacutenie du cancer
du poumon surtout dans lrsquoadeacutenocarcinome
Avec les deacutecouvertes biologiques et theacuterapeutiques de lrsquoimportance des
alteacuterations geacuteneacutetiques
En particulier EGFR et ALK
Changement majeur dans la prise en charge
7 octobre 2014 4
Courtesy Pr Pauwels UZA
Introduction
Walk wwwcaporginstitute
Walk wwwcaporginstitute
7 octobre 2014 8
Plan
1 Quand les tests de biologie moleacuteculaire doivent ils ecirctre reacutealiseacutes
2 Comment tester EGFR
3 Comment tester ALK
4 Autres tests en routine
5 Comment les tests de biologie moleacuteculaires doivent ils ecirctre
impleacutementeacutes pour les adeacutenocarcinomes
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2014
7 octobre 2014 9
Le clinicien
Informations cliniques
Choix du site
Cyto histo
Fixation
Le pathologiste
Diagnostic
Qualiteacute du preacutelegravevement
Technique
Biologiste moleacuteculaire technologue
Equipe pluridisciplinaire
The right drug at the right dose to the right patient at the right time
7 octobre 2014 11
Le clinicien
Quel patient
Critegraveres cliniques Histologiques
Quel type de mateacuteriel
Cytohisto
Primitif vs meacutetastase
Quid si plusieurs primitifs
7 octobre 2014 12
Caracteacuteristiques cliniques AUCUNE
Les mutations EGFR sont plus freacutequentes chez les femmes non
fumeurs origine asiatique
Am J Clin Pathol 2012138332-346
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
7 octobre 2014 13
ALK
Quel patient
Critegraveres cliniques
Quel type de mateacuteriel
Cytohisto
Primitif vs meacutetastase
Quid si plusieurs primitifs
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
La preacutesence drsquoune translocation de ALK est plus freacutequente chez les jeunes
non fumeurs
7 octobre 2014 14
Types histologiques
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
bullAdeacutenocarcinomes (TOUS les sous types)
bullCarcinomes mixte avec une composante adeacutenocarcinome
bullExclus
bullAbsence de composante adeacutenocarcinome
bull Ex SCC purs
bull SCLC pur
bull LCC sans composante ADC en IHC
bullAttention si mateacuteriel quantitativement limiteacute (biopsie cytologie)
bullLa composante ADC ne peut ecirctre exclue
bullLes tests peuvent ecirctre reacutealiseacutes mecircme si SCC OU SCLC
bullChez un patient jeune non fumeur
7 octobre 2014 15
7 octobre 2014 16
Attention agrave lrsquoeacutepargne tissulaire
7 octobre 2014 17
La meilleure strateacutegie pour prendre en charge des preacutelegravevements de petite taille
pour des cas suspecteacutes de cancer du poumon est baseacute sur des informations
cliniques
Ces informations sont utiles pour le pathologiste pour
1 deacuteterminer les prioriteacutes dans lrsquoapproche diagnostique
2 deacuteterminer si un diagnostic speacutecifique est requis
3preacutevoir les investigations neacutecessaires et anticiper lrsquoutilisation drsquoIHC et des tests
de biologie moleacuteculaires
4 preacutevenir lrsquoutilisation inutile de tissu pour des tests qui ne sont pas requis ou
inteacuteressants eacutetant donneacute la clinique
7 octobre 2014 18
Lrsquohistoire clinique est essentielle pour
envisager si la tumeur pourrait ecirctre
meacutetastatique
Lrsquoexclusion drsquoune origine meacutetastatique
est une perte de temps de tissus et
de ressources du laboratoire
Il ne faut pas faire de laquo reflex testing raquo
pour faire un diagnostic diffeacuterentiel
entre une tumeur primitive et une
meacutetastase sans informations cliniques
pertinentes
7 octobre 2014 19
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
Discordance rare signification clinique incertaine (prob technique ds ganglion)
Le choix doit ecirctre base sur la qualiteacute (richesse tumorale)
7 octobre 2014 20
Un patient preacutesentant de multiples tumeurs primitives
Chaque tumeur doit ecirctre testeacutee
Il ne faut pas par contre tester diffeacuterentes zones drsquoune mecircme tumeur
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
7 octobre 2014 21
Au moment du diagnostic pour les stades IV
Au moment de la progression reacutecidive pour les autres stades
Ou au moment du diagnostic en fonction des deacutecisions locales
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Quel patient
7 octobre 2014 22
Les reacutesultats EGFR et ALK doivent ecirctre obtenus endeacuteans les 15 j
post arriveacutee du preacutelegravevement au laboratoire de biologie moleacuteculaire
(10 jours ouvrables)
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Timing
7 octobre 2014 23
EGFR epidermal growth factor receptor
Courtesy Pr Pauwels UZA
Mutations in exons 18-21 of the EHFR gene coding for the receptorrsquos internal TK domain activate the
receptor independently of extracelular ligand binding and are refferred as laquo activating mutations raquo
7 octobre 2014 24
Type de mateacuteriel
Fixeacute au formol (10) et enrobeacute dans la paraffine (FFEP)
Frais
Fixation agrave lrsquoalcool
PAS de deacutecalcifiant ni Bouin
Cytologie (bloc tissulaire) Histologie
Temps de fixation 6 agrave 48 h
POURCENTAGE EN CELLULES TUMORALES
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
7 octobre 2014 25
Courtesy Dr AL Trepant
7 octobre 2014 26
Avantage de la cytologie possibiliteacute de reacutealiser dans une tumeur
donneacutee des preacutelegravevements seacuterieacutes au cours du temps
But
eacutevaluer lrsquoefficaciteacute de la theacuterapie cibleacutee via la caracteacuterisation
moleacuteculaire
Identifier des laquo genetic shifts raquo drsquoADC mutants au cours du
traitement Tki (T790M)
Cytologie
Jiang SX et al Int J Cancer 2008 Gazdar AFOncogene 2009
Bean J et al Clin Cancer Res 2008
7 octobre 2014 27
Avant les analyses de biologie moleacuteculaire le contenu en cellules
tumorales de lrsquoeacutechantillon doit ecirctre deacutetermineacute afin drsquoeacutevaluer la fiabiliteacute
du reacutesultat
Crucial ratio entre le nombre de cellules malignes par rapport aux
cellules normales
Deacutetermination du pourcentage en cellules tumorales (cellulariteacute)
dissection manuelle (microdissection)
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 28
Un eacutechantillon doit contenir de 200 agrave 400 cellules tumorales
Rarement atteint en routine
50 de cellules tumorales mais des reacutesultats peuvent ecirctre obtenus
avec 10 agrave 20 de cellules tumorales
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 29
bull Le pourcentage moyen de tumeur preacutesent dans les biopsies
bronchiques est drsquoun peu plus que 20 quand un diagnostic de SCC
ou ADC est diagnostiqueacute mais de 10 pour les cas de NSCLC-
NOS
bull Il nrsquoy a pas de tumeur dans 13 agrave frac12 des tissus preacuteleveacutes par
bronchoscopie pour maligniteacute
7 octobre 2014 32
7 octobre 2014 33
Pre-preparation for molecular analysis
Selection of the tumoral zone
Evaluation of of tumoral cells
HampE Unstained
slides
Macro-
dissection
Extraction ADN Dosage ADN
Courtesy M le Mercier PhD
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 4
Courtesy Pr Pauwels UZA
Introduction
Walk wwwcaporginstitute
Walk wwwcaporginstitute
7 octobre 2014 8
Plan
1 Quand les tests de biologie moleacuteculaire doivent ils ecirctre reacutealiseacutes
2 Comment tester EGFR
3 Comment tester ALK
4 Autres tests en routine
5 Comment les tests de biologie moleacuteculaires doivent ils ecirctre
impleacutementeacutes pour les adeacutenocarcinomes
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2014
7 octobre 2014 9
Le clinicien
Informations cliniques
Choix du site
Cyto histo
Fixation
Le pathologiste
Diagnostic
Qualiteacute du preacutelegravevement
Technique
Biologiste moleacuteculaire technologue
Equipe pluridisciplinaire
The right drug at the right dose to the right patient at the right time
7 octobre 2014 11
Le clinicien
Quel patient
Critegraveres cliniques Histologiques
Quel type de mateacuteriel
Cytohisto
Primitif vs meacutetastase
Quid si plusieurs primitifs
7 octobre 2014 12
Caracteacuteristiques cliniques AUCUNE
Les mutations EGFR sont plus freacutequentes chez les femmes non
fumeurs origine asiatique
Am J Clin Pathol 2012138332-346
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
7 octobre 2014 13
ALK
Quel patient
Critegraveres cliniques
Quel type de mateacuteriel
Cytohisto
Primitif vs meacutetastase
Quid si plusieurs primitifs
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
La preacutesence drsquoune translocation de ALK est plus freacutequente chez les jeunes
non fumeurs
7 octobre 2014 14
Types histologiques
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
bullAdeacutenocarcinomes (TOUS les sous types)
bullCarcinomes mixte avec une composante adeacutenocarcinome
bullExclus
bullAbsence de composante adeacutenocarcinome
bull Ex SCC purs
bull SCLC pur
bull LCC sans composante ADC en IHC
bullAttention si mateacuteriel quantitativement limiteacute (biopsie cytologie)
bullLa composante ADC ne peut ecirctre exclue
bullLes tests peuvent ecirctre reacutealiseacutes mecircme si SCC OU SCLC
bullChez un patient jeune non fumeur
7 octobre 2014 15
7 octobre 2014 16
Attention agrave lrsquoeacutepargne tissulaire
7 octobre 2014 17
La meilleure strateacutegie pour prendre en charge des preacutelegravevements de petite taille
pour des cas suspecteacutes de cancer du poumon est baseacute sur des informations
cliniques
Ces informations sont utiles pour le pathologiste pour
1 deacuteterminer les prioriteacutes dans lrsquoapproche diagnostique
2 deacuteterminer si un diagnostic speacutecifique est requis
3preacutevoir les investigations neacutecessaires et anticiper lrsquoutilisation drsquoIHC et des tests
de biologie moleacuteculaires
4 preacutevenir lrsquoutilisation inutile de tissu pour des tests qui ne sont pas requis ou
inteacuteressants eacutetant donneacute la clinique
7 octobre 2014 18
Lrsquohistoire clinique est essentielle pour
envisager si la tumeur pourrait ecirctre
meacutetastatique
Lrsquoexclusion drsquoune origine meacutetastatique
est une perte de temps de tissus et
de ressources du laboratoire
Il ne faut pas faire de laquo reflex testing raquo
pour faire un diagnostic diffeacuterentiel
entre une tumeur primitive et une
meacutetastase sans informations cliniques
pertinentes
7 octobre 2014 19
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
Discordance rare signification clinique incertaine (prob technique ds ganglion)
Le choix doit ecirctre base sur la qualiteacute (richesse tumorale)
7 octobre 2014 20
Un patient preacutesentant de multiples tumeurs primitives
Chaque tumeur doit ecirctre testeacutee
Il ne faut pas par contre tester diffeacuterentes zones drsquoune mecircme tumeur
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
7 octobre 2014 21
Au moment du diagnostic pour les stades IV
Au moment de la progression reacutecidive pour les autres stades
Ou au moment du diagnostic en fonction des deacutecisions locales
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Quel patient
7 octobre 2014 22
Les reacutesultats EGFR et ALK doivent ecirctre obtenus endeacuteans les 15 j
post arriveacutee du preacutelegravevement au laboratoire de biologie moleacuteculaire
(10 jours ouvrables)
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Timing
7 octobre 2014 23
EGFR epidermal growth factor receptor
Courtesy Pr Pauwels UZA
Mutations in exons 18-21 of the EHFR gene coding for the receptorrsquos internal TK domain activate the
receptor independently of extracelular ligand binding and are refferred as laquo activating mutations raquo
7 octobre 2014 24
Type de mateacuteriel
Fixeacute au formol (10) et enrobeacute dans la paraffine (FFEP)
Frais
Fixation agrave lrsquoalcool
PAS de deacutecalcifiant ni Bouin
Cytologie (bloc tissulaire) Histologie
Temps de fixation 6 agrave 48 h
POURCENTAGE EN CELLULES TUMORALES
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
7 octobre 2014 25
Courtesy Dr AL Trepant
7 octobre 2014 26
Avantage de la cytologie possibiliteacute de reacutealiser dans une tumeur
donneacutee des preacutelegravevements seacuterieacutes au cours du temps
But
eacutevaluer lrsquoefficaciteacute de la theacuterapie cibleacutee via la caracteacuterisation
moleacuteculaire
Identifier des laquo genetic shifts raquo drsquoADC mutants au cours du
traitement Tki (T790M)
Cytologie
Jiang SX et al Int J Cancer 2008 Gazdar AFOncogene 2009
Bean J et al Clin Cancer Res 2008
7 octobre 2014 27
Avant les analyses de biologie moleacuteculaire le contenu en cellules
tumorales de lrsquoeacutechantillon doit ecirctre deacutetermineacute afin drsquoeacutevaluer la fiabiliteacute
du reacutesultat
Crucial ratio entre le nombre de cellules malignes par rapport aux
cellules normales
Deacutetermination du pourcentage en cellules tumorales (cellulariteacute)
dissection manuelle (microdissection)
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 28
Un eacutechantillon doit contenir de 200 agrave 400 cellules tumorales
Rarement atteint en routine
50 de cellules tumorales mais des reacutesultats peuvent ecirctre obtenus
avec 10 agrave 20 de cellules tumorales
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 29
bull Le pourcentage moyen de tumeur preacutesent dans les biopsies
bronchiques est drsquoun peu plus que 20 quand un diagnostic de SCC
ou ADC est diagnostiqueacute mais de 10 pour les cas de NSCLC-
NOS
bull Il nrsquoy a pas de tumeur dans 13 agrave frac12 des tissus preacuteleveacutes par
bronchoscopie pour maligniteacute
7 octobre 2014 32
7 octobre 2014 33
Pre-preparation for molecular analysis
Selection of the tumoral zone
Evaluation of of tumoral cells
HampE Unstained
slides
Macro-
dissection
Extraction ADN Dosage ADN
Courtesy M le Mercier PhD
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
Introduction
Walk wwwcaporginstitute
Walk wwwcaporginstitute
7 octobre 2014 8
Plan
1 Quand les tests de biologie moleacuteculaire doivent ils ecirctre reacutealiseacutes
2 Comment tester EGFR
3 Comment tester ALK
4 Autres tests en routine
5 Comment les tests de biologie moleacuteculaires doivent ils ecirctre
impleacutementeacutes pour les adeacutenocarcinomes
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2014
7 octobre 2014 9
Le clinicien
Informations cliniques
Choix du site
Cyto histo
Fixation
Le pathologiste
Diagnostic
Qualiteacute du preacutelegravevement
Technique
Biologiste moleacuteculaire technologue
Equipe pluridisciplinaire
The right drug at the right dose to the right patient at the right time
7 octobre 2014 11
Le clinicien
Quel patient
Critegraveres cliniques Histologiques
Quel type de mateacuteriel
Cytohisto
Primitif vs meacutetastase
Quid si plusieurs primitifs
7 octobre 2014 12
Caracteacuteristiques cliniques AUCUNE
Les mutations EGFR sont plus freacutequentes chez les femmes non
fumeurs origine asiatique
Am J Clin Pathol 2012138332-346
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
7 octobre 2014 13
ALK
Quel patient
Critegraveres cliniques
Quel type de mateacuteriel
Cytohisto
Primitif vs meacutetastase
Quid si plusieurs primitifs
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
La preacutesence drsquoune translocation de ALK est plus freacutequente chez les jeunes
non fumeurs
7 octobre 2014 14
Types histologiques
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
bullAdeacutenocarcinomes (TOUS les sous types)
bullCarcinomes mixte avec une composante adeacutenocarcinome
bullExclus
bullAbsence de composante adeacutenocarcinome
bull Ex SCC purs
bull SCLC pur
bull LCC sans composante ADC en IHC
bullAttention si mateacuteriel quantitativement limiteacute (biopsie cytologie)
bullLa composante ADC ne peut ecirctre exclue
bullLes tests peuvent ecirctre reacutealiseacutes mecircme si SCC OU SCLC
bullChez un patient jeune non fumeur
7 octobre 2014 15
7 octobre 2014 16
Attention agrave lrsquoeacutepargne tissulaire
7 octobre 2014 17
La meilleure strateacutegie pour prendre en charge des preacutelegravevements de petite taille
pour des cas suspecteacutes de cancer du poumon est baseacute sur des informations
cliniques
Ces informations sont utiles pour le pathologiste pour
1 deacuteterminer les prioriteacutes dans lrsquoapproche diagnostique
2 deacuteterminer si un diagnostic speacutecifique est requis
3preacutevoir les investigations neacutecessaires et anticiper lrsquoutilisation drsquoIHC et des tests
de biologie moleacuteculaires
4 preacutevenir lrsquoutilisation inutile de tissu pour des tests qui ne sont pas requis ou
inteacuteressants eacutetant donneacute la clinique
7 octobre 2014 18
Lrsquohistoire clinique est essentielle pour
envisager si la tumeur pourrait ecirctre
meacutetastatique
Lrsquoexclusion drsquoune origine meacutetastatique
est une perte de temps de tissus et
de ressources du laboratoire
Il ne faut pas faire de laquo reflex testing raquo
pour faire un diagnostic diffeacuterentiel
entre une tumeur primitive et une
meacutetastase sans informations cliniques
pertinentes
7 octobre 2014 19
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
Discordance rare signification clinique incertaine (prob technique ds ganglion)
Le choix doit ecirctre base sur la qualiteacute (richesse tumorale)
7 octobre 2014 20
Un patient preacutesentant de multiples tumeurs primitives
Chaque tumeur doit ecirctre testeacutee
Il ne faut pas par contre tester diffeacuterentes zones drsquoune mecircme tumeur
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
7 octobre 2014 21
Au moment du diagnostic pour les stades IV
Au moment de la progression reacutecidive pour les autres stades
Ou au moment du diagnostic en fonction des deacutecisions locales
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Quel patient
7 octobre 2014 22
Les reacutesultats EGFR et ALK doivent ecirctre obtenus endeacuteans les 15 j
post arriveacutee du preacutelegravevement au laboratoire de biologie moleacuteculaire
(10 jours ouvrables)
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Timing
7 octobre 2014 23
EGFR epidermal growth factor receptor
Courtesy Pr Pauwels UZA
Mutations in exons 18-21 of the EHFR gene coding for the receptorrsquos internal TK domain activate the
receptor independently of extracelular ligand binding and are refferred as laquo activating mutations raquo
7 octobre 2014 24
Type de mateacuteriel
Fixeacute au formol (10) et enrobeacute dans la paraffine (FFEP)
Frais
Fixation agrave lrsquoalcool
PAS de deacutecalcifiant ni Bouin
Cytologie (bloc tissulaire) Histologie
Temps de fixation 6 agrave 48 h
POURCENTAGE EN CELLULES TUMORALES
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
7 octobre 2014 25
Courtesy Dr AL Trepant
7 octobre 2014 26
Avantage de la cytologie possibiliteacute de reacutealiser dans une tumeur
donneacutee des preacutelegravevements seacuterieacutes au cours du temps
But
eacutevaluer lrsquoefficaciteacute de la theacuterapie cibleacutee via la caracteacuterisation
moleacuteculaire
Identifier des laquo genetic shifts raquo drsquoADC mutants au cours du
traitement Tki (T790M)
Cytologie
Jiang SX et al Int J Cancer 2008 Gazdar AFOncogene 2009
Bean J et al Clin Cancer Res 2008
7 octobre 2014 27
Avant les analyses de biologie moleacuteculaire le contenu en cellules
tumorales de lrsquoeacutechantillon doit ecirctre deacutetermineacute afin drsquoeacutevaluer la fiabiliteacute
du reacutesultat
Crucial ratio entre le nombre de cellules malignes par rapport aux
cellules normales
Deacutetermination du pourcentage en cellules tumorales (cellulariteacute)
dissection manuelle (microdissection)
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 28
Un eacutechantillon doit contenir de 200 agrave 400 cellules tumorales
Rarement atteint en routine
50 de cellules tumorales mais des reacutesultats peuvent ecirctre obtenus
avec 10 agrave 20 de cellules tumorales
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 29
bull Le pourcentage moyen de tumeur preacutesent dans les biopsies
bronchiques est drsquoun peu plus que 20 quand un diagnostic de SCC
ou ADC est diagnostiqueacute mais de 10 pour les cas de NSCLC-
NOS
bull Il nrsquoy a pas de tumeur dans 13 agrave frac12 des tissus preacuteleveacutes par
bronchoscopie pour maligniteacute
7 octobre 2014 32
7 octobre 2014 33
Pre-preparation for molecular analysis
Selection of the tumoral zone
Evaluation of of tumoral cells
HampE Unstained
slides
Macro-
dissection
Extraction ADN Dosage ADN
Courtesy M le Mercier PhD
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
Walk wwwcaporginstitute
7 octobre 2014 8
Plan
1 Quand les tests de biologie moleacuteculaire doivent ils ecirctre reacutealiseacutes
2 Comment tester EGFR
3 Comment tester ALK
4 Autres tests en routine
5 Comment les tests de biologie moleacuteculaires doivent ils ecirctre
impleacutementeacutes pour les adeacutenocarcinomes
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2014
7 octobre 2014 9
Le clinicien
Informations cliniques
Choix du site
Cyto histo
Fixation
Le pathologiste
Diagnostic
Qualiteacute du preacutelegravevement
Technique
Biologiste moleacuteculaire technologue
Equipe pluridisciplinaire
The right drug at the right dose to the right patient at the right time
7 octobre 2014 11
Le clinicien
Quel patient
Critegraveres cliniques Histologiques
Quel type de mateacuteriel
Cytohisto
Primitif vs meacutetastase
Quid si plusieurs primitifs
7 octobre 2014 12
Caracteacuteristiques cliniques AUCUNE
Les mutations EGFR sont plus freacutequentes chez les femmes non
fumeurs origine asiatique
Am J Clin Pathol 2012138332-346
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
7 octobre 2014 13
ALK
Quel patient
Critegraveres cliniques
Quel type de mateacuteriel
Cytohisto
Primitif vs meacutetastase
Quid si plusieurs primitifs
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
La preacutesence drsquoune translocation de ALK est plus freacutequente chez les jeunes
non fumeurs
7 octobre 2014 14
Types histologiques
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
bullAdeacutenocarcinomes (TOUS les sous types)
bullCarcinomes mixte avec une composante adeacutenocarcinome
bullExclus
bullAbsence de composante adeacutenocarcinome
bull Ex SCC purs
bull SCLC pur
bull LCC sans composante ADC en IHC
bullAttention si mateacuteriel quantitativement limiteacute (biopsie cytologie)
bullLa composante ADC ne peut ecirctre exclue
bullLes tests peuvent ecirctre reacutealiseacutes mecircme si SCC OU SCLC
bullChez un patient jeune non fumeur
7 octobre 2014 15
7 octobre 2014 16
Attention agrave lrsquoeacutepargne tissulaire
7 octobre 2014 17
La meilleure strateacutegie pour prendre en charge des preacutelegravevements de petite taille
pour des cas suspecteacutes de cancer du poumon est baseacute sur des informations
cliniques
Ces informations sont utiles pour le pathologiste pour
1 deacuteterminer les prioriteacutes dans lrsquoapproche diagnostique
2 deacuteterminer si un diagnostic speacutecifique est requis
3preacutevoir les investigations neacutecessaires et anticiper lrsquoutilisation drsquoIHC et des tests
de biologie moleacuteculaires
4 preacutevenir lrsquoutilisation inutile de tissu pour des tests qui ne sont pas requis ou
inteacuteressants eacutetant donneacute la clinique
7 octobre 2014 18
Lrsquohistoire clinique est essentielle pour
envisager si la tumeur pourrait ecirctre
meacutetastatique
Lrsquoexclusion drsquoune origine meacutetastatique
est une perte de temps de tissus et
de ressources du laboratoire
Il ne faut pas faire de laquo reflex testing raquo
pour faire un diagnostic diffeacuterentiel
entre une tumeur primitive et une
meacutetastase sans informations cliniques
pertinentes
7 octobre 2014 19
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
Discordance rare signification clinique incertaine (prob technique ds ganglion)
Le choix doit ecirctre base sur la qualiteacute (richesse tumorale)
7 octobre 2014 20
Un patient preacutesentant de multiples tumeurs primitives
Chaque tumeur doit ecirctre testeacutee
Il ne faut pas par contre tester diffeacuterentes zones drsquoune mecircme tumeur
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
7 octobre 2014 21
Au moment du diagnostic pour les stades IV
Au moment de la progression reacutecidive pour les autres stades
Ou au moment du diagnostic en fonction des deacutecisions locales
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Quel patient
7 octobre 2014 22
Les reacutesultats EGFR et ALK doivent ecirctre obtenus endeacuteans les 15 j
post arriveacutee du preacutelegravevement au laboratoire de biologie moleacuteculaire
(10 jours ouvrables)
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Timing
7 octobre 2014 23
EGFR epidermal growth factor receptor
Courtesy Pr Pauwels UZA
Mutations in exons 18-21 of the EHFR gene coding for the receptorrsquos internal TK domain activate the
receptor independently of extracelular ligand binding and are refferred as laquo activating mutations raquo
7 octobre 2014 24
Type de mateacuteriel
Fixeacute au formol (10) et enrobeacute dans la paraffine (FFEP)
Frais
Fixation agrave lrsquoalcool
PAS de deacutecalcifiant ni Bouin
Cytologie (bloc tissulaire) Histologie
Temps de fixation 6 agrave 48 h
POURCENTAGE EN CELLULES TUMORALES
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
7 octobre 2014 25
Courtesy Dr AL Trepant
7 octobre 2014 26
Avantage de la cytologie possibiliteacute de reacutealiser dans une tumeur
donneacutee des preacutelegravevements seacuterieacutes au cours du temps
But
eacutevaluer lrsquoefficaciteacute de la theacuterapie cibleacutee via la caracteacuterisation
moleacuteculaire
Identifier des laquo genetic shifts raquo drsquoADC mutants au cours du
traitement Tki (T790M)
Cytologie
Jiang SX et al Int J Cancer 2008 Gazdar AFOncogene 2009
Bean J et al Clin Cancer Res 2008
7 octobre 2014 27
Avant les analyses de biologie moleacuteculaire le contenu en cellules
tumorales de lrsquoeacutechantillon doit ecirctre deacutetermineacute afin drsquoeacutevaluer la fiabiliteacute
du reacutesultat
Crucial ratio entre le nombre de cellules malignes par rapport aux
cellules normales
Deacutetermination du pourcentage en cellules tumorales (cellulariteacute)
dissection manuelle (microdissection)
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 28
Un eacutechantillon doit contenir de 200 agrave 400 cellules tumorales
Rarement atteint en routine
50 de cellules tumorales mais des reacutesultats peuvent ecirctre obtenus
avec 10 agrave 20 de cellules tumorales
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 29
bull Le pourcentage moyen de tumeur preacutesent dans les biopsies
bronchiques est drsquoun peu plus que 20 quand un diagnostic de SCC
ou ADC est diagnostiqueacute mais de 10 pour les cas de NSCLC-
NOS
bull Il nrsquoy a pas de tumeur dans 13 agrave frac12 des tissus preacuteleveacutes par
bronchoscopie pour maligniteacute
7 octobre 2014 32
7 octobre 2014 33
Pre-preparation for molecular analysis
Selection of the tumoral zone
Evaluation of of tumoral cells
HampE Unstained
slides
Macro-
dissection
Extraction ADN Dosage ADN
Courtesy M le Mercier PhD
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 8
Plan
1 Quand les tests de biologie moleacuteculaire doivent ils ecirctre reacutealiseacutes
2 Comment tester EGFR
3 Comment tester ALK
4 Autres tests en routine
5 Comment les tests de biologie moleacuteculaires doivent ils ecirctre
impleacutementeacutes pour les adeacutenocarcinomes
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2014
7 octobre 2014 9
Le clinicien
Informations cliniques
Choix du site
Cyto histo
Fixation
Le pathologiste
Diagnostic
Qualiteacute du preacutelegravevement
Technique
Biologiste moleacuteculaire technologue
Equipe pluridisciplinaire
The right drug at the right dose to the right patient at the right time
7 octobre 2014 11
Le clinicien
Quel patient
Critegraveres cliniques Histologiques
Quel type de mateacuteriel
Cytohisto
Primitif vs meacutetastase
Quid si plusieurs primitifs
7 octobre 2014 12
Caracteacuteristiques cliniques AUCUNE
Les mutations EGFR sont plus freacutequentes chez les femmes non
fumeurs origine asiatique
Am J Clin Pathol 2012138332-346
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
7 octobre 2014 13
ALK
Quel patient
Critegraveres cliniques
Quel type de mateacuteriel
Cytohisto
Primitif vs meacutetastase
Quid si plusieurs primitifs
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
La preacutesence drsquoune translocation de ALK est plus freacutequente chez les jeunes
non fumeurs
7 octobre 2014 14
Types histologiques
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
bullAdeacutenocarcinomes (TOUS les sous types)
bullCarcinomes mixte avec une composante adeacutenocarcinome
bullExclus
bullAbsence de composante adeacutenocarcinome
bull Ex SCC purs
bull SCLC pur
bull LCC sans composante ADC en IHC
bullAttention si mateacuteriel quantitativement limiteacute (biopsie cytologie)
bullLa composante ADC ne peut ecirctre exclue
bullLes tests peuvent ecirctre reacutealiseacutes mecircme si SCC OU SCLC
bullChez un patient jeune non fumeur
7 octobre 2014 15
7 octobre 2014 16
Attention agrave lrsquoeacutepargne tissulaire
7 octobre 2014 17
La meilleure strateacutegie pour prendre en charge des preacutelegravevements de petite taille
pour des cas suspecteacutes de cancer du poumon est baseacute sur des informations
cliniques
Ces informations sont utiles pour le pathologiste pour
1 deacuteterminer les prioriteacutes dans lrsquoapproche diagnostique
2 deacuteterminer si un diagnostic speacutecifique est requis
3preacutevoir les investigations neacutecessaires et anticiper lrsquoutilisation drsquoIHC et des tests
de biologie moleacuteculaires
4 preacutevenir lrsquoutilisation inutile de tissu pour des tests qui ne sont pas requis ou
inteacuteressants eacutetant donneacute la clinique
7 octobre 2014 18
Lrsquohistoire clinique est essentielle pour
envisager si la tumeur pourrait ecirctre
meacutetastatique
Lrsquoexclusion drsquoune origine meacutetastatique
est une perte de temps de tissus et
de ressources du laboratoire
Il ne faut pas faire de laquo reflex testing raquo
pour faire un diagnostic diffeacuterentiel
entre une tumeur primitive et une
meacutetastase sans informations cliniques
pertinentes
7 octobre 2014 19
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
Discordance rare signification clinique incertaine (prob technique ds ganglion)
Le choix doit ecirctre base sur la qualiteacute (richesse tumorale)
7 octobre 2014 20
Un patient preacutesentant de multiples tumeurs primitives
Chaque tumeur doit ecirctre testeacutee
Il ne faut pas par contre tester diffeacuterentes zones drsquoune mecircme tumeur
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
7 octobre 2014 21
Au moment du diagnostic pour les stades IV
Au moment de la progression reacutecidive pour les autres stades
Ou au moment du diagnostic en fonction des deacutecisions locales
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Quel patient
7 octobre 2014 22
Les reacutesultats EGFR et ALK doivent ecirctre obtenus endeacuteans les 15 j
post arriveacutee du preacutelegravevement au laboratoire de biologie moleacuteculaire
(10 jours ouvrables)
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Timing
7 octobre 2014 23
EGFR epidermal growth factor receptor
Courtesy Pr Pauwels UZA
Mutations in exons 18-21 of the EHFR gene coding for the receptorrsquos internal TK domain activate the
receptor independently of extracelular ligand binding and are refferred as laquo activating mutations raquo
7 octobre 2014 24
Type de mateacuteriel
Fixeacute au formol (10) et enrobeacute dans la paraffine (FFEP)
Frais
Fixation agrave lrsquoalcool
PAS de deacutecalcifiant ni Bouin
Cytologie (bloc tissulaire) Histologie
Temps de fixation 6 agrave 48 h
POURCENTAGE EN CELLULES TUMORALES
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
7 octobre 2014 25
Courtesy Dr AL Trepant
7 octobre 2014 26
Avantage de la cytologie possibiliteacute de reacutealiser dans une tumeur
donneacutee des preacutelegravevements seacuterieacutes au cours du temps
But
eacutevaluer lrsquoefficaciteacute de la theacuterapie cibleacutee via la caracteacuterisation
moleacuteculaire
Identifier des laquo genetic shifts raquo drsquoADC mutants au cours du
traitement Tki (T790M)
Cytologie
Jiang SX et al Int J Cancer 2008 Gazdar AFOncogene 2009
Bean J et al Clin Cancer Res 2008
7 octobre 2014 27
Avant les analyses de biologie moleacuteculaire le contenu en cellules
tumorales de lrsquoeacutechantillon doit ecirctre deacutetermineacute afin drsquoeacutevaluer la fiabiliteacute
du reacutesultat
Crucial ratio entre le nombre de cellules malignes par rapport aux
cellules normales
Deacutetermination du pourcentage en cellules tumorales (cellulariteacute)
dissection manuelle (microdissection)
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 28
Un eacutechantillon doit contenir de 200 agrave 400 cellules tumorales
Rarement atteint en routine
50 de cellules tumorales mais des reacutesultats peuvent ecirctre obtenus
avec 10 agrave 20 de cellules tumorales
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 29
bull Le pourcentage moyen de tumeur preacutesent dans les biopsies
bronchiques est drsquoun peu plus que 20 quand un diagnostic de SCC
ou ADC est diagnostiqueacute mais de 10 pour les cas de NSCLC-
NOS
bull Il nrsquoy a pas de tumeur dans 13 agrave frac12 des tissus preacuteleveacutes par
bronchoscopie pour maligniteacute
7 octobre 2014 32
7 octobre 2014 33
Pre-preparation for molecular analysis
Selection of the tumoral zone
Evaluation of of tumoral cells
HampE Unstained
slides
Macro-
dissection
Extraction ADN Dosage ADN
Courtesy M le Mercier PhD
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 9
Le clinicien
Informations cliniques
Choix du site
Cyto histo
Fixation
Le pathologiste
Diagnostic
Qualiteacute du preacutelegravevement
Technique
Biologiste moleacuteculaire technologue
Equipe pluridisciplinaire
The right drug at the right dose to the right patient at the right time
7 octobre 2014 11
Le clinicien
Quel patient
Critegraveres cliniques Histologiques
Quel type de mateacuteriel
Cytohisto
Primitif vs meacutetastase
Quid si plusieurs primitifs
7 octobre 2014 12
Caracteacuteristiques cliniques AUCUNE
Les mutations EGFR sont plus freacutequentes chez les femmes non
fumeurs origine asiatique
Am J Clin Pathol 2012138332-346
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
7 octobre 2014 13
ALK
Quel patient
Critegraveres cliniques
Quel type de mateacuteriel
Cytohisto
Primitif vs meacutetastase
Quid si plusieurs primitifs
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
La preacutesence drsquoune translocation de ALK est plus freacutequente chez les jeunes
non fumeurs
7 octobre 2014 14
Types histologiques
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
bullAdeacutenocarcinomes (TOUS les sous types)
bullCarcinomes mixte avec une composante adeacutenocarcinome
bullExclus
bullAbsence de composante adeacutenocarcinome
bull Ex SCC purs
bull SCLC pur
bull LCC sans composante ADC en IHC
bullAttention si mateacuteriel quantitativement limiteacute (biopsie cytologie)
bullLa composante ADC ne peut ecirctre exclue
bullLes tests peuvent ecirctre reacutealiseacutes mecircme si SCC OU SCLC
bullChez un patient jeune non fumeur
7 octobre 2014 15
7 octobre 2014 16
Attention agrave lrsquoeacutepargne tissulaire
7 octobre 2014 17
La meilleure strateacutegie pour prendre en charge des preacutelegravevements de petite taille
pour des cas suspecteacutes de cancer du poumon est baseacute sur des informations
cliniques
Ces informations sont utiles pour le pathologiste pour
1 deacuteterminer les prioriteacutes dans lrsquoapproche diagnostique
2 deacuteterminer si un diagnostic speacutecifique est requis
3preacutevoir les investigations neacutecessaires et anticiper lrsquoutilisation drsquoIHC et des tests
de biologie moleacuteculaires
4 preacutevenir lrsquoutilisation inutile de tissu pour des tests qui ne sont pas requis ou
inteacuteressants eacutetant donneacute la clinique
7 octobre 2014 18
Lrsquohistoire clinique est essentielle pour
envisager si la tumeur pourrait ecirctre
meacutetastatique
Lrsquoexclusion drsquoune origine meacutetastatique
est une perte de temps de tissus et
de ressources du laboratoire
Il ne faut pas faire de laquo reflex testing raquo
pour faire un diagnostic diffeacuterentiel
entre une tumeur primitive et une
meacutetastase sans informations cliniques
pertinentes
7 octobre 2014 19
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
Discordance rare signification clinique incertaine (prob technique ds ganglion)
Le choix doit ecirctre base sur la qualiteacute (richesse tumorale)
7 octobre 2014 20
Un patient preacutesentant de multiples tumeurs primitives
Chaque tumeur doit ecirctre testeacutee
Il ne faut pas par contre tester diffeacuterentes zones drsquoune mecircme tumeur
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
7 octobre 2014 21
Au moment du diagnostic pour les stades IV
Au moment de la progression reacutecidive pour les autres stades
Ou au moment du diagnostic en fonction des deacutecisions locales
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Quel patient
7 octobre 2014 22
Les reacutesultats EGFR et ALK doivent ecirctre obtenus endeacuteans les 15 j
post arriveacutee du preacutelegravevement au laboratoire de biologie moleacuteculaire
(10 jours ouvrables)
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Timing
7 octobre 2014 23
EGFR epidermal growth factor receptor
Courtesy Pr Pauwels UZA
Mutations in exons 18-21 of the EHFR gene coding for the receptorrsquos internal TK domain activate the
receptor independently of extracelular ligand binding and are refferred as laquo activating mutations raquo
7 octobre 2014 24
Type de mateacuteriel
Fixeacute au formol (10) et enrobeacute dans la paraffine (FFEP)
Frais
Fixation agrave lrsquoalcool
PAS de deacutecalcifiant ni Bouin
Cytologie (bloc tissulaire) Histologie
Temps de fixation 6 agrave 48 h
POURCENTAGE EN CELLULES TUMORALES
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
7 octobre 2014 25
Courtesy Dr AL Trepant
7 octobre 2014 26
Avantage de la cytologie possibiliteacute de reacutealiser dans une tumeur
donneacutee des preacutelegravevements seacuterieacutes au cours du temps
But
eacutevaluer lrsquoefficaciteacute de la theacuterapie cibleacutee via la caracteacuterisation
moleacuteculaire
Identifier des laquo genetic shifts raquo drsquoADC mutants au cours du
traitement Tki (T790M)
Cytologie
Jiang SX et al Int J Cancer 2008 Gazdar AFOncogene 2009
Bean J et al Clin Cancer Res 2008
7 octobre 2014 27
Avant les analyses de biologie moleacuteculaire le contenu en cellules
tumorales de lrsquoeacutechantillon doit ecirctre deacutetermineacute afin drsquoeacutevaluer la fiabiliteacute
du reacutesultat
Crucial ratio entre le nombre de cellules malignes par rapport aux
cellules normales
Deacutetermination du pourcentage en cellules tumorales (cellulariteacute)
dissection manuelle (microdissection)
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 28
Un eacutechantillon doit contenir de 200 agrave 400 cellules tumorales
Rarement atteint en routine
50 de cellules tumorales mais des reacutesultats peuvent ecirctre obtenus
avec 10 agrave 20 de cellules tumorales
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 29
bull Le pourcentage moyen de tumeur preacutesent dans les biopsies
bronchiques est drsquoun peu plus que 20 quand un diagnostic de SCC
ou ADC est diagnostiqueacute mais de 10 pour les cas de NSCLC-
NOS
bull Il nrsquoy a pas de tumeur dans 13 agrave frac12 des tissus preacuteleveacutes par
bronchoscopie pour maligniteacute
7 octobre 2014 32
7 octobre 2014 33
Pre-preparation for molecular analysis
Selection of the tumoral zone
Evaluation of of tumoral cells
HampE Unstained
slides
Macro-
dissection
Extraction ADN Dosage ADN
Courtesy M le Mercier PhD
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
The right drug at the right dose to the right patient at the right time
7 octobre 2014 11
Le clinicien
Quel patient
Critegraveres cliniques Histologiques
Quel type de mateacuteriel
Cytohisto
Primitif vs meacutetastase
Quid si plusieurs primitifs
7 octobre 2014 12
Caracteacuteristiques cliniques AUCUNE
Les mutations EGFR sont plus freacutequentes chez les femmes non
fumeurs origine asiatique
Am J Clin Pathol 2012138332-346
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
7 octobre 2014 13
ALK
Quel patient
Critegraveres cliniques
Quel type de mateacuteriel
Cytohisto
Primitif vs meacutetastase
Quid si plusieurs primitifs
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
La preacutesence drsquoune translocation de ALK est plus freacutequente chez les jeunes
non fumeurs
7 octobre 2014 14
Types histologiques
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
bullAdeacutenocarcinomes (TOUS les sous types)
bullCarcinomes mixte avec une composante adeacutenocarcinome
bullExclus
bullAbsence de composante adeacutenocarcinome
bull Ex SCC purs
bull SCLC pur
bull LCC sans composante ADC en IHC
bullAttention si mateacuteriel quantitativement limiteacute (biopsie cytologie)
bullLa composante ADC ne peut ecirctre exclue
bullLes tests peuvent ecirctre reacutealiseacutes mecircme si SCC OU SCLC
bullChez un patient jeune non fumeur
7 octobre 2014 15
7 octobre 2014 16
Attention agrave lrsquoeacutepargne tissulaire
7 octobre 2014 17
La meilleure strateacutegie pour prendre en charge des preacutelegravevements de petite taille
pour des cas suspecteacutes de cancer du poumon est baseacute sur des informations
cliniques
Ces informations sont utiles pour le pathologiste pour
1 deacuteterminer les prioriteacutes dans lrsquoapproche diagnostique
2 deacuteterminer si un diagnostic speacutecifique est requis
3preacutevoir les investigations neacutecessaires et anticiper lrsquoutilisation drsquoIHC et des tests
de biologie moleacuteculaires
4 preacutevenir lrsquoutilisation inutile de tissu pour des tests qui ne sont pas requis ou
inteacuteressants eacutetant donneacute la clinique
7 octobre 2014 18
Lrsquohistoire clinique est essentielle pour
envisager si la tumeur pourrait ecirctre
meacutetastatique
Lrsquoexclusion drsquoune origine meacutetastatique
est une perte de temps de tissus et
de ressources du laboratoire
Il ne faut pas faire de laquo reflex testing raquo
pour faire un diagnostic diffeacuterentiel
entre une tumeur primitive et une
meacutetastase sans informations cliniques
pertinentes
7 octobre 2014 19
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
Discordance rare signification clinique incertaine (prob technique ds ganglion)
Le choix doit ecirctre base sur la qualiteacute (richesse tumorale)
7 octobre 2014 20
Un patient preacutesentant de multiples tumeurs primitives
Chaque tumeur doit ecirctre testeacutee
Il ne faut pas par contre tester diffeacuterentes zones drsquoune mecircme tumeur
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
7 octobre 2014 21
Au moment du diagnostic pour les stades IV
Au moment de la progression reacutecidive pour les autres stades
Ou au moment du diagnostic en fonction des deacutecisions locales
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Quel patient
7 octobre 2014 22
Les reacutesultats EGFR et ALK doivent ecirctre obtenus endeacuteans les 15 j
post arriveacutee du preacutelegravevement au laboratoire de biologie moleacuteculaire
(10 jours ouvrables)
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Timing
7 octobre 2014 23
EGFR epidermal growth factor receptor
Courtesy Pr Pauwels UZA
Mutations in exons 18-21 of the EHFR gene coding for the receptorrsquos internal TK domain activate the
receptor independently of extracelular ligand binding and are refferred as laquo activating mutations raquo
7 octobre 2014 24
Type de mateacuteriel
Fixeacute au formol (10) et enrobeacute dans la paraffine (FFEP)
Frais
Fixation agrave lrsquoalcool
PAS de deacutecalcifiant ni Bouin
Cytologie (bloc tissulaire) Histologie
Temps de fixation 6 agrave 48 h
POURCENTAGE EN CELLULES TUMORALES
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
7 octobre 2014 25
Courtesy Dr AL Trepant
7 octobre 2014 26
Avantage de la cytologie possibiliteacute de reacutealiser dans une tumeur
donneacutee des preacutelegravevements seacuterieacutes au cours du temps
But
eacutevaluer lrsquoefficaciteacute de la theacuterapie cibleacutee via la caracteacuterisation
moleacuteculaire
Identifier des laquo genetic shifts raquo drsquoADC mutants au cours du
traitement Tki (T790M)
Cytologie
Jiang SX et al Int J Cancer 2008 Gazdar AFOncogene 2009
Bean J et al Clin Cancer Res 2008
7 octobre 2014 27
Avant les analyses de biologie moleacuteculaire le contenu en cellules
tumorales de lrsquoeacutechantillon doit ecirctre deacutetermineacute afin drsquoeacutevaluer la fiabiliteacute
du reacutesultat
Crucial ratio entre le nombre de cellules malignes par rapport aux
cellules normales
Deacutetermination du pourcentage en cellules tumorales (cellulariteacute)
dissection manuelle (microdissection)
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 28
Un eacutechantillon doit contenir de 200 agrave 400 cellules tumorales
Rarement atteint en routine
50 de cellules tumorales mais des reacutesultats peuvent ecirctre obtenus
avec 10 agrave 20 de cellules tumorales
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 29
bull Le pourcentage moyen de tumeur preacutesent dans les biopsies
bronchiques est drsquoun peu plus que 20 quand un diagnostic de SCC
ou ADC est diagnostiqueacute mais de 10 pour les cas de NSCLC-
NOS
bull Il nrsquoy a pas de tumeur dans 13 agrave frac12 des tissus preacuteleveacutes par
bronchoscopie pour maligniteacute
7 octobre 2014 32
7 octobre 2014 33
Pre-preparation for molecular analysis
Selection of the tumoral zone
Evaluation of of tumoral cells
HampE Unstained
slides
Macro-
dissection
Extraction ADN Dosage ADN
Courtesy M le Mercier PhD
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 11
Le clinicien
Quel patient
Critegraveres cliniques Histologiques
Quel type de mateacuteriel
Cytohisto
Primitif vs meacutetastase
Quid si plusieurs primitifs
7 octobre 2014 12
Caracteacuteristiques cliniques AUCUNE
Les mutations EGFR sont plus freacutequentes chez les femmes non
fumeurs origine asiatique
Am J Clin Pathol 2012138332-346
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
7 octobre 2014 13
ALK
Quel patient
Critegraveres cliniques
Quel type de mateacuteriel
Cytohisto
Primitif vs meacutetastase
Quid si plusieurs primitifs
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
La preacutesence drsquoune translocation de ALK est plus freacutequente chez les jeunes
non fumeurs
7 octobre 2014 14
Types histologiques
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
bullAdeacutenocarcinomes (TOUS les sous types)
bullCarcinomes mixte avec une composante adeacutenocarcinome
bullExclus
bullAbsence de composante adeacutenocarcinome
bull Ex SCC purs
bull SCLC pur
bull LCC sans composante ADC en IHC
bullAttention si mateacuteriel quantitativement limiteacute (biopsie cytologie)
bullLa composante ADC ne peut ecirctre exclue
bullLes tests peuvent ecirctre reacutealiseacutes mecircme si SCC OU SCLC
bullChez un patient jeune non fumeur
7 octobre 2014 15
7 octobre 2014 16
Attention agrave lrsquoeacutepargne tissulaire
7 octobre 2014 17
La meilleure strateacutegie pour prendre en charge des preacutelegravevements de petite taille
pour des cas suspecteacutes de cancer du poumon est baseacute sur des informations
cliniques
Ces informations sont utiles pour le pathologiste pour
1 deacuteterminer les prioriteacutes dans lrsquoapproche diagnostique
2 deacuteterminer si un diagnostic speacutecifique est requis
3preacutevoir les investigations neacutecessaires et anticiper lrsquoutilisation drsquoIHC et des tests
de biologie moleacuteculaires
4 preacutevenir lrsquoutilisation inutile de tissu pour des tests qui ne sont pas requis ou
inteacuteressants eacutetant donneacute la clinique
7 octobre 2014 18
Lrsquohistoire clinique est essentielle pour
envisager si la tumeur pourrait ecirctre
meacutetastatique
Lrsquoexclusion drsquoune origine meacutetastatique
est une perte de temps de tissus et
de ressources du laboratoire
Il ne faut pas faire de laquo reflex testing raquo
pour faire un diagnostic diffeacuterentiel
entre une tumeur primitive et une
meacutetastase sans informations cliniques
pertinentes
7 octobre 2014 19
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
Discordance rare signification clinique incertaine (prob technique ds ganglion)
Le choix doit ecirctre base sur la qualiteacute (richesse tumorale)
7 octobre 2014 20
Un patient preacutesentant de multiples tumeurs primitives
Chaque tumeur doit ecirctre testeacutee
Il ne faut pas par contre tester diffeacuterentes zones drsquoune mecircme tumeur
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
7 octobre 2014 21
Au moment du diagnostic pour les stades IV
Au moment de la progression reacutecidive pour les autres stades
Ou au moment du diagnostic en fonction des deacutecisions locales
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Quel patient
7 octobre 2014 22
Les reacutesultats EGFR et ALK doivent ecirctre obtenus endeacuteans les 15 j
post arriveacutee du preacutelegravevement au laboratoire de biologie moleacuteculaire
(10 jours ouvrables)
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Timing
7 octobre 2014 23
EGFR epidermal growth factor receptor
Courtesy Pr Pauwels UZA
Mutations in exons 18-21 of the EHFR gene coding for the receptorrsquos internal TK domain activate the
receptor independently of extracelular ligand binding and are refferred as laquo activating mutations raquo
7 octobre 2014 24
Type de mateacuteriel
Fixeacute au formol (10) et enrobeacute dans la paraffine (FFEP)
Frais
Fixation agrave lrsquoalcool
PAS de deacutecalcifiant ni Bouin
Cytologie (bloc tissulaire) Histologie
Temps de fixation 6 agrave 48 h
POURCENTAGE EN CELLULES TUMORALES
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
7 octobre 2014 25
Courtesy Dr AL Trepant
7 octobre 2014 26
Avantage de la cytologie possibiliteacute de reacutealiser dans une tumeur
donneacutee des preacutelegravevements seacuterieacutes au cours du temps
But
eacutevaluer lrsquoefficaciteacute de la theacuterapie cibleacutee via la caracteacuterisation
moleacuteculaire
Identifier des laquo genetic shifts raquo drsquoADC mutants au cours du
traitement Tki (T790M)
Cytologie
Jiang SX et al Int J Cancer 2008 Gazdar AFOncogene 2009
Bean J et al Clin Cancer Res 2008
7 octobre 2014 27
Avant les analyses de biologie moleacuteculaire le contenu en cellules
tumorales de lrsquoeacutechantillon doit ecirctre deacutetermineacute afin drsquoeacutevaluer la fiabiliteacute
du reacutesultat
Crucial ratio entre le nombre de cellules malignes par rapport aux
cellules normales
Deacutetermination du pourcentage en cellules tumorales (cellulariteacute)
dissection manuelle (microdissection)
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 28
Un eacutechantillon doit contenir de 200 agrave 400 cellules tumorales
Rarement atteint en routine
50 de cellules tumorales mais des reacutesultats peuvent ecirctre obtenus
avec 10 agrave 20 de cellules tumorales
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 29
bull Le pourcentage moyen de tumeur preacutesent dans les biopsies
bronchiques est drsquoun peu plus que 20 quand un diagnostic de SCC
ou ADC est diagnostiqueacute mais de 10 pour les cas de NSCLC-
NOS
bull Il nrsquoy a pas de tumeur dans 13 agrave frac12 des tissus preacuteleveacutes par
bronchoscopie pour maligniteacute
7 octobre 2014 32
7 octobre 2014 33
Pre-preparation for molecular analysis
Selection of the tumoral zone
Evaluation of of tumoral cells
HampE Unstained
slides
Macro-
dissection
Extraction ADN Dosage ADN
Courtesy M le Mercier PhD
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 12
Caracteacuteristiques cliniques AUCUNE
Les mutations EGFR sont plus freacutequentes chez les femmes non
fumeurs origine asiatique
Am J Clin Pathol 2012138332-346
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
7 octobre 2014 13
ALK
Quel patient
Critegraveres cliniques
Quel type de mateacuteriel
Cytohisto
Primitif vs meacutetastase
Quid si plusieurs primitifs
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
La preacutesence drsquoune translocation de ALK est plus freacutequente chez les jeunes
non fumeurs
7 octobre 2014 14
Types histologiques
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
bullAdeacutenocarcinomes (TOUS les sous types)
bullCarcinomes mixte avec une composante adeacutenocarcinome
bullExclus
bullAbsence de composante adeacutenocarcinome
bull Ex SCC purs
bull SCLC pur
bull LCC sans composante ADC en IHC
bullAttention si mateacuteriel quantitativement limiteacute (biopsie cytologie)
bullLa composante ADC ne peut ecirctre exclue
bullLes tests peuvent ecirctre reacutealiseacutes mecircme si SCC OU SCLC
bullChez un patient jeune non fumeur
7 octobre 2014 15
7 octobre 2014 16
Attention agrave lrsquoeacutepargne tissulaire
7 octobre 2014 17
La meilleure strateacutegie pour prendre en charge des preacutelegravevements de petite taille
pour des cas suspecteacutes de cancer du poumon est baseacute sur des informations
cliniques
Ces informations sont utiles pour le pathologiste pour
1 deacuteterminer les prioriteacutes dans lrsquoapproche diagnostique
2 deacuteterminer si un diagnostic speacutecifique est requis
3preacutevoir les investigations neacutecessaires et anticiper lrsquoutilisation drsquoIHC et des tests
de biologie moleacuteculaires
4 preacutevenir lrsquoutilisation inutile de tissu pour des tests qui ne sont pas requis ou
inteacuteressants eacutetant donneacute la clinique
7 octobre 2014 18
Lrsquohistoire clinique est essentielle pour
envisager si la tumeur pourrait ecirctre
meacutetastatique
Lrsquoexclusion drsquoune origine meacutetastatique
est une perte de temps de tissus et
de ressources du laboratoire
Il ne faut pas faire de laquo reflex testing raquo
pour faire un diagnostic diffeacuterentiel
entre une tumeur primitive et une
meacutetastase sans informations cliniques
pertinentes
7 octobre 2014 19
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
Discordance rare signification clinique incertaine (prob technique ds ganglion)
Le choix doit ecirctre base sur la qualiteacute (richesse tumorale)
7 octobre 2014 20
Un patient preacutesentant de multiples tumeurs primitives
Chaque tumeur doit ecirctre testeacutee
Il ne faut pas par contre tester diffeacuterentes zones drsquoune mecircme tumeur
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
7 octobre 2014 21
Au moment du diagnostic pour les stades IV
Au moment de la progression reacutecidive pour les autres stades
Ou au moment du diagnostic en fonction des deacutecisions locales
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Quel patient
7 octobre 2014 22
Les reacutesultats EGFR et ALK doivent ecirctre obtenus endeacuteans les 15 j
post arriveacutee du preacutelegravevement au laboratoire de biologie moleacuteculaire
(10 jours ouvrables)
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Timing
7 octobre 2014 23
EGFR epidermal growth factor receptor
Courtesy Pr Pauwels UZA
Mutations in exons 18-21 of the EHFR gene coding for the receptorrsquos internal TK domain activate the
receptor independently of extracelular ligand binding and are refferred as laquo activating mutations raquo
7 octobre 2014 24
Type de mateacuteriel
Fixeacute au formol (10) et enrobeacute dans la paraffine (FFEP)
Frais
Fixation agrave lrsquoalcool
PAS de deacutecalcifiant ni Bouin
Cytologie (bloc tissulaire) Histologie
Temps de fixation 6 agrave 48 h
POURCENTAGE EN CELLULES TUMORALES
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
7 octobre 2014 25
Courtesy Dr AL Trepant
7 octobre 2014 26
Avantage de la cytologie possibiliteacute de reacutealiser dans une tumeur
donneacutee des preacutelegravevements seacuterieacutes au cours du temps
But
eacutevaluer lrsquoefficaciteacute de la theacuterapie cibleacutee via la caracteacuterisation
moleacuteculaire
Identifier des laquo genetic shifts raquo drsquoADC mutants au cours du
traitement Tki (T790M)
Cytologie
Jiang SX et al Int J Cancer 2008 Gazdar AFOncogene 2009
Bean J et al Clin Cancer Res 2008
7 octobre 2014 27
Avant les analyses de biologie moleacuteculaire le contenu en cellules
tumorales de lrsquoeacutechantillon doit ecirctre deacutetermineacute afin drsquoeacutevaluer la fiabiliteacute
du reacutesultat
Crucial ratio entre le nombre de cellules malignes par rapport aux
cellules normales
Deacutetermination du pourcentage en cellules tumorales (cellulariteacute)
dissection manuelle (microdissection)
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 28
Un eacutechantillon doit contenir de 200 agrave 400 cellules tumorales
Rarement atteint en routine
50 de cellules tumorales mais des reacutesultats peuvent ecirctre obtenus
avec 10 agrave 20 de cellules tumorales
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 29
bull Le pourcentage moyen de tumeur preacutesent dans les biopsies
bronchiques est drsquoun peu plus que 20 quand un diagnostic de SCC
ou ADC est diagnostiqueacute mais de 10 pour les cas de NSCLC-
NOS
bull Il nrsquoy a pas de tumeur dans 13 agrave frac12 des tissus preacuteleveacutes par
bronchoscopie pour maligniteacute
7 octobre 2014 32
7 octobre 2014 33
Pre-preparation for molecular analysis
Selection of the tumoral zone
Evaluation of of tumoral cells
HampE Unstained
slides
Macro-
dissection
Extraction ADN Dosage ADN
Courtesy M le Mercier PhD
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 13
ALK
Quel patient
Critegraveres cliniques
Quel type de mateacuteriel
Cytohisto
Primitif vs meacutetastase
Quid si plusieurs primitifs
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
La preacutesence drsquoune translocation de ALK est plus freacutequente chez les jeunes
non fumeurs
7 octobre 2014 14
Types histologiques
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
bullAdeacutenocarcinomes (TOUS les sous types)
bullCarcinomes mixte avec une composante adeacutenocarcinome
bullExclus
bullAbsence de composante adeacutenocarcinome
bull Ex SCC purs
bull SCLC pur
bull LCC sans composante ADC en IHC
bullAttention si mateacuteriel quantitativement limiteacute (biopsie cytologie)
bullLa composante ADC ne peut ecirctre exclue
bullLes tests peuvent ecirctre reacutealiseacutes mecircme si SCC OU SCLC
bullChez un patient jeune non fumeur
7 octobre 2014 15
7 octobre 2014 16
Attention agrave lrsquoeacutepargne tissulaire
7 octobre 2014 17
La meilleure strateacutegie pour prendre en charge des preacutelegravevements de petite taille
pour des cas suspecteacutes de cancer du poumon est baseacute sur des informations
cliniques
Ces informations sont utiles pour le pathologiste pour
1 deacuteterminer les prioriteacutes dans lrsquoapproche diagnostique
2 deacuteterminer si un diagnostic speacutecifique est requis
3preacutevoir les investigations neacutecessaires et anticiper lrsquoutilisation drsquoIHC et des tests
de biologie moleacuteculaires
4 preacutevenir lrsquoutilisation inutile de tissu pour des tests qui ne sont pas requis ou
inteacuteressants eacutetant donneacute la clinique
7 octobre 2014 18
Lrsquohistoire clinique est essentielle pour
envisager si la tumeur pourrait ecirctre
meacutetastatique
Lrsquoexclusion drsquoune origine meacutetastatique
est une perte de temps de tissus et
de ressources du laboratoire
Il ne faut pas faire de laquo reflex testing raquo
pour faire un diagnostic diffeacuterentiel
entre une tumeur primitive et une
meacutetastase sans informations cliniques
pertinentes
7 octobre 2014 19
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
Discordance rare signification clinique incertaine (prob technique ds ganglion)
Le choix doit ecirctre base sur la qualiteacute (richesse tumorale)
7 octobre 2014 20
Un patient preacutesentant de multiples tumeurs primitives
Chaque tumeur doit ecirctre testeacutee
Il ne faut pas par contre tester diffeacuterentes zones drsquoune mecircme tumeur
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
7 octobre 2014 21
Au moment du diagnostic pour les stades IV
Au moment de la progression reacutecidive pour les autres stades
Ou au moment du diagnostic en fonction des deacutecisions locales
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Quel patient
7 octobre 2014 22
Les reacutesultats EGFR et ALK doivent ecirctre obtenus endeacuteans les 15 j
post arriveacutee du preacutelegravevement au laboratoire de biologie moleacuteculaire
(10 jours ouvrables)
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Timing
7 octobre 2014 23
EGFR epidermal growth factor receptor
Courtesy Pr Pauwels UZA
Mutations in exons 18-21 of the EHFR gene coding for the receptorrsquos internal TK domain activate the
receptor independently of extracelular ligand binding and are refferred as laquo activating mutations raquo
7 octobre 2014 24
Type de mateacuteriel
Fixeacute au formol (10) et enrobeacute dans la paraffine (FFEP)
Frais
Fixation agrave lrsquoalcool
PAS de deacutecalcifiant ni Bouin
Cytologie (bloc tissulaire) Histologie
Temps de fixation 6 agrave 48 h
POURCENTAGE EN CELLULES TUMORALES
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
7 octobre 2014 25
Courtesy Dr AL Trepant
7 octobre 2014 26
Avantage de la cytologie possibiliteacute de reacutealiser dans une tumeur
donneacutee des preacutelegravevements seacuterieacutes au cours du temps
But
eacutevaluer lrsquoefficaciteacute de la theacuterapie cibleacutee via la caracteacuterisation
moleacuteculaire
Identifier des laquo genetic shifts raquo drsquoADC mutants au cours du
traitement Tki (T790M)
Cytologie
Jiang SX et al Int J Cancer 2008 Gazdar AFOncogene 2009
Bean J et al Clin Cancer Res 2008
7 octobre 2014 27
Avant les analyses de biologie moleacuteculaire le contenu en cellules
tumorales de lrsquoeacutechantillon doit ecirctre deacutetermineacute afin drsquoeacutevaluer la fiabiliteacute
du reacutesultat
Crucial ratio entre le nombre de cellules malignes par rapport aux
cellules normales
Deacutetermination du pourcentage en cellules tumorales (cellulariteacute)
dissection manuelle (microdissection)
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 28
Un eacutechantillon doit contenir de 200 agrave 400 cellules tumorales
Rarement atteint en routine
50 de cellules tumorales mais des reacutesultats peuvent ecirctre obtenus
avec 10 agrave 20 de cellules tumorales
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 29
bull Le pourcentage moyen de tumeur preacutesent dans les biopsies
bronchiques est drsquoun peu plus que 20 quand un diagnostic de SCC
ou ADC est diagnostiqueacute mais de 10 pour les cas de NSCLC-
NOS
bull Il nrsquoy a pas de tumeur dans 13 agrave frac12 des tissus preacuteleveacutes par
bronchoscopie pour maligniteacute
7 octobre 2014 32
7 octobre 2014 33
Pre-preparation for molecular analysis
Selection of the tumoral zone
Evaluation of of tumoral cells
HampE Unstained
slides
Macro-
dissection
Extraction ADN Dosage ADN
Courtesy M le Mercier PhD
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 14
Types histologiques
Lindeman NI et al The journal of Molecular Diagnostics 2013
bullAdeacutenocarcinomes (TOUS les sous types)
bullCarcinomes mixte avec une composante adeacutenocarcinome
bullExclus
bullAbsence de composante adeacutenocarcinome
bull Ex SCC purs
bull SCLC pur
bull LCC sans composante ADC en IHC
bullAttention si mateacuteriel quantitativement limiteacute (biopsie cytologie)
bullLa composante ADC ne peut ecirctre exclue
bullLes tests peuvent ecirctre reacutealiseacutes mecircme si SCC OU SCLC
bullChez un patient jeune non fumeur
7 octobre 2014 15
7 octobre 2014 16
Attention agrave lrsquoeacutepargne tissulaire
7 octobre 2014 17
La meilleure strateacutegie pour prendre en charge des preacutelegravevements de petite taille
pour des cas suspecteacutes de cancer du poumon est baseacute sur des informations
cliniques
Ces informations sont utiles pour le pathologiste pour
1 deacuteterminer les prioriteacutes dans lrsquoapproche diagnostique
2 deacuteterminer si un diagnostic speacutecifique est requis
3preacutevoir les investigations neacutecessaires et anticiper lrsquoutilisation drsquoIHC et des tests
de biologie moleacuteculaires
4 preacutevenir lrsquoutilisation inutile de tissu pour des tests qui ne sont pas requis ou
inteacuteressants eacutetant donneacute la clinique
7 octobre 2014 18
Lrsquohistoire clinique est essentielle pour
envisager si la tumeur pourrait ecirctre
meacutetastatique
Lrsquoexclusion drsquoune origine meacutetastatique
est une perte de temps de tissus et
de ressources du laboratoire
Il ne faut pas faire de laquo reflex testing raquo
pour faire un diagnostic diffeacuterentiel
entre une tumeur primitive et une
meacutetastase sans informations cliniques
pertinentes
7 octobre 2014 19
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
Discordance rare signification clinique incertaine (prob technique ds ganglion)
Le choix doit ecirctre base sur la qualiteacute (richesse tumorale)
7 octobre 2014 20
Un patient preacutesentant de multiples tumeurs primitives
Chaque tumeur doit ecirctre testeacutee
Il ne faut pas par contre tester diffeacuterentes zones drsquoune mecircme tumeur
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
7 octobre 2014 21
Au moment du diagnostic pour les stades IV
Au moment de la progression reacutecidive pour les autres stades
Ou au moment du diagnostic en fonction des deacutecisions locales
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Quel patient
7 octobre 2014 22
Les reacutesultats EGFR et ALK doivent ecirctre obtenus endeacuteans les 15 j
post arriveacutee du preacutelegravevement au laboratoire de biologie moleacuteculaire
(10 jours ouvrables)
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Timing
7 octobre 2014 23
EGFR epidermal growth factor receptor
Courtesy Pr Pauwels UZA
Mutations in exons 18-21 of the EHFR gene coding for the receptorrsquos internal TK domain activate the
receptor independently of extracelular ligand binding and are refferred as laquo activating mutations raquo
7 octobre 2014 24
Type de mateacuteriel
Fixeacute au formol (10) et enrobeacute dans la paraffine (FFEP)
Frais
Fixation agrave lrsquoalcool
PAS de deacutecalcifiant ni Bouin
Cytologie (bloc tissulaire) Histologie
Temps de fixation 6 agrave 48 h
POURCENTAGE EN CELLULES TUMORALES
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
7 octobre 2014 25
Courtesy Dr AL Trepant
7 octobre 2014 26
Avantage de la cytologie possibiliteacute de reacutealiser dans une tumeur
donneacutee des preacutelegravevements seacuterieacutes au cours du temps
But
eacutevaluer lrsquoefficaciteacute de la theacuterapie cibleacutee via la caracteacuterisation
moleacuteculaire
Identifier des laquo genetic shifts raquo drsquoADC mutants au cours du
traitement Tki (T790M)
Cytologie
Jiang SX et al Int J Cancer 2008 Gazdar AFOncogene 2009
Bean J et al Clin Cancer Res 2008
7 octobre 2014 27
Avant les analyses de biologie moleacuteculaire le contenu en cellules
tumorales de lrsquoeacutechantillon doit ecirctre deacutetermineacute afin drsquoeacutevaluer la fiabiliteacute
du reacutesultat
Crucial ratio entre le nombre de cellules malignes par rapport aux
cellules normales
Deacutetermination du pourcentage en cellules tumorales (cellulariteacute)
dissection manuelle (microdissection)
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 28
Un eacutechantillon doit contenir de 200 agrave 400 cellules tumorales
Rarement atteint en routine
50 de cellules tumorales mais des reacutesultats peuvent ecirctre obtenus
avec 10 agrave 20 de cellules tumorales
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 29
bull Le pourcentage moyen de tumeur preacutesent dans les biopsies
bronchiques est drsquoun peu plus que 20 quand un diagnostic de SCC
ou ADC est diagnostiqueacute mais de 10 pour les cas de NSCLC-
NOS
bull Il nrsquoy a pas de tumeur dans 13 agrave frac12 des tissus preacuteleveacutes par
bronchoscopie pour maligniteacute
7 octobre 2014 32
7 octobre 2014 33
Pre-preparation for molecular analysis
Selection of the tumoral zone
Evaluation of of tumoral cells
HampE Unstained
slides
Macro-
dissection
Extraction ADN Dosage ADN
Courtesy M le Mercier PhD
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 15
7 octobre 2014 16
Attention agrave lrsquoeacutepargne tissulaire
7 octobre 2014 17
La meilleure strateacutegie pour prendre en charge des preacutelegravevements de petite taille
pour des cas suspecteacutes de cancer du poumon est baseacute sur des informations
cliniques
Ces informations sont utiles pour le pathologiste pour
1 deacuteterminer les prioriteacutes dans lrsquoapproche diagnostique
2 deacuteterminer si un diagnostic speacutecifique est requis
3preacutevoir les investigations neacutecessaires et anticiper lrsquoutilisation drsquoIHC et des tests
de biologie moleacuteculaires
4 preacutevenir lrsquoutilisation inutile de tissu pour des tests qui ne sont pas requis ou
inteacuteressants eacutetant donneacute la clinique
7 octobre 2014 18
Lrsquohistoire clinique est essentielle pour
envisager si la tumeur pourrait ecirctre
meacutetastatique
Lrsquoexclusion drsquoune origine meacutetastatique
est une perte de temps de tissus et
de ressources du laboratoire
Il ne faut pas faire de laquo reflex testing raquo
pour faire un diagnostic diffeacuterentiel
entre une tumeur primitive et une
meacutetastase sans informations cliniques
pertinentes
7 octobre 2014 19
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
Discordance rare signification clinique incertaine (prob technique ds ganglion)
Le choix doit ecirctre base sur la qualiteacute (richesse tumorale)
7 octobre 2014 20
Un patient preacutesentant de multiples tumeurs primitives
Chaque tumeur doit ecirctre testeacutee
Il ne faut pas par contre tester diffeacuterentes zones drsquoune mecircme tumeur
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
7 octobre 2014 21
Au moment du diagnostic pour les stades IV
Au moment de la progression reacutecidive pour les autres stades
Ou au moment du diagnostic en fonction des deacutecisions locales
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Quel patient
7 octobre 2014 22
Les reacutesultats EGFR et ALK doivent ecirctre obtenus endeacuteans les 15 j
post arriveacutee du preacutelegravevement au laboratoire de biologie moleacuteculaire
(10 jours ouvrables)
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Timing
7 octobre 2014 23
EGFR epidermal growth factor receptor
Courtesy Pr Pauwels UZA
Mutations in exons 18-21 of the EHFR gene coding for the receptorrsquos internal TK domain activate the
receptor independently of extracelular ligand binding and are refferred as laquo activating mutations raquo
7 octobre 2014 24
Type de mateacuteriel
Fixeacute au formol (10) et enrobeacute dans la paraffine (FFEP)
Frais
Fixation agrave lrsquoalcool
PAS de deacutecalcifiant ni Bouin
Cytologie (bloc tissulaire) Histologie
Temps de fixation 6 agrave 48 h
POURCENTAGE EN CELLULES TUMORALES
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
7 octobre 2014 25
Courtesy Dr AL Trepant
7 octobre 2014 26
Avantage de la cytologie possibiliteacute de reacutealiser dans une tumeur
donneacutee des preacutelegravevements seacuterieacutes au cours du temps
But
eacutevaluer lrsquoefficaciteacute de la theacuterapie cibleacutee via la caracteacuterisation
moleacuteculaire
Identifier des laquo genetic shifts raquo drsquoADC mutants au cours du
traitement Tki (T790M)
Cytologie
Jiang SX et al Int J Cancer 2008 Gazdar AFOncogene 2009
Bean J et al Clin Cancer Res 2008
7 octobre 2014 27
Avant les analyses de biologie moleacuteculaire le contenu en cellules
tumorales de lrsquoeacutechantillon doit ecirctre deacutetermineacute afin drsquoeacutevaluer la fiabiliteacute
du reacutesultat
Crucial ratio entre le nombre de cellules malignes par rapport aux
cellules normales
Deacutetermination du pourcentage en cellules tumorales (cellulariteacute)
dissection manuelle (microdissection)
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 28
Un eacutechantillon doit contenir de 200 agrave 400 cellules tumorales
Rarement atteint en routine
50 de cellules tumorales mais des reacutesultats peuvent ecirctre obtenus
avec 10 agrave 20 de cellules tumorales
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 29
bull Le pourcentage moyen de tumeur preacutesent dans les biopsies
bronchiques est drsquoun peu plus que 20 quand un diagnostic de SCC
ou ADC est diagnostiqueacute mais de 10 pour les cas de NSCLC-
NOS
bull Il nrsquoy a pas de tumeur dans 13 agrave frac12 des tissus preacuteleveacutes par
bronchoscopie pour maligniteacute
7 octobre 2014 32
7 octobre 2014 33
Pre-preparation for molecular analysis
Selection of the tumoral zone
Evaluation of of tumoral cells
HampE Unstained
slides
Macro-
dissection
Extraction ADN Dosage ADN
Courtesy M le Mercier PhD
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 16
Attention agrave lrsquoeacutepargne tissulaire
7 octobre 2014 17
La meilleure strateacutegie pour prendre en charge des preacutelegravevements de petite taille
pour des cas suspecteacutes de cancer du poumon est baseacute sur des informations
cliniques
Ces informations sont utiles pour le pathologiste pour
1 deacuteterminer les prioriteacutes dans lrsquoapproche diagnostique
2 deacuteterminer si un diagnostic speacutecifique est requis
3preacutevoir les investigations neacutecessaires et anticiper lrsquoutilisation drsquoIHC et des tests
de biologie moleacuteculaires
4 preacutevenir lrsquoutilisation inutile de tissu pour des tests qui ne sont pas requis ou
inteacuteressants eacutetant donneacute la clinique
7 octobre 2014 18
Lrsquohistoire clinique est essentielle pour
envisager si la tumeur pourrait ecirctre
meacutetastatique
Lrsquoexclusion drsquoune origine meacutetastatique
est une perte de temps de tissus et
de ressources du laboratoire
Il ne faut pas faire de laquo reflex testing raquo
pour faire un diagnostic diffeacuterentiel
entre une tumeur primitive et une
meacutetastase sans informations cliniques
pertinentes
7 octobre 2014 19
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
Discordance rare signification clinique incertaine (prob technique ds ganglion)
Le choix doit ecirctre base sur la qualiteacute (richesse tumorale)
7 octobre 2014 20
Un patient preacutesentant de multiples tumeurs primitives
Chaque tumeur doit ecirctre testeacutee
Il ne faut pas par contre tester diffeacuterentes zones drsquoune mecircme tumeur
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
7 octobre 2014 21
Au moment du diagnostic pour les stades IV
Au moment de la progression reacutecidive pour les autres stades
Ou au moment du diagnostic en fonction des deacutecisions locales
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Quel patient
7 octobre 2014 22
Les reacutesultats EGFR et ALK doivent ecirctre obtenus endeacuteans les 15 j
post arriveacutee du preacutelegravevement au laboratoire de biologie moleacuteculaire
(10 jours ouvrables)
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Timing
7 octobre 2014 23
EGFR epidermal growth factor receptor
Courtesy Pr Pauwels UZA
Mutations in exons 18-21 of the EHFR gene coding for the receptorrsquos internal TK domain activate the
receptor independently of extracelular ligand binding and are refferred as laquo activating mutations raquo
7 octobre 2014 24
Type de mateacuteriel
Fixeacute au formol (10) et enrobeacute dans la paraffine (FFEP)
Frais
Fixation agrave lrsquoalcool
PAS de deacutecalcifiant ni Bouin
Cytologie (bloc tissulaire) Histologie
Temps de fixation 6 agrave 48 h
POURCENTAGE EN CELLULES TUMORALES
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
7 octobre 2014 25
Courtesy Dr AL Trepant
7 octobre 2014 26
Avantage de la cytologie possibiliteacute de reacutealiser dans une tumeur
donneacutee des preacutelegravevements seacuterieacutes au cours du temps
But
eacutevaluer lrsquoefficaciteacute de la theacuterapie cibleacutee via la caracteacuterisation
moleacuteculaire
Identifier des laquo genetic shifts raquo drsquoADC mutants au cours du
traitement Tki (T790M)
Cytologie
Jiang SX et al Int J Cancer 2008 Gazdar AFOncogene 2009
Bean J et al Clin Cancer Res 2008
7 octobre 2014 27
Avant les analyses de biologie moleacuteculaire le contenu en cellules
tumorales de lrsquoeacutechantillon doit ecirctre deacutetermineacute afin drsquoeacutevaluer la fiabiliteacute
du reacutesultat
Crucial ratio entre le nombre de cellules malignes par rapport aux
cellules normales
Deacutetermination du pourcentage en cellules tumorales (cellulariteacute)
dissection manuelle (microdissection)
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 28
Un eacutechantillon doit contenir de 200 agrave 400 cellules tumorales
Rarement atteint en routine
50 de cellules tumorales mais des reacutesultats peuvent ecirctre obtenus
avec 10 agrave 20 de cellules tumorales
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 29
bull Le pourcentage moyen de tumeur preacutesent dans les biopsies
bronchiques est drsquoun peu plus que 20 quand un diagnostic de SCC
ou ADC est diagnostiqueacute mais de 10 pour les cas de NSCLC-
NOS
bull Il nrsquoy a pas de tumeur dans 13 agrave frac12 des tissus preacuteleveacutes par
bronchoscopie pour maligniteacute
7 octobre 2014 32
7 octobre 2014 33
Pre-preparation for molecular analysis
Selection of the tumoral zone
Evaluation of of tumoral cells
HampE Unstained
slides
Macro-
dissection
Extraction ADN Dosage ADN
Courtesy M le Mercier PhD
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 17
La meilleure strateacutegie pour prendre en charge des preacutelegravevements de petite taille
pour des cas suspecteacutes de cancer du poumon est baseacute sur des informations
cliniques
Ces informations sont utiles pour le pathologiste pour
1 deacuteterminer les prioriteacutes dans lrsquoapproche diagnostique
2 deacuteterminer si un diagnostic speacutecifique est requis
3preacutevoir les investigations neacutecessaires et anticiper lrsquoutilisation drsquoIHC et des tests
de biologie moleacuteculaires
4 preacutevenir lrsquoutilisation inutile de tissu pour des tests qui ne sont pas requis ou
inteacuteressants eacutetant donneacute la clinique
7 octobre 2014 18
Lrsquohistoire clinique est essentielle pour
envisager si la tumeur pourrait ecirctre
meacutetastatique
Lrsquoexclusion drsquoune origine meacutetastatique
est une perte de temps de tissus et
de ressources du laboratoire
Il ne faut pas faire de laquo reflex testing raquo
pour faire un diagnostic diffeacuterentiel
entre une tumeur primitive et une
meacutetastase sans informations cliniques
pertinentes
7 octobre 2014 19
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
Discordance rare signification clinique incertaine (prob technique ds ganglion)
Le choix doit ecirctre base sur la qualiteacute (richesse tumorale)
7 octobre 2014 20
Un patient preacutesentant de multiples tumeurs primitives
Chaque tumeur doit ecirctre testeacutee
Il ne faut pas par contre tester diffeacuterentes zones drsquoune mecircme tumeur
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
7 octobre 2014 21
Au moment du diagnostic pour les stades IV
Au moment de la progression reacutecidive pour les autres stades
Ou au moment du diagnostic en fonction des deacutecisions locales
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Quel patient
7 octobre 2014 22
Les reacutesultats EGFR et ALK doivent ecirctre obtenus endeacuteans les 15 j
post arriveacutee du preacutelegravevement au laboratoire de biologie moleacuteculaire
(10 jours ouvrables)
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Timing
7 octobre 2014 23
EGFR epidermal growth factor receptor
Courtesy Pr Pauwels UZA
Mutations in exons 18-21 of the EHFR gene coding for the receptorrsquos internal TK domain activate the
receptor independently of extracelular ligand binding and are refferred as laquo activating mutations raquo
7 octobre 2014 24
Type de mateacuteriel
Fixeacute au formol (10) et enrobeacute dans la paraffine (FFEP)
Frais
Fixation agrave lrsquoalcool
PAS de deacutecalcifiant ni Bouin
Cytologie (bloc tissulaire) Histologie
Temps de fixation 6 agrave 48 h
POURCENTAGE EN CELLULES TUMORALES
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
7 octobre 2014 25
Courtesy Dr AL Trepant
7 octobre 2014 26
Avantage de la cytologie possibiliteacute de reacutealiser dans une tumeur
donneacutee des preacutelegravevements seacuterieacutes au cours du temps
But
eacutevaluer lrsquoefficaciteacute de la theacuterapie cibleacutee via la caracteacuterisation
moleacuteculaire
Identifier des laquo genetic shifts raquo drsquoADC mutants au cours du
traitement Tki (T790M)
Cytologie
Jiang SX et al Int J Cancer 2008 Gazdar AFOncogene 2009
Bean J et al Clin Cancer Res 2008
7 octobre 2014 27
Avant les analyses de biologie moleacuteculaire le contenu en cellules
tumorales de lrsquoeacutechantillon doit ecirctre deacutetermineacute afin drsquoeacutevaluer la fiabiliteacute
du reacutesultat
Crucial ratio entre le nombre de cellules malignes par rapport aux
cellules normales
Deacutetermination du pourcentage en cellules tumorales (cellulariteacute)
dissection manuelle (microdissection)
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 28
Un eacutechantillon doit contenir de 200 agrave 400 cellules tumorales
Rarement atteint en routine
50 de cellules tumorales mais des reacutesultats peuvent ecirctre obtenus
avec 10 agrave 20 de cellules tumorales
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 29
bull Le pourcentage moyen de tumeur preacutesent dans les biopsies
bronchiques est drsquoun peu plus que 20 quand un diagnostic de SCC
ou ADC est diagnostiqueacute mais de 10 pour les cas de NSCLC-
NOS
bull Il nrsquoy a pas de tumeur dans 13 agrave frac12 des tissus preacuteleveacutes par
bronchoscopie pour maligniteacute
7 octobre 2014 32
7 octobre 2014 33
Pre-preparation for molecular analysis
Selection of the tumoral zone
Evaluation of of tumoral cells
HampE Unstained
slides
Macro-
dissection
Extraction ADN Dosage ADN
Courtesy M le Mercier PhD
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 18
Lrsquohistoire clinique est essentielle pour
envisager si la tumeur pourrait ecirctre
meacutetastatique
Lrsquoexclusion drsquoune origine meacutetastatique
est une perte de temps de tissus et
de ressources du laboratoire
Il ne faut pas faire de laquo reflex testing raquo
pour faire un diagnostic diffeacuterentiel
entre une tumeur primitive et une
meacutetastase sans informations cliniques
pertinentes
7 octobre 2014 19
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
Discordance rare signification clinique incertaine (prob technique ds ganglion)
Le choix doit ecirctre base sur la qualiteacute (richesse tumorale)
7 octobre 2014 20
Un patient preacutesentant de multiples tumeurs primitives
Chaque tumeur doit ecirctre testeacutee
Il ne faut pas par contre tester diffeacuterentes zones drsquoune mecircme tumeur
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
7 octobre 2014 21
Au moment du diagnostic pour les stades IV
Au moment de la progression reacutecidive pour les autres stades
Ou au moment du diagnostic en fonction des deacutecisions locales
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Quel patient
7 octobre 2014 22
Les reacutesultats EGFR et ALK doivent ecirctre obtenus endeacuteans les 15 j
post arriveacutee du preacutelegravevement au laboratoire de biologie moleacuteculaire
(10 jours ouvrables)
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Timing
7 octobre 2014 23
EGFR epidermal growth factor receptor
Courtesy Pr Pauwels UZA
Mutations in exons 18-21 of the EHFR gene coding for the receptorrsquos internal TK domain activate the
receptor independently of extracelular ligand binding and are refferred as laquo activating mutations raquo
7 octobre 2014 24
Type de mateacuteriel
Fixeacute au formol (10) et enrobeacute dans la paraffine (FFEP)
Frais
Fixation agrave lrsquoalcool
PAS de deacutecalcifiant ni Bouin
Cytologie (bloc tissulaire) Histologie
Temps de fixation 6 agrave 48 h
POURCENTAGE EN CELLULES TUMORALES
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
7 octobre 2014 25
Courtesy Dr AL Trepant
7 octobre 2014 26
Avantage de la cytologie possibiliteacute de reacutealiser dans une tumeur
donneacutee des preacutelegravevements seacuterieacutes au cours du temps
But
eacutevaluer lrsquoefficaciteacute de la theacuterapie cibleacutee via la caracteacuterisation
moleacuteculaire
Identifier des laquo genetic shifts raquo drsquoADC mutants au cours du
traitement Tki (T790M)
Cytologie
Jiang SX et al Int J Cancer 2008 Gazdar AFOncogene 2009
Bean J et al Clin Cancer Res 2008
7 octobre 2014 27
Avant les analyses de biologie moleacuteculaire le contenu en cellules
tumorales de lrsquoeacutechantillon doit ecirctre deacutetermineacute afin drsquoeacutevaluer la fiabiliteacute
du reacutesultat
Crucial ratio entre le nombre de cellules malignes par rapport aux
cellules normales
Deacutetermination du pourcentage en cellules tumorales (cellulariteacute)
dissection manuelle (microdissection)
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 28
Un eacutechantillon doit contenir de 200 agrave 400 cellules tumorales
Rarement atteint en routine
50 de cellules tumorales mais des reacutesultats peuvent ecirctre obtenus
avec 10 agrave 20 de cellules tumorales
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 29
bull Le pourcentage moyen de tumeur preacutesent dans les biopsies
bronchiques est drsquoun peu plus que 20 quand un diagnostic de SCC
ou ADC est diagnostiqueacute mais de 10 pour les cas de NSCLC-
NOS
bull Il nrsquoy a pas de tumeur dans 13 agrave frac12 des tissus preacuteleveacutes par
bronchoscopie pour maligniteacute
7 octobre 2014 32
7 octobre 2014 33
Pre-preparation for molecular analysis
Selection of the tumoral zone
Evaluation of of tumoral cells
HampE Unstained
slides
Macro-
dissection
Extraction ADN Dosage ADN
Courtesy M le Mercier PhD
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 19
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
Discordance rare signification clinique incertaine (prob technique ds ganglion)
Le choix doit ecirctre base sur la qualiteacute (richesse tumorale)
7 octobre 2014 20
Un patient preacutesentant de multiples tumeurs primitives
Chaque tumeur doit ecirctre testeacutee
Il ne faut pas par contre tester diffeacuterentes zones drsquoune mecircme tumeur
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
7 octobre 2014 21
Au moment du diagnostic pour les stades IV
Au moment de la progression reacutecidive pour les autres stades
Ou au moment du diagnostic en fonction des deacutecisions locales
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Quel patient
7 octobre 2014 22
Les reacutesultats EGFR et ALK doivent ecirctre obtenus endeacuteans les 15 j
post arriveacutee du preacutelegravevement au laboratoire de biologie moleacuteculaire
(10 jours ouvrables)
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Timing
7 octobre 2014 23
EGFR epidermal growth factor receptor
Courtesy Pr Pauwels UZA
Mutations in exons 18-21 of the EHFR gene coding for the receptorrsquos internal TK domain activate the
receptor independently of extracelular ligand binding and are refferred as laquo activating mutations raquo
7 octobre 2014 24
Type de mateacuteriel
Fixeacute au formol (10) et enrobeacute dans la paraffine (FFEP)
Frais
Fixation agrave lrsquoalcool
PAS de deacutecalcifiant ni Bouin
Cytologie (bloc tissulaire) Histologie
Temps de fixation 6 agrave 48 h
POURCENTAGE EN CELLULES TUMORALES
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
7 octobre 2014 25
Courtesy Dr AL Trepant
7 octobre 2014 26
Avantage de la cytologie possibiliteacute de reacutealiser dans une tumeur
donneacutee des preacutelegravevements seacuterieacutes au cours du temps
But
eacutevaluer lrsquoefficaciteacute de la theacuterapie cibleacutee via la caracteacuterisation
moleacuteculaire
Identifier des laquo genetic shifts raquo drsquoADC mutants au cours du
traitement Tki (T790M)
Cytologie
Jiang SX et al Int J Cancer 2008 Gazdar AFOncogene 2009
Bean J et al Clin Cancer Res 2008
7 octobre 2014 27
Avant les analyses de biologie moleacuteculaire le contenu en cellules
tumorales de lrsquoeacutechantillon doit ecirctre deacutetermineacute afin drsquoeacutevaluer la fiabiliteacute
du reacutesultat
Crucial ratio entre le nombre de cellules malignes par rapport aux
cellules normales
Deacutetermination du pourcentage en cellules tumorales (cellulariteacute)
dissection manuelle (microdissection)
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 28
Un eacutechantillon doit contenir de 200 agrave 400 cellules tumorales
Rarement atteint en routine
50 de cellules tumorales mais des reacutesultats peuvent ecirctre obtenus
avec 10 agrave 20 de cellules tumorales
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 29
bull Le pourcentage moyen de tumeur preacutesent dans les biopsies
bronchiques est drsquoun peu plus que 20 quand un diagnostic de SCC
ou ADC est diagnostiqueacute mais de 10 pour les cas de NSCLC-
NOS
bull Il nrsquoy a pas de tumeur dans 13 agrave frac12 des tissus preacuteleveacutes par
bronchoscopie pour maligniteacute
7 octobre 2014 32
7 octobre 2014 33
Pre-preparation for molecular analysis
Selection of the tumoral zone
Evaluation of of tumoral cells
HampE Unstained
slides
Macro-
dissection
Extraction ADN Dosage ADN
Courtesy M le Mercier PhD
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 20
Un patient preacutesentant de multiples tumeurs primitives
Chaque tumeur doit ecirctre testeacutee
Il ne faut pas par contre tester diffeacuterentes zones drsquoune mecircme tumeur
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Type de mateacuteriel primitif vs meacutetastase
7 octobre 2014 21
Au moment du diagnostic pour les stades IV
Au moment de la progression reacutecidive pour les autres stades
Ou au moment du diagnostic en fonction des deacutecisions locales
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Quel patient
7 octobre 2014 22
Les reacutesultats EGFR et ALK doivent ecirctre obtenus endeacuteans les 15 j
post arriveacutee du preacutelegravevement au laboratoire de biologie moleacuteculaire
(10 jours ouvrables)
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Timing
7 octobre 2014 23
EGFR epidermal growth factor receptor
Courtesy Pr Pauwels UZA
Mutations in exons 18-21 of the EHFR gene coding for the receptorrsquos internal TK domain activate the
receptor independently of extracelular ligand binding and are refferred as laquo activating mutations raquo
7 octobre 2014 24
Type de mateacuteriel
Fixeacute au formol (10) et enrobeacute dans la paraffine (FFEP)
Frais
Fixation agrave lrsquoalcool
PAS de deacutecalcifiant ni Bouin
Cytologie (bloc tissulaire) Histologie
Temps de fixation 6 agrave 48 h
POURCENTAGE EN CELLULES TUMORALES
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
7 octobre 2014 25
Courtesy Dr AL Trepant
7 octobre 2014 26
Avantage de la cytologie possibiliteacute de reacutealiser dans une tumeur
donneacutee des preacutelegravevements seacuterieacutes au cours du temps
But
eacutevaluer lrsquoefficaciteacute de la theacuterapie cibleacutee via la caracteacuterisation
moleacuteculaire
Identifier des laquo genetic shifts raquo drsquoADC mutants au cours du
traitement Tki (T790M)
Cytologie
Jiang SX et al Int J Cancer 2008 Gazdar AFOncogene 2009
Bean J et al Clin Cancer Res 2008
7 octobre 2014 27
Avant les analyses de biologie moleacuteculaire le contenu en cellules
tumorales de lrsquoeacutechantillon doit ecirctre deacutetermineacute afin drsquoeacutevaluer la fiabiliteacute
du reacutesultat
Crucial ratio entre le nombre de cellules malignes par rapport aux
cellules normales
Deacutetermination du pourcentage en cellules tumorales (cellulariteacute)
dissection manuelle (microdissection)
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 28
Un eacutechantillon doit contenir de 200 agrave 400 cellules tumorales
Rarement atteint en routine
50 de cellules tumorales mais des reacutesultats peuvent ecirctre obtenus
avec 10 agrave 20 de cellules tumorales
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 29
bull Le pourcentage moyen de tumeur preacutesent dans les biopsies
bronchiques est drsquoun peu plus que 20 quand un diagnostic de SCC
ou ADC est diagnostiqueacute mais de 10 pour les cas de NSCLC-
NOS
bull Il nrsquoy a pas de tumeur dans 13 agrave frac12 des tissus preacuteleveacutes par
bronchoscopie pour maligniteacute
7 octobre 2014 32
7 octobre 2014 33
Pre-preparation for molecular analysis
Selection of the tumoral zone
Evaluation of of tumoral cells
HampE Unstained
slides
Macro-
dissection
Extraction ADN Dosage ADN
Courtesy M le Mercier PhD
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 21
Au moment du diagnostic pour les stades IV
Au moment de la progression reacutecidive pour les autres stades
Ou au moment du diagnostic en fonction des deacutecisions locales
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Quel patient
7 octobre 2014 22
Les reacutesultats EGFR et ALK doivent ecirctre obtenus endeacuteans les 15 j
post arriveacutee du preacutelegravevement au laboratoire de biologie moleacuteculaire
(10 jours ouvrables)
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Timing
7 octobre 2014 23
EGFR epidermal growth factor receptor
Courtesy Pr Pauwels UZA
Mutations in exons 18-21 of the EHFR gene coding for the receptorrsquos internal TK domain activate the
receptor independently of extracelular ligand binding and are refferred as laquo activating mutations raquo
7 octobre 2014 24
Type de mateacuteriel
Fixeacute au formol (10) et enrobeacute dans la paraffine (FFEP)
Frais
Fixation agrave lrsquoalcool
PAS de deacutecalcifiant ni Bouin
Cytologie (bloc tissulaire) Histologie
Temps de fixation 6 agrave 48 h
POURCENTAGE EN CELLULES TUMORALES
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
7 octobre 2014 25
Courtesy Dr AL Trepant
7 octobre 2014 26
Avantage de la cytologie possibiliteacute de reacutealiser dans une tumeur
donneacutee des preacutelegravevements seacuterieacutes au cours du temps
But
eacutevaluer lrsquoefficaciteacute de la theacuterapie cibleacutee via la caracteacuterisation
moleacuteculaire
Identifier des laquo genetic shifts raquo drsquoADC mutants au cours du
traitement Tki (T790M)
Cytologie
Jiang SX et al Int J Cancer 2008 Gazdar AFOncogene 2009
Bean J et al Clin Cancer Res 2008
7 octobre 2014 27
Avant les analyses de biologie moleacuteculaire le contenu en cellules
tumorales de lrsquoeacutechantillon doit ecirctre deacutetermineacute afin drsquoeacutevaluer la fiabiliteacute
du reacutesultat
Crucial ratio entre le nombre de cellules malignes par rapport aux
cellules normales
Deacutetermination du pourcentage en cellules tumorales (cellulariteacute)
dissection manuelle (microdissection)
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 28
Un eacutechantillon doit contenir de 200 agrave 400 cellules tumorales
Rarement atteint en routine
50 de cellules tumorales mais des reacutesultats peuvent ecirctre obtenus
avec 10 agrave 20 de cellules tumorales
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 29
bull Le pourcentage moyen de tumeur preacutesent dans les biopsies
bronchiques est drsquoun peu plus que 20 quand un diagnostic de SCC
ou ADC est diagnostiqueacute mais de 10 pour les cas de NSCLC-
NOS
bull Il nrsquoy a pas de tumeur dans 13 agrave frac12 des tissus preacuteleveacutes par
bronchoscopie pour maligniteacute
7 octobre 2014 32
7 octobre 2014 33
Pre-preparation for molecular analysis
Selection of the tumoral zone
Evaluation of of tumoral cells
HampE Unstained
slides
Macro-
dissection
Extraction ADN Dosage ADN
Courtesy M le Mercier PhD
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 22
Les reacutesultats EGFR et ALK doivent ecirctre obtenus endeacuteans les 15 j
post arriveacutee du preacutelegravevement au laboratoire de biologie moleacuteculaire
(10 jours ouvrables)
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Timing
7 octobre 2014 23
EGFR epidermal growth factor receptor
Courtesy Pr Pauwels UZA
Mutations in exons 18-21 of the EHFR gene coding for the receptorrsquos internal TK domain activate the
receptor independently of extracelular ligand binding and are refferred as laquo activating mutations raquo
7 octobre 2014 24
Type de mateacuteriel
Fixeacute au formol (10) et enrobeacute dans la paraffine (FFEP)
Frais
Fixation agrave lrsquoalcool
PAS de deacutecalcifiant ni Bouin
Cytologie (bloc tissulaire) Histologie
Temps de fixation 6 agrave 48 h
POURCENTAGE EN CELLULES TUMORALES
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
7 octobre 2014 25
Courtesy Dr AL Trepant
7 octobre 2014 26
Avantage de la cytologie possibiliteacute de reacutealiser dans une tumeur
donneacutee des preacutelegravevements seacuterieacutes au cours du temps
But
eacutevaluer lrsquoefficaciteacute de la theacuterapie cibleacutee via la caracteacuterisation
moleacuteculaire
Identifier des laquo genetic shifts raquo drsquoADC mutants au cours du
traitement Tki (T790M)
Cytologie
Jiang SX et al Int J Cancer 2008 Gazdar AFOncogene 2009
Bean J et al Clin Cancer Res 2008
7 octobre 2014 27
Avant les analyses de biologie moleacuteculaire le contenu en cellules
tumorales de lrsquoeacutechantillon doit ecirctre deacutetermineacute afin drsquoeacutevaluer la fiabiliteacute
du reacutesultat
Crucial ratio entre le nombre de cellules malignes par rapport aux
cellules normales
Deacutetermination du pourcentage en cellules tumorales (cellulariteacute)
dissection manuelle (microdissection)
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 28
Un eacutechantillon doit contenir de 200 agrave 400 cellules tumorales
Rarement atteint en routine
50 de cellules tumorales mais des reacutesultats peuvent ecirctre obtenus
avec 10 agrave 20 de cellules tumorales
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 29
bull Le pourcentage moyen de tumeur preacutesent dans les biopsies
bronchiques est drsquoun peu plus que 20 quand un diagnostic de SCC
ou ADC est diagnostiqueacute mais de 10 pour les cas de NSCLC-
NOS
bull Il nrsquoy a pas de tumeur dans 13 agrave frac12 des tissus preacuteleveacutes par
bronchoscopie pour maligniteacute
7 octobre 2014 32
7 octobre 2014 33
Pre-preparation for molecular analysis
Selection of the tumoral zone
Evaluation of of tumoral cells
HampE Unstained
slides
Macro-
dissection
Extraction ADN Dosage ADN
Courtesy M le Mercier PhD
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 23
EGFR epidermal growth factor receptor
Courtesy Pr Pauwels UZA
Mutations in exons 18-21 of the EHFR gene coding for the receptorrsquos internal TK domain activate the
receptor independently of extracelular ligand binding and are refferred as laquo activating mutations raquo
7 octobre 2014 24
Type de mateacuteriel
Fixeacute au formol (10) et enrobeacute dans la paraffine (FFEP)
Frais
Fixation agrave lrsquoalcool
PAS de deacutecalcifiant ni Bouin
Cytologie (bloc tissulaire) Histologie
Temps de fixation 6 agrave 48 h
POURCENTAGE EN CELLULES TUMORALES
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
7 octobre 2014 25
Courtesy Dr AL Trepant
7 octobre 2014 26
Avantage de la cytologie possibiliteacute de reacutealiser dans une tumeur
donneacutee des preacutelegravevements seacuterieacutes au cours du temps
But
eacutevaluer lrsquoefficaciteacute de la theacuterapie cibleacutee via la caracteacuterisation
moleacuteculaire
Identifier des laquo genetic shifts raquo drsquoADC mutants au cours du
traitement Tki (T790M)
Cytologie
Jiang SX et al Int J Cancer 2008 Gazdar AFOncogene 2009
Bean J et al Clin Cancer Res 2008
7 octobre 2014 27
Avant les analyses de biologie moleacuteculaire le contenu en cellules
tumorales de lrsquoeacutechantillon doit ecirctre deacutetermineacute afin drsquoeacutevaluer la fiabiliteacute
du reacutesultat
Crucial ratio entre le nombre de cellules malignes par rapport aux
cellules normales
Deacutetermination du pourcentage en cellules tumorales (cellulariteacute)
dissection manuelle (microdissection)
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 28
Un eacutechantillon doit contenir de 200 agrave 400 cellules tumorales
Rarement atteint en routine
50 de cellules tumorales mais des reacutesultats peuvent ecirctre obtenus
avec 10 agrave 20 de cellules tumorales
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 29
bull Le pourcentage moyen de tumeur preacutesent dans les biopsies
bronchiques est drsquoun peu plus que 20 quand un diagnostic de SCC
ou ADC est diagnostiqueacute mais de 10 pour les cas de NSCLC-
NOS
bull Il nrsquoy a pas de tumeur dans 13 agrave frac12 des tissus preacuteleveacutes par
bronchoscopie pour maligniteacute
7 octobre 2014 32
7 octobre 2014 33
Pre-preparation for molecular analysis
Selection of the tumoral zone
Evaluation of of tumoral cells
HampE Unstained
slides
Macro-
dissection
Extraction ADN Dosage ADN
Courtesy M le Mercier PhD
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 24
Type de mateacuteriel
Fixeacute au formol (10) et enrobeacute dans la paraffine (FFEP)
Frais
Fixation agrave lrsquoalcool
PAS de deacutecalcifiant ni Bouin
Cytologie (bloc tissulaire) Histologie
Temps de fixation 6 agrave 48 h
POURCENTAGE EN CELLULES TUMORALES
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
7 octobre 2014 25
Courtesy Dr AL Trepant
7 octobre 2014 26
Avantage de la cytologie possibiliteacute de reacutealiser dans une tumeur
donneacutee des preacutelegravevements seacuterieacutes au cours du temps
But
eacutevaluer lrsquoefficaciteacute de la theacuterapie cibleacutee via la caracteacuterisation
moleacuteculaire
Identifier des laquo genetic shifts raquo drsquoADC mutants au cours du
traitement Tki (T790M)
Cytologie
Jiang SX et al Int J Cancer 2008 Gazdar AFOncogene 2009
Bean J et al Clin Cancer Res 2008
7 octobre 2014 27
Avant les analyses de biologie moleacuteculaire le contenu en cellules
tumorales de lrsquoeacutechantillon doit ecirctre deacutetermineacute afin drsquoeacutevaluer la fiabiliteacute
du reacutesultat
Crucial ratio entre le nombre de cellules malignes par rapport aux
cellules normales
Deacutetermination du pourcentage en cellules tumorales (cellulariteacute)
dissection manuelle (microdissection)
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 28
Un eacutechantillon doit contenir de 200 agrave 400 cellules tumorales
Rarement atteint en routine
50 de cellules tumorales mais des reacutesultats peuvent ecirctre obtenus
avec 10 agrave 20 de cellules tumorales
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 29
bull Le pourcentage moyen de tumeur preacutesent dans les biopsies
bronchiques est drsquoun peu plus que 20 quand un diagnostic de SCC
ou ADC est diagnostiqueacute mais de 10 pour les cas de NSCLC-
NOS
bull Il nrsquoy a pas de tumeur dans 13 agrave frac12 des tissus preacuteleveacutes par
bronchoscopie pour maligniteacute
7 octobre 2014 32
7 octobre 2014 33
Pre-preparation for molecular analysis
Selection of the tumoral zone
Evaluation of of tumoral cells
HampE Unstained
slides
Macro-
dissection
Extraction ADN Dosage ADN
Courtesy M le Mercier PhD
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 25
Courtesy Dr AL Trepant
7 octobre 2014 26
Avantage de la cytologie possibiliteacute de reacutealiser dans une tumeur
donneacutee des preacutelegravevements seacuterieacutes au cours du temps
But
eacutevaluer lrsquoefficaciteacute de la theacuterapie cibleacutee via la caracteacuterisation
moleacuteculaire
Identifier des laquo genetic shifts raquo drsquoADC mutants au cours du
traitement Tki (T790M)
Cytologie
Jiang SX et al Int J Cancer 2008 Gazdar AFOncogene 2009
Bean J et al Clin Cancer Res 2008
7 octobre 2014 27
Avant les analyses de biologie moleacuteculaire le contenu en cellules
tumorales de lrsquoeacutechantillon doit ecirctre deacutetermineacute afin drsquoeacutevaluer la fiabiliteacute
du reacutesultat
Crucial ratio entre le nombre de cellules malignes par rapport aux
cellules normales
Deacutetermination du pourcentage en cellules tumorales (cellulariteacute)
dissection manuelle (microdissection)
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 28
Un eacutechantillon doit contenir de 200 agrave 400 cellules tumorales
Rarement atteint en routine
50 de cellules tumorales mais des reacutesultats peuvent ecirctre obtenus
avec 10 agrave 20 de cellules tumorales
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 29
bull Le pourcentage moyen de tumeur preacutesent dans les biopsies
bronchiques est drsquoun peu plus que 20 quand un diagnostic de SCC
ou ADC est diagnostiqueacute mais de 10 pour les cas de NSCLC-
NOS
bull Il nrsquoy a pas de tumeur dans 13 agrave frac12 des tissus preacuteleveacutes par
bronchoscopie pour maligniteacute
7 octobre 2014 32
7 octobre 2014 33
Pre-preparation for molecular analysis
Selection of the tumoral zone
Evaluation of of tumoral cells
HampE Unstained
slides
Macro-
dissection
Extraction ADN Dosage ADN
Courtesy M le Mercier PhD
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 26
Avantage de la cytologie possibiliteacute de reacutealiser dans une tumeur
donneacutee des preacutelegravevements seacuterieacutes au cours du temps
But
eacutevaluer lrsquoefficaciteacute de la theacuterapie cibleacutee via la caracteacuterisation
moleacuteculaire
Identifier des laquo genetic shifts raquo drsquoADC mutants au cours du
traitement Tki (T790M)
Cytologie
Jiang SX et al Int J Cancer 2008 Gazdar AFOncogene 2009
Bean J et al Clin Cancer Res 2008
7 octobre 2014 27
Avant les analyses de biologie moleacuteculaire le contenu en cellules
tumorales de lrsquoeacutechantillon doit ecirctre deacutetermineacute afin drsquoeacutevaluer la fiabiliteacute
du reacutesultat
Crucial ratio entre le nombre de cellules malignes par rapport aux
cellules normales
Deacutetermination du pourcentage en cellules tumorales (cellulariteacute)
dissection manuelle (microdissection)
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 28
Un eacutechantillon doit contenir de 200 agrave 400 cellules tumorales
Rarement atteint en routine
50 de cellules tumorales mais des reacutesultats peuvent ecirctre obtenus
avec 10 agrave 20 de cellules tumorales
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 29
bull Le pourcentage moyen de tumeur preacutesent dans les biopsies
bronchiques est drsquoun peu plus que 20 quand un diagnostic de SCC
ou ADC est diagnostiqueacute mais de 10 pour les cas de NSCLC-
NOS
bull Il nrsquoy a pas de tumeur dans 13 agrave frac12 des tissus preacuteleveacutes par
bronchoscopie pour maligniteacute
7 octobre 2014 32
7 octobre 2014 33
Pre-preparation for molecular analysis
Selection of the tumoral zone
Evaluation of of tumoral cells
HampE Unstained
slides
Macro-
dissection
Extraction ADN Dosage ADN
Courtesy M le Mercier PhD
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 27
Avant les analyses de biologie moleacuteculaire le contenu en cellules
tumorales de lrsquoeacutechantillon doit ecirctre deacutetermineacute afin drsquoeacutevaluer la fiabiliteacute
du reacutesultat
Crucial ratio entre le nombre de cellules malignes par rapport aux
cellules normales
Deacutetermination du pourcentage en cellules tumorales (cellulariteacute)
dissection manuelle (microdissection)
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 28
Un eacutechantillon doit contenir de 200 agrave 400 cellules tumorales
Rarement atteint en routine
50 de cellules tumorales mais des reacutesultats peuvent ecirctre obtenus
avec 10 agrave 20 de cellules tumorales
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 29
bull Le pourcentage moyen de tumeur preacutesent dans les biopsies
bronchiques est drsquoun peu plus que 20 quand un diagnostic de SCC
ou ADC est diagnostiqueacute mais de 10 pour les cas de NSCLC-
NOS
bull Il nrsquoy a pas de tumeur dans 13 agrave frac12 des tissus preacuteleveacutes par
bronchoscopie pour maligniteacute
7 octobre 2014 32
7 octobre 2014 33
Pre-preparation for molecular analysis
Selection of the tumoral zone
Evaluation of of tumoral cells
HampE Unstained
slides
Macro-
dissection
Extraction ADN Dosage ADN
Courtesy M le Mercier PhD
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 28
Un eacutechantillon doit contenir de 200 agrave 400 cellules tumorales
Rarement atteint en routine
50 de cellules tumorales mais des reacutesultats peuvent ecirctre obtenus
avec 10 agrave 20 de cellules tumorales
Pirker R et al J Thorac Oncol 2010
7 octobre 2014 29
bull Le pourcentage moyen de tumeur preacutesent dans les biopsies
bronchiques est drsquoun peu plus que 20 quand un diagnostic de SCC
ou ADC est diagnostiqueacute mais de 10 pour les cas de NSCLC-
NOS
bull Il nrsquoy a pas de tumeur dans 13 agrave frac12 des tissus preacuteleveacutes par
bronchoscopie pour maligniteacute
7 octobre 2014 32
7 octobre 2014 33
Pre-preparation for molecular analysis
Selection of the tumoral zone
Evaluation of of tumoral cells
HampE Unstained
slides
Macro-
dissection
Extraction ADN Dosage ADN
Courtesy M le Mercier PhD
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 29
bull Le pourcentage moyen de tumeur preacutesent dans les biopsies
bronchiques est drsquoun peu plus que 20 quand un diagnostic de SCC
ou ADC est diagnostiqueacute mais de 10 pour les cas de NSCLC-
NOS
bull Il nrsquoy a pas de tumeur dans 13 agrave frac12 des tissus preacuteleveacutes par
bronchoscopie pour maligniteacute
7 octobre 2014 32
7 octobre 2014 33
Pre-preparation for molecular analysis
Selection of the tumoral zone
Evaluation of of tumoral cells
HampE Unstained
slides
Macro-
dissection
Extraction ADN Dosage ADN
Courtesy M le Mercier PhD
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 32
7 octobre 2014 33
Pre-preparation for molecular analysis
Selection of the tumoral zone
Evaluation of of tumoral cells
HampE Unstained
slides
Macro-
dissection
Extraction ADN Dosage ADN
Courtesy M le Mercier PhD
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 33
Pre-preparation for molecular analysis
Selection of the tumoral zone
Evaluation of of tumoral cells
HampE Unstained
slides
Macro-
dissection
Extraction ADN Dosage ADN
Courtesy M le Mercier PhD
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 34
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test EGFR
Deacutetection dans des eacutechantillons avec au moins 50 de cellules tumorales Controcircles interlaboratoires Pas drsquoIHC Pas FISH
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
NEXT GENERATION SEQUENCING
Simultaneous sequencing of millions of short DNA
sequences 1 run =gt 1 chip
50 genes for 16 samples
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
Tests de deacutetection du reacutearrangement de ALK
Immunohistochimie
Fluorescence in situ (FISH)
Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
FISH Principe
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
Signal pattern Vysis ALK
Break Apart FISH Kit
Les 2 sondes sont proches
sur le gegravene ALK
Si translocation les 2 sondes
sont seacutepareacutees et distantes
Si deletion de 5rsquo de ALK un
signal orange seul
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
Une inversion du bras court
du chromosome 2 produit une
fusion du gegravene ALK et du
gegravene EML4
Ce reacutearrangement produit une
proteacuteine avec une activiteacute
kinase activatrice constitutive
Il y a une dizaine de variants
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
bull Translocation si
ndash gt15 des cellules tumorales (50 cellules) avec split pattern
orange et vert seacutepareacutes gt 2 diamegravetre des signaux
bull Narrow split signal peuvent ecirctre vus en lrsquoabsence de
reacutearrangement de ALK
ndash Perte signaux verts (donneacutees limiteacutees quant au cuttoff agrave
deacuteterminer selon les laboratoires) (hellip) selon les eacutetudes cutoffs
de 15
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014
Deacutetection reacutearrangement ALK FISH
Normal
Reacutearrangement
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
Exemples de FISH ALK
pas de reacutearrangement reacutearrangement
Lindeman et al J Mol Diagn 2013
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
Test valideacute cliniquement
VysisAbbott ALK FISH break apart
scoring par 2 personnes avec un training dans lrsquoanalyse FISH dans les
tumeurs solides et guideacutees par un pathologistes avec un training en
FISH
Positif gt25 de cellules positives
Neacutegatif lt10
Entre les deux deuxiegraveme lecture il faut en moyenne 15 de cellules
positives
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
Interpreacutetation difficile
1 La fusion- inversion se passe sur le mecircme chromosome
2 Dans certains noyaux wild type on peut avoir une seacuteparation
discregravete des signaux rouge et vert
3 Faux positif lors de la coupe
Il faut un entrainement speacutecifique et de lrsquoexpeacuterience pour une
interpreacutetation correcte ( cette technique doit ecirctre effectueacutee par un
nombre limiteacute de personnes au sein du laboratoire afin drsquoeacuteviter des
eacutecarts drsquointerpreacutetation)
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 46
Immunohistochimie(IHC)
Le but est la deacutetection de proteacuteines
Celle-ci est deacutetecteacutee par une reacuteaction colorimeacutetrique via un anticorps
httpwwwhistalimcompagesenimmunohistochemistryphp
Courtesy Dr AL Trepant
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
Immunohistochimie
Interviendrait pour le screening
Mise en eacutevidence de la tyrosine kinase qui est la cible du crizotinib
Avantages
Peu couteux
Rapide
Facilement inteacutegreacute dans un compte rendu
Commun agrave tous les laboratoires drsquoanatomie pathologique
Difficulteacutes
Preacuteparation du tissu
Choix de lrsquoanticorps
Systegraveme de scoring
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
Immunohistochimie
Phase analytique
La concentration en proteacuteine ALK est basse
3 anticorps publieacutes
Attention diffeacuterent que celui utiliseacute pour les lymphomes
Clone 5A4 (Novocastra 125)
ALK1 (Dako)
D5F3 (Cell Signalling Technology)
Haute VPN haute VPP Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
Immunohistochimie
Tuononen K et al Biomed Res Int 2013
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
Immunohistochi
mie
Tregraves bonne concordance entre FISH et IHC Takeuchi K et al(2009) Clin Cancer Res Rodig SJ et al(2009) Clin Cancer Res Yang P et al 2012) J Thorac Oncol
Boland JM et al (2009) Hum Pathol Hofman P et al (2011) Ann Oncol Yi ES et lal(2011) J Thorac Oncol
Paik JH et al(2011) J Thorac Oncol McLeer-Florin A et al (2012) J Thorac Oncol Mino-Kenudson M et
al(2010)
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 52
Autres
Her2 PCR Trastuzumab
Afanitb
BRAF PCR Vemurafinib
RET FISH Vandenatib
ROS 1 FISH IHC Crizotinib
DDR2 (scc) seacutequenccedilage
KRAS PCR Contre
utilisation TKI
PIK3CA PCR
FGFR1(scc) FISH
MET IHC QPCR
wwwmycancergenomeorg
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 53
Conclusions
Tout adeacutenocarcinome mecircme si une limiteacute agrave une
composante
Autre histologie si jeune non fumeur et mateacuteriel limiteacute
CytoHisto
Meacutetaprimitif
Stade IV progression (autres agrave discuter en local)
EGFR (PCR)
Si wild type IHC ALK
Si positif FISH
Equipe pluridisciplinaire
7 octobre 2014 54
MERCI
7 octobre 2014 54
MERCI