les mutations du promoteur de tert sont des … · immunohistochimie . biologie moléculaire ....

Dr Jean-Charles Nault Inserm U1162, Dir: Pr Jessica Zucman-Rossi

Service d’hépatologie, Hôpital Jean Verdier

Les mutations du promoteur de TERT sont des altérations génétiques précoces de la

transformation maligne des nodules cirrhotiques en carcinome hépatocellulaire

Pas de conflits d’intérêt

Carcinome hépatocellulaire

Nodule dysplasique bas

grade

Nodule dysplasique haut grade

Cirrhose

90%

Progression tumorale

TP53 CTNNB1

Facteurs de risque Hépatite B et C

Alcool Obesité

Aflatoxine B1 Hémochromatose

Foie non-cirrhotique

10%

Hétérogénéité des facteurs de risque

à travers le monde

Accumulation d’altérations génétiques et épigénétiques

Sénescence réplicative Stress oxydatif Réactivation de la télomérase

Nault et al. Seminars in liver disease 2011

40 39 38 1 2 3 ……. …….

Présentateur

Commentaires de présentation

Most of the times, hepatocellular carcinoma arise on cirrhosis through a multistep process of carcinogenesis and accumulation of epigenetic and genetic defects. In less than 10 % of the cases HCC could also arise on non cirrhotic liver.



grade


Cirrhose

90%


TP53 CTNNB1

Facteurs de risque Hépatite B et C

Alcool Obesité

Aflatoxine B1 Hémochromatose


10%

Hétérogénéité des facteurs de risque

à travers le monde




40 39 38 1 2 3 ……. …….

Identification d’altérations génétiques dans le CHC

Présentateur



Voies de signalisation identifiées par le séquençage haut débit dans le CHC

WNT/β-Catenin P53 & Cell cycle

Chromatin remodeling PI3K/Ras Oxydative stress

Fréquence des altérations génétiques

49% 29% 25% 13% 7-8%

Guichard, Amaddeo, Imbeaud et al, Nature Genetics, 2012

Présentateur


Recently, in our lab, using next generation sequencing, we have drawn the genetic landscape of hepatocellular carcinoma with several pathway involved in liver carcinogenesis as: Wnt/Bcatenine, TP53 and cell cycle gene, chromatine remodelling, ras/ras/map kinase ad oxydative stress pathway.

WNT/β-Catenin P53 & Cell cycle

Chromatin remodeling PI3K/Ras Oxydative stress

Frequency of the pathway alteration

49% 29% 25% 13% 7-8%

Guichard, Amaddeo, Imbeaud et al, Nature Genetics, 2012 Nault JC, et al. Nature communications 2013

59%

TERT prom 59%

Telomere maintenance

Les mutations dans le promoteur de TERT sont les altérations génétiques somatiques

les plus fréquente du CHC

Présentateur


Recently, we also identified TERT promotmutation as the most frequent somatic genetics alterations in HCC with an overall frequencies of 59%.

TERT gene TERT core promoter

ATG Transcription

start -100 pb -200 bp

G>A 6 %

Distribution des mutations 93 % 1 %

G>A G>T

Sequence of reference -GGGAGGGCCCAGGGGGCCGGGTCGGGGGAGGCCC- -146 bp -124 bp

Mutations somatiques dans 59% des CHC

Les mutations du promoteur de TERT sont exclusives

Nault et al. Nature Communications 2013

2 hot spots

Les mutations dans le promoteur de TERT sont les altérations génétiques somatiques les plus fréquente du CHC

Présentateur


TERT promoter mutations were located at two hot spot situated 124 pair bases and 146 pair bases before the ATG start with mostof mutations occuring at the 124 pair bases hot spot..

TERT

TERC

Complexe télomérase

RNA template

Catalytic enzyme

Augmentation de l’activité télomérase

TERT promoter TERT gene

Synthèse des télomères

Prolifération, survie Echappement à la sénescence réplicative

Augmentation de l’activité de la télomérase secondaire aux mutations dans son promoteur

Augmentation de l’activité du promoteur

TERT mRNA

Mutation (substitution)

Calado R, et al. NEJM 2009 Huang FW, et al. Science 2013

TCF

TCF Création d’une séquence consensus Ets/TCF

Présentateur


These mutations created a ETS/TCF binding sequence that lead to an increase promoter activity and, consequently, an increase TERT expression. As TERT is the limiting factor of the telomerase complex, TERT overexpression increase telomerase activity and lead to telomere synthesis. It helps the tumor cells to escape the replicative senescence observed in cirrhotic hepatocytes and promotes proliferation and survival.



grade


Cirrhose

90%


TP53 CTNNB1


10%




40 39 38 1 2 3 ……. …….

Carcinogénèse hépatique: un processus multi-étapes Génétique des lésions prénéoplasiques

et de la transformation maligne

Présentateur



CHC « précoce »

Nodule dysplasique de bas grade

Nodule dysplasique de

haut grade Cirrhose

90%

CHC « avancé »

< 2 cm


Senescence réplicative Stress oxydatif Réactivation de la télomérase

CHC > 2 cm Métastase Thrombose

porte

CHC < 2 cm BCLC 0 CHC BCLC A to C

Transformation maligne Initiation Progression tumorale Carcinogenic field effect

International Consensus Group For Hepatocellular Neoplasia Hepatology 2008

40 39 38 1 2 3 ……. …….

Carcinogénèse hépatique: un processus multi-étapes

Présentateur


In cirrhotic liver, the international consensus group for hepatocellular neoplasia has precised the different steps of carcinogenesis: low grade dysplastic nodules, thus high grade dysplastic nodules, thus among HCC of less than 2 cm classfied BCLC 0 the early HCC and next the small and progressed HCC. Finally tumor progression lead to increase of size, tumor portal thrombosis and metastasis in HCC classified BCLC A to C.

CHC « précoce »



haut grade Cirrhose

90%

CHC « avancé »

< 2 cm


porte




Difficulté diagnostique

Histologie Immunohistochimie Biologie moléculaire

Glypican 3 Glutamine synthase

Heat shock protein 70

Combinaison de 3 gènes (RT-PCR quantitative)

LYVE-1, GPC3 et SURVIVIN

Diagnostic de CHC « précoce »

Au moins 2 marqueurs positifs: Spécificité 100% sensibilité 33 à 72%

Invasion stromale Densité cellulaire, atypie nucléaire, artère isolée….

International Consensus Group Hepatology 2008 Di tomaso L Hepatology 2007 Llovet J, et al. Gastroenterology 2006

Présentateur



CHC « précoce »



haut grade Cirrhose

90%

CHC « avancé »

< 2 cm



porte



40 39 38 1 2 3 ……. …….


Nault et al. Nature Communications 2013

Mutations du promoteur de TERT dans 20% des nodules dysplasiques mais nombre

limité de cas (n=20)

Présentateur



But

• Décrire la fréquence des mutations du promoteur de TERT dans les nodules dysplasiques (bas grade et haut grade) sur cirrhose et dans la transformation maligne (en CHC précoce/early HCC)

• En utilisant une série de nodules développés sur cirrhose bien caractérisés au niveau histologique et immunohistochimique par un panel de 6 anatomopathologistes de 3 centres (Bordeaux, Créteil, Milan)

Présentateur


In this study, we aim to describe the frequencies of TERT promoter mutations in premalignant nodules and in transformation in early HCC. We want to use a series of nodules developed on cirrhosis well-characterized at the histological and immunohistochemical levels by a panel of 6 expert pathologists from 3 centers (Bordeaux, Creteil, Milano)

Méthodes • Séquençage du promoteur de TERT dans 96 nodules

cirrhotiques (37 nodules analysés en paraffine et 59 nodules avec tissu congelé) chez 58 patients dans 3 centres (Milan, Bordeaux, Créteil)

• 30 nodules sur 96 ont été séquencés pour 10 gènes impliqués dans la carcinogénèse hépatique (CTNNB1, TP53, AXIN1, ARID1A…..)

• 114 tissus cirrhotiques ont été screenés pour les

mutations dans le promoteur de TERT

Nault JC, Calderaro J, et al. Hepatology 2014 In press

Présentateur


First, we have screened TERT promoter mutations using direct sanger sequening in 96 nodudeles developed on cirrhosis in 58 patients treated in 3 centers (Milano, Bordeaux and Creteil). Among these 96 nodules, 30 have been screened for mutations in 10 cancer genes known as recurently mutated in HCC as CTNN1, TP53 or AXIN1.

Méthodes

Diagnostic à 3 niveaux

Diagnostic final= gold standard

Diagnostic dans le CR anapath

Diagnostic par consensus local entre 2

anatomopathologistes

Diagnostic par consensus final lors d’une séance de

relecture collective parles 6 anatomopathologistes


Présentateur


For assessment of interobserer agreement, diagnosis was recorded at three level: diagnosis from the pathological report, diagnosis from the local reviewing of two pathologists in each center and the diagnosis from the final consensus obtained during a collective reviewing with 6 pathologists.

Méthodes

Séance collective de relecture par 6 anatomopathologistes des 96 nodules Histologie

Invasion stromale Atypie cellulaire

Artère isolée …..

Immunohistochimie

Glypican 3 (GPC3) Glutamine synthase (GS)

Heat Shock protein 70 (HSP70)

Nodules classés dans: Pas de consensus

Nodule dysplasique de bas grade (LGDN) Nodule dysplasique de haut grade (HGDN)

CHC « précoce » (eHCC) CHC avancé < 2 cm (spHCC)


Présentateur


During the collective reviewing, we recorded histological features and the results of immunohistochemistry including glypican 3, glutamine synthase and heat shock protein 70. Nodules were classified in one of these subgroups: no consensus, low grade dysplastic nodules, high grade dyplastic nodule, early HCC and small and progressed HCC

Description des patients

114 cirrhoses supplémentaires 82% d’homme, âge moyen 61 ans

Alcool 40%, Hépatite B 16%, Hépatite C 46%, NASH 4%

58 patients avec 96 nodules développés

sur cirrhose Age 57 (47-70)

Gender (male) 40 (68%) Center Bordeaux 25 (42%)

Center Creteil 15 (26%) Center Milano 18 (32 %)

Resection 18 (31%) Liver transplantation 40 (69%)

Alcohol 26 (44%) Hepatitis B virus 5 (8%) Hepatitis C virus 24 (41%)

Hemochromatosis 2 (3%) NASH 4 (7%)

Primary biliary cirrhosis 1 (0.5%)


Présentateur


This is the description of the patients. Among 58 patients, 68% were male with a mean age of 57 year old;31% of the patients were treated by liver resection and 69 % by liver transplanttion. The etiology of the underlying liver disease was alcohol in 44% of the cases, hepatitis B virus in 8% of the cases and hepatitis C virus in41% of the cases.

Résultats du consensus

CHC avancé < 2 cm

CHC précoce

Nodule dysplasique

de haut grade

Nodule Dysplasique

de bas grade

?

Pas de consensus

n=8 (8%) n=32 (33%) n=16 (17%) n=23 (24%) n=17 (18%)

Exclusion des analyses suivantes

Parmi les 96 nodules


Présentateur


The collective reviewing of 6 expert pathologists have classified the 96 nodules as: LGDN in 32 cases, HGDN in 16 cases, early HCC in 23 cases, small and progressed HCC in 17 cases. In 8 cases, a firm diagnosis was not reached and these cases were excluded of the following analysis

Concordance interobservateur

Pour le diagnostic des nodules dysplasiques (LGDN/HGDN) par rapport aux CHC (précoce

et avancé < 2 cm)

Diagnostic consensus final

(6 anatomopathologistes)

Diagnostic CR anapath

Kappa=0.58 Moyen


Présentateur


The interobserver agreement for the diagnosis of benign versus malignant lesions between the diagnosis from the pathological report and dignosis of the final consenss was moderate with a kappa value of 0.58

Diagnostic Consensus local


Kappa=0.744 Bon


Concordance interobservateur

Pour le diagnostic des nodules dysplasiques (LGDN/HGDN) par rapport aux CHC (précoce

et avancé < 2 cm)

Diagnostic consensus final


Présentateur


In contrast, the interobserver agreement for the diagnosis of benign versus malignant lesions between the diagnosis from the local reviewing by two pathologists and the final consensus was goodwith a kappa value of 0.744

Fréquence des mutations du promoteur de TERT

Mutations somatiques du promoteurs de TERT n=29/96 (30%) 7 en paraffine et 22 en tissu congelé

OR (CI 95%) P value

Formation pseudoglandulaire 9.6 (3.3; 28.1) <0.0001

Artère isolée 3.5 (1.3; 9.6) 0.018

Atypie cellulaire 5.9 (1.6;21.8) 0.006

HSP70 + 5.3 (1.8; 15.6) 0.0023

GPC3 + 3.8 (1.3; 11.5) 0.02


Association avec les mutations dans le promoteur de TERT

Sequence de reference – GCCCGGAGGGGGCTGGGCCGGGGGACCCGGGAGGG-

-CCGGAA-

-146 bp

Ets/TCF binding sequence

Tumeur

Normal

Distribution des mutations dans les

nodules cirrhotiques 87 % 13 %

-124 bp

-CCGGAA-

Pas de mutations du promoteur de TERT dans le tissu cirrhotique adjacent

Présentateur


Among 96 nodules, we identified, both in FFPE aand frozen tissues, 29 TERT promoter mutations for an ovearll frequencies of 30% We did’nt identify any TERT promoter mtations in the corresponding non tumor tissue confirming that these mutations were somatic events. Moreover, TERT promoter mutations were significantly associated with pseudoglandular formation, unpaired arteries, cytological atypia, positive HSP70 staining and positive GPC staining. These results suggests that TERT promoter mutations were associated with histological and immunohistochemical features of malignancies.

TERT promoter mutation

10 cancer genes (CTNNB1, TP53,…)

020406080

6% 19%

61% 42%

64%

Malignant transformation Initiation Tumor progression

0204060

0% 0% 0% 28%

56%

n=13 n=5 n=6 n=7 n=35

n=32 n=16 n=23 n=17 n=94

Carcinogenic field effect

0%

0%

n=172

n=172

0204060

IHC GS

020406080

IHC HSP70

020406080100IHC

GPC3

0%

0%

0% 0% 0%

4% 12% 30% 30%

7% 6% 35%

63%

56% 33%

n=58

n=58

n=58

n=26 n=16 n=23 n=15

n=26 n=16 n=23 n=15

n=26 n=16 n=23 n=15

n=22

59%

72%

n=22

70%

n=22

LGDN HGDN Early HCC

Small and progressed

HCC

HCC BCLC A to C

Cirrhotic liver


Les mutations du promoteur de TERT sont impliquées dans l’initiation tumorale et la transformation

maligne

LGDN: bas grade HGDN: haut grade

Early HCC: CHC précoce

Présentateur


We did’nt identify any TERT promoter mutation in cirrhotic liver. In contrast we identify 6% of TERT promoter mutation in low grade dysplastic nodules and 19% of TERT promoter mutations in high grade dysplastic nodules. The frequencies of TERT promoter mutations dramatically increase in early HCC with 61% and were stable in small and progressed HCC (42%) and in HCC classified BCLC stage A to C (64%). Consequently, TERT promater mutations were involved in tumor initiation and malignant transformation on cirrhosis.



020406080

6% 19%

61% 42%

64%


0204060

0% 0% 0% 28%

56%

n=13 n=5 n=6 n=7 n=35

n=32 n=16 n=23 n=17 n=94


0%

0%

n=172

n=172

0204060

IHC GS

020406080

IHC HSP70

020406080100IHC

GPC3

0%

0%

0% 0% 0%

4% 12% 30% 30%

7% 6% 35%

63%

56% 33%

n=58

n=58

n=58

n=26 n=16 n=23 n=15

n=26 n=16 n=23 n=15

n=26 n=16 n=23 n=15

n=22

59%

72%

n=22

70%

n=22

LGDN HGDN Early HCC


HCC

HCC BCLC A to C

Cirrhotic liver

10 gènes séquencés(CTNNB1, TP53, AXIN1, ARID1A, ARID2, NFE2L2, KEAP1, RPS6KA3, CDKN2A, PIK3CA)


Les mutations dans les autres gènes sont impliquées dans la progression tumorale



Présentateur


Next among the 10 cancers genes, known as mutated in HCC, we did’nt identify any mutation in ciirrhosis, premalignant lesions and early HCC. In contrast, we found mutations in these cancer genes in 28% of small and progressed HCC and in 56% of HCC BCLCL stage A to C. Consequently, mutations in other cancer genes appears to be involved in tumor progression



020406080

6% 19%

61% 42%

64%


0204060

0% 0% 0% 28%

56%

n=13 n=5 n=6 n=7 n=35

n=32 n=16 n=23 n=17 n=94


0%

0%

n=172

n=172

0204060

IHC GS

020406080

IHC HSP70

020406080100IHC

GPC3

0%

0%

0% 0% 0%

4% 12% 30% 30%

7% 6% 35%

63%

56% 33%

n=58

n=58

n=58

n=26 n=16 n=23 n=15

n=26 n=16 n=23 n=15

n=26 n=16 n=23 n=15

n=22

59%

72%

n=22

70%

n=22

LGDN HGDN Early HCC


HCC

HCC BCLC A to C

Cirrhotic liver




Présentateur


Finally this is the distribution of glutamine synthase, HSP70 and glypican 3. Except for glypican 3 that are not expressed in premalignant nodules, HSP70 and GS were rarely expressed in premalignant nodules and their frequencies increase during malignant transformation inn early HCC.

LGDN HGDN eHCC Small and progressed

HCC

DiagnosisTERT promoter mutation

Glypican 3HSP70

Glutamine synthaseCytologic atypia

Unpaired arteriesPseudoglandular


Distribution des caractéristiques histologiques, immunohistochimiques et génétiques

Dans les CHC « précoces » 61% de mutations du promoteur de TERT 39% avec au moins 2 marqueurs positifs à

l’immunohistochimie (HSP70, GPC3 and GS)

Présentateur


It is a representation of each nodules in each colum with the results ofTERT promoter mutations, immunostaining and some pathologial features. Only 39% of early HCC harbored at least two positive immunohistochemical markers. In contrast, 61% of early HCC were mutated fr the TERT promoter/

Cas sans consensus

8 cas sans consensus

diagnostique

3 cas haut grade VS CHC précoce

1 case bas grade VS CHC précoce

4 cas bas grade VS HGDN

2 cas avec mutations dans le promoteur de TERT

1 cas avec mutation dans le promoteur de TERT

HGDN vs eHCC ?

Mutation du promoteur de TERT +

HSP70 neg Glutamine synthase neg

Glypican 3 neg

Example: CHC1073T


Présentateur


Among the 8 cases without definitive diagnosis, there is a doubt etween HGDN and eHCC in 3 cases and 2 of these 3 cases were mutated for the TERT promoter. In one case there is a doubt between LGDN and eHCC. In 4 cases there is a doubt between LGDN and HGDN with one case positive for the TERT promoter.

Site internet

http://mnd-tert2014.inserm-u1162.fr/


Présentateur


Finally, to give the possibility to reassess all the cases and for eductionnal purpose, we have created a web site with free open access.

Site internet



Présentateur


All the cases were included in this database

Site internet



Présentateur


And all the virtual slides are available in the website

Site internet



Présentateur


In addition with the immunostaining of glypican 3, glutamine synthase an hsPèà

Conclusion • Les mutations du promoteur de TERT sont les premières

altérations génétiques somatiques identifiées dans les nodules dysplasiques cirrhotiques

• Les mutations du promoteur de TERT sont impliquées dans la transformation maligne des nodules dysplasiques cirrhotiques

• Les nodules dysplasiques avec une mutation du promoteur de TERT pourraient être à risque de transformation maligne

• Les mutations dans le promoteur de TERT sont des

nouveaux biomarqueurs (paraffine et congelé) suggèrant une transformation maligne en cours ou déjà effectuée.


Présentateur


In conclusion, TERT promoter mutation is the first recurrent genetic alteration observed in premalignant nodules on crrhosis and is also involved in the malignant transformation of these nodules. Consequently, premalignant nodules with TERT promoter mutations could have a high risk of malignant transformation. In this setting TERT promoter muation is a new biomarker availabe in FFPE or frozen tisues that suggest an undergoing or an already completed malignant transformation.

Inserm U1162, Paris Direction : Jessica Zucman-Rossi Julien Calderaro Sandrine Imbeaud Eric Letouze Shalini Data Gabrielle Couchy Karine Poussin Qian Cao Clément Meiller Sandra Rebouissou Andrea Fanconi

Clinicians Alexis Laurent Daniel Azoulay Laurence Chiche Jean-Frédéric Blanc

Pathologist team Massimo Roncalli Luca Di Tomaso Julien Calderaro Elie Serge Zafrani Charles Balabaud Paulette Bioulac-Sage


HECAM

Présentateur


I would like to thank of the member of the lab, all the clinician and the pathologist team. Thank you for your attention.

les mutations du promoteur de tert sont des … · immunohistochimie . biologie moléculaire ....

Documents