dr. vincent renouf pr. aline lonvaud-funele9rence%20vinitech/... · les bactéries lactiques...

Dynamique et Maîtrise des flores lactiques

Dr. Vincent RENOUF&

Pr. Aline Lonvaud-Funel

[email protected]érences VINITECH – mercredi 3 décembre 2009

� Les bactéries lactiques interviennent durant l’élaboration du vin.

� Elles appartiennent à la microflore œnologique au même titre que les levures, les bactéries acétiques…

Comprendre comment fonctionne la microflore du vin et comment peut-on la maîtriser?

�Ces microorganismes interagissent entre eux, suivant les caractéristiques du raisin et les interventions du vinificateur pour faire, en partie, les qualités et les défauts du vin.

� Comme pour les autres microorganismes oenologiques, l’origine naturelle des bactéries lactiques du vin est le raisin

� La flore indigène est très diversifiée

Une baie supporte plusieurs dizaines Une baie supporte plusieurs dizaines dd’’espespèèces de bactces de bactééries diffries difféérentes!rentes!

AB

Enterococcus faeciumCOenococcus oeni

DE

Leuconostoc mesenteroidesFPediococcus parvulus

G

Lactobacillus johnsoniiH

IJLactobacillus plantarumK

LLactobacillus sanfransiscensis

Bacillus mycoidesM

NO

Lactobacillus caseiP

Leifsonia xyliQ

RGluconobacter oxydans

ST

Pseudomonas jesseniiU

Burkholderia vietnamiensisV

WXYZ

AAABACAD

Serratia rubidaeaEnterobacter gergoviae

AEAF

98100

6999

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100

100

100100

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99

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97

0.05

AB

Enterococcus faeciumCOenococcus oeni

DE

Leuconostoc mesenteroidesFPediococcus parvulus

G

Lactobacillus johnsoniiH

IJLactobacillus plantarumK

LLactobacillus sanfransiscensis

Bacillus mycoidesM

NO

Lactobacillus caseiP

Leifsonia xyliQ

RGluconobacter oxydans

ST

Pseudomonas jesseniiU

Burkholderia vietnamiensisV

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AAABACAD

Serratia rubidaeaEnterobacter gergoviae

AEAF

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100100

100

100

100100

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96

97

0.05

Renouf et al. 2007Appl. Microbiol. Biot. 11,316-327

Une multitude de cellules: donc une Une multitude de cellules: donc une multitude de mmultitude de méétabolismes, de bons et de tabolismes, de bons et de

mauvais!mauvais!

Les bactLes bactééries du vin sont dries du vin sont dééjjàà prpréésentes sentes sur le raisin, dsur le raisin, dèès la nouaison.s la nouaison.

Renouf et al. 2005Aust. J. Grape Wine Res. 11,316-327

�� Les bienfaits de la fermentation malolactique sont reconnus Les bienfaits de la fermentation malolactique sont reconnus

COOH

COOH

HO-C-H

CH2

HO-C-H

COOH

CH3

CO2+

Enzyme malolactique

NAD+, Mn2+

COOH

COOH

HO-C-H

CH2

HO-C-H

COOH

CH3

CO2+HO-C-H

COOH

CH3

CO2+

COOH

CH3

CO2+

Enzyme malolactique

NAD+, Mn2+

Les bactéries lactiques sont bénéfiques au vin

Intérêt organoleptique

Rôle dans la stabilisation du vin

Certaines

L’acide-L-malique L’acide-L-lactique

DuretDuretéé GoGoûût agrt agrééableable

Oenococcus oeni

Transformation malolactique

�� Mais aussi Mais aussi àà ll’’origine de nombreuses bactorigine de nombreuses bactééries dries d’’altaltéérations des vinsrations des vins

��Toutes les bactToutes les bactééries ries lactiques ne sont pas lactiques ne sont pas bbéénnééfiques pour la qualitfiques pour la qualitéé du du vin.vin.

��La flore indigLa flore indigèène non ne non mamaîîtristriséée est source e est source dd’’altaltéérations du vinrations du vin

� Maladie de la graisse� Piqûre lactique� Dégradation de l’acide tartrique: maladie de la tourne� Dégradation du glycérol: maladie de l’amertume� Dégradation du l’acide sorbique: odeur de géranium� Goût de souris� Amines biogènes

�� Les amines biogLes amines biogèènes, une rnes, une rééelle problelle probléématiquematique

Grande étude menée Patrick Lucas et Aline Lonvaud-Funel dans le vignoble bordelais en 2005: 264 vins fin de FML indigène (2005) � dénombrement des bactéries productrices d’histamine (HDC+)

HDC+ /ml

7

23

21

30

66

69

35

13

< 1

1 – 10

10 - 102

102 - 103

103 - 104

104 - 105

105 - 106

> 106

nbre vins

< 3 %

> 70 %

Contamination souvent importante

~ tous contaminés en fin de FML

1- Impact sensoriel

2- Impact sur la santé des consommateurs

� Chez les sujets sensibles: nausées, rougeurs, vomissements, désordres

intestinaux, réactions allergiques diverses…

� Les amines biogènes, notamment la putrescine et la cadavérine, ont un réel impact organoleptique (masque des

arômes fruités).

Limite 2 mg/L Limite 10 mg/L

�� De nombreuses bactDe nombreuses bactééries dries d’’altaltéérations des vinsrations des vins

�� Des espDes espèèces indigces indigèènes incriminnes incriminéées bien connues:es bien connues:

��PediococcusPediococcus parvulusparvulus, , PediococcusPediococcus damnosusdamnosus, , LactobacillusLactobacilluscollonocollonoïïdesdes……

�� Et au sein des espEt au sein des espèèces, des souches peuvent être prces, des souches peuvent être prééjudiciables et judiciables et dd’’autres non!autres non!

��Toutes les souches dToutes les souches d’’Oenococcus oeni ne sont pas bOenococcus oeni ne sont pas béénnééfiques, certaines fiques, certaines produisent des amines biogproduisent des amines biogèènes, certaines sont des souches nes, certaines sont des souches «« filantesfilantes »»……

��Identifier les espIdentifier les espèèces et les souches ces et les souches responsables des altresponsables des altéérations, les causes rations, les causes de leur dde leur dééveloppement et comment les veloppement et comment les mamaîîtriser!triser!

��Favoriser les souches dFavoriser les souches d’’intintéérêtrêt

Jours après les vendanges

Levures totales

Levures non-Saccharomyces

Bactéries lactiques

Bactéries acétiques

La fermentation alcoolique

20 25 30 35 40 45

0

0,5

1

1,5

2

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Aci

de

-L-m

aliq

ue

(g

/L)

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0

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1

1,5

2

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de

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aliq

ue

(g

/L)

25 30 35 40 45


1E+00

1E+01

1E+02

1E+03

1E+04

1E+05

1E+06

1E+07

1E+08

0 5 10 15 20


UF

C/m

L

0,98

1

1,02

1,04

1,06

1,08

1,1

1,12

De

nsi

té

La fermentation malolactique

Renouf 2006

�� Dynamique des bactDynamique des bactééries lactiques au sein de lries lactiques au sein de l’é’écosystcosystèème microbien me microbien durant les vinificationsdurant les vinifications

�� LL’’environnement se modifie, les populations environnement se modifie, les populations microbiennes fluctuent. Les bactmicrobiennes fluctuent. Les bactééries lactiques ries lactiques éévoluent voluent dans cette dynamique microbienne.dans cette dynamique microbienne.

�� Une Une éévolution quantitative mais qualitative des bactvolution quantitative mais qualitative des bactééries lactiquesries lactiques

Enterococcus sp.

Lactobacillus sp.

O. oeni

Lactobacillus sp.

Acetobacter sp.

Lactobacillus sp.

Gluconobacter sp.

Vinification

�� Les cellules les mieux adaptLes cellules les mieux adaptéées subsistent, les autres sont es subsistent, les autres sont ééliminliminééeses

�� La diversitLa diversitéé des espdes espèèces et des souches est maximale avant la fermentation ces et des souches est maximale avant la fermentation alcooliquealcoolique

�� AprAprèès la fermentation alcoolique, seule s la fermentation alcoolique, seule O. oeniO. oeni subsiste. Parmi les subsiste. Parmi les diffdifféérentes souches prrentes souches préésentes, seules les plus rsentes, seules les plus réésistantes persistent et sistantes persistent et peuvent agir.peuvent agir.

Diversité des espècesPCR-DGGE rpOB

Renouf et al. Food Microbio. 2006

Diversité (nombre de profils) des souches au sein de l’espèce O. oeni

PCR-RAPDRenouf et al. J. Ind. Biotechnol. Microbiol. 2008

Avant la FA

Après la FA

A quels stades doit-on contrôler ces phénomènes?

�� Les points clefs : les stades de vide microbiologique!Les points clefs : les stades de vide microbiologique!


Levures totales





20 25 30 35 40 45

0

0,5

1

1,5

2

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0 5 10 15 20


UF

C/m

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1,1

1,12

De

nsi

té


� Avant le départ de la fermentation alcoolique

Diversité importante (Lactobacillus…)+

Milieu riche en sucres et en nutriments et conditions favorables à la croissance (température, O2…)

Pîqure lactique, Amines biogènes…

Renouf 2006

�� Les points clefs : les stades de vide microbiologique!Les points clefs : les stades de vide microbiologique!

� Après la fermentation alcoolique


Levures totales





20 25 30 35 40 45

0

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1

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UF

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L

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De

nsi

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Renouf 2006Jours après les vendanges

Levures totales





20 25 30 35 40 45

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De

nsi

té


Renouf 2006

A la fin de la FA, les A la fin de la FA, les SaccharomycesSaccharomyces ddééclinent. Elles clinent. Elles liblibèèrent un rent un éécosystcosystèème me ququ’’Oenococcus oeniOenococcus oeni et les et les BrettanomycesBrettanomyces vont se disputer!vont se disputer!

Interaction indirecte: Interaction indirecte: le risque le risque Brettanomyces!Brettanomyces!

�� Les points clefs : la latence entre la fin de la FA et le dLes points clefs : la latence entre la fin de la FA et le dééclenchement de la FMLclenchement de la FML


FAFA FMLFML SOSO22

Fer

men

tatio

ns s

pont

anF

erm

enta

tions

spo

ntan

éé eses

Vinifications

Renouf et al. 2005J. Int. Sc. Vigne Vin. 39,179-190

�� Plus la FML Plus la FML tarde tarde àà se se ddééclencher, plus clencher, plus Brettanomyces Brettanomyces dispose de temps dispose de temps pour se dpour se déévelopper!velopper!

Renouf et Murat Rev. Œnologues, Janv. 2008

�� AprAprèès les fermentations, la vie microbiologique du vin continues les fermentations, la vie microbiologique du vin continue

SO2�� Durant lDurant l’é’élevage, llevage, l’’objectif est de robjectif est de rééduire duire progressivement la charge microbienne progressivement la charge microbienne pour prpour préévenir les altvenir les altéérations et prrations et prééserver la server la qualitqualitéé du produit.du produit.~107

UFC/mL

~103

UFC/mLFA FML

~105

UFC/mL

~106/107

UFC/mL

~107

UFC/mL

~103

UFC/mLFA FML

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UFC/mL

~106/107

UFC/mL

ENTONNAGE

<1UFC/mL

ELEVAGE

SOUTIRAGE

SOUTIRAGE

SOUTIRAGE+COLLAGE

~104

UFC/mL

CONDIONNEMENT

ENTONNAGE

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ELEVAGE

SOUTIRAGE

SOUTIRAGE

SOUTIRAGE+COLLAGE

~104

UFC/mL

CONDIONNEMENT

Charge microbienne du vin

Vinifications

Élevage

�� AprAprèès les fermentations, la vie microbiologique du vin continues les fermentations, la vie microbiologique du vin continue

1E+00

1E+01

1E+02

1E+03

1E+04

1E+05

1E+06

1E+07

1E+08

1E+09

0 80 160 240 320 400 480 560 640

Jours après vendanges

UFC

/mL

Levures totales

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UFC

/mL


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CFU

/mL


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1E+06

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0 80 160 240 320 400 480 560 640


UFC

/mL


Levures 103

/102

UFC/mL

Évolutions moyenne des populations microbiennes durant l’élevage (moyennes établies sur 6 lots de vinifications dans 4 chais différents, Renouf 2006)

Bactéries acétiques 104/ 103 UFC/mLBactéries lactiques 106 → 105 UFC/mL

�� Parmi tous les microorganismes, Parmi tous les microorganismes, les bactles bactééries lactiques rries lactiques réésistent sistent trtrèès bien au sulfitage posts bien au sulfitage post--fermentaire!fermentaire!

Bactéries lactiques 106 → 105 UFC/mL

�� Les espLes espèèces et les souches majoritaires changent aprces et les souches majoritaires changent aprèès le sulfitages le sulfitage

Enterococcus sp.

Lactobacillus sp.

Pediococcus parvulus

O. oeni

Lactobacillus sp.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1-baies2-FA3-Macération4-FML5-SO2

6-Entonnage7-Soutirage et réajustement du SO28-Soutirage9-Soutirage et réajustement du SO210-Soutirage et réajustement du SO211-Collage12-Embouteillage

�� Les espLes espèècesces

�� Et même au niveau des souchesEt même au niveau des souches

I II III IV

1er groupe O. oeni

I : EcoulageII: Début de la FMLIII: Mi-FML IV: Fin de la FML]

V: SO2 post-fermentaireVI: EntonnageVII: Réajustement du SO2 VIII: Soutirage

SO2

2èmz

groupe O. oeni

V VI VII VIII

SO2

�� Durant lDurant l’é’élevage les levage les conditions sont moins conditions sont moins favorables aux favorables aux microorganismes (SO2, microorganismes (SO2, temptempéératurerature……), de ), de nouveaux microorganismes nouveaux microorganismes dominateurs, plus dominateurs, plus rréésistants, peuvent sistants, peuvent apparaapparaîître!tre!

�� Et dans la bouteille, Et dans la bouteille, çça continue!!! a continue!!!

3,5×10 5

±1,7×1055,4×10 2

±1,1×10 21981X

<1 UFC/10 mL

2,2×10 4

±0,6×10 41981IX

<1 UFC/10 mL

3,1×102

±0,4×1021981VIII

3,3×10 5

±1,7×1052,8×102

±0,2×1021974VII

4,1×10 6

±1,7×1061,5×102

±1,0×1021949VI

<1 UFC/10 mL

6,6×10 2

±3,1×10 21947V

2,6×10 4

±1,4×103,7×10 3

±1,9×10 31929IV

<1 UFC/10 mL

<1 UFC/10 mL1928III

<1 UFC/10 mL

2,2×10 3

±1,4×10 31926II

<1 UFC/10 mL

4,4×102

±0,4×1021909I

Bactéries (UFC/mL)

Levures(UFC/mL)

MillésimesVins

E

Lactobacillus plantarum

D

Pediococcus damnsosus


B

Oenococcus oeni

A

Leuconostoc mesenteroides

C

100

100

100

100

86

66

90

0.02

Fréquencede la

détection(%)

5 %

5 %

90 %

50 %

5 %

E


D



B

Oenococcus oeni

A


C

100

100

100

100

86

66

90

0.02

E


D



B

Oenococcus oeni

A


C

100

100

100

100

86

66

90

0.02

Fréquencede la

détection(%)

5 %

5 %

90 %

50 %

5 %

Saccharomyces cerevisiae

II

Kluyveromyces lactis

IX

Zygosaccharomyces bailii

IV

VII

VIII

Pichia anomala

III

VI

Brettanomyces bruxellensis

I

Rhodotorula mucilaginosa

V100

100

92

100

100

93

100

100

80

72

97

63

0.05

Fréquencede la

détection(%)

5 %

100 %

10 %

5 %

20 %

5 %

5 %

5 %

5 %

Saccharomyces cerevisiae

II

Kluyveromyces lactis

IX

Zygosaccharomyces bailii

IV

VII

VIII

Pichia anomala

III

VI

Brettanomyces bruxellensis

I

Rhodotorula mucilaginosa

V100

100

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100

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80

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Fréquencede la

détection(%)

5 %

100 %

10 %

5 %

20 %

5 %

5 %

5 %

5 %-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

1949 1978 1998 1967 1974 2003 1993 1997 1996 2000 1999 2003 1995 1909 1926 2001 2002 1999

Millésimes

Log[

pop

ula

tion

s U

FC

/mL

]

-8

-6

-4

-2

0

2

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1949 1978 1998 1967 1974 2003 1993 1997 1996 2000 1999 2003 1995 1909 1926 2001 2002 1999

Millésimes

Log[

pop

ula

tion

s U

FC

/mL

]

�� Les bactLes bactééries prries préésentes au sentes au moment du conditionnement moment du conditionnement peuvent persister dans la bouteille et peuvent persister dans la bouteille et être prêtre prééjudiciables judiciables àà la qualitla qualitéé du vin du vin lors de sa dlors de sa déégustationgustation

Équilibre et occupation de la niche écologique

Indentification des levuresPCR-DGGE NL1/LS2

Renouf et al. Am. J. Enol. Vitic. 2007

Indentification des bactériesPCR-DGGE rpoB

Renouf et al. Am. J. Enol. Vitic. 2007

Levures


�� Pour rPour réésumer: les bactsumer: les bactééries lactiques au centre du consortium microbiologique ries lactiques au centre du consortium microbiologique œœnologique!nologique!

Par moment, les bactéries lactiques sont bénéfiques :� Fermentation malolactique,

� Occupation de l’écosystème jusqu’au sulfitage au dépend des Brettanomyces.

À d’autres étapes, elles sont préjudiciables :� Avant la fermentation alcoolique,

�Pendant l’élevage,�Dans la bouteille.

�� Des outils pour le vinificateur Des outils pour le vinificateur

� Pour analyser les flores lactiques Pour analyser les flores lactiques

� Méthodes conventionnelles

� L’épifluorescence� Dénombrement sur des milieux nutritifs sélectifs gélosés

� Méthodes moléculaires : PCR et PCR quantitative

�Détection et identification des espèces

�Détection d’activités préjudiciables: → production d’amines biogènes→ production de glucanes→dégradation du glycérol,


� Pour maPour maîîtriser le dtriser le dééclenchement de la fermentation malolactiqueclenchement de la fermentation malolactique

Les levains malolactiques sont Les levains malolactiques sont des souches sdes souches séélectionnlectionnééesespour leurs pour leurs aptitudes aptitudes œœnologiquesnologiques

et et ll’’absence de mabsence de méétabolismes prtabolismes prééjudiciablesjudiciables. .

Ils sont associIls sont associéés s àà des procdes procééddéés de s de productionproduction et et dd’’inoculationinoculation ddééveloppveloppéés pour s pour

renforcer leurs qualitrenforcer leurs qualitéés intrinss intrinsèèquesques

Gain Gain de tempsde temps

SSéécuritcurit ééfermentairefermentaire

PrPréévention vention des altdes alt éérationsrations

��Pour Maintenir Pour Maintenir une microflore une microflore choisie, choisie, active active et contrôlet contrôléée e jusqujusqu’’au sulfitageau sulfitage


� Pour contrôler les dPour contrôler les dééveloppements des bactveloppements des bactééries lactiques indries lactiques indéésirablessirables

� Dans le moût

Vendanges abîméesMacération pré-fermentaireMoûts issus de thermo…

× SO2 de la vendange, oui mais ne tomber dans l’excès: < 8 g/hL!× Attention aux macérations pré-fermentaires

× Favoriser l’implantation d’une LSApuis d’un levain malolactique : en ajoutant massivement une souche sélectionnée on réduit les activités préjudiciables de la flore indigène

� Durant l’élevage× SO2 évidemment à raisonner en fonction du pH et du pouvoir combinant du vin× règles d’hygiène: température, entretien des contenants, soutirage, collage…

× Soutirage, collage…× La filtration < 0,45 µm pour conditionner un produit stérile et éviter les déviations dans la bouteille.

Maintenir la veille!

�� Un outil spécifique pour contrôler les bactéries lactiques: LE LYSOZYME!

Dynamique et Maîtrise des flores lactiques

Dr. Vincent RENOUF&

Pr. Aline Lonvaud-Funel

[email protected]érences VINITECH – mercredi 3 décembre 2009

dr. vincent renouf pr. aline lonvaud-funele9rence%20vinitech/... · les bactéries lactiques...

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