Dosage des acides aminés plasmatiques

Etapes préanalytiques

Etude multicentrique

Angers : Gilles Simard

Caen : Marie-Hélène Read

Clermont-Ferrand : Régine Quinard

Lille : Gilbert Briand

Lyon : Cécile Acquaviva, Cécile Pagan, Alice Merllié

Paris Necker : Sylvia Sanquer

Paris Robert Debré : Apolline Imbard, Jean-François Benoist

Reims : Roselyne Garnotel

Rouen : Marion Colnot, Frédéric Ziegler et Soumeya Bekri

Dosage des acides aminés plasmatiques

Etapes préanalytiques

Objectif : définir les modalités de prélèvements et de conservation des échantillons pour

le dosage des acides aminés plasmatiques

Trois études

• Influence de la nature du tube de prélèvement et de la température de centrifugation

(4°C ou 16°C)

• Conservation du sang total à température ambiante versus dans la glace

• Conservation du plasma à température ambiante versus dans la glace

Nature du tube de prélèvement et température de centrifugation

Comparaison

- Tubes héparinés classiques centrifugés à 4°C ou 16°C

- Tubes héparinés avec gel séparateur (polymère acrylique BD) centrifugés à 4°C ou 16°C

- Tubes EDTA

Etude réalisée dans 4 labo / 2 prélèvements témoins par labo

- Clermont-Ferrand et Caen : technique échange d’ions

- Angers et Lyon : technique MSMS

Méthode d’analyse des résultats

– Condition de référence = tube hépariné classique centrifugé à 4 °C = valeur de 100%

– Variations exprimées en pourcentage par rapport à cette condition de référence (prise en

compte de la moyenne des % des 2 témoins)

– Interprétation tient compte de la répétabilité des dosages d’acides aminés estimée à 10%

60

70

80

90

100

110

120

130

Heparine 4°C Heparine 16°C Heparine gel 4°C EDTA 4°C

ALAARG

ASN

ASP

CITCYS

GLN

GLUGLY

HIS

ILELEU

LYS

MET

ORNPHE

PRO

SERTAU

THR

TYR

Résultats Caen

Orn, Glu

Tau

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

HEP 4° HEP 16° HEP GEL 16° HEP GEL 4° EDTA 4°

ALA

ARG

ASN

ASP

CIT

CYS

GLN

GLU

GLY

HIS

ILE

LEU

LYS

MET

ORN

PHE

PRO

#REF!

SER

TAU

Asp

Résultats Clermont Ferrand

Tau, Glu

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

HEP 4°C HEP 16°C HEP GEL 16°C HEP GEL 4°C EDTA 4°C

Ala

Arg

Asn

Asp

Cit

Cystine

Gln

Glu

Gly

His

IsoLeu

Leu

Lys

Mét

Orn

Phé

Pro

Sér

Tau

Thréo

Trp

Tyr

Val

Tau

Asn

Asp

Tyr

Cys

Résultats Angers

Résultats Lyon

0102030405060708090

100110120130140150160170180190200210220230240250

Heparine 4°C Heparine 16°C Heparine gel 16°C Heparine gel 4°C EDTA 16°C

ALA

ARG

ASN

ASP

CIT

CYS

GLN

GLU

GLY

HIS

ILE spé

LEU spé

LYS

MET

ORN

PHE

PRO

SER

THR

TRP

TYR

VAL

* Attention valeurs basses

Glu* Asp*

Gly

Cys

Conclusions

- Technique d’échange d’ions, pas de variations communes entre les 2 labo : pas

d’influence du type de tube ni de la température de centrifugation

- Technique MSMS : tendance à une inhibition avec l’EDTA : à éviter

� Recommandations générales

- prélèvement sur tube hépariné avec ou sans gel,

- centrifugation 4°C de préférence mais 16°C possible

- éviter EDTA

Conservation du sang total prélevé sur héparine

- à température ambiante

- à +4°C

pendant 0, 30 mn, 1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h (sauf Lille, max = 3h30 ; + de temps

intermédiaires)

Puis congélation du plasma jusqu’à analyse (+ test de déprotéinisation immédiate à

Lille).

3 labo : Reims, Lille, Paris Necker (+ test sang EDTA)

Dosages de 2 témoins/labo

Analyse des données

- Calcul des variations en %, en prenant le T0 comme référence 100%

- Prise en compte des variations < ou > à 10% (moyenne des % des 2 témoins)

Sang total conservé à T ambiante : résultats Reims

0102030405060708090

100110120130140150160170180190200210220230240250260270280290300310320330340350360370380

T 0 T 30min T 60min T 2h T 3h T 4h T 5h T 6h

Thr

Ser

Asn

Glu

Gln

Gly

Ala

Cit

Val

Met

Cys2

Ile

Leu

Tyr

Phe

Trp

Orn

Lys

1Met

His

3Met

Arg

Pro

Orn

Glu

Arg

Cys

0102030405060708090

100110120130140150160170180190200210

T0 T30 T1H T2H T3H30

Ala

Arg

Asn

Asp

Cit

Cys

Gln

Glu

Gly

His

Ile

Leu

Lys

Met

Orn

Phe

Pro

Ser

Tau

Thr

Trp

Tyr

Orn

Glu

Arg

Cys

0102030405060708090

100110120130140150160170180190200210

T0 T30 T1H T2H T3H30

AlaArg

AsnAspCitCysGlnGluGlyHisIle

LeuLysMetOrnPheProSerTauThrTrp

TyrVal

Orn

Glu

ArgAsp

Sang total conservé à T ambiante : résultats Lille

Congélation du plasma

Congélation après déprotéinisation

Sang total conservé à T ambiante : résultats NeckerAttention cystine et acide aspartique non quantifiés

30405060708090

100110120130140150160170180190200210220230240

T0 T30 T1H T2H T4H

ASP

ASN

SER

SAR

GLN

GLY

GLU

THR

ALA

CIT

PRO

VAL

MET

TYR

ILE

LEU

PHE

HIS

ORN

TRP

LYS

ARG

Orn

GluAsn

Arg

Cit

héparine

EDTA

30405060708090

100110120130140150160170180190200210220230240250260

T0 T30 T1H T2H T4H

ASN

SER

SAR

GLN

GLY

GLU

THR

ALA

CIT

PRO

VAL

MET

Orn

Glu

Arg

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

180

190

200

210

220

230

240

250

260

270

280

290

300

310

320

T 0 T 30min T 60min T 2h T 3h T 4h T 5h T 6h

Asp

Thr

Ser

Asn

Glu

Gln

Gly

Ala

Cit

Val

Met

Cys2

Ile

Leu

Tyr

Phe

Trp

Orn

Lys

His

Arg

Pro

Asp (mais valeurs très

faibles)

Orn

Glu

Arg

Sang total conservé à 4 °C : résultats Reims

Sang total conservé à 4 °C : résultats Necker

Attention cystine et acide aspartique non quantifiés

70

80

90

100

110

120

130

140

T0 T30 T1H T2H T4H

ASP

ASN

SER

SAR

GLN

GLY

GLU

THR

ALA

CIT

PRO

VAL

MET

TYR

ILE

LEU

PHE

Glu Orn

Tyr

Héparine

Conclusions

- Sang total conservé à température ambiante

- Dès 1h de conservation du sang total, augmentation de l’ornithine avec diminution

concomitante de l’arginine

- puis ↑ acide glutamique (interpréter la somme Gln+Glu) et ↓ cystine

- Sang total conservé à 4°C

- Amplitude de variation moins importante

- Mais augmentation de l’ornithine avec diminution de l’arginine (>3h)

- Augmentation de l’acide glutamique (interpréter la somme Gln+Glu)

- à température ambiante

- à +4°C

pendant 0, 30 mn, 1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h

Puis congélation du plasma jusqu’à analyse

2 labo : Paris RDB, Rouen

Dosages de 2 témoins/labo

Analyse des données

- Calcul des variations en %, en prenant le T0 comme référence 100%

- Prise en compte des variations < ou > à 10% (moyenne des % des 2 témoins)

Conservation du plasma hépariné

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

T0 T30 T1H T2H T3H T4H T5H T6H

PRO

ASP

THR

SER

ASN

GLU

GLN

GLY

ALA

CIT

VAL

CYS

MET

ILE

LEU

TYR

PHE

ORN

LYS

HIS

ARG

Résultats Rouen

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

T0 T30 T60 T2h T3H T4H T5H T6H

Tau

Asp

Thr

Ser

Asn

Glu

Gln

Gly

Ala

Cit

Val

Cys

Met

Ileu

Leu

Tyr

Phe

Orn

His

Lys

Résultats RDB

Plasma conservé à T ambiante

Glu

Glu

Cys

Cys

Plasma conservé à 4°C

80

90

100

110

120

130

T0 T30 T1H T2H T3H T4H T5H T6H

PROTAUASPTHRSERASNGLUGLNGLYALACITVALCYSMETILELEUTYRPHE

RouenGlu

80

90

100

110

120

130

T0 T30 T60 T2H T3H T4H T5H T6H

Tau

Asp

Thr

Ser

Asn

Glu

Gln

Gly

Ala

Cit

Val

Cys

Met

RDB

Conclusions

- Plasma température ambiante

- > 2H ↑ acide glutamique : interpréter la somme Gln+Glu

- > 3H ↓ cystine

- Autres AA : pas variation jusqu’à 6H

- Plasma 4°C

- > 3H : augmentation de l’acide glutamique : interpréter la somme Gln+Glu

- Autres AA : pas variation jusqu’à 6H

Résultats identiques à ceux présentés par Lyon à la réunion Biologie & Qualité

en 2013

1. Anticoagulant

– héparine (avec ou sans gel séparateur)

– éviter EDTA

2. Centrifugation

– recommandée à 4°C mais 16°C acceptable

– dans l’heure qui suit le prélèvement, sinon mettre le sang à 4°C (max = 3H)

– Au delà

• ↓ arginine et ↑ ornithine

• ↓ cystine

• ↑ acide glutamique : interpréter le bloc Gln+Glu

3. Conservation du plasma

– 1H à T ambiante , ensuite

• ↑ acide glutamique (>2H) : interpréter le bloc Gln+Glu

• ↓ cystine (>3H)

• Autres AA : pas de variation significative jusqu’à 6H

– 3H à 4°C, au-delà ↑ acide glutamique (autres AA pas de variation significative jusqu’à 6H)

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