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Le dépistage de l’antigène HBs

(Par méthode ELISA)

S / Abdessemed

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Intérêt diagnostique :

Une hépatite virale de type B est le plus souvent accompagnée de l’apparition de l’antigène de surface du virus de l’hépatite B dans le sérum. En règle générale, l’AgHBspeut être mis en évidence dans le sérum dès 2 à 3 semaines avant le début de la maladie, et atteint son point culminant au moment de l’apparition des symptômes caractéristique (ictère, modification de la concentration des enzymes spécifiques du foie).

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On observe ensuite généralement une lente élimination de l’antigène. Chez un certain nombre de sujets, et chez un pourcentage inconnu de personnes ayant été infectées par le virus de l’hépatite B de façon subclinique, l’antigène peut rester mesurable dans le sérum pendant des années, voire à vie.

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Dans la mesure où une transfusion de sang contenant de l’AgHBs a entraîné une hépatite B dans de nombreux cas, le principal intérêt de la mise en évidences de l’AgHBs réside dans le dépistage des dons de sang, afin de réduire la fréquence des hépatites B post-transfusionnelles. La détection de l’AgHBs est également utilisée pour le diagnostic des hépatites B aigues ou chroniques.

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stade Ag HBS Ag HBe Ac anti HBS Ac anti HBC Ac anti HBe

Hépatite : Début

Etat

Guérison

++

+/-

-

+

+

-

-

-

+/-

-

++

+

-

-

+

Hépatite

chronique

+ + - + -

Porteur sain + +/- - + -/+

Vaccination - - + - -

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1. Principe :

Enzygnost ®HBs Ag est un test immunoenzymatique basé sur une réaction en deux étapes : l’Ag HBs contenu dans l’échantillon à tester réagit tout d’abord simultanément d’une part avec les anticorps anti-HBs polyclonaux fixés à la surface des cupules de plaque de microtitration, et d’autre part avec le conjugué 1 (anti-HBs/Biotine, coloré en bleu). Après élimination des éléments non liés, le conjugué 2 (streptavidine/POD, coloré en jaune) réagit ensuite avec le conjugué 1.

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Après élimination des éléments non liés, l’activité enzymatique du conjugué 2 liée est mesurée (réaction colorée en bleu). La transformation enzymatique du chromogène est ensuite interrompue par l’addition de la solution d’arrêt POD (réaction colorée en jaune). L’intensité de la coloration est directement proportionnelle à la concentration antigénique de l’échantillon.

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2. Réactifs :

Plaque Enzygnost® HBs Ag 5.0 : plaque de microtitration recouverte d’AC de mouton anti-AgHBs.

Conjugué 1 (anti-HBs/Biotine) : anti-HBsmonoclonal (de souris). Conjugué à la biotine, coloré en bleu. Agent de conservation (phénol : max. 1 g/l)

Conjugué 2 (streptavidine/POD) : streptavidineconjugué à la peroxydase (POD). Coloré en jaune. Agent de conservation (phénol : max. 1 g/l)

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Sérum de contrôle HBs Ag négatif : sérum humain, valeur de D.O. indicative : ≤ 0,150. Agent de conservation (phénol : max. 1 g/l)

Sérum de contrôle HBs Ag positif : sérum humain stabilisé.0, 4 ± 0,2 (standard du PEI {Paul-Ehrlich-Institut})), valeur de D.O. indicative : ≥ 0,7. Agent de conservation (phénol : max. 1 g/l).

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Préparation des réactifs :

Porter tous les réactifs et échantillons à +15/+25°C avant le début du test, sans sortir la plaque de son emballage.

Sortir du cadre les barrettes non utilisées dans le test, et les conserver pour un usage ultérieur.

Pour une plaque, diluer 20mL de solution de lavage POD avec l’eau distillée ou désionisée en complétant à 400 mL.

Pour une plaque, diluer 1 mL de chromogène TMB avec 10 mL de tampon/substrat TMB dans le flacon plastique vide inclus dans le coffret (solution d’emploi du chromogène) et la conserver dans le flacon fermé à l’abri de la lumière.

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Matériel nécessaire :

Incubateur : bain marie couvert (+37±1°C) ou méthode d’incubation équivalente.

Pipettes : pipettes à embout de 25, 100 et 1000µL.

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Laveur

Lecteur de plaques "Elisa"

Incubateur

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3. Echantillons à tester :

Utiliser des échantillons (sérum humains ou plasmas citrates, héparines ou prélevés sur EDTA) obtenus selon les techniques standard des laboratoires. Les échantillons peuvent être conservés 3 jours maximum à +2/+8°C.

Pour une conservation plus longue, les congeler.

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4. Réalisation du test

Distribution des contrôles et échantillons : distribuer dans 3 cupules (A1 à C1) 100 µL de sérum de contrôle négatif, dans 1 cupule (D1) 100µL de sérum de contrôle positif, dans les cupules suivantes 100µL de chacun des échantillons non dilués, puis en fin de série ou en fin de plaque de nouveau 100µL de sérum de contrôle positif.

Les pipetages doivent être enchaînés, et ne pas durer plus de 30min par plaque.

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Enchaîner la distribution du conjugué 1 immédiatement après celle des échantillons.

Distribution de conjugué 1 : distribuer dans chaque cupule 25 µL de conjugué 1 (anti-HBs/Biotine). Couvrir ensuite d’une feuille adhésive et placer la plaque dans l’incubateur immédiatement après la distribution du conjugué.

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Incubation : laisser incuber 60 ± 2min à 37 ± 1° C, et enchaîner immédiatement le processus de lavage.

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Lavage : retirer la feuille adhésive, aspirer le contenu de toutes les cupules, et distribuer dans chacune d’elles environ. 0,3 ml de solution de lavage. Répéter 4 fois l’opération, en respectant un temps de contact de 10sec. Dès la fin de processus de lavage, distribuer immédiatement le conjugué 2 afin d’éviter tout desséchement.

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Distribution du conjugué 2 : ajouter dans chaque cupule 100µL du conjugué 2 (streptavidine/POD), couvrir d’une nouvelle feuille adhésive, et placer immédiatement la plaque dans l’incubateur.

Incubation : laisser incuber 30 ± 2min à37 ± 1°C, et enchaîner immédiatement le processus de lavage.

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Lavage : retirer la feuille adhésive,Répéter4 fois l’opération. Dès la fin de processus de lavage, distribuer immédiatement le substrat.

Distribution du substrat : distribuer dans chaque cupule 75µL de solution d’emploi du chromogène, puis couvrir la plaque d’une nouvelle feuille adhésive.

Incubation du substrat : laisser incuber 30 ± 2min à +15/+25° C, à l’abri de la lumière.

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Arrêt de la réaction : retirer la feuille adhésive et ajouter dans chaque cupule 75µL de solution d’arrêt POD en respectant le même rythme

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Mesure : faire une mesure photométrique dans l’heure qui suit à 450nm. La longueur d’onde de référence doit être de 650 nm (éventuellement comprise entre 615 et 690 nm).

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5. Validation du test :

Calculer les valeurs moyennes des sérums de contrôle à partir des différentes valeurs mesurées si :

0,010 ≤ DO.neg ≤ 0,150

DO .POS ≥ 0 ,700

Sur les 3 valeurs mesurées du sérum de contrôle négatif, une valeur sortant du domaine indiqué peut être négligée.

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Pour le sérum de contrôle positif, les deux valeurs obtenues doivent se trouver dans le domaine indiqué.

Si ces critères ne sont pas remplis, le test doit être recommencé.

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Calculer la valeur moyenne des DO du sérum de contrôle négatif.

A cette valeur moyenne, ajouter 0,050 pour obtenir la valeur-seuil :

Moyenne D.Oneg + 0,050 = valeur-seuil (cut off)

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6. Résultats du test

D.O échantillon < cut off = négatif

D.O échantillon ≥ cut off = positif

Les échantillons dont la valeur est trouvée ≥ à la V.S doivent être retestés en double.

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Si les deux valeurs de densités obtenues dans le deuxième test sont trouvées inferieures à la V.S, l’échantillon doit être considéré comme négatif.

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Si au moins une des deux valeurs obtenues dans le deuxième test est trouvée à nouveau ≥ à la V.S, l’échantillon doit être considéré comme provisoirement positif et doit être confirmé par un test de confirmation.

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Antigène HBS « test de confirmation »

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1. Principe :

L’échantillon à analyser est incubé avec des antiHBS (humain) « R1 », pour la comparaison on reprend le même échantillon avec du sérum contrôle négatif (exempt d’anticorps antiHBS) « R2 ».

Les anticorps en excès saturent tous les déterminants antigéniques de l’antigène HBS présent dans l’échantillon.

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Un test de dépistage réalisé ensuite indique qu’il n y a plus d’antigène HBS, l’échantillon mélangé avec le sérum de contrôle « R2 » est positif.

Lorsque la réaction est non spécifique, on obtient même après addition d’anti HBS « R1 » une réaction positive.

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2. Réactifs :

o antiHBS humain stabilisé « R1 »

o sérum de contrôle humain exempt d’anticorps antiHBS « R 2 »

tous les réactifs utilisés dans le test de dépistage

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Remarque : les échantillons qui ont présenté lors du test de dépistage des D.O ≥ au sérum de contrôle positif doivent êtres dilués au préalable au 1/10 ou au 1/100 avec une solution saline isotonique.

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3. Mode opératoire :

Tube 1 Tube 2

échantillon 200 µl 200 µl

Réactif « 1 » 50µl -----

Réactif « 2 » ------ 50µl

Dans deux tubes, mélanger respectivement :

Traiter le contrôle positif comme échantillon.-- Incuber 1 heure entre 37et 40 ° C.-- Utiliser les échantillons ainsi traités dans un test de dépistage en incluant les témoins positifs et témoins négatifs.

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4. Analyse des résultats :

Analyse visuelle : placer le portoir sur fond blanc.

Le témoin positif non traité orange-jaune.

Le témoin négatif incolore.Le témoin positif traité par le « R1 » doit

avoir une coloration nettement plus faible que le témoin positif mélangé au « R2 » sinon refaire le test.

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