comparaison de méthodes pour le dosage de la transferrine...

Comparaison de méthodes

pour le dosage de

la Transferrine déficiente

en carbohydrate

Auteur : Jeanneret Damien

Accompagnants : Cipolli Mercedes Druon Jean-Michel

Laboratoire : FutureLab BBR-LTC, Lausanne

Période : Novembre 2010-Mars 2011

Jeanneret Damien Travail de Diplôme en Immunologie TAB 50, ESsanté Novembre-Mars 2011

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Table des matières

SUMMARY :................................................................................................................4

RESUME : ...................................................................................................................4

INTRODUCTION :.......................................................................................................5

Description du laboratoire : ..................................................................................................................................5

Généralités :............................................................................................................................................................6

Caractéristiques des différents marqueurs biologiques de l’imprégnation éthylique : [1]..............................7

Caractéristiques métaboliques : [1] ......................................................................................................................7

Intérêt diagnostique :.............................................................................................................................................8

Caractéristiques des 2 méthodes : ........................................................................................................................8

Description méthode immunonéphélémétrie : [5] ...............................................................................................9

Description méthode HPLC : [4] ........................................................................................................................10

BUT : .........................................................................................................................11

DEVELOPPEMENT : ................................................................................................12

Matériel : [2], [3] ..................................................................................................................................................12

Méthode : [2] ........................................................................................................................................................13

Calcul du pourcentage CDT : .............................................................................................................................13

RESULTATS :...........................................................................................................14

Corrélation avec la méthode de référence : [6]..................................................................................................14

Répétabilité : [6] ...................................................................................................................................................15

Reproductibilité : [6]............................................................................................................................................15

Limite de détection : [6].......................................................................................................................................16

Contamination : [6]..............................................................................................................................................16

Biais : [6] ...............................................................................................................................................................17

Linéarité : [6]........................................................................................................................................................17

Graphique de la linéarité du %CDT :................................................................................................................18

Graphique de linéarité de la transferrine [g/l] : ................................................................................................19


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Graphique de la linéarité de la CDT [mg/l] :.....................................................................................................20

Sensibilité et spécificité : [7] ................................................................................................................................21

Variant génétique :...............................................................................................................................................23

INTERPRETATION DES RESULTATS : ..................................................................24

Régression selon Passing-Bablok :......................................................................................................................24

Diagramme des rapports :...................................................................................................................................26

Diagramme des différences : ...............................................................................................................................27

CONCLUSION ..........................................................................................................28

REMERCIEMENTS ...................................................................................................30

BIBLIOGRAPHIE :....................................................................................................31

Texte :....................................................................................................................................................................31

Illustrations : ........................................................................................................................................................32

LEXIQUE :.................................................................................................................33

ANNEXES: ................................................................................................................34

Annexe 1: Rapport du CSCQ..............................................................................................................................34

Annexe 2: Feuilles de résultats du BN Prospec® ..............................................................................................35

Annexe 4 : Insert ..................................................................................................................................................77


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Summary :

This study compares two methods (high performance liquid chromatography and nephelometry on BN Prospec® by Siemens) and shows how they work to measure carbohydrate deficient transferrinBN Prospec (CDT). This transferrin has lost carbohydrates and increases on a pathological way in case of regular alcohol consumption over 50g/day. This biomarker is considered to be more sensitive and more specific than γ-glutamyltransferase (GGT) or than the mean corpuscular volume (MCV), to diagnose chronic alcoholism or to follow withdrawals.

To do that comparison, we will take 36 serum samplings on which we will make, with both methods, the measurement of CDT. Several tests will be done to determine if this parameter’s analysis can be set in those conditions and on that automaton. Those tests are, for example, correlation, reproducibility or contamination. After the measurements, we will draw charts to allow a better interpretation.

After all the measurements and charts have been done, we can say that CDT can and will be measured on BN Prospec® using nephelomety at FutureLab BBR laboratory from march 7, 2011.

Résumé :

Cette étude nous montre le déroulement de la comparaison entre deux méthodes, la chromatographie liquide à haute performance et la néphélémétrie sur le BN Prospec® de Siemens, pour le dosage de la transferrine déficiente en carbohydrate (CDT). C’est une transferrine qui à subit une délétion de plusieurs hydrates de carbone et qui augmente de manière pathologique lors d’une consommation d’alcool régulière et supérieure à 50 g/jour. C’est un marqueur biologique qui est considéré comme plus sensible et plus spécifique que la γ-glutamyltransférase (GGT) ou que le volume globulaire moyen (MCV), pour le diagnostique des cas d’alcoolisme chronique ou pour le suivi de sevrage.

Pour réaliser cette comparaison, nous allons prendre 36 échantillons de sérum sur lesquels nous allons effectuer, avec les deux méthodes, le dosage de la CDT. Plusieurs tests seront effectués pour définir s’il est possible de mettre en place l’analyse de ce paramètre dans ces conditions et avec cet automate. Dans ces tests, il y a par exemple la corrélation, la reproductibilité ou encore la contamination, suite à ces mesures, des graphiques seront tracés pour permettre une meilleure interprétation.

Suite à toutes ces mesures et graphiques effectués, nous pouvons dire que la CDT pourra et sera dosée sur le BN Prospec® par néphélémétrie au sein du laboratoire de FutureLab BBR à partir du lundi 7 mars 2011.


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Introduction :

Description du laboratoire :

Le laboratoire BBR-LTC Lausanne de la société AMS SA, fait partie du groupe FutureLab. AMS est un ensemble de laboratoires privés qui reçoit des analyses de différentes origines, tel que des hôpitaux, des cliniques, des médecins généralistes ou spécialisés. Le site de Lausanne est divisé en plusieurs secteurs, immuno-sérologie, chimie clinique, hématologie-hémostase, bactériologie, biologie moléculaire et génétique. C’est dans le secteur d’immuno-sérologie que j’ai effectué mon stage.

Figure 1 : Répartition des laboratoires d’AMS en Suisse


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Généralités :

La transferrine est une glycoprotéine servant à transporter le fer, elle a un poids moléculaire de 80KD, elle se compose d’une chaîne de polypeptides et de 2 chaînes de polysaccharides. Ces chaînes se terminent par des molécules d’acide sialique.

Il existe différentes isoformes de transferrine humaine en fonction du taux de sialylation. [1]

• Trisialylée <10% • Tétrasialylée <80% • Pentasialylée <15% • Hexasialylée <1% • Peu sialylée <2%

Une consommation abusive et répétée d’alcool entraîne une augmentation des formes peu sialylées (comportant moins de 3 molécules d’acide sialique). Dans ces formes, on compte les di-, mono- et asialylée, elles sont désignées sous le nom de Transferrine Déficiente en Carbohydrates ou CDT.

Il existe d’autres indicateurs de la consommation d’alcool, comme la γ-glutamyltransférase (GGT) ou le volume globulaire moyen (MCV), mais ces derniers sont des marqueurs moins spécifiques concernant la consommation d’alcool. [1]

Figure 3 : sialilation de la transferrine

Figure 2 : schéma d’une molécule de transferrine pentasialylée


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Caractéristiques des différents marqueurs biologiques de l’imprégnation éthylique : [1]

CDT GGT MCV Sensibilité 39-94% 34-84% 15-69% Spécificité 82-100% 11-85% 26-91% Demi-vie 14-17 jours 2-3 semaines 3 mois

Normalisation 4 semaines 2 mois 10-12 semaines Quantité d’alcool nécessaire pour augmentation

50-80g/j 80-200g/j

Durée d’alcoolisation nécessaire pour augmentation

1 semaine Plusieurs semaines

Caractéristiques métaboliques : [1]

La perte d’une ou de plusieurs chaînes se produit lors de la biosynthèse de la transferrine au niveau des hépatocytes, avant son excrétion. Il s’agit d’une inhibition des sialyltransférases membranaires due à la consommation d’alcool.

La CDT a une demi-vie dans l’organisme d’environ 14 jours, c’est-à-dire qu’il faut deux semaines au corps humain pour diminuer de moitié la concentration en CDT qu’il contient.

Facteurs influençant la CDT :

• Quantité d’alcool consommée • Sexe (taux plus élevé chez la femme) • Grossesse • Temps entre la dernière consommation et le prélèvement • Type de consommation

Facteurs n’influençant pas la CDT :

• Diabète • Alcoolisation aigüe • Consommation d’alcool modérée (<40 g/jour) • Tabac • Cancers du pancréas, infarctus, syndrome hépatique • Surcharge pondérale • Médicament (anticoagulants, analgésiques, antipsychotiques, anticonvulsifs)


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Intérêt diagnostique :

Le dosage de la CDT en rapport avec la transferrine permet : le suivi de traitement contre l’alcoolisme, la détection rapide des éventuelles rechutes durant le sevrage. Ce dosage peut également servir dans le milieu médico-légal dans le but de prouver, par exemple, si un conducteur était en état d’ébriété, lors d’un éventuel retrait du permis de conduire.

Caractéristiques des 2 méthodes :

Méthodes Référence Nouvelle

Fournisseur Chromsystems Siemens

Nom de la Méthode CDT in serum BN Prospec®

Technique HPLC Néphélémétrie

Unité % %

Valeur de réf. Min. 1.7 0

Valeur de réf. Max. 2.6 2.5


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Description méthode immunonéphélémétrie : [5]

Dans la néphélémétrie, on mesure la déviation de la lumière après avoir traversé une suspension. Le rayon lumineux émit, généralement par une diode laser, passe au travers de la solution formée par le(s) réactif(s), le diluant et l’échantillon.

Ce schéma nous montre le chemin effectué par le faisceau lumineux, le rayon est dévié par un premier miroir sur la cuvette, puis il la traverse. Lors de son passage dans la cuvette, la lumière est dispersée par les particules présentes dans celle-ci. La lumière dispersée est déviée par un deuxième miroir pour être dirigée sur le détecteur dans le but de mesurer l’intensité du signal lumineux. La concentration est calculée à l’aide d’une courbe de calibration faite préalablement à l’aide d’un standard dont la concentration est connue.

Les résultats sont transmis vers un ordinateur et peuvent ainsi soit être imprimés, soit ils sont directement passés sur le réseau du laboratoire, si l’automate est connecté « on-line ».

Figure 4 : Schéma du trajet du faisceau lumineux sur le BN Prospec®


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Description méthode HPLC : [4] L’échantillon est préalablement préparé en y ajoutant différents réactifs, ou tampons en le diluant.

Ensuite l’échantillon est introduit dans le système par l’injecteur à l’entrée de la colonne (phase stationnaire), celui-ci est dilué et entraîné au travers de la colonne par un liquide (la phase mobile).

La phase stationnaire sert à retenir les différents éléments (solutés) contenu dans l’échantillon, ils sont séparés grâce à leur vitesse de déplacement au travers de la phase stationnaire.

Après la colonne, se trouve un détecteur UV couplé à un enregistreur, le premier envoie au second le signal des différents éléments, séparés dans la colonne, et l’enregistreur transforme ces signaux sous forme d’un graphique, appelé chromatogramme, représentant les pics des différent solutés séparés. Le temps entre l’injection et la détection d’une substance est appelé Temps de Rétention (RT).

Figure 5 : Schéma d’un système HPLC

Figure 6 : Chromatogrammes du %CDT, à gauche un négatif et à droite un positif.


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But :

Validation d’une nouvelle méthode pour le dosage en routine de la Transferrine Déficiente en Carbohydrate (CDT), par néphélémétrie, sur le BN Prospec® de Siemens.

Figure 7 : Schéma du BN Prospec® de Siemens


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Développement :

Matériel : [2], [3]

• Automate : o BN Prospec® de Siemens

• Réactifs : o Antisérum anti-transferrine humaine (réf. OSAX), n° lot : 153431 et 153430 o Réactif CDT 1 (réf. OPCS), n° lot : 110120 o Réactif CDT 2 (réf. OPCS), n° lot : 110220 o Réactif supplémentaire CDT (réf. OPCS), n° lot : 110320 o Réactif supplémentaire L (réf. OQTD), n° lot : 169446 o Diluant (réf. OUMT), n° lot : 11261441, 11261427 et 11261460 o Tampon de réaction (réf. OUMS), n° lot : 1125728

• Contrôles : o CDT contrôle 1 (réf. OPCS), n° lot : 110520 o CDT contrôle 2 (réf. OPCS), n° lot : 110620 o Contrôle protéine bas (réf. OQIN), n° lot : 084631 et 084630 o Contrôle protéine moyen (réf. OQIO), n° lot : 084734 o Contrôle protéine haut (réf. OQIP), n° lot : 084832

• Standards : o Standard CDT SL (réf. OPCS), n° lot: 110420 o Standard protéine SL (humain) (réf. OQIM), n° lot : 083689 et 083687

• Echantillons de sérum frais et congelé (n=36)

• Matériel standard de laboratoire


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Méthode : [2]

Il s’agit d’une méthode de compétition entre la CDT présente dans l’échantillon et les particules de polystyrène recouvertes de CDT. Les anticorps anti-CDT présents dans le réactif CDT 2 se fixent aussi bien à la CDT du patient qu’à celle du premier réactif. Plus les anticorps anti-CDT s’agglutinent avec la CDT présente sur les billes de polystyrène, plus la lumière est déviée, moins la concentration de CDT chez le patient est élevée. C’est une réaction inversement proportionnelle au signal lumineux. Le résultat est calculé grâce à une courbe de calibration.

Pour le dosage de la transferrine la lumière est déviée par le complexe immun formé de la transferrine présente dans l’échantillon et un anticorps anti-transferrine spécifique.

Calcul du pourcentage CDT :

CDTlmgneTransferri

lmgCDT %100*)/(

)/(=

Exemples : Échantillon n°08522811 : %06.1100*2550

1.27=

Échantillon n°14528911 : %39.7100*2940217

=


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Résultats :

Corrélation avec la méthode de référence : [6]

Pour effectuer une corrélation, il faut utiliser au moins 20 échantillons, ici 36 sont testés. La totalité du domaine physiologique doit être couverte, c’est-à-dire qu’il faut avoir des valeurs basses, moyennes et hautes. Les échantillons sont dosés avec la méthode de référence (HPLC) et la nouvelle méthode (immunonéphélémétrie).

N° Lab. Méthode de

Référence Nouvelle Méthode Différences

1 8528411 1.0 1.6 -0.6 2 11514911 1.2 1.6 -0.4 3 8529111 1.3 1.9 -0.3 4 10540611 1.3 1.7 -0.4 5 12516911 1.1 1.6 -0.5 6 8522811 0.8 1.1 -0.3 7 8525811 10.1 5.5 4.6 8 8526611 3.6 2.8 0.8 9 8528011 0.8 1.0 -0.2 10 8526311 2.1 2.1 0 11 15519111 0.9 1.6 -0.7 12 19510711 10.2 6.8 3.4 13 15519411 6.1 4.5 1.6 14 15532011 1.6 2.0 -0.4 15 5524911 1.1 1.4 -0.3 16 6504211 2.1 2.0 0.1 17 21527511 0.8 1.5 -0.7 18 14511511 1.4 1.8 -0.4 19 17538311 0.8 1.4 -0.6 20 14532311 1.9 2.6 -0.7 21 17514111 1.5 2.0 -0.5 22 15535211 3.0 1.9 1.1 23 15540411 2.2 2.5 -0.3 24 17522811 0.7 1.5 -0.8 25 17533211 0.6 0.9 -0.3 26 17528011 1.4 1.9 -0.5 27 17538411 2.3 1.8 0.5 28 18512611 2.4 2.2 0.2 29 18519911 1.6 1.4 0.2 30 18510311 0.7 1.4 -0.7 31 21525211 <0.5 1.5 - 32 10537711 pas dosable* 1.4 - 33 14528911 15.1 7.4 7.7 34 20506511 33.0 17.5 15.5 35 22536511 14.9 7.1 7.8 36 19505111 6.4 4.7 1.7

*Echantillon comportant un variant génétique.


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Répétabilité : [6]

Les dosages s’effectuent pour le même paramètre du même échantillon dans des conditions standardisées (numéro de lot des réactifs, calibration, flacon de diluant, utilisateur, température). Ces tests s’effectuent lors d’une même série en utilisant si possible plusieurs niveaux de concentration (bas, moyen, haut). Le paramètre est dosé 3 à 4 fois sur les échantillons sélectionnés. Ensuite, on détermine la moyenne, l’écart type et le CV, celui-ci est comparé avec le CV donné par le fabriquant.

N°Lab Run1 Run2 Run3 Run4 Moyenne CV%

19510711 6.78 6.31 6.44 6.03 6.39 4.22 CDT 1 1.81 1.78 1.75 1.84 1.80 1.86 CDT 2 5.50 5.30 5.00 4.92 5.18 4.49

15505011 1.40 1.47 1.49 1.56 1.5 3.9 Calcul du CV moyen : 3.6% CV annoncé par le fabriquant : 7.6%

Le CV moyen trouvé est meilleur que celui donné par le fournisseur, on peut donc considérer la répétabilité dans ces conditions de travail comme bonne pour ce paramètre.

Reproductibilité : [6]

Les dosages s’effectuent pour le même paramètre du même échantillon dans des conditions différentes (numéro de lot des réactifs, calibration, flacon de diluant, utilisateur, température). Ces tests s’effectuent en général lors de différentes séries sur plusieurs jours. Il est conseillé de prendre différents niveaux de concentration (bas, moyen, haut). Le paramètre est dosé 3 à 4 fois sur les échantillons sélectionnés. Ensuite, on détermine la moyenne, l’écart type et le CV, celui-ci est comparé avec le CV donné par le fabriquant.

N°Lab. Run1 Run2 Run3 Run4 Moyenne CV%

19510711 7.1 6.5 6.7 6.5 6.7 3.8 CQ 6.1 5.7 6.3 5.8 6.0 3.6

CDT 1 1.9 2.0 1.8 1.8 1.89 3.50 CDT 2 4.8 5.3 5.7 5.4 5.28 6.14

Calcul du CV moyen : 4.3% CV annoncé par le fabriquant : 4.9% Le CV moyen trouvé est meilleur que celui annoncé par le fournisseur, la reproductibilité peut donc être considérée comme bonne, pour ce paramètre et dans ces conditions de travail.


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Limite de détection : [6]

Ce test permet d’établir la quantité minimale détectable par l’automate par rapport au blanc.

Pour mesurer cette valeur, on utilise ici le diluant du fabriquant que l’on passe 4 fois. La moyenne est calculée. Ici nous allons mesurer cette limite de détection sur les deux paramètres permettant le calcul du %CDT, respectivement la transferrine et la CDT. Car le calcul du %CDT sur du diluant est impossible car les deux paramètres seront rendus indosables.

CDT Transferrine

Valeur

mesurée (mg/l)

Valeur mesurée

(mg/l) 1 20.4 80 2 20.4 80 3 20.4 80 4 20.4 80

Moyenne 20.4 80 Les limites de détection annoncée :

• CDT→20 mg/l • Transferrine→90 mg/l

On observe que les valeurs mesurées sont très proches des valeurs annoncées par le fournisseur, ce qui nous permet de dire que nos résultats pour ce test sont bons.

Contamination : [6]

Ce test sert à vérifier si le rinçage de l’automate est efficace, pour ce test on commence par rincer l’appareil, ensuite on mesure un échantillon avec une valeur élevée en triplicata, suivi d’un échantillon avec une valeur basse en triplicata également.

Valeur Haute Valeur Base

1 8.13 1.18 2 7.99 1.3 3 7.8 1.34

Calcule de la contamination : 6.5% Il faut comparer la contamination calculée avec le CV en % de la répétabilité donnée par le fournisseur, qui est de 7.6%. Dans notre cas, notre résultat est meilleure que celui donnée par le fabriquant, elle peut donc être considérée comme bonne.


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Biais : [6]

Pour ce test, on peut utiliser un contrôle qualité (CQ) externe comme échantillon, la valeur vraie de cet échantillon étant la moyenne des résultats trouvés par les autres laboratoires ayant fait l’analyse. Il est également possible de prendre un standard d’un autre numéro de lot, vu qu’on connaît la concentration des standards. Ici, nous avons utilisé un CQ du Centre Suisse de Contrôle de Qualité (CSCQ).

N°Lab. 1 2 3 4 Valeur cible CV en %

CQ 6.1 5.7 6.3 5.8 5.9 1.0 Le résultat à été envoyé au CSCQ, et le rapport d’enquête pour cette analyse a été qualifié comme excellent (cf. Annexe 1 « Rapport du CSCQ »).

Linéarité : [6]

On effectue des dilutions à partir d’échantillons avec des valeurs élevées pour vérifier la linéarité et les limites analytiques supérieures et inférieures de la méthode.

Le rapport du %CDT ne devrait pas changé, car il est calculé en fonction de la transferrine et de la CDT qui sont tout deux dilués de la même manière. On peut également vérifier la linéarité et de la transferrine (g/l) et de la CDT (mg/l) séparément.

Dilutions N°Lab. Pur 1/2 1/4 1/8

8525811 5.50 6.49 7.50 8.22 19510711 6.12 6.93 7.69 8.36


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Graphique de la linéarité du %CDT : On constate : plus la dilution est haute, plus la valeur du %CDT augmente. Cela peut être dû à un excès d’antigène. Le nombre d’anticorps est constant, vu que la quantité de réactif est toujours la même, en diluant on diminuerait le nombre d’antigène, ce qui permet que tout les antigènes soient captés par un anticorps, donc il n’y a plus d’antigène libre. Ce qui explique une augmentation du %CDT.

Figure 8

0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.00

0 2 4 6 8 10


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Graphique de linéarité de la transferrine [g/l] :


8525811 2.87 1.62 0.84 0.44 19510711 2.45 1.25 0.62 0.29

Les dilutions sont assez bonnes, les valeurs sont environ divisées par deux, sauf pour le passage des titres 1 à 2.

Figure 9

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

0 2 4 6 8 10


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Graphique de la linéarité de la CDT [mg/l] :


8525811 159.0 105.0 62.8 35.8 19510711 150.0 86.5 47.5 27.6

Figure 10

0.0

20.0

40.0

60.0

80.0

100.0

120.0

140.0

160.0

180.0

0 2 4 6 8 10


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Sensibilité et spécificité : [7]

On appelle vrai positif (VP) un échantillon qui est trouvé positif avec les deux méthodes utilisées. Alors que l’on qualifie un échantillon de vrai négatif (VN) s’il est mesuré négativement avec les deux méthodes également.

Les faux négatifs (FN), sont les échantillons trouvés positifs avec la méthode de référence, et négatif avec la méthode à comparer. A l’inverse, un échantillon négatif avec la méthode de référence et positif avec la nouvelle, est un faux positif (FP).

Il est aussi possible de calculer les valeurs prédictives positives et négatives, ainsi que la prévalence.

HPLC Positif HPLC Négatif N Latex Positif 8 (VP) 2 (FP) N Latex Négatif 1 (FN) 23 (VN)

Sensibilité : C’est le rapport des vrais positifs sur le total des échantillons trouvés positifs avec la méthode de référence.

ésensibilitFNVP

VP=

+100*

%89100*18

8=

+

Sensibilité annoncée par le fournisseur : 93% On constate que nous trouvons une sensibilité légèrement inférieure à celle de Siemens, cela peut être dû à notre faible nombre de résultats positifs mesurés dans cette étude. En effet, le fournisseur à calculé ces valeurs sur 200 échantillons et nous seulement sur 36. On peut donc la considéré comme bonne.

Spécificité : C’est le rapport des vrais négatifs sur le total des échantillons trouvés négatifs avec la méthode de référence.

éspécificitFPVN

VN=

+100*

%92100*223

23=

+

Spécificité annoncée par le fournisseur : 97% Nous obtenons une spécificité légèrement inférieure à celle donnée par Siemens, cela peut être dû à notre petit nombre d'échantillons testés. Cependant, elle peut être considérée comme bonne.


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Valeur prédictive positive : c’est le pourcentage d’échantillons vrais positifs par rapport au total d’échantillons trouvés positifs.

100*FPVP

VP+

%80100*28

8=

+

Valeur prédictive négative : c’est le pourcentage d’échantillons vrais négatif par rapport au total d’échantillons trouvés négatifs.

100*FNVN

VN+

%96100*123

23=

+

Prévalence : c’est le pourcentage d’échantillons trouvés positifs par rapport à la totalité des échantillons testés.

100*FNVNFPVP

FNVP+++

+

%5.26100*12328

18=

++++


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Variant génétique : Le dosage de la CDT chez des patients présentant un variant génétique de la transferrine est possible.

Exemple :

Echantillon n°10537711, le dosage en HPLC est impossible, car le pic de la fraction de transferrine disialylée [a] chevauche celui de la trisialylée [b], le pic [c] représentant la transferrine tétrasialylée, il n’est donc pas possible de distinguer les deux isoformes, alors que sur les chromatogrammes de la figure 6 (page 10) les deux pics sont bien distincts. Par contre le dosage sur le même sérum par néphélométrie nous donne une valeur à 1.36 %.

Figure 11 : Chromatogramme chez un patient présentant un variant génétique

b

a

c


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Interprétation des résultats : Dans le but d’interpréter ces résultats, nous avons tracé plusieurs graphiques. Ceux-ci vont nous permettre notamment de déterminer le coefficient de corrélation, la régression selon Passing-Bablock, mais aussi le diagramme des rapports et celui des différences.

Régression selon Passing-Bablok :

Ce graphique nous permet de mettre en évidence la corrélation entre les deux méthodes. C'est-à-dire, que l’on reporte sur le graphique les valeurs trouvées pour les 34 échantillons testés (les 2 derniers n’ayant pas de valeur pour la méthode de référence), avec en ordonnée la méthode de référence et la méthode à tester en abscisse. Les lignes vertes représentent les normes pour chacune des méthodes, sous les 2 lignes le résultat est négatif ; entre les deux, il est considérer douteux, et en-dessus le résultat est positif.

On utilise la régression selon Passing-Bablok plutôt que la régression linéaire. La première convient mieux aux comparaisons de méthodes, car elle présente l'intérêt d'une bonne fiabilité aux données extrêmes. Alors que la deuxième convient mieux aux situations d’étalonnages que de comparaison.

Figure 12

Diagramme de dispersion avec régression selon Passing-Bablok

y = 0.522x + 1.002R2 = 0.991

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0

HPLC

BN

Pro

spec


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Ce graphique est un « zoom » sur les valeurs basses du graphique précédent, compris entre 0.0 et 8.0%. Il nous permet de mieux ce rendre compte de ce qu’il se passe à proximité des valeurs de référence. L’équation de la droite est la suivante : y = 0.522x + 1.002 Dans l’idéal elle devrait être de la forme y = 1x + 0 Le coefficient de corrélation (R2) est le suivant :

R2 = 0.991 Dans l’idéal il devrait être égal à 1. Le coefficient de corrélation nous indique si notre équation de la droite est forte ou pas, plus notre R2 est proche de 1, plus l’équation est forte. Ici notre valeur est très proche de la valeur idéale, donc notre équation est forte.

Figure 13

Diagramme de dispersion avec régression selon Passing-Bablok

y = 0.522x + 1.002R2 = 0.991

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0

HPLC

BN P

rosp

ec


- 26 -

Diagramme des rapports :

Ce diagramme est construit à partir du tableau de corrélation, les valeurs obtenues avec la nouvelle méthode sont divisées avec celles obtenues par HPLC.

En théorie, on devrait avoir des points répartis de manière aléatoire de part et d’autre de la moyenne et compris entre les 2 limites des +/- 2 écarts types (SD).

Diagramme des rapports

-2 SD

Moyenne

+2 SD

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0

HPLC

BN P

rosp

ec/H

PLC


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Diagramme des différences :

Ce graphique est construit à partir du tableau de corrélation, les points sont calculés en soustrayant les valeurs mesurées avec la nouvelle méthode à celles trouvées avec la méthode de référence. Ceci nous permet de constater que plus la valeur du %CDT est élevée, plus le résultat est sous-estimé avec la nouvelle méthode sur le BN Prospec®.

En théorie on devrait avoir des points répartis de manière aléatoire de part et d’autre de la moyenne et compris entre les 2 limites des +/- 2 écarts types (SD).

Figure 15

Diagramme des différences

-2 SD

+2 SD

Moyenne

-10

-5

0

5

10

15

20

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0

HPLC

HPLC

-BN

Pro

spec


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Conclusion

Ce travail a pour but la validation du dosage en routine de la Transferrine Déficiente en Carbohydrate sur BN Prospec®, en comparaison avec la méthode de référence, l’HPLC.

Résumé de l’ensemble des résultats :

1. La répétabilité est bonne à 3.6%. 2. La reproductibilité est bonne à 4.3%. 3. La contamination d’un échantillon à un autre est acceptable à 6.5%. 4. Les limites de détection de la CDT et de la transferrine correspondent à celle du

fournisseur. 5. La sensibilité est bonne à 89%. 6. La spécificité est bonne à 96%. 7. La néphélémétrie permet de doser un certain type de variant génétique qu’il n’est pas

possible de doser avec l’HPLC. Suite à cette comparaison de méthodes, le dosage du %CDT sera mis en place dans le laboratoire de FutureLab BBR de Lausanne.

Lors des analyses plusieurs difficultés sont survenues, notamment avec la stabilité des réactifs et des contrôles à bords de l’automate qui est réfrigéré. Il s’est avéré que leur stabilité, lorsqu’ils restaient chargés sur l’appareil, était plus courte que celle annoncée par le technicien de chez Siemens. Pour résoudre ce problème, nous avons alors pris la décision d’enlever les réactifs et les contrôles à chaque fin de journée de travail.

Autre difficulté, celle d’obtenir des échantillons de sérum frais positifs, il a donc fallu en décongelés depuis la sérothèque du laboratoire, c’est pour cette raison que nous n’avons pas utilisé de sérum frais.

Dans l’ensemble, les valeurs sont sous-estimées, et celle-ci augmente pour des résultats élevés de %CDT. Cependant, cela n’est pas dérangeant pour le suivi des patients, car les valeurs précédentes (antériorité) sont connues.


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Personnellement ce travail m’a beaucoup appris sur les comparaisons de méthodes, mais également sur la mise en place d’un nouvel automate en routine. En effet, le BN Prospec® est arrivé au laboratoire le jour où j’ai commencé mon stage chez FutureLab et j’ai effectué la quasi-totalité des corrélations pour tous les paramètres dont voici la liste

• %CDT • Haptoglobine • Sous classes IgG (IgG1, IgG2, IgG3 et IgG4) • Kappa et Lambda urinaire • IgG urinaire • Alpha-1-microglobuline urinaire • Lipoprotéine (a) • Antistreptolysine O (ASL) • Anti-DNase B streptococcique (ASD) • Ceruloplasmine

Il m’a également été possible d’assister à la mise en ligne, « on-line », de l’automate.


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Remerciements

• M Druon Jean-Michel, biologiste et corresponsable de mon travail de diplôme

• Mlle Cipolli Mercedes, technicienne en analyses biomédicale et corresponsable de mon travail de diplôme.

• Dr Augsburger Marc, responsable opérationnel de l’Unité de Toxicologie et de Chimie Forensiques, Centre Universitaire Romand de Médecine Légale.

• Mmes Liniger Corinne, Burgener Bénédicte et Monti Véronique pour leur soutien durant la réalisation de mon travail de diplôme.

• Mlle Jeanneret Sarah, communicatrice multilingue, pour la relecture et l’aide à la traduction anglaise du résumé.


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Bibliographie :

Texte :

[1] : http://www.labolecerf.fr/pro/cdt.htm, mis en ligne le 01.06.2003, consulté le 10.11.2010

[2] : Protocole d’utilisation N Latex CDT Kit, Siemens Healthcare Diagnostics Product Gmbh, Edition Mai 2009.

[3] : Protocole d’utilisation N Antisérum anti-Transferrine et Haptoglobine humaines, Siemens Healthcare Diagnostics Product Gmbh, Edition Juin 2008.

[4] : Chromatographie liquide haute performance, http://www.ac-nancy-metz.fr/enseign/physique/chim/jumber/pdf_chimie/HPLC.pdf, crée le 24.09.2004, consulté le 07.02.2011.

[5] : S Temple, Manuel de formation BN Prospec®, page 71, révision Janvier 2008.

[6] : 42 GS Lignes directrices pour l’évaluation de méthodes, Groupe AMS, crée le 12.05.2009.

[7] : A.Aelling, Cours de calcul statistique et de contrôle de qualité, édition 1997.

[8] : Directive pour le contrôle de qualité interne, site de la Qualab, http://www.qualab.ch/qualab_iqc_v2_3_f_20101129.pdf, version 2.3 crée le 29.11.2010, consulté le 07.02.2011


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Illustrations :

Figure 1 : Répartition des laboratoires d’AMS en Suisse, http://www.futurebiolab.ch/site/index.cfm?id_art=68006&actMenuItemID=15666&vsprache/FR/Un_partenaire_experimente_%C3%A0_.cfm, consulté le 22.03.2011.

Figure 2: Schéma d’une molécule de transferrine pentasialylée, F. Pourignaux, http://www.rsv-gnw.ch/fr/ichv/DocumentationDoc/2004_04_CDT_RR_F.pdf, consulté le 22.03.2011.

Figure 3 : Structure des isoformes de la transferrine présente dans le sérum. Les points représentent les acides sialiques terminaux. D’après Landberg et al. http://www.jle.com/fr/print/e-docs/00/00/C4/7F/article.phtml?fichier=images.htm, consulté le 01.02.2011.

Figure 4 et 365 : Schéma du faisceau lumineux sur BN Prospec®, S Temple, Manuel de formation BN Prospec®, page 73, révision Janvier 2008.

Figure 5 : Chromatographie liquide haute performance, http://www.ac-nancy-metz.fr/enseign/physique/chim/jumber/pdf_chimie/HPLC.pdf, crée le 24.09.2004, consulté le 07.02.2011.

Figure 6 : Chromatogrammes, http://www.recipe.de/en/products_hplc_diagn_21000.html, consulté le 10.02.2011.

Figure 8, 9, 10, 12, 13, 14 et 15 : Fichier Excel cdt(2), crée le 5.12.2008, modifié le 21.02.2011.

Figure 11: Measurement of Carbohydrate Defi cient Transferrin (CDT) with Capillarys system from Sebia, compared with Immunoassay quantifi cation from Axis-Shield, fichier PDF, http://www.furst.no/pdf/sissel_h.pdf, crée le25.09.2007, consulté le 3.03.2011


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Lexique :

• HPLC : Chromatographie liquide haute performance ou Chromatographie liquide à

haute pression.

• Qualab : Commission suisse pour l’assurance qualité dans le laboratoire médical.

• Variant génétique : C’est une mutation, une transformation, d’une partie de l’ADN codant pour la synthèse d’une protéine, ce qui entraîne un changement chez ladite protéine, soit dans sa forme, soit dans sa fonction.

• AMS : Analyses Médicales Service.

• CDT : Transferrine déficiente en carbohydrate.


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Annexes:

Annexe 1: Rapport du CSCQ


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Annexe 2: Feuilles de résultats du BN Prospec®


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Annexe 3 : Courbes de calibration


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Annexe 4 : Insert


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comparaison de méthodes pour le dosage de la transferrine...

Documents