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LABORATOIRE DE DIAGNOSTIQUE DE L’INSTITUT DE MICROBIOLOGIE DU CHUV
Les secrets de la méthode des 4 quadrants Jérémy Pittet & Valentin Loup
Mme Maria Senra Ortiz, Dr. Antony Croxatto & Dr. Guy Prod’hom
12/03/2014
Ecole Supérieure de la Santé, Lausanne
Figure 1 : Staphylococcus aureus
2
Sommaire
La méthode d’ensemencement en quatre quadrants est la méthode de référence pour la plupart des
prélèvements en microbiologie. Elle permet à la fois une estimation semi-quantitative du nombre de
germes contenus dans un prélèvement et l’obtention de colonies isolées. Le principe est un
épuisement séquentiel du matériel de départ.
L’automatisation des ensemencements au moyen du WASPI (Walk Away Specimen Processor)
permet d’obtenir une reproductibilité des mises en culture et représente ainsi une opportunité pour
l’investigation de cette méthode d’ensemencement.
Lors de notre stage de six mois au sein de l’institut de Microbiologie du CHUV, notre travail de
diplôme a permis de tester les limites de cette méthode.
Lors de ce travail nous avons souhaité :
Visualiser la répartition des germes sur un milieu solide ensemencé avec la méthode des 4
quadrants
Comparer 2 méthodes d’ensemencements en 4 quadrants disponibles sur le WASP.
Etablir une corrélation entre la méthode semi-quantitative des 4 quadrants et
l’ensemencement quantitatif.
Mots clés :
WASP Technique Quatre Quadrants Quantitative
I Pour tous les mots en rouge, se rapporter au « Lexique »
3
Abstract
The four quadrant streak pattern is one of the reference methods for samples inoculation on agar
plate in microbiology. It allows both a semi-quantitative estimation of the number of colony-forming
unit of a microbe in a sample and the obtention of individual colonies.
The automated streaking using the WASP, allows a reproductibility of the inoculation and represent
an opportunity for the investigation of this streaking methods.
During our six month training in the Institute of Microbiology of the Lausanne University Hospital
(CHUV), the goal of our diploma works was to test the limits of this method.
During this work we wished:
To monitor the distribution of bacteria plated with the four quadrant streak.
To compare two four quadrant streaking methods available in the WASP.
To investigate the correlation between the semi-quantitative four quadrant streaking method
and the quantitative seeding method.
Keys words:
WASP Streaking Four Quadrant Quantitative
4
TABLES DES MATIERES
1. INTRODUCTION : ............................................................................................................. 6
1.1 Historique de l’isolement .............................................................................................. 6
1.2 La méthode en 4 quadrants : ........................................................................................ 7
1.3 Autres méthodes d’ensemencement : ........................................................................... 8
1.4 L’ensemencement automatisé en microbiologie ........................................................... 9
1.4.1 Les ensemenceurs : ................................................................................................ 9
1.4.2 L’InoqulA : .............................................................................................................. 9
1.4.3 Le Previ-isola ........................................................................................................ 10
1.4.4 Le WASP : ............................................................................................................. 11
2. BUT : ............................................................................................................................. 12
3. MATÉRIEL ET MÉTHODE : .............................................................................................. 12
3.1 Matériel : .................................................................................................................... 12
3.1.1 Les souches ATCC: ................................................................................................ 12
3.1.2 Les milieux de culture : ........................................................................................ 12
3.1.3 Module d’acquisition d’images : .......................................................................... 14
3.2 Les mises en culture du WASP: .................................................................................... 14
3.2.1 La méthode des 4 quadrants Q3 : ........................................................................ 14
3.2.2 La méthode des 4 quadrants Q4 : ........................................................................ 14
3.2.3 La méthode quantitative2 H1: .............................................................................. 15
3.2.4 Le McFarland 0.5, les dilutions et les contrôles : ................................................. 15
3.2.1 La préparation des inoculum polymicrobiens ...................................................... 17
3.3 Déroulement de l’étude .............................................................................................. 18
4. RÉSULTATS : .................................................................................................................. 19
4.1 Test 1 : avec stérilisation ............................................................................................ 19
4.2 Test 1 : sans stérilisation ............................................................................................. 23
4.3 Test 2 : mélange de germe .......................................................................................... 28
4.4 Test 3 : limite supérieure de la méthode ..................................................................... 32
4.5 Test 4 : échantillons cliniques ..................................................................................... 36
5. DISCUSSION : ................................................................................................................ 40
5.1 1ère partie : comparaison des 4 quadrants .................................................................. 40
5.2 2ème partie mixes à différentes concentration ............................................................. 41
5
5.3 3ème partie limite de la méthode ................................................................................. 42
5.4 4ème Echantillons cliniques .......................................................................................... 42
5.5 Variations ................................................................................................................... 42
5.6 Observations ......................................................................... Erreur ! Signet non défini.
5.7 Proposition d’améliorations : ...................................................................................... 46
6. CONCLUSION ................................................................................................................ 47
7. COÛTS ........................................................................................................................... 48
8. REMERCIEMENTS .......................................................................................................... 49
9. BIBLIOGRAPHIE ................................................................... ERREUR ! SIGNET NON DEFINI.
10. TABLE DES ILLUSTRATIONS ............................................................................................ 51
11. REFERENCES ICONOGRAPHIQUES.................................................................................. 54
13. LEXIQUE : ...................................................................................................................... 55
14. GLOSSAIRE : .................................................................................................................. 56
15. ANNEXES : ..................................................................................................................... 57
6
1. Introduction :
1.1 Historique de l’isolement
La mise en culture par la méthode des 4 quadrants est appliquée dans la plupart des laboratoires de
microbiologie mais son origine est difficile à identifier. En effet dans un article rédigé par le
microbiologiste Robert Koch1 en 1881 il est déjà mentionné que pour étudier les bactéries il faut
auparavant obtenir des cultures pures. Ces cultures pures doivent être obtenues à partir de
l’ensemencement d’une colonie isolée représentant une souche bactérienne, sur un nouveau milieu
solide. Afin d’obtenir des colonies isolées, les microbiologistes se sont aperçus qu’il était nécessaire
de diluer la concentration bactérienne par épuisement en étalant le matériel sur le milieu solide afin
d’obtenir un gradient décroissant de germes.
La première version illustrée de la méthode en 4 quadrants que nous avons retrouvée est celle
décrite par les scientifiques Pelczar et Reid1 en 1958.
Ils y décrivent l’ensemencement du 1er quadrant par quatre stries unidirectionnelles
à l’aide d’une anse.
Ensuite, ils stérilisent celle-ci avant d’effectuer les trois autres quadrants toujours
en effectuant quatre à cinq stries unidirectionnelles, sans effectuer d’aller-retour.
Ils illustrent par cette méthode l’importance de la stérilisation après l’ensemencement du 1er quadrant
car la plupart du temps celui-ci est recouvert de colonies confluentes et la stérilisation de l’anse
permet de répartir le matériel sur les trois autres quadrants et d’obtenir des colonies isolées même
lors de prélèvements avec une forte concentration de bactéries.
La méthode en 4 quadrants n’a pas vraiment évolué depuis cette date, si ce n’est par le fait que l’on
effectue des stries en zigzags plutôt qu’unidirectionnelles et en plus grand nombre sur chaque
quadrant. En effet, cette méthode reste encore à l’heure actuelle celle de référence afin d’obtenir des
colonies isolées même à forte concentration bactérienne.
7
1.2 La méthode en 4 quadrants :
Cette méthode est utilisée pour la plupart des prélèvements car elle va permettre d’obtenir des
colonies isolées des différents germes. Elle permet d’avoir une estimation semi-quantitative de la
quantité des germes contenus dans les divers prélèvements. Le premier quadrant est réalisé en
effectuant des zigzags sur le quart de la gélose avec une quantité variable de prélèvement, puis
l’anse est stérilisée avant l’ensemencement des 3 autres quadrants2.
La répartition des germes sur le milieu de culture est ensuite évaluée en « + » suivant leur répartition
sur les différents quadrants :
Nombre de colonies dans les quadrants Grade Estimation semi-quantitative 1erquadrant 2ème quadrant 3ème quadrant 4ème quadrant
Quelques - - - + Faible
Tapis >5 - - ++ Modérée
Tapis >5 >5 - +++ Forte
Tapis >5 >5 >5 ++++ Forte
Figure 4 : Répartition sur 3 quadrants forte
Figure 2 : Répartition sur le
1er
quadrant quantité
faible
Figure 5 :Répartition sur 4 quadrants forte quantité
Figure 3 : Répartition sur le
1er
et 2ème
quadrants
(minimum 5 colonies) quantité modérée
1er
quadrant
3ème
quadrant
4ème
quadrant
2ème
quadrant
8
1.3 Autres méthodes d’ensemencement :
Il existe d’autres types d’ensemencements adaptés à des prélèvements spécifiques comme le LCR
(liquide céphalo-rachidien), l’ensemencement du liquide de sonicationII des prothèses et la méthode
quantitative.
Ensemencement du LCR : la méthode consiste à déposer 4 gouttes sur
une gélose à l’aide d’une pipette pasteur stérile. Cette méthode présente
les avantages suivants : i) ensemencement d’un volume plus important
(4x ~50 microlitres) ce qui permet de concentrer les germes ii)
visualisation d’éventuelles contaminations par la croissance de colonies
en dehors des gouttes.
Ensemencement de liquide de sonication de prothèse : la mise en culture du biofilm lors
d’infection de prothèse est précédée par une étape de sonication. La
prothèse est plongée dans une solution de PBS contenue dans un
récipient plastique. L’ensemble est soumis à une sonication pour détacher
le biofilm bactérien de la prothèse. On prélève ensuite 100 µl du PBS
contenant désormais les germes, que l’on étale sur un milieu de culture
solide à l’aide d’un râteau. Une fois la plaque incubée on compte le nombre
de colonies par géloses, afin d’exprimer le résultat final en nombre de
germes par millilitre ce qui en fait une méthode quantitative.
Ensemencement quantitatif2 : C’est la méthode utilisée en routine pour les prélèvements
urinaires, les lavages broncho-alvéolaires et les biopsies des patients
brûlés. La quantification bactérienne pour ces prélèvements est
essentielle à l’interprétation du résultat. Dans les urines une concentration
égale ou supérieure à 105 est généralement considérée comme
pathologique3. L’ensemencement par le WASP se fait par le dépôt de
10µl de matériel sur la gélose qui est ensuite tiré jusqu’au tiers de la
gélose puis des stries sont effectuées du haut jusqu’en bas du milieu. Les
résultats sont ensuite interprétés en comparaison avec des chablons (cf.
annexes) correspondant à une série de concentrations connues. A noter
que lors de l'ensemencement manuel conventionnel, le matériel est tiré sur la totalité de la
gélose avant d'effectuer des stries de haut en bas.
II Pour tous les mots en rouge, se rapporter au « Glossaire »
Figure 6 : Culture du LCR
Figure 7 : Sonication
Figure 8 : Méthode quantitative
9
1.4 L’ensemencement automatisé en microbiologie
Contrairement à la plupart des laboratoires d’analyses médicales, l’automatisation des activités de
bactériologie est encore limitée. Seules des activités spécifiques comme la détection des
hémocultures positives et la lecture d’antibiogrammes sont automatisées depuis plusieurs années.
Récemment, un nouveau type d’automate destiné à la mise en culture des échantillons cliniques a
été commercialisé. L’automatisation doit permettre de répondre à une demande accrue d’analyses
sans ressource en personnel supplémentaire.
1.4.1 Les ensemenceurs :
Les ensemenceurs automatiques sont devenus indispensables dans un laboratoire de routine en
microbiologie, car ils vont permettre d’assumer une activité répétitive sans valeur ajoutée pour le
personnel tout en maintenant la qualité du service. Ces automates ont comme points forts :
i) une haute cadence d’ensemencement
ii) une bonne reproductibilité de l’activité (indispensable pour les méthodes quantitatives).
Il existe différents modèles d’ensemenceurs sur le marché dont voici quelques exemples.
1.4.2 L’InoqulA :
Cet automate est produit par la maison BD Kiestra . La spécificité de celui-ci provient du fait qu’il
ensemence les prélèvements par l’intermédiaire d’une bille magnétique qui va se déplacer et repartir
les germes sur l’ensemble de la gélose en suivant une trajectoire bien précise en zigzag.
Figure 10 : Automate InoqulA de BD Kiestra Figure 9 : Isolement par l’InoquIA de BD Kiestra
10
1.4.3 Le Previ-isola
Le Previ-isola est un automate commercialisé par la maison BioMerieux®. Sa technique
d’ensemencement utilise un peigne tournant à 360°C, répartissant les germes sur toute la gélose.
Cette technique permet d’obtenir plus facilement un plus grand nombre de colonies isolées à partir
d’un prélèvement ainsi qu’une quantification depuis des chablons de référence.
Figure 11 : L’isolement du Previ-Isola Figure 12 : Le peigne du Previ-Isola
11
1.4.4 Le WASP :
Le WASP produit par la maison COPAN® est actuellement l’automate utilisé à l’Institut de
Microbiologie du CHUV. C’est un automate permettant l’ensemencement sur plusieurs milieux de
cultures et le dépôt de matériel sur des lamesa qui seront ensuite colorées au Gram.
Le WASP reproduit à l’identique le travail que ferait un technicien manuellement, c’est-à-dire à l’aide
d’une anse stérile avec laquelle il dépose 10µl de matériel et effectue des stries sur la totalité de la
gélose. L’avantage du WASP est la possibilité de programmer plusieurs méthodes (pattern)
d’ensemencements depuis un ordinateur relié à celui-ci. Il s’agit donc d’un automate flexible et
personnalisable. Cet automate possède un carrousel comprenant 9 compartiments séparésb où l’on
peut placer des milieux solides différents et ainsi ensemencer plusieurs géloses pour un même
prélèvement.
Pour pouvoir ensemencer les prélèvements avec le WASP, il faut qu’ils soient contenus dans un tube
COPAN car les bras automatiquesc de l’appareil sont calibrés pour ceux-ci. En effet, on charge les
tubes COPAN sur un tapis roulantd et un bras mécanique va prendre un à un chaque tube pour
l’ensemencement. Les milieux solides ressortent ensuite sur le tapis de distributione.
d
c
b a
c
e
Figure 13 : Le Wasp
12
2. But :
Cette étude a pour but de répondre à 3 objectifs distincts :
1. La méthode automatisée des 4 quadrants est-elle quantitative?
2. Comparer les deux différentes méthodes des 4 quadrants disponibles sur le WASP, en termes
de quantification et d’obtention de colonies isolées.
3. Quels sont les avantages de la méthode en 4 quadrants en comparaison avec la méthode
quantitative.
3. Matériel et méthode :
3.1 Matériel :
3.1.1 Les souches bactériennes:
Pour le déroulement de notre travail, nous avons testé nos méthodes avec 4 souches bactériennes
différentes. Des souches de référence ATCC (American type culture collection) et une souche
clinique :
Escherichia coli (Esccol) ATCC 25922
Staphylococcus aureus (Staaur) ATCC 29213
Enterococcus faecalis (Etcfec) ATCC 29212
Klebsiella pneumoniae (Klepne) souche clinique
Ces souches ont été choisies car elles ont une croissance rapide (moins de 24 heures) à 37°C et
sont fréquemment isolées des échantillons cliniques.
3.1.2 Les milieux de culture :
Pour notre étude nous avons ensemencé les germes sur deux géloses différentes :
Gélose Columbia4 :
Le milieu de Columbia est un milieu riche où la plupart des germes exigeants vont pousser. Ce
milieu est composé de sang de mouton (5%), de NaCl, d’agar, d’amidon et de peptones. Les
peptones vont faciliter la croissance des germes, tandis que l’amidon va apporter une source
d’énergie. Le sang de mouton va permettre la mise en évidence des différentes hémolyses et
apporter également l’hémine (facteur X) qui est indispensable pour la croissance de certaines
bactéries.
13
Gélose USB (Urine Screening of Bacteria):
Ces géloses chromogènes sont utilisées en routine pour tous les prélèvements urinaires. Elles
permettent la mise en évidence de trois activités enzymatiques que sont la β-galactosidase (rose), la
tryptophane déaminase (brune) et la β-glucosidase (bleu).
Nous avons utilisé ce milieu pour mieux visualiser les différents germes lors de nos ensemencements
polymicrobiens. En effet les différents germes vont ressortir avec des couleurs bien distinctes sur la
gélose :
Escherichia coli : colonies rose (1)
Staphylococcus aureus : colonies jaunes/blanches (2)
Enterococcus faecalis : colonies turquoise (3)
Klebsiella pneumoniae : colonies bleues foncées (4)
4
1
3
Figure 14 : Isolement quantitatif mix sur USB avec méthode H1
2
14
3.1.3 Acquisition d’images :
Afin de comparer les cultures, les boîtes de Pétri ont été photographiées.
3.2 Les mises en culture du WASP:
3.2.1 La méthode des 4 quadrants Q3 :
Cette méthode est celle utilisée actuellement en routine à l’Institut de Microbiologie du CHUV pour la plupart des prélèvements.
L’automate dépose 10µl d’échantillon sur la largeur du 1er quadrant (va et vient) puis ensemence
latéralement le premier quadrant (correspondant à 1/5ème de la surface de la gélose) en repassant 4
fois dans le 1er quadrant. L’anse est stérilisée après l'ensemencement du 1er quadrant avant
l’ensemencement des 3 quadrants suivants où elle repasse latéralement 4 fois dans le quadrant
précédent. Le fait de déposer à chaque fois la même quantité de matériel avant d’ensemencer le 1er
quadrant permet d’avoir une méthode reproductible et peut-être quantitative.
3.2.2 La méthode des 4 quadrants Q4 :
Figure 16 : Méthode en 4 quadrants Q3 avec Etc fec
Figure 18 : Méthode en 4 quadrants Q4 avec Etc fec
Figure 15 : Pattern de la méthode Q3
Figure 17 : Pattern de la méthode Q4
15
Cette méthode se distingue de la méthode Q3 par le fait que :
i) Le premier quadrant couvre une surface plus large (un tiers de la gélose)
ii) le dépôt initial du matériel ne se fait pas sur la largeur complète du 1er quadrant,
iii) Un plus grand nombre de stries sont effectuées pour chacun des quatre quadrants (7 stries).
Le but est d’ensemencer une surface plus importante de la gélose.
3.2.3 La méthode quantitative2 H1:
Dans la méthode quantitative effectuée par le WASP, le dépôt initial se fait sur 1/3 (20 mm) de la
gélose avant de répartir le matériel par épuisement par des stries sur l’ensemble de la gélose selon le
schéma indiqué ci-dessus. Dans cette méthode aucune stérilisation n’est effectuée par l’automate.
Grâce à la reproductibilité du WASP, des chablons de référence on été mis en place afin de quantifier
les germes correctement. Cette méthode permet une estimation quantitative au log de 10 près entre
103 et 108 avec la présence de colonies isolées. Au-delà de 108 cfu (colony forming unite)/ml,
l'obtention de colonies isolées est impossible.
3.2.4 Le McFarland 0.5, les dilutions et les contrôles :
Pour pouvoir quantifier de manière précise nos méthodes, nous partons à chaque fois d’une
suspension avec une concentration bactérienne connue, le McFarland 0.5 correspond à 1.5*108
germes/ml d’Escherichia coli. La préparation de l’inoculum est une étape importante. Il faut que la
suspension soit parfaitement homogène afin d’obtenir des résultats reproductibles. En effet, la qualité
de la suspension va influencer la précision des dilutions et modifiera considérablement le nombre de
colonies sur les plaques. Nous allons utiliser cette méthode pour tous les inocula de notre étude.
Figure 20 : Méthode Quantitative avec Etc fec
Figure 19 : Pattern de la méthode H1
16
Nous avons effectué des dilutions à partir de nos McFarland 0.5 pour obtenir un gradient de
concentration de 108 à 102 germes par millilitre.
Afin de vérifier si l’inoculum initial et les dilutions étaient corrects, nous avons étalé sur deux plaques
Columbia 100 µl au râteau des dilutions 103 et 104. Nous comptons ensuite le nombre de colonies sur
les plaques. Une dilution précise à 104 germes devrait donner une croissance d’environs 1000
colonies et une dilution correcte pour 103 devrait donner logiquement une croissance dix fois moins
élevée d'environ 100 colonies.
Mc Farland 0.5
200 µl Mc Farland
108 107 106 105 104 103 102
Contrôle : 100µl + 1800 µl NaCl
17
3.2.1 La préparation des inocula polymicrobiens
Nous avons préparé plusieurs McFarland 0.5 avec 4 différentes souches bactériennes :
Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli et Enterococcus faecalis. Nous
avons effectué des dilutions et des mélanges avec les différentes concentrations en utilisant toujours
le même volume (400µl) pour chaque germe. Le mélange des inocula peut faire varier la
concentration de l’échantillon d’environ un log. Par exemple, la concentration du mélange Etcfec 107,
Staaur 106, Klepne 105 possède une concentration de 3.6x106. La concentration diminue dans les
mélanges avec des concentrations différentes car les échantillons se diluent entre eux.
Exemple du calcul d’une concentration :
Exemple de la préparation d’un inoculum avec différentes concentrations de germes :
Etcfec 107 Staaur 106 Klepne 105
+ 400µl
Concentration final 3.6x106 cfu/ml
18
3.3 Déroulement de l’étude
Nous avons sélectionné trois types d’ensemencements pour la réalisation de cette étude qui sont les
2 méthodes en quatre quadrants Q3 et Q4 et la méthode quantitative H1. La stratégie optée pour ce
travail est divisée en quatre parties :
1. Nous avons ensemencé trois souches ATCC sur des plaques Columbia avec les méthodes
Q3, Q4 et H1 avec et sans stérilisation après le 1er quadrant afin d’avoir une première idée des
résultats. Ces résultats nous permettront de dire si la méthode en 4 quadrants est quantifiable
et de définir laquelle des deux méthodes en quatre quadrants est la plus performante.
2. Nous procédons à un mélange de germes (de 2 à 4) à différentes concentrations (allant de 108
à 105 germes/ml) dans le but d’observer :
i) Si la quantification est influencée par une flore polymicrobienne.
ii) D’observer si l’on obtient des colonies isolées de chaque germe malgré une forte
concentration.
3. Afin de tester la limite supérieure des trois méthodes d’ensemencement, nous avons effectué
une culture en overnight pour les souches d’Escherichia coli et de Staphylococcus aureus
dans des bouillons BHI (Brain Heart Infusion). Ceci nous permet d’obtenir une concentration
bactérienne entre 109 et 1010.
4. Nous avons testé divers prélèvements cliniques très fortement positifs à l’examen direct. Le
but étant de confronter nos dilutions avec des échantillons cliniques.
19
4. Résultats :
Première partie :
Déterminer laquelle de deux méthodes d’ensemencement en quatre quadrants est la plus
performante.
Comparer l’ensemencement en quatre quadrants avec la méthode quantitative.
4.1 Test 1 : avec stérilisation
Résultats des méthodes Q3, Q4 avec stérilisation et de la méthode quantitative H1 avec
Escherichia coli.
Pour la méthode Q3, nous avons observé qu’à la concentration la plus élevée (108), les colonies
atteignent le 3ème quadrant (figure 21). Nous avons pu relever également que dès la concentration
107, la répartition des germes ne se retrouvent plus qu’au 2ème quadrant (figure 22).
Pour la méthode Q4, les colonies ne se répartissent pas plus loin que le 2ème quadrant avec une
concentration de 108 (figure 23). A partir de 107 les colonies se répartissent uniquement sur le 1er
quadrant pour Esccol (figure 24) et Staaur, mais sur deux quadrants pour EEtcfec.
Les contrôles internes nous indiquent que nous sommes légèrement en-dessous des concentrations
(concentration la plus élevée égale environ à 5x107 plutôt que 108. Voir figure 21 ci-dessous).
L’étalement du contrôle à 104 nous avons compté environs 400 colonies alors que nous aurions dû
Figure 22 : Esccol 107 Q3
Figure 21 : Esccol 10
8 Q3
Figure 23 : Esccol 108 Q4 Figure 24 : Esccol 10
7 Q4
20
arriver autour des 1000 colonies (Figure 25). La situation est la même pour le contrôle à 103 où nous
comptons environs 40 colonies plutôt que 100 (Figure 26). Cela peut s’expliquer par le fait que la
préparation d'un McFarland 0.5 ne permet pas d'atteindre une concentration de 108 avec une
précision de 100% (variation biologique et analytique).
g10 g9 g8 g7 g6 g5 g4 g3 g2
Test 1 Sta aur H1 Columbia Non - - 10 8̂ 10 7̂ 10 7̂ 10 5̂ 10 4̂ 16 col 6 col
Test 1 Esc col H1 Columbia Non - - 10 8̂ 10 8̂ 10 6̂ 10 5̂ 10 4̂ 4 col Ø
Test 1 Etc fec H1 Columbia Non - - 10 8̂ 10 7̂ 10 6̂ 10 5̂ 10 4̂ 1 col Ø
Test 1 Sta aur Q3 Columbia oui - - 3+ 2+ 2+ 1+ 1+ qq Ø
Test 1 Etc fec Q3 Columbia oui - - 3+ 2+ 1+ 1+ 1+ qq Ø
Test 1 Esc col Q3 Columbia oui - - 3+ 2+ 2+ 1+ 1+ qq Ø
Test 1 Sta aur Q4 Columbia oui - - 2+ 2+ 1+ 1+ 1+ qq Ø
Test 1 Etc fec Q4 Columbia oui - - 3+ 2+ 1+ 1+ 1+ qq 2 col
Test 1 Esc col Q4 Columbia oui - - 2+ 1+ 1+ 1+ 1+ qq 1 col
Concentration des dil.Test Germes Méthodes Géloses Stérilisation
Figure 26 : contrôle interne 103 Figure 25 : contrôle interne 10
4
Tableau 1 : Tableau récapitulatif des résultats contenant la méthode H1 et les méthodes Q3 et Q4 avec stérilisation
21
Tous les ensemencements ont été réalisés sur gélose Columbia. Les chablons de référence sont sur
USB.
108 107 106 105
Q3
Q4
H1
H1 Réf.
Tableau 2 : Résultats de Q3 et Q4 avec stérilisation et de H1 avec Escherichia coli de 108 à 10
5
22
104 103 102
Q3
Q4
H1
H1 Réf.
Tableau 3 : Résultats de Q3 et Q4 avec stérilisation et de H1 avec l’Escherichia coli de 104 à 102
23
4.2 Test 1 : sans stérilisation
Résultats du test 1 avec les méthodes Q3, Q4 sans stérilisation après le 1er quadrant. Tous les
ensemencements ont été également réalisés sur gélose Columbia.
Contrairement à la méthode avec stérilisation, on remarque cette fois qu'une quantification est
possible (gradient de répartition proportionnel de 108 à 102) pour les deux méthodes mais que très
peu de colonies sont isolées pour les concentrations de 108 et 107.
Pour Etcfec et Staaur on remarque qu’entre 107 et 106 il n’y a pas une grande différence au niveau
des 3ème et 4ème quadrants mais que dans le tapis la quantité diminue (figures 27 à 28). Cette
observation peut être due au fait qu'une différence d'un log (10x) se distingue difficilement dans les
3ème et 4 ème quadrants lorsque la concentration de germes est très élevée.
Il devient impossible d'estimer une quantité lorsque la gélose est saturée (colonies confluentes).
Ainsi, des prélèvements contenant 108, 109 ou 1010 bacteries/ml auront une croissance confluente
identique sur la gélose. (Figure 29 et 30)
Figure 27 : Staaur à 107 avec Q3
Figure 28 : Staaur à 106 avec Q3
Figure 30 : Esccol à 107 avec Q3 Figure 29 : Esccol à 108
avec Q3
24
La différence importante observée entre 107 (figure 31) et 106 (figure 32) de Esccol est logique. Entre
50 et 100 colonies sont comptées du 2ème au 4 ème quadrant avec les dilution 106, ce qui signifie
qu'environ 1000 colonies sont présententes dans ces mêmes quadrants à 107.
Concernant la méthode Q4 on peut s’apercevoir que malgré la largeur plus grande du 1er cadran, il
n’y a pas de différence significative avec la méthode Q3. On retrouve les mêmes points mis en
évidence avec la méthode Q3.
En regardant ce tableau, on peut affirmer que les méthodes Q3 et Q4 sans stérilisation donnent des
résultats similaires et que ces résultats sont équivalents à la méthode H1.
g10 g9 g8 g7 g6 g5 g4 g3 g2
Test 1 Sta aur H1 Columbia Non - - 10 8̂ 10 7̂ 10 6̂ 10 5̂ 10 4̂ 1 col 1 col
Test 1 Esc col H1 Columbia Non - - 10 8̂ 10 8̂ 10 6̂ 10 5̂ 10 4̂ 3 col 1 col
Test 1 Etc fec H1 Columbia Non - - 10 8̂ 10 7̂ 10 6̂ 10 5̂ 10 4̂ 7 col 1 col
Test 1 Sta aur Q3 Columbia Non - - 4+ 4+ 4+ 3+ 1+ 1+/qq 3 col
Test 1 Etc fec Q3 Columbia Non - - 4+ 4+ 4+ 2+ 1+ Ø Ø
Test 1 Esc col Q3 Columbia Non - - 4+ 4+ 3+ 2+ 1+ qq Ø
Test 1 Sta aur Q4 Columbia Non - - 4+ 4+ 4+ 3+ 1+ qq 5 col
Test 1 Etc fec Q4 Columbia Non - - 4+ 4+ 4+ 2+ 1+ qq Ø
Test 1 Esc col Q4 Columbia Non - - 4+ 4+ 3+ 2+ 1+ qq Ø
Test Germes Méthodes Géloses StérilisationConcentration des dil.
Tableau 4 : Tableau récapitulatif des résultats contenant la méthode H1 et les méthodes Q3 et Q4 sans stérilisation
Figure 32 : Esccol à 106 Méthode Q3 Figure 31 : Esccol à 107
Méthode Q3
25
108 107 106 105
Q3
Q4
H1
H1 Réf.
Tableau 5 : Résultats des méthodes Q3 et Q4 sans stérilisation et de la méthode H1 de 108 à 105
26
104 103 102
Q3
Q4
H1
H1 Réf
Tableau 6 : Résultats des méthodes Q3 et Q4 sans stérilisation et de la méthode H1 de 104 à 102
27
Résumé des résultats du test 1 :
a) Le premier point important pour la méthode Q3, réalisé avec stérilisation, est le fait qu’à la
concentration 107, les colonies ne se répartissent pas plus loin que le 2ème quadrant. En routine cela
correspond à une quantité modérée.
De plus, le fait qu’à une concentration de 108, la répartition des colonies ne dépasse pas le 3ème
quadrant nous indique que lorsque nous sommes confrontés à des colonies allant jusqu’au 4ème
quadrant, les concentrations bactériennes se situent entre 109 et 1010.
b) Pour la partie du test sans stérilisation, nous avons pu nous apercevoir que la méthode choisie
n’influence en rien les résultats. Effectivement, quelque soit la concentration, les résultats seront
identiques pour les deux méthodes.
28
4.3 Test 2 : Inocula polymicrobiens
Cette étape va nous permettre de vérifier laquelle des méthodes (Q3 ou Q4) est la plus performante
au niveau de la quantification et de l’isolement lors de prélèvements polymicrobiens.
Nous avons utilisé 4 germes différents pour réaliser ce test qui sont : Staphylococcus aureus,
Enterococcus faecalis, Escherichia coli et Klebsiella pneumoniae.
Les différents ensemencements sont réalisés avec et sans stérilisation à partir de flores mixtes de
concentrations variables. Tous les tests ont été réalisés sur gélose USB.
Pour la méthode Q3, nous avons pu constater qu’avec des concentrations bactériennes à 108, la
stérilisation est indispensable afin d’obtenir des colonies isolées (figure 33 et 34).
Entre 107 et 106, nous sommes confrontés au même problème que dans le test n°1, les colonies
sont réparties sur deux quadrants. A cette concentration, la méthode Q3 sans stérilisation permet
d’obtenir plus de colonies isolées car elles sont mieux réparties sur la gélose (figure 35 et 36).
Figure 33 : Etc 108, Sta 10
8, Esc 10
8
Q3 avec stérilisation Figure 34 : Etc 10
8, Sta 10
8, Esc 10
8
Q3 sans stérilisation
Figure 35 : Etc 107, Sta 10
6, Kle 10
5
avec stérilisation Figure 36 : Etc 10
7, Sta 10
6, Kle 10
5
sans stérilisation
29
Pour la méthode Q4, à une concentration de 108, la stérilisation n’améliore pas l’isolement (cf. figure
37 et 38).
Lorsque nous sommes en présence d’une concentration inférieure ou égale à 107, le fait de stériliser
donne de moins bons résultats (cf. figure 36 et 37), comme déjà souligné avec la méthode Q3.
Figure 39 : Etc 107, Sta 10
6, Kle 10
5 Q4
avec stérilisation Figure 40 : Etc 10
7, Sta 10
6, Kle 10
5
Q4 sans stérilisation
Figure 37 : Etc 108, Sta 10
8, Esc
108 Q4 avec stérilisation
Figure 38 : Etc 108, Sta 10
8, Esc
108 Q4 sans stérilisation
30
(a) : Escherichia coli à 108, Staphylococcus aureus à 108, Enterococcus faecalis à 108
(b) : Escherichia coli à 108 et Klebsiella pneumoniae à 108
(a) Avec stérilisation (a) Sans stérilisation (b) Avec stérilisation (b) Sans stérilisation
Q3
Q4
H1
Tableau 7 Résultats de deux différents mix sur géloses USB
31
(c) : Enterococcus à 107, Staphylococcus aureus à 106 et Klebsiella pneumoniae à 105
(d) : Enterococcus à 108, Escherichia coli à 107 et Klebsiella pneumoniae à 105
(c) Avec stérilisation (c) Sans stérilisation (d) Avec stérilisation (d) Sans stérilisation
Q3
Q4
H1
Tableau 8 : Résultats de deux différents mix sur géloses USB
32
Résumé du test 2 :
a) Pour les méthodes avec stérilisation :
Avec Q3, les résultats diffèrent de ceux obtenus au test 1. En effet, avec une concentration
bactérienne à 108, nous retrouvons des colonies jusqu’au 4ème quadrant alors que lors de la
première expérience elles atteignaient seulement le 3ème. Sans stérilisation les résultats sont
équivalents au test n°1.
Pour la méthode Q4 , les résultats quantitatifs sont les mêmes que ceux observés dans le test
n°1.
b) Pour les méthodes sans stérilisation :
Pour des concentrations supérieures ou égales à 108, la stérilisation est indispensable pour
éviter une confluence des colonies avec les deux méthodes.
A partir d’une concentration de 107, les méthodes sont équivalentes et donnent de meilleurs
résultats sans stérilisation.
4.4 Test 3 : limite supérieure de la méthode
Après le test N°1, nous avons constaté que la concentration à 108 n’arrivait qu’au troisième quadrant.
Nous avons réalisé ce test pour évaluer la quantité des germes sur quatre quadrants et tester la
limite de deux méthodes d’isolement.
Nous avons pour cela cultivé deux souches bactérienne, Escherichia coli et Staphylococcus aureus,
jusqu’à atteindre une concentration situé entre 109 et 1010 germes/ml que nous avons ensuite dilué
jusqu’à 107 germes/ml.
Avec une concentration à 1010 nous atteignons cette fois le 4ème quadrant par les deux méthodes
avec stérilisation (Figure 41 et 42) tandis que la méthode H1 est complètement saturée (Figure 43).
Figure 41 : Q3 à 1010
avec
stérilisation
Figure 42 : Q4 à 1010
avec
stérilisation
Figure 43 : H1 à 1010
33
Pour la méthode Q3 avec stérilisation à 109, le 4ème quadrant est toujours atteint (Figure 44).
Pour la méthode Q4 avec stérilisation à 109 et 108 , les colonies n’arrivent qu’au 2ème quadrant (Figure
45 et 46). En regardant la plaque attentivement on remarque que l’automate ne touche pas le 1er
cadran dans la dilution 109 ce qui explique le nombre de colonies restreintes dans cet échantillon
(voir chapitre 5.5 variation point 3).
On remarque que nos concentrations sont effectivement supérieures à 108 cfu/ml grâce aux chablons
de référence. La quantité de colonies est plus élevée par rapport à tous nos autres tests.
Figure 44 : Q3 à 109 avec
stérilisation
Figure 45 : Q4 à 108 avec
stérilisation
Figure 46 : Q4 à 108 avec
stérilisation
34
1010 109 108 107
Q3
Q4
H1
H1 Ref
Tableau 9 : Résultats de la limite de la méthode d’Escherichia coli avec stérilisation
35
1010 109 108 107
Q3
Q4
H1
H1 Ref
Tableau 10 : limite de la méthode d’Escherichia coli sur Columbia sans stérilisation
36
4.5 Test 4 : échantillons cliniques
Ce test va nous permettre de tester la limite des deux méthodes sur des échantillons cliniques.
Nous avons donc choisi des prélèvements contenant une flore polymicrobienne en forte quantité à
l’examen direct. Nous avons sélectionné des prélèvements tels que des expectorations et un pus, à
cause de leur viscosité, afin d’observer s’il y a une différence en fonction de la nature de l’échantillon.
Expectorations :
g10 g9 g8 g7 g6 g5 g4 g3 g2
Test 3 Sta aur H1 Columbia Non - > 10 8̂ 10 8̂ 10 7̂ 10 6̂ 10 5̂ 10 4̂ Ø Ø
Test 3 Esc col H1 Columbia Non >10 8̂ >10 8̂ >10 8̂ 10 7̂ 10 6̂ 10 5̂ - - -
Test 3 Sta aur Q3 Columbia oui - 4+ 4+ 2+ 2+ 1+ 1+ 2 col Ø
Test 3 Esc col Q3 Columbia oui 4+ 4+ 2+ 2+ 1+ 1+ - - -
Test 3 Sta aur Q3 Columbia non - 4+ 4+ 4+ 4+ 2+ 1+ 2 col Ø
Test 3 Esc col Q3 Columbia non 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 2+ - - -
Test 3 Sta aur Q4 Columbia oui - 4+ 2+ 1+ 1+ 1+ 1+ Ø Ø
Test 3 Esc col Q4 Columbia oui 4+ 2+ 2+ 1+ 1+ 1+ - - -
Test 3 Sta aur Q4 Columbia non - 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 1+ 2 col Ø
Test 3 Esc col Q4 Columbia non 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 1+ - - -
Test Germes Méthodes Géloses StérilisationConcentration des dil.
Tableau 11 : Résultats récapitulatif du test sur la limite de la méthode avec Escherichia coli et Staphylococcus aureus
Figure 47 : Expectorations N°14-0219-0933 Q3 sans stérilisation
Figure 48 : Expectorations N°14-0219-0933 Q4 sans stérilisation
37
Figure 49 : N°14-0219-0933 Q3 avec stérilisation
Figure 50 : Expectorations N°14-0219-0933 Q4 avec stérilisation
Figure 51 : Expectorations N°14-0219-0933 H1
38
Figure 52 : Expectoration N°14-0219-0999 Q3 avec stérilisation
Figure 53 : Expectoration N°14-0219-0999 Q4 avec stérilisation
Figure 54 : Expectoration N°14-0219-0999 Q3 sans stérilisation
Figure 55 : Expectoration N°14-0219-0999 Q4 sans stérilisation
Figure 56 : Expectoration N°14-0219-0999 H1
39
Dans ces échantillons, qui sont généralement polymicrobiens, l’absence de stérilisation nous amène
jusqu’au 4ème quadrant avec des colonies isolées facilement identifiables. Avec la stérilisation, les
colonies poussent uniquement dans le 1er quadrant ce qui gêne la distinction de certaines bactéries.
Plaie opératoire superficielle :
Figure 57 : plaie opératoire superficielle 14-0219-0923 Q3 avec stérilisation
Figure 58 : plaie opératoire superficielle 14-0219-0923 Q4 avec stérilisation
Figure 59 : plaie opératoire superficielle 14-0219-0923 Q3 sans stérilisation
Figure 60 : plaie opératoire superficielle 14-0219-0923 Q4 sans stérilisation
40
Cette plaie opératoire superficielle possède une plus grande concentration des germes que les deux
expectorations ci-dessus. Sans stérilisation l’ensemencement est saturé, par contre la stérilisation
permet d’identifier tous les germes et l’on observe de nombreuses colonies isolées.
5. Discussion :
5.1 1ère
partie : comparaison des 4 quadrants
Test 1 avec stérilisation :
Dans ce test la méthode Q3 est meilleure que la méthode Q4. Cela peut être expliqué par la
largeur du premier quadrant où le matériel sera plus dilué avant d’être réparti sur les autres
quadrants.
Une quantification de ces deux méthodes (Q3 ou Q4) reste très difficile à réaliser en raison de
la répartition des germes uniquement dans le 1er quadrant pour les concentrations les plus
basses (g5 à g2).
Les résultats présenté dans les tableaux ci-dessus, nous permette de déduire qu’avec la
méthode Q3 lorsque nous observons en routine un prélèvement contenant une quantité forte
de germes (4+) nous sommes donc bien au-delà d’une concentration bactérienne
correspondant à 108.
A l’inverse pour les concentrations à 105, elles seront évaluées en quantité faible (1+) au poste
de routine. Dans un prélèvement contaminé (expectoration) cette quantité de germes peut se
révéler pathogénique bien qu’elle soit considérée comme faible.
On peut également relever le fait qu’avec la méthode Q4, on retrouve un nombre de colonies
isolées réduit par rapport à Q3, contrairement à ce que nous aurions attendu avec
l’élargissement du 1er quadrant. Cette différence est expliquée dans le chapitre 5.5 variations.
Figure 61 : plaie opératoire superficielle 14-0219-0923 H1
41
Grâce à nos contrôles internes et à la méthode quantitative qui correspond aux chablons de
référence nous pouvons affirmer la fiabilité de nos résultats.
Test 1 sans stérilisation :
Sans la stérilisation les méthodes Q3 et Q4 sont équivalentes, car en les comparants avec la
méthode quantitative on remarque une similitude qui nous permettrait de quantifier les 4
quadrants.
La quantification est donc envisageable si l’on supprimait la stérilisation dans les méthodes
d’ensemencements
Avec la suppression de la stérilisation nous obtenons des étalements à 4+ malgré une
concentration à 108 seulement.
Avec les dilutions plus basses (105) on retrouve des colonies uniquement dans le 1er quadrant.
On n’obtient pas de colonies isolées en supprimant la stérilisation.
La fiabilité de ce test est correct car les contrôles correspondent aux nombres de germes attendus et
que la méthode quantitative est identique aux chablons de référence.
La stérilisation est donc une méthode plus sensible à la variation de l’ensemencement donc moins
reproductible. C’est une méthode optimale pour l’isolement de colonies dans des échantillons
contenants une forte concentration de germes et pour la semi-quantification, mais pour avoir une
méthode quantitative la suppression de la stérilisation est idéale.
5.2 2ème
partie mixes à différentes concentration
Pour les prélèvements polymicrobiens, la largeur du 1er quadrant de la méthode Q4 n’amène pas de
plus-value car l’isolement est médiocre.
La méthode Q3 est donc plus intéressante dans les prélèvements polymicrobiens car sa répartition
est plus homogène et permet un meilleur isolement des colonies.
Concernant la quantification, nous observons des différences par rapport aux résultats obtenus sur
Columbia (test n°1). Sur USB, à une concentration de 108, le 4ème quadrant est cette fois atteint.
Cette variation pourrait venir de la gélose en elle-même, l’USB étant plus épaisse et plus rugueuse
qu’une gélose Columbia ou de l’inclinaison de l’anse (cf. chapitre 5.5).
A partir d’une dilution de 106, on ne retrouve des colonies que dans le 1er quadrant, ce qui rend la
quantification toujours aussi compliquée.
42
5.3 3ème
partie limite de la méthode
Pour la méthode Q3 nous pouvons observer qu’aux concentrations de 1010 et 109, les colonies
atteignent le 4ème quadrant. Ce qui signifie que lorsque nous rencontrons des prélèvements décrits à
4+ au poste de routine, cela correspond à une concentration bactérienne supérieure à 108 cfu/ml.
La méthode Q4 se révèle moins performante que la méthode Q3 lors de concentrations élevées. En
effet les colonies sont moins bien isolées, et nous passons de 4 quadrants à 1010 à 2 quadrants pour
une concentration de 109. Un 1er cadran plus large n’apporte pas de plus-value à la mise en culture.
5.4 4ème
Echantillons cliniques
Les résultats nous permettent d’observer qu’en supprimant la stérilisation dans des prélèvements
contenant une faible concentration de germes, le matériel est beaucoup mieux réparti. Cela confirme
les résultats obtenus dans la 2ème partie de l’étude.
Avec des prélèvements contenant une forte concentration de germes la stérilisation est indispensable
si l’on veut obtenir des colonies isolées. On remarque que la méthode Q3 est plus adaptée car le 1er
quadrant plus petit permet un meilleur étalement de l’échantillon.
On remarque également que la méthode quantitative est inutilisable pour des prélèvements
polymicrobiens au-delà de 108, on ne retrouve pas de colonies isolées. L’isolement par la méthode
des 4 quadrants est donc la plus utile dans ce genre de prélèvements.
5.5 Variations
Nous avons été confrontés à plusieurs facteurs pouvant influencer la reproductibilité, la qualité et la
quantification de nos ensemencements. En effet, de nombreuses variations sont présentes dans les
méthodes Q3 et Q4.Nous n’obtenons jamais exactement les mêmes résultats pour un même
protocole de mise en culture. Nous avons pu noter plusieurs raisons pouvant expliquer ces
variations :
1) L’inclinaison de l’anse :
L’anse pourrait expliquer une grande partie de ces variations. En effet nous avons remarqué que
celle-ci était parfois tordue ce qui pourrait dire que l’anse ne touchait pas assez la gélose lors de nos
ensemencements. Le WASP ne possède aucun capteur pouvant optimiser le contact avec le milieu
solide. Nous pouvons néanmoins affirmer que l’anse touchait la gélose lors de nos tests car on peut
nettement voir les stries dessinées sur nos géloses. Cependant, ce que l’on ne peut pas garantir est
une différence de pression exécutée par l’anse sur la gélose due à son inclinaison, ce qui pourrait
provoquer un moins bon dépôt du matériel sur le milieu solide.
2) Gélose USB vs Columbia :
Nous avons pu nous apercevoir à travers nos résultats qu’une différence sur la répartition des
colonies existe entre les milieux Columbia et USB. Cela peut être expliqué par la consistance du
milieu USB qui est plus dense que la Columbia (éventuellement plus d’agar). Cette différence de
consistance pourrait permettre à l’anse de mieux déposer le matériel sur la surface de la gélose car
43
celle-ci présente une plus forte résistance au mouvement de l'anse. De plus nous avons pu
remarquer que la surface de la gélose Columbia est beaucoup plus irrégulière.
3) Exécution incorrecte de Pattern :
Nous avons comparé nos ensemencements avec les patterns officiels fournis par COPAN et avons
pu constater de grandes différences entre la théorie et la réalité.
Pour la méthode Q3, nous avons remarqué qu’il y a une variation lorsque l’anse retourne dans le 1er
quadrant afin d’exécuter le 2ème. En effet, le WASP va retourner pour certains cas jusqu’à la 3ème strie
du 1er quadrant alors que dans d’autres seulement jusqu’à la 2ème strie. Cette différence pourrait
modifier la répartition sur les autres quadrants car on reprend plus ou moins de matériel. De plus
dans certains cas, lors de la conception des quadrants 3 et 4, l’automate ne retourne pas assez loin,
ou pas du tout, dans le quadrant antécédent. Ces variations par rapport aux patterns pourraient être
expliquées par l’inclinaison de l’anse ou par un mauvais paramétrage de l'automate. Néanmoins si le
problème ne vient pas de l’anse, le problème viendrait des Patterns qui ne correspondent pas à la
réalité de l’automate et il faudrait donc rapporter cette constatation à COPAN.
Figure 62 : StaAur à 108 cfu/ml
Figure 63 : StaAur à 107 cfu/ml
44
Pour la méthode Q4 la différence entre les patterns et nos ensemencements est beaucoup plus
marquée. En effet, pour effectuer le 2ème quadrant, l’automate est censé retourner jusqu’à la 3ème strie
du 1er quadrant, alors que dans nos résultats, l’anse touche tout juste la dernière strief. Ce point
pourrait expliquer pourquoi lors de nos résultats nous obtenons des répartitions ne dépassant jamais
le 1er quadrant. Le fait que peu de matériel soit reprit du 1er quadrant couplé à la stérilisation a pour
conséquence une immense perte de matériel qui se reflète sur la répartition. Il serait souhaitable de
reprogrammer le WASP afin qu’il retourne plus loin dans le 1er quadrant avec l’anse. Nous pouvons
voir une différence entre le pattern et nos ensemencements sur les quadrants 3 et 4, où l’on peut voir
dans certains cas l’anse ne retournant pas dans le quadrant précédentg.
f
f
g
g
f
g g
g
g
Figure 64 : Pattern Q4
Figure 65 : Mix Etcfec 108, Staaur 10
8, Esccol 10
8
45
5.6 Réponses au but de l’étude :
1. Peut-on quantifier la méthode des 4 quadrants ?
A travers nos diverses expériences, nous avons pu constater que les différents facteurs de
variation lors de l’ensemencement des méthodes Q3 et Q4 avec stérilisation, rend la
quantification difficile. Effectivement, nous avons pu mettre en évidence le fait que le WASP n’est
pas totalement reproductible, ce qui empêche une quantification précise.
Hormis le fait que l’automate n’est pas totalement reproductible, nos différentes tentatives de
quantification ne sont pas concluantes. En effet, lorsque nous stérilisons après le 1er quadrant,
nous nous trouvons avec une mauvaise répartition des germes sur la gélose, ce qui rend
compliqué le fait de voir la différence entre chaque log. Au contraire, lorsque nous ne stérilisons
pas l’anse après le 1er quadrant, nous nous retrouvons confrontés au problème des bactéries trop
confluentes à partir d’une concentration de 107 cfu/ml (saturation) mais une quantification reste
envisageable jusqu'à 107.
2. Comparaison des deux différentes méthodes d’ensemencement en 4 quadrants disponibles
sur le WASP, en termes de quantification et d’obtention de colonies isolées.
i) La quantification serait plus adaptée à la méthode Q3, ceci peut être dû à la trop forte
variation (voir point 5.5. variations) lors de l’ensemencement de la méthode Q4.
ii) La méthode Q3 avec stérilisation utilisée actuellement dans le laboratoire de microbiologie du
CHUV est la plus performante pour l’isolement des colonies lors des prélèvements à forte
concentration bactérienne. En effet, dans la méthode Q4, un premier quadrant plus large
n’apporte pas d’amélioration, l’isolement est insuffisant.
3. Comparaison de la méthode en 4 quadrants avec la méthode quantitative.
i) Avantage :
La possibilité d’obtenir des colonies isolées lors des fortes concentrations de bactériennes
(>108), ainsi que l’isolement des différentes morphologies.
ii) Inconvénients :
La quantification pourrait s’avérer utile pour d’autres types de prélèvements que les urines
ou les biopsies des brûlés. Si le seuil de pathogénicité se situe, en général à 105, la
quantification serait importante pour des prélèvements normalement contaminés par la
flore commensale, comme par exemple les expectorations. Pour les prélèvements
normalement stériles, cela permettrait, entre autre, de faire un suivi plus précis sur
l’efficacité du traitement.
46
5.7 Proposition d’améliorations :
a) Modification des patterns. Pour Q3 et Q4, envisager d’effectuer 1 strie remontant plus haut
dans le 1er quadrant tout en maintenant une stérilisation. Le fait de réaliser une strie plus
grande dans le 1er tapis va permettre de récupérer plus de matériel pour former les autres
quadrants, ce qui pourrait donner des résultats moins sous-évalués.
b) Vérifier l’état de l’anse du WASP minimum 2 fois par jour, une fois en début de journée et une
autre en début d’après-midi. En effet l’inclinaison de l’anse (droite ou au contraire fortement
inclinée) pourrait jouer un rôle dans l’exécution correcte des patterns.
c) L’épaisseur et la consistance des milieux solides pourraient jouer un rôle dans les variations
de l’ensemencement. Augmenter le pourcentage d’agar ou avoir la même épaisseur de gélose
améliorerait la qualité de l’ensemencement.
d) On pourrait également associer automatiquement des types d’ensemencements différents
avec des prélèvements stériles/non stériles. Il y a également la possibilité d’inclure des milieux
sélectifs afin de séparer les germes et augmenter notre résolution.
Voici différentes propositions de méthodes d’ensemencement pour les prélèvements de routine :
Prélèvements Isolement de colonies Quantification
Frottis oro-phayryngés Q3 avec stérilisation H1 (Q3 sans stérilisation)
LBA H1 (Q3 sans stérilisation) H1 (Q3 sans stérilisation)
Urines H1 H1
Liquide péritonéal Q3 sans stérilisation (H1) H1
Expectoration Q3 sans stérilisation Pas quantifiable
Plaie opératoire superficielle Q3 avec stérilisation H1
47
6. Conclusion
Le but de ce travail était de pouvoir quantifier la méthode des 4 quadrants (Q3 et Q4), de comparer 2
méthodes des 4 quadrants différentes et d’évaluer les avantages et les inconvénients de la méthode
des 4 quadrants par rapport à la méthode quantitative. Cette étude était basée sur l’ensemencement
automatique du WASP qui nous aurait permis d’obtenir des résultats reproductibles. Pour la
comparaison entre les méthodes Q3 et Q4 la grandeur des 1er quadrants et l’augmentation du
nombre de stries étaient les différences majeures.
D’après nos observations, nous pouvons conclure que la méthode des 4 quadrants n’est pas
quantifiable, sans une modification du protocole. La suppression de la stérilisation et un ajustement
des protocoles du WASP pourrait permettre une quantification. En effet, trop de variations dans
l’ensemencement du WASP nous empêchent de quantifier. La méthode Q3 est la meilleure car elle
donne plus de colonies isolées à la plupart des concentrations. Au contraire de la méthode Q4 qui
donne des résultats beaucoup plus variables, ceci peut être due au pattern non respecté (départ des
stries trop basses) de cette méthode. Le gros avantage de la méthode quantitative est de pouvoir
donner une concentration de germes dans les prélèvements tels que les urines, LBA, biopsies des
brulés mais avec des échantillons comprenant une flore polymicrobienne et une grande quantité de
germes il est très difficile de retrouver des colonies isolées.
En conclusion, le WASP n’est pas totalement reproductible mais reste un outil indispensable dans un
laboratoire de diagnostic bactériologique moderne grâce à sa vitesse d’ensemencement et à sa
régularité. Changer la méthode des 4 quadrants n’apporte rien au laboratoire il faut donc garder la
méthode actuelle (Q3). Par contre l’amélioration de la méthode en modifiant le pattern (matériel
récupéré plus haut dans les quadrants) pourrait apporter des avantages (plus de colonies isolées
avec de faibles concentrations de germes). Utilisé la méthode quantitative dans tous les
prélèvements n’est pas une solution car il est plus important d’obtenir des colonies isolées pour
pouvoir identifier chaque germe.
Ce travail nous a permis de progresser d’une autre manière dans notre stage et a apporté plusieurs
renseignements nouveaux et utiles pour le laboratoire:
i) Avoir une estimation quantitative des méthodes semi-quantitatives (4+ = 1010-109).
ii) La méthode Q3 avec stérilisation est la plus optimal pour les prélèvements riches en
bactéries.
iii) Une quantification ne peut se faire que sans stérilisation.
Conclusion personnelle :
A travers ce travail, nous avons appris à organiser une étude du début jusqu’à la fin. Nous avons
également développé un œil critique sur les différents résultats obtenus. Ce travail nous a permis de
jouer un rôle majeur dans un laboratoire en aidant dans le développement de celui-ci. Ainsi nous
avons pu enrichir notre expérience d’une autre manière durant ce stage.
48
7. Coûts
Ce travail a nécessité un certain budget, dont voici le tableau récapitulatif :
Matériel Prix à l’unité en CHF Quantité utilisée
Prix total en CHF
Anses vertes (paquet)
5.8 3 17.40
Columbia 1.08 246 265.70
USB 1.00 95 95.00
Tube Copan vide 0.34 70 23.80
Bouillon BHI 1.5 2 3.00
Anses d’inoculation
(paquet) 4.09 1 4.10
Embouts jaunes (boîtes)
0.855 5 4.30
Embouts bleus (boîtes)
0.855 3 2.60
Total 415.90
49
8. Remerciements
Nous tenons à remercier chaleureusement Mme. Maria Senra Ortiz et le Dr. Antony Croxatto qui
grâce à leurs connaissances et leur expérience ont pu nous diriger, nous conseiller et nous aider
durant la réalisation de cette étude.
Nous remercions également le Dr. Guy Prod’hom, responsable du laboratoire de bactériologie du
CHUV pour les propositions et les corrections apportées pendant notre travail ainsi que le Dr. Onya
Opota pour ces connaissances en anglais et la correction de notre travail
Tous les membres de l’équipe du laboratoire de bactériologie du CHUV reçoivent également notre
gratitude pour leur accueil durant nos 6 mois de stages.
50
9. Bibliographie
1. John, A. (1981). Laboratory Procedures in Clinical Microbiology. Washington
2. Bradley, J., & P., L. (10 août 1963). Quantitative urine cultures. British Medical
Journal , 361
3. BIOKAR DIAGNOSTICS. (s.d.). Gélose Columbia. Consulté le 03.13.2014, sur
Lycée Valin: http://lycee-valin.fr/bgb/ftech/C5K.pdf
4. Veron, B. (s.d.). gélose Columbia . Consulté le 03.13.2014, sur Microbiologie
médicale: http://www.microbiologie-medicale.fr/milieuxnonselectifs.htm
5. Futura-sciences. (s.d.). la coloration de gram. Consulté le 03.21.2014, sur
Futura-sciences: http://www.futura-sciences.com
51
10. Table des illustrations
Tableaux
Tableau 1 Tableau récapitulatif des résultats contenant la méthode H1 et les méthodes Q3 et Q4
avec stérilisation ................................................................................................................................. 20
Tableau 2 Résultats de Q3 et Q4 avec stérilisation et de H1 avec l’Escherichia coli de 108 à 105 ..... 21
Tableau 3 Résultats de Q3 et Q4 avec stérilisation et de H1 avec l’Escherichia coli de 104 à 102 ..... 22
Tableau 4 Tableau récapitulatif des résultats contenant la méthode H1 et les méthodes Q3 et Q4
sans stérilisation ................................................................................................................................. 24
Tableau 5 Résultats des méthodes Q3 et Q4 sans stérilisation et de la méthode H1 de 108 à 105 ... 25
Tableau 6 Résultats des méthodes Q3 et Q4 sans stérilisation et de la méthode H1 de 104 à 102 .... 26
Tableau 7 Résultats de deux différents mix sur géloses USB ............................................................ 30
Tableau 8 Résultats de deux différents mix sur géloses USB ............................................................ 31
Tableau 9 Résultats de la limite de la méthode d’Escherichia coli avec stérilisation .......................... 34
Tableau 10 imite de la méthode d’Escherichia coli sur Columbia sans stérilisation ............................ 35
Tableau 11 Résultats récapitulatif du test sur la limite de la méthode avec Escherichia coli et
Staphylococcus aureus ....................................................................................................................... 36
Tableau 12 Résultats de la limite de la méthode d’Escherichia coli avec stérilisation ........................ 36
52
Figure
Figure 1 Staphylococcus aureus ........................................................................................................... 1
Figure 2 Répartition sur le 1er quadrant quantité faible ...................................................................... 7
Figure 3 Répartition sur 4 quadrants forte quantité .......................................................................... 7
Figure 4 Répartition sur 3 quadrants forte quantité .......................................................................... 7
Figure 5 Répartition sur le 1er et 2ème quadrants (minimum 5 colonies) quantité modérée ................ 7
Figure 6 Culture du LCR ....................................................................................................................... 8
Figure 7 Sonication ............................................................................................................................... 8
Figure 8 Méthode quantitative ............................................................................................................... 8
Figure 9 Isolement par l’InoquIA de BD Kiestra ................................................................................... 9
Figure 10 Automate InoqulA de BD Kiestra .......................................................................................... 9
Figure 11 Le peigne du Previ-Isola ..................................................................................................... 10
Figure 12 L’isolement du Previ-Isola ................................................................................................... 10
Figure 13 Le Wasp .............................................................................................................................. 11
Figure 14 Isolement quantitatif mix sur USB ....................................................................................... 13
Figure 15 Pattern de la méthode Q3 ................................................................................................... 14
Figure 16 Méthode en 4 quadrants Q3 avec Etc fec .......................................................................... 14
Figure 17 Pattern de la méthode Q4 ................................................................................................... 14
Figure 18 Méthode en 4 quadrants Q4 avec Etc fec ........................................................................... 14
Figure 19 Pattern de la méthode H1 ................................................................................................... 15
Figure 20 Méthode Quantitative avec Etc fec ..................................................................................... 15
Figure 21 Esccol 108 Q3 ..................................................................................................................... 19
Figure 22 Esccol 107 Q3 ..................................................................................................................... 19
Figure 23 Esccol 108 Q4 ..................................................................................................................... 19
Figure 24 Esccol 107 Q4 ..................................................................................................................... 19
Figure 25 contrôle interne 104 ............................................................................................................. 20
Figure 26 contrôle interne 103 ............................................................................................................. 20
Figure 27 Staaur à 107 avec Q3 .......................................................................................................... 23
Figure 28 Staaur à 106 avec Q3 .......................................................................................................... 23
Figure 29 Esccol à 108 avec Q3 .......................................................................................................... 23
Figure 30 Esccol à 107 avec Q3 .......................................................................................................... 23
Figure 31 Esccol à 107 Méthode Q3 ................................................................................................... 24
Figure 32 Esccol à 106 Méthode Q3 ................................................................................................... 24
Figure 33 Etc 108, Sta 108, Esc 108 Q3 avec stérilisation .................................................................. 28
Figure 34 Etc 108, Sta 108, Esc 108 Q3 sans stérilisation ................................................................... 28
Figure 35 Etc 107, Sta 106, Kle 105 avec stérilisation .......................................................................... 28
Figure 36 Etc 107, Sta 106, Kle 105 sans stérilisation .......................................................................... 28
Figure 37 Etc 108, Sta 108, Esc 108 Q4 avec stérilisation ................................................................... 29
Figure 38 Etc 108, Sta 108, Esc 108 Q4 sans stérilisation ................................................................... 29
Figure 39 Etc 107, Sta 106, Kle 105 Q4 avec stérilisation ....................................................... 29
Figure 40 Etc 107, Sta 106, Kle 105 Q4 sans stérilisation .................................................................... 29
Figure 41 H1 à 1010 ..................................................................................... Erreur ! Signet non défini.
Figure 42 Q3 à 1010 avec stérilisation ......................................................... Erreur ! Signet non défini.
53
Figure 43 Q4 à 1010 avec stérilisation ................................................................................................. 32
Figure 44 Q3 à 109 avec stérilisation .......................................................... Erreur ! Signet non défini.
Figure 45 Q4 à 108 avec stérilisation .......................................................... Erreur ! Signet non défini.
Figure 46 Q4 à 108 avec stérilisation .......................................................... Erreur ! Signet non défini.
Figure 47 Expectorations N°14-0219-0933 Q3 sans stérilisation ................ Erreur ! Signet non défini.
Figure 48 Expectorations N°14-0219-0933 Q4 sans stérilisation ........................................................ 36
Figure 49 N°14-0219-0933 Q3 avec stérilisation ................................................................................ 37
Figure 50 Expectorations N°14-0219-0933 Q4 avec stérilisation ........................................................ 37
Figure 51 Expectorations N°14-0219-0933 H1 ................................................................................... 37
Figure 52 Expectoration N°14-0219-0999 Q3 avec stérilisation.......................................................... 38
Figure 53 Expectoration N°14-0219-0999 Q4 avec stérilisation.......................................................... 38
Figure 54 Expectoration N°14-0219-0999 Q3 sans stérilisation.......................................................... 38
Figure 55 Expectoration N°14-0219-0999 Q4 sans stérilisation.......................................................... 38
Figure 56 Expectoration N°14-0219-0999 H1 ..................................................................................... 38
Figure 57 plaie opératoire superficielle 14-0219-0923 Q3 avec stérilisation ....................................... 39
Figure 58 plaie opératoire superficielle 14-0219-0923 Q4 avec stérilisation ....................................... 39
Figure 59 plaie opératoire superficielle 14-0219-0923 Q3 sans stérilisation ....................................... 39
Figure 60 plaie opératoire superficielle 14-0219-0923 Q4 sans stérilisation ....................................... 39
Figure 61 plaie opératoire superficielle 14-0219-0923 H1 .................................................................. 40
Figure 62 StaAur à 108 cfu/ml ............................................................................................................. 43
Figure 63 StaAur à 107 cfu/ml ............................................................................................................. 43
Figure 64 Pattern Q4 .......................................................................................................................... 44
Figure 65 Mix Etcfec 108, Staaur 108, Esccol 108 ....................................... Erreur ! Signet non défini.
54
11. Références iconographiques
Figure 10 : Copan. (2012). Copan WASP. Consulté le 13 03, 2014, sur Copan Innovating together:
http://www.copanusa.com/products/wasp/general/
Figure 11 : Biomérieux. (2009). Previ-Isola. Consulté le 03 13, 2014, sur Biomérieux:
http://www.biomerieux-usa.com
Toutes les autres illustrations sont des photos personnelles.
55
13. Lexique :
ATCC : American type culture collection
BHI : Brain Heart Infusion
ESCCOL : Escherichia coli
ETCFEC : Enterococcus feacalis
KLEPNE : Klebsiella pneumoniae
LCR : Liquide céphalo-rachidien
NaCl : Chlorure de sodium
PBS : tampon phosphate salin (phosphate buffered saline)
STAAUR : Staphylococcus aureus
WASP : Walk Away Specimen Processor
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Glossaire :
Biofilm : Couche en 3 dimensions formées par les bactéries. Composées de polysaccharides et de
canaux servant à faire passer les nutriments.
Bouillon BHI (Brain-Heart Infusion) : Bouillon d’enrichissement pour culture de micro-organismes.
Gram : La coloration de Gram est fondée sur l'action successive d'un colorant, le cristal violet, d'iode
puis d'un mélange d'alcool et d'acétone. Dans un premier temps, le colorant pénètre dans la paroi et
le cytoplasme. Dans un second temps, l'iode réagit avec le colorant et le rend insoluble. La
perméabilité plus grande des bactéries à Gram négatif à l'alcool permet la décoloration. Les bactéries
à Gram positif restent colorées en violet ou mauve. Une contre-coloration (par exemple en rose)
permet de visualiser à nouveau, les corps cellulaires des bactéries à Gram négatif.
McFarland 0.5 : Le McFarland 0.5 est un NaCl ensemencé avec des bactéries. L’inoculum contient
environ 108 germes par millilitre, on détecte cette concentration grâce au trouble que les bactéries
font dans le NaCl. Sa densité dépend donc du volume de la bactérie. Cet inoculum a été fait à la
base avec une souche d’Escherichia coli, le McFarland est donc moins précis avec d’autre souches
bactériennes.
Overnight : Bouillon d’enrichissement incuber durant 22h.
Sonication : La sonication est une étape nécessaire dans des prélèvements tels que les prothèses.
En effet, les germes fixés sur la prothèse forment un biofilm. Un moyen simple pour récolter ce
biofilm et pouvoir mettre les germes en cultures est la sonication. Cette technique consiste à
immerger la prothèse dans du PBS et de soumettre le tout à des ultrasons afin de décoller le biofilm
et de le récolter dans le PBS. L’ensemencement se fait ensuite à l’aide du PBS qui contient à présent
les germes.
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14. Annexe :
Autres photos du test 1 sans stérilisation Staaur et Etcfec Q3 (108 à 104) :
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Autres photos du test 1 sans stérilisation Staaur et Etcfec Q4 (108 à 104) :
59
Autres photos du test 1 sans stérilisation Staaur et Etcfec H1 (108 à 104) :
60
Autres photos du test 1 avec stérilisation Staaur et Etcfec Q3 (108 à 104) :
61
Autres photos du test 1 avec stérilisation Staaur et Etcfec Q4 (108 à 104) :
62
Autres photos du test 1 avec stérilisation Staaur et Etcfec H1 (108 à 104) :
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Test 2 autres mix Etcfec 108, Staaur 107, Esccol 106, Klepne 105 Q3, Q4 avec et sans
stérilisation et H1:
Test 2 autres mix Esccol 108, Etcfec 106 Q3, Q4 avec et sans stérilisation et H1:
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Test 3 autres photo avec Staaur de 109 à 105 Q3 avec et sans stérilisation:
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Test 3 autres photo avec Staaur de 109 à 105 Q4 avec et sans stérilisation:
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Test 3 autres photo avec Staaur de 109 à 105 H1 :
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Test 4 plaie op sup N° 0225 0835 :