analyse du ghb dans l’urine et le sang de personnes...
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Analyse du GHB dans l’urine et le sang de personnes vivantes et de personnes décédées, en vue de la définition de
l’intervalle des valeurs physiologiques chez les personnes vivantes et l’évaluation du délai post-mortem.
Avril 2008
Annette JORDAN, Ecole Supérieure de la Santé, Lausanne.
Responsables: Dr Marc AUGSBURGER Dr Frank SPORKERT Mme Catherine MEYLAN BOHNENBLUST
Unité de toxicologie et de chimie forensique, Centre Universitaire Romand de Médecine Légale, Site de Lausanne.
1 Sommaire
Le GHB est une molécule endogène, produite par le corps, et également une drogue de synthèse. Sa nature endogène engendre des problèmes d’interprétation. Y a-t-il eu réellement une absobtion ? Le dosage du GHB se fait par une extraction suivie d’une dérivatisation par MSTFSA puis par analyse par GCMS. Cette étude comporte trois grandes parties.
Une partie traite de la stabilité du GHB sanguin. Un prélèvement sanguin est effectué sur six personnes puis est analysé à différents intervalles jusqu’à 70 jours. Les tubes sont conservés à température ambiante, au réfrigérateur et au congélateur pour déterminer l’influence du mode de conservation.
La définition des valeurs de références du GHB endogène est utile lors de l’interprétation des résultats. Du sang et de l’urine d’une même personne (40 cas de routine du laboratoire) et 34 urines du LAD sont dosés pour connaître les valeurs normales de personnes n’ayant à priori pas consommé de GHB.
Pour 42 cas d’autopsies, du sang et de l’urine d’une même personne n’ayant a priori pas consommé de GHB sont dosé dans le but d’évaluer le délai post-mortem.
2 Abstract
GHB is an endogenous molecule, synthesized by the body, and a synthesis drug too. Its endogenous nature causes interpretative problems. Is there a real absorbtion of GHB ? The detection of GHB is done by an extraction than a derivatization and finaly analyzed by GCMS. This study contains three parts.
One speak about GHB stability in blood. A blood sample is taken on six persons and analyzed at differents times until 70 days. The blood is kept at room temperature, at fridge and at freezer to specify the conservation influence on GHB value.
The reference values of endogenous GHB is used to results interpretation. Blood and urine of a same person (40 cases of laboratory routine) and 34 urines from LAD were analyzed to know values of persons who have not taken GHB in principle.
For 42 cases of autopsy, blood and urine from a same person who have not taken GHB in principle was analyzed. The target is to evalue the post mortem period.
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3 Table des matières
1 Sommaire ....................................................................................................... 2
2 Abstract.......................................................................................................... 2
3 Table des matières ........................................................................................... 3
3 Introduction................................................................................................... 6
3.1 Définition....................................................................................................................... 6
3.1.1 Statistiques ............................................................................................................. 6
3.1.2 Historique ............................................................................................................... 6
3.1.3 Synonymes ............................................................................................................. 7
3.2 GHB de synthèse........................................................................................................... 7
3.2.1 Molécule de GHB................................................................................................... 7
3.2.2 Molécule de GBL................................................................................................... 7
3.3 Biosynthèse.................................................................................................................... 8
3.3.1 Pharmacocinétique ................................................................................................. 9
3.4 Utilisations..................................................................................................................... 9
3.4.1 Thérapeutique......................................................................................................... 9
3.4.2 Soumission chimique ........................................................................................... 10
3.4.3 Drogue.................................................................................................................. 10
3.4.4 Mode d’action ...................................................................................................... 10
3.4.5 Dopage ................................................................................................................. 10
4 Buts du travail ............................................................................................. 11
4.1 Techniques d’analyses du GHB ................................................................................ 11
4.2 Valeurs de références ................................................................................................. 12
4.2.1 Ante-mortem ........................................................................................................ 12
4.2.2 Post-mortem ......................................................................................................... 13
5 Matériel ........................................................................................................ 14
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5.1 Matériel biologique .................................................................................................... 14
5.1.1 Stabilité (Cv) ........................................................................................................ 14
5.1.2 Personnes vivantes (V)......................................................................................... 14
5.1.3 Autopsies (A) ....................................................................................................... 15
5.1.4 Numérotation........................................................................................................ 15
5.2 Instruments, matériel, solutions et réactifs.............................................................. 15
5.2.1 Instruments ........................................................................................................... 15
5.2.2 Matériel ................................................................................................................ 17
5.2.3 Solutions et réactifs .............................................................................................. 18
6 Méthode........................................................................................................ 20
6.1 Préparation ................................................................................................................. 20
6.1.1 Standard interne.................................................................................................... 20
6.1.2 Droite d’étalonnage .............................................................................................. 20
6.1.3 Echantillons.......................................................................................................... 21
6.1.4 Extraction ............................................................................................................. 21
6.1.5 Dérivatisation ....................................................................................................... 21
6.2 Marche à suivre .......................................................................................................... 22
6.3 La chromatographie gazeuse et la spectrométrie de masse : aspects généraux ... 22
6.4 Utilisation des GCMS................................................................................................. 24
6.4.1 Nettoyage de l’appareil ........................................................................................ 24
6.4.2 Contrôle du bon fonctionnement.......................................................................... 24
6.4.3 Séquence d’injection ............................................................................................ 24
6.5 Différences entre les deux appareils ......................................................................... 25
6.5.1 Méthode................................................................................................................ 25
6.5.2 Laine de verre....................................................................................................... 25
6.6 Traitement du résultat :............................................................................................. 25
6.6.1 Doubles pics ......................................................................................................... 26
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6.6.2 Droite de calibration............................................................................................. 27
7 Résultats ....................................................................................................... 28
7.1 Stabilité (Cv) ............................................................................................................... 28
7.1.1 Résumé du but...................................................................................................... 28
7.1.2 Résultats ............................................................................................................... 28
7.1.3 Discussion ............................................................................................................ 33
7.2 Personnes vivantes (V) ............................................................................................... 34
7.2.1 Résumé du but...................................................................................................... 34
7.2.2 Résultats ............................................................................................................... 35
7.2.3 Discussion ............................................................................................................ 37
7.3 Autopsies (A)............................................................................................................... 38
7.3.1 Résumé du but...................................................................................................... 38
7.3.2 Résultats ............................................................................................................... 38
7.3.3 Discussion ............................................................................................................ 39
7.4 Discussion générale sur la méthode .......................................................................... 40
8 Conclusion.................................................................................................... 41
9 Lexique......................................................................................................... 43
10 Lexique des abréviations ........................................................................ 45
11 Références bibliographiques .................................................................. 46
12 Annexes .................................................................................................... 48
Les mots surlignés en gras dans ce travail sont définis dans le lexique.
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3 Introduction
3.1 Définition
L’acide gamma-hydroxybutirique ou GHB est une substance de synthèse mais aussi endogène. On le retrouve naturellement dans la plupart des tissus chez les mammifères. Le GHB agit comme neurotransmetteur et neuromodulateur. Il était utilisé en médecine comme agent anesthésique et hypnotique depuis les années 60. (Ferrara, Frison, Tedeschi & Le Beau, 2001, p.107).
Il est actuellement utilisé en Suisse pour le traitement de la cataplexie dans les cas de narcolepsie. La substance est un stupéfiant (Compendium suisse des médicaments 2007). Selon Ghysel (1999), « … il (GHB) est également utilisé à des fins non médicales chez des individus pratiquant le culturisme, chez des adeptes de produits psychoactifs. Il a également été utilisé à des fins criminelles pour soumettre des individus » (p. 129).
3.1.1 Statistiques
Entre 1997 et 2005, le CSIT (Centre Suisse d’Information toxicologique) a enregistré 334 cas d’intoxication par du GHB dont un cas mortel. Pour 271 d'entre eux, il s'agissait d'une intoxication aiguë consécutive à une absorption volontaire de GHB et pour 28, d'une intoxication aiguë non intentionnelle. 23 cas concernaient une exposition chronique. (Office fédéral de la santé public, 2007).
3.1.2 Historique
En 1874, Alexandre Saytzeff a décrit la préparation de ces sels (Ghysel, 1999, p.130). En 1961, il fut synthétisé pour la première fois par le professeur Henri Laborit. Dans les années 60, le GHB a commencé à être utilisé comme agent anesthésique et hypnotique (Ferrara, Frison, Tedeschi & Le Beau, 2001, p.107). Au début des années 80, il est utilisé par les bodybuilders aux USA pour ses effets anabolisants. Dans la fin des années 80, il est consommé comme drogue « ecstasy liquide ». Les effets sont semblables à l’alcool ou aux benzodiazépines. (Andresen, 2008.) En 2002, le GHB est soumis à la législation sur les stupéfiants. En 2005, le GHB est utilisé en Suisse comme médicament.
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3.1.3 Synonymes
Le GHB est plus couramment connu sous le nom de la « drogue du violeur ». Il est aussi connu sous le nom d’ecstasy liquide. Ferrara, Frison, Tedeschi & Le Beau, (2001) recensent une vingtaine de noms de rue « streets names » (p. 108).
Le nom de la molécule utilisé par le Compendium suisse des médicaments est l’oxybate de sodium, il est commercialisé sous le nom de Xyrem®.
3.2 GHB de synthèse
3.2.1 Molécule de GHB
Formule brute : C4H8O3 Poids moléculaire : 104 Point d’ébullition : 178- 180°C
GHB
Le sel sodique du GHB est synthétisé à partir de gamma-butyrolactone (GBL) et d’hydroxide de sodium (NaOH).
Son sel de sodium C4H7NaO3
Poids moléculaire 126.1
3.2.2 Molécule de GBL
Formule : C4H6O2
Poids moléculaire : 86.1 Point de fusion: -43 à -45°C Point d’ébullition: 204 à 206°C
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GBL
La différence entre le GHB et le GBL est que le GBL a perdu une molécule d’eau.
Le NaOH s’appelle aussi soude caustique et le GBL se trouve dans des décapants pour peintures. Ces deux produits sont en vente dans le commerce. Sur internet, la recette pour la synthèse en laboratoire se trouve facilement ainsi que la recette simple à effectuer dans sa cuisine. La synthèse s’effectue aisément. Le GHB est donc accessible à tous et n’est pas cher.
3.3 Biosynthèse
La substance endogène est produite dans le cerveau à partir de l’acide gamma-aminobutyrique (GABA). Le GABA est catabolisé par une acide gamma-amminobutyrique transaminase en semi-aldéhyde succinique (SAS). Le SAS est oxydé en succinate par une semi-aldéhyde succinique déshydrogénase. Une faible part du SAS est réduite en GHB. (Ghysel, 1999, p.129-130).
GABA transaminase GABA SAS
SAS déshydrogénase SAS Succinate
Réduction Succinate GHB
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3.3.1 Pharmacocinétique
L’absorption est rapide mais incomplète après une prise orale. Elle est retardée après un repas riche en graisses. La biodisponibilité est de 25 %. Moins de 1% est lié aux protéines plasmatiques. Le GHB a une demi-vie de 0.5 à 1 heure. Son analyse doit être effectuée rapidement après la prise.
Le GHB est catabolisé soit par une β-oxydation en 4-hydroxycrotonine, soit par oxydation d’une GHB déshydogénase en SAS qui est métabolisé en acide succinique par la désydrogénase semi-aldéhyde succinique. L’acide succinique entre dans le cycle de Krebs où il est métabolisé en gaz carbonique et en eau. Le GHB peut aussi être dégradé en SAS par une transhydrogénase en présence d’alpha-cétoglutarate. Il existe une autre voie qui fait intervenir une β-oxydation et du 3,4-hydroxybutyrate pour arriver à la formation d’acétyl CoA. Ce dernier entre dans le cycle de l’acide citrique pour conduire à la formation de gaz carbonique et d’eau.
L’élimination se fait presque entièrement par une transformation en gaz carbonique qui sera ensuite expiré. Moins de 5% est éliminé sous forme inchangée dans l’urine 6 à 8 heures après absorbtion.
Aucun métabolite actif n’a été identifié.
La pharmacocinétique décrite ci-dessus est celle du médicament Xyrem®. (Compendium suisse des médicaments, 2007).
3.4 Utilisations
3.4.1 Thérapeutique
Le GHB est utilisé pour traiter la cataplexie chez des patients atteints de narcolepsie. Il est un dépresseur du système nerveux central (SNC). Le mécanisme n’est pas précis, il agirait en favorisant le sommeil à ondes lentes et en consolidant la durée du sommeil nocturne. L’alcool peut provoquer une potentialisation des effets dépresseur du SNC.
Les effets indésirables passent par un état confusionnel agité, des vomissements, une transpiration profuse, des maux de têtes ainsi qu’une vision trouble. En cas de surdosage, les effets peuvent aller jusqu’au coma. (Compendium suisse des médicaments 2007).
En Italie, le GHB à forte dose a été essayé comme traitement de substitution de l’alcoolisme. Son but est de couper le « craving » le besoin compulsif de consommer de l’alcool en cas de dépendance psychique. (Lüscher, 2008).
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3.4.2 Soumission chimique
Le GHB est une drogue utilisée dans les soumissions chimiques et le plus fréquemment afin de commettre un viol. Il a aussi été employé pour obtenir une signature ou pour effectuer un vol.
Dans ces cas le GHB est idéal car : • Le GHB pur n’a ni goût, ni odeur, ni couleur. Il est donc indétectable par la personne qui
l’absorbe. • Une personne sous l’influence de GHB présente les mêmes symptômes qu’un individu
sous l’emprise d’alcool. • Le GHB a une action rapide et une élimination rapide. • Des prélèvements sanguins et urinaires ne sont pas systématiquement effectués. • De plus, la présence de GHB endogène dans le corps rend l’interprétation des résultats
difficile.
(Ferrara, Frison, Tedeschi & Le Beau, 2001, p.116-117).
3.4.3 Drogue
Une dose légère de GHB induit un état agréable de relaxation, de tranquillité, de douce euphorie, une tendance à parler, une chaleur émotionnelle et un état de somnolence. (Ferrara, Frison, Tedeschi & Le Beau, 2001, p.115). Ce sont les principaux effets recherchés par ceux qui utilisent le GHB comme une drogue.
Une consommation régulière de GHB peut entraîner une dépendance physique et une accoutumance. Une consommation régulière peut rendre les personnes tolérantes aux effets du GHB. (Stratégie nationale antidrogue, 2008).
3.4.4 Mode d’action
La cellule dopaminergique produit de la dopamine qui induit l’effet recherché de la drogue. La cellule GABA est inhibitrice de la cellule dopaminergique. Le GHB agit en inhibant l’action des cellules GABA mais aussi de la cellule dopaminergique mais dans une moindre mesure. Le GHB induit donc une libération augmentée de dopamine.
Selon Ghysel, (1999) « …, il (GHB) entrainerait une inhibition de la libération de la dopamine et une augmentation de sa synthèse, ces deux effets se traduisant par une augmentation globale du niveau de dopamine. » (p.131).
3.4.5 Dopage
Selon Ghysel, (1999) « Le GHB a été utilisé comme complément alimentaire chez les adeptes de culturisme car il augmenterait la libération de l’hormone de croissance. » (p.132).
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4 Buts du travail
Ce travail comporte trois grandes parties.
• Le GHB étant un produit de dégradation, sa concentration pourrait donc augmenter au cours du temps et plus précisément lors de la conservation d’un échantillon. Le danger est que la concentration augmente significativement et pose un problème pour l’interprétation des résultats : y a-t-il réellement eu consommation ? Un objectif de ce travail est d’analyser des échantillons sanguins afin d’étudier la stabilité du GHB au cours du temps. Les prélèvements sont analysés le lendemain de la prise de sang puis à différents intervalles jusqu’à 70 jours. Le but est d’observer si la concentration de GHB a tendance à augmenter, à diminuer ou à rester stable après conservation à différentes températures.
• Les valeurs de référence pour le GHB ne sont pas faciles à déterminer. Il faut trouver un cut-off, une valeur qui départage le GHB endogène du GHB exogène. Le GHB endogène peut varier d’un individu à l’autre. Le GHB exogène est rapidement métabolisé. Il est donc souvent très difficile de déterminer si la personne en a consommé ou pas.
Un objectif est d’analyser des échantillons de sang et d’urine chez des personnes n’ayant à priori pas consommé de GHB afin de déterminer l’intervalle des valeurs physiologiques. Les échantillons proviennent de la routine du laboratoire. Les analyses sont effectuées le plus rapidement possible après réception de l’échantillon au laboratoire pour avoir des intervalles de valeurs physiologiques au plus proche de la réalité.
• Après le décès, le corps se décompose et le GHB est un produit de dégradation. Il y a donc une production de GHB post-mortem. Un objectif est l’analyse d’échantillons de sang et d’urine post-mortem chez des personnes n’ayant à priori pas consommé de GHB, afin d’évaluer l’intérêt de la mesure du GHB pour estimer le délai post-mortem. Pour cela, il faut connaître les dates précises du décès, de l’autopsie (prélèvement), de l’analyse ainsi que des informations sur la conservation du corps et du type de prélèvements et leur conservation.
4.1 Techniques d’analyses du GHB
Le laboratoire utilise une méthode d’analyse qui commence par une extraction liquide-liquide, suivie d’une dérivatisation avec silylation et se termine par une analyse en chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GCMS).
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Il existe d’autres principes analytiques mentionnés dans la littérature :
• Précipitations des protéines à pH acide. • Passage de GHB à GBL puis mesure du GBL total.
Une méthode d’analyse développée par Saudan, Augsburger, Kintz, Saugy et Mangin (2007) permet le calcul du rapport isotopique C12/C14. Cette méthode se base sur la différence du rapport actuel endogène et du rapport du GHB exogène provenant du pétrole. Ces analyses se font par chromatographie gazeuse, combustion, rapport isotopique et spectrométrie de masse.
4.2 Valeurs de références
4.2.1 Ante-mortem
Plusieurs laboratoires ont fait des études pour déterminer ces valeurs de références. Ces valeurs appelées « cut-off » ont pour but d’essayer de déterminer si la concentration obtenue est endogène ou due à une prise exogène.
L’étude de Crookes, Faulds, Forrest et Galloway (2004) propose pour l’urine un « cut-off » urinaire de 5 mg/l. Ils ont utilisé une méthode d’extraction liquide-liquide, d’une dérivatisation silylée et une analyse par chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse. Ils ont dosé le GHB dans 50 urines de femmes. Leur valeur la plus haute est de 1.46 mg/l. Ils ont remarqué que la concentration diminue avec l’âge de la personne, ils proposent donc de corriger la valeur en calculant le rapport GHB/créatinine. La créatinine diminue aussi avec l’âge. Ce rapport permet de rendre une valeur ne dépendant pas de l’activité rénale.
L’étude de LeBeau, Christenson, Levine, Darwin et Huestis (2002) propose un « cut-off » urinaire de 10 mg/l. Leur étude a porté sur l’analyse urinaire de huit personnes (cinq hommes et trois femmes) pendant une semaine. Le résultat démontre qu’il y a des variations significatives entre les individus et aussi chez une même personne. La concentration de 10 mg/L est valable chez les individus non atteints de GHB acidurie (maladie génétique rare caractérisée par une production de GHB en grande quantité par le corps).
L’étude d’Elliott (2003) donne une concentration urinaire maximale de 3 mg/l. Pour ce résultat, il a analysé 144 urines. Il a également dosé 25 échantillons de plasma qui sont inférieurs à 2.5 mg/l (limite de détection de la méthode). Il a dosé les urines d’un homme et d’une femme en leur faisant subir plusieurs types de diète, il a remarqué que la concentration urinaire ne paraît pas en être affectée. Il propose un « cut-off » de 10 mg/l pour l’urine et un cut-off de 4 mg/l pour le plasma. Les valeurs inférieures ne permettent pas de déterminer la nature endogène ou exogène.
Les trois études présentées ci-dessus portent sur des nombres différents de mesures. Les « cut-off » urinaires proposés varient de 3 à 10 mg/l. Le problème d’interprétation se pose en présence d’une valeur inférieure à 10 mg/l, y-a-t’il eu une consommation de GHB ?
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Dans la méthode d’analyse, le laboratoire donne : Taux thérapeutiques : < 1 μg/ml Taux toxiques : 26-360 μg/ml Taux létal : >750 μg/ml (Winek, C. L., Wahba, W. W., Winek, C. L. Jr., Winek Balzer, T., 2001, cité par Meylan, C., 2007)
Ces valeurs ne permettent pas de distinguer l’endogène de l’exogène. Au laboratoire, le « cut-off » de 10 mg/l pour l’urine est utilisé.
Le catabolisme du GHB se fait grâce au cycle de Krebs. Une diminution de l’activité de ce cycle induit une augmentation de la concentration du GHB. La conservation des tubes sanguins devrait se traduire par une augmentation du GHB sanguin.
4.2.2 Post-mortem
Le phénomène d’augmentation de concentration dans le sang et les tissus du GHB post-mortem est du à la diminution d’activité du cycle de Krebs qui catabolise la molécule. (Ferrara, Frison, Tedeschi & Le Beau, 2001, p.119).
Selon Selon Ghysel (1999), « En l’absence d’urine dans les prélèvements post-mortem, l’analyse de l’humeur vitrée est importante car la formation post-mortem de GHB peut se produire dans le sang, pas dans l’humeur vitrée. » (p.136).
La concentration sanguine du GHB post-mortem est très difficile à interpréter. C’est pourquoi un dosage urinaire ou dans l’humeur vitrée peut apporter un résultat fiable.
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5 Matériel
5.1 Matériel biologique
5.1.1 Stabilité (Cv)
Le sang provient de collaborateurs du laboratoire. Un prélèvement a été effectué sur six personnes différentes. Le sang de la sixième personne est divisé en deux afin d’obtenir 7 tubes à analyser.
Le sang a été récolté dans des tubes fluorés. Ce choix a été fait car le sang pour les dosages du GHB se trouve généralement récolté dans ce type de tube. Il est aussi le plus couramment utilisé au laboratoire.
Chaque prélèvement est divisé en trois parts égales. Une part a été conservée à température ambiante au laboratoire, une autre au réfrigérateur et la dernière au congélateur.
Un suivi des températures est effectué au laboratoire grâce au système d’enregistrement LogTag. Un relevé est effectué chaque 15 minutes et les résultats sont représentés sous formes de graphiques. Pour mon travail, le relevé des températures permet de s’assurer des conditions de conservations des échantillons. Les tubes conservés à température ambiante étaient proches du détecteur (Labo principal) à environ 26°C. Au réfrigérateur (IN 31-15, analyses en cours), il faisait environ 5°C et au congélateur (IN 32-21, congélateur des « viols ») environ -21°C. En annexe se trouvent les graphiques des relevés des températures. Les prises de sang ont eu lieu le 22 janvier et la dernière analyse a été effectuée le 1er avril 2008.
5.1.2 Personnes vivantes (V)
Les échantillons proviennent de cas de routine du laboratoire. Les réceptions les plus récentes sont choisies pour être au plus proche de la concentration endogène. Le GHB est un produit de dégradation et sa concentration pourrait augmenter avec le temps dans le tube. Des prélèvements de sang et d’urine de mêmes personnes sont dosés pour établir un parallèle. Ces échantillons sont généralement conservés au réfrigérateur (IN 31-15, analyse en cours) à environ 4°. Les cas de viol sont conservés au congélateur (IN 32-21, congélateur des viols) à environ -21°C Ces cas de viol concernent aussi les suspicions et les tentatives, le viol n’étant pas forcément avéré.
Les cas de routine de personnes vivantes du laboratoire sont divisés en deux grandes catégories : les cas médicaments et drogues au volant (MDV) et la toxicologie générale (TOX).
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Les cas médicaments et drogues au volant sont des échantillons prélevés suite à un contrôle routier ou à un accident de la circulation. La police les effectue lors de suspicion de consommation de substances pouvant avoir une influence sur la conduite automobile.
La toxicologie générale concerne toutes les analyses demandées par un juge ou un médecin.
Des échantillons d’urine en provenance du Laboratoire d’Analyse du Dopage (LAD) ont aussi été utilisés pour cette partie du travail. Il s’agit de prélèvements effectués sur des culturistes. Pour ces urines, nous n’avons pas le sang correspondant et aucune information quant à la date de prélèvement ou sur la personne concernée.
5.1.3 Autopsies (A)
Les échantillons proviennent d’autopsies effectuées au CURML à Lausanne (anciennement IUML) entre 2006 et 2007. Les autopsies choisies sont celles pour lesquelles la date et parfois l’heure de la mort sont connues et pour lesquelles de l’urine est à disposition. Des analyses toxicologiques n’ont pas forcément été effectuées sur ces prélèvements.
Après la mort, les tissus se dégradent et deviennent perméables. La proximité du cœur avec l’estomac fait que des molécules ingérées diffusent directement dans le sang cardiaque. C’est pourquoi le sang cardiaque n’est souvent pas pris pour les dosages car les concentrations de certaines de ces substances peuvent être anormalement élevées. Les échantillons analysés ici proviennent de personnes n’ayant à priori pas consommé de GHB. Le sang cardiaque peut donc être pris en compte lors de l’analyse. Par contre le résultat pour le sang prélevé sur EDTA (A004) ne peut pas être pris en compte car il ne correspond pas aux conditions de conservation.
5.1.4 Numérotation
La numérotation des échantillons est propre à cette étude. Les échantillons sont d’abord identifiés par une lettre puis par un nombre. La lettre correspond à une partie du travail : V pour personne vivante, Cv pour la stabilité (conservation) des échantillons de personnes vivantes et A pour les autopsies.
5.2 Instruments, matériel, solutions et réactifs
5.2.1 Instruments
Balance (pesée du sang)
• Modèle : AC 88 Fabricant : Metler N° de série : 790535 N°LTCF : IN 28-03
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Bain-marie (Décongélation des échantillons)
• Nom : Bain-marie à agitation Fabricant : Kötterman N° de série : pas trouvé N°LTCF : IN 24-05
• La fonction agitation n’a pas été utilisée.
Centrifugeuse (Reprise du solvant après extraction)
• Modèle : 5417 R Fabricant : Eppendorf N° de série : 5407 04910 N°LTCF : IN 22-04
Chromatographes en phase gazeuse et spectromètres de masse (GCMS) (Analyse de l’échantillon)
• N° LTCF : IN10-02 (73N) GC : 6890 N Netwok GC System MS: 5973 N inert Fabricant : Agilent Technologies N° de série : U500033633
• N° LTCF : IN10-06 (73NNS) GC : 6890 Series GC System MS: 5973Netwok Mass Selective Detector Fabricant : Agilent Technologies N° de série : CN10343030
Etuve (Dérivatisation)
• N° article : 9010-0096 ED115 Fabricant : Binder N° de série : 06-96382 N°LTCF : IN 26-03
Evaporateurs à azote (Évaporation du solvant après pipetage des standards et extraction dans l’acétonitrile)
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• Modèle : Reacti-Therm III Fabricant : Pierce N° de série : 584 00172 N°LTCF : IN 23-01
• Modèle : TurboVap® LV Fabricant : Caliper Life Sciences N° de série : pas trouvé N°LTCF : IN 23-03
• La fonction pour chauffer de ces deux appareils n’a pas été utilisée car le GHB est volatil.
Vortex (Mélange du solvant avec l’échantillon biologique)
• Modèle : Vortex Genie Fabricant : Scientific Industries N° de série : Z-5449 N°LTCF : IN 25-02
• Modèle : Vortex Genie Fabricant : Scientific Industries N° de série : Z-37533 N°LTCF : IN 25-04
• Modèle : Vortex Genie Fabricant : Scientific Industries N° de série : Z-5559 N°LTCF : IN 25-06
5.2.2 Matériel
• Tubes de 10 ml en verre avec bouchons et téflons (reprise du solvant et dérivatisation).
• Pipettes de Soccorex, Eppendorf et Gilson
• Multipipettes Eppendorf
• Embouts
• Seringues Hamilton (pipetage des standards et du dérivé)
• Tubes Eppendorf de 2 ml
• Microvials pour échantillons : Infochroma AG (flacons spéciaux pour GCMS)
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• Vials de Agilent Technologies
• Bouchons à sertir 11mm et pince à sertir
• Verrerie diverse
5.2.3 Solutions et réactifs
• Méthanol (Solvant des standards, de rinçage pour les seringues) Fluka 65543 puriss. <99.8 % N° LTCF : IM1a
• Acétonitrile (Solvant d’extraction, de rinçage entre échantillons pour le GCMS) Fluka 00700 puriss. >99.5 % N° LTCF : IA5b
• MSTFA (N-Methyl-N-trimethylsilyltrifluoroactonamide) (Agent de dérivatisation) Macherey-Nagel AG N° LTCF : RD 20
• Chlorure de Sodium (NaCl 0.9% pour dilution des échantillons) N° LTCF : IVd2
• Mélange méthanolique de contrôle (Contrôle du bon fonctionnement du GCMS) N° LTCF : SNEL 35
• Standard interne (Vérification de l’extraction et résultats) Solution de GHB-D6 à 10 ug/ml dans du méthanol N° LTCF : S G06.10 Fait à partir de :
o Ampoules de 1 ml à 1 mg/ml de Gamma-Hydrxy Butiric Acid-D6 (GHB-D6) Fabricant : Lipomed AG N° lot: 752.1B1.1L2 N° LTCF: aG06q
o Ampoules de 1 ml à 1 mg/ml de Gamma-Hydrxy Butiric Acid-D6 (GHB-D6) Fabricant : Cerilliant N° lot: 35196-58A N° LTCF: aG06t
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• Standard (Droite de calibration) Solution de GHB à 10 ug/ml dans du méthanol N° LTCF : S G05.10 Fait à partir de :
o Ampoules de 1 ml à 1 mg/ml de Gamma-Hydrxy Butiric Acid Fabricant: Cerilliant N° lot: 31544-31I N° LTCF: aG05d
• Sang négatif (Droite de calibration et blanc sans standard interne) Sang de bovin
• Contrôle qualité interne : inexistant dans le commerce
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6 Méthode
La méthode d’analyse se décline en trois grandes étapes : la préparation de l’échantillon comprenant l’extraction et la dérivatisation, l’analyse par GCMS (chromatographie gazeuse couplée à un spectromètre de masse) et le traitement des résultats.
Les échantillons congelés sont au préalable amenés à température ambiante parfois à l’aide d’un bain-marie à 30°C (IN 34-05).
La méthode est quantitative et sa limite de détection 0.5 μg/ml.
6.1 Préparation
6.1.1 Standard interne Le standard interne (SI) est du GHD-D6 deutéré. Une substance deutérée est une substance où les atomes d’hydrogène ont été remplacés par un atome de Deutérium. Le Deutérium est un atome d’hydrogène qui contient un proton et un neutron, sa masses est donc le double de celle de l’hydrogène. Le GHB-D6 contient 6 atomes d’hydrogène deutéré, son poids moléculaire est de 110 (poids moléculaire de GHB : 104).
Le SI est un contrôle du bon fonctionnement de l’extraction. Le SI permet aussi d’aplanir les différences lors de la préparation pour l’analyse entre les tubes. Le rapport aire du GHB/aire du SI est calculé et utilisé pour la droite de calibration. Par exemple lors de la reprise du solvant après extraction, si une petite quantité est reprise, cela n’a aucune importance car le rapport ne varie pas.
Le standard interne est pipeté dans tous les tubes (standards et échantillons) sauf le blanc négatif. Ce dernier est un tube ne contenant pas de standard interne, il permet de s’assurer de l’absence de contamination lors du pipetage et de l’absence de pic de contamination à l’analyse au GCMS.
6.1.2 Droite d’étalonnage
Le standard est pipeté à chaque fois à une concentration différente pour établir la droite d’étalonnage. Les points sont à 0, 0.5, 1.0, 3.0 (2x), 5.0, 10.0 et 20.0 μg/ml. Le standard à 3.0 μg/ml est effectué à double, l’échantillon effectué à double est passé une fois en début et une fois en fin de série, ce qui permet d’avoir un contrôle interne pour l’injection sur le GCMS. Le blanc avec standard interne est le point à 0 μg/ml de la droite. Ce n’est pas le même tube que le blanc sans standard interne.
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Après le pipetage du standard interne et des points de la droite, les tubes sont évaporés sous azote à température ambiante. L’évaporation concerne uniquement le solvant et le GHB et le GHB-D6 sont gardés au fond du tube.
6.1.3 Echantillons
Du sang négatif de bovin est utilisé pour la droite et le blanc sans standard interne. Les échantillons de sang sont pesés, la concentration peut varier d’une personne à l’autre et il est souvent de mauvaise qualité en cas d’autopsie. Le sang est analysé à double. Les échantillons d’urine sont analysés à concentration normale et dilués dix fois (1/10) dans du NaCl 0.9%.
6.1.4 Extraction
L’extraction se fait grâce à de l’acétonitrile. Ce solvant est mélangé avec l’échantillon permettant le passage des substances à analyser.
Les deux phases, aqueuse et organique, sont séparées par centrifugation et le surnageant (le solvant) prélevé puis évaporé sous azote à température ambiante. Il reste seulement un résidu sec contenant les molécules extraites au fond du tube.
6.1.5 Dérivatisation
La dérivatisation est effectuée grâce à un dérivé, le MSTFA (N-Methyl-N-trimethylsilyltrifluoroactonamide). La dérivatisation permet de stabiliser la molécule au moment de l’injection dans le GCMS et d’augmenter sa spécificité lors de la détection. La dérivatistion augmente le poids moléculaire de la molécule. Les fragments obtenus après passage dans le spectromètre de masse auront donc une masse plus élevée et seront donc plus spécifiques (plus la masse est petite plus elle se rapproche du bruit de fond).
La dérivatisation se fait ici par silylation de la molécule. Un groupe silyl appelé aussi TMS est ajouté à chaque extrémité de la molécule à la place d’atome d’hydrogène.
GHB dérivé par silylation (GHB 2TMS)
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Les tubes sont chauffés pour accélérer la dérivatisation, refroidis puis le contenu transféré dans un microvial et injecté au GCMS pour séparation et détection.
6.2 Marche à suivre
• Pipeter 125 ul de standard interne GHB-D6, solution à 10 μg/ml (S G06.10) dans un tube Eppendorf. La concentration finale du standard interne est de 25 μg/ml.
• Pipeter le standard GHB, solution à 10 μg/ml (S G05.10) : 0, 2.5, 5, 15 (2x), 25, 50 et 100 μl. Les concentrations de la droite sont à 0, 2.5, 5, 15 (2x), 25, 50 et 100 μg/ml.
• Evaporer sous azote à température ambiante. Le GHB est une substance volatile, il est donc important de ne pas chauffer les tubes à 37°C.
• Prélever 50 μl d’échantillon, peser le sang.
• Ajouter 200 μl d’acétonitrile.
• Vortexer 30 secondes.
• Centrifuger 5 min à 12000 tours minutes (=15300g).
• Prélever le surnageant dans un tube en verre de 10 ml.
• Evaporer sous azote à température ambiante.
• Ajouter 100 μl de MSTFA.
• Chauffer 20 minutes à l’étuve à 90°C, puis laisser refroidir.
• Transférer dans un microvial, sertir.
• Injecter au GCMS.
(Voir annexe : Dosage de GHB, MA 32 853)
6.3 La chromatographie gazeuse et la spectrométrie de masse : aspects généraux
La chromatographie est une méthode de séparation et de quantification de composés présents dans une phase homogène liquide (chromatographie liquide) ou gazeuse (chromatographie gazeuse). Pour la phase gazeuse, les composés sont sous forme gazeuse ou susceptibles d’être vaporisés par chauffage sans se décomposer.
Le principe est basé sur l’équilibre successif entre deux phases dont l’une est dite stationnaire (fixe), emprisonnée dans la colonne et l’autre mobile qui se déplace grâce au vecteur (ici
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l’hélium) en entraînant les substances. Les composés se séparent selon leur taille et leur affinité avec la phase fixe.
• Le chromatogramme permet d’obtenir des informations qualitatives (temps de rétention d’un composé) et quantitative (aire du pic chromatographique).
• Domaine de mesure : 10-3-10-9g. Ordre du ng. (p.2/30)
La spectrométrie de masse désigne une méthode d’analyse qui repose sur la détermination des masses des espèces atomiques ou moléculaires individuelles.
Elle permet de recueillir des informations sur la nature, la composition et le structure des espèces présentes dans l’échantillon analysé. (p.20/30)
Parcours de la molécule de GHB dans le GCMS
La molécule est d’abord injectée dans le liner (tube en verre) où elle est vaporisée puis passe dans la colonne capillaire. La molécule migre dans la colonne. La migration varie selon la température, la pression, la taille et l’affinité de la molécule pour la phase fixe.
La molécule passe ensuite par l’interface puis dans le spectromètre de masse. Dans la source, la molécule est bombardée par des électrons et se fragmente. Les fragments migrent dans le quadripôle qui agit comme filtre. Chaque fragment arrive au multiplicateur qui multiplie leur signal. Le signal est transformé en un spectre de masse. (2008, « Chromatographie et spectrométrie de masse »)
Spectre de masse du GHB dérivé
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6.4 Utilisation des GCMS
6.4.1 Nettoyage de l’appareil
Avant chaque série l’appareil est nettoyé. Le liner (tube où a lieu la vaporisation) est changé. Le « gold seal » (pièce contre laquelle le liner s’appuie) est nettoyé. Au besoin la colonne est coupée et la pression du merlin vérifiée.
6.4.2 Contrôle du bon fonctionnement
Un contrôle du spectromètre de masse est effectué par une calibration autotune. Pour le GCMS, un mélange de contrôle méthanolique est passé. Ce mélange permet de s’assurer du bon fonctionnement du GC, de la sensibilité, de la couverture de tous les temps de rétention et des différentes familles de substances.
6.4.3 Séquence d’injection
• Solvant de rinçage
• Droite de calibration dans l’ordre croissant des concentrations
• Solvant de rinçage
• Dernier point de la droite passé en mode scan
• Solvant de rinçage
• Sang, patient 1
• Urine, patient 1
• Solvant de rinçage
• Sang, patient 2
• Urine, patient 2
• Solvant de rinçage
• Contrôle interne bis (deuxième passage d’un point de la droite)
• Solvant de rinçage
• Solvant de rinçage
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Le MSTFA est contenu dans de l’acétonitrile, ce solvant est dont aussi utilisé comme solvant de rinçage.
La droite et les échantillons sont passés en mode SIM de la méthode GHB. La méthode SIM détecte des ions choisis à l’avance et effectue plusieurs fois la détection ce qui augmente la sensibilité. Le mode SIM ne permet pas l’identification de la substance.
Pour chaque série, un balayage unique de tous les ions (mode SCAN) est effectué pour s’assurer que c’est bien du GHB. Une identification n’est possible qu’en SCAN. Le dernier point de la droite est ainsi passé à double, une fois en mode SIM pour la quantification et une fois en mode SCAN pour l’identification.
Les ions utilisés pour le dosage du GHB sont les ions 235, 204 et 233 pour le GHB et 241, 206 et 239 pour le GHB-D6. Les ions de la substance et de son deutéré sont très proches. Le ion 235 correspond au 241, le 204 au 206 et le 233 au 239. On utilise le spectre de masse pour détecter spécifiquement ces ions.
6.5 Différences entre les deux appareils
6.5.1 Méthode
La méthode d’analyse est la même pour les deux appareils. Elle diffère sur les paliers d’augmentation de la température de la colonne en début d’injection. Cela n’a aucune influence sur le résultat final. (Voir annexes : Méthode d’analyse pour IN 1006, GHB602.M et pour IN 1002, GHB203.M)
6.5.2 Laine de verre
De la laine de verre est introduite dans le tiers inférieur du liner pour retenir les impuretés pour l’appareil IN 1002. Alors que pour le IN 1006, l’analyse s’effectue sans laine de verre.
6.6 Traitement du résultat :
Pour les calculs de concentration, on utilise l’aire des pics obtenus pour chaque ion au temps de rétention de la molécule. L’aire des pics est normalement définie automatiquement grâce à une macro.
Une macro est un programme informatique qui traite des résultats. Ici elle définit l’aire du pic et donne son aire.
Exemple de résultat :
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Echantillon A031 injecté le 13.03.2008 sur l’IN 1002
Chaque fenêtre correspond à un ion. En ordonnée (axe x) se trouve le temps de rétention et en abscisse (axe y), l’abondance.
6.6.1 Doubles pics
Ce sont des pics du GHB et GHB deutéré qui se trouvent sous forme dédoublées.
Exemple de double pic
Standard 10μg/ml injecté le 13.03.2008 sur l’IN 1002
Ce phénomène a été observé aléatoirement sur les deux instruments. Les doubles pics ne sont pas dus à l’échantillon : un même échantillon a été injecté deux fois mais les doubles pics ne sont apparus qu’une seule fois. L’explication la plus logique à ce phénomène est que les
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conditions d’injection ne sont pas toujours bien reproductibles, ce qui induit le caractère aléatoire d’apparition de ces doubles pics.
6.6.2 Droite de calibration
Les points de droite de calibration sont calculés. Pour la concentration des ions, on divise l’aire du pic du ion du GHB par l’aire du pic du ion du GHB-D6 correspondant. Ce rapport permet d’aplanir les différences d’analyse d’un tube à l’autre.
Trois droites de calibration sont effectuées en tout : une pour le couple de ions 235-241, une pour 204-206 et une pour 233-239. Les concentrations des échantillons sont donc mesurées à triple. Pour le résultat final, on effectue la moyenne des trois.
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7 Résultats
7.1 Stabilité (Cv)
7.1.1 Résumé du but
Le but de cette partie du travail est d’évaluer l’augmentation du GHB lors de la conservation de sang fluoré à température ambiante, au réfrigérateur et au congélateur. Le GHB est un produit de dégradation, dû à la diminution de l’activité du cycle de Krebs qui catabolise la molécule. Sa concentration pourrait donc augmenter au cours de la conservation. Le danger est que la concentration augmente significativement et influence l’interprétation des résultats.
7.1.2 Résultats
Pour pouvoir établir les graphiques, les résultats ND (non détecté) sont transcrits 0.00 μg/ml. La linéarité n’est pas assurée lorsque les résultats sont inférieurs à la limite de détection (0.5 μg/ml). Tous les résultats pour cette partie, sauf un sont inférieurs à 0.5 μg/ml. Pour pouvoir interpréter ces résultats, les valeurs obtenues sont utilisées mais uniquement à titre indicatif.
Les résultats bruts se trouvent dans les annexes. Ici les graphiques pour chacun des sept prélèvements sont présentés pour les comparer selon l’âge et le sexe de la personne. Puis un graphique a été réalisé avec la valeur moyenne des prélèvements pour avoir une vision générale des différents types de conservation et de la possible augmentation de la concentration au cours la conservation.
Les analyses ont été effectuées à 1, 8, 14, 21, 28, 42 et 70 jours après le prélèvement.
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Cv 001
Age : 46
Sexe : F
Cv 002
Age : 22
Sexe : F
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Cv 003
Age : 35
Sexe : F
Cv 004
Age : 38
Sexe : H
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Cv 005
Age : 20
Sexe : F
Cv 006
Age : 40
Sexe : F
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Cv 007
Age : 40
Sexe : F
En sachant que le Cv 006 et le Cv 007 proviennent de la même personnes, des différences sont constatées. La concentration du Cv006 au 70eme jour est au-dessus de 0.5 μg/ml alors que le Cv007 ne l’est pas. Cette variation semble importante sur le graphique, mais elle est en réalité minime. Cette différence prouve que de petites valeurs ne sont pas linéaires et peuvent varier. C’est pour cela que ces résultats sont à prendre à titre indicatif.
Une interpétation à partir du sexe n’est pas possible car seulement un des prélèvements a été effectué sur un homme. En comparant les âges des donneurs, aucune variation n’est trouvée. Les analyses ont été effectuées sur un petit nombre de personnes. Pour une éventuelle interprétation, il faut voir les résultats pour les personnes vivantes au point 7.2 Personnes vivantes.
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Moyenne Cv001 – Cv007
Ce graphique permet deux interprétations. La concentration du GHB est plus élevée dans les tubes conservés à température ambiante. Les valeurs pour le GHB varient au début de la conservation et sont finalement en hausse à la dernière mesure.
7.1.3 Discussion
D’après ces graphiques, deux interprétations peuvent être distinguées :
• Sur ce graphique, les concentrations du GHB varient selon le mode de conservation. Les valeurs des tubes conservés à température ambiantes sont plus élevées que celles des tubes conservés au réfrigérateur. Ce même phénomène se passe entre les tubes conservés au réfrigérateur et au congélateur. Par ces interprétations, il peut être déduit que la température joue un rôle sur la quantité de GHB dans un tube fluoré.
• Pour la stabilité du GHB, il n’est pas aisé de déterminer une tendance. De manière générale pour les trois modes de conservation, la concentration augmente ente le 1er et le 14eme jour puis baisse jusqu’au 42eme jour et augmente une deuxième fois. Il n’est donc pas possible de dire que la concentration augment ou diminue au cours de la conservation.
Ces interprétations ne sont pas forcément exactes. Il faut prendre en compte :
• Les deux dernières mesures ont été effectuées sur le GCMS IN 1002 alors que les autres sur le IN 1006.
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• Une variabilité analytique peut se déceler entre deux dosages. Cette variabilité ne s’explique pas par un changement de technicien (c’est toujours la même personne qui a procédé aux analyses), mais par une reproductibilité pas exacte entre deux séries. Cette variabilité pourrait expliquer la concentration qui augment puis baisse et augmente à nouveau au cours du temps.
• Les résultats sont inférieurs à la limite de détection. Les valeurs ne se situent plus dans la linéarité, elles ne sont pas exactes. Par contre, la comparaison entre les trois températures reste valable.
Le but de cette partie est d’évaluer l’augmentation du GHB sanguin dans des tubes conservés à température ambiante, au réfrigérateur et au congélateur.
La thèse de l’augmentation de la concentration du GHB ne peut pas être prouvée ni infirmée par cette étude. Différents points le démontrent :
• Les valeurs sont inférieures à la droite de régression et ne peuvent être prises uniquement à titre indicatif.
• Les variations des valeurs sont minimes, elles ne peuvent pas être représentatives de ce qui ce passe dans le tube.
• La concentration augmente puis baisse et augmente à nouveau elle n’est pas constante.
Pour pouvoir donner un résultat, il serait intéressant d’analyser ces échantillons dans quelques semaines voir quelques mois. Pour déterminer si la concentration du GHB augmente ou diminue, une étude sur des échantillons avec un taux élevé de GHB au départ pourrait mieux le démontrer.
La différence entre les trois modes de conservation montre un taux de GHB plus élevé dans les tubes conservés à température ambiante. Cela correspond à l’idée du départ : la température peut avoir une influence sur la concentration de GHB. Mais il faut rester prudent sur ces interprétations, les valeurs sont utilisées à titre indicatif.
7.2 Personnes vivantes (V)
7.2.1 Résumé du but
Le but est de définir l’intervalle des valeurs physiologiques. L’analyse est effectuée sur des échantillons de sang et d’urine d’une même personne qui n’a a priori pas consommé de GHB. Ces 40 échantillons proviennent de la routine du laboratoire. 34 échantillons d’urines en provenance du LAD sont aussi analysés. Ces personnes ont peut-être consommé du GHB.
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7.2.2 Résultats
D’une manière générale, les résultats sont présentés en % pour pouvoir comparer sur le même graphique les valeurs obtenues pour le sang et l’urine. Pour le sang, 40 résultats sont exploitables et 72 pour l’urine, les deux urines restantes n’ont pas été prises en compte car les concentrations pour les trois ions diffèrent.
Les valeurs < 0.5 μg/ml ne sont pas dans la droite de régression, il faut donc les prendre avec prudence. Elles sont utilisées à titre indicatif.
Pour le sang, les concentrations sont toutes inférieures à 0.5 μg/ml sauf une. Elles varient de 0.01 à 0.60 μg/ml avec une moyenne de 0.17 μg/ml.
Pour l’urine, les concentrations varient de 0.00 à 1.23 μg/ml avec une moyenne de 0.16 μg/ml. Seulement 7 valeurs entrent dans la droite régression. Les autres sont toutes inférieures à 0.5 μg/ml.
Pour la comparaison des échantillons d’une même personne, aucun lien ne peut être établit. La personne qui a un taux de GHB dans le sang, ne l’a pas forcément dans l’urine.
Pour pouvoir comparer les résultats selon le sexe et l’âge des personnes, seuls les échantillons de la routine sont pris. Pour l’échantillon en provenance du LAD, ni le sexe, ni l’âge ne sont mentionnés, ils ne seront donc pas pris pour ces deux graphiques ci-dessous.
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Sur un total de 40 personnes, du sang et de l’urine ont été analysé chez 9 femmes et 31 hommes.
Sur le graphique, les hommes ont une concentration de GHB plus élevée que chez les femmes.
L’âge des personnes qui font partie de cette étude varie de 15 à 64 ans avec une prédominance entre 20 et 30 ans.
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Ce graphique illustre que dans cette étude, l’âge n’a pas d’influence sur la concentration de GHB. Pour une interprétation plus pointue, il serait bien d’avoir des personnes de mois de 20ans et de plu de 50 ans.
Les valeurs obtenues sont inférieures à la limite de détection, ces interprétations restent à prouver.
7.2.3 Discussion
Les valeurs < 0.5 μg/ml ne sont pas dans la droite de régression, il faut donc les prendre avec prudence. Elles sont utilisées à titre indicatif. D’une manière générale les valeurs varient de 0.01 à 0.60 pour le sang et de 0.00 à 1.23 pour l’urine.
Dans le sang, les concentrations sont faibles mais toujours présentes. Cela veut dire que le GHB endogène est bien détecté. La méthode de détection est donc assez sensible.
Dans l’urine, les concentrations varient plus que le sang, ce qui confirme que le dosage urinaire donne évaluation générale et non une valeur quantitative. Les résultats des concentrations des échantillons du LAD illustrent la probable absence de consommation. Des résultats plus élevés ont été trouvés dans d’autres échantillons de personne n’ayant pas à priori consommé de GHB. Si la consommation a eu lieu, la concentration du GHB dans l’urine est déjà revenue au niveau endogène.
Le graphique avec la comparaison des valeurs obtenues pour les hommes et les femmes, les hommes ont une concentration de GHB plus élevée que chez les femmes.
Le graphique des moyennes du GHB selon les âges montre que les valeurs n’ont ni tendance à augmenter ni à baisser.
Le but de cette partie est de définir l’intervalle des valeurs physiologiques. 40 échantillons viennent de la routine du laboratoire et 34 échantillons d’urines viennent du LAD sont aussi analysés. Ces dernières personnes ont peut-être consommé du GHB.
Pour la définition de l’intervalle des valeurs physiologiques, l’absence d’échantillon positif au GHB ne permet pas de définir un cut-off. Les concentrations obtenues pour les échantillons de sang vont jusqu’à 0.6 μg/ml. Un cut-off de faible concentration autour de 1.0 μg/ml pourrait être proposé, mais cette valeur est totalement arbitraire. Il faut pouvoir la comparer avec la valeur urinaire.
La définition d’un intervalle pour les physiologiques dans l’urine pose un problème similaire à celui du sang. L’absence de d’urine positive au GHB ne permet pas de définir un cut-off. Les valeurs obtenus vont jusqu’à 1.23 μg/ml. Au laboratoire, un cut-off de 10 μg/ml est utilisé. Il pourrait être réduit à 5 μg/ml. Ces deux cut-off sont arbitraires.
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7.3 Autopsies (A)
7.3.1 Résumé du but
Le but est l’évaluation du délai post-mortem. Les échantillons de sang et d’urine proviennent d’autopsies effectuées à Lausanne entre 2006 et 2007. Le GHB est un produit de dégradation, dû à la diminution de l’activité du cycle de Krebs qui catabolise la molécule. Il augmente en cas de conservation du corps.
7.3.2 Résultats
Les résultats obtenus entrent dans la droite de régression ou sont non détectés sauf trois inférieurs à la limite de détection. Pour ces trois échantillons, la valeur de 0.0 μg/ml leur a été attribuée.
L’âge des personnes autopsiées varie de 7 mois à 89 ans. Toutes les tranches d’âge de la population sont représentées.
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Une droite de régression est dessinée sur le graphique. Le coefficient de corrélation permet d’évaluer la dispersion des résultats. La droite idéale devrait avoir r = 1. Les valeurs obtenues (r=0.537 pour le sang et r=0.526 pour l’urine) sont loin de l’idéal. Ces valeurs ne permettent pas de faire la déduction suivante : si une concentration de GHB est mesurée, l’heure de la mort peut être calculée.
Mais grâce à cette droite de régression, une interprétation peut en être déduite : la concentration de GHB augmente avec le délai de prélèvement post-mortem. Plus le prélèvement est effectué tard après le décès, plus concentration de GHB risque d’être anormalement élevée.
Les concentrations urinaires de GHB sont moins élevées que les sanguines. Le GHB urinaire augmente moins au cours du temps après le décès que le GHB sanguin.
7.3.3 Discussion
Les valeurs obtenues lors des dosages donnent une grande dispersion des résultats autour des droites de régression sanguine et urinaire. Les mauvaises valeurs du coefficient de corrélation pour le sang et l’urine ne permettent pas de faire la déduction suivante : si une concentration de GHB est mesurée, l’heure de la mort peut être calculée.
Malgré ces résultats, ces droites permettent de dire que les concentrations de GHB augmentent avec le délai de prélèvement post-mortem.
Le but est l’évaluation du délai post-mortem. Pour l’évaluation de ce temps, la concentration de GHB ne suffit pas :
• La température de conservation du corps, le sexe et l’âge de la personne pourraient influencer.
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• La concentration de GHB dans le corps d’un vivant peut varier (voir la partie 7.2 Personnes vivantes). Le calcul de délai post-mortem ne partirait donc pas systématiquement à la même valeur.
7.4 Discussion générale sur la méthode
Les échantillons d’urine ont souvent des interférences qui ne permettent pas une bonne définition des pics du GHB. Par exemple, les deux échantillons d’urine (V011 et V021) qui ont des valeurs qui varient entre les valeurs pour les trois ions. Les pics du GHB-D6 sont généralement de bonnes tailles et faciles à déterminer. Le GHB-D6 a une concentration de 25μg/ml. Si la concentration de 5 μg/ml est utilisée comme cut-off, ces interférences pourraient gêner l’interprétation. Il serait donc intéressant de tester une méthode qui précipite les protéines et qui permettrait d’avoir moins d’interférences dans les urines.
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8 Conclusion
Ce travail a comporté trois buts :
• Evaluation de l’augmentation du GHB lors de la conservation de sang fluoré à température ambiante, au réfrigérateur et au congélateur.
• Définition l’intervalle des valeurs physiologiques.
• Evaluation du délai post-mortem.
La différence entre les trois modes de conservation montre un taux de GHB plus élevé dans les tubes conservés à température ambiante. Cela correspond à l’idée du départ : la température peut avoir une influence sur la concentration de GHB. Mais il faut rester prudent sur ces interprétations, les valeurs sont utilisées à titre indicatif.
Par contre il n’est pas possible de déterminer si la concentration du GHB a augmenté ou diminué au cours de la conservation. Pour approfondir ces résultats, il est prévu d’analyser ces échantillons dans quelques semaines.
Pour la définition de l’intervalle des valeurs physiologiques, l’absence d’échantillon positif au GHB ne permet pas de définir un cut-off. Les concentrations obtenues pour les échantillons de sang vont jusqu’à 0.6 μg/ml. Un cut-off de faible concentration autour de 1.0 μg/ml pourrait être proposé. Mais cette valeur est totalement arbitraire. Il faut pouvoir comparer avec la valeur urinaire.
La définition d’un intervalle pour les physiologiques dans l’urine pose un problème similaire à celui du sang. L’absence de d’urine positive au GHB ne permet pas de définir un cut-off. Les valeurs obtenus vont jusqu’à 1.23 μg/ml. Au laboratoire, un cut-off de 10 μg/ml est utilisé. Il pourrait être réduit à 5 μg/ml. Ces deux cut-off sont arbitraires.
Pour la définition d’un cut-off, il faut prendre en compte des résultats positif au GHB. Pour obtenir de tels échantillons, il faut effectuer un tel travail sur plus de temps.
Pour l’évaluation du délai post-mortem, les mauvaises valeurs du coefficient de corrélation pour le sang et l’urine ne permettent pas de faire la déduction suivante : si une concentration de GHB est mesurée, l’heure de la mort peut être calculée.
Malgré ces résultats, ces droites permettent de dire que les concentrations de GHB augmentent avec le délai de prélèvement post-mortem.
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Remarques personnelles
Le sujet de travail est un thème d’actualité, qui n’a jamais entendu parler de la drogue du violeur. La partie pratique m’a bien plu ainsi que le fait de travailler sur différent types d’échantillons (urine, sang de personnes vivantes et d’autopsies). Les analyses étaient parfois longues à effectué et à interpréter surtout en présence des doubles pics. Il a fallu gérer quelques imprévus: l’ordinateur qui gère GCMS IN 1006 a eu une panne et mon nouvel ordinateur a eu des problèmes d’enregistrement, une matinée entière de travail a été perdue.
Les responsables avec qui j’ai travaillé m’ont toujours bien entourée. Et les collaborateurs du laboratoire m’ont également bien soutenue. Un grand merci.
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9 Lexique
Accoutumance
Etat de l’organisme qui s’habitue progressivement à l’action d’un médicament, d’une drogue dont les effets diminuent petit à petit, ce qui oblige à augmenter les doses.
Cataplexie
Perte brutale, plus ou moins complète, du tonus musculaire, entraînant la chute, sans perte de connaissance, déclenchée parfois par une vive émotion.
Craving
(En anglais) Besoin compulsif de la substance en cas de dépendance psychique.
Cut-off
(En anglais) Valeur qui permet de passer d’une interprétation à l’autre.
Dépendance physique
Etat d’adaptation qui se manifeste par des troubles physique intenses quand l’administration du médicament, du tabac ou de l’alcool est suspendue.
Dépendance psychique
(Anglais : addiction) Etat dans lequel une substance produit un sentiment de satisfaction et une pulsion psychique exigeant la prise de la substance pour provoquer le plaisir ou éviter le malaise. Elle comporte le « craving », ce besoin compulsif de reprendre la substance.
Dépresseur du système nerveux central
Catégorie de psychotropes qui procurent une sensation de détente, diminuent la gêne, ralentissent les réflexes, provoquent des étourdissements, portent au sommeil. Sur le plan physique, ces produits provoquent un ralentissement des processus normaux de l'organisme.
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Narcolepsie
Accès brusque, de courte durée, d’un besoin irrépressible de sommeil.
Soumission chimique
Administration de substances psychoactives à une personne à des fins délictueuses ou criminelles. (Société Française de Toxicologie Analytique, novembre 2003)
Stupéfiant
Toute substance toxique, naturelle ou synthétique, agissant sur les centres nerveux, et dont l’usage plus ou moins prolongé détermine des perturbations graves de la personnalité, une détérioration progressive physique et psychique avec accoutumance et toxicomanie.
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10 Lexique des abréviations
A : Autopsies
CSIT : Centre Suisse d’Information Toxicologique
CURML : Centre Universitaire Romand de Médecine Légale
Cv : Stabilité
DFSA: Drug-facilitated Sexual Assault
GABA: Acide Gamma-Aminobutyrique
GBL: Gamma-Butyrolactone
GHB : Gamma-Hydroxybutyrate
IUML : Institut Universitaire de Médecine Légale de Lausanne (ancien nom du CURML)
LAD : Laboratoire d’Analyse du Dopage
LTCF : Laboratoire de Toxicologie de Chimie Forensique (ancien nom de l’UTCF)
MSTFA : N-Methyl-N-trimethylsilyltrifluoroactonamide
SAS : Semi-Aldéhyde Succinique
SI : Standard Interne
SNC : Système Nerveux Central
UTCF : Unité de Toxicologie et Chimie Forensique
V : Personnes vivantes
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11 Références bibliographiques
Andresen, H. (2008). Gamma Hydroxybuttersaüre - Wirkung, Analytik, Interpretation der Befunde. (Présentation effectuée en mars 2008.)
Compendium Suisse des médicaments, (2007). Xyrem®, Décembre 2005 (Page Web). Accès : http://www.kompendium.ch/MonographieTxt.aspx?lang=fr&MonType=fi(page consultée le 20 janvier 2008)
Crookes, C.E., Faulds, M.C., Forrest, A.R.W. and. Galloway J.H. (2004). A Reference Range for Endogenous Gamma-Hydroxybutyrate in Urine by Gas Chromatography–Mass Spectrometry. Accès http://www.jatox.com/jul-dec04.htm (page consultée le 03.03.2008)
Elliott, S.P. (2003). Gamma hydoxybutyric acid (GHB) concentrations in humans and factors affecting endogenous production. In Forensic Science International (pp. 9-16). Elsevier
Ferrara, S. D., Frison, G., Tedeschi, L. & Le Beau, M. (2001). Gamma-hydoxybutyrate (GHB) and related products. Drug-facilitated Sexual Assault (pp.107-126). Barcelona: Marc A. LeBeau & Ashraf Mozayani
Ghysel, M.-H. (1999). L’acide gamma-hydrxybtirique. In P. Mura (Coordinateur). Alcool, médicaments, stupéfiants et conduite automobile (pp.129-141). Paris : Elsevier
LeBeau, M. A., Christenson, R.H., Levine, B., Darwin, W. D., and Huestis, M.A. (2002). Intra- and Interindividual Variations in Urinary Concentrations of Endogenous Gamma-Hydroxybutyrate. Accès : http://www.jatox.com/abstracts/2002/september/340-lebeau.htm (page consultée le 03.03.08)
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Lüscher, C. (2008). Neurobiologie de l’addiction : la recherche fondamentale suggère de nouvelles pistes de traitement. Présentation du 2 avril 2008 au Centre Universitaire Romand de Médecine Légale- Site de Lausanne.
Manuila, L., Manuila, A., Lewalle, P. & Nicoulin, M. (2001). Dictionnaire Médical. Paris : Masson.
Meylan, C. (2007). Dosage de GHB. Méthode d’analyse MA 32853, Version 3.1, Unité de toxicologie et chimie forensiques, Site de Lausanne.
Office fédéral de la santé public. (26 nov. 2007) GHB (Gamma-hydroxybutyrate) (page Web). Accès : http://www.bag.admin.ch/themen/chemikalien/00228/04267/index.html?lang=fr (page consultée le 11 avril 2008)
Saudan, C., Augsburger, M., Kintz, P., Saugy, M. and Mangin, P. (2007). Carbon isotopic ratio analysis by gas chromatography/combustion/isotope ratio mass spectrometry for the detection of gamma-hydoxybutyric acid (GHB) administration to humans. In Rapid Communications in Mass Spectrometry. Wiley InterScience.
Société Française de Toxicologie Analytique. Soumission chimique : consensus SFTA-novembre 2003 (Page Web). Accès : http://www.sfta.org/Consensus/protocole%20souchi%2011%2003.pdf(page consultée le 23 mars 2008)
Stratégie nationale antidrogue (Gouvernement du Canada) (5 mars 2008). GHB (Page Web). Accès : http://www.strategienationaleantidrogue.gc.ca/parents/drogues-drugs/ghb.html(page consultée le 23 mars 2008)
Winek, C. L., Wahba, W. W., Winek, C. L. Jr., Winek Balzer, T. (2001). Drug and chemical blood-level data 2001, Forensic Science International (pp. 107-123).
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12 Annexes
• Annexe 1 : Dosage de GHB (MA 32853)
• Annexe 2 : Méthode d’analyse IN 1006 (GHB602.M)
• Annexe 3 : Méthode d’analyse IN 1002 (GHB203.M)
• Annexe 4 : Relevé des températures pour la température ambiante (Labo principal), le réfrigérateur (IN 31-15) et le congélateur (IN 32-21).
• Annexe 5 : Tableau échantillons pour Stabilité
• Annexe 6 : Résultats pour Stabilités
• Annexe 7 : Tableaux échantillons pour Personnes Vivantes
• Annexe 8 : Résultats pour Personnes Vivantes
• Annexe 9 : Tableaux échantillons pour Autopsies
• Annexe 10 : Résultats pour Autopsies
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