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BIOTECHNOLOGIE

COURS THEORIQUE2012-2013

Prof. A. TANTAOUI ELARAKI

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Plan général

• 1- Chapitre introductif

• 2- La souche microbienne à usage industriel

• 3- Le milieu de culture

• 4- Conduite des fermentations industrielles

• 5- Différents types de fermentations

• 6- Récupération des produits de fermentation

• 7- Industrie de la levure boulangère

• 8- Rôles des micro-organismes dans la fabrication des fromages

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1- CHAPITRE INTRODUCTIF

• 1.1- Définitions

• 1.2- Objectifs des Industries de Biosynthèse et de Fermentation (IBF)

• 1.3- Applications des Biotechnologies dans le domaine alimentaire

• 1.4- Intérêt d ’utiliser les micro-organismes dans l ’industrie.

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1.1- Définitions

• 1.1.1- Définitions des Biotechnologies

• 1.1.2- Définitions du mot « fermentation »

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1.1.1-Définitions des Biotechnologies

• Biotechnologies: Sciences et procédés visant l ’exploitation des propriétés des cellules (microbiennes, végétales, animales ou humaines) ou de leurs constituants (ADN, enzymes, etc.) pour satisfaire les besoins de l ’Homme

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Domaines d’application

• Alimentation

• Santé

• Energie

• Environnement

INDUSTRIES DE BIOSYNTHESE ET DE FERMENTATION (IBF)

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2 « types » de biotechnologies

- Biotechnologies classiques: pratiques connues et exploitées depuis longtemps, dues à l’observation et l’expérience, puis développées depuis la découverte des micro-organismes

Exemples: panification, brasserie, vinification (œnologie), fromagerie, fabrication de laits fermentés, etc.

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2 « types » de Biotechnologies (suite)

- Biotechnologies modernes: conséquences des développements récents des connaissances en génétique, biochimie, biologie moléculaire, etc.

• Exemples:

- manipulations génétiques (OGM)

- clonage d’organismes plus ou moins complexes (mammifères)

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1.1.2-Définitions de « fermentation»

• De fervere = bouillir• Déf. Biochimique: succession de réactions

d ’oxydoréduction entre composés organiques sources de Carbone et d ’énergie

• Déf. Microbiologique: tout processus biochimique conduit par des micro-organismes

• Déf. Industrielle: toute culture microbienne

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1.2- Objectifs des IBF

- Production de biomasse

- Obtention de produits sécrétés naturellement

- Obtention de produits métabolisés dans certaines conditions

- Bioconversions

- Séparation stéréospécifique

- Dégradation de composés complexes en composés plus simples

- Obtention de boissons & alim. fermentés

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1.2.1- Production de cellules microbiennes: BIOMASSE

• Cellules vivantes: levure boulangère, levains (lactiques par exemple)

• Constituants cellulaires: protéines (P.O.U. ou S.C.P.)

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1.2.2- Obtention de produits sécrétés naturellement

• Enzymes

• Pigments

• Toxines

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1.2.3- Obtention de produits métabolisés dans certaines

conditions

• Métabolisme dévié: surproduction

• Exemples: antibiotiques, acides aminés, vitamines

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Exemples de surproduction de vitamines ou d’acides aminés

Besoin (mg/l)

Ac. Glut. 300

Lysine 250

Vit. B2 0,5

Vit. B12 0,001

Prod. (mg/l) Rapport

90 000 300

50 000 200 7 000 14 000

100 10 000

Ac. Glut.: acide glutamique

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1.2.4- Bioconversions

• Exemple: Hydroxylation des stéroïdes

Préparation de la 11 α-hydroxy-progestérone à partir de la progestérone

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1.2.5- Séparation stéréospécifique

• Elimination d ’une des 2 formes d ’un mélange racémique

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1.2.6- Dégradation de molécules

• Traitements des eaux usées

• Méthanisation

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1.2.7- Obtention de boissons et d ’aliments fermentés

• Pain

• Fromages

• Yaourt et autres laits fermentés

• Boissons alcoolisées

• Riz Koji, etc.

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FermentationAc. Organiques

Antibiotiques

Alim. fermentés

Gibbérellines

L-sorbose

Traitement des eaux uséesPolysaccharides

Stéroïdes

Nucléotides

Boissons

Solvants

P.O.U Enzymes Acides aminés

Vitamines

Diverses applications des fermentations

Toxines

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1.3-Applications des Biotechnologies dans le domaine agro-alimentaire

• Applications classiques:

- Boissons et aliments fermentés

- Production d’agents de fermentation

• Applications plus récentes

- Production de biomasse alimentaire

- Autres produits d ’intérêt alimentaire

- Organismes génétiquement modifiés

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1.4- Intérêt d’utiliser les micro-organismes?

• Vitesse de croissance rapide

• Vitesse de métabolisme très élevée

• Croissance sur substrats peu coûteux

• Possibilité d ’utiliser des cellules génétiquement recombinéesou manipulées.

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Taux de croissance et teneur en protéines de quelques micro-organismes

Groupe Espèce

Taux de croissance

(conditions optimales)

Taux de protéines

(% extrait sec)

Bactérie Escherichia coli

3 div./h 82

Levure Hansenulaanomala

0,6 div./h 53

Algue Chlorellapyrenoidosa

0,1 div./h 44

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Protéines produites en 24h par divers organismes

Organisme (1000 Kg)

Protéines produites (Kg/j)

Rendement (%)

Bœuf

Soja

Levure

Bactérie

1

10

105

1011

0,1

1

104

1010

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Comparaison prairie naturelle/algue alimentaire (valeur fourragère) pour 1 ha

(en kg)

Source

d’azote

Rendement en protéines

Protéines obtenues sous

forme de viande

Prairie

Chlorellapyrenoidosa

670

44700

60

4030

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Chapitre II- La souche microbienne à usage industriel

• II.1- Caractéristiques du micro-organisme idéal

• II.2- Obtention des souches

• II.3- Amélioration des souches

• II.4- Conservation des souches

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II- La souche microbienne à usage industriel

II.1- Caractéristiques de la souche idéale

- Croissance rapide sur un substrat peu coûteux avec rendement élevé

- Production intense des enzymes nécessaires

- Transformation dans des conditions simples, y compris récupération du produit désiré

- Stabilité génétique

- Autres (selon le cas)

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II.2- Obtention des souches

• II.2.1- « Screening technic » pour l’obtention de nouvelles souches

• II.2.2- Collection de souches (« souchothèques »)

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II.2- Obtention des souches (suite)

• II.2.1- Screening technic

- Principe:

> passer au crible grand nombre de souches

> chercher là où on a le plus de chance de trouver

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II- La souche microbienne à usage industrielII.2- Obtention des souches

II.2.1- Screening technic

• Technique: souvent culture en boîte de Petri, milieu et conditions soigneusement choisis, puis purification des souches

- Exemples:

> souche capable de fermenter le lactose

> souche pour décomposer les hydrocarbures

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II.2.1- Screening technic

• Inconvénient: trop long

- Exemple: découverte d’un Actinomycète producteur d’oxytétracycline

2 ans55 chercheurs134 726 souches5000 échantillons de sol

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II.2.2- Collections de souches

• Définition: laboratoires spécialisés dans:

- l’isolement

- l’identification

- la caractérisation

- l’entretien et le stockage

Les souches sont répertoriées et mises à la disposition des utilisateurs

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II.2.2- Collections de souches

• ExemplesATCC: American Type Culture Collection (USA)CBS: Central Bureau voor Schimmel culture (NL)NRRL: Northern Regional Research Laboratory

(USA)CCTM: Centre de Collection de Types Microbiens

(CH)NCIB: National Collection of Industrial Bacteria

(UK)NCTC: National Collection of Type Culture (UK)

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II.3- Amélioration des souches

• II.3.1- Sélection naturelle

• II.3.2- Mutagenèse

• II.3.3- Recombinaison génétique « naturelle »

• II.3.4- Fusion cellulaire induite (fusion de protoplastes)

• II.3.5- Recombinaison génétique in vitro(génie génétique)

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II.3- Amélioration des souches (suite)

• II.3.1- Sélection naturelle

- Choisir l’individu le plus performant

- Le cultiver

- Sélectionner le plus performant de sa descendance (2èmegénération)

- Poursuivre sur plusieurs générations

Applicationssur moisissures productrices d’antibiotiques (+ 25%)

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• II.3.2- Mutagenèse

- Principe

- Dose efficace

- Agents mutagènes

- Criblage des mutants

- Applications

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II- La souche microbienne à usage industrielII.3- Amélioration des souches

II.3.2- Mutagenèse (suite)

• Principe: provoquer changements génétiques par mutation

• Dose efficace:

- Dose mortelle pour 99,5 à 99,9% de la population (0,1 à 0,5% de survivants)

- Fréquence de mutation: 10-2 (10-6 à 10-8 pour mutation naturelle)

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II - La souche microbienne àusage industrielII.3- Amélioration des souches


• Agents mutagènes chimiques

- Propionolactone- Analogues bases pur. & pyr.- Agents alkylants à l’azote- Acide nitreux- Oxyde d’éthylène- Dérivés de l’acridine- Sulfates et sulfonates (EMS)- Epoxydes- Ethylène- imines

• Agents mutagènes physiques

- Rayons UV

- Rayons γ

- Rayons X

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• Criblage des mutants: mise en évidence et récupération

Exemples:- Mutant auxotrophe pour un facteur de

croissance donné- Mutant résistant à un agent antimicrobien

chimique- Mutant capable de fermenter un glucide

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• Applications- Amélioration de Penicillium chrysogenum

pour production de pénicilline (sélection naturelle et mutagenèse)

- Souches mutantes de levure insensibles à la répression catabolique du glucose (pour assimilation du maltose)

- Souches mutantes de levure capables de synthétiser la thiamine

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• II.3.3- Recombinaison génétique « naturelle »

- II.3.3.1- Reproduction sexuée

- II.3.3.2- Parasexualité

41


II.3.3- Recombinaison génétique « naturelle »

• II.3.3.1- Reproduction sexuée

- Possible pour les Ascomycètes (ex. : levure)

- Conditions restrictives:

o même espèce

o signes sexuels opposés

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Gamète mâle

Levure + ou a

Gamète femelle

Levure - ou α

A (n) B (n)

Conjugaison

Zygote

Crossing-over

RecombinésA B

ME

IOS

E

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• II.3.3.2- Parasexualité (cas des Fungiimperfecti)

Cycle de reproduction découvert chez certaines espèces de moisissures parmi les champignons imparfaits

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Filament A (n)

Filament B (n)ANASTOMOSE

HETEROCARYON FUSION NUCLEAIRE (10-6-10-7)

HAPLOIDISATION (méïose)

Spores obtenues:Type parental AType parental BTypes haploïdes recombinésTypes diploïdes recombinés

CY

CLE

PA

RA

SE

XU

EL

1

5

43

2

45



- Notion d’hétérocaryon forcé

Maintien de l’hétérocaryon dans un milieu minimum, les souches parentales A et B ayant 2 auxotrophies différentes

- Conditions restrictives:

. Filaments de même espèce

. Filaments compatibles

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• II.3.4- Fusion cellulaire induite (fusion de protoplastes)

- Objectif

- Principe

- Technique

- Quelques applications

- Exemple détaillé

47

II- La souche microbienne à usage industrielII.3- Amélioration des souchesII.3.4- Fusion cellulaire induite

• Objectif: obtenir des recombinaisons génétiques entre cellules qui ne peuvent pas fusionner « naturellement »

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• Principe:

- Élimination de la paroi par attaque enzymatique (milieu isotonique)

- Mélange des 2 populations cellulaires en présence d’ions Ca++ et de polyéthylène glycol

- Régénération de la paroi

- Criblage des recombinants (marqueurs génétiques)

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• Technique

Exemple de technique de fusion cellulaire induite chez les moisissures

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Souche A (a-b-c+d+) Souche B (a+b+c-d-)

protoplastes protoplastes

Cultures Cultures

MM MMMC MC

Contrôle

des mutations

Contrôle

des mutations

Viabilité des protoplastes

Viabilité des protoplastes

PEG 30% + Ca++

Fusion

(0,1-1% au lieu de 10-6)

+

Culture sur MMRégénération et réversion

des produits de fusion(a+b+c+d+)

Culture sur MCRégénération et réversion

des protoplastesA (a-b-c+d+), B (a+b+c-d-)

et des produits de fusion(a+b+c+d+)

Enzymes lytiques

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• Quelques applications

- Streptomyces(antibiotiques)

- Penicillium chrysogenum(pénicilline)

- Aspergillus niger(acide citrique)

- Schizosaccharomyces pombe

- Saccharomyces lipolyticaSouches de même signe sexuel

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• Quelques applications (suite)

- Candida tropicalis(Deutéromycète): souches stables avec caractères des 2 parents

- Hybridations interspécifiques ou intergénériques

. Lactococcus lactissubsp. lactiset Lc. lactissubsp. cremoris

. Lc lactissubsp. lactiset Lactobacillus reuteri

. Candida albicanset C. tropicalis

. C. tropicaliset Pichia guillermondi

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• Exemple détaillé: FCI de 2 levures pour la valorisation de sous-produits amylacés par production d’éthanol. Caractéristiques des 2 partenaires et du produit de fusion

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Pousse à 37°C

Ne fermente pas mélibiose

Fermente dextrines

Pas de gène MAL

Petites colonies lisses

Diploïde (asque à 4 spores)

Ne pousse pas sur lactose

Ne pousse pas à 37°C

Fermente mélibiose

Ne fermente pas dextrines

Possède gène MAL

Grandes colonies lisses

Polyploïde (pas de spores)

Pousse sur lactose

Pousse à 37°C

Fermente mélibiose

Fermente rapidement maltose

Fermente dextrines

Aptitude légère à la sporulation

Colonies grandes et rugueuses

Pousse sur lactose

Saccharomyces diastaticus

Souche 1384 RD

Saccharomyces uvarum

Souche 21 RS

Produit de la fusion

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• II.3.5- Recombinaison génétique in vitro(génie génétique)

- Objectif

- Principe

- Exemple d’application

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II - La souche microbienne àusage industrielII.3- Amélioration des souches

II.3.5- Recombinaison génétique in vitro

• Objectif:

Introduire un gène intéressant (humain, animal, végétal ou microbien) dans une cellule étrangère (réceptrice) pour qu’il s’exprime dedans.

Avantages des cellules réceptrices microbiennes (bactéries surtout): facilité de culture et vitesse de reproduction et de métabolisme

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• Principe

- Découper le gène intéressant par action mécanique ou par action enzymatique (enzymes de restriction: extrémités cohésives)

- L’attacher à ADN familier (plasmide, ADN viral) pour former un ADN hybride (rôle des transférases terminales et de la ligase)

- Introduire l’ADN hybride dans la cellule réceptrice: cellule transformée ou génétiquement modifiée

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• Exemple d’application:

transformation d’Escherichia colipour la production de somatostatine humaine

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II.4- Conservation des souches

• Objectif: prolonger la durée d’utilisation des souches, avec leurs propriétés

• Principe: maintenir les souches en vie tout en les empêchant de se multiplier

• Techniques:- Conservation sous huile de paraffine- Congélation- Lyophilisation

60

II- La souche microbienne à usage industrielII.4. Conservation des souches

Techniques

• Conservation sous huile de paraffine

- Rôle de l’huile. Très faible passage de l’O2 (assurer la concentration critique en O2)

. Empêcher la dessiccation du milieu

- Durée de stockage: plusieurs mois àplusieurs années à +4°C

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Techniques

• Congélation

- Congélation lente ou rapide (azote liquide)

- Pour éviter formation de cristaux:

. Congélation rapide

. Addition d’agents protecteurs

- Durée de conservation: illimitée (jusqu’àdécongélation)

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Techniques

• Lyophilisation- Évaporation de l’eau à basse température

sous vide- Récipient scellé pour éviter réhumidification- Inconvénient: forte mortalité (réduite par

agents protecteurs)- Durée de conservation: illimitée, même à

température ambiante (jusqu’à ouverture des récipients)

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Chapitre III- Le milieu de culture

• III.1- Besoins nutritionnels des micro-organismes (rappels)

• III.2- Caractéristiques du milieu de culture idéal

• III.3- Nature et caractéristiques des milieux de base

• III.4- Amélioration et préparation des milieux

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III.1- Besoins nutritionnels des micro-organismes

• III.1.1- Besoins en eau

• III.1.2- Besoins en énergie

• III.1.3- Source de Carbone

• III.1.4- Source d’Azote

• III.1.5- Eléments minéraux

• III.1.6- Facteurs de croissance

65

III.1.1- Besoins en eau

• Rappel de la notion d ’activité de l ’eau (aw)

• awminimale et awoptimale

66

III.1.2- Besoins en énergie

• Notions de phototrophe et de chimiotrophe

• Catabolisme producteur d ’énergie

• Exemple: catabolisme du glucose en aérobiose et en anaérobiose

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III.1.3- Source de Carbone

• Glucides simples (oses) facilement utilisés en général:

- glucose

- fructose

- mannose

- etc.

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Source de Carbone (suite)• Glucides plus complexes: exigent une

hydrolyse

- pour les diholosides, enzymes spécifiques; exemples:

invertase pour saccharose;

β-galactosidasepour lactose, etc.

- pour les polysaccharides (amidon, cellulose, etc.): systèmes enzymatiques

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Système enzymatique pour la dégradation de l ’amidon

Amidon

DextrinesMaltose

Glucose

α-amylase

amylogucosidase

amyl

oglu

cosid

ase

maltase

70

Source de Carbone (suite)

• Estimation des besoins en Carbone (règle des 50/50):

- Le C représente 50% de l ’extrait sec cellulaire;

- En aérobiose, 50% du C du milieu sont convertis en C cellulaire

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III.1.4- Source d’Azote

• Azote inorganique (NO3- et NH4

+): pour champignons et certaines bactéries

• Azote organique:

- Urée

- Acides aminés

- Protéines: par micro-organismes protéolytiques

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III.1.5- Eléments minéraux

• Phosphore et Soufre

• Autres éléments minéraux

- éléments plastiques;

- oligo-éléments: co-facteurs enzymatiques ou faisant partie de la constitution de co-enzymes

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III.1.6- Facteurs de croissance

• Définition

• Nature:

- acides aminés;

- vitamines;

- bases puriques ou pyrimidiques.

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III.2- Caractéristiques du milieu de culture idéal

• Equilibré du point de vue nutritionnel;

• Permettant de réaliser les opérations technologiques dans des conditions optimales (coût, rendement, etc.);

• Disponible tout le temps;

• Bon marché.

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III.3- Nature et caractéristiques des milieux de base

• III.3.1- Principaux milieux de base utilisés

- Origines: sous-produits agricoles ou industriels;

- Milieux essentiellement sources de C.

- Milieux essentiellement sources de N.

• III.3.2- Caractéristiques et défauts des milieux de base.

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III.3- Nature et caractéristiques des milieux de base (suite)

• III.3.1- Principaux milieux de base utilisés

> Origines: sous-produits de l ’agro-industrie, de l ’agriculture et d ’autres industries:

- Mélasses de sucrerie;

- Lactosérum (fromagerie);

- Liqueur sulfitique de pâte à papier;

- Produits solides: son, paille, bagasse, etc.;

- Eaux usées d’huilerie, d’amidonnerie, etc.;

- Sous-produits pétroliers (n-paraffines).

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• III.3.1- Principaux milieux de base utilisés (suite)

> Milieux essentiellement sources de C- mélasses de sucrerie: environ 50% de sucres

- lactosérum: 4,4 à 5,2% de lactose

- produits à base de cellulose: sirops à 65-85% d ’oses par hydrolyse acide

- lessive sulfitique de pâte à papier: 1,4% d ’oses et 0,6% de pentoses

Composition du lactosérum

1,11,1Chlorures

6,42,0Lactate

2,0-4,51,0-3,0Phosphates

1,2-1,60,4-0,6Calcium

6,0-8,06,0-10,0Protéines

44,0-46,046,0-52,0Lactose

63,0-70,063,0-70,0Solides totaux

Lactosérum acide (g/l)

Lactosérum doux (g/l)

Composants

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> Milieux essentiellement sources de C

- Hydrocarbures: nécessitent beaucoup d’O2C6H12O6+2,1O2+NH3 1,2C5H9NO4+5,4 H2O

C16H34+8,45O2+NH3 3,2C5H9NO4+4,1 H2O

Glucose Hexadécane

Rendement molaire (%) 120 320

Rendement pondéral (%) 98 208

Besoin en O2 (mole/mole) 2,1 8,45

80


> Milieux essentiellement sources d ’Azote:

- Farines ou tourteaux de graines oléagineuses (soja, coton, arachide, lin, etc.)

- Corn steep liquor: 7 à 8% d ’azote

- Lactosérum: plusieurs protéines

- Caséine

- Déchets de viande

- Farine de poisson

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• III.3.2- Caractéristiques et défauts des milieux de base

- Présence de composés complexes non assimilables

- Déséquilibre nutritionnel

- Forte concentration en sucres (avantage et contrainte)

- Présence de substances inhibitrices

- Présence de contaminants microbiens

- Présence de matières en suspension

- Production saisonnière

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III.4- Amélioration et préparation des milieux de culture

• III.4.1- Hydrolyse

• III.4.2- Dilution

• III.4.3- Supplémentation

• III.4.4- Clarification

• III.4.5- Stérilisation

83

III.4.1- Hydrolyse

• Hydrolyse acide des glucides complexes: HClconcentré à chaud (dépense d ’énergie)

• Hydrolyse enzymatique:

- Systèmes enzymatiques spécifiques (amidon, cellulose);

- β-galactosidase pour le lactose du lactosérum;

- Associations de micro-organismes (procédéSYMBA).

84

III.4.2- Dilution

• Abaisse la viscosité

• Augmente l’activité de l’eau aw

• Abaisse la pression osmotique

• Réduit l’effet glucose

• Réduit l’effet des substances inhibitrices

• Permet d’ajuster la composition du milieu pour que le substrat le plus cher soit le substrat limitant

85

III.4.3- Supplémentation

• Objectif: corriger les déficiences des milieux de base

• Tenir compte de la dilution

• Ajout de solutions nutritives, de préférence pasteurisées séparément

86

Supplémentation(exemples)

• Sources d ’azote (pour la mélasse en levurerie): urée, sels d ’ammonium;

• Sources de Phosphore: DAP ou MAP;

• Sources de Soufre: ac. sulfurique (pH aussi) ou sulfate d ’ammonium (azote aussi);

• Oligo-éléments: Fe et Cu pour aérobies;

• Facteurs de croissance: surtout vitamines

87

III.4.4- Clarification

• Objectif: éliminer les substances en suspension

• Sédimentation: pas toujours efficace

• Centrifugation: idem

• Précipitation (alumine ou alginate) suivie de filtration

> Dans le cas de la mélasse, pré-dilution avant clarification

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III.4.5- Stérilisation

> Surtout nécessaire quand:

- pH de travail pas assez acide

- température de travail pas assez élevée

> Améliore souvent le rendement

> Pré-dilution préalable pour les mélasses

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Stérilisation (techniques)

> En discontinu(dans la cuve de fermentation)

- Remplissage de la cuve (volume désiré)

- Chauffage: double paroi ou serpentin, avec agitation, ou injection de vapeur dans le milieu

- Arrêt du chauffage et refroidissement

> En continu: système adapté à la fermentation continue

90

AB

C

D

vapeur

Eau glacée

Milieu stérilisérefroidi

A: cuve de préparation; B: réchauffeur; C: stérilisateur tubulaire;

D: échangeur réfrigérant

Stérilisation continue avec échangeur de température

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Stérilisation continue avec injection de vapeur

I

II III

IVV

vapeur

vide

Milieu stérilisérefroidi

I: cuve de préparation; II: injecteur; III: stérilisateur; IV: soupape; V: flash cooler

92

Chapitre IV- Conduite des fermentations industrielles

• IV.1- Essais préliminaires au laboratoire ou en pilote

• IV.2- Inoculation ou ensemencement

• IV.3- Classification des fermentations selon GADEN

• IV.4- Contrôle des paramètres de la culture

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IV.1- Essais préliminaires

> Stade laboratoire: cultures successives (volumes croissants)

- tube à essai ou petit Erlenmeyer: culture possible? Forte ou faible? etc.

- gros Erlenmeyer ou ballon: agitation, optimisation des conditions de culture et de la composition du milieu, détermination de k max

- fermenteurs de laboratoire (paramètres maîtrisés)

94

Fermenteur de laboratoire

95

Fermenteurs de laboratoire

96

Essais préliminaires (suite)

> Stade pilote: fermenteurs de capacité de plus en plus élevée: 20 à plus de 100 litres

97

Fermenteur pilote

98

Essais préliminaires (suite)

�Scale up: calculs pour transposer à l ’échelle industrielle les résultats obtenus à l ’échelle pilote

�Fermenteurs de production: de capacités très variables

99

Fermenteur de production

100

Atelier de fermentation

101

IV.2- Inoculation ou ensemencement

• IV.2.1- Préparation de l ’inoculum

• IV.2.2- Techniques d ’inoculation

102

IV.2.1- Préparation de l ’inoculum

• Jadis, utilisation du « pied-de-cuve »

• Objectifs:

- ensemencer une quantité suffisante de cellules pour qu’elles soient dominantes dès le départ;

- cellules inoculées en phase exponentielle de croissance pour éviter phase de latence trop longue.

• Diagramme de préparation de l ’inoculum

103

Souche mère (lyophilisée, congelée, sous huile)

Suspension (cellules végétatives ou spores)

Culture sur milieu solide (slant)

Suspension de cellules (eau distillée ou eau physiologique stériles)

Culture en Erlen (agitation) ou en fioles de Fernbach (anaérobies) (inoculum/milieu: 5 à 10%; v/v)

Culture en petit fermenteur (2 à 5 litres)

Culture en fermenteur plus gros (50 à 1000 litres) (pied de cuve)


Culture sur milieu de conservation

Culture en milieu liquide (riche)

Stock

Étapes de la préparation de l’inoculum

























104

IV.2.2- Techniques d’inoculation

> Inoculation manuelle

- Inconvénients: risques de contamination

- Possibilité d ’application si contaminants éventuels peu compétitifs (cas du Yaourt)

105

Techniques d’inoculation (suite)

> Inoculation aseptique

- Exemples de techniques

- Technique utilisant le Bazooka

- Technique de transfert aseptique par gravité

- Avantage: risques de contamination minimisés

106

• Vapeur

A

Air stérilisé

B

V2

V3

R1 V6

R2 V7V5

V4

V1

1- stérilisation des conduites: V1, V3, V5, R1et R2 ouverts

2- refroidissement à l’air: V2, V3, V5, R1 et R2 ouverts

3- inoculation: V2, R1, V6, V7, R2 et V4 ouverts

A: cuve de production

B: Bazooka (inoculum)Technique d’inoculation aseptique utilisant le Bazooka

107

II

V1

V2

V3

V4

V5

1- stérilisation des conduites: V1 et V4 ouverts

2- refroidissement: V2 et V4ouverts

3- inoculation: V3 et V5ouverts

I: pied de cuveII: cuve de production

Inoculation par transfert aseptique par gravité

I

vapeur

Air stérile

inoculum

108

IV.3- Classification des fermentations selon GADEN

• > Catégorie1: apparition du produit désiréparallèle à la croissance microbienne (biomasse) et à la disparition du substrat limitant

• Production du produit désiréentièrementcoupléeà la consommation du substrat limitant

109

Temps

Biomasse

Produit désiré

Substrat limitant

Catégorie I de Gaden

110

Classification de GADEN (suite)

• > Catégorie II: apparition du produit désirépartiellement coupléeà la croissance microbienne et à la disparition du substrat limitant

111

Temps

Biomasse

Produit désiré

Substrat limitant

Catégorie II de Gaden

112


• Catégorie III: apparition du produit désirécomplètement découpléede la croissance microbienne et de la disparition du substrat limitant

113

Temps

Biomasse

Produit désiré

Substrat

limitant

Catégorie III de Gaden

114


> Remarque: dans les catégories II et III, les conditions optimales de croissance microbienne sont généralement différentes des conditions optimales d ’obtention du produit désiré

115

IV.4- Contrôle des paramètres de la culture

• IV.4.1- Régulation du pH

• IV.4.2- Régulation de la température

• IV.4.3- Contrôle de la mousse

• IV.4.4- Contrôle du taux de croissance

• IV.4.5- Aération-Agitation (contrôle de l ’oxygénation)

116

IV.4.1- Régulation du pH

• pH initial fixé,

• ajusté au départ avec des solutions d ’acides (H2SO4; H3PO4) ou de bases (NH4OH),

• ces solutions sont en même temps nutritives

117

Régulation du pH (suite)

• Evolution en cours de fermentation:

• - alcalinisation (dégradation des protides)

• - acidification (dégradation des glucides)

• >>> Risque de ralentissement, puis d ’arrêt de la croissance

• >>> Risque de baisse du rendement

118

pHPénicilline

(UI/ml)

pH régulé

pH non régulé

Pénicilline (pH non régulé)

Pénicilline (pH régulé)

3

6

9

2400

1200

400

Production de pénicilline avec ou sans régulation du pH

119


• Solutions:

> Milieux tamponnés: coûteux et instables

> Addition de solutions d ’acides ou de bases:

- addition manuelle

- régulation automatique

120


• Addition manuelle de solutions acides ou basiques, suivant un programme établi empiriquement

• >> Inconvénients: risques de surdosage ou de sous-dosage, risques de contaminations,

• soubresauts dans la croissance

121


• Régulation automatique: électrode plongée dans le moût pour mesurer le pH en continu, pH-mètre relié à un système de régulation automatique

122

IV.4.2- Régulation de la température

• Température initiale fixée

• Tendance au réchauffement (libération de chaleur), d ’où risque de ralentissement de la croissance

• Parfois rendement et qualité influencés

• Exemple: en levurerie, si température > 35°C, l ’activité fermentaire augmente, d ’où perte de rendement , mais meilleure stabilité

123

Régulation de la température (suite)

• Chaleur à évacuer parfois importante

• Exemple: en levurerie industrielle 3200 kcal/kg de levure sèche produite, soit 700 kcal/kg de mélasse utilisée (à 50% de sucres)

124

Régulation de la température (suite)

• Solution: refroidissement

>> circulation d ’eau glacée, avec possibilitéde régulation automatique par thermostat

>> ruissellement externe (perte par évaporation)

125

IV.4.3- Contrôle de la mousse

• Causes:

> composition des milieux de culture

> l ’aération et l ’agitation accentuent le moussage

126

Contrôle de la mousse (suite)

• Conséquences du moussage:

> réduction du volume utile du fermenteur;

> réduction de l ’efficacité de l ’aération;

> risques de débordements (pertes, contaminations)

127

Contrôle de la mousse (suite)

• Solution: utilisation d ’antimousses

> nature: silicone, alcools supérieurs, huiles végétales, etc.

> Technique: - Manuelle: risque de mauvais dosage et de contamination - Automatique: régulation par électrode de contact et écoulement aseptique

128

Réservoir d’antimousse

VanneAmplificateur

Niveau de tolérance de la mousse

Limite du volume utile

Électrode de

contact

Moût en fermentation

Régulation automatique dela mousse

129

IV.4.4- Contrôle du taux de croissance

• k : taux de croissance, en g de biomasse produite par g de micro-organisme et par h (taux d ’accroissement spécifique)

• Pour chaque espèce, il existe un kmaxExemple: pour la levure, kmax = 0,6 g/g/h

• k varie avec divers paramètres: température, pH, oxygénation, composition du milieu, etc.

130

Contrôle du taux de croissance (suite)

• Nécessité de contrôler le k car conditionne le rendement et la qualité de certains produits Exemple: en levurerie boulangère, quand k augmente, le rendement diminue (activitéfermentaire plus intense)

131


• On peut jouer sur différents paramètres: - température, pH, etc. - concentration du substrat limitant; selon l’équation de Monod: k=kmax.S/(ks+S) S: concentration en substrat limitant (g/l) ks: constante représentant la valeur de S pour laquelle k=kmax/2

132


• Si S augmente, k augmente et s ’approche de kmaxMais si S augmente, en levurerie, l ’effet glucose (effet Crabtree) augmente, d’oùbaisse de rendement et augmentation de la production d ’éthanol (toléré: 0,5 à 1% d ’éthanol)

133

IV.4.5- Aération - Agitation

• IV.4.5.1- Généralités

• IV.4.5.2- Efficacité du système d’aération d’un fermenteur

• IV.4.5.3- Régulation de l’aération

• IV.4.5.4- Stérilisation de l’air

134

Aération – Agitation (suite)

• IV.5.4.1- Généralités- Les 2 opérations sont complémentaires- Satisfaire la DMO (demande maximale en O2)- Air et non oxygène pur- Air stérilisé par filtration- Rôles de l’agitation:

. Homogénéisation dumilieu

. Accroissement de l’efficacitéde l’aération

DMO (mmoles d’O 2/l/h

Azotobacter sp 260Penicillium chrysogenum 20 - 30Saccharomyces cerevisiae 10 - 15

Escherichia coli 5 - 8

135

Aération – Agitation (suite)

• IV.4.5.2- Efficacité du système d’aération

- Ce qui compte, c’est la vitesse VA d’assimilation de l’O2 par le micro-organisme

- Ce qui limite cette assimilation, c’est la vitesse VD

(très lente) de dissolution de l’O2 dans le moût

- Si on ajoute dans le milieu un produit oxydable, son oxydation se fera à une vitesse VO qui sera limitée par VD

VA = VD = VO

136

Aération – Agitation IV. 4.5.2- Efficacité du système d’aération (suite)

• Méthode au sulfite pour déterminer VO

- On sait que

VD = kla(Ca – Cl) (équation de Fink)avec Ca: concentration de l’O2 dans l’air

Cl: concentration de l’O2 dans le liquidea: surface d’échange air/liquidekl: constante

Or, Cl = 0 (puisque toute fraction d’O2 dissoute est immédiatement assimilée) et Ca est constante. Donc, ce qui caractérise le système d’aération d’un fermenteur, c’est le

kla ou OAR (OxygenAbsorption Rate)

137

Aération – Agitation IV. 4.5.2- Efficacité du système d’aération (suite)

• Paramètres de variation du kla

- La présence de substances dissoutes le fait baisser

- Les substances tensioactives (mousse) le font baisser

- Il baisse quand la viscosité du milieu augmente

kla1 T1ρ2

kla2 T2ρ1= Ti; température absolue

ρi: viscosité

138

Aération – Agitation

• IV.4.5.3- Régulation de l’aération- Mesure en temps réel de la concentration

d’O2 dissous dans le moût:. Électrode de Day. Dispositif d’Aiba

- Possibilité de programmation informatique de la courbe de la DMO pour contrôle automatique

139

Fil de Nickel-Chrome

Tube d’aluminium (anode)

Électrolyte: éthylène glycol 55% saturé de KCl

Rondelle de caoutchouc

Rondelle de platine (cathode)

Membrane de téflon

électrode de DAY

140

Analyseur d’O2

Enregistreur

Tube de téflon

Courant

d’Azote

Dispositif d’AIBA

141


• IV.4.5.4- Stérilisation de l’air

- Généralités

. Nécessaire pour éviter les contaminations

. Chaleur inefficace

. Stérilisation par filtration

. Filtres à air caractérisés par leur efficacité

142

Aération – AgitationIV.4.5.4- Stérilisation de l’air

• Efficacité d’un filtre à airSoit N0: concentration des particules à l’entrée du filtre

N: concentration des particules à une distance L de l’entrée

dN - kN0

dL

Log N = - kL

N0

Soit η l’efficacité du filtre; η = N0 – N = 1 – N = 1 – e –kL

N0 N0

Pour que η = 1, il faudrait N= 0, soit L ∞

=

143


• Notion de L90: épaisseur de filtre capable de retenir 90% des particules de l’air

soit N0 = 100, donc N = 10

d’où Log 10 = - kL90, donc Log 10 = k L90, soit

100

Autres paramètres: taille des particules, vitesse du flux d’air, etc.

L90 = 2,3k

144


• Matériaux filtrants- Conventionnels: coton, laine de verre, charbon

activé, etc.- Modernes: papier imprégné de résine, bronze

fritté,etc.• Séchage de l’air avant filtration (passage sur

matériaux desséchants) pour éviter la condensation, cause de contaminations microbiennes

145

Matériaux Diamètre des fibres (µm)

Micro-organismes

Vitesse de l’air (cm/sec)

L90 (cm)

Laine de verre

16 Spores de Bacillussubtilis

3

30

300

4

11,5

0,4

Fibre de verre

8,5 Bactério-phage T25 d’E. coli

3

30

300

0,425

0,7

1,1

Charbon norit (15-30 mesh)

Charbon activé (4-8 mesh)

Laine de verre

-

-

18,5

Spores de B.cereus

Spores deB. subtilis

Serratiamarcescens

1,4

6,4

18

28,5

3,9

78

1,7

1,57

17

8,75

3,1

3

146


• IV.4.5.5- Besoins en énergie pour l’aérationPour soufflage de l’air (compresseur) et agitation,

forte consommation d’énergie.Exemple: 1 Kg de levure (en extrait sec) exige 20 à 25 m3

d’airL’énergie nécessaire pour soufflage de l’air et agitation: 0,4 kwh/kg de levure sèche, soit 80 % de l’énergie dépensée dans l’atelier de fermentation

147


• IV.4.5.6- Design des fermenteurs industriels:

Dépend étroitement des besoins en oxygénation et agitation et du système d’aération – agitation adopté

148

Chapitre V- Différents types de fermentations

• V.1- Fermentation en milieu liquide (FML)

- FML en discontinu (batch)

- FML en continu

• V.2- fermentation en milieu solide (FMS)

• V.3- Culture de cellules immobilisées

149

V.1- Fermentation en milieu liquide

• V.1.1- Fermentation en milieu liquide en discontinu (batch)

- Principe

- Avantages et inconvénients

• V.1.2- fermentation en milieu liquide en continu

- Principe

- Hypothèses de base de la fermentation continue

- Expression mathématique

- Avantages et inconvénients

150

V.1.1- Fermentation en milieu liquide en discontinu (batch)

• V.1.1.1- PrincipeCulture dans un système clos;Généralement, les étapes suivantes:- 1-Remplissage de la cuve avec le milieu- 2-Stérilisation du milieu dans la cuve- 3-Réglage des différents paramètres (pH, température, etc.)- 4-Inoculation- 5-Mise en route du système aération-agitation et des

régulations automatiques

151

V.1.1- Fermentation en milieu liquide en discontinu (batch)V.1.1.1- Principe (suite)

• Suite des étapes du batch:

- 5-Développement du micro-organisme jusqu’à l’arrêt de croissance (épuisement du substrat limitant, accumulation de déchets)

- 6- Vidange (soutirage) du moût épuisé (effluent) qui sera traité pour la récupération du produit désiré

- 7- Nettoyage et désinfection de la cuve, des conduites, etc.

152

Fermentation en milieu liquide en discontinu (batch)

• V.1.1.2- Avantages et inconvénients

- Avantages

. Équipements peu coûteux

. Ne nécessite pas de main d’œuvre qualifiée

- Inconvénients

. Forte dépense en énergie et produits de N&D

. Perte de temps

. Nécessite un effectif important en personnel

153

V.1.2- Fermentation en milieu liquide en continu

• V.1.2.1- Principe

Culture dans un système ouvert, les cellules étant maintenues en phase exponentielle de croissance, en général selon le principe suivant :

- Le chémostat: milieu nutritif stérile additionné àun débit constant (en rapport avec la consommation du substrat limitant)

154

Air

Compresseur

Compresseur

Air

Filtre

Filtre

Réservoir

de milieu de

culture

Trop-plein

Agitateur

magnétique

Inoculum

155

Fermentation en milieu liquide en continu

• V.1.2.2- Hypothèses de base de la fermentation continue

- 1. toutes cellules en train de se diviser (phase exponentielle de croissance)

- 2. toutes cellules exactement dans les mêmes conditions (agitation): taux d’accroissement spécifique k constant

- 3- densité cellulaire N constante dans le temps- 4- Concentration du substrat limitant S constante- 5- l’effluent qui quitte le fermenteur a exactement

la même composition que le moût à l’intérieur du fermenteur

156


• V.1.2.3- Expression mathématique de la fermentation continue

A- cas général

F0 Fi-1 Fi

Fi+1

1 i-1 i i+1 n Effluent final

Milieu stérile

F1

157

Fermentation en milieu liquide en continuExpression mathématique: cas général

Caractéris-tiques des

fermenteurs

Fermenteur 1 Fermenteur

i-1

Fermenteur i Fermenteur i+1

Densitécellulaire

N1 Ni-1 Ni Ni+1

Volume V1 V i-1 V i V i+1

Vitesse spécifique de

croissance

k1 ki-1 ki ki+1

158

Fermentation en milieu liquide en continuExpression mathématique: cas général

• Dans le fermenteur i,

dNi kiNi + Fi-1 Ni-1 – Fi Ni

dt Vi-1 V i

=

159

Fermentation en milieu liquide en continuExpression mathématique

• B- cas d’un fermenteur unique en régime permanent

- Fermenteur unique : Ni-1 = 0

- Régime permanent: dNi = 0

dt

d’où kiNi = Fi Ni avec Fi = Di (taux de

V i V i dilution)

ki = Di Règle absolue pour fermenteur unique en régime permanent

160

Fermentation en milieu liquide en continuExpression mathématique, fermenteur unique en régime

permanent

• Applications

- Si D > kmax; forte dilution

Ni 0 ; phénomène du « wash out »

- « Holding time »: temps de renouvellement du fermenteur

1 Vi

Di Fi= Exemple: avec Vi = 10 m3 et Fi = 2,5 m3/h;

holding time = 4h

161


• C- Effet de la concentration en substrat: équation de Monod

ki = kmax Si

ks+Si

Si S augmente, k augmente.

Mais: . Perte de substrat

. Autres effets indésirables (effet glucose)

ki: vitesse de croissance (mg/mg/h)

kmax: vitesse spécifique maximale

Si: conc. en substrat limitant (mg/ml)

ks: valeur de S pour k = ½ kmax

Heureusement, ks généralement faible (de l’ordre du cg/ml pour les sucres et du mg/ml pour les acides aminés)

162

Évolution de la biomasse en fonction du temps

Log N

T

t

B1

B2 B2 = B1 ekt

163


• D- Cas d’une série de fermenteursExemple: fermentation à double effet (cas des

fermentations des catégories II & III de Gaden)k1 > k2 puisque nécessairement S1 > S2

Mais ce n’est pas gênant; généralement, la croissance est plus recherchée dans le premier fermenteur que dans le second

164


• V.1.2.4- Avantages et inconvénients�Avantages:- Économie d’énergie- Économie de produits de Nettoyage & Désinfection- Fermenteur tout le temps productif- Plus économique car pas de temps mort- Permet l’optimisation du système sans arrêter la

production (injection de nutriments, changement des conditions physico-chimiques)

165

Fermentation en milieu liquide en continu V.1.2.4- Avantages et inconvénients

�Inconvénients:

- Investissement coûteux

- Nécessite un personnel hautement qualifié

- Manque de souplesse dans la production (cas de panne)

166

V.2- Fermentation en milieu solide (FMS)

• V.2.1- Définition et historique

• V.2.2- Différents types de fermenteurs pour les FMS

• V.2.3- Applications des FMS

• V.2.4- Avantages et inconvénients des FMS

167

Fermentation en milieu solide (FMS)

• V.2.1- Définition et historique�Définition: culture de micro-organismes sur et à

l’intérieur de particules solides humectées sans qu’il y ait de phase liquide circulante (= systèmes avec cellules immobilisées)

� La matrice peut être:- Un support inerte imbibé d’un milieu nutritif complet

(pH ajusté)- Un substrat nutritif solide (son, paille, etc.) imbibé

d’eau ou d’une solution nutritive de complémentation (pH ajusté)

168

Matrice solide

Liquide

Gaz

Micro-organisme

Fermentation en milieu solide

169

Fermentation en milieu solide Définition et historique

�Historique:

- Riz fermenté en Asie (depuis plus de 3000 ans)

- Fromages moisis (Camembert, Roquefort, les Bleus, etc.) connus depuis des siècles

- Depuis le début du XXèmesiècle, nombreuses applications: enzymes, acides organiques, protéines , compostage, champignons comestibles, etc.

170


• V.2.2- Différents types de fermenteurs pour les FMS

- Fermenteur à plateaux type Koji

- Fermenteur de type tambour rotatif

- Fermenteur agité (ex.: bio-réacteurhorizontal agité)

171

1

2

3

4 8

13

56

7

9 10

11

12

14

1: Enceinte du Koji; 2: Vanne d’arrivée d’eau; 3: Tube UV; 4, 8 & 13: Ventilateurs; 5: filtre sortie d’air; 6: sortie d’air; 7: Humidificateur; 9: dispositif de chauffage de l’air; 10: Recyclage de l’air; 11: filtre; 12: entrée d’air; 14: plateaux

Bioréacteur de type Koji

172

Bioréacteur de type tambour

rotatif

1

23

456

7

1: Entrée d’air; 2: diffuseur d’air; 3: tuyau d’alimentation; 4: rouleaux d’entraînement; 5: tambour rotatif; 6: milieu de culture; 7: rails d’entraînement

173

Bioréacteur horizontal agité

1

2

2

34

5

6

8 97

1: Entrée d’air; 2: Capteurs; 3: Double enveloppe; 4: Pales d’agitation; 5: Sortie d’air; 6: Moteur d’agitation; 7: Réacteur; 8: Milieu solide; 9: Axe d’agitation

174


• V.2.3- Applications des FMS

�Production d’enzymes: amylases, cellulases, protéases sur riz, soja ou blé (procédé Koji); d’autres enzymes: pectinases, présure fongique, etc.

�Acides organiques: acides citrique, kojique, itaconique, etc.

175


• V.2.3- Applications des FMS (suite)�Protéines d’organismes unicellulaires: Aspergillus

niger, A. oryzae, etc. sur substrats amylacés (manioc, pomme-de-terre, etc.) pour alimentation animale

�Production de spores:- Penicillium roquefortiiet P. caseicolumpour

fromageries- Trichoderma, Beauveria, etc. pour lutte biologique

176

V.3- Culture de cellules immobilisées

• V.3.1- Principe

• V.3.2- Systèmes anciens

• V.3.3- Systèmes modernes

• V.3.4- Avantages

177

Culture de cellules immobilisées

• Généralités

- En milieu liquide classique:

. densité cellulaire limitée

. extraction du produit désiré difficile

- L’ immobilisationdes cellules permet d’améliorer les performances

- Possibilité de fixer aussi des enzymes

178


• V.3.1- Principe:

- Immobiliser les cellules sur (ou dans) un support, en général dans une colonne

- Faire circuler le milieu liquide frais stérile àtravers la colonne

- Récupérer l’effluent (milieu transformé) contenant le produit désiré

179


• V.3.2- Systèmes anciens

Ils reposaient sur l’adsorption des micro-organismes à la surface des éléments du support. Exemples:

- Lits bactériens pour le traitement des eaux usées;

- Fabrication de vinaigre par circulation de vin sur des copeaux de hêtre (bois) sur lesquels s’est développée une couche de cellules bactériennes (Acetobacter)

180


• V.3.3- Systèmes modernes� Procédés d’immobilisation des cellules- Adsorption- Liaison covalente- Inclusion- Encapsulation- Floculation (réticulation)� Types de fermenteurs pour cellules immobilisées (exemples)- Réacteurs à lit fixe- Réacteurs à fibres creuses

181

Culture de cellules immobiliséesSystèmes modernes

Procédés d’immobilisation des cellules

� 1- Adsorption: billes (0,2 mm) dextrane ou polyacrylamide

� 2- Liaison covalente: entre support et cellules à l’aide de glutaraldéhyde ou bromure de cyanogène

� 3- Inclusion par gélification dans une matrice� 4- Encapsulation: dans des micro-billes d’acétate de

cellulose ou de polyester (matériaux semi-perméables)

� 5- Floculation: agrégation de cellules individuelles (peut être améliorée par addition de chitosane): réticulation

182

Adsorption

Liaison covalente

Inclusion dans une matrice

Encapsulation

Réticulation

Immobilisation des micro-organismes1

5

4

2

3

183


Types de fermenteurs pour cellules immobilisées

�Réacteur à lit fixe

Réacteur: colonne dans laquelle sont entassées des billes de verre (3 à 5 mm de ø)

Lors de l’inoculation, les cellules s’immobilisent sur les billes

L’aération et le contrôle du milieu se font àl’extérieur de la colonne

184

˜

˜

Prise

d’échantillon

Acide ou

base

pompe

pompe

Filtre à air

Sortie d’airElectrode à pH

Entrée d’air

Prise d’échantillon

MilieuMélangeur

Drainage

Réacteur à lit fixe

185


Types de fermenteurs pour cellules immobilisées

�Réacteurs à fibres creuses

Le milieu de culture circule au travers de fibres creuses en polypropylène entre lesquelles les cellules se développent

186

Ouvertures d’inoculation

Air

Nutriments Fibre creuse

Milieu

Cellules microbiennes

CapillaireRéacteur à fibres

creuses

187


• V.3.4- Avantages

- Réutilisation possible ou utilisation en continu

- Maintien du bio-réacteur stable et actif

- Vitesse de réaction augmentée

- Récupération facile du produit

- Meilleur contrôle du système de production

188

Chapitre VI- Récupération des produits de fermentation

• VI.1- Schéma général

• VI.2- Principales techniques utilisées

VI.2.1- Techniques mécaniques

VI.2.2- Techniques de séparation « par membrane »

VI.2.3- Techniques d’extraction par solvant

VI.2.4- Techniques électrostatiques et échange d’ions

VI.2.5- Techniques de récupération des produits endocellulaires

189

Récupération des produits de fermentation

Effluent final

SéparationCentrifugation

Filtration

Effluent léger

Divers procédés

Produits solubles: Antibiotiques Acides organiques Exotoxines, etc.

Biomasse

Utilisation directe: lev. boulangère

« Conditionnement»: levure aliment

Récupération pdtsendocellulaires:nucléotides, protéines, endoenzymes, etc.

VI. 1- Schéma général

190

Récupération des produits de fermentation

VI.2- Principales techniques

VI.2.1- Techniques mécaniques- Centrifugation:pour récupérer les micro-organismes

unicellulaires ou séparer 2 liquides de densités différentes

Loi de Stokes: (ρp - ρl) dp2 ω r

18µV =

V: vitesse de sédimentation en cm/sec ρp : densité des la particule en g/cm3

ρl: densité du liquide en g/cm3

dp: diamètre de la particule µ: viscosité du liquide r: distance de la particule à l’axe de rotation en cm ω: vitesse angulaire en rad

191

Récupération des produits de fermentation Principales techniques

Techniques mécaniques

- Floculation:

. Neutraliser les charges négatives de la surface des micro-organismes avec des cations (sulfate d’alumine: 1 – 2%; chlorure de calcium: 0,1 –0,5%; tétrachlorure de titane: 0,01 – 0,02%);

. Utiliser des polymères hydrophiles: gélatine, alginate de sodium, carboxy-méthyl-cellulose

192



• FlotationLes particules solides à séparer se fixent sur les bulles d’un gaz: la flotation

des particules adhérentes aux bulles permet de les éliminer sous forme de mousse. La relation représentant l’équilibre à l’interface est donnée par l’équation de Gibbs

- 1 dy Γ1 : Concentration à la surface

Γ1 Ci : conc. du composé dans le liquide

RT d ln Ci y: tension superficielle

Rapport gaz/liquide élevé pour avoir le moins de liquide possible une fois la mousse cassée

Exemple: Escherichia coli, avec 0,0015 mg/ml d’éthylhexadecyldiméthyl-ammonium bromure, la mousse cassée contient 106 fois plus de cellules

=

193



• Précipitation

Ex.: obtention de pénicilline sous forme de précipité de procaïne pénicilline

194


VI.2.2- Techniques de séparation « par membrane »

• Séparation par membrane:

- Filtration classique

- Dialyse

- Osmose

- Pervaporation

- Électro-dialyse

- Électro-osmose

- Ultra-filtration

195


Techniques de séparation « par membrane »

• Filtration classique:- Sert à séparer le myceliumdu moût

fermenté- Pour les Actinomycètes, nécessité de

chauffer, d’acidifier- En levurerie, filtre rotatif sous vide pour

obtenir la pâte de levure à partir de la crème de levure

196


Techniques de séparation « par membrane »

• Filtration sur gel:

- Permet de séparer des molécules de tailles différentes

- Lorsqu’on ajoute un solvant, les grosses molécules apparaîtront les premières dans l’effluent.

- Exemple: séparation d’une protéine allergisante présente dans la pénicilline à l’aide de SephadexG 25

197


VI.2.3- Techniques d’extraction par solvant

• Extraction simple

• Systèmes liquides biphasiques

• Adsorption et chromatographie

198


Techniques d’extraction par solvant

• Extraction simple:

- Solvants utilisés: alcools, esters, cétones, éthers

- Le produit se répartit dans les 2 phases suivant un coefficient de partage qui varie avec le pH

- Exemple: pH 7: pénicillinatede sodium soluble dans l’eau

pH 2: acide pénicillique soluble dans l’acétate d’amyle

199



• Systèmes liquides biphasiques:

Exemple: Bacillus thuringiensis: la phase aqueuse contient 99% des cristaux de protéine insecticide; les spores se retrouvent dans le tétrachlorure de Carbone

200



• Adsorption et chromatographie:on fixe le composé à séparer sur un adsorbant solide et on l’élue à l’aide d’un faible volume d’un solvant dans des conditions de pH précises

Exemple: streptomycine. Adsorption sur résine échangeuse d’ions à pH 7,5. Élution avec HCl 0,2 N

201


VI.2.4- Techniques électrostatiques et échange d’ions

• Électrophorèse

• Résines échangeuses d’ions

• Liquides échangeurs d’ions

202


Techniques électrostatiques et échange d’ions

• ÉlectrophorèseExemple: on sépare spores et cellules diploïdes

de Saccharomyces cerevisiae

• Résines échangeuses d’ions: adsorbent algues, bactéries et virus, mais trop onéreuses

203


Techniques électrostatiques et échange d’ions

• Liquides échangeurs d’ions

Le liquide échangeur d’ions (complexe d’une amine R3N et d’un acide HA) est dissous dans solvant organique. Si la solution aqueuse contient un anion P-, celui-ci est extrait par un échange d’ions avec le composé aminé

R3NHA + P- R3NHP + A- Phase organique

P- A- Phase aqueuse

On sépare les 2 phases par centrifugation et le produit P-

est extrait de la phase organique

204


VI.2.5- Récupération des produits endocellulaires

• Modification du pH pour changer la perméabilitécellulaire

• Ajouter des solvants (chloroforme pour terramycine) ou des détergents (pour l’acide glutamique)

• Choc thermique (extraction de la vitamine B12)• Choc osmotique• Alternance congélation / décongélation• Eclatement dans des filières étroites à haute pression• Broyage du myceliumcongelé

205

Chapitre VII- Levurerieindustrielle

• VII.1- La souche de levure boulangère

• VII.2- Le milieu de culture en levurerieindustrielle

• VII.3- Conduite de la fermentation

• VII.4- Récupération et conditionnement des formes commerciales

206

INOCULUM

MILIEU DE CULTURE

PRODUIT DESIRE

Souche de levure

Préparation de l’inoculum

Mélasse brute

Corrections

Programme d’alimentation

Température

pH

Oxygénation

Mousse

Inoculation

Récupération

207

Levurerieindustrielle

• VII.1- La souche de levure boulangère

- Rôle de la levure dans la panification

- Critères de choix de la souche de levure

- Principales caractéristiques (nutritionnelles et métaboliques)

208

Levurerie industrielle

VII-1- La souche de levure boulangère

• Rôle de la levure dans la panification (espèce Saccharomyces cerevisiae)

- Élasticité de la mie (production de CO2)

- Arôme du pain: produits secondaires

- Apport nutritionnel: lysine, vitamines

209

Levurerie industrielleVII-1- La souche de levure boulangère

• Critères de choix

- Activité élevée (production de CO2)- Absence d’amertume- Thermophilie (souhaitable)- Activité amylasique:

. Rare chez Saccharomyces cerevisiae

. Bonne chez S. diastaticus

210


• Principales caractéristiques�Généralités- Aéro-anaérobie facultatif- Capable de pousser sur divers substrats

carbonés- Reproduction asexuée par bourgeonnement

(nécessite beaucoup d’énergie)- Production de cellules (croissance) et

production d’éthanol toujours en compétition

211

GLUCOSE C6H12O6

ACIDE PYRUVIQUE 2CH3COCOOH

Cycle de

Krebs

6 CO2 + 6 H2O + 38 ATP

CROISSANCE IMPORTANTE

2 CH3CH2OH + 2 CO2 + 4 ATP

CROISSANCE FAIBLE

O2

Effet Glucose

(Crabtree)

Effet Pasteur

212


• Principales caractéristiques�Glucides utilisables- Glucose, fructose et mannose (formes D): en

aérobiose et en anaérobiose- Saccharose: grâce à l’invertase, constitutive, à

activité très rapide- Amidon: amylase à activité très réduite ou

inexistante- Lactose: non utilisable

213


• Principales caractéristiques (suite)�Autres propriétés nutritionnelles- azote: NH4

+, acides aminés, urée (milieu riche en biotine)

NO3- non utilisable

- sels minéraux. P et S: besoins importants; H3PO4, H2SO4

(acidification), (NH4)2SO4 (azote en plus) . Alcalino-terreux: Mg (nécessaire); Ca (stimulant). Oligo-éléments: Cu & Fe (nécessaires à la

respiration); Zn (également nécessaire)

214


• Principales caractéristiques� Autres propriétés nutritionnelles (suite)- Facteurs de croissance

Nature Besoin Demande

Mg/g MS

Observations

Biotine

Inositol

Ac. Panthotén.

Thiamine

Ac. nicotin.

Pyridoxine

Néces.

Stimule

Stimule

Stimule

Néces.

Stimule

0,25

300

12

Remplaçable (D-biotine-méthyl-ester, etc.)

Apport exogène nécessaire pr act. enz. max.

Remplaçable (nicotinamide)

215


• VII.2- le milieu de culture en levurerieindustrielle

- Le milieu de base: la mélasse de sucrerie

- Défauts de la mélasse et leur correction

216

Levurerie industrielleVII.2- le milieu de culture en levurerie industrielle

� Le milieu de base: la mélasse de sucrerie- Différents types de mélasses

. Mélasses de betterave+ Mélasse de sucre brut+ Mélasses de sucre blanc+ Mélasses de sucre raffiné

. Mélasses de canne+ Mélasse brute: blackstrap+ Mélasses de raffinage

217


Composition moyenne des mélasses (en %)

Constituants Betterave CanneEau

Sucres: saccharose

glucose

fructose

raffinose

Mat.azotées totales

Cendres SiO2

K2O

CaO

MgO

P2O5

Na2O

Fe2O3

Al2O3

Résidus carbonatés (en CO2)

Résidus sulfatés (en SO3)

Chlorures

16,5

51,01,0 53,0

1,0

19,0

0,10

3,90

0,26

0,16

0,06 11,5

1,30

0,02

0,07

3,50

0,55

1,60

20,0

3214 62

16

-

10,0

0,5

3,5

1,5

0,1

0,2 8,0

-

0,2

-

-

1,6

0,4

218


�Défauts de la mélasse et leur correction

- Viscosité

- Substances inhibitrices

- Déficiences nutritionnelles

- Matières en suspension

- Présence de contaminants microbiens

- Saisonnalité de la production

219

LevurerieindustrielleVII.2- le milieu de culture en levurerie industrielle

Défauts de la mélasse et leur correction

• Viscosité de la mélasse

- Elle gêne les transvasements et la clarification- Effet du Brix: à 20°C, 471 poises pour Brix 82,3

56 poises pour Brix 78,5- Effet de la température: pour Brix 78,5

56 poises à 20°C4 poises à 50°C

- Remèdes. Chauffage pour transvasements seuls. Dilution pour clarification et stérilisation (1/2 à 1/3 => Brix 25-40)

220



• Substances inhibitrices - Nature et origine. SO2: traitement des betteraves à la réception; sulfitation au diffuseur

. Nitrites: engrais (NO3- réduits par bactéries)

. Hydoxy méthyl furfural (HMF): réaction de Maillard; surtout mélasse de canne

. Imido disulfonate de Potassium: complexe entre SO2, NO3

- et K+ (précipite à froid)- Remèdes: contrôle préalable; dilution (< CMI)

221



• Déficiences nutritionnelles- Origines: déséquilibre de la composition

dilution (obligatoire)- Remèdes. Azote: urée, sels d’ammonium (sulfate par exemple),

ammoniaque (régulation du pH). Phosphore et soufre: ac. phosphorique ou ac. sulfurique (pH

initial); sulfate et phosphate d’ammonium par la suite (progressivement);

. Oligo-éléments: Cu et Fe surtout, Mg, Zn, etc.

. Facteurs de croissance: Biotine (pour mélasses de betterave); Thiamine (mélasses de canne).

222



• Présence de matières en suspension

- Inconvénients:

. Stérilisation difficile

. Croissance de la levure ralentie

. Coloration anormale du produit fini

- Remède: clarification (par précipitation ou centrifugation)

223



• Présence de micro-organismes contaminants

Remède: stérilisation (voir Chap. II)

• Production saisonnière

Solution: stockage

224


• VII.3- Conduite de la fermentation- Étapes de la fermentation- Contrôles des paramètres de la culture

. pH

. Température

. Oxygénation

. Mousse

. Alimentation en substrats

. Taux de croissance

225

Levurerie industrielleVII.3- Conduite de la fermentation

• Étapes de la fermentation (exemple):

- Préparation au laboratoire

- G1: petit fermenteur

- G2: 2èmefermenteur

- G3: grande cuve

- Générations suivantes

226

226226

Souche importée

Ballon

Fermenteur G1

Fermenteur

G2

Grande

cuve G3

Étapes de la fermentation en levurerie (Exemple)

227


Etapes de la fermentation

• Générations suivantes (économie de souche importée)

- La biomasse obtenue dans G3 concentrée par centrifugation (crème de levure)

- Répartie en plusieurs fractions

- Chaque fraction servira à ensemencer une cuve de type G3

- Opération répétée sur plusieurs générations (6 à 8)

228


Etapes de la fermentation

• Conduite de la fermentation dans la cuve G3: fermentation discontinue avec alimentation progressive en substrat (voir plus loin)

229


Contrôle des paramètres de la culture

• pH- Culture possible entre pH 3,5 et 7- pH acides préférés pour éviter les contaminations

bactériennes- Évolution du pH en cours de fermentation => le

rétablir par addition d’ac. sulfurique ou d’ammoniaque (régulation automatique)

- Risque de coloration grisâtre si:. Trop de matières en suspension. pH acide (surtout pH < 5)

230



• Température- Croissance possible entre 20 et 40°C- Basses températures: meilleure efficacité de la conversion du

substrat en cellules- Hautes températures (> 35°C): perte de rendement par

augmentation d’activité fermentaire, mais meilleure stabilité- À la SOMADIR: 32-34°C- Dégagement de chaleur par fermentation: 3200 Kcal/Kg de

levure sèche (700 Kcal/Kg de mélasse à 50% de sucres- Refroidissement peut être régulé automatiquement

(thermostat)

231



• Oxygénation

- 1g d’O2 nécessaire pour produire 1g de levure sèche- Quantité d’air nécessaire: 20-25 m3/Kg de levure sèche- Énergie nécessaire pour le soufflage de l’air: 0,4 Kwh/Kg

de levure sèche (80% de la consommation de l’atelier de fermentation)

- Contrôle par dispositif automatique- Filtration de l’air: filtres dégrossissants (poussières et

micro-organismes) et filtres stérilisants (fibres de verre, laine minérale, cellulose - amiante, etc.)

232



• Mousse

- Inconvénients de la mousse:

. Risques de contamination

. Réduction de l’efficacité de l’aération

- Remèdes

. Addition d’antimousse dans la pré-couche

. Addition progressive manuelle ou automatique(électrode de contact)

233



• Contrôle de l’alimentation en substrat- Croissance sur la pré-couche, tendance à

l’épuisement des substrats- Addition progressive en substrats suivant des

volumes et des délais contrôlés:. Par la richesse en alcool du moût (effet Crabtree): taux toléré: 0,5 à 1%. Par le test de titration au formol (concentration de l’ion ammonium et des amino-acides) => réglage de l’alimentation en Azote

234



• Contrôle du taux de croissance- Équation de Monod: k = kmax S

ks + S- kmax = 0,6 g/h/g- pour un k élevé, rendement faible, activité

fermentaire élevée.- Généralement, on choisit k = 0,05-0,3 g/h/g pour

avoir qualité, densité cellulaire et conversion du substrat en cellules satisfaisant

235



• Conduite de la culture en alimentation progressive en substrat

- Fixer la valeur voulue de k (généralement 0,05-0,3)

- Partir de la quantité de biomasse apportée par l’inoculum, soit B0

- Au bout de la première heure, biomasse B1

B1= B0 ekT

236



• Exemple:

k = 0,15

B0= 4500 kg de levure

B1= 4500e0,15

Quantité de biomasse à produire: B1-B0

Quantité de mélasse à apporter = appliquer la règle des 50/50 (voir diapo 70)

237



• Pour la 2èmeheure, idem

B2= B1ekT

238



• Calcul des besoins en Azote- 1èreheure, produire B1-B0 de levure- Protéines = 50% de la matière sèche- Azote: quantité de protéines/6,25- Quantité d’urée CO(NH2)2 à apporter =

quantité d’azote x 60/28 (60 g d’urée contiennent 28 g d’Azote)

- 2èmeheure: idem partant de B2-B1

239


• VII.4- Récupération et conditionnement des différentes formes commerciales (voir schéma diapo suivante)

240

Effluent final

Effluent délevuré

Crème de levure

Commercialisation

Inoculation (génération suivante)

Levure sèche

Séchage(atomis°)Rejet ou

recyclage

Pâte de levure

Filtration(filtre

rot./vide

Levure fraîche

Commercialisation

Boudinage

Commercialisation

Centrifugation

Séchage(lit fluidisé)

241

Chapitre VIII- Rôle des micro-organismes dans la fabrication des

fromages

• Généralités

• VIII.1- Caillage du lait

• VIII.2- Egouttage du caillé

• VIII.3- Affinage

242

VIII- Rôle des micro-organismes dans la fabrication des fromages

• Généralités

Fromage: produit alimentaire obtenu par:

- Caillage (coagulation) du lait

- Égouttage du caillé (coagulum)

- Affinage du caillé égoutté (facultatif: fromages affinés seulement)

243

Lait

Caillé

Lactosérum Caillé égoutté

Coagulation

Egouttage

Affinage

Fromage frais

Fromage affiné

Vente

Schéma général de la fabrication des

fromages

244

Types de pâte Affinage Exemples

Fraîche Sans affinage Jben, Petit-Suisse

MolleCroûte moisie

Moisissure interne

Croûte lavée

Camembert, Brie,

Bleus, Roquefort (brebis)

Munster, Livarot

Pressée

Ferme non cuite

Ferme cuite

Croûte moisie

Croûte lavée

Croûte lavée

Ouverture, cr. morgée

Ouverture, cr. sèche

Sans ouv., cr. morgée

St-Nectaire, Tomme

St-Paulin, Reblochon

Cantal

Comté

Emmenthal, Gruyère

Beaufort

Classification des fromages

245

Rôle des micro-organismes dans la fabrication des fromages

• VIII.1- Caillage du lait

- Définition

- Caillage enzymatique: caillé présure

- Caillage par acidification: caillé acide ou lactique

- Caractéristiques des deux types de caillé

- Remarques

246


Caillage du lait

�Définition

Caillage: transformation du lait liquide en lait coagulé (coagulum = caillé de fromagerie)

Dans le lait liquide, micelles de caséine en suspension stable car entourées d’une couche d’eau d’hydratation (charges négatives)

Caillage: déstabilisation de cette suspension

247

micelle

Eau liéeEau d’hydratation périphérique

Eau libre

Hydratation de la micelle de caséine en suspension stable

249


Caillage du lait

�Caillage enzymatique

Caséine entière CGP + paracaséineCGP (Caséino-Glyco-Peptide) très chargé

négativement, se détache (PM faible)Paracaséine, instable, coagule => caillé présureRôle important joué par Ca++ et phosphate de

calcium colloïdal

présure

250

-Ca-

-Ca-

-Ca--Ca-

-Ca-

-Ca-

-Ca-

251

Rôle des micro-organismes dans la fabrication des fromagesCaillage du lait

�Caillage par acidification

pH normal du lait frais: 6,6-6,8

pH isoélectrique de la caséine: 4,6

L’acide lactique produit par fermentation diminue le pH; coagulation à pH 4,6

=> caillé acide ou lactique

252


�Caractéristiques des 2 types de caillé:

Caillé acide: mou, perméable, peu élastique

Caillé présure: ferme, imperméable, élastique

253


�Remarques:- Souvent, en fromagerie, coexistence des 2

mécanismes => caillé mixte- La part des 2 mécanismes peut varier,

donnant des caillés mixtes àdominance présureou àdominance lactique

- Un caillé présure peut évoluer vers les caractéristiques d’un caillé acide suite au développement des bactéries lactiques

254


VIII.2- Egouttage du caillé

- Définition

- Égouttage spontané (cas du Camembert)

- Égouttage forcé (cas des fromages à pâte cuite)

255


Egouttage du caillé

�Définitions

- Egouttage: élimination du lactosérum

- La fraction solide qui reste: caillé égoutté

256



�Egouttage spontané (cas du Camembert)

- Caillage par présure après un léger développement des bactéries lactiques: caillé mixte à dominance présure au départ

- Moulage: le caillé doit être ferme- Egouttage: 28-30°C (salles d’égouttage); les

ferments lactiques dominants: Lactococcus lactissubsp. lactiset L. lactissubsp. diacetylactis

257



- Rétraction du caillé par:

�Déminéralisation: libération des ions Ca++

et solubilisation du phosphate de Ca colloïdal

�Protéolyse

�Modification de texture du caillé

Au bout de 24 h, caillé de type lactique presque pur (pH 4,2-4,6)

258

- Ca -

-C

a -

- Ca

-

- Ca -

- Ca -

-H

-H

-H

-H

-H

-H

-H

-H

-H

-H

Mécanisme de l’égouttage spontané

- Déplacement des ions Ca++ par les ions H+

- Solubilisation du phosphate de Calcium en milieu acide

- Action des protéases bactériennes ( )

Micelle avantégouttage

Micelle aprèségouttage

259



- Conditions d’un bon égouttage

�Température: 28-32°C

�Lait exempt d’antibiotiques

�Pas trop de Coliformes

260



�Egouttage forcé (fromages à pâte ferme)

- Caillage très rapide (1h15mn à 1h30mn): lait portéà 32°C et emprésuré => caillé de type présure

- Travail du caillé:

. Brassage: découpage et agitation

. Chauffage (52-54°C): sélection de bactéries lactiques thermophiles: Streptococcusthermophilus, Lactobacillus helveticus, Lb. lactis

261Découpage et agitation du caillé en fromagerie

262



Attention: survie des formes sporulées:

- Clostridiumbutyricum

- Cl. tyrobutyricum

- Cl. sporogenes

Risque d’accident de fabrication: gonflement tardif

Relation avec ensilages mal réussis (pH trop élevé)

263



- Pressurage: . Accentuation de l’égouttage. Collage des grains de caillé. « Formage » ou mise en forme du fromage

Lactobacilles se développent davantage au centre, Streptocoques davantage vers la périphérie (sélection thermique)

Fin du séjour sous presse: population bactérienne de plusieurs milliards/gramme et pH 5,1-5,2 (Emmenthal)

264

Pressurage

265


VIII.3- Affinage des fromages

�Cas du Camembert

�Cas des fromages à pâte ferme (type Gruyère)

266


Cas du camembert

• Salage: sel fin ou saumure, après égouttage et démoulage

• Ensemencement des spores de Penicilliumcaseicolum: dans le lait avant caillage, ou au cours du salage ou après salage

• Séjour au hâloir: salle climatisée (13-15°C; 90% HR)

• Phénomènes superficiels et phénomènes profonds

267


Cas du camembert�Phénomènes superficiels: succession de groupes

microbiens- Flore acidophile (levures essentiellement): consomme

l’acide lactique, préparant l’installation du Penicillium- Penicillium caseicolum: fleurissement (feutrage blanc

vers 8èmejour au hâloir); fromages placés sur claies en bois et retournés pour aérationProduction de protéases et de lipases qui diffusent vers le centre

- Ferments du rouge: Microcoques et Brevibacteriumlinens(très protéolytiques)

268


Cas du camembert

Conditions d’un bon développement du Penicillium: salage bien dosé

- Salage insuffisant: développement excessif des levures acidophiles => peau de crapaud

- Salage excessif: développement nul ou insuffisant des levures acidophiles => fromage nu, sec et trop acide

269

Camembert

270

Autre exemple de fromage moisi:le Roquefort

Moisissure interne: Penicillium roqueforti

271


Cas du camembert

�Phénomènes en profondeur, essentiellement:

- Diffusion des protéases du Penicilliumet des ferments du rouge (affinage centripète): fromage « affiné à cœur », puis fromage « coulant »

272

Croûte de P. caseicolum Fraction déjà affinée

Fraction non encore affinéeLipases

Protéases

Schéma de l’affinage centripète du Camembert

273273

Affinage centripète duCamembert

Croûte moisie

Partie superficielle de la pâte, affinée

Partie centrale pas encore affinée

274


Cas des fromages à pâte ferme• Salage• Séjour en cave froide (10 – 12°C, 2 à 3 semaines)- Chute du nombre des micro-organismes- Nouvelle poussée (env. 1 milliard/g):

Lb. helveticuset Str. thermophilusen symbiose- Nouvelle chute de population (env. 105/g): libération

d’enzymes endocellulaires (protéases) par Lb. helveticuset Lb. lactissurtout

- Soins apportés à la croûte: salage, brossage, retournement

275


Cas des fromages à pâte ferme

• Séjour en cave chaude- Évolution de la pâte. Nouvelle prolifération microbienne (108-109/g): Propionibactéries (PropionibacteriumfreudenreietP. jansenii). Température optimale: 23-24°C. Formation d’acides propionique et acétique et de CO2 à partir du lactose, d’ac. lactique et d’ac. pyruvique => goût et arôme et « ouverture »

276



. Importance du développement de l’ouverture�Emmenthal: « yeux » de la taille d’une noix

Cave chaude: 20-22°C�Gruyère: « yeux » de la taille d’une noisette

Cave chaude: 17-18°C�Fromage de Beaufort (Fr.) ou de Fribourg

(CH): « Gruyère sans trous »Température maintenue: 10-12°C

Affinage des fromages àpâte ferme

278

Emmenthal

279



- Évolution de la croûte:

. Cas de l’Emmenthal et du Gruyère, croûte sèche (frottages avec sel sec, retournements et brossages)

. Cas du fromage de Comté, développement de la morge: couche visqueuse rouge à brune de bactéries (Brevibacteriumlinenset Br. gruyerencea) halotolérantes (jusqu’à 16% de sel), température optimale 21°C, très protéolytiques, libérant tyrosine, ammoniac et amines (goût très fort)

biotechnologie - … · ii.1- caractéristiques de la souche ... - régénération de la paroi -...

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