analyse post-génomique des interactions cellulaires … · ii.4 la cacophonie microbienne ... i.1...

1

Thèse de Doctorat

de Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries

Filière : Microbiologie et Biocatalyse industrielle

Présentée à

L’ Institut National des Sciences Appliquées de Toulouse

par

Mathieu MALIGOY

Analyse post-génomique des interactions cellulaires dans des écosystèmes modèles.

Devant le jury composé de

Mme V. MONNET Directeur de Recherche, INRA, Jouy-en-Josas Rapporteur

M. P. BONNARME Directeur de Recherche, INRA, Grignon Rapporteur

M. P. RENAULT Directeur de Recherche, INRA, Jouy-en-Josas Examinateur

M. R. PERRIN Responsable de Département Microbiologie,

SOREDAB, La Boissière Ecole Examinateur

M. N. LINDLEY Directeur de Recherche CNRS, INSA, Toulouse Président

M. P. LOUBIERE Directeur de Recherche INRA, INSA Toulouse Directeur de thèse

Cette thèse a été préparée au Laboratoire d’Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés (LISBP), UMR-CNRS 5504, UMR-INRA 792.

Nom : MALIGOY Prénom : Mathieu Titre : Analyse post-génomique des interactions cellulaires dans des écosystèmes modèles. Projet de thèse, Spécialité : Ingénieries microbienne et enzymatique Année : 2008 Lieu : Toulouse N° d’ordre : Pages : 195

Résumé : L’objectif était de caractériser les mécanismes d’interaction entre la bactérie lactique

Lactococcus lactis et la levure Saccharomyces cerevisiae dans des écosystèmes modèles. Le comportement macro-cinétique de L. lactis, analysé en co-culture avec la levure et en culture pure, semble indépendant de la présence de la levure. Par contre, la levure utilise ses propres produits de fermentation (éthanol, acétate), ainsi que le lactate produit par L. lactis, pour prolonger sa croissance en aérobiose. Une méthode pour réduire les hybridations croisées sur les puces à ADN de L. lactis lors de l’analyse transcriptomique des co-cultures a été développée. Ainsi, pour la première fois, le transcriptome de L. lactis a été analysé avec des puces à ADN dans une culture mixte. La comparaison directe des cultures pure et mixte en phase exponentielle de croissance met en évidence de nombreux gènes du métabolisme des pyrimidines sous-exprimés en co-culture. Ce phénomène, confirmé par RT-qPCR, semble lié à la présence d’éthanol produit par la levure. Selon une autre stratégie, l’analyse cinétique comparative des données de transcriptome a été soumise à différents traitements statistiques pour déterminer la robustesse des données. Malgré des différences entre listes de gènes sélectionnés, le profil d’expression global est similaire en cultures pure et mixte, caractéristique de l’adaptation à la carence en glucose. Même si certains gènes de régulateurs semblent différemment exprimés en cultures pure et mixte, L. lactis semble finalement peu affecté par la présence de la levure. Mots Clés : Lactococcus lactis, Saccharomyces cerevisiae, culture mixte, interaction inter-espèce, transcriptome

Ce travail n’aurait pas pu être réalisé sans le soutien de nombreuses personnes que je tiens à remercier ici. Je remercie Nic Lindley, directeur du Laboratoire d’Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, pour m’avoir permis de réaliser mes travaux de thèse dans son laboratoire et pour avoir accepté de présider le jury. J’adresse également mes remerciements à Véronique Monnet et Pascal Bonnarme pour avoir accepté de juger mes travaux ainsi qu’à Pierre Renault et Rémi Perrin pour leur participation au jury de thèse. Je remercie très très très chaleureusement Pascal Loubière pour m’avoir accueilli dans l’équipe du Génie du Métabolisme des Procaryotes, pour ses encouragements, pour ses précieux conseils, pour la confiance et la liberté qu’il m’a accordées, et pour son sourire permanent. Un grand merci aussi à Muriel Cocaign-Bousquet pour son humanité, pour sa rigueur scientifique, et pour nos réunions interminables autour des données transcriptomiques. Je tiens aussi à remercier les autres membres et ex-membres de l’équipe lactique pour leur aide, pour leur bonne humeur, et pour tous les bons moments passés ensemble. Je remercie Myriam, Clémentine, Sophie, Valérie, Julien, Sébastien, Chonticha, Panada, Pantip, Emma, Sandy, et Mathieu. Merci aussi à toute l’équipe de la plateforme Biopuces, tout spécialement à Lidwine et Serguei sans lesquels une grande partie de mes travaux n’auraient pas été possibles. La recherche n’étant pas efficace sans caféine, je remercie toutes celles et ceux avec qui j’ai partagé un café à la cafet’ (Dieu sait qu’ils sont nombreux !). Merci pour vos encouragements, pour nos débats à propos de tout et n’importe quoi et pour nos fous-rires. Merci donc à Claudia, Roberto, Céline, Suzana, Julien, Jan, Sandra, Romain, Hélène(s), Delphine, Céline, Caroline, Nathalie(s), Khalid, Emilie, Fabien, Clément, Mathieu(s), Olivier, Marie, Florence(s)…et à tous les autres. Enfin, merci à Nathalie, Gabriël et Jules, pour m’avoir permis d’aller jusqu’au bout, pour leurs yeux bleus, pour le bonheur d’être en famille.

SSoommmmaaiirr ee

Sommaire

Introduction .......................................................................... 1

Chapitre I : Introduction bibliographique ......... ................. 3 I. La complexité du monde vivant ........................................................................................... 3

II. Les interactions cellulaires : « le choc des cultures » ....................................................... 3

II.1 Interactions trophiques, interactions nutritio nnelles, ou « cross-feeding » ............. 5

II.1.1 Définition .................................................................................................................. 5

II.1.2 Interactions trophiques dans le tractus digestif ......................................................... 5

II.1.3 Interactions trophiques dans l’environnement .......................................................... 6

II.1.4 Intérêt technologique des cultures mixtes ................................................................ 7

II.2 Quorum Sensing .......................................................................................................... 11

II.2.1 Bactéries gram négatives ........................................................................................ 12

II.2.2 Bactéries gram positives ......................................................................................... 13

II.2.3 Le Quorum Sensing universel aux bactéries .......................................................... 14

II.2.4 Les levures .............................................................................................................. 14

II.2.5 Le Quorum Sensing entre procaryotes et eucaryotes ............................................. 15

II.3 Les molécules anti-microbiennes ............................................................................... 15

II.4 La cacophonie microbienne ........................................................................................ 16

II.5 Quelques mots sur les biofilms ................................................................................... 17

III. Lactococcus lactis et les bactéries lactiques ................................................................... 17

III.1 Phylogénie ................................................................................................................... 17

III.1.1 Lactococcus lactis subsp. lactis IL1403 ................................................................ 18

III.1.2 Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis LD61 ................................. 18

III.2 Catabolisme des sucres .............................................................................................. 19

III.2.1 Transport des sucres .............................................................................................. 20

III.2.2 La glycolyse .......................................................................................................... 22

III.2.3 Destin du pyruvate ................................................................................................ 22

III.2.4 Métabolisme aérobie ............................................................................................. 25

III.3 Le métabolisme des purines, pyrimidines, nucléotides, et nucléosides chez

Lactococcus lactis. ............................................................................................................... 28

Sommaire

III.3.1 Organisation des gènes du métabolisme des purines et des pyrimidines .............. 28

III.3.2 La biosynthèse de novo ......................................................................................... 30

III.3.3 Les systèmes de transport ...................................................................................... 33

III.3.4 Les voies de sauvetage et d’interconversion ......................................................... 34

III.4 Systèmes de régulation chez Lactococcus lactis ...................................................... 36

III.4.1 Régulation biochimique ........................................................................................ 36

III.4.2 Régulation génétique ............................................................................................. 40

IV. Les levures ........................................................................................................................ 53

IV.1 Saccharomyces cerevisiae ........................................................................................... 53

IV.2 Le métabolisme central de Saccharomyces cerevisiae ............................................. 55

IV.2.1 La glycolyse .......................................................................................................... 56

IV.2.2 La fermentation alcoolique ................................................................................... 56

IV.2.3 Le métabolisme oxydatif ....................................................................................... 57

V. Les habitats communs à Lactococcus lactis et Saccharomyces cerevisiae ................... 59

VI. Les puces à ADN .............................................................................................................. 60

VI.1 Puces à ADN et populations hétérogènes ................................................................. 61

VI.1.1 Puces dédiées à la détection d’espèces ................................................................. 62

VI.1.2 Puces dédiées à l’analyse transcriptomique .......................................................... 62

VI.2 Recouvrement des données d’analyses transcriptomiques .................................... 67

Chapitre II : Matériel et méthodes .................................... 71 I. Microorganismes et conditions de culture ........................................................................ 71

I.1 Espèces et souches ......................................................................................................... 71

I.2 Milieux de culture ......................................................................................................... 71

I.3 Conservation des souches ............................................................................................. 73

I.4 Précultures ..................................................................................................................... 73

I.5 Cultures discontinues en bioréacteur.......................................................................... 74

II. Techniques analytiques ..................................................................................................... 75

II.1 Mesure de la concentration en biomasse ................................................................... 75

II.1.1 Turbidimétrie .......................................................................................................... 75

II.1.2 Gravimétrie ............................................................................................................. 75

II.1.3 Comptage des colonies sur boites de pétri .............................................................. 75

II.1.4 Relation DO/masse sèche/UFC .............................................................................. 76

Sommaire

II.2 Dosage des métabolites extracellulaires .................................................................... 76

II.2.1 Dosage des substrats et produits de fermentation ................................................... 76

II.2.2 Dosage des nucléobases .......................................................................................... 77

III. Préparation des acides nucléiques et utilisation des puces à ADN .............................. 77

III.1 Extraction de l’ARN total ......................................................................................... 77

III.1.1 Préparation des ADNc ........................................................................................... 78

III.1.2 Extraction des ADN génomiques .......................................................................... 79

III.1.3 Hybridation et détection sur les puces à ADN ...................................................... 79

III.1.4 Traitement des données de puces à ADN .............................................................. 81

Chapitre III : Analyse transcriptomique de Lactococcus

lactis en coculture avec Saccharomyces cerevisiae. ........... 87

Chapitre IV : Influence du traitement statistique sur le

résultat de l’analyse transcriptomique ............................ 102 I. Introduction ....................................................................................................................... 102

I.1 Nouvelle souche ........................................................................................................... 102

I.2 Nouvelles conditions de culture ................................................................................. 102

I.3 Nouvelle façon de comparer les transcriptomes ...................................................... 103

I.4 Analyse quantitative des divergences de résultats en fonction du traitement

statistique .......................................................................................................................... 104

II. Résultats ........................................................................................................................... 105

II.1 Comparaison inter-normalisation ........................................................................... 105

II.1.1 Les trois types de normalisation sont-ils adaptés ? ............................................... 105

II.1.2 Recouvrement des données entre les normalisations en fonction de la stringence du

test de Student ................................................................................................................ 108

II.1.3 Recouvrement des données en fonction du seuil de coupure du ratio d’expression

........................................................................................................................................ 111

II.2 Comparaison inter-culture. ...................................................................................... 113

III. Discussion ....................................................................................................................... 118

III.1 Contexte .................................................................................................................... 118

Sommaire

III.2 Comparaison des trois méthodes de normalisation .............................................. 118

III.3 Comparaison inter-culture ..................................................................................... 119

III.4 Le choix de la normalisation ................................................................................... 120

III.5 L’interprétation biologique .................................................................................... 121

Chapitre V : Comparaison dynamique du profil

transcriptomique de Lactococcus lactis en culture pure et

en culture mixte avec Saccharomyces cerevisiae. ............ 101

Conclusion et perspectives ............................................... 156 I. Bilan ................................................................................................................................... 156

I.1 L’ajout d’ADN génomique pour réduire les cross-hybridations ........................... 157

I.2 Stratégie d’analyse ...................................................................................................... 158

I.3 L’interaction cellulaire ............................................................................................... 159

I.3.1 Interaction entre IL1403 et CEN.PK113-7D ......................................................... 159

I.3.2 Interaction entre LD61 et CEN.PK113-7D ............................................................ 160

II. Perspectives ...................................................................................................................... 162

II.1 Analyse transcriptomique dans des écosystèmes de plus en plus complexes ....... 162

II.2 Les autres méthodes globales ................................................................................... 164

II.2.1 Analyse Protéomique ............................................................................................ 164

II.2.2 Résonance Magnétique Nucléaire ........................................................................ 165

III. Pour conclure… ............................................................................................................. 166

Références bibliographiques ............................................ 167

II nnttrr oodduucctt iioonn

Introduction

1

Depuis des millénaires, les aliments fermentés font partie du menu des hommes, qui

apprécient leurs propriétés gustatives et sanitaires et leur longue durée de conservation. C’est

vraisemblablement les aliments fermentés liquides qui sont apparus en premier dans le

croissant fertile au Néolithique (environ 10 000 ans avant J.C.). La sédentarisation,

l’agriculture, l’élevage, et la poterie ont permis le développement du vin, de la bière et des

laitages. Vers 4800 avant J.C. les sumériens utilisaient les levures pour élaborer l’ancêtre de

la bière et le pain, c’est aussi l’apparition des premières faisselles. Vers 3000 avant J.C. les

égyptiens plantaient des vignes pour le vin funéraire et à la même époque les babyloniens

fabriquaient du vin de palme. On trouve des preuves écrites de la consommation de pain au

levain et de bière dans le plus ancien texte de loi connu, rédigé à Babylone sous le règne

d’Hammourabi en 2100 avant J.C. Les premiers véritables fromages et beurres sont apparus

vers 1400 avant J.C. en Inde et en Mésopotamie. Peu à peu de nombreux types de

fermentation ont vu le jour, ainsi le chou fermenté vers 300 avant J.C. en Chine, le fromage à

pâte pressée vers 100 avant J.C, la charcuterie dans l’antiquité, l’hydromel chez les celtes, le

kéfir et le saké en Asie, les yaourts etc. Malgré la maîtrise toujours plus grande des techniques

de fermentation, ce phénomène resta longtemps entouré d’un grand mystère. Seuls les Dieux

étaient capables de tels prodiges : Osiris en Egypte, Noé en Arménie, Dionysos en Grèce, et

Bacchus à Rome. Il faudra attendre longtemps avant de commencer à comprendre le rôle des

microorganismes dans tout cela.

De nos jours, malgré le développement toujours plus rapide de la Science, les

industriels continuent d’utiliser des méthodes ancestrales telles que le criblage de souches et

le test gustatif pour pérenniser, améliorer ou élaborer de nouveaux produits fermentés.

Pourquoi ? Parce qu’il reste tant à découvrir sur les espèces étudiées au cas par cas, et surtout

sur le fonctionnement des écosystèmes complexes que constituent les matrices alimentaires.

Les outils dont nous disposons ne sont pas encore assez performants pour bien décrire le

comportement des espèces dans une population hétérogène et nous devons nous employer à

sans cesse les améliorer. Lorsque nous serons à même de caractériser complètement les

microorganismes ainsi que les interactions et communications qui se mettent en place dans le

procédé de fermentation, alors nous pourrons établir des modèles qui changeront radicalement

les méthodes de création de nouveaux produits avec plus de rationalité et d’efficacité. Il en est

de même dans la lutte éternelle de la médecine contre les pathogènes en constante évolution.

La découverte de nouvelles molécules thérapeutiques pourra-t-elle un jour se faire grâce à la

Introduction

2

logique et non plus l’empirisme des techniques actuelles ? Finalement l’objectif ultime est

d’aboutir à une meilleure compréhension du fonctionnement d’une partie non négligeable de

notre environnement, afin de mieux le contrôler et de le préserver.

Malgré l’évidente hétérogénéité du monde microbien il subsiste toujours un décalage

entre les recherches effectuées en laboratoire et ce qu’il se passe dans l’industrie ou

l’environnement. Les microorganismes de laboratoire sont des modèles, souvent évolués, qui

parfois ont perdu une grande part des fonctionnalités essentielles à leur survie dans la nature

car devenues superflues dans nos tubes à essais. Ils ne sont souvent pas représentatifs de la

globalité du monde vivant microscopique. De plus les microbes vivent généralement en

communautés, c'est-à-dire qu’ils partagent les ressources d’un habitat commun, ce qui

implique nécessairement des mécanismes d’interaction, voire de communication.

Paradoxalement, la plupart de l’information concernant les mécanismes d’interaction a été

obtenue grâce à l’isolement puis la mise en culture pure de microorganismes. A l’heure

actuelle réaliser des cultures mixtes afin d’étudier ces phénomènes dans des conditions plus

proches des biotopes rencontrés en dehors des laboratoires reste un défi. Par ailleurs la

technologie actuelle permet d’accéder au fonctionnement de tout un pan de la mécanistique

cellulaire à la fois. Par exemple les puces à ADN permettent de réaliser l’analyse

transcriptomique complète d’un organisme, c'est-à-dire de mesurer simultanément

l’expression de tous les gènes d’un organisme. Cette approche pourrait permettre de

compléter les connaissances sur les mécanismes d’interaction déjà décrits, voire d’en

découvrir de nouveaux. Mais l’utilisation des puces à ADN avec des populations hétérogènes

reste encore problématique à cause d’obstacles techniques plus ou moins prévisibles. Nous

nous proposons de trouver des solutions techniques et finalement de réaliser une étude des

interactions microbiennes entre une bactérie lactique et une levure dans un écosystème

modèle. Cette thèse doit être considérée comme une première étape dans un domaine ou peu

de choses ont été explorées.

CChhaappii tt rr ee II :: II nnttrr oodduucctt iioonn bbiibbll iiooggrr aapphhiiqquuee

I. Etude bibliographique

3

II .. LL aa ccoommpplleexxii ttéé dduu mmoonnddee vviivvaanntt

La diversité des microorganismes de notre planète est considérable. Les plantes et les

animaux dominent notre perception visuelle de la nature, mais les microorganismes

constituent une biomasse considérable et jouent un rôle dans la pérennité de la biosphère

terrestre (Woese et al., 1990). De nos jours on dénombre 55 grands groupes de bactéries et 13

d’archéobactéries, et c’est peu comparé à ce qui reste vraisemblablement à explorer. Par

exemple, les écosystèmes terrestres sont dotés d’une très grande variété d’espèces (Gans et

al., 2005) et peuvent contenir jusqu’à 20 divisions bactériennes (Dunbar et al., 2002). Une

surprenante diversité microbiologique a aussi été décrite dans les écosystèmes aquatiques tant

chez les procaryotes que chez les eucaryotes (Beja et al., 2002; Moon-van der Staay et al.,

2001; Sogin et al., 2006). Dans le tractus digestif d’un être humain adulte, 8 grands groupes

de bactéries ont été identifiés. Une étonnante variété de souches et d’espèces y a été

rencontrée avec plus de 7000 phylums ou espèces différentes (Backhed et al., 2005).

Dans les procédés technologiques ainsi que dans les conditions naturelles, les

phénomènes observés sont souvent la conséquence de l’activité de communautés

microbiennes complexes. Dans la plupart des processus impliquant des microorganismes,

comme par exemple l’élaboration de produits laitiers ou d’alcools fermentés, dans la

composition de levains, dans les cycles écologiques, le traitement des eaux usées, il existe des

formes de communications cellulaires intra-espèces et inter-espèces plus ou moins directes

(Guerrero and Berlanga, 2006).

II II .. LL eess iinntteerr aacctt iioonnss cceell lluullaaiirr eess :: «« llee cchhoocc ddeess ccuull ttuurr eess »»

Depuis Pasteur, la microbiologie s’est focalisée sur l’étude de cultures pures, souvent

hors du contexte sauvage, ne tenant pas ou très peu compte de l’influence de l’environnement

naturel et des nombreux systèmes d’interaction et de communication entre espèces. Ces

approches ont été déterminantes pour jeter les bases de la microbiologie et définir l’archétype

de la cellule vivante. Elles restent d’actualité pour préciser toujours davantage les mécanismes


4

qui régissent la vie des microorganismes mais certains phénomènes nous échappent encore du

fait de la complexité des écosystèmes sauvages − naturels ou industriels. La cellule est définie

comme la plus petite entité vivante sur notre planète. Les fonctions individuelles de la cellule

assurent sa survie et la transmission de son matériel génétique. Ces fonctions cellulaires

individuelles doivent être mises en parallèle avec un niveau d’organisation plus important : la

population. Une cellule seule est en effet plus fragile face à la brutalité de l’environnement

que si elle fait partie d’un groupe. La coordination du comportement de toutes les cellules

d’une même espèce peut lui donner l’avantage en cas de concurrence avec d’autres espèces.

L’activité d’une cellule prise individuellement a des effets limités sur une petite échelle,

localement autour de la cellule. Mais l’addition de tous ces effets a pour résultat des

modifications majeures sur une échelle beaucoup plus importante, au niveau de

l’environnement global et peut avoir une forte influence sur l’activité des autres

microoganismes (Rainey and Rainey, 2003).

La caractérisation de l’évolution de l’activité et des fonctions des microorganismes

dans leur environnement naturel, c'est-à-dire en interaction avec d’autres espèces, sera

certainement une clef pour comprendre le fonctionnement des écosystèmes dans leur

globalité. La théorie écologique définit le réseau d’interactions en classifiant les phénomènes

d’interaction (Boddy and Wimpenny, 1992) : (i) neutralisme - le microorganisme est

indifférent aux modifications environnementales résultant de l’activité d’autres microbes,

c’est un cas rare. (ii) commensalisme – l’interaction bénéficie à un seul partenaire et n’a pas

d’effet néfaste sur le second. (iii) mutualisme ou synergisme - l’effet est positif, les deux

espèces bénéficient réciproquement de l’interaction. (iv) antagonisme - l’effet est négatif,

l’interaction est caractérisée par un stress du microorganisme qui doit s’adapter pour contrer

l’activité d’une autre espèce. S’il n’en est pas capable il ne survie pas. (v) parasitisme ou

prédation – une espèce en manipule une seconde pour son propre bénéfice ou la détruit pour

s’en nourrir. (vi) compétition – il s’agit des interactions inhérentes à la conquête de niches

écologique. Il peut s’agir de plusieurs espèces consommant le même substrat (carbone,

oxygène…), ou de la distribution spatiale dans un écosystème (biofilm par exemple). Ces

interactions peuvent être liées à des facteurs physicochimiques (interactions trophiques), ou à

de véritables systèmes de communication intercellulaires (quorum sensing).


5

II.1 Interactions trophiques, interactions nutritionnelles, ou « cross-feeding »

II.1.1 Définition

L’environnement est en constante évolution du fait de la consommation des ressources

et de la formation de produits métaboliques par les populations microbiennes. Par exemple, la

limitation en source de carbone affecte la synthèse de biomasse et le déficit en substrat

énergétique force la population à s’adapter en changeant de métabolisme. Le résultat final est

souvent une modification de composition de la population. L’action simultanée de toutes les

cellules d’une même espèce peut modifier l’environnement physicochimique et perturber le

développement des autres espèces − nous parlerons ici d’interactions trophiques. Des études

empiriques et théoriques suggèrent que la structure et la force des liens trophiques ont une

grande influence sur les caractéristiques des écosystèmes comme la diversité des espèces, ou

la stabilité et la dynamique des populations (Yoshida et al., 2007).

II.1.2 Interactions trophiques dans le tractus digestif

Il a été montré des phénomènes d’interactions trophiques dans les écosystèmes du

tractus digestif des animaux et des êtres humains dans lequel le produit d’une espèce est

utilisé, ou bien génère des conditions favorables pour la croissance d’une autre espèce. Le

résultat est souvent une modification du métabolisme énergétique du partenaire (Wolin et al.

1997). Ces phénomènes de mutualisme ou de commensalisme sont souvent axés autour du

transfert d’hydrogène, de l’utilisation de produits de fermentations comme le lactate, le

succinate, les acides gras, ou encore de résidus de polymère complexes partiellement

dégradés. Des bactéries comme Roseburia et Faecalibacterium prausnitzii ont besoin

d’acétate pour leur croissance optimale et nombre d’entre elles sont productrices d’hydrogène

(Barcenilla et al., 2000; Duncan et al., 2004). En co-culture avec des microorganismes

acétogènes, l’hydrogène est consommé pour synthétiser de l’acétate, qui est utilisé à son tour

par les producteurs de butyrate (Chassard and Bernalier-Donadille, 2006). Toujours dans le

tractus digestif, les bifidobactéries sont de grandes productrices de lactate qui peut être utilisé

par d’autres espèces ou au contraire être inhibiteur de croissance. Des co-cultures de

Bifidobacterium adolescentis capables de dégrader l’amidon avec une souche de Eubacterium

hallii incapable de dégrader l’amidon mais consommatrice de lactate produisent du butyrate

par un phénomène de cross-feeding (Belenguer et al., 2006). D’autres groupes de bactéries du


6

colon utilisent la voie de l’acrylate pour convertir le lactate en propionate comme

Megasphaera elsdenii. Des études de traceurs isotopiques stables indiquent que la conversion

de lactate en butyrate et propionate peut avoir lieu dans l’écosystème microbien du tractus

digestif (Bourriaud et al., 2005; Morrison et al., 2006). Pour plus de détails voir la revue de

Flint et al. (Flint et al., 2007). Les bifidobactéries permettent de lutter contre la colonisation

des muqueuses intestinales par des bactéries pathogènes en partie grâce à des produits de

fermentation tels que le lactate ou l’acétate et de l’acidification qui en découle mais aussi de

substances anti-microbiennes (Gibson and Wang, 1994).

A ce jour, seuls deux articles très récents (2008) mentionnent l’utilisation d’une

technique d’analyse post-génomique pour étudier L. lactis au sein d’un véritable écosystème.

Les deux articles concernent l’analyse protéomique de L. lactis dans le tractus digestif de

souris. L’expression des protéines du métabolisme mixte s’est révélée être plus importante in

vivo (dans l’intestin de souris) que lors de cultures in vitro, reflétant vraisemblablement une

adaptation du métabolisme au milieu intestinal (Roy et al., 2008b). La même équipe à

comparé l’effet de l’alimentation de la souris, plus précisément l’ingestion de lactose, sur le

protéome de L. lactis. Une réorientation du métabolisme vers les voies d’utilisation du lactose

a été observée chez L. lactis dans le tractus digestif de souris nourries avec du lactose. Des

expériences de compétition entre plusieurs souches de bactéries lactiques dans le tractus

digestif de la souris ont par ailleurs montré que cette faculté d’adaptation métabolique

conférait un avantage écologique aux souches capables d’utiliser le lactose. Cette étude a

permis d’explorer à la fois les interactions bactérie/hôte et les interactions bactéries/bactéries

(Roy et al., 2008a).

II.1.3 Interactions trophiques dans l’environnement

Les interactions trophiques concernent aussi les bactéries de l’environnement. Des

études utilisant des techniques moléculaires montrent une association syntrophique d’une

archéobactérie et d’une bactérie sulfato-réductrice pour l’utilisation de méthane (Valentine,

2002). Une autre étude montre des liens trophiques entre deux bactéries thermophiles :

Thermicanus aegyptius produit du formate et du lactate et Moorella thermoacetica le

consomme en produisant de l’acétate. Cette découverte était fortuite car il s’agissait

initialement d’étudier des cultures pures qui se sont finalement avérées être des co-cultures

(Gossner et al., 1999). De la même façon fut découverte une association commensale entre


7

une bactérie aérotolérante (Clostridium intestinale) et une bactérie acétogène (Sporomusa

rhizae) provenant de la rhizosphère de joncs (Juncus roemerianus). L’H2 produit par

Clostridium permet l’utilisation de sucres avec production d’acétate par Sporomusa. De plus,

Clostridium détoxifie le milieu en transformant l’O2, conférant ainsi une protection à

Sporomusa, sensible à l’O2 (Gossner et al., 2006). Des associations symbiotiques ont aussi

lieu entre des bactéries fermentaires qui génèrent de l’H2 et des bactéries méthanogènes qui le

consomment. Pour supporter les observations faites sur le terrain, des co-cultures de

laboratoire montrent qu’associer des bactéries fermentaires et méthanogènes conduit à un taux

de croissance et un rendement en biomasse supérieurs à ceux obtenus en cultures pures

(Bonch-Osmolovskaya et al., 1991 ; Muralidharan et al., 1997). La bactérie hyper-

thermophile Thermotoga maritima croît en fermentant divers carbohydrates et en produisant

de l’H2. Cet hydrogène est inhibiteur pour sa croissance. En co-culture avec une souche

méthanogène hydrogénotrophe comme Methanococcus jannaschii, cet effet inhibiteur est levé

et la densité cellulaire est accrue (Johnson et al., 2006 ; Muralidharan et al., 1997).

II.1.4 Intérêt technologique des cultures mixtes

Dans les procédés industriels

De nombreux procédés technologiques mettent à profit les caractéristiques des cultures

mixtes. Les avantages qu’elles procurent, comparées aux traditionnelles cultures pures sont

les suivants : pas de nécessité de stérilisation, une grande adaptabilité due à la diversité

microbienne, et la capacité d’utiliser plusieurs substrats (pour revue voir (Kleerebezem and

van Loosdrecht, 2007). Ces procédés peuvent être utilisés pour dégrader les effluents de

l’industrie pétrochimique ou des papeteries (Alatriste-Mondragon et al., 2006; Kleerebezem

et al., 2003 ; Kortekaas et al., 1998 ; Seghezzo et al., 2006; van Lier et al., 2001). La

production par fermentation de biocarburants comme le biohydrogène, le méthane ou le

bioéthanol reçoit une attention particulière de nos jours, et peut être effectuée grâce à des

cultures mixtes (Akkerman et al., 2002 ; Barbosa et al., 2001; Li et al., 2007 ; Liu et al.,

2006 ; Zoetemeyer et al., 1982a; Zoetemeyer et al., 1982b ; Gomez et al., 2006). Une autre

application des cultures mixtes est la production de polyhydroxyalkanoates servant à la

fabrication de matières plastiques biodégradables (Reis et al., 2003). Des cultures mixtes,

comportant trois partenaires, deux bactéries lactiques et une levure, ont été employées pour

améliorer la production d’acide lactique (Plessas et al., 2008). Pisman et Somova ont étudié


8

des levures ayant des stratégies métaboliques différentes (Pisman and Somova, 2003) et ont

montré que Candida utilis émettait des métabolites favorisant la croissance de Candida

guilliermondii, et vice versa. La co-culture de ces deux espèces s’est avérée plus efficace dans

l’utilisation des ressources du milieu que les cultures pures et a abouti à une production de

biomasse plus de trois fois supérieure.

Le ratio de concentration entre les différentes espèces est variable d’un procédé

technologique à l’autre, et au sein un même procédé au cours du temps, notament à cause des

phénomènes de contamination. Par exemple, Passoth et al. (2007) ont révélé une

concentration éntonemment élevée en bactéries lactiques contaminantes dans un procédé de

production d’éthanol par des levures. Près de 70% de la biomasse été constituée de batéries

lactiques dans certains lot alors qu’elle était inférieure à 10% dans un d’autre lot. D’après

cette étude l’espèce productrice originale (S. cerevisae) avait été suplantée par une autre

espèce de levure (Dekkera bruxellensis), et un groupe de bactéries lactiques (Lactobacillus

vini) alors que l’équipe en charge de la production n’avait décelé aucune modification de

productivité et de rendement en éthanol. Finalement l’association entre D. bruxellensis et L.

vini, s’est avéré efficace pour produire de l’éthanol, à tel point que le groupe industriel a

décidé de ne pas tenter de rétablir la population de S. cerevisiae (Passoth et al., 2007).

Dans la fabrication des aliments fermentés

Les aliments fermentés comme le vin et les produits laitiers sont le fruit de l’activité

conjointe de plusieurs espèces de bactéries et de levures. De nombreux cas d’interactions

positives ont été recensés.

Les bactéries lactiques produisent des acides en consommant les carbohydrates et la

croissance de certains microorganismes est rapidement inhibée par cette acidification. La

présence d’espèces désacidifiantes permet souvent de prolonger l’activité de ces bactéries. Par

exemple, dans la fermentation du raisin, Pseudomonas putida en monoculture croît puis est

rapidement inhibé par l’acidification générée par la fermentation des carbohydrates. Des

cocultures avec Saccharomyces cerevisiae ont été conduites dans dus jus de raisin ainsi que

dans un milieu de laboratoire. La levure fait chuter la forte concentration en carbohydrates et

réduit l’acidification du milieu de culture par la bactérie. Cette dernière peut alors survivre

plus longtemps (Romano and Kolter, 2005). Durant la fabrication de fromages, pendant les

premiers jours d’affinage, les levures colonisent la surface du fromage et utilisent le lactate,


9

conduisant à la désacidifiaction et permettant le développement de bactéries sensibles à

l’acidité (Corsetti et al., 2001). Il est connu que l’acidification de la matrice fromagère par les

bactéries lactiques rend les précurseurs, comme H2S, difficilement disponible pour les

réactions de synthèse des composés soufrés volatiles. Les propriétés désacidifiantes des

levures, consommatrices de lactate entre autre, pourraient faciliter la disponibilité du H2S

pour les espèces productrices de composés soufrés volatiles. Par ailleurs la production

simultanée de méthanethiol par les levures et les bactéries lactiques pourrait accroître la

production de polysulfides (Landaud et al., 2008; Lopez Del Castillo-Lozano et al., 2007).

Dans un écosystème fromager modèle comportant Yarrowia lipolytica, Cholet et coll. (2007)

ont constaté une remontée du pH qui ne semblait pas être liée à la consommation de lactate

(Cholet et al., 2007). Les analyses d’expression génétique par puce à ADN n’ont pas révélé

l’expression des gènes d’utilisation du lactate, par contre les gènes codant pour des

aminotranférases semblaient fortement exprimés. Il a donc été proposé que la remontée du pH

de matrice fromagère puisse être liée à la libération d’ammoniac lors du catabolisme de la L-

méthionine par Y. lipolytica (Cholet et al., 2007).

Les interactions sont aussi parfois liées à des échanges de facteurs de croissances.

Dans le kéfir, aliment fermenté d’Asie, le développement de Lactobacillus kefiranofaciens

ainsi que la production de grains de kéfir sont stimulés par la présence de Saccharomyces

cerevisiae (Cheirsilp et al., 2003a; Cheirsilp et al., 2003b). Durant la vinification une grande

quantité de biomasse de levure produite meurt par autolyse, relâchant des acides aminés et des

vitamines qui peuvent stimuler la croissance d’autres espèces (Fleet, 2003). Les champignons

présents sur les raisins peuvent participer à la production de conditions favorables au

développement de bactéries acétogènes. Ces bactéries produisent alors un niveau élevé

d’acétate qui retarde la croissance des levures lors de la vinification (Drysdale et al., 1989 ;

Ludovico et al., 2001). Il a été montré que la fabrication du yaourt dépend d’interactions

positives, aussi appelées proto-coopérations, entre Streptococcus thermophilus et

Lactobacillus bulgaricus (Sodini et al., 2000). La proto-coopération se traduit par

l’augmentation de la vitesse d’acidification (O'Leary V and Woychik, 1976), de la

concentration finale en biomasse (Rajagopal et al., 1990), de la production de composés

aromatiques (El-abassy et al., 1993) ou de la synthèse de polysaccharides extracellulaires

(Bouzar et al., 1997) qui conditionnent les propriétés gustatives et la texture du yaourt. Ces

interactions proviennent généralement de l’échange de facteurs de croissance entre les deux


10

espèces (Sodini et al., 2000). D’une part la production de formiate et de CO2 par S.

thermophilus stimule la croissance de L. bulgaricus ((Driessen et al., 1982) sité dans (Sodini

et al., 2000)). La forte activité protéolytique de L. bulgaricus libère des acides aminés et des

peptides qui sont alors utilisés par S. thermophilus lors de la formation de yaourt (Courtin et

al., 2002 ; Courtin and Rul, 2004 ; Sodini et al., 2000 ; Rajagopal et al., 1990).

L’activité des bactéries lactiques et des levures est également responsable de la

production d’arômes et de pigments lors de la formation de fromage. Par exemple La

production des pigments de la croute du fromage est directement liée à la composition de la

flore micobienne de surface. Différentes associations de levures et de bactéries ont ainsi

conduit la des couleurs différentes (Mounier et al., 2008). La libération d’acides aminés

consécutive à la dégradation de la caséine du lait par certaines bactéries lactiques permet la

synthèse de composés aromatiques par d’autres espèces (Helinck et al., 2004; Smit et al.,

2005). Il a été montré que la formation de certains arômes dans les fromages est favorisée

lorsqu’il y a coopération entre espèces de bactéries lactiques (Ayad et al., 2001; Kieronczyk

et al., 2003). Par exemple, la dégradation de cystéine et de méthionine par les

microorganismes conduit à la synthèse de méthanetiol et H2S, précurseurs des composés

soufrés volatiles, responsable du goût du fromage, mais également d’autres aliments

fermentés comme la bière et le vin (Landaud et al., 2008). Enfin, lors de la vinification

certaines espèces de levures peuvent hydrolyser les protéines et la pectine du jus de raisin

pour produire le substrat carboné nécessaire à la croissance d’autres espèces (Charoenchai et

al., 1997).

Parfois les interactions sont négatives, et on observe des phénomènes d’inhibition.

Lors de la fermentation du jus de raisin en vin les produits de fermentation des levures tels

que l’éthanol et les acides gras à courte chaîne ont un effet inhibiteur des sur certains

microorganismes (Bauer et al., 2000 ; Bisson et al., 1999) et la production de dioxyde de

carbone et l’élimination de l’oxygène limite la croissance des espèces aérobies (Charoenchai

et al., 1997). Certaines bactéries et levures sont utilisées pour empécher le développement de

bactéries pathogenes comme Listeria. L’inhibition de Listeria est parfois liée à la production

d’une molécule antimicrobienne (Eppert et al., 1997), et parfois résulte des modifications

environnementales générées par l’association de bactéries et levures (Maoz et al., 2003).

La frontière entre interaction microbienne et adaptation métabolique face à

l’environnement est floue et fait parfois l’objet de réflexions (Keller and Surette, 2006). Dans


11

notre approche nous considèrerons qu’il y a interaction dès lors que la modification de

l’environnement modifiant le comportement d’un microbe découle de l’activité d’un autre

microbe.

II.2 Quorum Sensing

Les interactions cellulaires peuvent aussi s’effectuer par le biais de mécanismes plus

spécifiques ou l’on peut parler de véritable communication. Les bactéries sont capables de

réagir en fonction de la taille et de la composition de la communauté à laquelle elles

appartiennent (Fuqua et al., 1996). Ce système de communication, appelé quorum sensing, est

basé sur la synthèse, l’émission et la réception par les cellules de facteurs moléculaires

diffusibles, les autoinducteurs. Ces petites molécules s’accumulent jusqu’à une concentration

seuil (quorum) qui une fois atteinte engendre une cascade de signalisation aboutissant à une

réponse adaptée et coordonnée de toutes les cellules d’une même espèce. La capacité de réagir

collectivement et simultanément peut conférer au groupe l’avantage face aux autres types

microbiens en présence, ou face à l’environnement (Bassler, 2002; Camara et al., 2002;

Fuqua and Greenberg, 2002; Waters and Bassler, 2005). Le quorum sensing peut engendrer

des réponses très diversifiées.

Le premier exemple de quorum sensing provient d’une bactérie bioluminescente

(Vibrio fisheri) vivant en symbiose avec certaines espèces de poissons d’eaux profondes ou de

calmar. La quantité de lumière émise par Vibrio fisheri n’est pas corrélée avec le nombre de

bactéries mais il existe un seuil de concentration cellulaire au delà duquel la lumière est

produite. Il a été montré que la production de lumière est activée par une molécule

autoinductrice (Miller and Bassler, 2001; Nealson et al., 1970). Chez de nombreuses autres

bactéries le quorum sensing contrôle la compétence et la sporulation (Perego and Hoch, 1996;

Rudner et al., 1991), ou encore la formation de biofilms (Zhu and Mekalanos, 2003). Le

quorum sensing est également le déclencheur de l’induction de facteurs de virulence chez

l’homme ou les plantes (Bassler, 2002; Dow et al., 2003; Qin et al., 2001) . Il est par exemple

à l’origine de la virulence de Erwinia carotovora, et du genre Pseudomonas (Dong et al.,

2000; Otto et al., 2001). Il a été montré qu’il existait des transferts de plasmides entre certains

Rhizobium et Agrobacterium. Les gènes transmis sont nécessaires à la formation de nodules et

à la symbiose avec la plante hôte. Le mécanisme du transfert est sous le contrôle du quorum

sensing. Le quorum sensing influence aussi de nombreux autres aspects de l’interaction entre


12

Rhizobium et les végétaux, comme par exemple la formation de nodules. De plus la plante

peut interférer avec ce quorum sensing et peut même répondre aux signaux moléculaires

produits par les bactéries (Sanchez-Contreras et al., 2007). D’autres études montrent que lors

de l’infection de plantes par Erwinia, le quorum sensing contrôle la production des enzymes

de dégradation de la paroi cellulaire ainsi que des facteurs de virulence (Barnard et al., 2007).

D’autres travaux ont porté sur le rôle du quorum sensing chez les pathogènes de l’Homme.

Les staphylocoques et entérocoques sont des pathogènes humains importants. Des études

montrent que le transfert de résistances aux antibiotiques est contrôlé par le quorum sensing

(Dunny, 2007). D’autres articles démontrent que le quorum sensing régule la synthèse de

molécules antimicrobiennes comme les antibiotiques (Derzelle et al., 2002; Takano et al.,

2001), ou les bactériocines (Brurberg et al., 1997; Eijsink et al., 1996; Hauge et al., 1998;

Huttunen et al., 1995 ; Quadri et al., 1997). Le quorum sensing contrôle la synthèse de ces

molécules au sein de l’espèce ou même parfois d’une espèce à l’autre. Par exemple

Lactococcus lactis peut induire la synthèse de plantaricine par Lactobacillus plantarum grâce

à un mécanisme d’autoinduction (quorum sensing) (Maldonado et al., 2004).

Le quorum sensing peut être le média d’une communication intra ou inter-espèce. Il

existe des mécanismes différents pour les bactéries gram-positives et gram-négatives, et

également des systèmes spécifiques aux levures et autres champignons. Toutefois il n’est pas

rare de trouver des passerelles entre le quorum sensing des bactéries gram positives et

négatives, entre bactéries et levures, ou encore parfois entre microorganismes et organismes

multicellulaires.

II.2.1 Bactéries gram négatives

Chez les bactéries gram négatives (comme Vibrio) un gène, généralement appelé luxI,

induit la synthèse d’une homosérine lactone (HSL) aussi appelée autoinducteur 1 (AI-1). Cet

AI-1 traverse la membrane plasmique et interagit avec le récepteur cytoplasmique LuxR

(figure1). Une cascade de signal se met alors en route dans la cellule pour engendrer la

réponse cellulaire (Fuqua and Greenberg, 2002; Keller and Surette, 2006; Miller and Bassler,

2001; Nealson et al., 1970). Ce mécanisme a été décrit chez de nombreuses espèces de

bactéries gram négatives, parmi lesquelles Vibrio (Nealson et al., 1970), Escherishia coli

(Winson et al., 1998), Pseudomonas (Dong et al., 2005), Sinorhizobium (Llamas et al., 2004),

ou encore Aeromonas (Swift et al., 1997).


13

Figure 1: Mécanisme du Quorum sensing chez les bactéries Gram negatives. L’autoinducteur-1 synthétisé par LuxI est diffusé librement à travers la membrane plasmique. AI-1 interagit avec le récepteur LuxR qui active ou inhibe la transcription de gènes cibles.

II.2.2 Bactéries gram positives

Chez les bactéries gram positives, les autoinducteurs sont des oligopeptides. Ces

molécules sont détectées par un système à deux composants plus ou moins spécifique (figure

2) et le signal est ensuite relayé à l’intérieur de la cellule jusqu’aux gènes cibles (Gray, 1997;

Keller and Surette, 2006). Ce phénomène a été trouvé chez de nombreuses espèces de

bactéries gram positives, parmi lesquelles S.aureus (de Vos et al., 1997; Kleerebezem et al.,

1997; Lyon et al., 2002), B. subtilis (de Vos et al., 1997; Kleerebezem et al., 1997;

Lombardia et al., 2006), S. pneumoniae (de Vos et al., 1997; Kleerebezem et al., 1997), ou

encore des bactéries couramment rencontrées dans l’industrie laitière du genre Clostridium,

Lactococcus, Lactobacillus (de Vos et al., 1997).

Ces oligopeptides sont très spécifiques et peuvent parfois permettre de distinguer le

signal entre deux souches d’une même espèce. Cette forte spécificité a été particulièrement

marquée chez S. aureus dont les souches sont classées en fonction de leur signal

oligopeptidique (Ji et al., 1997; Lyon et al., 2002).


14

Figure 2 : Mécanisme du Quorum sensing chez les bactéries Gram positives. Des oligonucléotides sont synthétisés et exportés par un transporteur ABC (ATP Binding Cassette). L’oligopeptide (autoinducteur) active un système à deux composantes qui régule les gènes cibles.

II.2.3 Le Quorum Sensing universel aux bactéries

On a longtemps considéré que le quorum sensing était spécifique à chaque espèce, mais

il s’est avéré que ce phénomène peut aussi être inter-espèce. Vibrio harveyi fut le premier

microorganisme pour lequel a été découverte une double signalisation intercellulaire capable

de franchir la barrière des espèces. V. harveyi produit une HSL (AI-1) comme les bactéries

Gram négatives mais aussi un deuxième autoinducteur, AI-2, qui semble être destiné à la

communication inter-espèce. AI-2 est une furanone dont la production dépend du gène luxS.

Ce gène est présent dans le génome de nombreuses espèces bactériennes Gram positives et

négatives. LuxS et AI-2 sont très probablement les vecteurs d’un langage microbien universel

(Schauder and Bassler, 2001; Sun et al., 2004; Surette et al., 1999; Vendeville et al., 2005;

Xavier and Bassler, 2003). Citons comme exemple la communication par des HSL entre deux

pathogènes, Pseudomonas aeruginosa et Burkholderia cepacia (Lewenza et al., 2002 ;

Riedel, 2001).

II.2.4 Les levures

Dans le cas des levures il existe des preuves que le bicarbonate (Ohkuni et al., 1998),

l’acétaldéhyde (Richard et al., 1996), et l’ammoniac (Palkova et al., 1997; Palkova and


15

Vachova, 2003) peuvent servir de signaux moléculaires intercellulaires. Un système de

communication apparenté au quorum sensing a été mis en évidence chez les champignons et

les levures. Chez Candida albicans, le farnésol est excrété continuellement pendant la

croissance en quantité proportionnelle à la densité cellulaire comme toute molécule de

quorum sensing. Il inhibe notamment la transition levure/hyphe de Candida Albicans et sa

capacité à former des biofilms (Hornby et al., 2001; Ramage et al., 2002). Une seconde

molécule de quorum sensing a été découverte. Cette molécule promeut la transition

levure/hyphe à partir d’un seuil de concentration ici encore proportionnel à la densité

cellulaire. Cette molécule a été purifiée et identifée, il s’agit du tyrosol (Chen et al., 2004).

Pour revue voir (Hogan, 2006; Nickerson et al., 2006; Sprague and Winans, 2006).

II.2.5 Le Quorum Sensing entre procaryotes et eucaryotes

Le quorum sensing peut aussi être le centre d’interactions entre eucaryotes et

procaryotes. Par exemple les molécules de quorum sensing produites par Pseudomonas

aeruginosa et Xanthomonas campestris répriment le développement des hyphes chez Candida

albicans (Hogan et al., 2004; Wang et al., 2004). Le chimiotactisme des diatomées vis à vis

des signaux HSL produit par les bactéries est un autre exemple (Joint et al., 2002). Le quorum

sensing est parfois détourné par une autre espèce à des fins de manipulation. Ainsi certaines

algues comme Delisea pulchra sont capables de synthétiser des molécules proches des HSL et

inhibent la formation de biofilms bactériens (Bauer and Robinson, 2002; Givskov et al., 1996;

Manefield et al., 1999).

II.3 Les molécules anti-microbiennes

D’autres molécules synthétisées par les microorganismes sont des facteurs

d’interaction cellulaire au sens où elles entravent la croissance de certaines espèces de

microorganismes. Elles existent sous diverses formes : bactériocines, antibiotiques, ou encore

pesticides.

Voici quelques exemples ; La paenimyxine, biopesticide synthétisé par Paenibacillus,

modifie la structure des communautés bactériennes du sol. Cet effet n’est que transitoire

puisqu’il n’a pu être observé de modifications significatives après 7, 14 et 28 jours en

comparaison avec le témoin sans traitement. Ceci illustre à la fois la temporalité des

interactions microbiennes et l’extraordinaire plasticité et adaptabilité des communautés


16

bactériennes du sol (Selim et al., 2007). Les bifidobactéries peuvent inhiber la croissance

d’autres espèces par la production de produits de fermentation (voir interactions trophiques

plus haut) mais aussi par la synthèse de molécules antimicrobiennes pouvant affecter un large

spectre de microorganismes comprenant les genres Salmonella, Listeria, Campylobacter,

Shigella et Vibrio (Gibson and Wang, 1994). Graham et Fleet (2003) ont pu démontrer que

lors de la vinification, certaines levures pouvaient synthétiser des enzymes de dégradation des

parois bactériennes (Fleet, 2003). Certaines levures parmi lesquelles Metschnikowia,

Candida, Pichia, Cryptococcus, Saccharomyces, et Zygosaccharomyces ont une forte activité

antifongique ou antibactérienne (Suzzi et al., 1995). Ces molécules sont des peptides, des

protéines ou des glycoprotéines comme les toxines « killer », et des enzymes qui détruisent la

paroi d’autres microorganismes (Fleet, 2003).

Le rôle des antibiotiques pour contrôler la population bactérienne en tuant les cellules

nous apparaît familier mais il semble que les antibiotiques puissent agir comme des molécules

signaux. D’après certaines études il semblerait que la majorité des composés organiques de

faible poids moléculaire secrétés par les microorganismes peuvent jouer un rôle dans la

communication intercellulaire. Ainsi de nombreux antibiotiques, même à faible concentration,

peuvent moduler l’expression de gènes. Certains auteurs postulent que leur activité première

est la signalisation intercellulaire plutôt que l’inhibition de croissance. Le but est de maintenir

la communauté microbienne dans l’environnement tout en conservant les interactions de ces

populations avec les microorganismes environnants (Joint et al., 2007 ; Yim et al., 2007).

II.4 La cacophonie microbienne

Les communautés microbiennes sont souvent complexes et la cellule perçoit des

signaux de diverses sources et de diverses natures simultanément. La réponse de la cellule est

le résultat de l’intégration de tous ces signaux. Il est parfois difficile de démêler

l’enchevêtrement de ces systèmes d’interaction et de communication. Par exemple, la cavité

buccale humaine est un écosystème dans lequel se côtoient de nombreuses espèces

microbiennes. L’étude des interactions entre deux espèces de cet écosystème a fait apparaître

un « réseau » relativement simple, mais laisse également entrevoir la multiplicité des

interactions (cross-feeding et quorum sensing) qui doivent avoir lieu avec des populations

comportant un nombre élevé d’espèces, baignant dans un environnement en constante

évolution. Ainsi la colonisation de la plaque dentaire par Veillonella atypica requiert la


17

présence de Streptococcus gordonii. En effet S. gordonii fermente les sucres et produit de

l’acide lactique, source de carbone privilégiée de V. atypica (interaction trophique). Il a été

montré que V. atypica produit une substance chimique soluble qui induit l’expression de

l’amylase chez S. gordonii (quorum sensing), accroissant indirectement la vitesse de

dégradation des sucres complexes en acide lactique (Egland et al., 2004). Il n’y a

apparemment aucun bénéfice pour S. gordonii, c’est un cas manifeste de manipulation

chimique.

II.5 Quelques mots sur les biofilms

Il n’aurait pas été concevable de terminer ce chapitre sur les interactions microbiennes

sans mentionner l’existence de biofilms, même s’ils sont un peu en dehors du cadre de cette

thèse. Les biofilms sont des communautés microbiennes fixées sur un support solide dont la

cohésion est assurée par une matrice de polymères produits par les microorganismes. De telles

structures comportent parfois plusieurs espèces et peuvent adopter des distributions spatiales

spécifiques pour former une sorte de pseudo tissu primitif, précurseurs des tissus des

eucaryotes multicellulaires. Les interactions cellulaires définissent, en même temps qu’elles

en découlent, la structure spatiale et fonctionnelle du biofilm (Branda et al., 2005; Costerton,

2004; Guerrero et al., 2002; Kives et al., 2005).

II II II .. LLaaccttooccooccccuuss llaaccttiiss eett lleess bbaaccttéérr iieess llaacctt iiqquueess

III.1 Phylogénie

Les bactéries lactiques sont des bactéries gram positives, non sporulantes, qui

fermentent les hydrates de carbone et certains alcools en acide lactique. Ces bactéries à faible

pourcentage en GC constituent un embranchement du phylum des clostridies. La morphologie

des cellules varie selon l’espèce: coques, coccobacilles ou bâtonnets. Les bifidobactéries ont

longtemps fait partie de ce groupe mais de nos jours elles sont rattachées à un autre taxon

(Schleifer, 1987 ; Vandamme et al., 1996).


18

Le genre Lactococcus comprend les espèces garvieae, lactis, piscium, plantarum et

raffinolactis. L’espèce lactis est subdivisée en trois sous-espèces nommées cremoris,

hordniae et lactis (Holzapfel et al., 2001; Stiles and Holzapfel, 1997). Les lactocoques sont

des bactéries lactiques en forme de coques, regroupées ou non en chaînettes, aérotolérantes, et

mésophiles. Leur température optimale de croissance avoisine les 30°C (Adamberg et al.,

2003). L’environnement naturel de Lactococcus lactis, généralement le lait ou les végétaux,

est souvent très riche en constituants nutritifs de sorte que l’absence de pression de sélection a

vraisemblablement conduit l’espèce ancestrale de Lactococcus lactis à perdre peu à peu de

nombreuses voies métaboliques. Par conséquent cette espèce présente de nombreuses

auxotrophies et de fortes exigences nutritionnelles, notamment en ce qui concerne les acides

aminés et les vitamines. Les besoins de L. lactis en acides aminés, vitamines, et ions

métalliques sont bien caractérisés (Boyaval, 1989 ; Cocaign-Bousquet et al., 1995 ;

Desmazeaud, 1983 ; Jensen and Hammer, 1993 ; Pandey et al., 1994Cocaign-Bousquet et al.,

1995 ; Jensen and Hammer, 1993). Bien que non indispensable à sa croissance, l’apport en

nucléotides exogènes favorise son développement. L. lactis peut utiliser de nombreux

carbohydrates comme source de carbone : glucose, lactose, galactose etc.

III.1.1 Lactococcus lactis subsp. lactis IL1403

Lactococcus lactis subsp. lactis IL1403 descend phylogénétiquement de la souche

IL594 isolée du lait et curée de tous ses plasmides (Chopin et al., 1984). Son génome est

constitué d’un chromosome circulaire de 2365,589 kb avec 35,4% de GC dont le séquençage

complet a été achevé en 2001 (Bolotin et al., 2001). Il porte 2310 cadres ouverts de lecture

(Open Reading Frames, ORFs ) identifiés. Ces gènes ont été annotés et classés selon leur

fonction biologique : 64% d’entre eux présentent une homologie de séquence avec des gènes

connus chez d’autres espèces, 20% ne présentent pas d’homologie et ont une fonction

inconnue, et 16% sont considérés comme spécifiques de L. lactis. Cette souche sert souvent

de modèle d’étude des lactocoques en particulier et des bactéries lactiques en général.

III.1.2 Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis LD61

La souche Lactococcus lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis LD61 est une souche

utilisée dans l’industrie laitière (SOREDAB) pour la fabrication de fromages. La structure

chromosomique de LD61 est relativement proche de celle d’IL1403 mais elle contient aussi


19

des plasmides portant les gènes d’utilisation du lactose, et des gènes codant pour des

protéases qui lui permettent de se développer dans le lait. Comme tous les biovar

diacetylactis, LD61 contient des gènes nécessaires à la production de diacétyle, une molécule

aromatique conférant le goût du beurre.

III.2 Catabolisme des sucres

Ribulose-5-P

Xylulose-5-P

Sedoheptu-lose-7-P

Erythrose-4-P

Ribose-5-P

Acétyl-P

Acétate

Glucose-6-P

Fructose-6-P

Fructose-1,6-diP

Glycéraldéhyde-3-P

1,3-diP-glycérate

3-P-glycérate

2-P-glycérate

P-énolpyruvate

Pyruvate

Glucose

Lactate

Dihydroxy-acétone-P

PiNADH+H

NAD

NADH+H

NAD

ATP

ADP

ATP

ADP

ATP

ADP

Acétyl-P

Acétate

ATP

ADP

ATP

ADP

ATP

ADP

Glucose

Glucose-6-P

6-P-gluconate

Ribulose-5-P

Xylulose-5-P

ATP

ADP

NADH+H

NAD

Acétyl-P

Acétyl-CoA

Acétaldéhyde

Ethanol

NADH+H

NAD

NADH+H

NAD

Acétate

P i

NADH+H

NAD

CO2

BIFIDE

HÉTÉROFERMENTAIRE

HOMOFERMENTAIRE

PK

LDH

FBA

PC

GLK

GLKACK

AK

XPC

XPC

Figure 3: Voies homofermentaire, hétérofermentaire et bifide de la dégradation du glucose. Les principales enzymes sont marquées en italique. GLK : glucokinase, FBA : fructose-1,6-bisphosphate aldolase, PC : fructose-6-phosphate phosphocétolase, XPC : xylulose-5-phosphate phosphocétolase, PK : pyruvate kinase, LDH : lactate déshydrogénase, ACK : acétate kinase.


20

Chez les bactéries lactiques il existe deux grandes voies du catabolisme des

sucres (figure 3). Il s’agit de la voie homofermentaire ou voie d’Embden-Meyerhoff-Parnas et

de la voie hétérofermentaire ou voie des pentoses-phosphate. Une troisième voie, la voie

bifide, concerne principalement les bifidobactéries proches des bactéries lactiques mais ne

faisant plus partie de ce groupe.

La voie bifide conduit, à partir d’une mole de glucose, à la formation d’une mole de

lactate et 1,5 moles d’acétate. Le bilan énergétique est supérieur aux voies homofermentaires

et hétérofermentaire, décrites ci-dessous, avec 2,5 moles d’ATP produites par mole de

glucose consommée.

La voie hétérofermentaire concerne essentiellement Leuconostoc et certains

lactobacilles. Cette voie conduit à la formation de lactate, d’acétate, d’éthanol et de CO2. Le

bilan énergétique est d’une mole d’ATP produite par mole de glucose consommée.

La voie homofermentaire est rencontrée chez les lactocoques, les pédiocoques, et les

lactobacilles. Cette voie conduit à la formation d’un produit de fermentation majoritaire, le

lactate.

III.2.1 Transport des sucres

La membrane plasmique, constituée d’une double couche phospholipidique, est une

barrière hydrophobe sélective définissant les limites du contenu cellulaire. La membrane

plasmique laisse passer les composés apolaires par simple diffusion alors qu’elle est

imperméable aux composés polaires hydratés tels que les sucres. L’entrée de sucre dans la

cellule doit donc se faire par des systèmes de transport transmembranaires. Il existe deux

systèmes de transport des sucres chez L. lactis : le système PTS (PEP dependent Transport

System) qui couple le transport et la phosphorylation du glucide, et le système perméase

énergie-dépendant qui facilite l’entrée des sucres sous forme libre (Mitchell et al., 1982;

Postma et al., 1993; Ye and Saier, 1996).

III.2.1.1 Perméases

Le système perméase est un système de transport actif qui utilise la force proton motrice

pour faire entrer les sucres dans la cellule (figure 4). La force proton motrice résulte d’un

gradient de concentration transmembranaire de protons qui génère un potentiel


21

électrochimique transmembranaire. Ce potentiel électrochimique peut être dû à l’activité de

l’ATPase, une enzyme transmembranaire qui couple l’hydrolyse de l’ATP avec la sortie de

protons. Chez les lactocoques le symporteur qui couple l’efflux de lactate et de protons génère

également de la force proton motrice (Konings et al., 1997; ten Brink et al., 1985). Cette force

est utilisée par le système perméase pour faire entrer conjointement protons et sucres dans la

cellule. Le sucre y est immédiatement phosphorylé par une kinase ATP dépendante pour être

ensuite pris en charge par les enzymes du catabolisme.

L’affinité des perméases pour le glucose est plus faible que celle du PTS (Cvitkovitch et

al., 1995a; Cvitkovitch et al., 1995b). Cependant l’étude de mutants du système PTS a montré

que les perméases étaient capables de compenser un système PTS déficient pour permettre la

croissance sur glucose (Garrigues et al., 1997 ; Thompson and Chassy, 1985; Thompson et

al., 1985).

Figure 4 : Système perméase de transport de sucre

III.2.1.2 Système PTS

Le système PTS (phosphoenolpyruvate dependent Transport System) est un groupe de

translocation qui associe l’entrée d’hydrate de carbone avec sa phosphorylation (figure

5)(Postma et al., 1993). Le groupement phosphoryl du phosphoenolpyruvate (PEP) est

transféré successivement sur l’enzyme EI puis sur HPR (sur le résidu His-15). HPR

phosphorylée phosphoryle à son tour une enzyme EII. Chaque perméase EII est constituée de

trois (IIA, B, C) ou quatre (IIA, B, C, D) domaines ou protéines selon le système (Reizer and

ADP

ATP

ATPase

Perméase

sucre sucre

H+ H+

EXTERIEUR INTERIEUR

+

+

-

-

nH+

sucre-P

ATP ADP


22

Saier, 1997) et est spécifique d’un sucre (Meadow et al., 1990; Postma et al., 1993). Le

complexe EII transfère ensuite son groupement phosphoryl sur le sucre lors de son entrée

dans la cellule. Les gènes ptnAB, ptnC et ptnD codent pour le système PTS responsable de

l’import de glucose (Bolotin et al., 2001).

Figure 5: Système PTS (d’après Postma et al., 1993)

III.2.2 La glycolyse

La voie centrale du catabolisme des sucres est la glycolyse. Le glucose entre dans la

cellule grâce au système PTS ou aux perméases. Il est immédiatement phosphorylé (soit par le

système PTS, soit par la glucokinase) en glucose-6-P (G6P) et rejoint la glycolyse où une

succession de réactions conduisent jusqu’à la formation de pyruvate (figure 3). Le bilan

énergétique de la glycolyse est de 2 moles d’ATP et 2 moles de NADH produites par mole de

glucose consommée.

III.2.3 Destin du pyruvate

Le pyruvate, situé au carrefour de nombreuses voies métaboliques, doit être oxydé afin

de rétablir la balance de pouvoir réducteur (NADH/NAD+). Chez L. lactis, le glucose

emprunte toujours la voie homo-fermentaire, et le pyruvate est transformé pour conduire soit

au métabolisme homolactique, soit à un métabolisme mixte (Cocaign-Bousquet et al., 1996).

EXTERIEUR INTERIEUR

sucre-P

HPr(his-P)

HPr(his)

EI

EI-P pyruvate

PEP

EII-A EII-B sucre

P P

EII-C / -D


23

Glucose

Pyruvate

Acétyl-CoA

Ethanol

Acétaldéhyde

NAD+

NADH

NAD+

NADH

Lactate

NAD+ NADH

Acétyl-P

Formiate

ATP

Acétate

CoA

CO2 + NADH

CoA + NAD+

CoA

acétolactate acétoïne

CO2

CO2

diacétyle

O2

2,3-butanediol

NAD+NADH

NADHNAD+

Figure 6: Métabolisme du pyruvate chez L. lactis.

III.2.3.1 Fermentation homolactique

Le métabolisme est dit homolactique lorsque le lactate représente plus de 90 % des

produits de fermentation. A la sortie de la glycolyse, la lactate-déshydrogénase (LDH)

convertit le pyruvate en lactate et régénère 2 moles de NAD+ par mole de glucose (figure 6).

L’activité de la LDH permet ainsi de rééquilibrer le bilan d’oxydoréduction (Neves et al.,

2005). Le rendement théorique limite (Yglucose,lactate) est de 2 molelactate/moleglucose. Dans la

pratique, chez L. lactis, on observe un rendement final (Rglucose,lactate) autour de 1,8

molelactate/moleglucose, soit 90% du glucose converti en lactate. En effet une partie du carbone

peut-être convertie en d’autres produits de fermentation ou être utilisée pour construire la

biomasse (Even et al., 2001).

Le gène ldh codant pour la LDH est essentiel à la voie de fermentation homolactique

(Griffin et al., 1992). Deux autres gènes présents sur le chromosome de IL1403, ldhB et ldhX

présentent de fortes homologies avec ldh, mais leur fonction est inconnue (Bolotin et al.,

2001).


24

III.2.3.2 Fermentation mixte

Certaines conditions de fermentation, comme la croissance sur galactose (Thomas et al.,

1980), la limitation en carbohydrate (Thomas et al., 1979), ou l’aérobiose (Anders et al.,

1970 ; Condon et al., 1987) induisent le basculement du métabolisme vers les voies

fermentaires mixtes (figure 6). Dans ce cas, le flux de conversion de pyruvate en lactate est

plus faible à cause de la diminution de l’activité de la LDH, étroitement liée à l’état

d’oxydoréduction de la cellule. Le pyruvate est alors disponible pour la synthèse d’autres

produits de fermentation, et peut être pris en charge par la pyruvate formiate lyase (PFL) ou la

pyruvate déshydrogénase (PDH), toutes deux catalysant la transformation du pyruvate en

acétyl-CoA avec production respective de formiate (anaérobiose) et de CO2 (aérobiose)

(Cocaign-Bousquet et al., 1996; Garrigues et al., 1997; Koebmann et al., 2002; Neves et al.,

2005; Solem et al., 2003). Ensuite l’acétyl-CoA peut être converti en acétaldéhyde puis

éthanol par l’alcool déshydrogénase (ADHE), ou en acétyl-phosphate puis acétate par la

phosphotransacétylase (PTA) et l’acétate kinase (ACK). La voie de l’éthanol produit 2 moles

de NAD+ alors que la voie de l’acétate produit 1 mole d’ATP. L’équilibre d’oxydoréduction

(régénération de NAD+) détermine la stœchiométrie des produits de la fermentation mixte

(Garrigues et al., 1997; Neves et al., 2005; Papagianni et al., 2007). Le bilan énergétique de la

fermentation mixte est amélioré par rapport à la voie homolactique puisque la synthèse

d’acétate permet de produire un ATP supplémentaire.

Synthèse d’arômes

Certaines souches de L. lactis peuvent produire des arômes à partir du pyruvate et

ainsi participer aux propriétés organoleptiques des aliments fermentés. Certains arômes sont

issus de la protéolyse des protéines du lait ou du métabolisme de certains acides aminés (Smit

et al., 2005) alors que d’autres dérivent du catabolisme des sources de carbone (de Vos and

Hugenholtz, 2004). Par exemple, Lactococcus lactis ssp lactis biovar diacetylactis est capable

de synthétiser du diacétyle, de l’acétolactate, ou de l’acétoïne à partir du pyruvate (figure 6)

(Neves et al., 2005). Dans ce cas l’acétolactate synthase, codée par als ou ilvBN, permet de

former une mole d’acétolactate à partir de deux moles de pyruvate. L’acétolactate peut ensuite

être décarboxylé chimiquement en diacétyle en présence d’oxygène, ou enzymatiquement en

acétoïne par l’acétolactate décarboxylase codée par le gène aldB (Goupil-Feuillerat et al.,


25

2000) Le diacétyle peut ensuite être réduit en acétoïne, à son tour réduite en 2,3-butanediol.

Ces deux réactions successives sont catalysées par la diacétyle-acétoïne réductase (gène butA)

et génèrent une mole de NAD+ pour chacune d’entre elles (Swindell et al., 1996).

III.2.4 Métabolisme aérobie

III.2.4.1 Métabolisme aérobie classique

L. lactis est dite micro-aérophile et dans certaines conditions cette bactérie peut tolérer

et même utiliser l’O2 (Condon et al., 1987 ; Duwat et al., 2001). La présence d’oxygène induit

l’activité NADH oxydase qui ré-oxyde NADH en NAD+ et par conséquent fait baisser le ratio

NADH/NAD+ (Bassit et al., 1993; Jensen et al., 2001; Snoep et al., 1992). Chez L. lactis, 3

gènes codent pour la NADH oxydase (noxC, noxD et noxE) (Bolotin et al., 2001). Lorsque le

ratio NADH/NAD+ est faible, l’activité de la LDH diminue alors que l’activité de la PDH

augmente (Jensen et al., 2001; Snoep et al., 1992; Snoep et al., 1993). Par ailleurs la présence

d’oxygène inactive la PFL (Abbe et al., 1982; Melchiorsen et al., 2000; Starrenburg and

Hugenholtz, 1991 ; Takahashi et al., 1982 ). Dans ces conditions, en fonction de la quantité

d’oxygène et de l’équilibre d’oxydoréduction, le métabolisme bascule de la fermentation

homolactique vers la fermentation mixte avec production de lactate, d’acétate, et de CO2

(Garrigues et al., 1997; Neves et al., 2005; Papagianni et al., 2007).

La présence d’oxygène influe aussi sur la synthèse d’arômes chez L. lactis biovar

diacetylactis. La diminution de l’activité de la LDH et de la PFL en parallèle de

l’augmentation de l’activité de la PDH favorisent, en plus de la voie de fermentation mixte, la

synthèse d’acétolactate (Bassit et al., 1993; Snoep et al., 1992; Starrenburg and Hugenholtz,

1991). Or, nous l’avons vu, cette molécule instable en présence d’oxygène peut être convertie

en diacétyle ou en acétoine. La production de diacétyle et d’acétoine peut donc être stimulée

en aérobiose. La stœchiométrie entre ces deux composés et les produits de fermentation mixte

dépend à la fois de la quantité d’oxygène, du ratio NADH/NAD+, de l’activité de la PDH, et

de l’activité de l’acétolactate synthase.


26

III.2.4.2 Stress oxydatif

La présence d’oxygène contribue au basculement du métabolisme vers la fermentation

mixte, conditionne la stoechiométrie des produits de fermentation, et influe sur la synthèse

des composés aromatiques (voir plus haut). Mais l’oxygène est aussi un agent toxique

impliqué dans le vieillissement et la mortalité cellulaire (Berlett and Stadtman, 1997; Orr and

Sohal, 1994). Le stress oxydatif peut causer plusieurs sortes de dommage à la cellule

bactérienne: ruptures de voies métaboliques, mutations spontanées et effets bactériostatiques

et bactéricides (Berlett and Stadtman, 1997; Fridovich, 1998). Certaines réactions du

métabolisme réduisent partiellement l’O2 menant à la formation d'espèces réactives (ROS),

comme le radical superoxyde (O2-), le radical hydroxyle (OH-) et l'eau oxygénée (H2O2). En

premier lieu, l’activité NADH oxydase oxyde le NADH en NAD+, en réduisant O2 en H2O2

(NADH oxydase de type I) ou H2O (NADH oxydase de type II). Ces ROS ont un potentiel

d'oxydation élevé et sont responsables de la toxicité en altérant les protéines, les lipides et les

acides nucléiques (Farr and Kogoma, 1991; Fridovich, 1998; Storz and Imlay, 1999).

L. lactis possède une superoxyde-dismutase (Sod) unique qui réduit les radicaux O2- en

H2O2, diminuant ainsi la toxicité (Condon et al., 1987 ; Fridovich, 1989; Sanders et al., 1995).

SodA est un système efficace de résistance au stress oxydatif puisque son inactivation par

mutation induit la diminution du taux de croissance uniquement en aérobiose (Sanders et al.,

1995). De plus, le gène sodA est faiblement exprimé en anaérobiose alors qu’il est activé en

aérobiose. En cas de faible activité de la Sod, l’accumulation de glutathione intracellulaire

pourrait être un mécanisme alternatif pour détoxifier la cellule en éliminant les radicaux O2-

(Fahey et al., 1978 ; Meister, 1988). En effet, la forte concentration en glutathione active la

glutathione réductase GshR, responsable de la réduction de H2O2 (Li et al., 2003).

Lactococcus est dépourvue de catalase mais H2O2 peut être réduit par la NADH

péroxydase conduisant à la formation d’H2O (Miyoshi et al., 2003). Cependant, l’activité de

la NADH péroxidase est faible chez L. lactis et la détoxification du H2O2 cellulaire par cette

enzyme est inefficace. Lorsque le flux glycolytique est fort, chez L. lactis ATCC19435

(déficiente en NADH peroxidase et en superoxyde dismutase), le pyruvate réagit avec H2O2

pour former de l’eau et de l’acétate (van Niel et al., 2002), fournissant ainsi la cellule avec un

mécanisme alternatif de protection contre l’H2O2.


27

Un autre mécanisme de résistance au stress oxydatif est lié à l'activité de RecA, une

protéine de réparation de l’ADN. Duwat et coll. (1995) ont construit une souche L. lactis

mutante de recA, et ont observé une forte sensibilité à l'aération, se traduisant par la

diminution du taux de croissance et de la viabilité. Ils ont proposé que l’oxygène serait

responsable de la toxicité et détériorerait l'ADN, et que RecA jouerait un rôle essentiel dans la

réparation de l’ADN. Le gène recA de L. lactis est co-transcrit avec un autre gène de

réparation de l’ADN codant pour une formamidopyrimidine DNA glycosylase (fpg) (Duwat

et al., 1995a; Duwat et al., 1995b; Duwat et al., 1995c).

III.2.4.3 La respiration

Les lactocoques peuvent mettre en route un métabolisme respiratoire sous certaines

conditions environnementales. L’apport d’hème, une molécule de porphyrine contenant du fer

qui permet de fixer l’oxygène, est indispensable pour le fonctionnement de la chaîne

respiratoire de Lactococcus lactis, même si l’aération est potentiellement suffisante (Duwat et

al., 1999; Duwat et al., 2001; Gaudu et al., 2002; Sijpesteijn, 1970). En effet, les systèmes

d’import de porphyrine et de fer sont présents chez Lactococcus lactis mais une partie

seulement de la voie de biosynthèse d’hème est active (Duwat et al., 2001). A l’exception de

la voie de synthèse d’hème, tous les éléments de la chaine respiratoire sont présents chez L.

lactis : des NADH déshydrogénases (codées par les gènes noxA et noxB), des enzymes de

synthèse de ménaquinone (codées par menFDXBEC et preA-menA), et de cytochrome

oxydases (codées par les gènes cydABCD). L’activité de tous ces éléments a pu être

démontrée durant la phase exponentielle et la phase stationnaire de croissance en présence

d’hème et d’oxygène. Pendant la respiration, la chaine respiratoire suffit à générer la force

proton motrice et permet de s’affranchir de l’activité du complexe F1F0-ATPase (Brooijmans

et al., 2007). Par conséquent le complexe F1F0-ATPase qui est indispensable pour la

croissance en condition de fermentation (Koebmann et al., 2000) ne l’est plus en conditions

de respiration (Blank et al., 2001).

La respiration, en réduisant le niveau d'oxydation intracellulaire, améliore la survie

cellulaire et le rendement en biomasse en comparaison de la croissance fermentaire en

condition statique ou en condition d'aération (Bolotin et al., 2001; Duwat et al., 2001). Par

ailleurs, le lactate s’accumule moins au profit de la production de CO2, et le pH reste élevé


28

(Gaudu et al., 2002). La respiration conduit donc aussi à éviter le stress acide (Rezaiki et al.,

2004). Dans des conditions aérées en présence d’hème, la diminution de la production de

lactate peut aussi s’accompagner de l’augmentation de la production d’acétate, d’acétoine et

de diacétyle (Duwat et al., 2001).

III.3 Le métabolisme des purines, pyrimidines, nucléotides, et

nucléosides chez Lactococcus lactis.

Le métabolisme des nucléotides joue un rôle fondamental dans la vie cellulaire. La

plupart des nucléotides sont des sources d'énergie nécessaires à de nombreuses réactions.

L’ATP est la source d’énergie la plus couramment rencontrée mais le GTP est aussi très

important et est employé dans la synthèse de protéines et dans d’autres réactions. L’UTP

permet l’activation du glucose et du galactose. Le CTP est une source d'énergie requise dans

le métabolisme des lipides. L'AMP fait partie de la structure de quelques coenzymes comme

le NAD et le Coenzyme A. Par dessus tout, les nucléotides sont les molécules essentielles

servant à construire les acides nucléiques (ADN et ARN).

Les besoins en nucléotides de la cellule peuvent être assouvis par deux moyens : la

synthèse de novo des nucléotides à partir des sources de carbone et d’azote disponibles, ou

l’exploitation des nucléotides, nucléosides et nucléobases de l’environnement grâce à un

système de sauvetage et d’interconversion. Lactococcus lactis met en œuvre et régule ces

deux mécanismes en fonction des conditions environnementales comme la majorité des

procaryotes, toutefois elle présente un certain nombre de caractères qui lui sont spécifiques

(pour revue voir (Kilstrup et al., 2005)).

III.3.1 Organisation des gènes du métabolisme des purines et des

pyrimidines

L’organisation des gènes impliqués dans le métabolisme des purines, pyrimidines,

nucléotides et nucléosides a été largement étudiée chez de nombreuses espèces bactériennes :

Escherichia coli, Salmonella typhimurium (Neuhard et Nygaard sités par (Kilstrup et al.,

1998)), Lactobacillus plantarum (Elagoz et al., 1996), Enterococcus faecalis (Li et al., 1995),


29

Bacillus subtilis (Quinn et al., 1991; Zalkin and Dixon, 1992), Bacillus caldolyticus (Ghim

and Neuhard, 1994). Chez les bactéries à gram positif les gènes sont généralement organisés

en larges opérons : l’opéron pur, comportant les gènes nécessaires à la biosynthèse des

purines, et l’opéron pyr composé des gènes de biosynthèse des pyrimidines. Chez

Lactococcus lactis ces gènes sont distribués en petits opérons et gènes monocystroniques

éparpillés sur le chromosome (figure 7). Les principaux gènes du métabolisme des purines de

Lactococcus lactis sont répartis ainsi : hpt, guaB, add, apt, deoD, guaC-xpt-pbuX, folC, guaA,

purCSQLF (Peltonen and Mantsala, 1999), purMN, hprT-purH, purDEK (Nilsson and

Kilstrup, 1998), trxB2 (Bolotin et al., 1999), purB, purA, et purR (Kilstrup and Martinussen,

1998). Pour le métabolisme des pyrimidines on observe la repartition suivante : nrdD, pyrG

(Jorgensen et al., 2004; Wadskov-Hansen et al., 2001), udp, deoD, trxB1, nrdEF, pyrEC

(Bolotin et al., 1999), pdp -deoC- cdd (Martinussen et al., 1994 ; Martinussen et al., 1995),

carB (Martinussen and Hammer, 1998), pyrKDbF (Andersen et al., 1996) (pyrKDbF de la

souche MG1363 correspond à pyrZ-pydB-pyrF chez IL1403), pyrDa (Andersen et al., 1994)

(pyrDa de la souche MG1363 correspond à pydA chez IL1403), pyrRPB-carA (Martinussen et

al., 2001), udk (Martinussen et al., 1994), cmk, upp (Martinussen and Hammer, 1994), et

pyrH (Wadskov-Hansen et al., 2000).

Chromosome L. lactis

guaAfolC

guaC-xpt-pbuX

deoD

apt

add

guaB

hpt

purA

purB

purDEKhprT-purH

purMNpurCSQLF

Chromosome L. lactis

deoD

pyrG

nrdD

pyrH

udp

upp

udk

cmk

pyrRPB-carA

pydA

pyrF-pydB-pyrZ

carB pdp-deoC-cdd

trxB1

nrdE nrdFpyrEC

ORIORIpurR

trxB2

Figure 7 : A gauche : répartition des gènes impliqués dans le métabolisme des purines sur le chromosome de Lactococcus lactis IL1403. A droite : répartition des gènes impliqués dans le métabolisme des pyrimidines sur le chromosome de Lactococcus lactis IL1403.


30

III.3.2 La biosynthèse de novo

La synthèse de novo consiste en la production des nucléobases à partir des éléments

disponibles dans le milieu environnant. Ainsi une machinerie enzymatique permet de

transformer les sources de carbone et d’azote pour former les molécules servant à la

construction des acides nucléiques. Deux voies existent : la synthèse de novo des purines et la

synthèse de novo des pyrimidines.

III.3.2.1 Biosynthèse de novo des purines

La synthèse de novo des purines résulte de la succession de 10 réactions enzymatiques

conduisant, à partir du PRPP (5-phosphoribosyl-pyrophosphate) et de la L-glutamine, à la

formation de l’IMP (figure 8). Dix gènes codent pour les enzymes catalysant ces dix

réactions : purB, purC, purD, purE, purF, purH, purK, purL, purM, purN. La première

réaction de la biosynthèse de novo des purines, catalysée par PurF, consiste en l’assemblage

du pyrophosphate provenant du PRPP avec le groupement amine de la glutamine, formant le

ribosyl-amine-5-P. Ensuite les enzymes PurD et PurN convertissent le ribosylamine-5-P

successivement en GAR et FGAR. La transformation du FGAR en FGAM requiert PurL,

mais aussi, chez B. subtilis et probablement chez L. lactis, les deux sous-unités PurQ et PurS.

PurQ porterait un domaine glutamine amidotransférase alors que PurS servirait de lien entre

PurQ et PurL. Ensuite l’enzyme codée par purM convertit le FGAM en AIR. La voie

métabolique peut continuer vers l’IMP par la transformation de l’AIR en 5’P-ribosyl-4-

carboxy-5-aminoimidazole par l’activité de PurE et PurK, ou être déviée vers le métabolisme

de la thiamine. PurC et PurB catalysent ensuite la production d’AICAR. Enfin les deux

dernières réactions qui conduisent à la synthèse de l’IMP sont catalysées par l’enzyme PurH.

Finalement la voie métabolique se divise en deux après l’IMP pour aboutir à la production

d’AMP et de GMP (Zalkin and Dixon, 1992).


31

1-(5’P-ribosyl)-N-formylglycinamide

FGAM

L-glutamine

GARPRPP Ribosylamine-5-P

(purF)

Voie des Pentoses

Phosphates

5’P-ribosyl-4-carboxy-5-aminoimidazole

5’P-ribosyl-4-(N-succinocarboxamide)-

5-aminoimidazole

AIR

1-(5’P-ribosyl)-5-formamido-4-imidazole carboxamide

IMP

AICAR

Métabolisme de la Thiamine

(purD)

(purN)

(purL)

(purM)

(purE ; purK)

(purC)

(purB)

(purH)

(purH)

Figure 8 : voie de synthèse de novo des purines. Entre parenthèse sont indiqués les gènes impliqués dans la réaction. Abréviations : PRPP, 5-phosphoribosyl-1-diphosphate ; GAR, 5'-phosphoribosyl-glycinamide ; FGAM, 2-formamido-N1-5'-phosphoribosyl-acetamidine ; AIR, aminoimidazole ribotide ; AICAR, 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribotide ; IMP, inosine monophosphate.


32

III.3.2.2 Biosynthèse de novo des pyrimidines

orotate

PRPP

Orotidine-5-P

Voie des Pentoses Phosphates

UMP

dihydroorotate

Métabolisme du glutamate

(carA ; carB)

N-carbamoyl-L-aspartate

carbamoyl-P

L-glutamine

Cycle de l’urée

(pyrB)

(pyrC)

(pydB = pyrDb)

(pyrF)

(pyrE)

Aspartate

Pi

Figure 9 : Voie de synthèse de novo des pyrimidines. Entre parenthèses sont indiqués les noms des gènes impliqués dans la réaction. Abréviations : PRPP, 5-phosphoribosyl-1-diphosphate ; UMP, uridine monophosphate

La synthèse de novo des pyrimidines permet de produire de l’UMP grâce à 6 réactions

enzymatiques à partir du PRPP et de la L-glutamine (figure 9). L’UMP sert ensuite de

précurseur pour la formation de l’UTP, CTP, dTTP etc. (Martinussen et al., 2001). La

première étape de la synthèse de novo des pyrimidines est la formation de carbamoyl-P. Les

gènes carA et carB codent respectivement pour la petite et la grande sous unité de la

carbamoyl-P-synthase (CPSase) qui catalyse cette réaction. La deuxième réaction est la

transformation du carbamoyl-P en carbamoyl-aspartate par l’aspartate-transcarboxylase

(PyrB) (Martinussen et al., 2001). Ensuite le carbamoyl-aspartate est transformé en dihydro-

orotate par l’enzyme produit du gène pyrC (Bolotin et al., 1999). Puis la dihydroorotate-


33

synthase (pydB) catalyse la réaction qui produit l’orotate. La protéine codée par le gène pyrZ

serait impliquée dans le transfert d’électrons avec pydB (Andersen et al., 1996). Une

particularité de l’espèce Lactococcus lactis est qu’elle possède deux dihydroorotate-synthase,

codées par les gènes pyrDa (ou pydA) et pyrDb (ou pydB) alors que tous les autres

procaryotes étudiés à ce jour n’en possèdent qu’une seule. Il a été montré que Lactococcus

lactis peut n’avoir qu’une seule de ces deux enzymes sans perdre sa prototrophie pour les

pyrimidines. Le plus surprenant est de constater que le gène pyrDa présente 70% d’homologie

avec le gène de dihydroorotate-synthase de Saccharomyces cerevisiae et semble beaucoup

plus éloigné de son homologue chez Bacillus subtilis, alors que pyrDb présente seulement

24% de similarité avec son homologue chez Saccharomyces cerevisiae mais 64% avec

Bacillus subtilis. PyrDa serait adapté à un métabolisme anaérobie, et PyrDb serait l’enzyme

commune à tous les procaryotes (Andersen et al., 1994). La réaction suivante est catalysée par

l’enzyme PyrE qui synthétise l’orotidine-5-P à partir du PRPP et de l’orotate (Bolotin et al.,

1999). Enfin pyrF code pour une OMP-décarboxylase qui convertit l’orotidine en UMP,

produit final de la synthèse de novo des pyrimidines (Andersen et al., 1996).

III.3.3 Les systèmes de transport

L’ajout d’adénine, guanine, ou hypoxanthine facilite la croissance de mutants

auxotrophes pour les purines (Nilsson and Lauridsen, 1992). Chez L. lactis subsp. lactis

IL1403 il existe une uracile-perméase, codée par le gène pyrP (Martinussen et al., 2001), et

un transporteur de purine codé par le gène pbuX (Bolotin et al., 2001). Des homologies de

séquence avec Bacillus subtilis laissent penser que les gènes yriD et pbuO sont impliqués

dans le transport de guanine et d’hypoxanthine comme leurs homologues de B. subtilis. Par

ailleurs un transporteur d’adénine existe vraisemblablement mais n’a pas encore été identifié.

On notera également que certaines souches de L. lactis ont un transporteur d’orotate, codé par

le gène oroP (Kilstrup et al., 2005).

Chez L. lactis subsp. cremoris MG1363, il existe également deux transporteurs de

nucléosides, l’un permettant l’import de l’uridine (pyrimidine), et l’autre l’import

d’adénosine, d’inosine et de guanosine (purines) ainsi que de cytidine (pyrimidines). L’import

des purines et de cytidine est réalisé grâce à un transporteur ABC codé par les gènes nupABC.

Chez IL1403 les gènes nupABC correspondraient aux gènes yngEFG mais leur fonction n’a


34

pas été démontrée. Il semblerait qu’un troisième transporteur, responsable de l’import de

thymidine et non identifié à ce jour, soit aussi présent sur le chromosome de MG1363

(Kilstrup et al., 2005).

III.3.4 Les voies de sauvetage et d’interconversion

UMPCMP

URCR U

CTP UTP

Synthèse de novo des pyrimidines

AR IR GR

A Hx G

AMP IMP GMP

ATP GTP

Synthèse de novo des purines

ARIR

GRCR UR

MG1363

IL1403IL1403

U

A Hx G X

MG1363

CDP UDP(pyrH)

(udk)

(pyrG)

(upp)(udk)

(cdd)

(cmk)

(pdp)

(guaC)

XMP(guaB) (guaA)

(purA)(purB)

(hprT)

(deoD)(deoD)(add)

(hprT)(apt) (apt)

(hprT)

(deoD)

(cmk)

(hpt) (hpt) (hpt)X

(hpt)(xpt)

inex

Figure 10: Systèmes de transport et principales voies de sauvetage et d’interconversion des purines et pyrimidines. CR: cytidine; UR: uridine ; U: uracile ; AR : Adénosine ; IR : inosine ; GR : guanosine ; Hx : hypoxanthine ; A : Adénine : G : guanine. Entre parenthèses figurent les noms des gènes impliqués dans les réactions. Le numéro des souches dans lesquelles ont été détectés les transporteurs est indiqué : IL1403 pour Lactococcus lactis subsp. lactis ; MG1363 pour Lactococcus lactis subsp. cremoris.

La synthèse de novo des purines et pyrimidines permet à la cellule de construire les

molécules nécessaires à l’élaboration des chaînes d’acides nucléiques. Ceci mobilise de

l’énergie et des substrats au détriment d’autres fonctions de la cellule. Afin d’éviter ce

détournement la cellule peut utiliser les molécules préexistantes. C’est ce que l’on appelle les

voies de sauvetage et d’interconversion des nucléotides et nucléosides qui dépendent des

besoins de la cellule en nucléotides.


35

L. lactis peut utiliser de nombreuses sources de purines exogènes que sont l’adénosine,

la guanosine, l’inosine, l’adénine, l’hypoxanthine, la xanthine, et la guanine. Après son entrée

dans la cellule l’adénosine peut être convertie en inosine par l’adénosine-désaminase, codée

par le gène add ou déphosphorylée en adénine par la nucléoside-phosphorylase codée par le

gène deoD (Kilstrup et al., 2005)(figure 10). De même l’inosine est convertie soit en

adénosine par l’adénosine-désaminase (add), soit déphosphorylée en hypoxanthine par la

nucléoside-phosphorylase DeoD. La guanosine est également déphosphorylée pour former la

guanine grâce à DeoD. Ensuite, le sauvetage des purines s’effectue grâce à la conversion des

ribonucléosides monophosphates par les phosphoribosyltransferases. Le chromosome de L.

lactis IL1403 comporte 4 gènes de purine-phosphoribosyltransferase: hpt et hprT codant pour

deux hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase, xpt codant pour une xanthine-

phosphoribosyltransferase, et apt codant pour une adenine-phosphoribosyltransferase (Nilsson

and Lauridsen, 1992).

Toutes les pyrimidines sont métabolisables par Lactococcus lactis à l’exception de la

cytosine. La cellule importe des précurseurs pour ensuite les convertir en cytosine

intracellulaire ou activer la synthèse de novo. La cytidine importée dans la cellule peut être

désaminée par une cytidine-désaminase (gène cdd) pour former l’uridine ou être convertie en

CMP par par l’uridine kinase codée par udk (Kilstrup et al., 2005). L’uridine peut également

être prise en charge par l’uridine kinase (udk) pour former l’UMP, ou être convertie en

uracyle par Pdp (Kilstrup et al., 2005). L’enzyme de la voie de sauvetage de l’uracile

(pyrimidine) est l’uracile-phosphoribosyltransferase (UPRTase), codée par le gène upp, qui

conduit à la synthèse d’UMP à partir de l’uracyle (Martinussen and Hammer, 1994). Le CMP

et l’UMP sont convertis en CDP et UDP par l’enzyme codée par cmk. La seule enzyme de

Lactococcus lactis à catalyser la réaction de production de l’UTP est PyrH (UMP-kinase). Le

gène pyrH est un gène essentiel et fait partie avec frr1 (ribosomal recycling factor 1) d’un

cluster très conservé parmi les procaryotes (Wadskov-Hansen et al., 2000). Le gène pyrG

code pour une CTP synthase qui catalyse la conversion d’UTP en CTP (Wadskov-Hansen et

al., 2001). La protéine PyrG contrôle directement la concentration intracellulaire en CTP

(Jorgensen et al., 2004).


36

III.4 Systèmes de régulation chez Lactococcus lactis

Les systèmes de régulation peuvent être basés sur des mécanismes biochimiques, qui

modifient directement l’activité enzymatique, conduisant à la diminution ou à l’augmentation

de la vitesse de certaines réactions. D’autres processus régulateurs se déroulent au niveau de

l’expression génétique ou de la traduction des ARN messager en protéines, conduisant à

l’induction ou la répression de la transcription et/ou de la traduction selon les cas. La

modification de l’expression et/ou de l’activité des enzymes modifie les vitesses de

transformation des différents intermédiaires métaboliques et conduit parfois à la réorientation

des flux métaboliques.

III.4.1 Régulation biochimique

Lactococcus lactis peut adapter son métabolisme pour répondre aux contraintes

environnementales. La régulation biochimique s’effectue à plusieurs niveaux : au niveau de

l’entrée du substrat, au niveau des enzymes de la glycolyse, et au niveau des enzymes de

transformation du pyruvate.

III.4.1.1 Régulation des systèmes de transport des sucres

Chez L. lactis, la régulation du transport des sucres permet de favoriser l’utilisation du

glucose aux dépens des autres sources de carbone. Cette régulation est liée à des phénomènes

de compétition au niveau des transporteurs, d’exclusion et d’expulsion. Ces mécanismes

influent sur la vitesse de transport des sucres et contrôlent indirectement le flux métabolique

intracellulaire (Papagianni et al., 2007).

La différence d’affinité d’un transporteur vis-à-vis des sucres peut favoriser l’import

d’un sucre par rapport à l’autre. Par exemple un système PTS prend en charge en priorité le

sucre pour lequel la protéine EII a le plus d’affinité. Il y a donc compétition entre les sucres

vis-à-vis du même transporteur. Il existe aussi des différences d’affinité entre les protéines EII

des systèmes PTS vis-à-vis de la protéine HPr-P. De ce fait, certaines EII son favorisées pour

recevoir le groupement phosphoryle de la protéine HPr-P. Cette compétition conduit à


37

privilégier un système de transport et favorise l’import d’un sucre par rapport aux autres

(Poolman, 2002).

L’exclusion est l’inhibition allostérique d’un transporteur de type PTS ou d’une

perméase, et a pour effet d’inhiber l’import de certains substrats. Ce phénomène implique la

phosphorylation de la protéine HPr-P du système PTS sur un résidu ser-46 au lieu de his-15.

Cette phosphorylation est catalysée par la protéine kinase/phosphatase ATP-dépendante

HPrK/P, qui est activée par le fructose-biphosphate (FBP) et inhibée par le Pi (Deutscher and

Saier, 1983; Saier and Crasnier, 1996). Donc la modulation de la concentration en FBP,

contrôlée par l’import de sucre et le flux catabolique, contrôle la formation de HPr(Ser)-P

(Reizer et al., 1983). Par exemple, une forte concentration en glucose entraine l’augmentation

des concentrations intracellulaires de FBP et d’ATP et la diminution de la disponibilité en Pi.

L’activité de HPr-kinase est alors stimulée et la protéine HPr, phosphorylée en ser-46, bloque

l’import d’autres sucres (et/ou d’inducteurs de gènes cataboliques) en agissant au niveau des

transporteurs et bloque aussi leur phosphorylation puisqu’un seul des deux sites de la protéine

HPr peut-être phosphorylé à la fois (Poolman, 2002; Saier and Crasnier, 1996; Thompson and

Torchia, 1984).

Lorsqu’un sucre est importé dans la cellule alors qu’il n’est pas le sucre préférentiel, il

peut être déphosphorylé puis expulsé de la cellule. Ce phénomène s’appelle l’expulsion

(Reizer et al., 1983). La phosphorylation en ser-46 de HPr serait impliquée dans l’activation

d’une sucre-phosphate phosphorylase chez L. lactis (Wittekind et al., 1989; Ye et al., 1994),

mais son rôle direct dans l’expulsion n’a pas pu être confirmé in vivo chez Lb. casei

(Dossonnet et al., 2000), Lb. brevis (Djordjevic et al., 2001) et L. lactis (Monedero et al.,

2001). HPr-(ser)P n’est pas indispensable à l’expulsion et jouerait donc un rôle indirect dans

cette régulation.

III.4.1.2 Le shift homolactique/mixte

L. lactis montre généralement un métabolisme homolactique mais sous certaines

conditions, comme dans le cas d’une limitation en glucose ou d’une croissance sur galactose

(Even et al., 2001; Thomas et al., 1979; Thomas et al., 1980), maltose (Snoep et al., 1992), ou

pentoses (Kandler, 1983), ou en présence d’oxygène (Papagianni et al., 2007), le métabolisme


38

bascule vers la fermentation mixte. La régulation du shift homolactique/mixte est complexe et

intervient à plusieurs niveaux. Ainsi l’analyse du transcriptome de L. lactis a montré que le

niveau d’expression de l’ensemble des gènes de la glycolyse et des voies de fermentation

mixtes influe sur la réorientation des flux métaboliques. Les gènes de la glycolyse sont plus

exprimés lors de la croissance sur glucose que sur galactose alors que la plupart des gènes des

voies de fermentation mixtes a un niveau d’expression plus fort sur galactose que sur glucose

(Even et al., 2001). En adéquation avec cette observation, la comparaison du protéome de

Lactococcus cultivé sur glucose et sur d’autres sources de carbone (lactose, maltose) a

démontré que le métabolisme homolactique de Lactococcus était lié à une forte concentration

en enzymes glycolytiques, alors que l’accumulation d’autre produits de fermentation que la

lactate s’accompagne de l’augmentation de la concentration de certaines enzymes des voies

de fermentation mixte (Guillot et al., 2003; Palmfeldt et al., 2004).

Figure 11 : Vue d’ensemble simplifiée de la glycolyse et de sa régulation par le FBP et les trioses phosphates dihydroxyacétone phosphate (DHAP) et glycéraldehyde-3-phosphate (GAP). La régulation positive de la LDH par le FBP est indiqué par le signe +, et la régulation négative de la PFL par les trioses phosphate est indiquée par le signe de division. TPI, triose phosphate isomérase; Acetyl-CoA, acétyl coenzyme A. (figure extraite de (Solem et al., 2007)).


39

Le principal modèle de régulation du shift homolactique/mixte est étroitement lié au

flux glycolytique, au rapport NADH/NAD+ et à la concentration en FBP.

Certains auteurs ont mentionné le rôle du FBP dans le contrôle du métabolisme

lorsque le flux glycolytique est faible. Le faible flux glycolytique résultant d’une carence en

sucre induit un abaissement du niveau de FBP (Thomas et al., 1979), et la concentration en

triose-phosphates (DHAP, GAP) chez L. lactis est diminuée pendant la croissance sur des

sucres dont l’assimilation est lente (Thomas et al., 1980). Comme le FBP est un activateur

allostérique de la LDH (Wolin, 1964), et que les triose-phosphates sont des inhibiteurs

allostériques de la PFL (Takahashi et al., 1982), si le flux catabolique est faible, l’activité de

la LDH est réduite alors que celle de la PFL est augmentée. En conséquence, le pyruvate peut

être convertit, en plus du lactate, en acétyl-coA et le métabolisme peut basculer vers la

fermentation mixte (Crow and Pritchard, 1977; Solem et al., 2007; Thomas et al.,

1979)(figure 11).

D’autres auteurs ont montré l’implication du ratio NADH/NAD+ dans le shift

homolactique/mixte. Un fort flux glycolytique induit un ratio NADH/NAD+ élevé et une

limitation au niveau de la GAPDH. L’accumulation de FBP et DHAP et GAP qui en résulte

conduit à l’accroissement de l’activité de la LDH. L’activité de la GAPDH est alors juste

suffisante pour assurer le flux vers le pyruvate. De plus la concentration élevée en DHAP et

GAP inhibe la PFL et le ratio faible de NADH/NAD+ ne permet pas d’augmenter l’activité de

la PDH. En conséquence la plupart du pyruvate est converti en lactate par la LDH et le

métabolisme est homolactique (Garrigues et al., 1997; Papagianni et al., 2007). En revanche

un flux glycolytique faible induit la diminution du ratio NADH/NAD+ conduisant à

l’affaiblissement de l’activité de la LDH et rendant disponible le pyruvate pour d’autres

enzymes. Le faible ratio NADH/NAD+ s’accompagne aussi de la levée d’inhibition de la

GAPDH. En conséquence la concentration en trioses-phosphates (DHAP et GAP), inhibiteurs

de la PFL, est réduite. Le pyruvate peut alors emprunter les voies de fermentation mixte,

conduisant à l’accumulation, en plus du lactate, d’éthanol, d’acétate, de formiate (en

anaérobiose) ou de CO2 (en aérobiose)(Even et al., 2001; Solem et al., 2007)(figures 6 et 11).

Une étude montre que ces deux facteurs (niveau de FBP et ratio NADH/NAD+) sont

importants, mais que leur implication dans le contrôle de l’orientation du métabolisme varie

selon les souches (van Niel et al., 2004).


40

La modulation de l’activité de la GAPDH chez L. lactis (Even et al., 1999) a permis

de montrer que cette enzyme exerçait un fort contrôle sur le flux catabolique et jouait

vraisemblablement un rôle important dans le basculement homolactique/mixte. Cependant

Solem et coll. (2003) ont montré que la modulation de l’activité de la GAPDH par mutation

dans la souche MG1363 ne permettait pas de modifier le flux glycolytique. L’expérience n’a

pas été menée dans les mêmes conditions de culture, ni avec les mêmes souches, ce qui

pourrait expliquer la divergence entre les études.

L’opéron las, codant pour la PFK, la pyruvate kinase (PYK) et la LDH (Llanos et al., 1993),

régule le flux glycolytique et indirectement le destin du pyruvate. Des études de mutants ont

confirmé que la LDH a un effet négatif fort sur le flux des voies de fermentation mixte

(Andersen et al., 2001). Au contraire PYK exerce un contrôle positif fort sur la production de

formiate et d'acétate (Koebmann et al., 2005). Le contrôle positif par PYK et le contrôle

négatif par LDH s’annulent, aboutissant à de très petits effets sur l’orientation du métabolisme

si la mutation affecte l’expression de l’opéron las en entier.

L’environnement gazeux joue un rôle crucial dans l’orientation du métabolisme vers la

fermentation mixte. De plus, lorsque le métabolisme est mixte, la quantité d’oxygène

influence la stœchiométrie des produits de la fermentation. En anaérobiose, avec un flux

glycolytique faible, le pyruvate est pris en charge, en plus de la LDH, par la PFL et le

métabolisme s’oriente vers les voies de fermentation mixtes avec production de lactate,

formiate, acétate et éthanol. En aérobiose, l’oxygène modifie le rapport NADH/NAD+,

induisant l’activation des NADH oxydases et de la PDH, la diminution de l’activité de la

LDH, et l’inactivation de la PFL. Le métabolisme mixte conduit donc à l’accumulation de

lactate, acétate, et CO2 (voir « Métabolisme aérobie »).

III.4.2 Régulation génétique

138 régulateurs potentiels ont été recensés dans le génome de L. lactis IL1403. Ces

régulateurs ont été classés en 10 familles (Bolotin et al., 2001; Guedon et al., 2002) selon leur

fonction, ou leur mode d’action : régulation générale, système à deux composantes, les

familles lacI, lysR, araC, deoR, marR, et bglG, et les « GTP binding proteins ». Les

mécanismes de régulation génétique chez L. lactis ont été largement décrits dans la revue de

Guédon et coll. (2002). Les paragraphes qui suivent constituent une mise à jour de cette revue


41

et ne constituent donc pas une description exhaustive. L’attention est portée sur les

régulateurs qui ont fait l’objet de travaux récents (depuis 2002), sur les régulateurs globaux

(CcpA, CodY), et sur ceux qui pourraient être potentiellement impliqués dans une interaction

inter-espèce même s’il est difficile de connaître à priori l’implication d’un régulateur dans une

interaction microbienne.

III.4.2.1 Facteurs sigma

Les facteurs sigma contrôlent l’expression génique en interagissant avec l’ARN

polymérase pour lui permettre de reconnaitre la région promotrice, de s’y fixer, et d’initier la

transcription. Seul trois facteurs sigma ont été identifiés chez L. lactis. RpoD est un facteur

sigma végétatif qui reconnait la séquence promotrice de nombreux gènes de L. lactis et active

la transcription des gènes de ménage pendant la phase exponentielle de croissance (Goupil-

Feuillerat et al., 2000). ComX est un facteur sigma alternatif qui régule les gènes tardifs de la

compétence en se fixant à l’ADN au niveau d’une séquence appelée cin-box. La compétence

est un système de transfert de matériel génétique d’une espèce à une autre. Cependant la

compétence naturelle chez L. lactis n’a pas encore été démontrée (Wydau et al., 2006). Enfin

SigX est vraisemblablement un autre facteur sigma alternatif, mais sa fonction reste inconnue

chez L. lactis.

III.4.2.2 CcpA

La répression catabolique est observée chez L. lactis lorsque la source de carbone est

assimilée rapidement, comme le glucose par exemple. Il s’agit de l’inhibition de la

transcription de gènes d’utilisation des autres sources de carbone. Ce contrôle est exercé par

la protéine CcpA. Chez L. lactis CcpA est aussi responsable de l’activation des gènes

impliqués dans la glycolyse, notamment l’opéron las (Luesink et al., 1998). CcpA se fixe aux

sites cre (cisacting catabolite responsive elements) en amont des promoteurs des gènes régulés

(Henkin, 1996). L’action de CcpA est stimulée par l’interaction avec la protéine HPr

lorsqu’elle est phosphorylée en ser46 (voir régulation du système PTS) en présence de FBP

(Cocaign-Bousquet et al., 2002; Saier and Crasnier, 1996; Schumacher et al., 2004). Donc,

une forte concentration en glucose, qui induit un haut niveau de FBP et la phosphorylation de


42

HPr en ser46, provoque l’activation de CcpA. Un tétramère de CcpA associé à HPr-ser46-P

se fixe alors aux sites cre de l’ADN, activant la transcription des gènes de la glycolyse, et

inhibant la transcription des gènes requis pour l’assimilation d’autres sources de carbone

(Schumacher et al., 2004).

Comme le montre l’analyse transcriptomique de la souche MG1363, le régulon de

CcpA comporte de nombreux gènes (Zomer et al., 2007). Parmi eux se trouvent des gènes du

métabolisme du carbone et de la glycolyse mais aussi du métabolisme des nucléotides, de

l’import d’azote, et des gènes de modulation du pH intracellulaire. Sa délétion conduit à la

modification d’expression de 13% des gènes du génome de L. lactis. Par exemple CcpA

régule les gènes responsables de l’utilisation de certaines sources de carbone comme les

riboses, le mannitol, le gluconate, les β-glucosides (Guedon et al., 2001), le galactose

(Luesink et al., 1998) et le fructose (Barriere et al., 2005). CcpA est aussi impliqué dans la

régulation du métabolisme aérobie et dans le basculement entre les voies métaboliques. En

effet il contrôle l’expression de noxE codant pour la NADH oxidase et activerait la

transcription de fhuR, régulateur de l’import d’hème, essentiel à la respiration chez L. lactis

(Gaudu et al., 2003). La présence de séquences cre dans la région promotrice de pepP et pepQ

suggère que ces deux gènes du système protéolytique sont contrôlés par CcpA (Guedon et al.,

2001; Zomer et al., 2007). Enfin, il faut aussi noter que CcpA s’autorégule chez L. lactis

(Zomer et al., 2007).

III.4.2.3 Régulation des voies d’assimilation des autres sources de carbone

La possibilité d’utiliser plusieurs sources de carbone est un moyen de s’adapter aux

modifications environnementales. Des analyses transcriptomiques ont en effet montré que la

carence carbone provoque la diminution générale de l’expression des gènes d’utilisation du

glucose et induit au contraire les gènes d’utilisation des autres sources de carbone en levant

l’inhibition de certains régulateurs génétiques (Ganesan et al., 2007; Redon et al., 2005a).

Dans le cas d’interaction trophiques entre microorganismes, il peut arriver qu’une espèce

consomme les produits d’une autre espèce. En plus de CcpA, responsable de la régulation

globale du catabolisme, il existe de nombreux régulateurs spécifiques classés en différentes

familles (LacI, LysR, AraC, GntR, DeoR, BglG) et contrôlant l’expression des gènes

d’utilisation de substrats carbonés.


43

Ainsi LacR, dont le gène est porté généralement par un plasmide, contrôle l’expression

des gènes d’utilisation du lactose (lacABCDFEGX) (Siezen et al., 2005). Les gènes

d’assimilation du xylose (xylRAB) sont contrôlés par XylR (Erlandson et al., 2000; Guedon et

al., 2002). BglR est un anti-terminateur de transcription impliqué dans l’assimilation des β-

glucosides. L’étude de mutants de bglR et ccpA a montré que le transport de cellobiose est

effectué par un système PTS cellobiose/lactose dépendant de CcpA alors que l’import des

autres β-glucosides, comme la salicine, serait contrôlé par BglR (Kowalczyk et al., 2008). Les

gènes d’assimilation du maltose seraient sous le contrôle de l’activateur MalR (Andersson and

Radstrom, 2002). Le catabolisme du fructose et sa régulation chez L. lactis a fait l’objet d’une

étude basée sur la comparaison des transcriptomes de mutants comparés à une souche

sauvage. FruR est le répresseur de l’opéron fructose. Son mode d’action est très proche de

celui de LacR. FruR se fixe à une séquence consensus de l’ADN (TGAWWGWTTT)4 et son

activité est modulée par le fructose-1-phosphate (Barriere et al., 2005). L. lactis peut

également métaboliser le malate et le citrate grâce aux opérons mle et cit. Un régulateur deoR

situé en amont de l’opéron cit a été trouvé mais son implication dans la régulation de cit n’a

pas été prouvée (Guedon et al., 2002). L’opéron mle quant à lui serait activé par MleR, un

régulateur de la famille LysR, lorsque le malate est présent dans le milieu de culture (Renault

et al., 1989). Enfin rbsR, kdgR, gntR, rgrA et rliB codent pour des régulateurs potentiels de

gènes impliqués respectivement dans le catabolisme du ribose, du mannonate, du gluconate et

de deux sucres inconnus, mais ils restent peu étudiés (Guedon et al., 2002).

III.4.2.4 CodY

Le régulateur CodY contrôle le métabolisme de l’azote et régule l’expression de

centaines de gènes chez L. lactis. Ce régulateur de transcription se fixerait à l’ADN au niveau

d’une séquence consensus formant une structure palindromique appelée codY-box

(AATTTTCNGAAAATT) pour moduler la transcription (Guedon et al., 2005). De nombreux

promoteurs de gène régulés par CodY contiennent la CodY-box. Cependant, chez L. lactis 30

% des promoteurs cibles de CodY ont des motifs CodY-box qui présentent tous au moins trois

mésappariements avec à la séquence consensus. Ceci montre probablement que CodY peut

aussi reconnaître des conformations particulières de l’ADN comme suggéré chez B. subtilis

par Serror et Sonenshein (Serror and Sonenshein, 1996), ou que CodY contrôle indirectement


44

leur niveau d'expression. CodY est fortement actif en présence d’isoleucine, à tel point que la

croissance de L. lactis est inhibée par une forte concentration en isoleucine dans le milieu de

culture (Chambellon and Yvon, 2003; Goupil-Feuillerat et al., 2000; Guedon et al., 2005;

Lapujade et al., 1998).

CodY contrôle complètement le métabolisme de l’azote chez L. lactis en contrôlant le

système protéolytique et le métabolisme des acides aminés. CodY réprime les gènes du

système protéolytique dont pepN, pepC, opp-pepO1 et probablement prtPM, pepX et pepDA2

(den Hengst et al., 2005). CodY contrôle aussi les gènes impliqués dans la biosynthèse et le

transport des BCAA, glutamate, glutamine, histidine, sérine, thréonine, lysine et asparagine,

dans la protéolyse et dans les voies d’assimilation de peptides (Chambellon and Yvon, 2003;

den Hengst et al., 2006; Guedon et al., 2001) CodY contrôle aussi indirectement la

biosynthèse de cystéine et de glycine, qui utilise la sérine comme précurseur, et la biosynthèse

de la proline et de l’arginine, qui utilise le glutamate comme précurseur. Par ailleurs, CodY

réprime le métabolisme du glycogène et les voies d’assimilation du glycérol qui pourraient

fournir à la cellule le carbone nécessaire à la biosynthèse d'acides aminés en carence de sucre.

Finalement CodY contrôle toutes les voies d’assimilation de l’azote en modulant la synthèse

de novo des acides aminés ainsi que l’import de sources nutritionnelles secondaires (Guedon

et al., 2005).

Une analyse protéomique a révélé que la respiration conduit à l’augmentation du taux

d’enzymes protéolytiques (PepO1, PepC). Cette induction ne semble pas liée à la régulation

par CodY, laissant supposer l’existence d’autres régulateurs du système protéolytique (Vido

et al., 2004).

III.4.2.5 Systèmes à deux composants

Les systèmes à deux composants (Two components Systems, TCS) sont impliqués dans

la détection des modifications des conditions environnementales et dans le déclenchement de

la réponse cellulaire. Les TCS, au nombre de 8 chez L. lactis IL1403, sont constitués d’une

histidine kinase (HK) membranaire responsable de la perception d’un signal spécifique et

d’un régulateur de réponse cytoplasmique assurant la transduction du signal en se liant à

l’ADN (Appleby et al., 1996). Lors de son interaction avec un signal environnemental, HK

s’autophosphoryle, puis le phosphate est transféré sur le régulateur de réponse. Le régulateur


45

de réponse est alors activé et se fixe à l’ADN pour déclencher une réponse adaptée. Les gènes

codant pour chaque TCS fonctionnent par paires (kin/llr ) à l'exception de llrH qui est un

régulateur de réponse orphelin sans HK dans son voisinage.

KinA/LlrA serait impliqué dans la régulation du métabolisme de l’arginine et la réponse

au stress acide. KinC/LlrC semble être un système global de résistance au stress puisque son

inactivation par mutation conduit à une sensibilité accrue au stress acide, et que la protéine

LlrC a été décrite comme une « cold shock protein » (stress thermique) (Wouters et al., 2001).

KinD/LlrD est impliqué dans la réponse au stress osmotique, KinF/LlrF dans la réponse au

stress oxydatif et KinE/LlrE semble réguler l’activité phosphatase dans la cellule. Les gènes

kinG/llrG appartiennent à un cluster avec tyrA-aroA-aroK-pheA, indiquant que KinG/LlrG

pourrait être impliqué dans le métabolisme des acides aminés branchés. Enfin, le gène llrH est

suivi par octA et yrfD qui codent une ornithine carbamoyl-transférase et un antiporteur d'acide

aminé, laissant penser que LlrH jouerait un rôle dans la régulation du métabolisme de

l’arginine. Aucun rôle n’a pu être défini pour KinB/LlrB (O'Connell-Motherway et al., 2000).

Dans d’autres souches de L. lactis que IL1403, des TCS supplémentaires peuvent être

portés par des éléments génétiques mobiles comme le système nisR/nisK qui contrôle

l’expression de l’opéron nisine (Kuipers et al., 1995), lcoR/lcoS impliqué dans la résistance au

cuivre (Khunajakr et al., 1999), ou CesSR impliqué dans la réponse aux stress altérant

l’enveloppe cellulaire (Martinez et al., 2007; Veiga et al., 2007).

III.4.2.6 Régulation du métabolisme des purines et pyrimidines

La description de la régulation du métabolisme des purines et pyrimidines est très

développée en comparaison des autres systèmes de régulation dans l’optique de mieux

appréhender les travaux décrits dans (Maligoy et al., 2008).

Les voies de synthèse de novo et les voies de sauvetage et d’interconversion des purines

et pyrimidines sont étroitement mêlées et régulées par l’activité de transporteurs et de

régulateurs transcriptionnels. Ces mécanismes de régulation sont généralement liés aux

concentrations extra et intracellulaires en nucléotides et nucléosides. Il a été observé que la

modification des concentrations intracellulaires en nucléotides a un effet sur la régulation de

nombreuses réactions enzymatiques (Martinussen et al., 2003).


46

a.La régulation du métabolisme des purines

Figure 12 : Modèle de la régulation PurR chez L. lactis. (A) Le contrôle du niveau de PRPP et la régulation génétique de la voie de biosynthèse de l’IMP. D’après le modèle du contrôle du niveau de PRPP de B. subtilis, la concentration en PRPP peut être diminuée par la phosphoribosylation des nucléobases en NMP (représentés ici par l’adénine), et par l’inhibition de la PRPP synthase par l’ADP. En condition de haut niveau de PRPP PurR active la transcription des gènes de la voie de biosynthèse de l’IMP, ainsi que glyA et fhs impliqués dans l’incorporation des C1 du formiate et de la sérine pour former le THF (tétrahydrofolate). Les unités C1 du formyl-THF et méthanyl-THF sont incorporés en bases puriques par les transformylases PurN et PurH. (B) Modèle de l’induction par PRPP de l’activation de la transcription par PurR. PurR se fixe à la PurBoxe sur l’AND quelle que soit la condition. La liaison de PRPP change la conformation de PurR qui reconnaît et positionne l’ARN polymerase correctement, permettant d’initier la transcription. (figure extraite de (Kilstrup et al., 2005)).

La régulation transcriptionnelle de la plupart des molécules du métabolisme des

purines dépend d’une seule molécule régulatrice : PurR. Une séquence consensus appelée «

purBox » est présente en amont du promoteur de nombreux opérons, notamment ceux de la

voie de synthèse de novo des purines. Cette séquence permettrait la fixation de l’activateur

transcriptionnel PurR, puis de l’ARN-polymérase (figure 12). Il s’agit d’un système de

régulation classique avec activateur de transcription et facteur sigma 70. Une purBox se

trouve en amont du gène purR, indiquant qu’il y a autorégulation. La protéine PurR de L.

lactis présente 51% d’homologie en termes d’acides aminés avec PurR de Bacillus subtilis, et


47

près de 80% d’homologie globale. Mais PurR est indispensable à l’activation de la voie de

synthèse de novo des purines chez L. lactis, indiquant qu’il s’agit d’un activateur, alors que

chez Bacillus subtilis PurR est un répresseur. La purBox de Bacillus est imparfaite de sorte

que PurR se décroche en présence de PRPP laissant la place pour le complexe de

transcription. En revanche la purBox de Lactococcus lactis est parfaite, ce qui signifie que

PurR ne se détache pas. Ceci explique la différence de mécanisme de régulation malgré

l’implication de la même molécule PurR chez les deux espèces (Kilstrup et al., 1998; Kilstrup

and Martinussen, 1998; Martinussen et al., 2003). De nombreux gènes font partie du régulon

PurR, appartennant principalement à la voie de synthèse de novo des purines (Kilstrup et al.,

1998; Nilsson and Kilstrup, 1998; Peltonen and Mantsala, 1999).

Le PRPP confère à PurR sa forme active. En absence de PRPP, PurR est inactive, et il

n’y a pas d’activation de la transcription. Or la concentration intracellulaire en PRPP est

directement liée à la concentration en purines. Ainsi Beyer et coll. (2003) ont montré par une

analyse protéomique que la régulation par PurR est directement corrélée avec la disponibilité

en purine exogène (Beyer et al., 2003). Par exemple l’expression de l’opéron purDEK est

fortement altérée par la présence de purines et PurR serait impliquée dans ce mécanisme

(Nilsson and Kilstrup, 1998). De même l’opéron purCQSLF qui est précédé par une purBox

en amont (2 séquences purBox en réalité) est régulé en réponse à l’ajout de purines exogènes

(Peltonen and Mantsala, 1999).

b.La régulation du métabolisme des pyrimidines

La régulation du métabolisme des pyrimidines dépend d’une molécule régulatrice

PyrR et d’une séquence de type terminateur. La protéine régulatrice PyrR de L. lactis présente

de fortes homologies avec celle de Bacillus subtilis et il est probable que la régulation se fasse

par les mêmes mécanismes (Martinussen et al., 2001). Les terminateurs sont des structures

secondaires des acides nucléiques qui peuvent empêcher la transcription. Il existe un

terminateur ainsi qu’une séquence consensus appelée « pyrBox » en amont du promoteur de

nombreux opérons, notamment ceux de la synthèse de novo des pyrimidines. La protéine

PyrR facilite la formation du terminateur en se fixant à la pyrBoX (figure 13), inhibant ainsi

la transcription (Martinussen and Hammer, 1998). La régulation par PyrR est liée à la

disponibilité en pyrimidines. Ainsi l’expression du gène carB est régulée par la concentration


48

en uracile par le biais de PyrR. Il existe une structure de type terminateur ainsi qu’une

séquence consensus appelée « pyrBox » en amont du promoteur de carB (Martinussen and

Hammer, 1998). De même l’expression des opérons pyrRPB-carA, pyrKDbF, pyrEC, et

pyrDb est inhibée en présence d’uracile (Andersen et al., 1996; Martinussen et al., 2001).

Figure 13 : Modèle de la régulation par PyrR. Les promoteurs des gènes de biosynthèse de pyrimidine initie constitutivement la transcription, et la structure (I) se forme. La protéine PyrR est sensible au niveau d’UMP intra-cellulaire: lorsque les pyrimidines sont abondantes, la concentration en UMP est élevée, facilitant la formation du complexe PyrR–UMP. Ce complexe peut se lier à une séquence spécifique de l’anti-terminateur (structure I), provoquant sa stabilisation. En conséquence, la formation de l’anti-terminateur (II) est empêché, favorisant la formation du terminateur (III). L’ARN polymérase termine prématurément la transcription. A un faible niveau d’UMP, PyrR ne peut pas se fixer à l’anti-terminateur et la structure anti-terminatrice énergétiquement plus favorabe se forme. Le terminateur ne peut pas se former et la transcription se poursuit. (figure extraite de (Kilstrup et al., 2005)).


49

Le gène pyrG n’est pas assujetti à la même régulation que les autres gènes du

métabolisme des pyrimidines. Il est régulé spécifiquement par la concentration intra cellulaire

en cytidine (figure 14). En effet la présence de CTP inhibe l’expression de pyrG chez L. lactis

comme chez de nombreuses autres bactéries. Une séquence « terminateur » a été détectée

dans le « leader » de l’ARNm de pyrG mais il semble que le mécanisme de régulation ne soit

pas lié à PyrR. Une enzyme encore inconnue serait sensible à la concentration en CTP, et

interviendrait dans la formation ou la déstructuration du terminateur, modulant ainsi le niveau

d’expression de pyrG (Jorgensen et al., 2003).

Figure 14 : Modèle de la régulation par de pyrG. (A) LA transcription est initiée avec la séquence 50-GGGC. (B) Lorsuqe la concentration en CTP est élevée, la transcription se poursuit et la structure terminatrice impliquant des paires de bases se forme. (C) Structure secondaire du leader de pyrG dans avec la configuration terminateur. (D) Lorsque le CTP est limitant l’ARN polymérase s’arrête immédiatement devant le résidu C à la position quatre dans la séquence 50-GGGC. A cause de dérapages de la transcription, des résidus G supplémentaires sont incorporés à l’extrémité 50 de l’ARN. Cette succession de G forme des paires avec le côté gauche de la tige du terminateur, empêchant ainsi la formation du terminateur. La transcription se poursuit avec pour résultat l’expression de pyrG. (E) Structure secondaire du leader de pyrG dans la configuration anti-terminateur. (figure extraite de (Kilstrup et al., 2005)).


50

Le carbonate est un substrat de la carbamoyl-P-synthase (CarAB) et semble aussi

influencer le métabolisme des pyrimidines. Il a été montré que Lactobacillus plantarum était

incapable de croître en présence d’uracile sans ajout d’une forte concentration de CO2. Ceci

montre que la concentration de carbamoyl-P pourrait être régulée par le bicarbonate

intracellulaire. Par ailleurs le carbamoyl-P est un précurseur de pyrimidines mais aussi

d’arginine. La carbamoyl-P-synthase serait régulée également par l’arginine, du moins chez

Lactobacillus plantarum (Nicoloff et al., 2000).

III.4.2.7 Biosynthèse et dégradation des acides aminés

L. lactis a besoin d’acides aminés exogènes pour une croissance optimale mais elle peut

synthétiser des acides aminés s’ils sont absents du milieu de culture. En effet son génome

contient tous les gènes de synthèse de novo des acides aminés (Bolotin et al., 2001).

L’expression d’un certain nombre d’entre eux varie en fonction de la concentration en acide

aminé dans le milieu de culture. Ainsi il a été montré que la régulation de la transcription des

opérons trp, leu-ilv-ald, his et metC-cysK, permet de répondre à un déficit en acide aminé, et

est le plus souvent contrôlée au niveau de l’initiation et de l’élongation. La transcription des

opérons his et leu-ilv-ald est réprimée 10 à 30 fois en présence d’histidine et d’isoleucine dans

le milieu de culture, suggérant l'existence d'un répresseur (Delorme et al., 1992, 1999; Godon

et al., 1992; Godon et al., 1993). Mais l’examen des régulateurs, annotés principalement par

homologie de séquence protéiques en comparaison avec des bases de données, n'a pas permis

d’identifier précisément le gène répresseur.

L’expression de l’opéron metC-cysK impliqué dans le métabolisme de la méthionine et

de la cystéine, est elle aussi modifiée en réponse à la concentration en acide aminé. En effet la

transcription de cet opéron est réduite si la concentration en cystéine, méthionine, ou

glutathione est élevée dans le milieu de culture. Le régulateur cmbR, appelé fhuR chez L.

lactis IL1403, a été identifié par une approche de mutagénèse aléatoire et semble activer la

transcription de metC-cysK en présence d'acétyl-sérine. Par ailleurs, cmbR contrôle aussi la

transcription de l’opéron fhuCBGDR dont il est le dernier gène et qui code pour un

transporteur ABC de ferrichrome mais le rôle physiologique de cette régulation conjointe

n’est pas clair (Fernandez et al., 2002).


51

Le contrôle du métabolisme de l’arginine de L. lactis serait assuré par deux protéines

présentant de fortes homologies, ArgR et AhrC. ArgR serait impliqué dans l'anabolisme de

l’arginine alors qu’AhrC serait impliqué dans son catabolisme (Larsen et al., 2004; Larsen et

al., 2005). Le signal de reconnaissance de ces régulateurs sur l'ADN est un palindrome appelé

ARG-box (Makarova et al., 2001). Il faut noter que le métabolisme de l’arginine peut aussi

être contrôlé directement ou indirectement par les systèmes à deux composants KinA/LlrA et

LlrH (voir plus haut).

La glutamine synthase est une enzyme responsable de l'assimilation de l'ammonium

pour fournir la glutamine à la cellule. La glutamine sert de source d'azote pour la synthèse

d'autres acides aminés, de bases et de vitamines. Chez L. lactis, l’opéron glnRA est

responsable de la synthèse de glutamine : GlnA est la glutamine synthétase et GlnR un

répresseur de transcription qui se fixe à une séquence spécifique de l’ADN appelée GlnR-box.

Récemment il a été montré que cette glnR-box est présente en amont des opérons amtB-glnK,

glnRA, et glnPQ et que GlnR réprime l’expression de ces opérons en fonction de la

disponibilité des sources d’azote (Larsen et al., 2006). L’opéron amtB-glnK est aussi réprimé

dans un mutant ∆glnR de la souche MG1363, lorsque la concentration en NH3 est élevée,

contrairement à glnRA, et glnPQ. Il semble donc que amtB-glnK soit aussi régulé par un

deuxième répresseur, vraisemblablement CodY (voir plus haut). D’autre part l’activité de la

glutamine synthétase (GlnA) peut aussi être contrôlée par la protéine PII/PII-UMP codée par

glnB pour répondre aux besoins en azote de la cellule. Le gène glnB serait régulé par le

système à deux composants KinA/llrA. Comme souvent, le métabolisme de L. lactis dépend

de systèmes de régulation croisés, et la participation de chaque régulateur dans la réponse à

l’environnement peut être difficile à appréhender. La régulation de nombreux autres gènes du

métabolisme des acides aminés reste peu connue.

III.4.2.8 Stress acide, thermique, osmotique, oxydatif

L. lactis doit faire face à de nombreux stress dans les procédés naturels ou industriels et

doit mettre en place des mécanismes de résistance adaptés. Des analyses transcriptomiques et

protéomiques ont révélé que la résistance au stress acide (Budin-Verneuil et al., 2005; Budin-

Verneuil et al., 2007; Raynaud et al., 2005; Vido et al., 2005; Xie et al., 2004), thermique

(Xie et al., 2004), osmotique (Xie et al., 2004), et oxydatif (Vido et al., 2005) implique en


52

général un grand nombre de gènes et/ou protéines. Il y a parfois de grandes divergences entre

les articles, suggérant la superposition de systèmes de régulation conduisant à tel ou tel

phénotype en réponse au stress, en fonction d’autres paramètres (souches, conditions de

culture…). Cependant certains régulateurs spécifiques et leur régulon ont pu être caractérisés

précisément, parfois grâce à des techniques d’analyse globale (Akyol, 2007; Magnani et al.,

2008).

Par exemple des régulateurs spécifiques sont impliqués dans la réponse au stress

osmotique (BusR, GadR), ionique (PhoU, CopR, ZitR, FlpA, FlpB) et oxydatif (Fur). Par

ailleurs la régulation de l’import et du métabolisme des métaux est souvent liée au stress

oxydatif. Cela paraît logique, en particulier pour l’hème qui joue un rôle important dans le

métabolisme oxydatif de L. lactis (Guedon et al., 2002; Sanders et al., 1998). Enfin, le

métabolisme du citrate semble régulé par CitI en réponse au stress acide mais le mécanisme

moléculaire reste inconnu (Martin et al., 2004).

La description de ces systèmes de régulation ne sera pas plus développée car les

conditions dans lesquelles nous nous proposons d’étudier les interactions microbiennes

n’autorisent pas de tels stress. En effet il s’agit de cultures dans un système fermé (Batch)

dans lequel les paramètres physicochimiques (pH, température, environnement gazeux) sont

maintenus constants, et donc les stress acide, thermique, osmotique, et oxydatif ne peuvent

pas avoir lieu.

III.4.2.9 Résistance aux molécules anti-microbiennes

Les interactions cellulaires peuvent être liées à la production de molécules

antimicrobiennes (antibiotiques, bactériocines etc.). Un moyen pour les bactéries de résister à

ces drogues est d’expulser la molécule grâce à un système de transport. Peu de régulateurs

impliqués dans ces phénomènes de résistance ont été étudiés.

Chez L. lactis, LmrCD est un transporteur ABC qui permet d’expulser de multiples

molécules (multidrug transporter). LmrR coderait pour un régulateur de transcription qui se

fixerait à la région promotrice de l’opéron lmrCD et modulerait son expression en

interagissant avec une molécule antimicrobienne. Quand les cellules sont exposées à des

composés toxiques, ces composés peuvent se lier à LmrR. LmrR change probablement de

conformation et son interaction avec la région promotrice de lmrCD est affaiblie, permettant à


53

la polymérase d'ARN d'amorcer la transcription. Cela aboutit à la levée de répression des

gènes lmrCD et induit l'expression d'un transporteur qui expulse les molécules toxiques de la

cellule. Ainsi une forte activation des gènes lmrC et lmrD est observée dans quatre souches

résistantes lorsqu’elles sont exposées à des molécules antimicrobiennes (Lubelski et al.,

2006).

II VV.. LL eess lleevvuurr eess

Les levures sont des champignons unicellulaires utilisés dans les procédés de

fermentation agroalimentaires tels que la fabrication de produits laitiers (fromages, kéfir…),

de la bière, du vin, des spiritueux (rhum, whisky, gin, vodka…), et du pain. Ce sont des

microorganismes que l’on retrouve également dans de nombreux écosystèmes naturels.

Certaines levures sont des pathogènes opportunistes, elles appartiennent généralement au

genre Candida. La levure la plus utilisée en industrie, la plus étudiée en laboratoire, et sans

doute la plus connue est Saccharomyces, aussi appelée levure de bière ou levure du

boulanger. Les levures occupent une multitude d’habitats qui peuvent être liés ou non aux

activités humaines. De nombreux isolats naturels ont été recueillis dans des vignes où S.

cerevisiae est présente sur les grains de raisin. On trouve également des levures à la surface

d’autres fruits servant à la production d’alcools fermentés. Il existe aussi des preuves que les

insectes et les oiseaux sont des agents importants de dissémination des levures (Mortimer and

Polsinelli, 1999). Des levures appartenant à l’espèce Saccharomyces ont pu être isolées

d’échantillons provenant de biotopes aussi nombreux que variés comme par exemple le lit du

Danube (Slavikova and Vadkertiova, 1997) ou la rhizosphère des chênes américains

(Sniegowski et al., 2002).

IV.1 Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae est un champignon levuriforme (unicellulaire) appartenant

au genre des ascomycètes. Cette levure se développe préférentiellement en aérobiose, mais

peut également croître en anaérobiose, sous certaines conditions, notamment l’adjonction


54

d’ergostérol au milieu de culture (Moller et al., 2001; Visser et al., 1990). La croissance de

Saccharomyces est favorisé en milieu acide - son optimum de pH se situe entre 4,5 et 6,5 -

mais elle tolère parfaitement des valeurs de pH comprises entre 2,5 et 8,0. Saccharomyces

cerevisiae est une espèce mésophile avec un optimum de température entre 25 et 30°C (Rose

and Harrisson, 1971) qui peut s’adapter et croître dans un large spectre de température.

Toutefois elle est généralement incapable de se développer à des températures supérieures à

40°C.

La levure a été le premier organisme eucaryote dont le génome a été entièrement

séquencé (Dujon, 1996; Goffeau et al., 1996). La plupart des séquences décodées proviennent

de la souche Saccharomyces cerevisiae S288c. Saccharomyces cerevisiae contient 16

chromosomes sur lesquels sont répartis 5885 gènes potentiels codant pour des protéines ainsi

que 140 gènes environ codant pour des ARN ribosomaux. Une grande part a été étudiée et

annotée. Il existe des gènes continus comme chez les bactéries, et des gènes discontinus

(introns et exons) comme chez les eucaryotes supérieurs. Par ailleurs, chaque mitochondrie

renferme son propre matériel génétique réparti en plusieurs molécules d'ADN circulaires qui

codent pour des enzymes de la chaîne respiratoire.

Des variations génétiques et phénotypiques existent entre les différentes souches de S.

cerevisiae. Cette hétérogénéité réside dans la production d’éthanol, d’acétate, de sulfites et

d’autres produits métaboliques (Cavalieri et al., 1998), dans les caractères morphologiques

des colonies (Casalone et al., 2005) ou encore dans la capacité à métaboliser certains sucres

tels que le sucrose, le maltose ou le galactose (Cavalieri et al., 1998 ; Landry et al., 2006).

Malgré le fait que la plupart de l’information dont nous disposons sur le génome de

Saccharomyces provient de S288c, cette souche n’a généralement pas un fond génétique idéal

pour étudier certains aspects biologiques. En effet, la souche S288c présente de nombreux

inconvénients tels qu’une capacité de sporulation limitée (Deutschbauer and Davis, 2005),

l'inaptitude à métaboliser le maltose (Charron et al., 1986) ou encore à initier une croissance

filamenteuse en carence en azote (Gagiano et al., 2002). Pour toutes ces raisons, et bien

d’autres encore, de nombreuses équipes de recherche utilisent des souches avec un fond

génétique plus ou moins éloigné de S288c pour réaliser des études physiologiques, génétiques

ou génomiques (Huang et al., 2005; Primig et al., 2000; van Dijken et al., 2000; Xu et al.,

2004). Il faut ajouter que l’ADN mitochondrial n’a pas été pris en compte dans le séquençage

du génome et qu’il constitue une source d’hétérogénéité supplémentaire. Un article décrit les


55

variations génétiques entre les principales souches de laboratoire et S288c et a aboutit à la

création d’une base de données qui permet de prendre en compte ces variations lors du design

de sondes ou lors d’analyses transcriptomiques, notamment avec les puces à ADN

(Schacherer et al., 2007).

La famille CEN-PK est communément considérée comme la plus approchante de la

levure modèle idéale (van Dijken et al., 2000) car elle présente un phénotype dit « sauvage ».

Cette souche est capable de synthétiser la plupart des lipides, acides aminés, nucléotides,

cofacteurs et vitamines nécessaires à sa croissance à partir des ressources de son

environnement. Elle peut utiliser de nombreuses sources de carbone telles que le glucose, le

maltose, le galactose, l’éthanol, l’acétate. Il s’agit d’un microorganisme qui peut s’adapter

facilement à des conditions de culture variées. La souche CEN.PK113-7D (ou CEN.PK905),

qui a servi pour les travaux décrits dans cette thèse, est prototrophe, MAT a, MAL2-8c, c'est-

à-dire que l’expression des gènes mal est indépendante de la répression glucose et de la

présence de maltose, et SUC2, c'est-à-dire qu’elle peut métaboliser le saccharose.

IV.2 Le métabolisme central de Saccharomyces cerevisiae

Glucose

Glucose-6-P

Fructose-6-P

Fructose-1,6-diP

Dihydroxyacétone-P

Perméase

ATP

ATPPi

NAD+

NADH

Glycérol-3-P

Glycérol

NAD+

NADH

ATP

Glycéraldéhyde-3-P

3,P-glycérate

2,P-glycérate

Phosphoénol-pyruvate

Pyruvate

AcétaldéhydeEthanol

NAD+

NADH

ATP

ATP

CO2

Acétate

NAD+ NADH

NADPH

NADP+

ATP + CoA

Acétyl-CoA

Oxaloacétate

NAD+

+CoANADH +CO2

Citrate Isocitrate

α-cétoglutatrate

Succinyl-coA

SuccinateFumarate

Malate

Acétyl-CoA CoASH

+H2ONAD+

NADH +CO2

NAD+

+CoASH

NADH +CO2

GDP +Pi

GTP +CoASH

FAD+FADH2

H2O

Acétyl-CoA

ATP +CO2

Glyoxylate

NAD+

NADH

Ex

In

Figure 15 : Représentation shématique du métabolisme central de Saccharomyces cerevisiae.


56

IV.2.1 La glycolyse

Le glucose est le substrat carboné préférentiel de la levure. En effet, comme chez

Lactococcus lactis, le glucose exerce une répression catabolique inhibant les enzymes

d’utilisation des autres sources de carbone. La voie principale du catabolisme de la levure est

la glycolyse (figure 15). Le glucose entre dans la cellule par diffusion facilité grâce à des

perméases, phosphorylé par une glucokinase, puis suit la voie de la glycolyse pour finalement

former le pyruvate selon des mécanismes similaires à ceux de Lactococcus lactis : des

réactions successives de transformation à partir du glucose-6-P s’accompagnent d’une

libération d'énergie sous la forme de 2 moles d'ATP et 2 moles de NADH par mole glucose

consommé. Le produit final de la glycolyse est le pyruvate qui doit ensuite être transformé

pour régénérer le pouvoir réducteur (NAD+).

IV.2.2 La fermentation alcoolique

Lorsque la concentration en oxygène est très faible (microaérobiose) voire nulle

(anaérobiose) le métabolisme de la levure est exclusivement fermentaire (Bjorkqvist et al.,

1997; Visser et al., 1990). En effet, en absence d’O2 la levure doit trouver un accepteur

d’électron de substitution afin de régénérer le NAD+. En général le produit final en

anaérobiose est l’éthanol. A la sortie de la glycolyse, le pyruvate est scindé en acétaldéhyde et

CO2 par la pyruvate décarboxylase. Puis la conversion de l’acétaldéhyde en éthanol permet de

rétablir la balance des pouvoirs réducteurs. Le bilan énergétique de la fermentation alcoolique

est le suivant :

1 C6H12O6 + 2 Pi → 2 CO2 + 2 C2H6O + 2 ATP

Le rendement théorique limite de production d’éthanol (Yglucose,éthanol) est de 0,51

géthanol/gglucose. Dans la pratique, on peut atteindre au maximum 95% de ce rendement

théorique, soit environ 0,48 géthanol/gglucose. En effet une partie de la consommation du glucose

sert à la production de biomasse, et une autre partie est transformée en produits de

fermentation secondaires, en particulier du glycérol.


57

IV.2.3 Le métabolisme oxydatif

En présence d’oxygène, le pyruvate est oxydé en CO2 et H2O grâce au cycle de Krebs,

et le NADH est réoxydé en NAD+ avec la production d’ATP par phosphorylation oxydative.

L’énergie libérée sert à la multiplication cellulaire et à la conversion des glucides simples en

matériel de réserve (glycogène et tréhalose) (Rose and Harrisson, 1971). Malgré la présence

d’oxygène, Saccharomyces cerevisiae ne métabolise généralement qu’une faible part du

carbone par la respiration alors qu’une grande majorité du carbone (80%) est déviée vers la

fermentation alcoolique. En effet même si l’aération est suffisante pour maintenir la chaîne

respiratoire en activité, l’effet Crabtree réoriente une grande part du catabolisme vers la

production d’éthanol (Crabtree, 1929). Ce phénomène peut être observé en cas de fortes

concentrations en glucose et peut s’expliquer par l’absence de contrôle au niveau de son

entrée dans la cellule (perméases). La cellule doit faire face à un afflux important de glucose

et les enzymes de transformation du pyruvate (pyruvate déshydrogénase, acétaldéhyde

déshydrogénase, et acétyl-CoA synthase) sont rapidement saturées. Finalement l’effet

Crabtree se manifeste par l’inhibition de la respiration et la production d’éthanol par le

métabolisme fermentaire (Ben Chaabane, 2006 ; Mouret, 2006).

IV.2.3.1 Croissance sur éthanol

Saccharomyces cerevisiae peut se développer avec de l’éthanol comme substrat carboné

grâce au métabolisme oxydatif. Lorsque le glucose fait défaut, l’éthanol peut être reconverti

en acétaldéhyde par l’alcool déshydrogénase (ADH). L’acétaldéhyde peut alors être

transformé en acétate grâce à l’acétaldéhyde déshydrogénase (ACH). Ces deux étapes

entraînent la formation d’une mole de NADH et d’une mole de NADPH par mole d’éthanol.

Ensuite l’acétyl-CoA synthase transforme l’acétate en acétyl-CoA. En fait, l’acétyl-CoA

glucogénique provenant de la transformation du pyruvate est remplacé peu à peu par l’acétyl-

CoA gluconéogénique produit à partir de l’éthanol (de Jong-Gubbels et al., 1995). L’acétyl-

CoA peut alors rejoindre le cycle de Krebs ou le cycle du glyoxylate. Ces deux cycles ont des

localisations différentes dans la cellule. Les enzymes du cycle de Krebs sont localisées dans

les mitochondries alors que celles du cycle du glyoxylate sont localisées dans le cytosol (den

Hollander et al., 1981). D’après la littérature, le franchissement de la membrane


58

mitochondriale se fait uniquement grâce à la carnitine acétyl transférase. La voie de synthèse

de la carnitine étant inactive chez S. cerevisiae, l’apport de carnitine exogène est donc

indispensable à l’entrée de l’acétyl-CoA dans la mitochondrie (pour revue voir Mouret, 2006).

Cependant cette hypothèse est actuellement controversée et l’acétyle-coA semble pouvoir

entrer dans la mitochondrie par un autre système permettant l’assimilation de l’éthanol et

d’acétate.

Les enzymes du cycle du glyoxylate sont réprimées par le glucose mais sont

particulièrement actives lorsque la concentration en glucose est nulle. Cette voie constitue une

déviation de l’étape de décarboxylation du cycle de Krebs et conduit à l’accumulation de

précurseurs gluconéogéniques à partir de substrats à 2 carbones (acétate, éthanol…)

(Gonzalez, 1977). En d’autres termes, il faut des réactions anaplérotiques qui fournissent les

intermédiaires métaboliques de remplacement au cycle de Krebs lorsqu’ils sont redirigés vers

la gluconéogénèse. Chez la levure, ce rôle est assuré par le cycle du glyoxylate (de Jong-

Gubbels et al., 1995; den Hollander et al., 1981).

IV.2.3.2 Croissance sur lactate

Il est aussi connu que les levures sont capables d’utiliser le lactate comme source de

carbone. Le gène cyb2 de Saccharomyces cerevisiae code pour la cytochrome c

oxydoréductase plus connue sous le nom de cytochrome b2 (Cyb2p). Cette molécule est

localisée dans l’espace inter membranaire des mitochondries où elle oxyde le lactate en

pyruvate et réduit directement le cytochrome c (figure 16) (Brooks, 2002; Grad et al., 2005).

La capacité des levures à métaboliser l’acide lactique a été mise à profit pour accroître la

production de nisine par L. lactis dans une co-culture. L’acide lactique étant inhibiteur de

croissance pour les bactéries lactiques, sa consommation par la levure prolonge le procédé en

levant l’inhibition (Liu et al., 2006; Shimizu et al., 1999). De la même façon la production de

grains de kéfir a pu être améliorée. Cheirsilp et coll. ont réalisé des co-cultures de

Lactobacillus kefiranofaciens avec une souche de Saccharomyces cerevisiae apte à assimiler

l’acide lactique, levant ainsi l’inhibition de croissance sur le lactobacille : la production de

grains de kéfir fut augmentée (Cheirsilp et al., 2003a). D’autres auteurs mentionnent la

capacité de S. cerevisiae à croître en métabolisant le lactate notamment dans les procédés de

fermentations en lait ou lors de la vinification (Fleet, 1992; Gadaga et al., 2001). Il faut


59

toutefois garder à l’esprit que de fortes concentrations en lactate peuvent nuire à la croissance

cellulaire des levures (Champagne et al., 1990).

Figure 16 : Oxydation du lactate et du NADH par Cyb2p. Les complexes I, III, et IV se trouvent dans la membrane intern des mitochondries (IM), et ils translocalisent les protons dans l’espace intermembranaire. LDH, lactate déshydrogénase cytosolique endogène; Q, ubiquinone; cyt c, cytochrome c. (figure extraite de (Grad et al., 2005))

VV.. LL eess hhaabbii ttaattss ccoommmmuunnss àà LLaaccttooccooccccuuss llaaccttiiss eett

SSaacccchhaarr oommyycceess cceerr eevviissiiaaee

Lactococcus lactis et Saccharomyces cerevisiae partagent souvent le même biotope

dans des procédés de fermentation agroalimentaires ou dans l’environnement depuis des

siècles. Il existe même des preuves de coévolution avec des mécanismes de transfert

horizontal de gène d’une espèce à l’autre (Gojkovic et al., 2004). L’élaboration du kéfir,

boisson lactée alcoolisée originaire d’Asie, requiert la présence de levures et de bactéries

lactiques (Abraham and De Antoni, 1999; Angulo et al., 1993; Garrote et al., 2001; Marquina

et al., 2002; Simova et al., 2002). On retrouve aussi levures et lactocoques dans des breuvages

traditionnels d’Afrique tels que le burukutu (Faparusi et al., 1973), le lait fermenté alcoolisé


60

du Zimbabwe (Gadaga et al., 2001), ou encore le nyarmie, produit laitier fermenté du Ghana

(Obodai and Dodd, 2006). Des analyses de la composition de levains de boulangerie du

Portugal (Rocha and Malcata, 1999) ou d’Italie (Corsetti et al., 2001) ont, elles aussi, révélé la

présence simultanée de ces deux types de microorganismes. Les végétaux constituent souvent

un biotope commun pour ces deux microorganismes, particulièrement les céréales dans leur

état naturel ou fermenté. Par exemple on trouve S. cerevisiae et L. lactis parmi de nombreuses

autres espèces microbiennes dans des préparations de grains de lupin (Yamani et al., 1998).

Un autre article caractérise la fermentation de céréales et montre que des bactéries lactiques,

dont Lactococcus, et des levures, dont Saccharomyces, participent ensemble au procédé de

fermentation (Nout, 1992). Les deux espèces font aussi parfois partie de la flore intestinale

des mammifères (Marquina et al., 2002).

Des associations entre Lactococcus lactis et Saccharomyces cerevisiae ont souvent été

décrites et laissent supposer l’existence de mécanismes d’interaction entre ces deux

microorganismes. En effet il est très vraisemblable que les contraintes imposées par l’habitat

aient conduit l’évolution à mettre en place des stratégies d’interactions positives ou négatives,

voire de communication. Cependant peu d’informations sont disponibles dans la littérature

scientifique, de rares articles décrivent des liens de causalité entre le comportement de

Lactococcus et la présence de Saccharomyces. La plupart concernent la réutilisation du lactate

par la levure (voir plus haut). Nous voyons là l’utilité de pousser plus avant les investigations

dans le domaine des interactions intercellulaires concernant ces deux espèces.

VVII .. LL eess ppuucceess àà AADDNN

L’étude des communautés microbiennes soulève la question de leur composition, de

leur structure, de leur stabilité, de l’activité et de la fonction de chacun des microorganismes

qui la compose. Des outils sont à notre disposition pour répondre au mieux à chacune de ces

interrogations.

La physiologie cellulaire est le résultat d’un enchevêtrement complexe de réactions

biochimiques. Cette activité biochimique sert à la survie du microorganisme, et doit par

conséquent être en constante évolution face aux contraintes imposées par l’instabilité

environnementale. Les effecteurs de la réponse aux modifications du milieu extracellulaire

sont les enzymes traduits des ARN messagers, eux-mêmes transcrits à partir du génome. La


61

compréhension de la vie requiert de connecter et d’ordonner tous ces mécanismes caractérisés

individuellement. Ces éléments doivent être assemblés en un puzzle unique de plusieurs

niveaux : génome, transcriptome, protéome, métabolome. L’état du transcriptome – ensemble

des ARN d’une cellule à un instant donné – dépend des conditions physiologiques, de la

fonction et du niveau d’expression de chaque gène, ainsi que de la stabilité des ARN (Redon

et al., 2005b).

La puce à ADN est un outil performant de détection d’acides nucléiques. Le principe

des puces à ADN est le suivant : des milliers de sondes ADN ayant pour cible des gènes ou

des produits de gènes d’intérêt sont fixées sur un support solide miniaturisé, des acides

nucléiques marqués y sont hybridés, puis le signal de chaque sonde est quantifié et enregistré

par un détecteur (scanner). Il s’agit d’une version miniaturisée du northern blot qui présente

l’avantage de pouvoir porter plusieurs centaines ou milliers de sondes (Southern et al., 1999).

Il existe de nombreuses façons de préparer l’échantillon mais le schéma est toujours le même.

La première étape est l’extraction suivie de la purification des acides nucléiques, ce peut être

de l’ADN ou de l’ARN. Dans certains cas il faut procéder à une amplification de ces

fragments afin d’en augmenter la concentration. Ensuite vient le temps du marquage de

l’ADN ou de l’ARN. De nos jours l’ARN est généralement converti en ADN complémentaire

(ADNc) par une rétro-transcription. Les marqueurs peuvent être radioactifs ou fluorescents

(Shalon et al., 1996).

Au départ les puces à ADN ont été développées pour l’analyse transcriptomique des

cellules d’Arabidopsis (Schena et al., 1995). Elles ont ensuite montré leur utilité dans des

domaines variés pour détecter de nombreux types d’acides nucléiques dans le but d’étudier

l’expression génétique, de détecter des fonctions d’intérêt ou de mettre en évidence la

présence de certaines espèces dans des écosystèmes complexes.

VI.1 Puces à ADN et populations hétérogènes

En 1997, Guschin et coll. ont pour la première fois fait usage de puces à ADN en

biologie environnementale pour décrire la composition de communautés microbiennes. Leur

puce était constituée de 9 sondes ayant pour cible des ARNr 16S de bactéries nitrifiantes

(Guschin et al., 1997). Depuis, le champ d’application de cette technologie n’a cessé de

s’étendre notamment pour l’étude des écosystèmes. Pour des détails sur l’application des


62

puces à ADN en écologie microbienne voir les articles de Ye et al. (2001), Dorigo et al.

(2005) et Wagner et al. (2007).

De nos jours, les puces à ADN ont deux applications principales en écologie

microbienne : la détection d’espèces grâce aux phylo-chips (phylogenetic oligonucleotide

arrays) et aux CGA (community genome arrays) et la mise en évidence de fonctions

métaboliques d’intérêt dans des communautés microbiennes grâce aux FGA (functional gene

arrays) (Wagner et al., 2007).

VI.1.1 Puces dédiées à la détection d’espèces

Deux types de puces peuvent servir à la détection d’espèces microbiennes. Les CGA

(community genome arrays) sont conçues sur la base de tout l’ADN génomique isolé de

cultures pures. Ces puces sont efficaces et relativement spécifiques mais sont limitées à la

détection d’espèces cultivables. Les phylo-chips (phylogenetic oligonucleotide arrays) ciblent

des fragments de gènes codant des ARNr amplifiés par PCR ou directement des gènes

d’ARNr extraits de la population microbienne. Leur utilisation permet, au moins en théorie,

de détecter n’importe quel microorganisme pour peu que les sondes soient conçues dans cette

optique (Guschin et al., 1997). Ainsi la diversité des communautés microbiennes a pu être

évaluée grâce à des puces à ADN à partir d’échantillons de l’environnement (Castiglioni et

al., 2004; Small et al., 2001). Certaines de ces puces sont constituées de plus de 30 000

sondes et sont à même d’assurer la détection de nombreux microorganismes (Wilson et al.,

2002).

VI.1.2 Puces dédiées à l’analyse transcriptomique

VI.1.2.1 Functionnal gene array

Les « FGA » (functional gene arrays) détectent certains gènes ou familles de gènes qui

codent des enzymes clés de certaines voies métaboliques (Dennis et al., 2003; Schadt et al.,

2005 ; Taroncher-Oldenburg et al., 2003). Naturellement l’analyse est alors réduite à des

fonctions très précises de certains microorganismes comme par exemple les bactéries oxydant

le méthane (Bodrossy et al., 2003; Stralis-Pavese et al., 2004). D’autres articles décrivent des


63

puces dédiées à la détection de quelques gènes du cycle de l’azote dans l’environnement – les

sondes ciblent les gènes nirS et nirK codant pour des nitrite réductases, amoA codant une NH3

mono-oxygénase, et pmoA codant pour une méthane mono-oxygénase (Tiquia et al., 2004;

Wu et al., 2001). Taroncher-Oldenburg et al. (2003) ont également appliqué cette technologie

pour l’étude de la diversité fonctionnelle des gènes du cycle de l’azote de l’environnement.

Un article récent décrit la conception, le développement et l’application d’une FGA portant

des sondes ciblant 1961 gènes métaboliques. Cette puce contient des oligonucléotides de 50

pb complémentaires de gènes bactériens impliqués dans la décomposition de la matière

organique, la fixation du carbone, la résistance aux métaux, ainsi que dans les cycles de

l’azote, du soufre, et du phosphore (Zhang et al., 2007). D’autres articles décrivent des

méthodologies d’utilisation de PhyloChips ou de FGA pour l’étude fonctionnelle des

communautés microbiennes (Adamczyk et al., 2003; Dennis et al., 2003; Rhee et al., 2004).

Une méthode consiste par exemple à exposer les microorganismes à un substrat carboné

marqué et à mesurer le taux d’incorporation du marqueur dans les ARN ribosomaux

(Adamczyk et al., 2003; Wagner et al., 2006).

Ces études sont réalisées avec des communautés microbiennes très complexes,

comportant de nombreuses espèces, et fournissent des informations utiles pour la description

de la structure de la population et de diverses activités fonctionnelles. Cependant ces études

sont restreintes à la détection d’espèces, ou d’un nombre réduit de gènes, et jamais à la

quantification du niveau de transcrit de la totalité d’un génome. De plus les méthodes

employées ne permettent pas de définir clairement le rôle de chaque espèce dans la

communauté. L’activité observée provient-elle d’une espèce unique ou de plusieurs espèces

simultanément ?

VI.1.2.2 Puces pan-génomique

Il existe des puces à ADN pan-génomiques comportant des milliers de sondes ciblant la

totalité des gènes d’une espèce. Ainsi permettent-elles de caractériser l’évolution du niveau de

transcrits de chaque gène en fonction des changements de conditions expérimentales et

d’apporter une vision globale de l’activité de la cellule au niveau du transcriptome (de Saizieu

et al., 1998; DeRisi et al., 1997; Lockhart et al., 1996). Ces puces sont utilisées en routine

dans les laboratoires avec des cultures pures en utilisant diverses méthodologies. Par exemple


64

elle peuvent être employées pour caractériser des mutations : les transcrits d’un mutant et

ceux d’une souche sauvage, cultivés dans les mêmes conditions sont hybridés sur la puce

(Oshima et al., 2002 ; Wernisch et al., 2002). D’autres études sont réalisées avec une seule

souche, pour laquelle les conditions de culture ont été modifiées, l’objectif étant de visualiser

les modifications transcriptomiques en fonction des conditions environnementales (Even et

al., 2001; Stanley et al., 2003). Mais l’utilisation de puces pan-génomiques en véritables

cultures mixtes est encore très réduite à causes d’obstacles méthodologiques, en particulier au

niveau de la spécificité d’hybridation. Les articles mentionnant de telles études sont

extrêmement rares. L’étude du transcriptome de Thermotoga maritima en coculture avec

Methanococcus jannaschii (Johnson et al., 2006) a pu être réalisée parce que les auteurs ont

eu la chance de ne pas détecter de cross-hybridations. Ils l’expliquent par le fait que les deux

espèces présentent moins de 80% d’homologie au niveau de leurs nucléotides et se réfèrent à

l’article de Wu et coll. (Wu et al., 2001). Cependant Wu et coll. n’ont pas écrit que les cross-

hybridations sont impossibles en dessous de 80% d’homologie mais qu’il est possible d’en

diminuer l’intensité (voir plus bas). De plus les deux études sont basées sur l’utilisation de

puces différentes. Par ailleurs Johnson et coll. indiquent que la concentration en

Methanococcus jannaschii était très faible dans l’échantillon en comparaison de celle de

Thermotoga maritima, et cela a indiscutablement eu une incidence sur le taux de cross-

hybridations.

VI.1.2.3 Difficultés d’utilisation des puces à ADN en culture mixte

Les obstacles à l’utilisation de puces à ADN avec des communautés microbiennes ont

été recensés par Wagner et ses collaborateurs dans un article récent (Wagner et al., 2007).

Notre cas est un peu particulier par rapport à cette étude car il ne s’agit pas d’utiliser des FGA

ou des Phylochips, mais des puces pan-génomiques. L’objectif est de mesurer spécifiquement

les abondances de transcrits de tout le génome d’une espèce issue d’une co-culture. Toutefois

certaines des difficultés d’utilisation relevées par Wagner et coll. sont transposables à notre

cas, notamment en ce qui concerne la spécificité d’hybridation. La spécificité d’association

sonde/cible dépend essentiellement du degré de divergence des séquences, toutefois il est

possible de jouer sur certains paramètres afin d’accroître la spécificité pour limiter les cross-

hybridations. Nous classerons les facteurs qui influent sur la spécificité en trois catégories : la


65

phylogénie des espèces de la population, la conception des sondes ADN, et les conditions

d’hybridations.

La phylogénie des différentes espèces qui composent la population est le cœur du

problème. La proximité phylogénétique se traduit nécessairement par une plus grande

similarité des génomes et par conséquent par des ARN ayant une plus forte homologie avec

les sondes de la puce. Il est concevable que les ADNc d’une espèce proche s’hybrident sur la

puce d’autant plus facilement que s’il s’agit d’une espèce voisine. Plus l’espèce est proche de

l’espèce pour laquelle la puce est dédiée et plus la spécificité sera faible. Par ailleurs cela peut

être utile dans certains cas au vu de l’utilisation de certaines puces pour l’étude de souches ou

d’espèces différentes de celle employée lors du design des sondes. Mais la spécificité du

signal lors de l’utilisation d’une puce pour l’étude de populations hétérogènes est

difficilement évaluable, particulièrement lorsque la composition en microorganismes de

l’échantillon n’est pas bien connue, comme par exemple pour les échantillons issus de

l’environnement. Il s’avère donc nécessaire de trouver une méthode permettant de limiter les

effets de la proximité phylogénétique.

Le design des sondes ADN est aussi très important car il définit le type et la taille de

chaque sonde, et influe donc sur la spécificité d’hybridation. Les fragments PCR ont une

grande taille, de l’ordre de 500 pb, alors que les oligonucléotides ont une taille plus modeste

de l’ordre de quelques dizaines de paires de bases. Les sondes oligonucléotidiques semblent

minimiser d’avantage les cross-hybridations que les fragments PCR (Wodicka et al., 1997).

Des études indiquent qu’un mismatch d’un seul nucléotide peut être distingué par hybridation

sur une puce à sondes oligonucléotidiques (pour revue voir (Ramsay, 1998)). Cependant,

comme une petite portion du gène est utilisée pour la détection, l’intensité du signal est

généralement plus faible et par conséquent la sensibilité est réduite (Wu et al., 2001). La

conception des sondes est généralement effectuée en regard de tout le génome de l’espèce

considérée afin que chaque spot soit spécifique d’un gène et d’un seul. Mais en cas

d’utilisation de telles puces pour des populations de plusieurs espèces, la spécificité n’est plus

garantie. Idéalement, il conviendrait de réaliser un design en prenant en compte le génome de

toutes les espèces qui composent la population. Ceci n’a à ma connaissance jamais été réalisé

pour tout un génome, vraisemblablement à cause de la nécessité de refaire un design à chaque

nouvelle population étudiée et que ce design est souvent impossible si l’on s’intéresse à des

écosystèmes aux espèces mal définies voire inconnues.


66

Enfin, la spécificité de la puce dépend aussi de la stringence d’hybridation qui peut être

accrue par le biais de l’optimisation de paramètres physicochimiques. L’élévation de la

température est généralement efficace mais atteint rapidement ses limites à partir d’un certain

degré d’homologie de séquence. Wu et al. montrent en effet que la modification de la

température n’a pas d’influence sur la spécificité d’hybridation sur leur puce au delà de 80%

d’homologie (Wu et al., 2001). Ils montrent également qu’une température supérieure à 60°C

présente l’inconvénient de conduire à une diminution importante du signal général de la puce.

De même la modification de la concentration en sels peut influer sur l’hybridation. Wu et ses

collaborateurs on par exemple testé l’effet de différentes conditions de lavage sur

l’hybridation en faisant varier la concentration en SSC de 0.01× à 0.1×. L’intensité de signal

s’accroît avec l’augmentation de la concentration en sels et l’effet de la stringence du lavage

sur l’intensité du signal semble être dépendante de la séquence. Des différences significatives

ont été observées pour différentes concentrations en sels pour des fragments qui étaient autour

de 70% d’homologie avec l’ADN cible. En revanche si l’homologie est supérieure à 80%, la

différence est très faible voire inexistante (Wu et al., 2001). Il semble donc qu’à partir d’un

certain pourcentage d’homologie entre la sonde et la cible, l’augmentation de la stringence par

la modification de la température ou de la concentration en sel soit inefficace pour réduire

significativement les cross-hybridations.

Une solution consiste à cultiver les cellules dans un appareil spécial, comme par

exemple un double bioréacteur à membranes, qui permet de séparer les biomasses tout en

mélangeant le milieu de culture grâce à un système de filtration. Ce système présente

toutefois l’inconvénient de restreindre la culture à des conditions de laboratoire. De plus le

filtre est susceptible de retenir certaines molécules qui pourraient servir de vecteur de

l’interaction. Cette difficulté peut toutefois être amoindrie en effectuant des études

préliminaires pour déterminer le type de molécules retenu par la membrane au cours du

temps.

Une autre méthode consiste à réaliser des extractions différentielles. C'est-à-dire des

extractions qui permettent de favoriser l’extraction des acides nucléiques d’une espèce par

rapport aux autres. Mais cela peut s’avérer très difficile, voire impossible dans certains cas du

fait de la complexité de la population, ou de la proximité phylogénétique des différents

microbes. De plus ce type d’extraction est généralement long, et il est connu que les ARN


67

peuvent avoir une stabilité faible (Redon et al., 2005b). Un temps d’extraction trop long peut

par conséquent induire un biais dans l’analyse transcriptomique.

Les obstacles à l’utilisation de puces à ADN pan-genomiques en culture mixte sont

nombreux et difficilement contournables. Au fil de ces pages nous discuterons de la mise en

œuvre d’une nouvelle méthodologie qui, je l’espère, en apportant une vision sous un autre

angle, permettra de mieux comprendre les interactions microbiennes.

VI.2 Recouvrement des données d’analyses transcriptomiques

Les outils et les stratégies d’analyse transcriptomique basée sur la technologie des

puces à ADN sont divers et variés. Les méthodes ne sont pas standardisées et diffèrent

souvent d’un laboratoire à l’autre. En conséquence la fiabilité et la reproductibilité des

données de puce à ADN sont souvent sujettes à caution et leur utilisation n’a pas trouvé de

consensus. Les facteurs affectant la reproductibilité des analyses transcriptomiques par

biopuce sont nombreux : plateforme technologique utilisée, reproductibilité de l’extraction et

de marquage de l’échantillon d’ARN, conditions d’hybridation, expérimentateur, traitement

statistique etc. Des articles décrivent la comparaison des données de puces à ADN avec pour

objectif d’isoler et d’estimer l’influence de certains de ces facteurs sur le taux de

recouvrement des données.

De nombreuses études ont été publiées sur la reproductibilité des données provenant

de divers types de puces commerciales et artisanales avec des résultats mitigés. Certaines

indiquent une faible concordance des résultats entre différents types de puce (Frantz, 2005;

Ioannidis, 2005; Jarvinen et al., 2004; Jurata et al., 2004; Kothapalli et al., 2002; Kuo et al.,

2002; Li et al., 2002; Marshall, 2004; Park et al., 2004; Tan et al., 2003) alors que d’autres

montrent au contraire une bonne concordance de résultats (Bammler et al., 2005; Barnes et

al., 2005; Dobbin et al., 2005; Irizarry et al., 2005; Larkin et al., 2005). Par ailleurs, Jarvinen

et coll. ont montré que les puces commerciales présentent un meilleur recouvrement de

données que les puces « artisanales » (Jarvinen et al., 2004). La plupart de ces travaux ont été

réalisés à partir des mêmes échantillons ARN.

Lorsque l’échantillon d’ARN n’est pas le même, c’est-à-dire lorsqu’il est issu d’extractions

indépendantes, le recouvrement des données est généralement diminué. Wang et coll. ont

ainsi montré que l’utilisation d’échantillons d’ARN différents était l’un des facteurs


68

principaux de la perte de recouvrement (Wang et al., 2005). D’autres auteurs ont mentionné

des différences significatives de résultats lors d’hybridations d’acides nucléiques provenant de

clones de souris, pourtant extraits dans les même conditions (Pritchard et al., 2001). Il semble

également que l’étape de marquage des ADNc soit également un facteur de variabilité

important (Ach et al., 2007). Des études se sont aussi intéressées à l’effet de

l’expérimentateur sur le recouvrement des données. Wang et coll. ont montré que le

recouvrement des données de microarrays dépend moins du type de puce utilisé que de

l’équipe qui l’utilise (Wang et al., 2005). Il semble toutefois possible de réaliser une analyse

transcriptomique complète issue de travaux indépendants de plusieurs laboratoires, à

condition que les modes opératoires techniques et statistiques soient standardisés (Dobbin et

al., 2005). Finalement, une approche efficace de comparaison inter-plateforme implique des

puces de technologies similaires, des échantillons préparés avec des méthodes identiques, et

des traitements statistiques standardisés (Severgnini et al., 2006).

Il existe de nombreuses façons de comparer les résultats issus de plusieurs analyses en

« microarray » (Kestler et al., 2005) et certains auteurs suggèrent que le choix du traitement

statistique des données ainsi que le mode de comparaison entre les résultats est fondamental

pour estimer la reproductibilité des données de biopuces (Bosotti et al., 2007). L’une des plus

simples, des plus efficaces, et des plus employée de nos jours est d’examiner le recouvrement

des listes de gènes grâce au diagramme de Venn. Cette méthode peut être utilisée pour valider

les résultats d’expériences similaires réalisées dans différentes conditions (Kestler et al.,

2005; Pirooznia et al., 2007; Shippy et al., 2004; Tan et al., 2003), ou pour comparer les

résultats issus de la même expérience mais dont les données ont subi des traitements

statistiques différents (Barbacioru et al., 2006; Jaffrezic et al., 2007).

Il est surprenant de constater que l’effet de différentes normalisations et de différents tests

statistiques sur le résultat final d’une analyse par puce à AND, c'est-à-dire dans quelle mesure

la normalisation ou le traitement statistique mènent à des divergences entre listes de gènes

sélectionnés, soit un sujet si peu abordé dans la littérature scientifique. Il n’y a pas de

consensus qui préconise une méthode de normalisation par rapport aux autres, des revues ont

simplement été publiées sur le sujet (Fujita et al., 2006; Jeffery et al., 2006). Le consortium

EADGENE a réalisé des travaux très complets sur la comparaison de l’efficacité de divers

traitements statistiques sur des données de puces à ADN simulées et réelles (de Koning et al.,

2007). Des données simulées fournies à plusieurs équipes de recherche permettaient de


69

connaitre à priori les gènes présentant une variation d’expression, et ainsi de comparer

quantitativement les différentes méthodes. La plupart des méthodes statistiques ont donné des

résultats satisfaisant, proches de ce qui était attendu à priori malgré un bruit de fond supérieur

à ce qui est normalement mesuré dans des expériences réelles. Un consensus semble avoir été

trouvé concernant la normalisation, et la plupart des équipes ont corrigé le biais de marquage

en choisissant une normalisation de type LOWESS. Par ailleurs la soustraction du bruit de

fond est apparue inutile à toutes les équipes sauf une. Evidement ce consensus reste valable

uniquement pour le jeu de donnée utilisé dans l’étude, d’autant que l’extrapolation de données

simulées à la réalité est toujours délicate. Par exemple les données simulées présentaient une

variance constante, ce qui n’est généralement pas le cas avec des données réelles (Watson et

al., 2007). Par ailleurs des données brutes issues de véritables expériences en « microarrays »

ont été fournies aux différentes équipes d’EADGENE. Le choix des méthodes de

normalisation et des traitements statistiques a mené à des divergences de résultats, les listes de

gènes avec une expression différentielle significative n’étaient pas tout à fait identiques et

dépendaient de l’approche utilisée. Cependant l’interprétation biologique et les conclusions

tirées des analyses étaient les mêmes (Jaffrezic et al., 2007). Un autre article décrit la

comparaison des performances de 5 méthodes de normalisation (quantile (Bolstad et al.,

2003)), médiane (Hartemink et al., 2001), scale (Yang et al., 2002), VSN (Huber et al., 2002)

et cyclic LOES (Yang et al., 2002) appliquées aux données de puces à ADN commerciales

(Applied Biosystems Expression Array System). Les résultats montrent une forte concordance

entre ces normalisations que ce soit au niveau du signal, de la détection, de la variation, ou du

ratio d’expression mesurés. Naturellement plus la stringence du test statistique est diminuée,

en élevant le seuil de coupure de la p-value lors du test de Student par exemple, et plus la

détection et le recouvrement des expressions différentielles sont bons, et en parallèle le

pourcentage de faux positifs est élevé (Barbacioru et al., 2006; Shi et al., 2006). En d’autres

termes le recouvrement des listes de gènes dont la variation d’expression est déclarée

significative varie en fonction de la stringence des tests statistiques. En effet la comparaison

de données issues d’expériences différentes, en l’occurrence provenant de l’hybridation sur

différents types de puces à ADN, indique que chacune des analyses donne une vision partielle

des processus biologiques concernés (Pedotti et al., 2008). Et dans les travaux qui seront

développés plus loin dans cette thèse, ou un seul type de puce à ADN a été utilisé,

l’estimation du recouvrement des données issues d’expériences différentes d’une part, et du


70

recouvrement des données issues de la même expérience d’autre part, varie en fonction de la

normalisation et des paramètres des tests statistiques. Par ailleurs malgré les divergences de

données, l’interprétation biologique reste la même (Maligoy et al., 2008b).

CChhaappii tt rr ee II II :: MM aattéérr iieell eett mméétthhooddeess

II. Matériel et méthodes

71

II .. MM iiccrr oooorr ggaanniissmmeess eett ccoonnddii tt iioonnss ddee ccuull ttuurr ee

I.1 Espèces et souches

Deux souches de lactocoques ont été utilisées au cours de ces travaux : la souche

Lactococcus lactis subsp. lactis IL1403 curée de ses plasmides et dont le génome a été

entièrement séquencé en 2001 (Bolotin et al., numéro d’accession GenBank AE005176), et la

souche industrielle Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis LD61.

La levure employée est Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D. Le génome de la souche

S288C a été séquencé en 1996 (Goffeau et al., 1996) et sert de référence pour l’ensemble des

souches de S. cerevisiae.

Deux autres souches de bactéries ont également été utilisées : Lactobacillus plantarum

WCFS1 et Corynebacterium glutamicum ATCC13032 dont les génomes ont été séquencés en

2003 (Kalinowski et al., 2003; Kleerebezem et al., 2003).

I.2 Milieux de culture

Deux milieux de culture semi-synthétiques ont été utilisés pour les travaux de l’article

(Maligoy et al. 2008a) (Tableau 1 et 2) : un milieu à base d’extrait de levure (Yeast Extract

Medium, YEM) et le milieu Luria-Bertini (LB) constitué de triptone (10g/l), extrait de levure

(5g/l), et NaCl (10g/l). La stérilisation s’effectue par autoclavage (120°C, 20minutes). Une

solution de glucose concentrée (20X) est préparée et stérilisée par autoclave à part puis

ajoutée au reste de la solution. L’ergostérol qui permet la croissance de S. cerevisiae en

anaérobiose, est instable à forte température. Il a donc été préparé à part et stérilisé par

filtration lors de son ajout au milieu de culture grâce à une seringue munie d’un filtre

Sartorius® 0,2 µm.

Le milieu de culture chimiquement défini utilisé est dérivé du milieu MCD (Poolman

and Konings, 1988). Ce nouveau milieu est de même composition que le MCD excepté qu’il

est dépourvu d’adénine, de guanine, d’uracile, et de xanthine (Tableau 2). Ce milieu contient

l’ensemble des nutriments nécessaires à la croissance de L. lactis (sucre, acides aminés,


72

vitamines, sels minéraux). Un pH de 6,6 est obtenu grâce au tampon K-phosphate dont la

concentration est augmentée 3 fois dans le cas de cultures en fioles car le pH ne peut y être

régulé. La stérilisation s’effectue par filtration grâce à des seringues munies de filtres

(Sartorius® 0,2 µm) pour les faibles volumes, ou grâce à une cartouche de filtration

Sartorius® reliée à une pompe.

Tableau 1 : Composition du milieu de culture YEM.

Tableau 2 : Composition du milieu de culture MCD. (1) concentration utilisée en fermenteur pH- régulé (entre parenthèses) ou en fiole à pH libre (sans parenthèses). (2) chacun de ces acides aminés doit être dissout séparément du reste des composés.

Composés concentration (g/l) Composés concentration (g/l)Glucose 10 MgCl2, 6 H2O 0,2Acétate de sodium 1 FeSO4, 4 H2O 0,011Citrate d'ammonium 0,6 CaCl2, 2 H2O 0,05KH2PO4 9 (3)1

ZnSO4, 7 H2O 0,005

K2HPO4 7,5 (2,5)1COCl2, 6 H2O 0,0025

Alanine 0,24 Ac. P -aminobenzoïque 0,01Arginine 0,12 Biotine 0,01Asparagine 0,34 Cyano-cobalamine 0,001Cystéine2 0,17 Ac. Folique 0,001Glutamine 0,51 Inosine 0,005Glycine 0,17 Ac. Nicotinique 0,001Histidine 0,11 Ac. Orotique 0,005Isoleucine 0,2 Pantothénate de calcium 0,001Leucine 0,47 Pyridoxamine 0,005Lysine-HCl 0,35 Pyridoxine 0,002Méthionine 0,12 Riboflavine 0,001Phénylalanine2 0,28 Thiamine 0,001Proline 0,68 Ac. D,L-6,8-thioctique 0,0025Sérine 0,34 Déoxy-thymidine 0,005Thréonine 0,23 Adénine 0,01Tryptophane 0,05 Guanine 0,01Tyrosine2 0,29 Uracile 0,01Valine 0,33 Xanthine 0,01

Composés concentration (g/l)Glucose 20KH2PO4 9

K2HPO4 7,5

MgCl2, 6H2O 0,2Yeast Extract 10Ergostérol 6.10-3


73

I.3 Conservation des souches

Lactococcus lactis IL1403 et LD61, Lactobacillus plantarum WCFS1, et

Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D ont été cultivées en milieu YEM et

Corynebacterium glutamicum ATCC13032 en milieu LB glucose. Des cellules récoltées en

phase exponentielle de croissance ont été stockées à -20 °C dans des cryotubes dans le même

milieu avec 20 % (V/V) de glycérol. Par ailleurs des colonies de Saccharomyces cerevisiae

ont aussi été conservées à 4°C sur boîte de pétri contenant du milieu YEM supplémenté en

agarose (20%).

I.4 Précultures

Les précultures de Lactococcus lactis (IL1403 ou LD61), ainsi que celles de

Lactobacillus plantarum WCFS1 ont été réalisées dans des fioles stériles serties avec un

bouchon de butyle imperméable à l’oxygène, préalablement dégazées à l’azote et autoclavées

(121 °C, 20 min). Les précultures de Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D ont été

réalisées dans des erlenmeyers cotonnés.

Les précultures ont été faites dans le milieu approprié : YEM pour l’étude de

spécificité des puces à ADN en culture mixte ainsi que pour la caractérisation de la réponse de

Lactococcus lactis IL1403 face à Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D (Maligoy et al.,

2008) ; MCD et MCDSB filtrés stérilement avec des filtres Sartorius 0,22 µm pour la partie

consacrée au comportement transcriptomique de L. lactis LD61 cultivé avec S. cerevisiae.

Lors des précultures le milieu MCDSB a toujours été employé avec une concentration de

tampon K-phosphate accrue de façon à limiter l’acidification du milieu (Tableau 2).

Les précultures de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 ont été réalisées dans des

erlenmeyers cotonnés contenant du milieu LB glucose et stérilisés par autoclavage (121 °C,

20 min).

Pour la préculture initiale de bactéries (Lactococci, Lactobacillus, Corynebacterium),

une fiole fut ensemencée à 1,5 % V/V à partir du stock glycérolé et incubée à 30 °C sous

agitation. Pour la préculture initiale de levures (Saccharomyces), un erlenmeyer est

ensemencé à partir d’un clone sur boite de pétri et incubée à 30 °C sous agitation. Une


74

nouvelle fiole ou un nouvel erlenmeyer est ensuite ensemencé avec les cellules en phase

exponentielle de croissance ainsi obtenues. Cette opération est répétée de façon à avoir un

volume nécessaire jusqu’à inoculation de la culture en fermenteur. Les niveaux d’inoculation

et les durées des précultures successives sont ajustés pour que les cellules soient en phase

exponentielle de croissance lors des inoculations ultérieures.

Les cellules issues de la dernière préculture sont directement inoculées dans le

bioréacteur à un volume ajusté afin d’obtenir la concentration initiale de biomasse désirée.

I.5 Cultures discontinues en bioréacteur

Les cultures décrites dans l’article (Maligoy et al., 2008a) ont été réalisées en

bioréacteurs de 2L (Sétric, génie industriel Toulouse) dans du milieu YEM. Un module Sétric

permet de réguler les différents paramètres environnementaux. L’agitation fut fixée à 250 rpm

et la température maintenue constante à 30 °C par une résistance chauffante et un circuit de

refroidissement par circulation d’eau. Le pH fut régulé à 6,6 par ajout automatique de KOH

10 N. Une surpression d’azote de 20 mbar a été maintenue au cours de la culture.

Pour le même article des cultures Corynebacterium glutamicum ATCC13032 ont été

réalisées avec le même appareil, la même température, et le même système de régulation du

pH. Cependant, à cause des exigences particulières de Corynebacterium, la culture a été

réalisée en milieu LB avec une aération maintenue par l’injection d’air comprimé dans le

milieu.

Dans le deuxième article (Maligoy et al., 2008b) les cultures ont été conduites en

MCD dans les mêmes fermenteurs. L’agitation et la température furent maintenues à 850 rpm

et à 30 °C. Le pH fut régulé à 6,6 par ajout automatique de KOH 10 N avant la carence en

glucose (accumulation de lactate et d’acétate dans le milieu). Ensuite, durant la phase de

croissance oxydative de la levure (consommation du lactate et d’acétate), la régulation du pH

(6,6) fut faite par ajout automatique d’acide ortho-phosphorique. L’aération a été réalisée

grâce à l’injection d’air comprimé dans le milieu au cours du procédé.


75

II II .. TTeecchhnniiqquueess aannaallyytt iiqquueess

II.1 Mesure de la concentration en biomasse

II.1.1 Turbidimétrie

La densité optique (DO) a été mesurée à 580 nm à l’aide d’un spectrophotomètre

(Hitachi U1100). Lorsque nécessaire, les échantillons furent dilués dans de l’eau pour rester

dans la gamme de linéarité de l’appareil (DO < 0,6).

II.1.2 Gravimétrie

La biomasse contenue dans un volume connu d’échantillon a été déterminée par pesée

après filtration sur une membrane de porosité 0,45 µm, lavage des filtres et séchage à l’étuve

sous vide (200 mbar, 60°C) pendant 24 heures. La masse sèche a été déterminée par

différence entre les masses du filtre avant et après filtration de l’échantillon.

II.1.3 Comptage des colonies sur boites de pétri

Des étalements sur boite de pétri contenant du YEM (Tableau 1) supplémenté en

agarose 20% ont été réalisés au cours des cultures en fermenteur. Chaque prélèvement de

culture a été dilué de dix en dix dans de l’eau physiologique stérile (NaCl 9 g.l-1) dans des

tubes eppendorfs stériles, puis 100 µl ont été déposés et étalés avec des billes de verre

stérilisées par autoclavage (121 °C, 20 min) sous une hôte à flux laminaire. La dilution

adéquate fut choisie de telle sorte que l’on puisse compter entre 30 et 300 colonies sur chaque

boite. Par sécurité, un encadrement de cette dilution fut réalisé avec les dilutions supérieures

et inférieures. Le comptage fut effectué après une incubation de 48h00 à 30°C. La

morphologie des colonies a permi de différentier les espèces : colonies blanches, translucides

et petites pour Lactococcus ; colonies banches, opaques, légèrement duveteuses, et grosses

pour Saccharomyces.


76

II.1.4 Relation DO/masse sèche/UFC

L’hétérogénéité des cultures mixtes rend difficile l’estimation de la biomasse de chaque

espèce séparément. Pour résoudre ce problème une corrélation DO/masse sèche/UFC (Unité

Formant une Colonie) a été établie pour chaque souche dans les deux milieux de culture :

0,30 g.l-1/uDO580/7.109 cfu.ml-1 pour la souche de L. lactis IL1403 en YEM

0,24 g.l-1/uDO580/5.107 cfu.ml-1 pour la souche de S. cerevisiae CEN.PK113-7D en YEM

0,30 g.l-1/uDO580/5.109 cfu.ml-1 pour la souche de L. lactis LD61 en MCDSB

0,25 g.l-1/uDO580/8.107 cfu.ml-1 pour la souche de S. cerevisiae CEN.PK113-7D en MCDSB

II.2 Dosage des métabolites extracellulaires

II.2.1 Dosage des substrats et produits de fermentation

Des prélèvements de culture sont effectués toutes les 30 minutes au cours du procédé de

fermentation, centrifugés 3 minutes à 10000 rpm et le surnageant est conservé à –20°C. Au

moment de l’analyse en chromatographie les échantillons sont décongelés sur glace. Pour les

échantillons de culture en milieu YEM, les protéines sont précipitées avec une solution

d’hydroxyde de baryum 0,3 M et de sulfate de Zinc 0,3 M et le surnageant est transféré dans

des vials. Pour les échantillons de culture en milieu MCDSB les échantillons sont filtrés à la

seringue avec des filtres Minisart 0,2 µm (Sartorius®). Les concentrations en glucose, lactate,

formiate, acétate, éthanol et glycérol sont mesurées en chromatographie en phase liquide à

haute pression (HPLC). Le système d’HPLC (Hewlett Packard series 1050) est équipé d’un

passeur automatique (Waters 717 Autosampler), d’une précolonne (Biorad Microguard) et

d’une colonne de type H+ (Biorad HPX87H) qui effectue une séparation par échange d’ions

et exclusion. L’analyse des échantillons est réalisée à 48 °C et un débit d’éluant (H2SO4 5

mM) de 0,5 ml.min-1. La détection est assurée par un spectrophotomètre UV (Perkin Elmer

LC90Bio) à 210 nm pour le lactate, l’acétate et le formiate et par un réfractomètre (Hewlett

Packard series 1047A) pour le glucose et l’éthanol, tous deux branchés en série. Les


77

concentrations de ces composés dans les surnageants de culture sont déterminées grâce au

dosage de solutions étalons.

II.2.2 Dosage des nucléobases

La concentration en bases azotées dans le surnageant de culture a été mesurée en HPLC

par la méthode décrite par Loret et al. (2007).

II II II .. PPrr ééppaarr aatt iioonn ddeess aacciiddeess nnuuccllééiiqquueess eett uutt ii ll iissaatt iioonn ddeess

ppuucceess àà AADDNN

III.1 Extraction de l’ARN total

Des échantillons de culture sont prélevés, congelés dans l’azote liquide (5 aliquots de

culture sont systématiquement recueillis), et conservés à -20 °C jusqu’au cassage des cellules.

Tous les outils employés lors du cassage sont préalablement nettoyés avec une solution

RNase Away® et stockés dans l’azote liquide jusqu’à leur utilisation. Les cellules sont

décongelées à 4 °C et un volume correspondant à 6 mg de masse sèche est centrifugé (4800

rpm, 5 min, 4 °C). Le culot est repris dans 100 µl d’eau autoclavée (121 °C, 20 min) et

transféré dans un tube eppendorf stérile à fond rond que l’on plonge immédiatement dans

l’azote liquide. Le glaçon est déposé dans un récipient contenant une bille en téflon grâce à

une spatule. Le récipient est placé dans le MikroDismembrator® programmé pour effectuer 1

cycle de 2 minutes à 2600 rpm. La poudre obtenue est transférée encore gelée dans un tube

falcon® de 15ml stérile contenant 4ml de tampon RLT (Tampon de lyse RNeasy Qiagen

Midikit®). La purification se réalise avec le kit d’extraction RNeasy Qiagen Midikit® en

suivant les instructions du fournisseur. Ce protocole comporte une étape de précipitation

d’éventuels débris cellulaires, puis l’application de l’échantillon sur colonne de silice suivi

d’étapes de lavage avant l’élution réalisée avec 250 µl d’H2O autoclavée (121 °C, 20 min).

Un traitement à la DNase I (Qiagen) est inclus lors de la procédure d’extraction pour éliminer

l’ADN génomique, car nous avons observé que la présence d’ADNg affecte la qualité des


78

hybridations ultérieures en causant des hybridations non spécifiques. Des aliquots de 50 µl

sont entreposés à –20°C.

L’ARN total obtenu est quantifié par mesure de l’absorbance à 260 nm (DO260) après

dilution adéquate de l’ARN dans de l’eau pour rester dans la gamme de linéarité du

spectrophotomètre (Hewlett Packard 8453, DO < 0,6). La concentration d’ARN (µg.µl-1) est

obtenue grâce à la relation suivante : [ARN] = DO260 × 0,04 × facteur de dilution. La pureté

de l’ARN est vérifiée par mesure de l’absorbance à 280 nm (1,8 < DO260/DO280 < 2)..

La qualité de l’ARN est vérifiée par deux méthodes. La première consiste à faire migrer

l’extrait par électrophorèse dans un gel en conditions dénaturantes. Un volume d’ARN

équivalent à 2 µg est incubé pendant 15 min à 65 °C avec 5 µl de solution dénaturante

(MESA 1,3 X, 21 % (V/V) formaldéhyde 37 %, 64 % (V/V) formamide, BET 0,17 mg.ml-1)

puis rapidement refroidi dans la glace. L’échantillon est déposé avec 1,5 µl de tampon de

charge (tampon Na-phosphate (10 mM, pH 7), bleu de bromophénol 2 g.l-1) sur un gel

d’agarose (1 % P/V) contenant 3,3 % (V/V) de formaldéhyde 37 % et 10 % (V/V) de MESA

10X. La migration est réalisée à 4 °C dans un tampon MESA 1X pendant 30 min à 100 V. Les

bandes d’acide nucléique sont révélée sous ultra-violet. La deuxième consiste à utiliser le

système d’électrophorèse miniaturisé du Bioanalyzer Agilent® comme décrit par le

fournisseur.

III.1.1 Préparation des ADNc

L’utilisation de support de type lame de verre a orienté le choix de la méthode de

marquage vers une rétro-transcription en présence de dCTP liés à des marqueurs fluorescents

: cyanine-3 (Cy3) ou cyanine-5 (Cy5). Une quantité constante d’ARN total est marquée par

un procédé direct utilisant le kit Labelstar® (Qiagen). 30 µg d’ARN total sont dénaturés et

mélangés à du tampon RT-buffer (Qiagen), une solution de dNTP (0,5 mM final de dATP,

dTTP, dCTP; 0,08 mM final de dCTP), 5 µl d’amorces aléatoires hexamères (Invitrogen), du

dCTP marqué au Cy3 ou Cy5 (0,02 mM final), 20 U de RNase inhibitor (Qiagen), et une

rétro-transcriptase Labelstar® (Qiagen). Ce mélange est incubé 2 heures à 37°C puis la

réaction est stoppée par l’adjonction de la solution LS (Qiagen). L’ADNc est purifié dans une

colonne MinElute® (Qiagen) avec un volume d’élution final de 10 µL (tampon EB Qiagen).


79

Les ADNc-Cy3 ou Cy5 sont conservés à –20°C à l’obscurité jusqu’à l’hybridation sur les

puces à ADN.

III.1.2 Extraction des ADN génomiques

Les procédés d’extraction d’ADN génomique de Saccharomyces cerevisiae,

Corynebacterium glutamicum, et Lactobacillus plantarum sont décrits dans l’article (Maligoy

et al., 2008a).

III.1.3 Hybridation et détection sur les puces à ADN

III.1.3.1 Lames de verre

L’un des objectifs de cette thèse était de développer une méthodologie applicable dans

de nombreuses circonstances avec de multiples espèces microbiennes. Par conséquent la

simplicité et l’universalité ont déterminé le choix d’un support de type lame de verre. Ce type

de puce à ADN est en effet le plus répandu et supplante peu à peu les autres modèles

(membranes de nylon). Il permet la comparaison simultanée de deux conditions avec un

marquage fluorescent moins contraignant que le marquage radioactif. Il permet en outre une

économie de sondes ADN lors de la fabrication de la puce car le volume de dépôt sur lame de

verre est réduit par rapport à celui des membranes de nylon.

Les sondes ADN sont un lot de PCR cibles conçu par la société Eurogentec

(financement Génopôle Toulouse Midi-Pyrénées en 2001). 2053 PCRs spécifiques des ORFs

de L. lactis sont disponibles, ce qui représente 89 % des séquences codantes identifiées dans

le génome (Bolotin et al., 2001). Elles présentent une taille moyenne de 535 bp et des

concentrations variant de 40 à 180 µg.ml-1. Les ORFs manquants représentent des gènes de

petite taille (< 100 bp), des gènes dupliqués dont un seul représentant a été conservé ou des

gènes pour lesquels l’amplification par PCR a échoué (73 ORFs).

Les sondes PCRs sont spottées en duplicata sur des lames de verre UltraGAPS®

(Corning) par la Plateforme Biopuces (Génopole Toulouse). Il est important de mentionner

que certains dépôts sont dépourvus de sondes ADN et ne sont composés que d’eau et de


80

DMSO : les spots ainsi formés seront appelés « vides ». Les lames de verre sont ensuite

conservées à température ambiante dans un dessicateur.

III.1.3.2 Hybridation

Les hybridations ont été réalisées en chambre automatique Discovery® (Ventana).

L’appareil est programmé pour effectuer une préhybridation suivie d’une hybridation. Les

seules interventions de l’utilisateur sont les dépôts de la solution de préhybridation et de

l’ADNc ainsi que le lavage des puces à la fin du processus. Les lames de verre sont

préhybridées avec environ 2 ml de solution (BSA 1%, SSC 2X, SDS 0,2X) déposés à la

micropipette. Après 1h20 de préhybridation à la température programmée, la solution

d’hybridation est déposée à la micropipette et l’hybridation s’opère ensuite automatiquement

pendant une durée et à une température programmées.

Le test de spécificité des puces à ADN a nécessité l’évaluation de l’effet de la

température. Pour cela des hybridations ont été réalisées pendant 8h00 à 42°C ou 47°C, et

5h00 à 50°C. Le temps d’hybridation est réduit à 5h00 car nous avons constaté l’évaporation

du liquide à la surface de la puce au delà, entraînant des problèmes de lavage et une mauvaise

qualité des signaux mesurés par la suite.

La solution d’hybridation contient 9 µg d’ADNc-Cy3 et 9 µg d’ADNc-Cy5 avec du

tampon Versarray Chiphyb® (200 µl q.s.p.). De l’ADN génomique non marqué et

partiellement digéré a aussi été ajouté sur certaines puces à 50°C pour améliorer la spécificité

d’hybridation. C’est le cas de toutes les puces ayant servi à l’étude du transcriptome (y

compris pour les hybridation en culture pure afin d’uniformiser les expériences) : 14µl

d’ADNg (environ 300 µg) sont dénaturés 10 minutes à 90°C puis stockés à 4°C puis mis en

présence des 9 µg de cDNA-cy3 et des 9 µg de cDNA cy5 pendant 10 min à Température

ambiante à l’obscurité. Le tout est déposé sur la puce avec 200 µl q.s.p. de Versarray

Chiphyb®.

Le lavage de la puce s’effectue par une agitation vigoureuse dans un falcon 50ml à

l’abri de la lumière dans du SSC 2X (Ribowash®) par deux fois, puis du SSC 0,1X (Sigma®

SSC buffer). La lame de verre est ensuite séchée par quelques secondes de centrifugation (700

rpm, 5 min).


81

III.1.3.3 Mesure de la fluorescence

La fluorescence sur les puces est mesurée à l’aide d’un scanner GenePix 4000A®

(Axon Instrument) avec deux longueurs d’onde d’excitation (540nm et 632nm) et une

résolution de 50 µm. Les images sont analysées à l’aide du logiciel GenePix®.

III.1.4 Traitement des données de puces à ADN

Le logiciel GenePix® (Axon) permet d’accéder à l’intensité de fluorescence de tous les

spots mesurée par le scanner. Les valeurs brutes des signaux, associées aux noms de gènes

correspondants, sont rendues accessibles sur le domaine utilisateur personnel du site internet

de la plateforme biopuce de toulouse (https://biopuce.insa-toulouse.fr). Les signaux sont

ensuite traités en ligne grâce au logiciel BioPlot (développé par Serguei Sokol). La

normalisation est la première étape de l’analyse et consiste à réajuster les intensités mesurées

à chaque longueur d’onde l’une par rapport à l’autre. Ensuite la comparaison du transcriptome

d’une condition test par rapport à une condition de référence est basée sur le calcul du rapport

(R) d’intensités de fluorescence verte (IY) sur rouge (IX) : R = IY / IX. Enfin différents tests

statistiques et filtres de données permettent de déterminer le degré de significativité des

variations mesurée.

III.1.4.1 Transformation logarithmique

La distribution des rapports d’intensité (R) n’est généralement pas une distribution

normale (gaussienne) avec les puces à deux couleurs. En outre il y a généralement

hétéroscédasticité (les variances dépendent d’un facteur), ce qui pose des problèmes quant à

l’application de certaines opérations et certains tests statistiques. On utilise alors les log(R)

dont la distribution se rapproche de la loi normale (distribution log normale) et qui rétablit

l’homoscédasticité.


82

III.1.4.2 Test de significativité de l’intensité de fluorescence de chaque spot

La significativité du signal de chaque spot est déterminée grâce à un seuil d’intensité

significative basée sur l’intensité de spots « vides ». Ce test est effectué avant la normalisation

pour chacune des puces indépendamment les unes des autres. Un seuil de coupure (SI) est

établi pour chaque longueur d’onde comme étant la moyenne du signal des spots vides

(log(IXvides)) plus trois écarts types (σ) :

SI = log(IXvides) + 3.σ

Les intensités supérieures à SI sont considérées comme significatives (erreur<1%). Les spots

présentant une intensité de signal non significative sont considérés comme des spots dont

l’hybridation est en deçà du seuil de détection. Ils sont en quelque sorte apparentés à des spots

« vides ». Ce test à été utilisé au préalable de la normalisation All Significant Spots Mean

(voir plus bas) à l’aide du logiciel Microsoft Excel®.

III.1.4.3 Test de spécificité d’hybridation

La spécificité d’hybridation des ADNc avec les sondes ADN de la puce est cruciale

pour un usage approprié de cet outil en culture mixte. Les effets de deux paramètres que sont

la température d’hybridation et le dépôt d’ADN génomique de l’espèce partenaire de

Lactococcus lactis sont évalués séparément.

Des prélèvements de cultures pure de Lactococcus lactis IL1403, de Saccharomyces

cerevisiae CEN.PK113-7D, de Lactobacillus plantarum WCFS1, et de Corynebacterium

glutamicum ATCC13032 sont réalisés en phase exponentielle de croissance, 3h00 après

inoculation des bioréacteurs afin d’obtenir des lots d’ARN provenant de chaque souche. Des

biopuces IL1403 sont ensuite hybridées avec les ADNc-Cy5 de IL1403 et les ADNc-Cy3

d’une autre souche. Trois répétitions ont été réalisées. Il convient ensuite de déterminer si le

signal mesuré par le scanner pour chaque spot est significatif ou non, c’est à dire si

l’hybridation est spécifique ou non. Pour cela, un seuil d’intensité minimal est calculé en se

basant sur l’intensité de fluorescence des spots vides. Ce calcul est réalisé pour chacune des

puces indépendamment les unes des autres. La normalisation n’est pas encore réalisée car elle

n’a aucun sens dans le cas où l’on espère mesurer un signal fort avec l’ADNc de L. lactis et a


83

contrario faible avec l’ADNc de l’autre espèce. Un seuil de coupure (SI) est établi pour

chaque longueur d’onde comme étant la moyenne du signal des spots vides (log(IXvides)) plus

trois écarts types (σ) :

SI = log(IXvides) + 3.σ

Les intensités supérieures à SI sont considérées comme significatives (erreur < 1%). Les spots

présentant un signal significatif avec l’ADNc de l’espèce partenaire de L. lactis sont

considérés comme cross-hybridant, c’est à dire que la sonde ADN de la biopuce n’est pas

suffisamment spécifique de L. lactis (hybridations croisées). Les spots cross-hybridant avec

l’ADNc de S. cerevisiae sont définitivement exclus des analyses de transcriptome de L. lactis

en culture mixte. Les calculs ont été réalisés à l’aide du logiciel Microsoft Excel®.

III.1.4.4 La Normalisation

Les puces à ADN utilisées sont « bicolores », c'est-à-dire que des ADN

complémentaires portant des marqueurs fluorescents (cy3 et cy5) y sont hybridés

simultanément. Il existe des biais systématiques et des biais aléatoire induisant une différence

importante d’intensité entre la fluorescence mesurée dans les deux longueurs d’ondes par le

scanner. Les biais sont liés principalement à la reproductibilité de l’extraction et de la rétro-

transcription des ARN, à la quantité d’ADNc déposé sur la puce. Plus important encore, le

cy3 et le cy5 ne réagissent pas de la même manière à l’excitation du laser du scanner car ils

n’ont pas le même coefficient d’extinction molaire, à quantité égale le cy5 émet généralement

un signal plus fort que le cy3. La normalisation a pour but de rétablir l’équilibre entre les

intensités globales des deux couleurs et de fournir une répartition symétrique des log(R)

autour de 0 La normalisation corrige les intensités d’expression par un facteur de

normalisation K, tel que pour chaque gène on obtienne une valeur normalisée dans le rouge

(NX) et dans le vert (NY) :

NX = log(IX) – KX et NY = log(IY) – KY

On calcule ensuite pour chaque gène le logarithme du ratio normalisé :

log(R) = NX – NY

Un moyen simple de vérifier l’efficacité de la normalisation est de s’assurer que les

log(R) de tous les gènes de la puce sont distribués selon une loi normale centrée sur 0. Trois


84

types de normalisations, dont les algorithmes sont utilisable en ligne sur le logiciel BioPlot (S.

Sokol, 2004-2007, http://biopuce.insa-toulouse.fr/), sont particulièrement utilisées en analyse

transcriptomiques : la normalisation par la moyenne d’intensité de tous les spots (All Spots

Mean = ASM) ou sa variante qui consiste à normaliser par la moyenne d’intensité des spots

significatifs (All Significant Spots Mean = ASSM), la normalisation LOWESS (LOcally

WEighted Scatterplot Smoothing), et la normalisation par la méthode des Quantiles. Le choix

de la normalisation est essentiel car il influe sur les tests statistiques ultérieurs (Test de

student, False Discovery Rate, etc.) et conditionne les résultats finaux.

Avec la normalisation par la moyenne d’intensité de tous les spots (All Spots Mean =

ASM) le facteur de normalisation K est la moyenne des logarithmes d’intensité (log(I)) de

l’ensemble des spots de la puce dans chaque longueur d’onde. La normalisation par la

moyenne d’intensité de tous les spots présentant une intensité significative (All Significant

Spots Mean = ASSM) est une variante de la précédente : le facteur de normalisation K est la

moyenne des logarithmes d’intensité (log(I)) des spots dont l’intensité mesurée est estimée

significative grâce à un test statistique (S. Sokol, 2004-2007, http://biopuce.insa-toulouse.fr/).

Si l’on veut tenir compte des biais de normalisation dépendant de l’intensité du signal de

fluorescence sans filtrer les données au préalable, il est possible d’employer la normalisation

LOWESS (LOcally WEighted Scatterplot Smoothing). Dans ce cas le facteur de

normalisation K est estimé à l’aide d’une régression linéaire locale. Pour simplifier il s’agit

d’un système de « fenêtre glissante » qui permet de calculer une courbe de normalisation

ajustée à la forme du nuage. La fonction LOWESS est contrôlée par un paramètre f (0<f≤1)

qui spécifie la proportion de spots définissant le voisinage (« fenêtre ») pour ajuster la droite

des moindres carrés pondérés. Généralement f est fixé à 0,4 (Clevel and Devlin, 1988 ; Yang

et al., 2002).

Une autre façon de normaliser les données en tenant compte du biais lié au marqueur est

d’utiliser la normalisation par Quantile (Bolstad et al., 2003). La normalisation par Quantile

consiste à classer la liste des spots de chaque puce par ordre d’intensité croissante, puis à

forcer toutes les listes à adopter la même distribution.


85

III.1.4.5 Le test de student

L’un des tests statistiques les plus utilisés pour l’analyse de données de puces à ADN

est le test de student. Il s’agit d’un test paramétrique comparatif qui permet de déterminer le

degré de significativité de la différence entre deux moyennes (on parle aussi de test de

conformité). Son nom vient de la loi de Student utilisée pour déterminer l'écart critique. Le

test de Student ne peut être utilisé qu'à deux conditions: les distributions des moyennes

doivent être normales, c'est-à-dire décrire une courbe de Gauss, et leurs variances doivent être

homogènes (homoscédasticité). La transformation logarithmique permet habituellement

d’obtenir une distribution normale des valeurs mesurées au scanner et de rétablir

l’homoscédasticité. La normalisation permet de centrer la distribution des log(R) autour de 0

(voir plus haut). Il s’agit ici d’évaluer la significativité de l’écart de log(R) par rapport à 0.

Une valeur statistique t (t-value) est calculée pour chaque gène:

t = |log(R)| / √(σ2/n-1)

avec log(R) = NX - NY (logarithme de ratio normalisé), σ l’écart type, et n le nombre de

répétitions. Plus la variation d’expression est significative et plus la t-value est éloignée de 0.

La t-value est comparée à la loi de student pour obtenir la valeur de probabilité p (p-value). La

p-value est la probabilité pour que t ne soit pas significativement différent de 0. Il suffit alors

de fixer une valeur critique α (en général α=0,05) et de comparer la p-value à α. Si la p-value

est inférieure à α, la variation est considérée significative (avec une erreur estimée à 5%).

Après la normalisation des données, le test de Student a été appliqué à l’aide du logiciel

BioPlot (S. Sokol, 2004-2007, http://biopuce.insa-toulouse.fr/).

III.1.4.6 Le filtre par le ratio (R)

Afin d’affiner d’avantage les résultats il est possible d’utiliser un filtre de donnée

supplémentaire en utilisant des seuils de coupure du ratio d’expression (R).

Les puces à ADN nous donnent une image déformée des variations réelles d’abondance

en ARN. De nombreux biais techniques faussent l’analyse et il faut distinguer les variations

de fluorescence mesurées sur la puce à ADN et les variations de concentration en ARN réelles

dans la cellule vivante. Nous l’avons vu, la normalisation permet de supprimer le biais de


86

fluorescence, et le test de student permet d’évaluer la significativité des variations observées.

Mais ces variations sont-elles le reflet de l’activité transcriptomique réelle dans la cellule? Et,

si c’est le cas, à partir de quelle amplitude une variation de concentration en ARN entraîne-t-

elle une véritable réponse biologique ? Il est très difficile de répondre à ces questions. C’est

pourquoi il existe un filtre de données par un seuil de coupure du ratio d’expression : des

seuils arbitraires de ratio inférieur et supérieur à 1 sont fixés. Les variations comprises entre

ces deux valeurs ne sont pas prises en compte, même en cas de succès au test de student.

Ainsi sont éliminés d'emblée les gènes dont la variation mesurée est significative mais dont la

variation de concentration en ARN n’est pas suffisamment importante pour entraîner une

réponse biologique. Le seuil de coupure du ratio d’expression a été appliqué à l’aide du

logiciel BioPlot (S. Sokol, 2004-2007, http://biopuce.insa-toulouse.fr/).

CChhaappii tt rr ee II II II :: AAnnaallyyssee ttrr aannssccrr iippttoommiiqquuee ddee LLaaccttooccooccccuuss

llaaccttiiss eenn ccooccuull ttuurr ee aavveecc SSaacccchhaarroommyycceess cceerreevviissiiaaee..

III. Analyse transcriptomique de L. lactis en coculture avec S. cerevisiae

87

Les interactions microbiennes dans les procédés de fermentation sont des phénomènes

fréquents et présentent de grands intérêts technologiques, notamment en industrie agro-

alimentaire (voir Bibliographie). Nous avons cherché à découvrir et comprendre de nouveaux

modes d’interactions entre deux espèces fréquemment rencontrées dans les mêmes

écosystèmes. Pour cela Lactococcus lactis et Saccharomyces cerevisiae ont été cultivées

ensemble dans des bioréacteurs. L’analyse des interactions cellulaires a été faite au niveau des

paramètres cinétiques de croissance et de certains métabolites extracellulaires, ainsi qu’au

niveau transcriptomique, reflet de l’expression génique.

Les puces à ADN donnent accès à la différence d’expression de chaque gène dans une

condition test par rapport à une condition de référence : c’est ce que l’on appelle le ratio

d’expression (R). Cependant leur utilisation pour l’étude transcriptomique de

microorganismes provenant de populations mixtes se heurte à de nombreux obstacles

techniques (voir Bibliographie). La principale difficulté pour utiliser les puces à ADN avec

des cultures mixtes provient des cross-hybridations des acides nucléiques de levure avec les

sondes conçue pour s’hybrider avec les ADNc de L. lactis IL1403. L’ampleur de ces cross-

hybridations, mesurée et reportée dans l’article qui suit (Maligoy et al., 2008a), est

significative et nuit gravement à l’interprétation.

La solution que nous avons élaborée pour détecter et réduire le nombre de spots cross-

hybridant ne sera pas développée ici puisqu’elle est décrite en détail dans l’article qui suit

(Maligoy et al., 2008a). Brièvement, la méthode consiste à ajouter de l’ADN génomique non

marqué de levure dans la solution d’hybridation, de la même manière qu’avec certains

protocoles d’utilisation de puces à ADN dans lesquels l’ajout d’ADN de sperme de saumon

sert à saturer les sites d’hybridation non-spécifiques. Un seuil de significativité d’intensité de

fluorescence, calculé à partir des intensités de spots vides ― constitué uniquement de tampon

(DMSO) sans sonde ADN ― a permis de mettre en évidence les spots présentant une cross-

hybridation et de les retirer des analyses ultérieures. L’ajout d’ADN génomique à permis de

réduire très sensiblement le signal provenant des cross-hybridations de la levure, rendant

possible l’utilisation de puces à ADN avec des co-cultures de Lactococcus lactis et

Saccharomyces cerevisiae. Le problème de la cross-hybridation surmonté, des mises au point

supplémentaires se sont avérées nécessaires au moment du traitement des données,

notamment concernant la normalisation.


88

En biologie, l’hypothèse généralement admise est que la majorité des gènes a une

expression stable et que les gènes sur-exprimés et sous-exprimés sont répartis de façon

symétrique de part et d’autre. Cependant de nombreux biais techniques viennent fausser

l’analyse. Lors de l’hybridation sur « microarrays », les quantités d’ADNc de l’échantillon de

référence et de l’échantillon test sont censées être identiques mais dans la pratique elles ne le

sont pas tout à fait. Ceci est d’autant plus vrai avec les ADNc provenant de cultures mixtes où

la biomasse de chaque espèce est évaluée avec une marge d’erreur importante. A cela

viennent s’ajouter les biais de reproductibilité des extractions, des rétro-transcriptions et de

l’incorporation des marqueurs fluorescents cy3 et cy5. Enfin, le cy3 et le cy5 ne réagissent

pas de la même manière à l’excitation du laser du scanner car ils n’ont pas le même

coefficient d’extinction molaire (à quantité égale le cy5 émet un signal plus fort que le cy3).

La normalisation permet de réajuster les intensités globales des deux couleurs et de fournir

une répartition normale des ratios (voir Matériels et Méthodes pour plus de détail sur la

transformation logarithmique).

0

10

20

30

40

50

60

70

-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1

log(R)

Nom

bre

de g

ènes

0

10

20

30

40

50

60

70

-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1

log(R)

Nom

bre

de g

ènes

Figure 17 : répartition du nombre de gènes en fonctions du logarithme des ratios (log(R)) avec les données brutes, non normalisées. A : hybridation des ADNc de culture pure de L. lactis IL1403 en YEM (prélèvements A et C). B : hybridation des ADNc de co-culture de L. lactis IL1403 et S. cerevisiae CEN.PK113-7D en YEM (prélèvements B et B’).

A titre d’exemple regardons la répartition de ratios (R) parmi l’ensemble des gènes

avec les valeurs brutes (non normalisées) issues d’hybridations sur des puces IL1403 dont il

est question dans l’article (Maligoy et al., 2008a) (figure 17). Pour que le test de student

puisse être utilisé, l’histogramme doit avoir l’allure d’une courbe de gauss centrée autour de 0

a b


89

(loi normale), c'est-à-dire une répartition symétrique des variations génétiques négatives

(sous-expression) et positives (sur-expression). Mais les histogrammes des données brutes ne

sont pas centrés sur 0 (figure 17). De plus l’allure de courbe avec deux « bosses » (non

gaussienne) indique clairement qu’il y a deux populations distinctes de spots qui ne donnent

pas le même type de réponse.

En effectuant la normalisation par la moyenne d’intensité de tous les spots (All Spots

Mean ou ASM : voir Matériels et Méthodes) et en traçant l’histogramme de distribution des

ratios (R), la médiane de la courbe est plus proche de 0 qu’avec les données brutes mais n’y

est pas tout à fait. Reste également la deuxième « bosse » qui correspond en réalité aux spots

vides et aux spots dont l’hybridation est si faible qu’ils peuvent être apparentés à des spots

vides. Ces spots perturbent le calcul de normalisation ASM et doivent être écartés.

Dans ce but un filtrage des données a été élaboré et appliqué avant de procéder à la

normalisation ASM. Pour cela, des seuils d’intensité de fluorescence minimale rouge (SX) et

verte (SY) ont été déterminés avant normalisation. Le choix du mode de calcul du seuil de

coupure est arbitraire. Cependant le seuil de coupure devait permettre d’éliminer le maximum

de spots sans ADN (vides et « missings ») puisqu’ils sont censés avoir un niveau

d’hybridation très faible. Le choix s’est finalement porté sur des seuils de coupure calculés en

faisant la moyenne des logarithmes des intensités des spots vides (Ivide) plus trois écarts types

(σ) :

SX = log(IXvide) + 3.σ SY = log(IY

vide) + 3.σ

L’addition de trois écart-types conduit à un niveau de confiance supérieur à 99%. Par

ce moyen nous avons mis à profit les spots vides de la puce pour calculer un seuil de

significativité et éliminer les spots non significatifs ainsi que les spots vides avant la

normalisation. Les spots pour lesquels l’intensité de fluorescence est simultanément inférieure

aux deux seuils (IX<SX et IY<SY) ont été désignés comme similaires aux spots vides et par

conséquent incorrects. Le tri des données ayant été effectué, nous avons pu procéder à la

normalisation par la moyenne d’intensité des spots présentant un signal significatif (All

Significant Spots Mean : voir Matériel et Méthode). L’histogramme représentant la répartition

des log(R) a une allure de courbe de gauss centrée sur 0 (figure 18) indiquant que la


90

normalisation est correcte. Ensuite le test de student et divers filtres ont été appliqués et

finalement l’analyse du transcriptome a été faite comme décrit dans l’article (Maligoy et al.,

2008a).

Freq

0

10

20

30

40

50

60

70

-1.50 -1.00 -0.50 0.00 0.50 1.00

log(R)

Nom

bre

de g

ènes

Freq

0

10

20

30

40

50

60

70

-1.50 -1.00 -0.50 0.00 0.50 1.00

log(R)N

ombr

e de

gèn

es

Figure 18 : répartition du nombre de gènes en fonctions du logarithme des ratios (log(R)) avec les données normalisées par ASSM. Seuls les gènes avec une intensité de fluorescence supérieure au seuil de significativité sont représentés. a : hybridation des ADNc de culture pure de L. lactis IL1403 en YEM (prélèvements A et C). b : hybridation des ADNc de co-culture de L. lactis IL1403 et S. cerevisiae CEN.PK113-7D en YEM (prélèvements B et B’).

Le plan d’expérience choisi pour l’analyse transcriptomique proprement dite consiste

en la comparaison directe du transcriptome de L. lactis en culture mixte avec S. cerevisae par

rapport à la culture pure (figure 19). Pour cette première étude nous souhaitions éviter les

variations d’expression relatives au ralentissement ou à l’arrêt de croissance pour concentrer

les recherches sur l’interaction proprement dite. D’autre part l’évaluation technique

concernant l’ajout d’ADN génomique nécessitait de simplifier le système au maximum pour

éliminer les artefacts. Par conséquent les travaux ont été focalisés sur la phase exponentielle

de croissance qui génère théoriquement peu de variations d’expression génique. Ce plan

d’expérience ne permet pas de faire l’analyse dynamique des variations d’expression génique,

mais il a l’avantage de donner un accès direct aux variations de niveau de transcrits

spécifiques de la présence de l’espèce partenaire de L. lactis, ici la levure. Pour les extractions

d’ARN des prélèvements ont été effectués en phase exponentielle de croissance en culture

pure (A, B, et C ; figure 19) et en culture mixte (B’ ; figure 19). La comparaison du

transcriptome en culture mixte par rapport à la culture pure a été réalisée en hybridant les

a b


91

ADNc provenant des prélèvements B en culture pure et B’ en culture mixte correspondant au

même temps de culture (2,5 heure). D’autre part, pour se focaliser sur les variations

spécifiques de la mixité de la population et éliminer les variations provenant d’un décalage

temporel entre les deux cultures, les prélèvements devaient être effectués au même moment

exactement. Pour tenter de minimiser un éventuel décalage entre les temps de prélèvement B

et B’, des prélèvements encadrant le moment choisi pour l’analyse (2h30, B et B’) ont été

effectués en culture pure (2h00, A et 3h00, C). Les variations mesurées entre A et C devaient

être soustraite à l’analyse des variations mesurée entre B et B’. En d’autres termes, les

variations d’expression génique provenant de l’avancement naturel de la croissance de L.

lactis ont été soustraites des analyses de l’interaction microbienne. L’interprétation biologique

est détaillée dans l’article qui suit (Maligoy et al., 2008a).

T0

A B CPhase exponentielle de croissance

B’

T0

Culture pure

Culture mixte

Phase exponentielle de croissance

Figure 19: représentation schématique de l’avancement de la culture. Les prélèvements pour les extractions d’ARN ont été effectués à 2h00, 2h30, et 3h00 en culture pure (A, B et C), et à 2h30 en culture mixte (B’). Les doubles flèches représentent les analyses comparatives effectuées par hybridation sur puce à ADN.


92


93


94


95


96


97


98


99


100


101

CChhaappii tt rr ee II VV :: II nnff lluueennccee dduu tt rr aaii tteemmeenntt ssttaatt iisstt iiqquuee ssuurr llee

rr ééssuull ttaatt ddee ll ’’ aannaallyyssee tt rr aannssccrr iippttoommiiqquuee

IV. Influence du traitement statistique sur le résultat de l’analyse transcriptomique

102

II .. II nnttrr oodduucctt iioonn

Dans l’article précédent (Maligoy et al., 2008a) nous avons surmonté un certain

nombre d’obstacles liés à l’utilisation de puces à ADN en culture mixte (cross-hybridation,

traitement des données, etc.) et nous avons eu la chance de détecter une interaction entre L.

lactis et S. cerevisiae. Cependant les conditions de cultures n’étaient pas optimales pour

favoriser l’observation d’interactions microbiennes. C’est donc naturellement que la

modification de certains paramètres techniques s’est imposée lors de la mise au point des

stratégies d’analyses ultérieures.

I.1 Nouvelle souche

Lactococcus lactis IL1403 est la souche séquencée qui a servi de référence pour

l’élaboration des sondes de la puce à ADN, mais c’est aussi une souche de laboratoire qui a

perdu une grande part de ses potentialités sauvages : incapacité à croître sur lactose, absence

de plasmides. Les chances d’observer un mécanisme d’interaction spécifique avec IL1403

étaient donc faibles, et l’utilisation d’une souche présentant un véritable phénotype sauvage

aurait permis d’augmenter les chances de détecter un mécanisme d’interaction. Les

expériences suivantes ont donc été menées avec L. lactis subsp. diacetylactis LD61 provenant

de l’industrie laitière. Cette souche, qui contient des plasmides et tous les gènes nécessaires

pour se développer et s’adapter dans le lait, est fréquemment en contact avec d’autres espèces

lors de la fabrication de produits laitiers, notamment avec des levures.

I.2 Nouvelles conditions de culture

Le milieu de culture employé précédemment (Maligoy et al., 2008a) était un milieu

riche à base d’extrait de levure, impliquant des difficultés de dosage, et une connaissance non-

exhaustive de sa composition. Pour connaître avec certitude le rôle éventuel de chaque

composé dans l’interaction un milieu de culture synthétique, comme celui employé dans les


103

expériences suivantes, était nécessaire. D’autre part l’aération continue permettait de

caractériser le comportement transcriptomique de L. lactis en aérobiose jusqu’alors jamais

étudié.

I.3 Nouvelle façon de comparer les transcriptomes

Dans l’article précédent (Maligoy et al., 2008a), la nécessité de simplifier l’analyse

pour la mise au point de la méthode a conduit à se focaliser sur la phase exponentielle de

croissance. Or, les chances d’observer des interactions microbiennes sont plus grandes

lorsque les microorganismes sont en état de stress, avec une forte concentration en biomasse

et la limitation des ressources. Par conséquent, les expériences ultérieures ont consistées à

chercher des interactions non plus en phase exponentielle de croissance mais à des moments

où la cellule n’est plus dans des conditions favorables, lors de l’arrêt de croissance et pendant

la phase stationnaire.

La précédente expérience a consisté à réaliser une comparaison directe entre la culture

pure et la culture mixte. Mais, nous l’avons vu, les variations spécifiques de l’interaction

devait être séparées des variations résultant du décalage temporel entre les prélèvements. Des

puces supplémentaires ont donc due être utilisées pour détecter les variations entre deux

prélèvements en phase exponentielle de croissance, encadrant le moment de l’analyse de

l’interaction (Maligoy et al., 2008a). Finalement cette approche est coûteuse en nombre de

puces et ne donne pas un aperçu dynamique du transcriptome. Au contraire la nouvelle

approche, décrite plus bas, permet d’économiser des puces et de réaliser une analyse

dynamique des variations d’expression génique.

Des cultures pures de L. lactis LD61 et de S. cerevisiae CEN.PK113-7D ont été

conduites en bioréacteur en parallèle de co-cultures. Pour les analyses transcriptomiques de

LD61: un prélèvement en phase exponentielle de croissance (A et A’) de chaque culture sert

de condition de référence (figure 20); un prélèvement à l’épuisement du glucose (B et

B’) ainsi qu’un prélèvement en début de phase stationnaire (C et C’) servent de conditions

tests (figure 20). Pour chaque type de culture, c'est-à-dire la culture pure de LD61 et la co-

culture, les hybridations sur les puces ont été réalisées ainsi : A avec B et A’ avec B’ d’une

part, A avec C et A’ avec C’ d’autre part ; A ou A’ servant de référence dans les deux cas


104

(figure 20). Les comparaisons doivent apporter des informations dynamiques sur la

modification d’expression génique à la fois durant l’avancement de chaque procédé

indépendamment l’un de l’autre, et aussi dans la co-culture par rapport à la culture pure. Le

différentiel d’expression entre culture pure et co-culture a pour but d’aboutir à la détection

éventuelle d’interactions entre les deux espèces au niveau du transcriptome.

T0

A B Cphase exponentielle de croissance phase stationnaire

phase exponentielle de croissance phase stationnaireT0

Culture pure

Culture mixte

A’ B’ C’

Figure 20 : représentation schématique de l’avancement de la culture. Les prélèvements pour les extractions d’ARN sont indiqués par les lettres A, B et C pour la culture pure, et A’, B’ et C’ pour la co-culture. Les doubles flèches représentent les analyses comparatives effectuées par hybridation sur puce à ADN.

I.4 Analyse quantitative des divergences de résultats en fonction

du traitement statistique

Les conditions d’hybridation de nos puces à ADN pour leur utilisation en culture

mixte ont été définies dans les travaux décrits dans l’article précédent (Maligoy et al.,

2008a). Leur originalité nous a conduit à nous poser des questions quant à la robustesse des

données obtenues, et à l’influence des traitements statistiques sur les résultats. Des études


105

mentionnent la comparaison des résultats d’un même jeu de données de biopuces ayant subi

différents traitements statistiques. Des divergences ont été décelées entre les différentes

méthodes, sans toutefois altérer l’essentiel des interprétations biologiques (voir bibliographie

et (Jaffrezic et al., 2007)). Les paragraphes qui suivent concernent les divergences

quantitatives dans les résultats de nos données traitées avec les trois méthodes de

normalisation les plus utilisées en analyse transcriptomique : ASSM qui consiste à normaliser

par la moyenne de tous les spots significatifs, LOWESS qui consiste à normaliser en faisant

des régressions linéaires locales successives pour s’affranchir du biais de marquage, et la

méthode des Quantiles qui consiste à uniformiser le signal des spots classés par ordre

d’intensité croissante et qui permet elle aussi de corriger le biais de marquage (voir matériel et

méthode). Nous avons également fait varier d’autres paramètres comme le seuil de p-value du

test de Student ou le seuil de coupure du ratio d’expression. L’influence de trois traitements

statistiques sur l’interprétation biologique proprement dite quant à elle sera détaillée plus loin,

dans l’article (Maligoy et al., 2008b).

II II .. RRééssuull ttaattss

II.1 Comparaison inter-normalisation

II.1.1 Les trois types de normalisation sont-ils adaptés ?

Un même jeu de données a été normalisé par trois méthodes (Maligoy et al., 2008a):

ASSM, LOWESS, et méthode des Quantiles. En traçant les histogrammes de distribution des

ratios il est possible de vérifier l’efficacité de chaque normalisation. Pour chaque jeu de

données, avec chaque méthode de normalisation se dessine une courbe de gauss centrée sur 0.

Les trois méthodes de normalisation semblent donc adaptées à nos données (figures 21, 22 et

23). Il semble cependant que la normalisation ASSM donne de moins bons résultats car

l’allure gaussienne n’est pas toujours très nette, notamment pour l’hybridation C/A (figure

21b).


106

0

10

20

30

40

50

60

70

-1.50 -1.00 -0.50 0.00 0.50 1.00

log(R)

Nom

bre

de g

ènes

0

10

20

30

40

50

60

70

-1.50 -1.00 -0.50 0.00 0.50 1.00

log(R)

Nom

bre

de g

ènes

0

10

20

30

40

50

60

70

-1.50 -1.00 -0.50 0.00 0.50 1.00

log(R)

Nom

bre

de g

ènes

0

10

20

30

40

50

60

70

-1.50 -1.00 -0.50 0.00 0.50 1.00

log(R)

Nom

bre

de g

ènes

Figure 21: répartition du nombre de gènes en fonction du logarithme des ratios avec les données normalisées par ASSM. a : hybridation des ADNc de culture pure de L. lactis LD61 (B vs A). b : hybridation des ADNc de culture pure de L. lactis LD61 (C vs A). c : hybridation des ADNc de co-culture de L. lactis LD61 et S. cerevisiae CEN.PK113-7D (B’ vs A’). d : hybridation des ADNc de co-culture de L. lactis LD61 et S. cerevisiae CEN.PK113-7D (C’ vs A’).

a b

c d


107

0

10

20

30

40

50

60

70

-1.50 -1.00 -0.50 0.00 0.50 1.00

log(R)

Nom

bre

de g

ènes

0

10

20

30

40

50

60

70

-1.50 -1.00 -0.50 0.00 0.50 1.00

log(R)

Nom

bre

de g

ènes

0

10

20

30

40

50

60

70

-1.50 -1.00 -0.50 0.00 0.50 1.00

log(R)

Nom

bre

de g

ènes

0

10

20

30

40

50

60

70

-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1

log(R)

Nom

bre

de g

ènes

Figure 22 : répartition du nombre de gènes en fonction du logarithme des ratios avec les données normalisées par LOWESS. a : hybridation des ADNc de culture pure de L. lactis LD61 (B vs A). b : hybridation des ADNc de culture pure de L. lactis LD61 (C vs A). c : hybridation des ADNc de co-culture de L. lactis LD61 et S. cerevisiae CEN.PK113-7D (B’ vs A’). d : hybridation des ADNc de co-culture de L. lactis LD61 et S. cerevisiae CEN.PK113-7D (C’ vs A’).

a b

c d


108

0

10

20

30

40

50

60

70

-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1

log(R)

Nom

bre

de g

ènes

0

10

20

30

40

50

60

70

-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1

log(R)

Nom

bre

de g

ènes

0

10

20

30

40

50

60

70

-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1

log(R)

Nom

bre

de g

ènes

0

10

20

30

40

50

60

70

-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1

log(R)

Nom

bre

de g

ènes

Figure 23: répartition du nombre de gènes en fonction du logarithme des ratios avec les données normalisées par Quantile. a : hybridation des ADNc de culture pure de L. lactis LD61 (B vs A). b : hybridation des ADNc de culture pure de L. lactis LD61 (C vs A). c : hybridation des ADNc de co-culture de L. lactis LD61 et S. cerevisiae CEN.PK113-7D (B’ vs A’). d : hybridation des ADNc de co-culture de L. lactis LD61 et S. cerevisiae CEN.PK113-7D (C’ vs A’).

II.1.2 Recouvrement des données entre les normalisations en fonction

de la stringence du test de Student

Le pourcentage de recouvrement des listes de gènes retenus par le test de Student avec

les trois normalisations a été obtenu en traçant des diagrammes de Venn (figures 24 et 25).

Chaque cercle représente un ensemble de gènes retenus par le test de Student avec un type de

normalisation. Les cercles se recoupent là où les ensembles sont communs : les gènes inclus

dans deux cercles appartiennent à deux ensembles simultanément, les gènes à l’intersection

des trois cercles sont retenus par le test de Student quel que soit le type de normalisation. Le

a b

c d


109

pourcentage de recouvrement des données est calculé par rapport à la totalité des gènes. Par

souci de lisibilité le diamètre des cercles est proportionnel au nombre de gènes qui composent

l’ensemble. Nous avons fait varier le seuil de p-value (α) afin d’évaluer son impact sur le

recouvrement des données en fonction de la normalisation.

Naturellement en augmentant ou en abaissant le seuil de p-value lors du test de Student

le nombre de variations considérées significatives varie en conséquence : le nombre d’ARNm

dont l’abondance varie significativement décroît avec la diminution du seuil de p-value. Pour

chaque seuil de p-value le nombre de variations considérées significatives est du même ordre

de grandeur entre ASSM et quantile, légèrement inférieur avec LOWESS (figures 24 et 25).

Par ailleurs, pour un même jeu de données traité avec les trois types de normalisation, le

pourcentage de recouvrement est d’autant plus grand que le seuil p-value est élevé.

Les données issues de l’hybridation de C vs A en culture pure traitées selon les trois

normalisations avec un seuil p-value fixé à 0,05 montrent 45% (6%+19%+3% +17%) de

gènes sur-exprimés et 64% (32%+27%+5%) de sous-exprimés communs à au moins deux

listes. 19% des gènes sur-exprimés et 32% des sous-exprimés sont communs aux trois

normalisations simultanément (figure 24). Des résultats similaires sont obtenus avec les puces

hybridées avec des ADNC d’échantillons de culture mixte : 59% (11%+1%+24%+23%) et

42% (20%+2%+11%+9%) de gènes sous-exprimés et sur-exprimés respectivement sont

communs à deux listes au moins ; 24% et 20% de gènes sous-exprimés et sur-exprimés

respectivement sont considérés significatifs quelle que soit la normalisation (figure 25).

Les hybridations de B vs A en culture pure et de B’ vs A’ en co-culture conduisent à un

faible nombre de variations significatives. Par exemple, pour un seuil de p-value fixé à 0,05,

une centaine de gènes tout au plus varient en comparaison des quelques 300 gènes des

hybridations C vs A et C’ vs A’.

Le nombre de gènes dont le ratio d’expression est significatif simultanément avec les

trois normalisations diminue lorsque le seuil de p-value diminue. Par exemple pour les gènes

sur-exprimés dans l’hybridation C vs A en culture pure le pourcentage de recouvrement entre

les trois normalisations est de 7%, 19%, 36%, et 50% avec α fixé à 0,02, 0,05, 0,10, et 0,20

respectivement (figure 24), et pour les gènes sous-exprimés dans la même expérience le

recouvrement est de 12%, 32%, 45%, et 57% pour α fixé à 0,02, 0,05, 0,10, et 0,20

respectivement (figure 24). Il en va de même pour C’ vs A’ en culture mixte (figure 25). Il


110

semble donc que le pourcentage de recouvrement entre les trois normalisations baisse avec

l’augmentation de la selectivité du test de Student.

Figure 24 : diagrammes de Venn. Les données d’hybridation des ADNc de C vs A en culture pure de L. lactis LD61 ont été normalisées par ASSM (rouge), LOWESS (vert), et Quantile (Bleu) puis soumises au test de Student en faisant varier le seuil de p-value de 0,02 à 0,2. Les cercles représentent les ensembles de gènes dont le niveau de transcrit à varié significativement. En haut les gènes sous-exprimés (-), en bas les gènes sur-exprimés (+). Le nombre de gènes est indiqué dans chaque ensemble ou sous-ensemble ainsi que le pourcentage qu’ils représentent par rapport à la totalité des gènes sélectionnés par l’ensemble des méthodes.

9 7%13

10%

1 1%

39 31%

11 9%

8 6%

46 36%

51 19%45

17%7 3%

35 13%

14 5%

16 6%

96 36%

163 36%

74 16%

8 2%

19 4%

14 3%

19 4%

159 35%

343 50%

104 15%

11 1.6%6

1%

15 2%

19 3%

182 27%

20 12%

18 11%

23 14%

74 44%

6 4%

4 2%

23 14%

96 32%

79 27%

15 5%47

16%

12 4%

45 15%

190 45%

125 29%

18 4%18

4%

17 4%

6 1%

51 12%

332 57%

97 17%

26 4%13

2%

25 4%

11 2%

80 14%

p-value<0,02 p-value<0,05 p-value<0,10 p-value<0,2

+

-


111

Figure 25 : diagrammes de Venn. Les données d’hybridation des ADNc de C’ vs A’ en co-culture de L. lactis LD61 et S. cerevisiae CEN.PK113-7D ont été normalisées par ASSM (rouge), LOWESS (vert), et Quantile (Bleu) puis soumises au test de Student en faisant varier le seuil de p-value de 0,02 à 0,2. Les cercles représentent les ensembles de gènes dont le niveau de transcrit a varié significativement. En haut les gènes sous-exprimés (-), en bas les gènes sur-exprimés (+). Le nombre de gènes est indiqué dans chaque ensemble ou sous-ensemble ainsi que le pourcentage qu’ils représentent par rapport à la totalité.

II.1.3 Recouvrement des données en fonction du seuil de coupure du

ratio d’expression

Observons les diagrammes de Venn qui comparent les ensembles de gènes dont

l’expression varie significativement dans les hybridations C vs A et C’ vs A’ (figure 26). Le

test de Student (α=0,05) sélectionne pour chaque normalisation un certain nombre de

variations significatives négatives (gènes sous-exprimés) et positives (gènes sur-exprimés).

Pour l’hybridation C/A les normalisations ASSM, LOWESS, et Quantile conduisent

respectivement à 223, 126, et 237 gènes sous-exprimés, et 208, 88, et 138 gènes sur-exprimés.

188 43%

34 15%

68 16%

37 8%

19 4%

60 14%

p-value<0,02 p-value<0,05 p-value<0,10 p-value<0,20

13 12%

17 16% 5

5%

13 12% 23

22%

35 33%

126 36%

42 12%

24 7%

9 3%

40 11%

17 5%

91 26%

306 52%90

15% 59 10%

28 5%

29 5%

77 13%

287 50%

62 11%

28 5%

2 1%

35 6%

19 3%

145 25%

9 5%

55 30%

47 25%

22 12% 25

22%

27 15%

78 24%

35 11%

75 23%70

22%

14 4%

1 1%

46 14%

51 20%27

11%24 9%13

5%

41 16%

6 2%

93 36%

+

-


112

Pour l’hybridation C’/A’ les normalisations ASSM, LOWESS, et Quantile conduisent

respectivement à 160, 168, et 258 gènes sous-exprimés, et 177, 122, et 115 gènes sur-

exprimés.

96 32%

79 27%

15 5%

47 16%

12 4%

3 1%

45 15%

71 31%

76 34%

7 3%

37 16%

2 1%

33 15%

51 19%

45 17%

7 3%

35 13%

14 5%

16 6%

96 36%

11 8%

38 28%

2 1%27

20%

2 1%

2 1%

55 40%

R<1 R<0,5

R>1 R>2

a

R<1 R<0,5

R>1 R>2

b

78 24%

35 11%

75 23%70

22%

14 4%

1 1%

46 14%

51 20%27

11%24 9%13

5%

41 16%

6 2%

93 36%

52 28%

37 20%

25 13%

43 23%

5 3%

25 13%

5 5%

17 17%

12 12%8

8%

4 4%

52 53%

Figure 26 : Les données ont été normalisées par ASSM (rouge), LOWESS (vert), et Quantile (Bleu). a : C vs A en culture pure de L. lactis LD61 ; b : C’ vs A’ en culture mixte l. lactis LD61 et S. cerevisiae CEN.PK113-7D. A gauche les gènes sont filtrés par le test de Student uniquement (α=0,05). A droite les gènes sont filtrés par le test de Student (α=0,05), et les seuils de ratio (0,5 et 2). En haut les gènes sous-exprimés, en bas les gènes sur-exprimés. Le nombre de gènes est indiqué dans chaque ensemble ou sous-ensemble ainsi que le pourcentage qu’ils représentent par rapport à la totalité.

Lorsqu’un seuil de coupure du ratio d’expression (ici R<0,5 et R>2) est appliqué en

plus du test de Student, le nombre de gènes sélectionnés est plus faible dans tous les cas.

Ainsi pour l’hybridation C/A les normalisations ASSM, LOWESS, et Quantile conduisent


Pour l’hybridation C’/A’ les normalisations ASSM, LOWESS, et Quantile conduisent


Avec les données de la culture pure (C/A) le pourcentage de recouvrement entre les résultats

issus des 3 modes de normalisation, c'est-à-dire le nombre de gènes sélectionnés par les trois

méthodes simultanément, diminue lorsque l’on applique le seuil de coupure du ratio. Ainsi

pour la culture pure (C/A) le pourcentage de recouvrement passe de 32% à 31% pour les sous-


113

exprimés, et de 19% à 8% pour les sur-exprimés, et pour la culture mixte (C’/A’) il passe de

24% à 28% pour les sous-exprimés et de 20% à 5% pour les sur-exprimés.

II.2 Comparaison inter-culture.

Les éventuels mécanismes d’interaction microbienne doivent se trouver

spécifiquement dans la culture mixte et pas dans la culture pure. Par conséquent la recherche

des variations d’expression génique liées à l’interaction doit se faire en comparant les données

provenant des deux cultures, c’est à dire que les variations simultanément détectées dans les

deux cas ne sont pas liées à l’interaction mais plutôt à la progression naturelle de la croissance

de L. lactis. Pour déterminer dans quelle mesure le traitement statistique influe sur le

recouvrement des données, les résultats des hybridations relatives aux co-cultures (C’/A’) ont

été comparés avec ceux des cultures pures (C/A) à l’aide de diagrammes de Venn (figures 27,

28 et 29). Lorsque le seuil de p-value diminue, le test est plus sélectif, le nombre de gènes

sélectionnés diminue dans les deux cultures, et le pourcentage de recouvrement diminue

également (figures 27, 28 et 29).

Dans les analyses classiques de puces à ADN, le seuil de p-value est généralement fixé

à 0,05. Détaillons davantage les résultats obtenus avec un seuil de p-value fixé à 0 ,05.

Avec la normalisation ASSM, 223 et 160 gènes sont sous-exprimés en culture pure et en

culture mixte respectivement contre 208 et 177 sur-exprimés. 29% des gènes sous-exprimés et

12% des sur-exprimés sont identiques entre les données de culture pure et de culture mixte

(figure 27).

Avec la normalisation LOWESS, 126 et 168 gènes sont sous-exprimés en culture pure

et en culture mixte respectivement contre 92 et 122 sur-exprimés. Le pourcentage de

recouvrement entre les deux conditions de culture est de 20% pour les variations d’expression

négatives et 4% pour les variations positives (figure 28).

Avec la normalisation par la méthode des quantiles 239 et 258 gènes sont sous-

exprimés en culture pure et en culture mixte respectivement contre 151 et 115 sur-exprimés.

Le pourcentage de recouvrement entre les deux conditions de culture est de 35% pour les

variations d’expression négatives et 5% pour les variations positives (figure 29).


114

Lorsqu’un seuil de coupure du ratio d’expression est appliqué en plus du test de

Student le nombre de gènes sélectionnés diminue dans tous les ensembles mais le pourcentage

de recouvrement entre culture pure et culture mixte reste équivalent (figures 30). Il faut noter

que le pourcentage de recouvrement est passé de 4% à 0% pour les gènes sur-exprimés avec

la normalisation LOWESS. Cependant cette diminution est faible puisqu’il s’agit de la perte

de seulement 9 gènes (figure 30).

Figure 27 : Les gènes avec une variation d’expression significative en co-culture (C’/A’) sont comparés avec les données de la culture pure de L. lactis LD61 (C/A). Les données ont été normalisées par ASSM, et soumises au test de Student en faisant varier α de 0,02 à 0,2. Dans la colonne de gauche les gènes sous-exprimés (-), dans la colonne de droite les gènes sur-exprimés (+). Le nombre de gènes est indiqué dans chaque ensemble ou sous-ensemble ainsi que le pourcentage qu’ils représentent par rapport à l’ensemble des gènes sélectionnés dans les deux cultures simultanément.

p-value<0,02

p-value<0,05

p-value<0,10

p-value<0,20

Culture pure Culture pure Culture mixte Culture mixte

87 29%

136 46%

73 25%

13 12%

52 47%

45 41%

221 48%

151 33%

91 20%

374 60%

146 24%

99 16%

42 12%

166 48%

135 39%

7 5%

69 53%

54 41%

127 22%

288 51%

149 26%

324 39%

324 39%

189 23%

+ -


115

Figure 28 : Les gènes avec une variation d’expression significative en co-culture (C’/A’) sont comparés avec les données de la culture pure de L. lactis LD61 (C/A). Les données ont été normalisées par LOWESS, et soumises au test de Student en faisant varier α de 0,02 à 0,2. Dans la colonne de gauche les gènes sous-exprimés (-), dans la colonne de droite les gènes sur-exprimés (+). Le nombre de gènes est indiqué dans chaque ensemble ou sous-ensemble ainsi que le pourcentage qu’ils représentent par rapport à l’ensemble des gènes sélectionnés dans les deux cultures simultanément.

Culture pure Culture mixte

p-value<0,02

Culture pure Culture mixte

p-value<0,05

p-value<0,10

p-value<0,20

48 20%

78 32%

120 49%

48 20%

78 32%

120 49%

13 10%

40 30%

81 60%

13 10%

40 30%

81 60%

109 27%

122 31%

166 42%

109 27%

122 31%

166 42%

219 38%

175 31%

175 31%

219 38%

175 31%

175 31%

9 4%

83 40%

113 55%

9 4%

83 40%

113 55%

2 3%

27 40%

39 67%

2 3%

27 40%

39 67%

43 12%

161 44%

164 45%

43 12%

161 44%

164 45%

151 25%

237 39%

218 36%

151 25%

237 39%

218 36%

+ -


116

Figure 29 : Les gènes avec une variation d’expression significative en co-culture (C’/A’) sont comparés avec les données de la culture pure de L. lactis LD61 (C/A). Les données ont été normalisées par Quantile, et soumises au test de Student en faisant varier α de 0,02 à 0,2. Dans la colonne de gauche les gènes sous-exprimés (-), dans la colonne de droite les gènes sur-exprimés (+). Le nombre de gènes est indiqué dans chaque ensemble ou sous-ensemble ainsi que le pourcentage qu’ils représentent par rapport à l’ensemble des gènes sélectionnés dans les deux cultures simultanément.

Culture pure Culture mixte Culture pure Culture mixte

p-value<0,02

p-value<0,05

p-value<0,10

p-value<0, 20

128 35%

111 30%

130 35%

128 35%

111 30%

130 35%

48 22%

87 40%

85 39%

48 22%

87 40%

85 39%

216 44%

135 27%

141 29%

216 44%

135 27%

141 29%

321 51%

147 23%

162 28%

321 51%

147 23%

162 28%

13 5%

138 54%

102 41%

13 5%

138 54%

102 41%

4 4%

58 55%

44 41%

4 4%

58 55%

44 41%

60 15%

204 50%

141 35%

60 15%

204 50%

141 35%

178 27%

286 43%

201 30%

178 27%

286 43%

201 30%

+ -


117

Figure 30 : Les données ont été normalisées par ASSM (rouge), LOWESS (vert), et Quantile (Bleu). Les données de l’hybridation de C/A en culture pure de L. lactis LD61 sont comparées avec les données de l’hybridation de C’/A’ en culture mixte L. lactis LD61 et S. cerevisiae CEN.PK113-7D. A gauche les gènes sont filtrés par le test de Student uniquement (α=0,05). A droite les gènes sont filtrés par le test de Student (α=0,05), et les seuils de ratio (0,5 et 2). Le nombre de gènes est indiqué dans chaque ensemble ou sous-ensemble ainsi que le pourcentage qu’ils représentent par rapport à la totalité.

87 29%

136 46%

73 25%

42 12%

166 48%

135 39%

75 34%

105 48%

39 18%

14 8%

92 55%

60 36%

R>1

R<1

R>2

R<0,5

R>1

R<1

R>2

R<0,5

48 20%

78 32%

120 49%

48 20%

78 32%

120 49%

9 4%

83 40%

113 55%

9 4%

83 40%

113 55%

28 21%

52 39%

54 40%

22 50%

21 50%

R>1

R<1

R>2

R<0,5

128 35%

111 30%

130 35%

128 35%

111 30%

130 35%

93 36%

99 39%

64 25%

13 5%

138 54%

102 41%

13 5%

138 54%

102 41%

7 6%

80 66%

35 28%

Culture

pure

Culture

mixte

Culture

pure

Culture

mixte

Culture

pure

Culture

mixte

Culture

pure

Culture

mixte

Culture

pure

Culture

mixte

Culture

pure

Culture

mixte

Culture

pure

Culture

mixte

Culture

pure

Culture

mixte

Culture

pure

Culture

mixte

Culture

pure

Culture

mixte

Culture

pure

Culture

mixte

Culture

pure

Culture

mixte


118

II II II .. DDiissccuussssiioonn

III.1 Contexte

Des co-cultures de Lactococcus lactis avec Saccharomyces cerevisiae ont été réalisées

dans le but d’étudier les interactions entre ces deux microorganismes grâce à la comparaison

du transcriptome de Lactococcus lactis en co-culture par rapport aux cultures pures. Au

préalable, nous avons voulu voir l’effet du traitement statistique sur le résultat de l’analyse, en

d’autres termes il s’agissait d’évaluer la robustesse des données.

III.2 Comparaison des trois méthodes de normalisation

La robustesse des données a été évaluée grâce à la comparaison des résultats issus de

données ayant été normalisées par trois méthodes (ASSM, LOWESS et Quantile). Le

recouvrement des données entre les différentes normalisations, en fonction du seuil de p-value

du test de Student et du seuil de ratio d’expression a été estimé afin d’évaluer

quantitativement l’influence du traitement statistique sur le résultat final.

Les trois types de normalisation semblent être efficaces pour établir une distribution

normale des ratios, permettant ainsi de poursuivre les analyses. Cependant la normalisation

ASSM semble moins efficace que les autres. Il est intéressant de constater que l’écart des

log(R) par rapport à 0 est moins grand dans les analyses comparatives des échantillons B vs A

et B’ vs A’ que dans C vs A et C’ vs A’. Ceci constitue un premier indice montrant que

l’amplitude de la variation d’expression par rapport à la phase exponentielle (A ou A’)

s’accentue avec le prolongement de la phase stationnaire de croissance.

Naturellement le nombre de gènes sélectionnés, c’est-à-dire pour lesquels l’abondance

de transcrit varie significativement, diminue avec l’élévation du seuil de p-value, car le test de

Student devient plus sélectif. Le recouvrement des données entre les trois normalisations

diminue également en parallèle de la diminution du nombre de gènes. Nous pouvons imaginer


119

que nous regardons les données au travers d’un tube. En changeant la méthode de calcul de

normalisation le tube change de place. En faisant varier le seuil p-value le diamètre du tube

grandit ou diminue. Il est donc logique de considérer que lorsque le tube se rétrécit, le taux de

recouvrement entre les tubes décroît.

Cependant il est important de garder à l’esprit que le test de Student ne nous donne

aucune indication sur les gènes qui ne sont pas sélectionnés, c'est-à-dire qu’il est impossible

de dire s’ils sont sur-exprimés, sous-exprimés ou stables. Le test de Student nous révèle une

partie de la réalité avec une erreur α. Plus α est faible et plus la fiabilité est grande, mais en

contrepartie plus d’information est perdue. Le compromis le plus employé de nos jours en

analyse de données d’hybridation sur puce à ADN est un seuil de coupure fixé à 5% (α =

0,05). Ce seuil donne des résultats avec une confiance de 95%.Le mode de calcul de

normalisation affecte le résultat en modifiant les listes des gènes qui ont une variation

d’expression significative puisque le recouvrement entre les trois types de normalisation est

inférieur à 100%. Mais le nombre de gènes sélectionnés reste équivalent avec les trois

normalisations si le même test statitique est utilisé (même valeur du seuil de p-value et même

valeur du seuil de ratio).

III.3 Comparaison inter-culture

L’objectif ultime de l’analyse était de détecter des interactions ente L. lactis et S.

cerevisiae au niveau de l’expression génique. Pour ce faire, les résultats des hybridations sur

puce à ADN avec les co-cultures devaient être comparés avec ceux provenant des cultures

pures. Les gènes communs aux deux conditions, c'est-à-dire dont le niveau d’expression varie

significativement simultanément en culture pure et en culture mixte ne sont pas

spécifiquement impliqués dans l’interaction cellulaire. Les gènes dont l’expression varie

uniquement dans la co-culture sont vraisemblablement spécifiquement impliqués dans

l’interaction. Les gènes dont l’expression varie significativement uniquement en culture pure

sont soit des gènes qui s’expriment seulement en culture pure et dont l’expression est éteinte

en co-culture, soit des gènes dont l’expression est équivalente dans les deux types de cultures

mais que le test statistique n’a retenu que dans la culture pure. En augmentant la stringence,


120

par la diminution de α ou l’application du seuil de coupure de R par exemple, la fiabilité des

résultats est accrue mais moins d’information est retenue.

Dans les hybridations C/A et C’/A’, quel que soit le seuil de p-value, le nombre de

gènes sur-exprimés est toujours inférieur au nombre de gènes sous-exprimés. Ceci est

vraisemblablement lié au ralentissement de croissance qui entraîne la diminution de la

concentration de nombreux ARN messagers chez L. lactis (Redon et al., 2005a). Cette

hypothèse sera validée dans l’article qui suit ce chapitre (Maligoy et al., 2008b). D’autre part

le recouvrement des gènes sur-exprimés est lui aussi toujours inférieur au recouvrement des

gènes sous-exprimés. Ceci s’explique soit par un phénomène biologique qui conduirait à une

divergence principalement pour les gènes sur-exprimés, soit par le fait que plus les ensembles

sont petits et plus le recouvrement est faible, comme c’est le cas lorsqu’on abaisse le seuil de

p-value pour rendre le test plus sélectif.

Le recouvrement des gènes sélectionnés entre culture pure et culture mixte augmente

lorsque le seuil de p-value est plus faible, c’est-à-dire lorsque le test de Student devient plus

sélectif. Ceci confirme le fait que le test de Student ne révèle qu’une partie de la réalité à

chaque fois (avec une erreur α) et indique que la distribution des p-values est

vraisemblablement indépendante du ratio.

Le pourcentage de recouvrement entre culture pure et culture mixte est du même ordre

de grandeur avec les trois normalisations, semblant indiquer une certaine robustesse du jeu de

données. A ce stade il est toutefois difficile de prévoir si les interprétations biologiques tirées

de l’analyse seraient similaires avec les trois normalisations.

III.4 Le choix de la normalisation

La normalisation globale par la moyenne de tous les spots (ASSM) présente l’avantage

d’être un calcul facile à appréhender (voir bibliographie). L’adaptation de cette méthode de

calcul avec les puces à ADN dont nous disposons donne de bons résultats en termes de

recouvrement des données avec les deux autres méthodes de normalisation. Cependant la

distribution des ratios est parfois médiocre, l’analyse est compliquée par la nécessité

d’éliminer les spots de faible intensité et la définition d’un seuil de fluorescence significative

conduit à perdre de l’information.


121

La normalisation LOWESS (voir bibliographie) fut à l’origine développée pour

corriger le biais d’intensité qui modifie la distribution des ratios. Si les difficultés que nous

avons rencontrées proviennent bien d’une mauvaise distribution des ratios, ce n’était pas

vraiment lié à un biais d’intensité mais plutôt à la présence de spots vides et de spots non-

hybridés qui constituaient un groupe indépendant du reste de la puce, pouvant perturber la

normalisation. La normalisation LOWESS est une succession de régressions linéaires locales

qui peut permettre de rétablir une distribution normale des ratios avec nos données. C’est ce

que nous avons obtenu. Toutefois, localement, il est difficile de prévoir l’influence des spots

vides sur les spots de faible intensité lorsqu’ils sont normalisés.

D’après ses auteurs la normalisation par la méthode des Quantiles montrerait de

meilleures performances que d’autres types de normalisation en termes de biais d’analyse et

de variance (voir bibliographie et (Bolstad et al., 2003)). Elle minimise aussi les biais de

saturation et de bruit de fond mais les spots d’intensité trop faibles adoptent la distribution des

autres spots et par conséquent des valeurs non significatives peuvent parfois s’élever au

dessus du bruit de fond.

Il n’existe pas à ce jour d’information qui justifie l’utilisation de l’une ou l’autre des

méthodes. La normalisation ASSM semble être la moins adaptée pour rétablir la distribution

normale des ratios d’expression avec nos données. La normalisation LOWESS et par Quantile

donnent toutes les deux une distribution des ratios correcte mais la normalisation par Quantile

permet de sélectionner systématiquement plus de gènes. La méthode de normalisation utilisée

en priorité dans l’article qui suit sera donc la normalisation par Quantile (Maligoy et al.,

2008b).

III.5 L’interprétation biologique

Le traitement statistique n’est finalement qu’un outil d’investigation mais

l’information biologique constitue le principal objectif d’une analyse de données de puce à

ADN. Il faut donc s’assurer qu’en changeant le traitement statistique, les données sont

suffisamment robustes pour conduire aux mêmes déductions. Dans l’article qui suit, une

analyse transcriptomique est réalisée avec trois méthodes de normalisation simultanément, et


122

nous montrons que les interprétations biologiques sont similaires malgré les divergences

quantitatives (Maligoy et al., 2008b).

CChhaappii tt rr ee VV :: CCoommppaarr aaiissoonn ddyynnaammiiqquuee dduu pprr ooff ii ll

tt rr aannssccrr iippttoommiiqquuee ddee LLaaccttooccooccccuuss llaaccttiiss eenn ccuull ttuurr ee ppuurr ee eett

eenn ccuull ttuurr ee mmiixxttee aavveecc SSaacccchhaarroommyycceess cceerreevviissiiaaee..

V. Comparaison dynamique du profil transcriptomique de L. lactis en culture pure et culture mixte avec S. cerevisiae

123

Comparative dynamic transcriptome profile of Lactococcus lactis in pure culture and in

mixed culture with Saccharomyces cerevisiae.

Mathieu MALIGOY, Serguei SOKOL, Muriel COCAIGN-BOUSQUET, Pascal

LOUBIERE*

Université de Toulouse; INSA,UPS,INP; LISBP, 135 Avenue de Rangueil, F-31077

Toulouse, France

INRA, UMR792 Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, F-31400 Toulouse,

France

CNRS, UMR5504, F-31400 Toulouse, France

*correspondent foot-note: e-mail: [email protected]

INSA – LISBP, 135 Avenue de Rangueil,

31077 Toulouse cedex 4, France.

Tel: (33) 561 559 465

Fax: (33) 561 559 400

Authors e-mail adresses : [email protected]

[email protected]

[email protected]

RUNNING TITLE: The mixed culture of L. lactis and S. cerevisiae

KEY WORDS : Lactococcus lactis, Saccharomyces cerevisiae, mixed culture, transcriptome,

interspecies interaction.


124

Comparative dynamic transcriptome profile of Lactococcus lactis in pure culture and in

mixed culture with Saccharomyces cerevisiae.

Mathieu MALIGOY, Serguei SOKOL, Muriel COCAIGN-BOUSQUET, Pascal

LOUBIERE*

Université de Toulouse; INSA,UPS,INP; LISBP, 135 Avenue de Rangueil, F-31077

Toulouse, France

INRA, UMR792 Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, F-31400 Toulouse,

France

CNRS, UMR5504, F-31400 Toulouse, France

ABSTRACT

Background: Since Lactococcus lactis and Saccharomyces cerevisiae often share the same

fermented food environments, the interaction mechanisms they can develop were observed

through global macro-kinetic analysis and transcriptome determination of L. lactis, in both

pure and mixed culture. Well-controlled growth conditions were used to accurately determine

the metabolic behaviour in both cultures. Moreover, contrarily to food processes, similar

biomass concentrations of both species were cultivated together in the mixed culture in order

to emphasize the possible effects of the yeast on L. lactis. Results: Thanks to the previous

development of a method enabling transcriptome analyses in mixed culture [7], the L. lactis

micro-arrays were used to analyse the dynamic profile of gene expression, from exponential

to stationary phase, in pure and mixed culture. These transcriptome data were treated with

different normalization methods to estimate their robustness. Despite some differences in the

gene list selected, the global L. lactis gene expression profile was similar in both pure and

mixed cultures, as evidenced by Wilcoxon test. The main dynamic transcriptome evolution

was the effect of glucose starvation observed in both culture. Conclusions: The method

previously described for the direct transcriptome comparison of pure and mixed culture was

used to compare global dynamic gene expression profiles. This comparative dynamic

transcriptome analysis of L. lactis grown in pure or in mixed culture with S. cerevisiae

demonstrated that L. lactis was weakly affected by the presence of the yeast.

BACKGROUND


125

More and more co-culture systems containing two microorganisms are developed for

the production of useful substances with an enhanced productivity compared with the pure

culture [1]. The advantage of these systems can involve many different factors related to the

various types of interaction mechanisms between cells living in the same habitat. Lactic acid

bacteria (LAB) and yeast often share the same environment in traditional fermentation

processes and in agro-food industries. The ability of yeasts to metabolize lactate has been

used in mixed cultures to diminish lactate concentration, thus decreasing the acid stress and

extending the growth of LAB. This strategy was particularly used for nisin production using

Lactococcus lactis [2, 3]. Apart from the positive effect of a reduction in the amount of lactic

acid by S. cerevisiae, a positive effect of yeast on the kefiran production and growth of

Lactobacillus kefiranofaciens in a mixed culture was observed [4]. It was demonstrated that

the main factor involved in the increased capsular kefiran production in the mixed culture was

physical contact between L. kefiranofaciens and the cell wall of S. cerevisiae, though the

mechanism remains unknown [5]. Another possible interaction is the sensitivity of LAB to

CO2 [6] or ethanol excreted as main products by the yeast [7], but also to other factors

required to support bacterial growth [8]. Finally, there are also reasonable clues of co-

evolution such as probable horizontal gene transfer between L. lactis and S. cerevisiae [9].

Up to now the complete genetic expression profile of microorganisms involved in

microbial interactions has been rarely investigated. This is mainly due to technical difficulties

related to the use of microarrays with mixed microbial populations. Very recently, a

methodological improvement of DNA biochip utilization was proposed in order to allow the

use of microarrays for transcriptome analysis of L. lactis in a mixed culture with S. cerevisiae

[7]. This approach enabled the global behavior of L. lactis when grown with S. cerevisiae to

be analyzed. The main result brought to light using transcriptomic analysis and confirmed

with RT-qPCR, was the inhibition of several genes of pyrimidine biosynthesis pathway by

ethanol produced by the yeast, while this effect had no consequences on the kinetics of both

species. However the analysis was done in a yeast extract containing medium where the

concentrations of nutrients were not controlled, and focused on regulation of gene expression

in exponential growth-phase only. In this work, we expected to extract more information by

studying transcriptome in all growth phases, not only in the exponential growth phase, but in

the transition between growth and stationary phase, and after several hours in the stationary


126

phase. Moreover, nutritional and environmental parameters, as well as temperature and pH,

were controlled during the cultures in order to avoid misinterpretation. Both species were

cultivated in the same reactor to enable possible contact cell-to-cell interactions to occur.

Furthermore, since the transcriptomic analysis was focused on L. lactis response to the yeast,

a 1/1 biomass concentration ratio was used in order to emphasize the possible effects of S.

cerevisiae on L. lactis compared to the normal use of these species in food bioprocesses

where yeasts are several order of magnitude less than LAB.

METHODS

Organisms and growth conditions

The microorganisms used throughout this work were Lactococcus lactis ssp. lactis

biovar. diacetylactis LD61, and Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D. They were grown

in modified chemically defined medium (CDM) [10] containing glucose (10 g.l-1), without

adenine, guanine, uracile, and xanthine, in aerobic conditions, in a 2-liters bioreactor (Setric

Génie Industriel, Toulouse, France) under continuous aeration at agitation speed of 800 rpm.

The temperature in the bioreactor was maintained at 30 °C, and the pH was maintained at 6.6

with automatic addition of KOH (10 N) and orthophosphoric acid depending on growth

phase. Each species was grown separately in pre-culture on the same medium. For the

inoculation, pre-culture cells were harvested during the exponential growth phase and

concentrated in order to obtain an initial OD580 of 0.02 and 0.1 in the bioreactor for L. lactis

and S. cerevisiae respectively.

Fermentation analysis

Bacterial growth was estimated by spectrophotometric measurement at 580 nm and

plate count on the medium used in bioreactors supplemented with agarose (20 g.l-1) (1 OD

unit was equivalent to 0.30 and 0.25 g of dry matter per liter, and to 5.109 and 8.107 cfu per

liter for L. lactis and S. cerevisiae respectively). Differences in colony morphologies enabled

the two species to be counted separately in mixed cultures. Culture samples were filtered prior

to measuring substrate (glucose) and product (lactate, formate, acetate, and ethanol)

concentrations by high-pressure liquid chromatography [11].


127

Biochips of Lactococcus lactis

L. lactis IL1403 specific PCR products (mean length 535 bp) were provided by

Eurogentec and spotted in duplicate on glass slides by the Biochips Platform (Toulouse

Génopole, France). 2003 ORFs of the 2310 identified on the genome were effectively

available.

RNA extraction

Frozen cell pellets corresponding to 6 mg dry weight were dropped into a pre-cooled 5

ml Teflon vessel. For the co-culture, the 6 mg of cell dry weight containing L. lactis and S.

cerevisiae was estimated from the plate count. A 7 mm bead made of tungsten carbide was

added. The flask was then shaken at 2600 rpm for 2 minutes into a Mikro-Dismembrator

(Braun, Melsungen). Powder was re-suspended into 4 ml of RLT buffer (Qiagen) supplied

with beta-mercaptoethanol. Following steps of RNA extraction were done according to

Qiagen RNeasy protocol including DNase I treatment. RNA quality and quantification were

analyzed using a Bioanalyser Agilent 2100 (Agilent technologies) [7].

Reverse-transcription and labeling

RNA coming from pure or mixed cultures was reverse-transcribed and labeled with a

cyanine dye (Cy3 or Cy5) in a direct process using Labelstar array kits (Qiagen). RNA (30

µg) was denatured and then combined with RT-buffer, dNTP mix (0.5 mM final for dATP,

dTTP, dCTP; 0.08 mM final for dCTP), random hexamer primers 5 µl (invitrogen), Cy3 or

Cy5-labeled dCTP (0.02 mM final), RNase inhibitor 20 units (Qiagen) and labelstar reverse

transcriptase (Qiagen). The mix was incubated 2 hours at 37 °C. The reaction was stopped by

adding LS solution (Qiagen) and cDNA was purified using MinElute columns (Qiagen). 10 µl

were collected for each reaction. Transcriptome analyses for the pure culture and the co-

culture were performed separately and compared after analyses. The samples A, B, and C

were taken respectively during exponential growth phase after 4 hours of culture (reference

sample), at the time of the glucose starvation, and during the stationary phase 4 hours after the

glucose starvation. The sample A of both types of culture served as the reference conditions.

Hybridization of labeled cDNA and scanning the glass slides

Experiments were carried out at the Biochips platform of Toulouse with an automatic

hybridization chamber (Discovery from Ventana Medical System, Inc) as described

previously [7].


128

Statistical design and analysis

Two independent cultures were used as biological replicates for each condition. Two

samples from each culture were used for independent mRNA extractions thus giving four

repetitions for each condition. These four repeated mRNA samples were labeled according to

dye-switch scheme also known as balanced block design [12]. Data were processed in the

following way. Raw spot intensities were corrected by background signal measured locally

around each spot and log-transformed. Then Quantile normalization [13] was applied.

Normalized spot log-ratios were used to calculate mean of gene replicates on each slide thus

giving four repeated log-ratios for each gene. The four repetitions were used in one-sample

Student's test at significance level 0.05. To reduce the number of false positives in Student's

test, the data were filtered beforehand by ratio with cutoff value 1.3. Beside Student's test

conducted on every individual gene, a global Wilcoxon test was applied to each functional

category defined in [14] at 0.05 level. The Wilcoxon test is different from enrichment tests

often used in transcriptome analyzes [15] in that the whole set of genes from a given category

is tested in the Wilcoxon test and not just the set of over- or under-expressed genes like it is

the case of hypergeometric, exact Fisher or other similar tests. Thus, the Wilcoxon test is

independent of results of individual tests conducted gene by gene and provides a conclusion

about global tendency of a given group to over- or under-expression. All data treatments were

done using BioPlot software developed at Biochips Platform of Toulouse http://biopuce.insa-

toulouse.fr/.

RESULTS

Metabolic analysis

In order to study the interactions between L. lactis and S. cerevisiae, the macroscopic

data from three types of culture were compared: the pure cultures of L. lactis LD61 and S.

cerevisiae CEN.PK113-7D, and the co-culture with both species sharing the same medium.

In pure culture, L. lactis LD61 exhibited an exponential growth phase with a

homolactic metabolism, producing lactate and traces amount of acetate, until the exhaustion

of glucose at 8 hours of culture (Figure 1).

In the same conditions, the growth of S. cerevisiae CEN.PK113-7D was divided in

two phases. The first one consisted in the consumption of glucose in 10.5 hours with the


129

production of ethanol via respiro-fermentative metabolism. Then a shift to respiratory

metabolism occurred and ethanol was consumed with the production of acetate until about 17

hours. After ethanol exhaustion, the production of biomass continued at the expense of acetate

until about 20 hours of culture (Figure 1).

The initial biomass concentrations in the co-culture were chosen to reach balanced

concentrations of lactococci and yeast in the early stationary growth phase. As in the pure

culture of yeast, two major steps were observed during the process. In the first one, the

biomass of both species accumulated at the expense of glucose, which was exhausted at 7

hours of culture. The metabolites formed were intermediate concentrations of lactic acid and

ethanol, and trace amounts of acetate (Figure 1). At the time of glucose exhaustion, while L.

lactis had reached the stationary growth phase, the yeast continued to build up its biomass by

the consumption of other carbon sources (Figure 1). As in pure culture, ethanol was used as a

carbon source until its exhaustion, at about 15 hours of culture. Lactic acid was also used as a

carbon source since glucose exhaustion and its concentration decreased between 7 to 35

hours. Acetate and yeast biomass were produced during this long phase while L. lactis

remained in stationary phase.

During the glucose consumption phase, the maximal specific growth rate of L. lactis

was identical in pure and mixed cultures (Table 1). Furthermore, the maximum specific rate

of lactic acid production was similar in both culture conditions. The exponential growth phase

was slightly shorter in the mixed culture than in pure cultures, since the growth rate started to

decrease at about 5.5 and 6.5 hours respectively. The maximal specific growth rate of S.

cerevisiae as well as the maximal specific production rate of ethanol was similar in pure and

mixed cultures, respectively 0.41 h-1, and around 19.5 mmol.g-1.h-1. As for L. lactis, the

exponential growth phase of S. cerevisiae was shorter in mixed culture (~ 6 hours) than in

pure culture (~ 9 hours).

L. lactis consumed the glucose at a higher maximal specific rate than the yeast, but the

biomass yield was comparable, 4.95 and 4.99 g.Cmol-1 for L. lactis and S. cerevisiae

respectively (Table 1). The yeast biomass yield on non-fermentable carbon sources, e.g.

ethanol, lactate, and acetate, was at least 5 fold higher than during the glucose consumption

phase.


130

Transcriptome analysis with Quantile normalization

The main objective of this study was to compare L. lactis LD61 behaviour during pure

culture and mixed culture with S. cerevisiae CEN.PK113-7D. Transcriptomic analysis were

performed separately for each type of culture in order to establish the kinetic behaviour. The

samples A, B and C were taken respectively in exponential growth phase (reference sample at

4 hours of culture), at the time of glucose exhaustion, and 4 hours late. Genes were classified

according to their biological functions [14]. The data were normalized using the Quantile

method, selected according to the student test and considering expression ratio (ER)

threshold. The functional analysis was performed using the Wilcoxon test to determine the

global expression change of each functional category.

Pure culture

In the L. lactis pure culture, according to Wilcoxon test, most of the functional

categories were globally under-expressed in B and C versus A (Table 2). This was true for

“biosynthesis of cofactors, prosthetic groups, and carriers”, “cell envelope”, particularly for

the subcategory concerning the genes of “murein sacculus and peptidoglycan metabolism”,

“replication”, “transcription”, “translation”, and “purines, pyrimidines, nucleosides and

nucleotides”. The categories related to “transport and binding proteins” seemed also globally

under-expressed, but only in C versus A. In the “transport and binding proteins” category, the

subcategory related to “amino acids, peptides and amines transporters” was repressed

according to the Wilcoxon test in C versus A. At the opposite, the genes belonging to “other

categories” were globally over-expressed in B and C versus A. This was mainly due to the

activation of a large number of phages and prophages (pi and ps) genes.

According to Student test, the expression level was significantly modified for 111 and

389 genes in B and C versus A respectively. For example, numerous genes from the purine

and from the pyrimidine de novo synthesis showed a significant decrease of transcript level.

While purC, purH and purl were under-expressed in B versus A, the genes purB, purC, purD,

purE, purH, purK, purL, purM, carA, carB, pyrB, pyrC, and pyrE were all under-expressed in

C versus A, together with several genes coding enzyme catalyzing reactions of the salvage

and inter-conversion pathways (see complete results on GEO database for more details). In

the subcategory related to transporters of “carbohydrates, organic alcohols and acids”, the

genes glpF1, coding a glycerol uptake facilitator, rbsC, part of the ribose transport operon


131

[16], and msmK coding a multiple sugar ABC transporter were very significantly over-

expressed in B versus A with ER of 4.56, 3.68 and 7.2 respectively. In C versus A, rbsB and

rbsD [16], part of the ribose transport operon, as well as ypcH (ER 2.00) coding a sugar ABC

transporter permease protein were also over-expressed; on the contrary rgpC (ER 0.48)

coding a polysaccharide ABC transporter permease protein [17] was under-expressed. One

should mentioned that genes coding enzymes involved in the utilization of other carbon

sources than glucose but belonging to other functional categories were also activated: rsbK

involved in the utilization of ribose [16] in B and C versus A; mtlD involved in mannitol

utilization [18], or bglA coding a 6-phospho-beta-glucosidase, in C versus A. In the “cellular

processes” category, while cell division genes, notably fts genes, were repressed in B and C

versus A, transformation genes (comGA, comGB [19]) were shown to be activated in C versus

A.

Among the regulatory genes differently expressed during the pure culture (Table 5),

purR responsible for the control of the expression of all genes of the purine de novo

biosynthesis [20] was under-expressed in B versus A, ccpA coding a well known regulator

involved in carbon starvation [21], gadR controlling osmoregulation [22], glnR regulating the

nitrogen metabolism [23], citR related to the citrate metabolism [24], and codY involved in

nitrogen starvation [25, 26], were under-expressed in C versus A. On the other hand, some

regulators showed a higher transcript level in the stationary phase compared to the reference

condition: rbsR involved in the control of ribose utilization [27], and rcfB involved in acid

adaptation [28] in B versus A; adaA a probable transcription activator of the adaAB operon

[29] involved in DNA repair mechanism, birA2 a probable repressor of the biotin operon, and

yohC known to be induced in carbon starvation in Salmonella [30], in C versus A.

Mixed culture

In the co-culture, according to Wilcoxon test, the functional categories related to

“purines, pyrimidines, nucleosides and nucleotides”, “transcription”, “translation” and the

“unknown genes” were globally under-expressed in B and C versus A (Table 2). The

“biosynthesis of cofactors, prosthetic groups, and carriers”, “cell envelope”, “fatty acid and

phospholipids metabolism”, and “transport and binding proteins” categories seemed also

globally under-expressed, but only in C versus A. In the “transport and binding proteins”

category, the subcategory related to “amino acids, peptides and amines transporters” was


132

repressed according to the Wilcoxon test in C versus A but not in B versus A. At the opposite,

the genes belonging to “other categories” were globally over-expressed in C versus A. This

was mainly due to the activation of a large number of phages and prophages (pi and ps) genes.

According to Student test, the expression level was significantly modified for 69 and

357 genes in B and C versus A respectively. As in pure culture, the genes purB, purC, purD,

purE, purH, purK, purL, purM, carA, carB, pyrB, pyrC, and pyrE from the purine and from

the pyrimidine de novo synthesis and several genes coding enzyme catalyzing reactions of the

salvage and inter-conversion pathways were under-expressed in C versus A, while purC,

purF, purH, purN and pyrG were under-expressed in B versus A. The expression of several

genes coding enzyme catalyzing reactions of the salvage and inter-conversion pathways was

also modified in B and C compared to A (see complete results on GEO database for more

details). In the “transport and binding protein” category, a large part of the genes related to the

subcategory “amino acids, peptides and amines transporters” with significant transcript level

variation encoded transporters of oligopeptide (opp and opt genes [31]) or spermidine and

putrescine (pot genes). In the “energy metabolism” category, genes involved in the synthesis

of ATP via the proton motive force (atpB, atpD, atpH [32]) and in citrate metabolism (cit

genes [33]) were under-expressed in C versus A. On the contrary, bglA (ER 2.30) coding a 6-

phospho-beta-glucosidase, xylX (ER 2.26), uxuA (ER 1.75), and malQ (ER 1.61) involved in

xylose, glucuronate and maltose utilization respectively [34, 35] were over-expressed in C

versus A. Among the regulatory genes differently expressed during the co-culture (Table 5),

purR involved in the purine metabolism [20], ccpA involved in catabolite repression [21],

gadR [22], kdgR [36] probably involved in galacturonic acid utilization and gntR involved in

gluconate utilization [37] were under-expressed in C versus A, while mtlR for the utilization

of mannitol [18], or codZ, a homologue of codY, were activated in C versus A.

Transcriptome analysis with two other normalization methods

The same raw data of mRNA abundance ratio as presented above were normalized

with two additional methods, the All Significant Spots Mean (ASSM), when the mean log-

intensity from all significant spots is used as normalization coefficient [7], and the LOWESS

[38]. The agreement between the results of these analysis expressed as the number of

significantly variable genes in the various sampling conditions was determined with Venn

diagrams (Figure 2). All the genes varied in the same way, e.g. up or down, with the different


133

normalization methods. The LOWESS and the ASSM normalizations did not result in the

same number of genes considered as positive, e.g. over- or under-expressed, with the

statistical tests (student test, ratio threshold). The gene list obtained with ASSM normalization

showed 33% to 63% of similarity with the gene list obtained with the Quantile normalization.

The LOWESS normalization gave 71% to 84% agreement with the Quantile normalization.

In order to compare the biological conclusions drawn at the functional category level

with the Quantile normalization with the two other normalization methods, the Wilcoxon test

was used. Compared to the Quantile method (Table 2), the vast majority of the functional

categories presented the same pattern according to the Wilcoxon test with both normalizations

(Table 3 and Table 4). The categories related to “unknown function”, to “translation”, and to

“purine, pyrimidine, nucleosides and nucleotides” seemed less transcribed in all conditions,

whatever the sampling time, the culture mode or the normalization method used. The group of

genes related to transporters seemed to be under-expressed in C versus A in pure and mixed

culture, with both normalizations, and also in B versus A in the mixed culture using ASSM

normalization, while only 7 genes were concerned. The subcategory concerning “phage

related functions and prophages” seemed to be over-expressed according to the Wilcoxon test

in almost every condition. The main differences between the three normalization methods

concerned the “energy metabolism” category since it seemed to be up-regulated in C versus A

in mixed culture using LOWESS, but down-regulated in C versus A in pure culture and in B

versus A in mixed culture using ASSM. The other differences were observed in groups were

the number of genes with significant expression ratio according to the Student test was low

(<13).

While 43 regulator genes were shown to vary significantly at least in one condition,

e.g. B or C versus A in pure or in mixed culture, using the Quantile normalization, 29 and 44

genes were selected using LOWESS or ASSM normalizations respectively (Table 5).

Compared with the Quantile method, 13 new genes were seen to be differently expressed with

ASSM, 2 (lacR and rarA) with LOWESS, and only 1 (yphL) with both method.


134

DISCUSSION

The aim of this work was to study the interactions between L. lactis and S. cerevisiae

by comparing in pure and mixed culture the macrokinetic behavior regarding some metabolic

features and the modification of the transcriptome of L. lactis. Gene expression profiles were

studied thanks to an innovative method able to reduce the cross-hybridization signal on the

DNA biochip [7].

The growth period in each culture started with an exponential growth phase, in which

it is considered that the environmental conditions allow the cells to grow at constant and

maximum rate. During that time the macroscopic data observed were in agreement with the

literature, and particularly the specific growth rates of the two species and their catabolic rates

[39]. Specific kinetic parameters were the same during this phase in the mixed culture and in

the pure cultures, indicating that no major interactions occurred in the co-culture.

Nevertheless some differences were observed: the glucose starvation occurred sooner in the

co-culture than in the pure cultures due to simultaneous consumption by the two

microorganisms, and all along the process, substrate and product concentrations between both

types of cultures were not the same.

During the glucose starvation, L. lactis entered in the stationary phase while the yeast

was able to grow again using other carbon sources most certainly after a shift from the

fermentation growth to the respiratory growth often encountered in Saccharomyces [40]. This

second growth phase was slightly different in pure and mixed culture: ethanol and acetate

were successively consumed to form biomass in the pure culture, while lactate produced by L.

lactis and ethanol were consumed together in the mixed culture to give biomass and acetate.

Probably acetate would have been consumed after lactate exhaustion in this culture. The

biomass yield in g of biomass per Cmole was at least 5 fold higher on the non fermentable

carbon sources than during the growth on glucose. This is not surprising since the respiratory

growth phase lead to higher biomass yield than the fermentation growth phase in yeasts due to

the better energetic yield of respiration. As a summary, while L. lactis is able to catabolize

only glucose, S. cerevisiae exhibited a complex pattern of substrate consumption since it

consumed successively glucose, then lactate and ethanol at the same time, and then acetate.

The transcriptomic analysis, though becoming more and more common, is still not a

trivial activity, a fortiori for a kinetic analysis in a mixed culture. While statistical analysis


135

using Student test to determine the significance of the results is now generally done, the

choice of the normalization method and the application of threshold ratio filter are still

relevant questions. Indeed, several treatment procedures for microarray data analysis have

emerged during the last decade but no consensus has yet been established. Modification of the

results of microarray analyses may come from the normalization method used and from the

stringency of the statistical test. In fact, the lower the stringency and the better are the

detection and the recovery of genes between microarray experiments, but the higher the false

positive rate [41-43]. Therefore, the biological information that could be retrieved from the

experiment may be dependent on the method used, i.e. is the same biological information

obtained ? To asses this point we investigated the recovery between the final results with three

normalization procedures. Globally a good agreement was obtained between the results of the

three normalizations, indicating the robustness of the data (Figure 2). Nevertheless, the

normalization by ASSM seemed to be less in agreement with the others. The Quantile and the

LOWESS normalizations presented a better agreement probably because these two methods

adjust normalization coefficients to spot intensity while ASSM uses the same correction for

all spots leaving untouched non linear distortions.

Most of the functional categories showed the same expression pattern between the

three normalization procedures and naturally led to the same biological conclusions thus

confirming that the Wilcoxon test is more robust with respect to normalization choice

compared to individual gene by gene tests. Nevertheless, some differences were observed in

categories larger than biological clusters, i.e. genes with no direct biological connections but

classified in the same group. For example, the category related to the “regulatory functions”

contains genes involved in the regulation of multiple pathways, hence not necessarily

expressed in the same way. Those groups must be taken apart and analyzed gene per gene

according to Student test.

In our experiments, using the Quantile normalization and student test as statistical

treatment, and applying a threshold ratio value, the number of significant transcript variations

was low at the time of growth arrest, and higher late in stationary phase, in pure as well as in

mixed culture. In similar conditions, Redon et al. [44] identified 704 genes which

significantly varied during glucose starvation in L. lactis IL1403. Moreover, most of the gene

expression variations were observed before glucose exhaustion, during the decelerating


136

growth phase. Similarly, the expression of 702 genes was shown to vary in L. lactis LD61

faced to acidification and temperature downshift [45]. Many factors can affect the

concordance between the results of DNA biochip experiments. The variation introduced by

RNA sample differences can provoke the diminution of data agreement [46]. The different

platforms used, e.g. two color microarrays instead of macroarrays with radioactive cDNA,

and the original hybridization procedure, e.g. in addition to labeled cDNA from L. lactis the

hybridization solution contained labeled cDNA and unlabeled genomic DNA of the yeast [7],

was with no doubt another factor of disagreement. Furthermore it could explain that only

about 70 to 110 genes were shown to vary significantly at the time of growth arrest, and

around 360 to 390 genes four hours late, and that the FDR were high in some cases. This may

indicate either a bias of the hybridization procedure in some cases, or an inadequacy of

normalization procedure with data. Nevertheless, the Quantile normalization gave satisfactory

FDR (<0.10) in C versus A in both type of culture and the three different normalizations

globally led to the same result. Moreover our interpretation could be comforted with literature

despite the lower number of gene with significant ER, particularly regarding the adaptation to

the glucose starvation and the entry in stationary growth phase [44, 45].

The rationale of the present work was to compare the kinetic profile of gene

expression in the pure and in the mixed culture, to identify the similarities, but above all, the

differences supposed to be specific for the interaction. At first sight, the concordance between

the gene lists showing significant variations in pure and mixed culture was quite low. Indeed,

using Quantile normalization, about 20% of the variable genes were the same in the pure and

in the mixed culture when comparing B to A. About 60% of the genes with significant

variation of expression were simultaneously detected in pure and mixed culture when

comparing C to A. All the genes in common varied in the same way, e.g., under or over-

expressed. For example, in C versus A analysis in the “translation” category, the common

genes with significant variation accounted for 76% of the genes in the pure culture and 79%

in the mixed culture. Another example showed that 63% of the genes with significant ER in

the subcategory related to transport of “amino acids, peptides and amines” were common in C

versus A in the pure and in the mixed culture, notably oppA (ER 0.10 and 0.13), oppC (ER

0.15 and 0.18), oppD (ER 0.32 and 0.28), oppF (ER 0.16 and 0.14), optF (ER 0.19 and 0.44),

potA (ER 0.45 and 0.27), and potD (ER 0.13 and 0.16). For some genes, a significant


137

variation of the level of transcript was observed in B versus A in the pure culture and in C

versus A in the mixed culture, as illustrated by the gene ydgC coding for an amino acid

permease (ER=0.55 and 0.60 respectively), or at the opposite in B versus A in the mixed

culture and C versus A in the pure culture like for the gene optA (ER of 0.57 and 0.18

respectively). This kind of observation should only reflect a time lag between the sampling in

the two types of culture and the stringency of our kinetic analysis. Also it should indicate that

similar patterns occurred in the two cultures, even if all the genes were not selected in each

condition. While the genes considered to be differently expressed according to Student test in

B versus A or C versus A in both culture were not strictly identical, one can consider that the

same biological processes were modified in B and in C versus A and even emphasized with

the time of cultivation (Table 2). A similar conclusion could be drawn with the Wilcoxon test,

since some categories were globally over-expressed in B versus A in the pure culture, and in

C versus A in the mixed culture, e.g. for example for the “carbohydrate transporters”

subcategory. Since our work, consisting in the comparison of close experimental conditions

but not identical, was based on independent biological replicates, this may have been a factor

diminishing the recovery between gene lists. Beside, it has been mentioned that the

microarray data issued from independent experiments may lead to a partial vision of the

biological processes concerned [47].

From a biological point of view, several variations observed in each culture could be

explained as a direct consequence of the glucose starvation and/or the entry into the stationary

phase. The level of transcript of ccpA coding the carbon catabolite repression protein was

lower in almost every condition compared to the exponential growth phase (Table 5). Various

functions are known to be either repressed or activated by CcpA, mostly in the “carbohydrate

transport and metabolism” functional category [21]. Indeed, an over-expression of several

genes coding carbohydrate transporters and enzymes involved in the utilization of sources of

carbon than glucose, e.g. glycerol, ribose, and multiple sugars (msm genes), were observed in

both culture. Others were only detected in the mixed culture such as genes related to the

metabolism of xylose, mannonate and maltose, or only in the pure culture such as genes from

mannitol and phospho-beta-glucoside utilization. These data indicated a progressive removal

of catabolite repression while glucose was exhausted.


138

In parallel, it is well known that the level of most mRNAs is generally lower in

stationary phase than in exponential growth phase [48]. Our data were in agreement with this

statement since the mRNA level related to cell envelope and fatty acid metabolism, DNA

replication, transcription (RNA polymerase), translation (ribosomal genes) and to several

amino acids transporters, notably opt and pot genes, decreased while entering in the stationary

phase. Other data linked to the entry in stationary phase and in agreement with literature were

the over-expression of multidrug resistance transporters, or the strong activation of numerous

phages and prophages genes.

The strongest similarities between pure and mixed cultures and even one of the most

obvious kinetic variation concerned genes related to the purine and pyrimidine metabolism.

The gene coding the regulator PurR seemed to be less transcribed during the stationary phase

both in pure and in mixed cultures (Table 5), as well as almost its entire regulon, i.e. genes for

purine de novo biosynthesis. In addition, the pyrimidine de novo synthesis and the nucleotides

and nucleosides inter-conversion and salvage pathways exhibited a similar pattern since

almost every gene related to this metabolism showed a lower transcript level in the stationary

phase compared to the reference. Our results indicated a progressive repression of the purine

and pyrimidine biosynthesis genes with the stationary phase of growth. The culture conditions

made those modifications predictable since adenine, guanine, uracile and xanthine were not

added to the medium. Thus L. lactis necessarily produced purine and pyrimidine via the de

novo synthesis pathways, and genes related to this metabolism were most likely actively

transcribed in exponential growth phase. Upon reaching the stationary phase, the transcription

of those genes became useless and decreased as did genes of several other aspects of

metabolism. It has been demonstrated that PurR is an activator of the purine biosynthesis gene

expression in L. lactis MG1363 [20]. Hence the concomitant under-expression of both the

activator PurR and the genes of the purine operon seemed to be logical. On the other hand,

Zomer et al. [21] observed a derepression of purine biosynthesis in L. lactis MG1363CcpA

during the transition phase from exponential to stationary phase. Moreover, the presence of

cre sites in the promoter regions and in some purine biosynthesis genes suggested a probable

direct regulation of these genes by CcpA, suggesting interactive crosstalk between carbon and

nitrogen metabolism. From these data, we could expect that a decrease in CcpA mRNA

abundance, as observed in stationary phase both in pure and in mixed culture, led to an over-


139

expression of the purine biosynthesis genes, while the opposite was observed. We could

propose then that in our conditions, the purine biosynthesis genes were under the control of

PurR but probably not of CcpA. In regard to the pyrimidine biosynthesis genes, the pyrR

regulator has been identified as an attenuator of the pyrRPB-carA operon [49]. While in the

stationary phase of our pure and mixed cultures, pyrB and carA were shown to be under-

expressed, pyrR was not selected as a significantly differently expressed gene, so no evidence

for a mode of regulation of these genes could be proposed. This apparent absence of

correlation for differential expression could simply reflect the activity of another regulator

targeting the same metabolic pathways, or the decoupling, in the time courses examined,

between the accumulation of mRNA of regulators and their protein activity.

Interesting information may be extracted from the “regulatory functions” category. In

our experiment many regulator genes were over or under-expressed in some conditions (Table

5). Since the three normalization methods gave a somewhat different list of variable regulator

genes, a focus was put on the genes which showed significant expression level variation at

least in one culture condition with the three methods, which was the case for sixteen genes

(Table 5). Nine of them appeared to be under-expressed with the three methods either in pure

or in mixed culture or both depending on the method. Since these expression variations were

observed both in pure and in mixed culture, one can consider that these genes were affected

by the stationary phase and not dependant on the interaction between microbial species. The

most obvious was the inactivation of ccpA coding the carbon catabolite control protein A only

in the stationary phase in agreement with literature [21], with the consequences on several

genes under its control as described above. The down regulation of PurR and its regulon in

both cultures is also explainable by the growth slowing-down (see above). Among the

regulator genes harboring this evolution profile, were glnR coding the GlnR regulator which

regulates some genes related to nitrogen starvation [23], gadR the activator controlling

sodium chloride induction of the gadCB operon [22], yeeG, typA, rmaG, llrD and llrF . These

two last genes are part of two-component systems, but they counterparts kinD and kinF were

never selected in our conditions. These two systems seem to be involved in salt or osmotic

stress responses and in oxidative stress responses respectively. It has been shown that in L.

lactis subsp. cremoris MG1363, these two systems were induced in mid-log phase or at the

end of exponential phase [50], while they were repressed during the stationary phase in our


140

experiments. Maybe the kinetics of the different cultures and the references used for

transcriptomic analysis could explain this difference.

Some of the regulator genes showed a significant expression variation with the three

normalization methods but only in pure culture. That was the case for the regulatory gene

codY known to be involved in amino acid metabolism and in the nitrogen starvation. The

expected effect of the inactivation of codY would have been the activation of several opp, opt,

and pep genes related to nitrogen source uptake and peptide degradation since their sequence

holds the codY box [26]. But most of the opp, opt and pep genes were repressed at the

beginning of the stationary phase in the pure culture. The same was obtained in the mixed

culture while the under-expression of codY was not detected. It should be mentioned,

however, that in C vs A in mixed culture, codY has an ER of 0.52, but with a p-value of 0.26,

and then it was logically discarded from the list of selected genes with significant expression

ratio. Furthermore very few genes from the amino acid metabolism showed an expression

variation in agreement with CodY regulation. The rmeA gene is hypothetically also involved

in peptide metabolism regulation, and it was strongly activated only in the pure culture. The

regulating network related to the entry in stationary phase and nitrogen starvation could be

intricate and cross regulations, notably between CodY, PurR, CcpA, GlnR and RmeA, may

have occurred. The other regulator genes varying only in pure culture were birA2, yohC and

yxcB. The gene yohC is part of an operon including pbpG, involved in the response to carbon

starvation in Salmonella [30]. Finally, though not observed with LOWESS normalization, one

can mention that the strong over-expression with ratio between 5 and 6 in B versus A of rbsR,

part of the ribose utilization operon, should also be coupled to glucose starvation. For all these

genes, it could be considered that the presence of the yeast suppressed the expression

variation, despite the fact that for most of them this variation seemed to be linked with carbon

starvation and/or entry in stationary phase, processes which occurred in both culture. It is also

possible that the variation of expression was the same in both type of culture, but detected

only in one condition by the statistical treatment.

The main potential interaction mechanism can probably be identified when a variation

of mRNA level was detected with the three normalization methods only in the mixed culture.

This was the case for the strong activation of mtlR, part of the mannitol operon, and mannitol

transcriptional anti-terminator [18]. It is expected that its activation occurs during carbon


141

starvation and in the presence of mannitol. But in our experiments, no mannitol was added to

the medium nor produced by the yeast. The other regulator differently expressed only in

mixed culture was kinC, part of the two-component system kinC/llrC . It should be noted that

llrC was also seen to be under-expressed using Quantile or ASSM normalization, but not with

LOWESS. This TCS might be involved in a global stress response in lactococci since the

mutants were acid-sensitive, and since LlrC was identified as a cold-induced protein [51]. One

can postulate that this TCS was under-expressed in stationary phase in our experiments due to

the presence of the yeast. It is interesting to note that in our previous work this TCS system

was not under-expressed in the direct comparison between a mixed-culture where ethanol was

produced and a pure culture, indicating that, among the products of the yeast metabolism,

ethanol was probably not the signal sensed by kinC/llrC [7].

Such interpretations should be drawn with caution since it could also be considered

that the expression variation occurring really in cells was the same in both type of culture but

that the statistical test did not consider it significant in one of the tested conditions. The main

problem concerning the comparison between independent microarray experiments is that

microarray may not be suitable to detect subtle expression variations [47]. Actually, the

statistical test leading to an unknown number of false negatives, e.g. real variations not

considered significant, give intrinsically only a partial vision of the real biological phenomena

for each experiment. So it might be difficult to know what variations are specific to one

experiment compared to another. Only the strong differences concerning a large cluster of

genes might be detected with such an experimental design. Besides, it allows the full

understanding of time dependent phenotype in each condition and the comparison between

both conditions with a minimum number of biochips to be made.

In a previous work, we investigated cellular interactions by a direct comparison

between a pure and a mixed culture during exponential growth phase, i.e. hybridization of

samples from both type of culture on the same slide [7]. This experimental design gives a

direct access to the variations specific of the mixed-culture, but its weaknesses are that it

requests a perfect timing in the sampling for RNA extraction to avoid artifacts due to time lag,

and that it is difficult to have access to the dynamic pattern of transcriptome throughout the

cultures. The choice of the method is free to each user and may be adapted to specific

situations.


142

The main result obtained previously was the under-expression of most of pyr genes in

mixed culture due to ethanol produced by the yeast [7]. In this current work, the medium was

devoid of adenine, guanine, uracile and xanthine in order to avoid changing conditions during

the culture advancement. Whatever the culture, e.g. pure or mixed, L. lactis had to synthesize

these bases to be able to grow. Later in the culture, when the growth stopped, as for many

metabolic functions, synthesis of bases was reduced in the same order of magnitude in both

cultures. Most of the metabolic changes expected to occur during the stationary phase were

brought to light in both cultures. The important ethanol effect seen in the previous work was

then either hidden due to the experimental design in the present work, or did not occur during

the entry into stationary phase. Moreover the culture medium used was not the same.

Finally the amplitude of the transcriptome variation was similar in the mixed culture

and in the pure culture, i.e. nearly the same number of genes for the same sampling time in

both cultures. Even if individual gene lists did not fit perfectly well between both types of

culture, the Wilcoxon test and the functional analysis led to the conclusion that the phenotype

of L. lactis was strongly similar with or without S. cerevisiae. However, some regulator genes

were seen to be expressed differently in both cultures, either with an apparent positive or

negative effect in the presence of the yeast. This observation opens the way to the analysis of

the potential role of these regulators in relation to the microbial interaction.

CONCLUSION

The complete dynamic growth profile of L. lactis in pure culture or in mixed culture

with S. cerevisiae was analysed in this study. Thanks to the previous development of a

method enabling transcriptome analyses in mixed culture [7], the L. lactis micro-arrays were

used to analyse the dynamic profile of gene expression, from exponential to stationary phase,

in pure and mixed culture. These transcriptome data were treated with different normalization

methods to estimate their robustness. Despite some differences in the gene list selected, the

global L. lactis gene expression profile was similar in both pure and mixed culture, as

evidenced by the Wilcoxon test. The main dynamic transcriptome evolution was the effect of

glucose starvation observed in both cultures. This comparative dynamic transcriptome

analysis of L. lactis grown in pure or in mixed culture with S. cerevisiae demonstrated that L.

lactis was only weakly affected by the presence of the yeast.


143

From a biotechnological point of view, our mixed cultures were made in conditions

where the amount of S. cerevisiae compared to L. lactis was largely higher than generally

encountered in the food and feed industries, emphasizing possible interaction effects of S.

cerevisiae on L. lactis. In conclusion, it could be considered that L. lactis in fermented foods

where yeast is present in relative low numbers should not be significantly affected by the co-

culture conditions.

AUTHORS’ CONTRIBUTIONS

MM carried out the experiments presented in this manuscript, the data analysis and their

interpretation and drafted the manuscript. SS participated in data normalization and in

statistical analysis. MCB participated in the design of the experiments, in transcriptome

analysis, and helped to draft the manuscript. PL conceived of the study, and participated in its

design and coordination and helped to draft the manuscript. All authors have read and

approved the final manuscript.

ACKNOWLEDGEMENTS This work was carried out with the financial support of the « ANR- Agence Nationale de la

Recherche - The French National Research Agency » under the « Programme National de

Recherche en Alimentation et nutrition humaine », project « ANR-05-PNRA-2E.11,

Genoferment».


144

REFERENCES

1. Taniguchi, M. and T. Tanaka, Clarification of interactions among microorganisms and development of co-culture system for production of useful substances. Adv Biochem Eng Biotechnol, 2004. 90: p. 35-62.

2. Shimizu, H., T. Mizuguchi, E. Tanaka, and S. Shioya, Nisin production by a mixed-culture system consisting of Lactococcus lactis and Kluyveromyces marxianus. Appl Environ Microbiol, 1999. 65(7): p. 3134-41.

3. Liu, C., B. Hu, Y. Liu, and S. Chen, Stimulation of nisin production from whey by a mixed culture of Lactococcus lactis and Saccharomyces cerevisiae. Appl Biochem Biotechnol, 2006. 129-132: p. 751-61.

4. Cheirsilp, B., H. Shoji, H. Shimizu, and S. Shioya, Interactions between Lactobacillus kefiranofaciens and Saccharomyces cerevisiae in mixed culture for kefiran production. J Biosci Bioeng, 2003. 96(3): p. 279-84.

5. Tada, S., Y. Katakura, K. Ninomiya, and S. Shioya, Fed-batch coculture of Lactobacillus kefiranofaciens with Saccharomyces cerevisiae for effective production of kefiran. J Biosci Bioeng, 2007. 103(6): p. 557-62.

6. Arsene-Ploetze, F., V. Kugler, J. Martinussen, and F. Bringel, Expression of the pyr operon of Lactobacillus plantarum is regulated by inorganic carbon availability through a second regulator, PyrR2, homologous to the pyrimidine-dependent regulator PyrR1. J Bacteriol, 2006. 188(24): p. 8607-16.

7. Maligoy, M., M. Mercade, M. Cocaign-Bousquet, and P. Loubiere, Transcriptome analysis of Lactococcus lactis in coculture with Saccharomyces cerevisiae. Appl Environ Microbiol, 2008. 74(2): p. 485-94.

8. Challinor, S.W. and A.H. Rose, Interrelationships between a yeast and a bacterium when growing together in defined medium. Nature, 1954. 174(4436): p. 877-8.

9. Gojkovic, Z., W. Knecht, E. Zameitat, J. Warneboldt, J.B. Coutelis, Y. Pynyaha, C. Neuveglise, K. Moller, M. Loffler, and J. Piskur, Horizontal gene transfer promoted evolution of the ability to propagate under anaerobic conditions in yeasts. Mol Genet Genomics, 2004. 271(4): p. 387-93.

10. Jensen, P.R. and K. Hammer, Minimal Requirements for Exponential Growth of Lactococcus lactis. Appl Environ Microbiol, 1993. 59(12): p. 4363-4366.

11. Cocaign-Bousquet, M. and N.D. Lindley, Pyruvate overflow and carbon flux within the central metabolic pathways of Corynebacterium glutamicum during growth on lactate. Enzyme Microb Technol, 1995. 17: p. 260-267.

12. Dobbin, K. and R. Simon, Comparison of microarray designs for class comparison and class discovery. Bioinformatics, 2002. 18(11): p. 1438-45.

13. Bolstad, B.M., R.A. Irizarry, M. Astrand, and T.P. Speed, A comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias. Bioinformatics, 2003. 19(2): p. 185-93.

14. Bolotin, A., P. Wincker, S. Mauger, O. Jaillon, K. Malarme, J. Weissenbach, S.D. Ehrlich, and A. Sorokin, The complete genome sequence of the lactic acid bacterium Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403. Genome Res, 2001. 11(5): p. 731-53.

15. Zeeberg, B.R., H. Qin, S. Narasimhan, M. Sunshine, H. Cao, D.W. Kane, M. Reimers, R.M. Stephens, D. Bryant, S.K. Burt, E. Elnekave, D.M. Hari, T.A. Wynn, C. Cunningham-Rundles, D.M. Stewart, D. Nelson, and J.N. Weinstein, High-Throughput GoMiner, an 'industrial-strength' integrative gene ontology tool for


145

interpretation of multiple-microarray experiments, with application to studies of Common Variable Immune Deficiency (CVID). BMC Bioinformatics, 2005. 6: p. 168.

16. Stentz, R. and M. Zagorec, Ribose utilization in Lactobacillus sakei: analysis of the regulation of the rbs operon and putative involvement of a new transporter. J Mol Microbiol Biotechnol, 1999. 1(1): p. 165-73.

17. Yamashita, Y., Y. Tsukioka, K. Tomihisa, Y. Nakano, and T. Koga, Genes involved in cell wall localization and side chain formation of rhamnose-glucose polysaccharide in Streptococcus mutans. J Bacteriol, 1998. 180(21): p. 5803-7.

18. Honeyman, A.L. and R. Curtiss, 3rd, The mannitol-specific enzyme II (mtlA) gene and the mtlR gene of the PTS of Streptococcus mutans. Microbiology, 2000. 146 (Pt 7): p. 1565-72.

19. Berge, M., M. Moscoso, M. Prudhomme, B. Martin, and J.P. Claverys, Uptake of transforming DNA in Gram-positive bacteria: a view from Streptococcus pneumoniae. Mol Microbiol, 2002. 45(2): p. 411-21.

20. Kilstrup, M. and J. Martinussen, A transcriptional activator, homologous to the Bacillus subtilis PurR repressor, is required for expression of purine biosynthetic genes in Lactococcus lactis. J Bacteriol, 1998. 180(15): p. 3907-16.

21. Zomer, A.L., G. Buist, R. Larsen, J. Kok, and O.P. Kuipers, Time-resolved determination of the CcpA regulon of Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363. J Bacteriol, 2007. 189(4): p. 1366-81.

22. Sanders, J.W., K. Leenhouts, J. Burghoorn, J.R. Brands, G. Venema, and J. Kok, A chloride-inducible acid resistance mechanism in Lactococcus lactis and its regulation. Mol Microbiol, 1998. 27(2): p. 299-310.

23. Larsen, R., T.G. Kloosterman, J. Kok, and O.P. Kuipers, GlnR-mediated regulation of nitrogen metabolism in Lactococcus lactis. J Bacteriol, 2006. 188(13): p. 4978-82.

24. Lopez de Felipe, F., C. Magni, D. de Mendoza, and P. Lopez, Citrate utilization gene cluster of the Lactococcus lactis biovar diacetylactis: organization and regulation of expression. Mol Gen Genet, 1995. 246(5): p. 590-9.

25. Guedon, E., B. Sperandio, N. Pons, S.D. Ehrlich, and P. Renault, Overall control of nitrogen metabolism in Lactococcus lactis by CodY, and possible models for CodY regulation in Firmicutes. Microbiology, 2005. 151(Pt 12): p. 3895-909.

26. den Hengst, C.D., S.A. van Hijum, J.M. Geurts, A. Nauta, J. Kok, and O.P. Kuipers, The Lactococcus lactis CodY regulon: identification of a conserved cis-regulatory element. J Biol Chem, 2005. 280(40): p. 34332-42.

27. Muller, W., N. Horstmann, W. Hillen, and H. Sticht, The transcription regulator RbsR represents a novel interaction partner of the phosphoprotein HPr-Ser46-P in Bacillus subtilis. Febs J, 2006. 273(6): p. 1251-61.

28. Madsen, S.M., T. Hindre, J.P. Le Pennec, H. Israelsen, and A. Dufour, Two acid-inducible promoters from Lactococcus lactis require the cis-acting ACiD-box and the transcription regulator RcfB. Mol Microbiol, 2005. 56(3): p. 735-46.

29. Morohoshi, F., K. Hayashi, and N. Munakata, Bacillus subtilis ada operon encodes two DNA alkyltransferases. Nucleic Acids Res, 1990. 18(18): p. 5473-80.

30. Kenyon, W.J., K.L. Nicholson, B. Rezuchova, D. Homerova, F. Garcia-del Portillo, B.B. Finlay, M.J. Pallen, J. Kormanec, and M.P. Spector, Sigma(s)-Dependent carbon-starvation induction of pbpG (PBP 7) is required for the starvation-stress response in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Microbiology, 2007. 153(Pt 7): p. 2148-58.


146

31. Lamarque, M., P. Charbonnel, D. Aubel, J.C. Piard, D. Atlan, and V. Juillard, A multifunction ABC transporter (Opt) contributes to diversity of peptide uptake specificity within the genus Lactococcus. J Bacteriol, 2004. 186(19): p. 6492-500.

32. Koebmann, B.J., D. Nilsson, O.P. Kuipers, and P.R. Jensen, The membrane-bound H(+)-ATPase complex is essential for growth of Lactococcus lactis. J Bacteriol, 2000. 182(17): p. 4738-43.

33. Martin, M.G., P.D. Sender, S. Peiru, D. de Mendoza, and C. Magni, Acid-inducible transcription of the operon encoding the citrate lyase complex of Lactococcus lactis Biovar diacetylactis CRL264. J Bacteriol, 2004. 186(17): p. 5649-60.

34. Stephens, C., B. Christen, K. Watanabe, T. Fuchs, and U. Jenal, Regulation of D-xylose metabolism in Caulobacter crescentus by a LacI-type repressor. J Bacteriol, 2007. 189(24): p. 8828-34.

35. Shulami, S., O. Gat, A.L. Sonenshein, and Y. Shoham, The glucuronic acid utilization gene cluster from Bacillus stearothermophilus T-6. J Bacteriol, 1999. 181(12): p. 3695-704.

36. Pujic, P., R. Dervyn, A. Sorokin, and S.D. Ehrlich, The kdgRKAT operon of Bacillus subtilis: detection of the transcript and regulation by the kdgR and ccpA genes. Microbiology, 1998. 144 (Pt 11): p. 3111-8.

37. Reizer, A., J. Deutscher, M.H. Saier, Jr., and J. Reizer, Analysis of the gluconate (gnt) operon of Bacillus subtilis. Mol Microbiol, 1991. 5(5): p. 1081-9.

38. Dudoit, S., Y.H. Yang, M. Callow, and T. Speed, Statistical Methods for identifying differentially expressed genes in replicated cDNA microarray experiments. Stat Sin., 2002. 12: p. 111-139.

39. Papagianni, M., N. Avramidis, and G. Filiousis, Glycolysis and the regulation of glucose transport in Lactococcus lactis spp. lactis in batch and fed-batch culture. Microbial Cell Factories, 2007. 6(16).

40. Serra, A., P. Strehaiano, and P. Taillandier, Characterization of the metabolic shift of Saccharomyces bayanus var. uvarum by continuous aerobic culture. Appl Microbiol Biotechnol, 2003. 62: p. 564-568.

41. Barbacioru, C.C., Y. Wang, R.D. Canales, Y.A. Sun, D.N. Keys, F. Chan, K.A. Poulter, and R.R. Samaha, Effect of various normalization methods on Applied Biosystems expression array system data. BMC Bioinformatics, 2006. 7: p. 533.

42. Jaffrezic, F., D.J. de Koning, P.J. Boettcher, A. Bonnet, B. Buitenhuis, R. Closset, S. Dejean, C. Delmas, J.C. Detilleux, P. Dovc, M. Duval, J.L. Foulley, J. Hedegaard, H. Hornshoj, I. Hulsegge, L. Janss, K. Jensen, L. Jiang, M. Lavric, K.A. Le Cao, M.S. Lund, R. Malinverni, G. Marot, H. Nie, W. Petzl, M.H. Pool, C. Robert-Granie, M. San Cristobal, E.M. van Schothorst, H.J. Schuberth, P. Sorensen, A. Stella, G. Tosser-Klopp, D. Waddington, M. Watson, W. Yang, H. Zerbe, and H.M. Seyfert, Analysis of the real EADGENE data set: comparison of methods and guidelines for data normalisation and selection of differentially expressed genes (open access publication). Genet Sel Evol, 2007. 39(6): p. 633-50.

43. Consortium, M., L. Shi, L.H. Reid, W.D. Jones, R. Shippy, J.A. Warrington, S.C. Baker, P.J. Collins, F. de Longueville, E.S. Kawasaki, K.Y. Lee, Y. Luo, Y.A. Sun, J.C. Willey, R.A. Setterquist, G.M. Fischer, W. Tong, Y.P. Dragan, D.J. Dix, F.W. Frueh, F.M. Goodsaid, D. Herman, R.V. Jensen, C.D. Johnson, E.K. Lobenhofer, R.K. Puri, U. Schrf, J. Thierry-Mieg, C. Wang, M. Wilson, P.K. Wolber, L. Zhang, S. Amur, W. Bao, C.C. Barbacioru, A.B. Lucas, V. Bertholet, C. Boysen, B. Bromley, D.


147

Brown, A. Brunner, R. Canales, X.M. Cao, T.A. Cebula, J.J. Chen, J. Cheng, T.M. Chu, E. Chudin, J. Corson, J.C. Corton, L.J. Croner, C. Davies, T.S. Davison, G. Delenstarr, X. Deng, D. Dorris, A.C. Eklund, X.H. Fan, H. Fang, S. Fulmer-Smentek, J.C. Fuscoe, K. Gallagher, W. Ge, L. Guo, X. Guo, J. Hager, P.K. Haje, J. Han, T. Han, H.C. Harbottle, S.C. Harris, E. Hatchwell, C.A. Hauser, S. Hester, H. Hong, P. Hurban, S.A. Jackson, H. Ji, C.R. Knight, W.P. Kuo, J.E. LeClerc, S. Levy, Q.Z. Li, C. Liu, Y. Liu, M.J. Lombardi, Y. Ma, S.R. Magnuson, B. Maqsodi, T. McDaniel, N. Mei, O. Myklebost, B. Ning, N. Novoradovskaya, M.S. Orr, T.W. Osborn, A. Papallo, T.A. Patterson, R.G. Perkins, E.H. Peters, R. Peterson, K.L. Philips, P.S. Pine, L. Pusztai, F. Qian, H. Ren, M. Rosen, B.A. Rosenzweig, R.R. Samaha, M. Schena, G.P. Schroth, S. Shchegrova, D.D. Smith, F. Staedtler, Z. Su, H. Sun, Z. Szallasi, Z. Tezak, D. Thierry-Mieg, K.L. Thompson, I. Tikhonova, Y. Turpaz, B. Vallanat, C. Van, S.J. Walker, S.J. Wang, Y. Wang, R. Wolfinger, A. Wong, J. Wu, C. Xiao, Q. Xie, J. Xu, W. Yang, L. Zhang, S. Zhong, Y. Zong and W.J. Slikker, The MicroArray Quality Control (MAQC) project shows inter- and intraplatform reproducibility of gene expression measurements. Nat Biotechnol, 2006. 24(1151-61).

44. Redon, E., P. Loubiere, and M. Cocaign-Bousquet, Transcriptome analysis of the progressive adaptation of Lactococcus lactis to carbon starvation. J Bacteriol, 2005. 187(10): p. 3589-92.

45. Raynaud, S., R. Perrin, M. Cocaign-Bousquet, and P. Loubiere, Metabolic and transcriptomic adaptation of Lactococcus lactis subsp. lactis Biovar diacetylactis in response to autoacidification and temperature downshift in skim milk. Appl Environ Microbiol, 2005. 71(12): p. 8016-23.

46. Wang, H., X. He, M. Band, C. Wilson, and L. Liu, A study of inter-lab and inter-platform agreement of DNA microarray data. BMC Genomics, 2005. 6(1): p. 71.

47. Pedotti, P., P.A. 't Hoen, E. Vreugdenhil, G.J. Schenk, R.H. Vossen, Y. Ariyurek, M. de Hollander, R. Kuiper, G.J. van Ommen, J.T. den Dunnen, J.M. Boer, and R.X. de Menezes, Can subtle changes in gene expression be consistently detected with different microarray platforms? BMC Genomics, 2008. 9(1): p. 124.

48. Redon, E., P. Loubiere, and M. Cocaign-Bousquet, Role of mRNA stability during genome-wide adaptation of Lactococcus lactis to carbon starvation. J Biol Chem, 2005. 280(43): p. 36380-5.

49. Martinussen, J., J. Schallert, B. Andersen, and K. Hammer, The pyrimidine operon pyrRPB-carA from Lactococcus lactis. J Bacteriol, 2001. 183(9): p. 2785-94.

50. O'Connell-Motherway, M., D. van Sinderen, F. Morel-Deville, G.F. Fitzgerald, S.D. Ehrlich, and P. Morel, Six putative two-component regulatory systems isolated from Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363. Microbiology, 2000. 146 (Pt 4): p. 935-47.

51. Wouters, J.A., H. Frenkiel, W.M. de Vos, O.P. Kuipers, and T. Abee, Cold shock proteins of Lactococcus lactis MG1363 are involved in cryoprotection and in the production of cold-induced proteins. Appl Environ Microbiol, 2001. 67(11): p. 5171-8.


148

FIGURE LEGENDS

Figure 1 : Evolution of biomass (g.liter-1), substrates and product concentrations (mM) during

the pure culture of L. lactis LD61 (A), the pure culture of S. cerevisiae CEN.PK113-7D (B),

and the mixed culture (C).

Figure 2 : Comparison of the number of L. lactis genes showing significant variation of

expression according to Student test (pvalue<0.05) with three data normalization methods.


149

Table 1: Kinetic parameters calculated from pure cultures and a mixed culture of both species.

*µ LD61 specific growth rate of L. lactis LD61; µCEN.PK113-7D specific growth rate of S. cerevisiae CEN.PK113-7D; qglucose specific glucose consumption rate; νlactate specific lactate production rate; νethanol specific ethanol production rate; Yglucose,LD61 yield of L. lactis LD61 biomass on glucose; Yglucose,CEN.PK113-7D yield of S. cerevisiae CEN.PK113-7D biomass on glucose; Yglucose,lactate yield of lactate on glucose; Yglucose,ethanol yield of ethanol on glucose; Ys,CEN.PK113-7D yield of S. cerevisiae CEN.PK113-7D biomass on non-fermentable substrates.

Parameter* and unit Value

L. lactis LD61 pure culture

S. cerevisiae CEN.PK113-7D

pure culture mixed culture

µLD61 (h-1) 0.75 ± 0.00 - 0.75 ± 0.01

µCEN.PK113-7D (h-1) - 0.41 ± 0.01 0.41 ± 0.06

qglucose (mmol.g-1.h-1) 23.62 ± 1.57 15.72 ± 0.19 -

νlactate (mmol.g-1.h-1) 44.83 ± 3.44 - 46.85 ± 2.05

νethanol (mmol.g-1.h-1) - 20.44 ± 2.64 18.54 ± 0.05

Yglucose,LD61 (g.Cmol-1) 4.95 ± 0.29 - -

Yglucose,CEN.PK113-7D (g.Cmol-1) - 4.99 ± 1.11 -

Yglucose,lactate (Cmol.Cmol-1) 0.90 ± 0.01 - -

Yglucose,ethanol (Cmol.Cmol-1) - 0.47 ± 0.026 -

Ys, CEN.PK113-7D (g.Cmol-1) - 27.77 ± 1.94 31.83 ± 0.00


150

Table 2 : Analysis of L. lactis gene expression in each functional category with data

normalized with the Quantile method.

Functional categories

Pure culture Mixed culture

B/A C/A B/A C/A

Studenta Wilcoxonb Studenta Wilcoxonb Studenta Wilcoxonb Studenta Wilcoxonb

AMINO ACID BIOSYNTHESIS

0 - 14 - 0 - 6 -

BIOSYNTHESIS OF COFACTORS, PROSTHETIC GROUPS, AND CARRIERS

4 down 9 down 2 - 5 down

CELL ENVELOPE 7 down 15 down 2 - 16 down

CELLULAR PROCESSES 1 - 11 - 1 - 6 -

CENTRAL INTERMEDIARY METABOLISM

1 - 1 - 0 - 1 -

ENERGY METABOLISM 11 - 39 - 9 - 37 -

FATTY ACID AND PHOSPHOLIPID METABOLISM

3 - 7 - 1 - 8 down

OTHER CATEGORIES 10 up 32 up 1 - 18 up

PURINES, PYRIMIDINES, NUCLEOSIDES AND

NUCLEOTIDES 7 down 30 down 11 down 23 down

REGULATORY FUNCTIONS 7 down 25 - 4 - 21 -

REPLICATION 4 down 13 down 2 - 12 -

TRANSCRIPTION 0 down 8 down 0 down 8 down

TRANSLATION 7 down 38 down 3 down 44 down

TRANSPORT AND BINDING PROTEINS

15 - 43 down 9 - 40 down

UNKNOWN 34 down 104 down 24 down 112 down

The False Discovery Rate estimated (for p-value<0.05) for B/A and C/A of the pure culture, and B/A and C/A of the mixed culture were 0.403, 0.076, 0.363, and 0.082 respectively. a number of genes showing significant expression ratio according to Student test (p-value<0.05). b result of the Wilcoxon test (p-wilcoxon<0.05) for each whole functional category: “up” and “down” indicate the global tendency of the whole category in B or C compared to A.


151

Table 3 : Analysis of L. lactis gene expression in each functional category with data normalized with the LOWESS method.

Functional categories


B/A C/A B/A C/A



1 down 3 - 1 - 3 -



CELL ENVELOPE 7 down 5 down 1 - 10 -



1 - 1 - 0 - 1 -

ENERGY METABOLISM 5 - 16 - 11 - 26 up


1 down 1 - 1 - 6 -

OTHER CATEGORIES 7 up 20 up 5 - 20 -



REGULATORY FUNCTIONS

5 down 15 down 2 - 12 -

REPLICATION 2 down 6 down 6 - 7 -




6 - 21 down 7 - 32 down




152

Table 4 : Analysis of L. lactis gene expression in each functional category with data normalized by all significant spots mean (ASSM).

Functional category


B/A C/A B/A C/A



1 down 13 down 0 - 6 -


1 down 7 down 1 down 6 down

CELL ENVELOPE 7 down 14 down 2 - 10 down



1 - 3 - 0 - 2 -

ENERGY METABOLISM 5 - 31 down 3 down 27 -



OTHER CATEGORIES 7 up 46 up 2 up 16 up



REGULATORY FUNCTIONS 5 down 33 - 0 - 15 -

REPLICATION 2 down 18 down 2 down 7 down




6 - 45 down 7 down 36 down




153

Table 5 : Significantly modified expression ratios of L. lactis regulator genes, in pure and mixed culture. Data were normalized by three normalization methods.

Quantile LOWESS All significant spots mean Subcategory

name Gene name

Pure culture Mixed culture Pure culture Mixed culture Pure culture Mixed culture B / A C / A B / A C / A B / A C / A B / A C / A B / A C / A B / A C / A

AraC-family regulators

adaA - 2.07 - - - - - - - 2.60 - - xylR - - - - - - - - - 2.58 - -

DeoR-family regulators

citR - 0.41 - - - 0.54 - - - 0.33 - - lacR - - - - - - 0.56 - - - - - rdrA - - - - - - - - - - - 3.18

General

argR - - - - - - - - - 1.76 - - - birA2 - 3.27 - - - 2.92 - - 1.50 3.05 -

codY - 0.33 - - - 0.40 - - - 0.30 - - codZ - - - 1.37 - - - - - - - 1.71 gadR - 0.50 - 0.33 - - - 0.46 - 0.45 - 1.39 glnB - - - - - - - - - 1.46 - 1.84 glnR - 0.23 - - - 0.28 - - - 0.23 - 0.26 gntR - - - 0.64 - - - 0.72 - - - - purR 0.55 - - 0.67 0.63 - - - 0.60 - - - rarA - - - - - - - 0.44 - - - - rcfB 2.66 - - - - - - - - - - - rmeA 1.60 1.61 - - 1.43 1.37 - - - 1.86 - - rmeC - - - 0.74 - - - - - - - - yabA - - - - - - - - - 1.67 - - ycfA - 1.55 - 1.43 - - - - - 1.45 - 1.53 ydcG - - - 0.48 - - - 0.45 - - - - yecE - 0.52 - - - - - - - 0.47 - - yeeG 0.48 0.34 - 0.36 0.54 - - 0.56 - 0.29 - 0.30 yjfE - - - - - - - - - - - 1.67 ykhI - - - - - - - - - - - 1.73 yljC - - - - - - - - - 2.10 - -

ymiA - 2.02 - - - - - - - 2.14 - 2.56 yohC - 2.09 - - - 1.72 - - - 2.67 - - ypgC - - - 2.69 - - - 1.68 - - - - yrbI - - - 0.50 - 0.62 - - - - - - ysfD - 0.27 - 0.24 - - - 0.35 - - - - ysfG 0.74 - - - - - - - - 0.71 - - yugA - 1.50 - - - - - - - 1.81 - - ywiI - 2.21 - - - - - - - 2.98 - - yxcB - 1.89 - - - 1.70 - - - 1.96 - -

GntR-family regulators

kdgR - - - 0.65 - - - 0.74 - - - - rgrB - 0.62 - - - 0.74 - - - - -

GTP-binding proteins

thdF - - - 0.59 - - - - - 0.55 - - typA - 0.22 0.71 - - 0.38 - - - 0.15 - - ylqL - - - - - - - - - 0.64 - - yphL - - - - - 0.64 - - - 0.65 - - ysxL - - - - - - - - 0.75 - - - yyaL - - - - - - - - 0.73 - - -

Lac-Ifamily regulators

ccpA - 0.34 - 0.61 - 0.38 - - - 0.35 - - rbsR 5.12 - - - - - - - 6.06 - - - rliDB - - - 2.51 - - - - - - - -

LysR-family regulators

mtlR - - - 2.57 - - - 1.94 - - - 2.56 rlrA - 1.43 - - - - - - - 1.63 - - rlrC - - - - - - - - - - - 4.08 rlrD - - 0.75 - - - 0.77 - - - - -

MarR-family regulators

rmaD - 1.98 - - - - - - - - - - rmaG 0.36 0.19 - 0.23 0.38 - - 0.41 - 1.19 - - zitR - - - - - - - - - 1.58 - -

Two-component

systems

kinC - - - 0.44 - - - 0.55 - - - 0.48 kinG - - - 0.74 - 0.41 - 0.74 - 0.58 - - llrC - - 0.65 - - - - - - 0.29 - 0.29 llrD - 0.27 - 0.50 - 0.35 - - - 0.25 - - llrE - 0.53 - - - - - - - - - - llrF - 0.46 0.68 0.59 - 0.57 - - - 0.50 - -


154

Figure 1:

0 10 20 30

0

20

40

60

80

100

Glu

cose

(m

M)

Lact

ate

(m

M)

Ace

tate

(m

M)

Eth

ano

l (m

M)

time (hour)

0.001

0.01

0.1

1

10

L.

lact

is LD

61

(g/

l)S

. ce

revi

sia

e CE

NP

K-9

05

(g/

l)

0

20

40

60

80

100

0.001

0.01

0.1

1

10

0

20

40

60

80

100

0.001

0.01

0.1

1

10

A

B

C


155

Figure 2 :

CCoonncclluussiioonn eett ppeerr ssppeecctt iivveess

Conclusion et perspectives

156

II .. BBii llaann

Les bactéries lactiques sont présentes dans de nombreux écosystèmes, naturels ou

artificiels, et côtoient de fait de nombreux autres types microbiens, procaryotes ou eucaryotes.

La proximité d’autres espèces est souvent génératrice de stress puisque les activités

métaboliques des différents microorganismes génèrent la modification de l'environnement.

Les bactéries lactiques mettent alors en place des mécanismes de réponses plus ou moins

spécifiques, par exemple en adaptant leur métabolisme ou en produisant dans certains cas des

molécules antimicrobiennes (bactériocines).

Les données bibliographiques montrent clairement que les interactions cellulaires ont

une grande influence sur le déroulement des procédés de l’industrie agroalimentaire, et sur la

qualité du produit fermenté. Ainsi la présence d’autres espèces génère souvent la modification

de la physiologie des cellules qui s’accompagne en général de la modulation de l’expression

génétique. L’analyse moléculaire, en particulier l’analyse globale, est un moyen d’accéder à

ces variations d’expression et pourrait fournir des informations sur le rôle de chaque espèce

de l’écosystème tout au long du procédé. Pourtant, à l’heure actuelle, l’étude des écosystèmes

reste essentiellement centrée sur la description de la composition en microorganismes ou bien

se focalise sur quelques fonctions d’intérêt, et sont rarement confortées par l’analyse

moléculaire. Si certains mécanismes moléculaires ont été décrits grâce à l’étude de cultures

pures, l’étude de ces mécanismes au sein d’un véritable écosystème, hors du contexte du

laboratoire, se heurte encore à de nombreux obstacles techniques.

L’objectif principal de nos travaux était d’apporter des solutions à cette problématique

d'analyse du comportement microbien en cultures mixtes. Pour cela des écosystèmes binaires,

comportant L. lactis et S. cerevisiae, ont été étudiés en couplant les données macro-cinétiques

en bioréacteur avec l’analyse du transcriptome de L. lactis par puce à ADN. Une mise au

point d’une méthode d’utilisation des puces à ADN en culture mixte a d’abord été nécessaire

et nous avons proposé une solution efficace qui semble pouvoir être étendue à d’autres

écosystèmes. Puis deux stratégies d’analyse ont été élaborées et appliquées à de véritables

cultures mixtes. Enfin l’analyse du transcriptome et des données de fermentation ont révélé


157

que l’interaction entre L. lactis et S. cerevisiae se traduit dans un cas par la modification de

l’expression génique de L. lactis, dans l’autre par une interaction nutritionnelle.

I.1 L’ajout d’ADN génomique pour réduire les cross-hybridations

Les puces à ADN sont utilisées pour la détection de variations transcriptomiques à

grande échelle. Cependant cette technologie exhaustive comporte certaines limitations

techniques dans le cadre de l'analyse de populations microbiennes hétérogènes. Nos travaux

ont montré que la principale difficulté de l’utilisation des puces à ADN de L. lactis en culture

mixte vient des cross-hybridations des acides nucléiques de l’espèce partenaire (ici S.

cerevisiae) dont le signal, en s’additionant au signal spécifique de L. lactis, fausse l’analyse.

Nous avons proposé une solution permettant de réduire les cross-hybridations, au moins dans

notre écosystème modèle, qui consiste à ajouter de l’ADN génomique non marqué du

partenaire de L. lactis lors de l’hybridation sur la puce à ADN. L’ADN génomique diminue

sensiblement le signal de fluorescence provenant des ADNc marqués cross-hybridant. Cette

approche a été validée dans le cadre de cultures mixtes L. lactis / levure puis a été étendu à

d'autres espèces phylogénétiquement plus proches de L. lactis que ne l'est la levure. La

méthode d’ajout d’ADN génomique pour faire diminuer le signal de cross-hybridation semble

pouvoir être extrapolée à d’autres espèces, avec des limitations dépendant de l’éloignement

phylogénétique entre espèces. En d’autres termes, plus les génomes sont différents, plus la

méthode est efficace.

L’idée initiale provient du protocole d’hybridation manuelle des puces à ADN qui

consiste à ajouter de l’ADN de sperme de saumon pour saturer les sites non spécifiques de la

puce, pour améliorer la fiabilité et la reproductibilité des données. Même si les hybridations

manuelles deviennent obsolètes, les protocoles d’utilisation des chambres d’hybridation

automatiques conservent en général une étape qui consiste à ajouter une solution contenant un

composé permettant de saturer les sites non spécifiques de la puce, avec de la BSA par

exemple (Ventana Discovery®). Cette étape semble donc cruciale pour accroitre la spécificité

de l’hybridation. Dans notre méthode, l’ajout d’ADN génomique de l’espèce partenaire joue

probablement le même rôle, mais l’effet est amplifié parce que l’ADN génomique de l’espèce

partenaire masque spécifiquement les sites concernés par les cross-hybridations,


158

contrairement à l’ADN de sperme de saumon ou à la BSA. Un autre mode d’action peut être

envisagé qui aurait lieu avant même l’hybridation sur la puce. L’ADN génomique et l’ADNc

du partenaire sont complémentaires, de sorte que des appariements peuvent se faire dans la

solution d’hybridation pour former des hybrides ADNg/ADNc double brins. L’ADNc étant

alors moins disponible pour s’hybrider sur la puce, le signal des cross-hybridations

diminuerait en conséquence. Ces deux explications ne sont pas contradictoires et il serait

intéressant de les valider et de déterminer la contribution de chacune dans la diminution du

signal de cross-hybridation. Des hybridations avec une gamme de concentration d’ADN

génomique croissante permettraient de montrer s’il s’agit véritablement d’un phénomène de

compétition, et de définir les limites de la méthode en terme quantitatif. Pour dissocier les

deux hypothèses, il faudrait réaliser des hybridations en changeant la préparation de la

solution d’hybridation, c’est-à-dire tantôt en préparant la solution d’hybridation en y incluant

l’ADNg, tantôt en préparant la solution d’hybridation sans ADNg qui serait ajouté au tout

dernier moment lors du dépôt sur la puce.

I.2 Stratégie d’analyse

Nous avons défini deux stratégies pour comparer le transcriptome de L. lactis en

culture mixte par rapport à la culture pure, basés sur des échantillonnages différents. Chacune

des méthodes permet de dissocier les variations d’expression géniques liées spécifiquement à

l’interaction cellulaire de celles liées à d’autres phénomènes biologiques (avancement de la

culture, adaptation aux différentes phases de croissance…). La première approche consistait à

faire une hybridation à partir d’un échantillon de culture mixte et d’un échantillon de culture

pure sur la même puce. Elle présente l’avantage de donner un accès direct aux variations

d’expression génique liées à l’interaction mais reste sujette aux artefacts provenant du

décalage temporel qui peut exister entre l’avancement des cultures au moment du

prélèvement. La seconde approche consistait à faire l’analyse cinétique des variations du

niveau de transcrit indépendamment dans chaque type de culture, et ensuite de comparer les

deux profils. Cette deuxième approche permet d’accéder à la dynamique du transcriptome au

cours des cultures mais la comparaison entre culture mixte et culture pure doit se faire de

façon globale, par catégories fonctionnelles, la comparaison gène à gène étant peu fiable.


159

Finalement les deux stratégies comportent leur point faible et à l’avenir le choix de la

méthode utilisée devra correspondre aux objectifs fixés. Dans le cadre d’une étude de

variations fines d’expression génique, concernant quelques gènes, la première méthode devra

être privilégiée. Au contraire, pour l’étude de mécanismes impliquant de larges groupes de

gènes, la seconde méthode sera plus adaptée.

I.3 L’interaction cellulaire

I.3.1 Interaction entre IL1403 et CEN.PK113-7D

Le premier écosystème modèle que nous avons étudié est une co-culture de L. lactis

IL1403 et S. cerevisiae CEN.PK113-7D dans un bioréacteur (Maligoy et al., 2008a). Nous

avons découvert une interaction entre les deux espèces dont l’effecteur est l’éthanol produit

par la levure qui induit la sous-expression globale des gènes de la voie de biosynthèse de novo

des pyrimidines de L. lactis. Mais malgré la variation d’expression génétique, le phénotype

apparent (vitesses spécifiques et rendements mesurés) de L. lactis est resté inchangé en

culture mixte par rapport à la culture pure. La fonction des gènes pyr est relativement bien

connue mais jusqu’à présent aucun lien n’avait été établi avec l’éthanol. Les déterminants

moléculaires de cette régulation demeurent inconnus. Nous avons d’ores et déjà montré par

RT-qPCR que certaines modifications transcriptomiques pouvaient être reproduites en culture

pure de L. lactis, grâce l’injection d’éthanol dans le milieu, indépendamment de la présence

de la levure. Il reste à décortiquer les mécanismes moléculaires qui modifient l’expression

génique en réponse à l’éthanol.

L’étude au niveau métabolique et transcriptomique de mutants de gènes pyr

complèterait ces résultats et apporterait des éléments pour comprendre comment l’éthanol

peut induire la modification du niveau de transcrits des gènes pyr. Une approche classique de

gain/perte de fonction, par inactivation et surexpression du gène candidat confirmera ou non

l’implication de chaque gène dans l'interaction. Après confirmation de l'implication réelle de

gènes candidats, leur étude pourrait passer par la caractérisation fine de leur régulation face au

stimulus "présence d'un partenaire dans l'écosystème" et des régions impliquées dans cette


160

régulation. Cela peut, par exemple, passer par l'utilisation de gènes rapporteurs, en portage

plasmidique ou chromosomique.

I.3.2 Interaction entre LD61 et CEN.PK113-7D

Le deuxième écosystème modèle que nous avons étudié était une co-culture de L. lactis

subsp. lactis biovar. diacetylactis LD61 et S. cerevisiae CEN.PK113-7D. Nous avons montré

que l’accumulation du lactate produit par la bactérie influence le métabolisme de la levure

puisqu’il sert de source de carbone à la levure lors de la phase de croissance oxydative

(Maligoy et al., 2008b). En effet la levure possède les enzymes spécifiques nécessaires pour

assimiler le lactate en aérobiose lors de la carence en glucose. Il s’agit ici d’une interaction

qui implique des mécanismes de réponse spécifiques de la part de la levure, engendrant un

phénotype différent en culture mixte par rapport à la culture pure (l’assimilation du lactate

induit des paramètres cinétiques différents en phase de croissance oxydative). Pour compléter

ces observations il serait intéressant d’établir un parallèle entre le transcriptome de L. lactis et

le transcriptome de la levure. Pour cela, il faudrait regarder s’il y a des cross-hybridation entre

les ADNc de L. lactis et les sondes de la puce de S. cerevisiae et le cas échéant il faudrait

tester l’efficacité de l’ajout d’ADN génomique en réduire l’ampleur. Si la méthode permet de

réduire significativement les cross-hybridations, alors les approches que nous avons

employées pour L. lactis pourront être utilisées pour caractériser le transcriptome de S.

cerevisiae. Sinon, il faudra recourir à d’autres stratégies, comme par exemple l’utilisation du

double bioréacteur à membrane (Manjarrez et al., 2000). Ce dispositif permet de cultiver des

cellules d’espèces différentes dans un milieu de culture commun tout en séparant les

biomasses. Avec cet appareil ne se pose plus la question de la spécificité d’hybridation de

puces à ADN puisque les biomasses peuvent être récupérées individuellement avant

l’extraction d’ARN. La compartimentation de la culture en utilisant un double bioréacteur à

membrane présente aussi l’avantage d’éliminer la composante « contact cellulaire » de

l’interaction. Dans le cadre d’une interaction préalablement détectée en bioréacteur standard,

comme celles détectées dans nos travaux, le double BRM permettrait de déterminer si le

contact cellulaire est un facteur de l’interaction, ou au moins de savoir si c’est une des

composantes de l'interaction. Dans le cas où le facteur de l’interaction serait une molécule


161

diffusible, la capacité de détection sera dépendante de la taille des pores de la membrane

filtrante et de son colmatage progressif.

Nos écosystèmes modèles sont des co-cultures réalisées en bioréacteur. Le bioréacteur

permet de maîtriser les conditions de culture pour cibler spécifiquement les variations

géniques liées à l’interaction cellulaire et pour limiter les autres sources de variation (stress

acide, thermique ou oxydatif). En outre l’utilisation du bioréacteur nous a assuré une bonne

reproductibilité des expériences, augmentant la probabilité que les variations phénotypiques

ou transcriptomiques observées entre culture mixte et culture pure soient la résultante d’une

interaction microbienne et non la conséquence de variations de cultures, indépendamment de

la présence de l’espèce partenaire. Une fois les conditions de culture déterminées, la recherche

d’interaction a été effectuée directement au niveau des paramètres cinétiques de croissance, et

au niveau du transcriptome.

Mais malgré le contrôle que l’on peut exercer sur le déroulement des cultures, établir la

part de responsabilité de chaque paramètre dans l’interaction est parfois difficile. Par

exemple, dans notre deuxième écosystème modèle, chez L. lactis nous n’avons pas pu

dissocier les variations génétiques provenant du ralentissement de la croissance (carence

glucose, diminution du taux de croissance…) des variations liées spécifiquement à la présence

de la levure. Une culture mixte en chémostat, avec un taux de dilution constant permettrait de

dissocier l’effet du ralentissement de la croissance de l’effet de l’interaction inter-espèce.

Même si l’équilibre est difficile à atteindre, des cultures mixtes ont déjà été réalisées en

chémostat par certaines équipes, notamment avec des bactéries et des levures (Basson, 2000 ;

McSweeney et al., 1993). En outre le maintient de l’équilibre permettrait de prolonger les

phénomènes liés à l’interaction qui sont d’ordinaire observables sur un laps de temps assez

court, et ainsi de rendre l’analyse plus aisée.

L. lactis et S. cerevisiae sont tous deux membres de la flore fromagère, mais ne se

développent pas en même temps au cours de la fabrication du fromage. L. lactis se développe

en début de procédé, où l’activité des levures est quasi nulle. Au contraire les levures se

développent plus tardivement lors de la maturation, dans un milieu dont les propriétés

physicochimiques (pH, texture, et surtout présence de lactate) dépendent de l’activité des

bactéries qui s’y sont développées avant elle. Il est donc logique de supposer que L. Lactis ne


162

soit pas très adaptée pour répondre aux métabolites synthétisés par la levure, puisqu’ils sont

absents lors de son développement. En revanche il semble logique que la levure soit adaptée,

si ce n’est à la présence de bactéries lactiques elles-mêmes, au moins à ses produits de

fermentation, en particulier le lactate.

II II .. PPeerr ssppeecctt iivveess

II.1 Analyse transcriptomique dans des écosystèmes de plus en

plus complexes

Les interactions cellulaires sont relativement peu explorées avec des souches

industrielles, et quasiment jamais étudiées dans leur contexte habituel, c'est-à-dire dans les

procédés technologiques agroalimentaires. Nos travaux constituent une première étape et

répondent à certaines questions méthodologiques et biologiques. La poursuite des recherches

doit se faire dans l’optique de se rapprocher peu à peu des conditions industrielles.

Dans une partie de nos travaux est utilisée la souche industrielle L. lactis subsp. lactis biovar.

diacetylactis LD61 qui possède toutes les fonctions nécessaires à son utilisation dans un

procédé de fermentation agroalimentaire, y compris en présence d’autres espèces. De fait

cette souche possède certainement des systèmes de réponse face aux autres microorganismes.

Les co-cultures ont été réalisées dans conditions permettant de dissocier les sources de

variation génétiques pour les rendre plus facile à comprendre (voir plus haut). Cependant de

telles conditions de cultures sont éloignées des conditions de fermentation industrielles,

notamment de l’industrie laitière (composition du milieu, régulation pH, température,

aération…). La poursuite des travaux s’orientera donc logiquement vers des cultures réalisées

dans des conditions mimant les procédés de l’industrie agroalimentaire, en utilisant par

exemple des matrices alimentaires modèles.

D’autre part les cultures mixtes que nous avons utilisées comportent seulement deux

espèces. Pour se rapprocher des conditions industrielles il faudra augmenter progressivement

le nombre d’espèces. L’augmentation du nombre d’espèce conduit à une probabilité plus

grande d’obtenir des séquences homologues entre espèces et donc des cross-hybridations.


163

Pour mesurer le transcriptome microorganismes dans un écosystème comportant plusieurs

partenaires, il sera nécessaire de limiter les cross-hybridations sur les puces à ADN, par

exemple en ajoutant de l’ADN génomique des différentes espèces. Cette approche permettra

d’une part d’évaluer les limites de cette méthode et d’autre part d’observer des réseaux

d’interaction de plus en plus étendus. A long terme, la multiplication des expériences laisse

entrevoir la possibilité de pouvoir modéliser et prédire l’efficacité de cette méthode lors de la

mise au point de nouveaux plans d’expériences, dans la limite de ce qu’autorise la proximité

phylogénétique.

Une autre solution consiste à compartimenter la culture grâce au double BRM. Ceci

permettrait de simplifier la caractérisation des différentes composantes de l’écosystème. De

plus, cet appareillage simplifie l’utilisation des puces à ADN en culture mixte puisque les

ARN peuvent être extraits de chaque espèce indépendamment.

Une autre façon de mesurer le transcriptome dans des cultures de plus en plus

complexes, est d’utiliser des puces spécifiquement dessinées pour l'étude d'une espèce dans

un écosystème complexe. La puce que nous avons employée durant ce travail a été dessinée

sans tenir compte des génomes d'autres espèces, donc sans introduire un critère de spécificité

des séquences utilisées. Ceci explique largement les cross-hybridations rencontrées durant ce

travail. Pour l'étude de L. lactis en présence de différents partenaires, il est évident que l’ajout

d’ADN génomique ne sera pas toujours suffisant pour diminuer les cross-hybridations. Et ce

d'autant que les espèces partenaires seront phylogénétiquement proches de L. lactis. Le design

de nouvelles puces à ADN utilisables dans de nombreuses conditions avec des écosystèmes

comportant un grand nombre d’espèces est une alternative intéressante. Une telle puce espèce

spécifique privilégiera la technologie à oligonucléotides plutôt que la technologie fragments

PCR de la puce actuelle. Les conditions appliquées à une puce à oligonucléotides peuvent être

plus stringeantes, limitant d'autant les phénomènes de cross-hybridations Enfin les génomes

pris en compte lors du design des sondes doivent refléter la composition de l’écosystème que

l’on souhaite étudier. Ce type de puce est actuellement en cours d’élaboration.

Le nombre de génome considéré est un facteur limitant : plus le nombre de génomes

considérés sera grand, plus rares seront les séquences spécifiques de chacun d’entre eux.

Ajoutons que l’accroissement de la proximité phylogénétique s’accompagne d’une

augmentation de l’homologie entre les génomes. Il sera donc plus difficile de trouver des


164

séquences spécifiques entre des espèces proches. Il est même très probable que certains gènes

ne présentent pas de séquence spécifique à un seul génome (gènes très conservés d’une espèce

à l’autre).

II.2 Les autres méthodes globales

II.2.1 Analyse Protéomique

L’analyse protéomique réalisée conjointement avec l’analyse du transcriptome

permettrait de comprendre les interconnexions entre le réseau protéique et la régulation de

l’expression génétique lors de l’interaction microbienne. Par exemple, les variations

d’expression génétique que nous avons détectées chez L. lactis en présence de la levure ne se

sont pas traduites par une modification physiologique visible. Il serait intéressant de mesurer

les variations de concentration des protéines, en particulier celles de la voie de synthèse de

novo des pyrimidines, pour voir si elles sont en corrélation avec les variations

transcriptionnelles.

La protéomique donne des résultats qui ne sont pas toujours en adéquation avec les

variations transcriptomiques. En effet la succession d’étapes conduisant à partir de

l’expression d’un gène, à une activité protéique induit nécessairement un décalage temporel.

La transcription, la traduction, la maturation (modification post-traductionnelle), et finalement

l’activité protéique elle-même ne sont pas forcément en corrélation directe. De plus, des

systèmes de régulation traductionnelle et post-traductionnelle s’additionnent souvent aux

régulations génétiques. Se pose aussi la question de savoir comment identifier l’origine de

chaque protéines mesurées en culture mixte. Pour les protéines intracellulaires, comment

déterminer de quelle espèce elles proviennent ? La première solution sera de l’identifier au

spectromètre de masse et de la comparer avec le génome (s’il est séquencé). La deuxième

solution sera de compartimenter la culture avec le double BRM pour pouvoir extraire les

protéines de chaque espèce indépendamment l’une de l’autre. Pour les protéines

extracellulaires la comparaison des données d’une culture mixte avec les données d’une

culture pure sera probablement la meilleure solution. Il faut ajouter que la protéomique n’est

pas aussi exhaustive que la transcriptomique. Classiquement, quelques centaines de protéines


165

sont identifiables par une approche protéomique 2D, majoritairement les protéines

cytoplasmiques. Il faut ajouter que l'identification des protéines membranaires pose encore

certains problèmes techniques.

II.2.2 Résonance Magnétique Nucléaire

La RMN (Résonance Magnétique Nucléaire) permet d'analyser des molécules en

mélange, sans a priori sur la composition de l'échantillon. Cette approche apporte à la fois des

informations qualitatives et quantitatives. Le principe est de mesurer la réponse des noyaux

atomiques des molécules placées dans un champ magnétique intense lorsqu’elles sont

soumises à une excitation radiofréquence résonante. La réponse est conditionnée par la nature

du noyau ainsi que son environnement moléculaire (fonction chimique, proximité des autres

atomes, ...). Une molécule donnée aura un spectre (1H, 13C, etc ...) caractéristique. Par

conséquent, elle pourra être identifiée sans ambiguïté. En ce qui nous concerne les molécules

recherchées étant organiques, la mesure de spectres RMN 1H, et 13C semblent être la plus

indiquée.

La métabolomique est une méthode d’exploration globale visant à analyser le plus

exhaustivement possible les différents métabolites présents dans un milieu (cellule, milieu

extracellulaire, biofluides...). Plusieurs stratégies sont envisageables pour étudier les

interactions microbiennes par une approche métabolomique utilisant la RMN. Dans le cas où

un phénotype d’interaction a clairement été observé, la RMN permettrait de valider le rôle de

molécules suposées jouer un rôle dans l’interaction. Dans le cas d’une prospective où aucune

hypothèse n’a était envisagée, la RMN permet de détecter les candidats et de les identifier.

Dans nos travaux la chromatographie a donné accès aux concentrations des principaux

métabolites extracellulaires, mais ce n’est pas une méthode exhaustive et certaines molécules

impliquées dans une interaction nous ont peut-être échappé. L’analyse comparative des

métabolites du milieu extracellulaire en culture mixte par rapport à des cultures pures

permettrait de cibler les molécules spécifiques de la culture mixte, et donc potentiellement

impliquées dans l’interaction. Au contraire dans le cas où un phénotype particulier, provenant

d’une interaction, a été détecté dans plusieurs situations, par exemple dans des conditions de

cultures différentes, avec des souches différentes, face à des espèces différentes, c’est dans les


166

similitudes que l’on pourrait découvrir les facteurs de l’interaction. Une fois détectée, la

molécule peut être identifiée par comparaison des spectres avec des bases de données. Dans le

cas de spectres inconnus, une stratégie de détermination structurale par RMN basée sur

l'analyse de spectres bidimensionnels pourra être mise en place. Mais les milieux de culture

sont des milieux aqueux et contiennent de nombreuses molécules présentes dans des

proportions très différentes. Par exemple, dans un spectre 1H, le signal de l’eau est très fort et

conduit à des difficultés d’analyse car il peut masquer les signaux d'intérêt. Différentes

méthodes permettent de contourner cet obstacle, notamment la lyophilisation et l’utilisation

d’un solvant deutéré. Certaines molécules très abondantes, comme les produits de

fermentation, peuvent également générer des spectres gênant l’analyse. D’autre part la grande

diversité d’espèces moléculaires dans l’échantillon, comme c’est généralement le cas avec le

milieu extracellulaire d’une culture, conduit souvent à la superposition des spectres et à de

grandes difficultés d’identification. Il est possible de minimiser ces phénomènes en

fractionnant l’échantillon, ou en recourant à des analyses en RMN 2D.

Les données qualitatives et quantitatives apportées par l’analyse en RMN devront être

intégrées à un contexte plus large, en les croisant par exemple avec les connaissances de la

physiologie du microorganisme, et les données d’analyse du transcriptome et du protéome.

II II II .. PPoouurr ccoonncclluurr ee……

Nous avons mis au point une méthode pour utiliser les puces à ADN de L. lactis en

culture mixte qui nous a permis de montrer que des modifications d’expression génique et/ou

physiologique se produisaient en co-culture avec S. cerevisiae. Les effecteurs semblent avoir

été identifiés, au moins en partie, mais les mécanismes précis de l’interaction,

particulièrement ceux liés à l’éthanol restent inconnus. L’étape suivante est donc de

comprendre précisément ces mécanismes en utilisant d’autres outils d’analyse. Notre modèle

microbien est un peu éloigné des systèmes naturels ou industriels mais il a le mérite de fournir

des réponses dans un domaine jusqu’alors peu exploré, au moins du point de vue du

lactocoque. Les informations retirées de nos travaux pourront servir de base pour continuer

les recherches dans le domaine de l’analyse des interactions microbiennes en écologie ou en

industrie.

RRééfféérr eenncceess bbiibbll iiooggrr aapphhiiqquueess

Références bibliographiques

167

A

Abbe, K., Takahashi, S., and Yamada, T. (1982) Involvement of oxygen-sensitive pyruvate formate-lyase in mixed-acid fermentation by Streptococcus mutans under strictly anaerobic conditions. J Bacteriol 152: 175-182.

Abraham, A.G., and De Antoni, G.L. (1999) Characterization of kefir grains grown in cows' milk and in soya milk. J Dairy Res 66: 327-333.

Ach, R.A., Floore, A., Curry, B., Lazar, V., Glas, A.M., Pover, R., Tsalenko, A., Ripoche, H., Cardoso, F., d'Assignies, M.S., Bruhn, L., and Van't Veer, L.J. (2007) Robust interlaboratory reproducibility of a gene expression signature measurement consistent with the needs of a new generation of diagnostic tools. BMC Genomics 8: 148.

Adamberg, K., Kask, S., Laht, T.M., and Paalme, T. (2003) The effect of temperature and pH on the growth of lactic acid bacteria: a pH-auxostat study. Int J Food Microbiol 85: 171-183.

Adamczyk, J., Hesselsoe, M., Iversen, N., Horn, M., Lehner, A., Nielsen, P.H., Schloter, M., Roslev, P., and Wagner, M. (2003) The isotope array, a new tool that employs substrate-mediated labeling of rRNA for determination of microbial community structure and function. Appl Environ Microbiol 69: 6875-6887.

Akyol, I. (2007) Regulation of the ribonucleotide reductases in Lactococcus lactis subsp. cremoris. Acta Biol Hung 58: 105-114.

Alatriste-Mondragon, F., Samar, P., Cox, H.H., Ahring, B.K., and Iranpour, R. (2006) Anaerobic codigestion of municipal, farm, and industrial organic wastes: a survey of recent literature. Water Environ Res 78: 607-636.

Akkerman, I., Janssen, M., Rocha, J., Wijffels, R.H. (2002) Photobiological hydrogen production: photochemical efficiency and bioreactor design. Int J Hydrogen Energy 27: 1195-1208.

Anders, R.F., Hogg, D.M., and Jago, G.R. (1970) Formation of hydrogen peroxide by group N streptococci and its effect on their growth and metabolism. Appl Microbiol 19: 608-612.

Andersen, H.W., Pedersen, M.B., Hammer, K., and Jensen, P.R. (2001) Lactate dehydrogenase has no control on lactate production but has a strong negative control on formate production in Lactococcus lactis. Eur J Biochem 268: 6379-6389.

Andersen, P.S., Jansen, P.J., and Hammer, K. (1994) Two different dihydroorotate dehydrogenases in Lactococcus lactis. J Bacteriol 176: 3975-3982.

Andersen, P.S., Martinussen, J., and Hammer, K. (1996) Sequence analysis and identification of the pyrKDbF operon from Lactococcus lactis including a novel gene, pyrK, involved in pyrimidine biosynthesis. J Bacteriol 178: 5005-5012.

Andersson, U., and Radstrom, P. (2002) Physiological function of the maltose operon regulator, MalR, in Lactococcus lactis. BMC Microbiol 2: 28.

Angulo, L., Lopez, E., and Lema, C. (1993) Microflora present in kefir grains of the Galician region (north-west of Spain). J Dairy Res 60: 263-267.

Appleby, J.L., Parkinson, J.S., and Bourret, R.B. (1996) Signal transduction via the multi-step phosphorelay: not necessarily a road less traveled. Cell 86: 845-848.

Ayad, E.H., Verheul, A., Engels, W.J., Wouters, J.T., and Smit, G. (2001) Enhanced flavour formation by combination of selected lactococci from industrial and artisanal origin with focus on completion of a metabolic pathway. J Appl Microbiol 90: 59-67.


168

B

Backhed, F., Ley, R.E., Sonnenburg, J.L., Peterson, D.A., and Gordon, J.I. (2005) Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science 307: 1915-1920.

Bammler, T., Beyer, R.P., Bhattacharya, S., Boorman, G.A., Boyles, A., Bradford, B.U., Bumgarner, R.E., Bushel, P.R., Chaturvedi, K., Choi, D., Cunningham, M.L., Deng, S., Dressman, H.K., Fannin, R.D., Farin, F.M., Freedman, J.H., Fry, R.C., Harper, A., Humble, M.C., Hurban, P., Kavanagh, T.J., Kaufmann, W.K., Kerr, K.F., Jing, L., Lapidus, J.A., Lasarev, M.R., Li, J., Li, Y.J., Lobenhofer, E.K., Lu, X., Malek, R.L., Milton, S., Nagalla, S.R., O'Malley J, P., Palmer, V.S., Pattee, P., Paules, R.S., Perou, C.M., Phillips, K., Qin, L.X., Qiu, Y., Quigley, S.D., Rodland, M., Rusyn, I., Samson, L.D., Schwartz, D.A., Shi, Y., Shin, J.L., Sieber, S.O., Slifer, S., Speer, M.C., Spencer, P.S., Sproles, D.I., Swenberg, J.A., Suk, W.A., Sullivan, R.C., Tian, R., Tennant, R.W., Todd, S.A., Tucker, C.J., Van Houten, B., Weis, B.K., Xuan, S., and Zarbl, H. (2005) Standardizing global gene expression analysis between laboratories and across platforms. Nat Methods 2: 351-356.

Barbacioru, C.C., Wang, Y., Canales, R.D., Sun, Y.A., Keys, D.N., Chan, F., Poulter, K.A., and Samaha, R.R. (2006) Effect of various normalization methods on Applied Biosystems expression array system data. BMC Bioinformatics 7: 533.

Barbosa, M.J., Rocha, J.M., Tramper, J., and Wijffels, R.H. (2001) Acetate as a carbon source for hydrogen production by photosynthetic bacteria. J Biotechnol 85: 25-33.

Barcenilla, A., Pryde, S.E., Martin, J.C., Duncan, S.H., Stewart, C.S., Henderson, C., and Flint, H.J. (2000) Phylogenetic relationships of butyrate-producing bacteria from the human gut. Appl Environ Microbiol 66: 1654-1661.

Barnard, A.M., Bowden, S.D., Burr, T., Coulthurst, S.J., Monson, R.E., and Salmond, G.P. (2007) Quorum sensing, virulence and secondary metabolite production in plant soft-rotting bacteria. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 362: 1165-1183.

Barnes, M., Freudenberg, J., Thompson, S., Aronow, B., and Pavlidis, P. (2005) Experimental comparison and cross-validation of the Affymetrix and Illumina gene expression analysis platforms. Nucleic Acids Res 33: 5914-5923.

Barriere, C., Veiga-da-Cunha, M., Pons, N., Guedon, E., van Hijum, S.A., Kok, J., Kuipers, O.P., Ehrlich, D.S., and Renault, P. (2005) Fructose utilization in Lactococcus lactis as a model for low-GC gram-positive bacteria: its regulator, signal, and DNA-binding site. J Bacteriol 187: 3752-3761.

Bassit, N., Boquien, C.Y., Picque, D., and Corrieu, G. (1993) Effect of Initial Oxygen Concentration on Diacetyl and Acetoin Production by Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis. Appl Environ Microbiol 59: 1893-1897.

Bassler, B.L. (2002) Small talk. Cell-to-cell communication in bacteria. Cell 109: 421-424. Basson NJ. (2000) Competition for glucose between Candida albicans and oral bacteria

grown in mixed culture in a chemostat. J Med Microbiol 49: 969-75. Bauer, W.D., and Robinson, J.B. (2002) Disruption of bacterial quorum sensing by other

organisms. Curr Opin Biotechnol 13: 234-237. Bauer, F.F., Pretorius, I.S. (2000) Yeast stress response and fermentation efficiency: how to

survive the making of wine—a review. S. Afr. J. Enol. Vitic. 21: 27-51


169

Beja, O., Suzuki, M.T., Heidelberg, J.F., Nelson, W.C., Preston, C.M., Hamada, T., Eisen, J.A., Fraser, C.M., and DeLong, E.F. (2002) Unsuspected diversity among marine aerobic anoxygenic phototrophs. Nature 415: 630-633.

Belenguer, A., Duncan, S.H., Calder, A.G., Holtrop, G., Louis, P., Lobley, G.E., and Flint, H.J. (2006) Two routes of metabolic cross-feeding between Bifidobacterium adolescentis and butyrate-producing anaerobes from the human gut. Appl Environ Microbiol 72: 3593-3599.

Ben Chaabane, F. (2006) Intensification de la production d’éthanol biocarburant dans un bioréacteur bi-étagé avec recyclage cellulaire : modélisation et stratégie et conduite. Thèse INSA Toulouse

Berlett, B.S., and Stadtman, E.R. (1997) Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress. J Biol Chem 272: 20313-20316.

Beyer, N.H., Roepstorff, P., Hammer, K., and Kilstrup, M. (2003) Proteome analysis of the purine stimulon from Lactococcus lactis. Proteomics 3: 786-797.

Bisson, L.F. (1999) Stuck and sluggish fermentations. Am. J. Enol. Vitic. 50: 107-119 Bjorkqvist, S., Ansell, R., Adler, L., and Liden, G. (1997) Physiological response to

anaerobicity of glycerol-3-phosphate dehydrogenase mutants of Saccharomyces cerevisiae. Appl Environ Microbiol 63: 128-132.

Blank, L.M., Koebmann, B.J., Michelsen, O., Nielsen, L.K., and Jensen, P.R. (2001) Hemin reconstitutes proton extrusion in an H(+)-ATPase-negative mutant of Lactococcus lactis. J Bacteriol 183: 6707-6709.

Boddy, L., and Wimpenny, J.W. (1992) Ecological concepts in food microbiology. Soc Appl Bacteriol Symp Ser 21: 23S-38S.

Bodrossy, L., Stralis-Pavese, N., Murrell, J.C., Radajewski, S., Weilharter, A., and Sessitsch, A. (2003) Development and validation of a diagnostic microbial microarray for methanotrophs. Environ Microbiol 5: 566-582.

Bolotin, A., Mauger, S., Malarme, K., Ehrlich, S.D., and Sorokin, A. (1999) Low-redundancy sequencing of the entire Lactococcus lactis IL1403 genome. Antonie Van Leeuwenhoek 76: 27-76.

Bolotin, A., Wincker, P., Mauger, S., Jaillon, O., Malarme, K., Weissenbach, J., Ehrlich, S.D., and Sorokin, A. (2001) The complete genome sequence of the lactic acid bacterium Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403. Genome Res 11: 731-753.

Bolstad, B.M., Irizarry, R.A., Astrand, M., and Speed, T.P. (2003) A comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias. Bioinformatics 19: 185-193.

Bonch-Osmolovskaya, E.A., and K.O. Stetter. (1991) Interspecies hydrogen transfer in cocultures of thermophilic Archaea. Syst. Appl. Microbiol. 14: 205-208.

Bosotti, R., Locatelli, G., Healy, S., Scacheri, E., Sartori, L., Mercurio, C., Calogero, R., and Isacchi, A. (2007) Cross platform microarray analysis for robust identification of differentially expressed genes. BMC Bioinformatics 8 Suppl 1: S5.

Bourriaud, C., Robins, R.J., Martin, L., Kozlowski, F., Tenailleau, E., Cherbut, C., and Michel, C. (2005) Lactate is mainly fermented to butyrate by human intestinal microfloras but inter-individual variation is evident. J Appl Microbiol 99: 201-212.

Bouzar, F., Cerning, J., Desmazeaud, M. (1997) Exopolysaccharide production and texture-promoting abilities of mixed-strain starter cultures in yogurt production. J Dairy Sci 80: 2310-2317.

Boyaval, P. (1989) Lactic acid bacteria and metal ions. Lait 69: 87-113.


170

Branda, S.S., Vik, S., Friedman, L., and Kolter, R. (2005) Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol 13: 20-26.

Brooijmans, R.J., Poolman, B., Schuurman-Wolters, G.K., de Vos, W.M., and Hugenholtz, J. (2007) Generation of a membrane potential by Lactococcus lactis through aerobic electron transport. J Bacteriol 189: 5203-5209.

Brooks, G.A. (2002) Lactate shuttles in nature. Biochem Soc Trans 30: 258-264. Brurberg, M.B., Nes, I.F., and Eijsink, V.G. (1997) Pheromone-induced production of

antimicrobial peptides in Lactobacillus. Mol Microbiol 26: 347-360. Budin-Verneuil, A., Pichereau, V., Auffray, Y., Ehrlich, D.S., and Maguin, E. (2005)

Proteomic characterization of the acid tolerance response in Lactococcus lactis MG1363. Proteomics 5: 4794-4807.

Budin-Verneuil, A., Pichereau, V., Auffray, Y., Ehrlich, D., and Maguin, E. (2007) Proteome phenotyping of acid stress-resistant mutants of Lactococcus lactis MG1363. Proteomics 7: 2038-2046.

C

Camara, M., Williams, P., and Hardman, A. (2002) Controlling infection by tuning in and turning down the volume of bacterial small-talk. Lancet Infect Dis 2: 667-676.

Casalone, E., Barberio, C., Cappellini, L., and Polsinelli, M. (2005) Characterization of Saccharomyces cerevisiae natural populations for pseudohyphal growth and colony morphology. Res Microbiol 156: 191-200.

Castiglioni, B., Rizzi, E., Frosini, A., Sivonen, K., Rajaniemi, P., Rantala, A., Mugnai, M.A., Ventura, S., Wilmotte, A., Boutte, C., Grubisic, S., Balthasart, P., Consolandi, C., Bordoni, R., Mezzelani, A., Battaglia, C., and De Bellis, G. (2004) Development of a universal microarray based on the ligation detection reaction and 16S rrna gene polymorphism to target diversity of cyanobacteria. Appl Environ Microbiol 70: 7161-7172.

Cavalieri, D., Barberio, C., Casalone, E. (1998) Genetic and molecular diversity in S. cerevisiae natural populations. Food Technology and Biotechnology 36: 45-50

Chambellon, E., and Yvon, M. (2003) CodY-regulated aminotransferases AraT and BcaT play a major role in the growth of Lactococcus lactis in milk by regulating the intracellular pool of amino acids. Appl Environ Microbiol 69: 3061-3068.

Champagne, C.P., Goulet, J., and Lachance, R.A. (1990) Production of Bakers' Yeast in Cheese Whey Ultrafiltrate. Appl Environ Microbiol 56: 425-430.

Charron, M.J., Dubin, R.A., and Michels, C.A. (1986) Structural and functional analysis of the MAL1 locus of Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 6: 3891-3899.

Chassard, C., and Bernalier-Donadille, A. (2006) H2 and acetate transfers during xylan fermentation between a butyrate-producing xylanolytic species and hydrogenotrophic microorganisms from the human gut. FEMS Microbiol Lett 254: 116-122.

Cheirsilp, B., Shimizu, H., and Shioya, S. (2003a) Enhanced kefiran production by mixed culture of Lactobacillus kefiranofaciens and Saccharomyces cerevisiae. J Biotechnol 100: 43-53.

Cheirsilp, B., Shoji, H., Shimizu, H., and Shioya, S. (2003b) Interactions between Lactobacillus kefiranofaciens and Saccharomyces cerevisiae in mixed culture for kefiran production. J Biosci Bioeng 96: 279-284.


171

Chen, H., Fujita, M., Feng, Q., Clardy, J., and Fink, G.R. (2004) Tyrosol is a quorum-sensing molecule in Candida albicans. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 5048-5052.

Cholet, O., Henaut, A., Casaregola, S., and Bonnarme, P. (2007) Gene expression and biochemical analysis of cheese-ripening yeasts: focus on catabolism of L-methionine, lactate, and lactose. Appl Environ Microbiol 73: 2561-2570.

Chopin, A., Chopin, M.C., Moillo-Batt, A., and Langella, P. (1984) Two plasmid-determined restriction and modification systems in Streptococcus lactis. Plasmid 11: 260-263.

Charoenchai, C., Fleet, G.H., Henschke, P.A., Todd, B.E.N. (1997) Screening of non-Saccharomyces wine yeasts for the presence of extracellular hydrolytic enzymes. Aust. J. Grape Wine Res 3: 2-8.

Clevel, W.S. and Devlin, S.J. (1988) Locally-weighted regression: An approach to regression analysis by local fitting. Journal of the American Statistical Association 83: 596-610

Cocaign-Bousquet, M., and Lindley, N.D. (1995) Pyruvate overflow and carbon flux within the central metablic pathway of Corynebacterium glutamicum during growth on lactate. Enz Microbiol Technol 17: 260-267.

Cocaign-Bousquet, M., Garrigues, C., Loubiere, P., and Lindley, N.D. (1996) Physiology of pyruvate metabolism in Lactococcus lactis. Antonie Van Leeuwenhoek 70: 253-267.

Cocaign-Bousquet, M., Even, S., Lindley, N.D., and Loubiere, P. (2002) Anaerobic sugar catabolism in Lactococcus lactis: genetic regulation and enzyme control over pathway flux. Appl Microbiol Biotechnol 60: 24-32.

Condon, S. (1987) Responses of lactic acid bacteria to oxygen. FEMS Microbiol Rev 46:269-280

Corsetti, A., Lavermicocca, P., Morea, M., Baruzzi, F., Tosti, N., and Gobbetti, M. (2001) Phenotypic and molecular identification and clustering of lactic acid bacteria and yeasts from wheat (species Triticum durum and Triticum aestivum) sourdoughs of Southern Italy. Int J Food Microbiol 64: 95-104.

Corsetti, A., Rossi, J., and Gobbetti, M. (2001) Interactions between yeasts and bacteria in the smear surface-ripened cheeses. Int J Food Microbiol 69: 1-10.

Costerton, B. (2004) Microbial ecology comes of age and joins the general ecology community. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 16983-16984.

Courtin, P., Monnet, V., and Rul, F. (2002) Cell-wall proteinases PrtS and PrtB have a different role in Streptococcus thermophilus/Lactobacillus bulgaricus mixed cultures in milk. Microbiology 148: 3413-3421.

Courtin, P. and Rul, F. (2004) Interactions between microorganisms in a simple ecosystem: yogurt bacteria as a study model. Lait 84:125-134.

Crabtree, H.G. (1929) Observations on the carbohydrate metabolism of tumours. Biochem J 23: 536-545.

Crow, V.L., and Pritchard, G.G. (1977) Fructose 1,6-diphosphate-activated L-lactate dehydrogenase from Streptococcus lactis: kinetic properties and factors affecting activation. J Bacteriol 131: 82-91.

Cvitkovitch, D.G., Boyd, D.A., and Hamilton, I.R. (1995a) Regulation of sugar uptake via the multiple sugar metabolism operon by the phosphoenolpyruvate-dependent sugar phosphotransferase transport system of Streptococcus mutans. Dev Biol Stand 85: 351-356.

Cvitkovitch, D.G., Boyd, D.A., Thevenot, T., and Hamilton, I.R. (1995b) Glucose transport by a mutant of Streptococcus mutans unable to accumulate sugars via the phosphoenolpyruvate phosphotransferase system. J Bacteriol 177: 2251-2258.


172

D

de Jong-Gubbels, P., Vanrolleghem, P., Heijnen, S., van Dijken, J.P., and Pronk, J.T. (1995) Regulation of carbon metabolism in chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae grown on mixtures of glucose and ethanol. Yeast 11: 407-418.

de Koning, D.J., Jaffrezic, F., Lund, M.S., Watson, M., Channing, C., Hulsegge, I., Pool, M.H., Buitenhuis, B., Hedegaard, J., Hornshoj, H., Jiang, L., Sorensen, P., Marot, G., Delmas, C., Le Cao, K.A., San Cristobal, M., Baron, M.D., Malinverni, R., Stella, A., Brunner, R.M., Seyfert, H.M., Jensen, K., Mouzaki, D., Waddington, D., Jimenez-Marin, A., Perez-Alegre, M., Perez-Reinado, E., Closset, R., Detilleux, J.C., Dovc, P., Lavric, M., Nie, H., and Janss, L. (2007) The EADGENE Microarray Data Analysis Workshop (open access publication). Genet Sel Evol 39: 621-631.

de Saizieu, A., Certa, U., Warrington, J., Gray, C., Keck, W., and Mous, J. (1998) Bacterial transcript imaging by hybridization of total RNA to oligonucleotide arrays. Nat Biotechnol 16: 45-48.

de Vos, W.M., Kleerebezem, M., and Kuipers, O.P. (1997) Expression systems for industrial Gram-positive bacteria with low guanine and cytosine content. Curr Opin Biotechnol 8: 547-553.

de Vos, W.M., and Hugenholtz, J. (2004) Engineering metabolic highways in Lactococci and other lactic acid bacteria. Trends Biotechnol 22: 72-79.

Delorme, C., Ehrlich, S.D., and Renault, P. (1992) Histidine biosynthesis genes in Lactococcus lactis subsp. lactis. J Bacteriol 174: 6571-6579.

Delorme, C., Ehrlich, S.D., and Renault, P. (1999) Regulation of expression of the Lactococcus lactis histidine operon. J Bacteriol 181: 2026-2037.

Desmazeaud, M. (1983) L’état des connaissances en matière de nutrition des bactéries lactiques. Lait 63: 267-316.

den Hengst, C.D., Curley, P., Larsen, R., Buist, G., Nauta, A., van Sinderen, D., Kuipers, O.P., and Kok, J. (2005) Probing direct interactions between CodY and the oppD promoter of Lactococcus lactis. J Bacteriol 187: 512-521.

den Hengst, C.D., Groeneveld, M., Kuipers, O.P., and Kok, J. (2006) Identification and functional characterization of the Lactococcus lactis CodY-regulated branched-chain amino acid permease BcaP (CtrA). J Bacteriol 188: 3280-3289.

den Hollander, J.A., Behar, K.L., and Shulman, R.G. (1981) 13C NMR study of transamination during acetate utilization by Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U S A 78: 2693-2697.

Dennis, P., Edwards, E.A., Liss, S.N., and Fulthorpe, R. (2003) Monitoring gene expression in mixed microbial communities by using DNA microarrays. Appl Environ Microbiol 69: 769-778.

DeRisi, J.L., Iyer, V.R., and Brown, P.O. (1997) Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale. Science 278: 680-686.

Derzelle, S., Duchaud, E., Kunst, F., Danchin, A., and Bertin, P. (2002) Identification, characterization, and regulation of a cluster of genes involved in carbapenem biosynthesis in Photorhabdus luminescens. Appl Environ Microbiol 68: 3780-3789.

Deutschbauer, A.M., and Davis, R.W. (2005) Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast. Nat Genet 37: 1333-1340.


173

Deutscher, J., and Saier, M.H., Jr. (1983) ATP-dependent protein kinase-catalyzed phosphorylation of a seryl residue in HPr, a phosphate carrier protein of the phosphotransferase system in Streptococcus pyogenes. Proc Natl Acad Sci U S A 80: 6790-6794.

Djordjevic, G.M., Tchieu, J.H., and Saier, M.H., Jr. (2001) Genes involved in control of galactose uptake in Lactobacillus brevis and reconstitution of the regulatory system in Bacillus subtilis. J Bacteriol 183: 3224-3236.

Dobbin, K.K., Beer, D.G., Meyerson, M., Yeatman, T.J., Gerald, W.L., Jacobson, J.W., Conley, B., Buetow, K.H., Heiskanen, M., Simon, R.M., Minna, J.D., Girard, L., Misek, D.E., Taylor, J.M., Hanash, S., Naoki, K., Hayes, D.N., Ladd-Acosta, C., Enkemann, S.A., Viale, A., and Giordano, T.J. (2005) Interlaboratory comparability study of cancer gene expression analysis using oligonucleotide microarrays. Clin Cancer Res 11: 565-572.

Dong, Y.H., Xu, J.L., Li, X.Z., and Zhang, L.H. (2000) AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora. Proc Natl Acad Sci U S A 97: 3526-3531.

Dong, Y.H., Zhang, X.F., Soo, H.M., Greenberg, E.P., and Zhang, L.H. (2005) The two-component response regulator PprB modulates quorum-sensing signal production and global gene expression in Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol 56: 1287-1301.

Dorigo, U., Volatier, L., and Humbert, J.F. (2005) Molecular approaches to the assessment of biodiversity in aquatic microbial communities. Water Res 39: 2207-2218.

Dossonnet, V., Monedero, V., Zagorec, M., Galinier, A., Perez-Martinez, G., and Deutscher, J. (2000) Phosphorylation of HPr by the bifunctional HPr Kinase/P-ser-HPr phosphatase from Lactobacillus casei controls catabolite repression and inducer exclusion but not inducer expulsion. J Bacteriol 182: 2582-2590.

Dow, J.M., Crossman, L., Findlay, K., He, Y.Q., Feng, J.X., and Tang, J.L. (2003) Biofilm dispersal in Xanthomonas campestris is controlled by cell-cell signaling and is required for full virulence to plants. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 10995-11000.

Drysdale, G.S., Fleet, G.H., (1989) The effect of acetic acid bacteria upon the growth and metabolism of yeast during the fermentation of grape juice. J. Appl. Bacteriol. 67: 471-481.

Dujon, B. (1996) The yeast genome project: what did we learn? Trends Genet 12: 263-270. Dunbar, J., Barns, S.M., Ticknor, L.O., and Kuske, C.R. (2002) Empirical and theoretical

bacterial diversity in four Arizona soils. Appl Environ Microbiol 68: 3035-3045. Duncan, S.H., Holtrop, G., Lobley, G.E., Calder, A.G., Stewart, C.S., and Flint, H.J. (2004)

Contribution of acetate to butyrate formation by human faecal bacteria. Br J Nutr 91: 915-923.

Dunny, G.M. (2007) The peptide pheromone-inducible conjugation system of Enterococcus faecalis plasmid pCF10: cell-cell signalling, gene transfer, complexity and evolution. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 362: 1185-1193.

Duwat, P., de Oliveira, R., Ehrlich, S.D., and Boiteux, S. (1995a) Repair of oxidative DNA damage in gram-positive bacteria: the Lactococcus lactis Fpg protein. Microbiology 141 (Pt 2): 411-417.

Duwat, P., Ehrlich, S.D., and Gruss, A. (1995b) The recA gene of Lactococcus lactis: characterization and involvement in oxidative and thermal stress. Mol Microbiol 17: 1121-1131.


174

Duwat, P., Sourice, S., Ehrlich, S.D., and Gruss, A. (1995c) recA gene involvement in oxidative and thermal stress in Lactococcus lactis. Dev Biol Stand 85: 455-467.

Duwat, P., Ehrlich, S.D., and Gruss, A. (1999) Effects of metabolic flux on stress response pathways in Lactococcus lactis. Mol Microbiol 31: 845-858.

Duwat, P., Sourice, S., Cesselin, B., Lamberet, G., Vido, K., Gaudu, P., Le Loir, Y., Violet, F., Loubiere, P., and Gruss, A. (2001) Respiration capacity of the fermenting bacterium Lactococcus lactis and its positive effects on growth and survival. J Bacteriol 183: 4509-4516.

E Egland, P.G., Palmer, R.J., Jr., and Kolenbrander, P.E. (2004) Interspecies communication in

Streptococcus gordonii-Veillonella atypica biofilms: signaling in flow conditions requires juxtaposition. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 16917-16922.

Eijsink, V.G., Brurberg, M.B., Middelhoven, P.H., and Nes, I.F. (1996) Induction of bacteriocin production in Lactobacillus sakei by a secreted peptide. J Bacteriol 178: 2232-2237.

El-abassy, M.Z. and Sitohy, M. (1993) Metabolic interaction between Streptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus in single and mixed starter yoghurts. Die Nahrung. 37: 53-58.

Elagoz, A., Abdi, A., Hubert, J.C., and Kammerer, B. (1996) Structure and organisation of the pyrimidine biosynthesis pathway genes in Lactobacillus plantarum: a PCR strategy for sequencing without cloning. Gene 182: 37-43.

Eppert, I., Valdes-Stauber, N., Gotz, H., Busse, M., and Scherer, S. (1997) Growth reduction of Listeria spp. caused by undefined industrial red smear cheese cultures and bacteriocin-producing Brevibacterium lines as evaluated in situ on soft cheese. Appl Environ Microbiol 63: 4812-4817.

Erlandson, K.A., Park, J.H., Wissam, El, K., Kao, H.H., Basaran, P., Brydges, S., and Batt, C.A. (2000) Dissolution of xylose metabolism in Lactococcus lactis. Appl Environ Microbiol 66: 3974-3980.

Even, S., Garrigues, C., Loubiere, P., Lindley, N.D., and Cocaign-Bousquet, M. (1999) Pyruvate metabolism in Lactococcus lactis is dependent upon glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase activity. Metab Eng 1: 198-205.

Even, S., Lindley, N.D., and Cocaign-Bousquet, M. (2001) Molecular physiology of sugar catabolism in Lactococcus lactis IL1403. J Bacteriol 183: 3817-3824.

F

Fahey, R.C., Brown, W.C., Adams, W.B., and Worsham, M.B. (1978) Occurrence of glutathione in bacteria. J Bacteriol 133: 1126-1129.

Faparusi, S.I., Olofinboba, M.O., and Ekundayo, J.A. (1973) The microbiology of burukutu beer. Z Allg Mikrobiol 13: 563-568.

Farr, S.B., and Kogoma, T. (1991) Oxidative stress responses in Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Microbiol Rev 55: 561-585.


175

Fernandez, M., Kleerebezem, M., Kuipers, O.P., Siezen, R.J., and van Kranenburg, R. (2002) Regulation of the metC-cysK operon, involved in sulfur metabolism in Lactococcus lactis. J Bacteriol 184: 82-90.

Fleet, G. (1992) Spoilage yeasts. Crit Rev Biotechnol 12: 1-44. Fleet, G.H. (2003) Yeast interactions and wine flavour. Int J Food Microbiol 86: 11-22. Flint, H.J., Duncan, S.H., Scott, K.P., and Louis, P. (2007) Interactions and competition

within the microbial community of the human colon: links between diet and health. Environ Microbiol 9: 1101-1111.

Frantz, S. (2005) An array of problems. Nat Rev Drug Discov 4: 362-363. Fridovich, I. (1989) Superoxide dismutases. An adaptation to a paramagnetic gas. J Biol

Chem 264: 7761-7764. Fridovich, I. (1998) Oxygen toxicity: a radical explanation. J Exp Biol 201: 1203-1209. Fujita, A., Sato, J.R., Rodrigues Lde, O., Ferreira, C.E., and Sogayar, M.C. (2006) Evaluating

different methods of microarray data normalization. BMC Bioinformatics 7: 469.2402. Fuqua, C., Winans, S.C., and Greenberg, E.P. (1996) Census and consensus in bacterial

ecosystems: the LuxR-LuxI family of quorum-sensing transcriptional regulators. Annu Rev Microbiol 50: 727-751.

Fuqua, C., and Greenberg, E.P. (2002) Listening in on bacteria: acyl-homoserine lactone signalling. Nat Rev Mol Cell Biol 3: 685-695.

G

Gadaga, T.H., Mutukumira, A.N., and Narvhus, J.A. (2001) The growth and interaction of yeasts and lactic acid bacteria isolated from Zimbabwean naturally fermented milk in UHT milk. Int J Food Microbiol 68: 21-32.

Gagiano, M., Bauer, F.F., and Pretorius, I.S. (2002) The sensing of nutritional status and the relationship to filamentous growth in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res 2: 433-470.

Ganesan, B., Stuart, M.R., and Weimer, B.C. (2007) Carbohydrate starvation causes a metabolically active but nonculturable state in Lactococcus lactis. Appl Environ Microbiol 73: 2498-2512.

Gans, J., Wolinsky, M., and Dunbar, J. (2005) Computational improvements reveal great bacterial diversity and high metal toxicity in soil. Science 309: 1387-1390.

Garrigues, C., Loubiere, P., Lindley, N.D., and Cocaign-Bousquet, M. (1997) Control of the shift from homolactic acid to mixed-acid fermentation in Lactococcus lactis: predominant role of the NADH/NAD+ ratio. J Bacteriol 179: 5282-5287.

Garrote, G.L., Abraham, A.G., and De Antoni, G.L. (2001) Chemical and microbiological characterisation of kefir grains. J Dairy Res 68: 639-652.

Gaudu, P., Vido, K., Cesselin, B., Kulakauskas, S., Tremblay, J., Rezaiki, L., Lamberret, G., Sourice, S., Duwat, P., and Gruss, A. (2002) Respiration capacity and consequences in Lactococcus lactis. Antonie Van Leeuwenhoek 82: 263-269.

Gaudu, P., Lamberet, G., Poncet, S., and Gruss, A. (2003) CcpA regulation of aerobic and respiration growth in Lactococcus lactis. Mol Microbiol 50: 183-192.

Ghim, S.Y., and Neuhard, J. (1994) The pyrimidine biosynthesis operon of the thermophile Bacillus caldolyticus includes genes for uracil phosphoribosyltransferase and uracil permease. J Bacteriol 176: 3698-3707.


176

Gibson, G.R., and Wang, X. (1994) Regulatory effects of bifidobacteria on the growth of other colonic bacteria. J Appl Bacteriol 77: 412-420.

Givskov, M., de Nys, R., Manefield, M., Gram, L., Maximilien, R., Eberl, L., Molin, S., Steinberg, P.D., and Kjelleberg, S. (1996) Eukaryotic interference with homoserine lactone-mediated prokaryotic signalling. J Bacteriol 178: 6618-6622.

Godon, J.J., Delorme, C., Ehrlich, S.D., and Renault, P. (1992) Divergence of Genomic Sequences between Lactococcus lactis subsp. lactis and Lactococcus lactis subsp. cremoris. Appl Environ Microbiol 58: 4045-4047.

Godon, J.J., Delorme, C., Bardowski, J., Chopin, M.C., Ehrlich, S.D., and Renault, P. (1993) Gene inactivation in Lactococcus lactis: branched-chain amino acid biosynthesis. J Bacteriol 175: 4383-4390.

Goffeau, A., Barrell, B.G., Bussey, H., Davis, R.W., Dujon, B., Feldmann, H., Galibert, F., Hoheisel, J.D., Jacq, C., Johnston, M., Louis, E.J., Mewes, H.W., Murakami, Y., Philippsen, P., Tettelin, H., and Oliver, S.G. (1996) Life with 6000 genes. Science 274: 546, 563-547.

Gojkovic, Z., Knecht, W., Zameitat, E., Warneboldt, J., Coutelis, J.B., Pynyaha, Y., Neuveglise, C., Moller, K., Loffler, M., and Piskur, J. (2004) Horizontal gene transfer promoted evolution of the ability to propagate under anaerobic conditions in yeasts. Mol Genet Genomics 271: 387-393.

Gomez, X., Moran, A., Cuetos, M.J., Sanchez, M.E. (2006) The production of hydrogen by dark fermentation of municipal solid wastes and slaughterhouse waste: a two-phase process. J Power Sources 157: 727-732.

Gonzalez, E. (1977) Two-carbon assimilative capacity and the induction of isocitrate lyase in Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol 129: 1343-1348.

Gossner, A.S., Devereux, R., Ohnemuller, N., Acker, G., Stackebrandt, E., and Drake, H.L. (1999) Thermicanus aegyptius gen. nov., sp. nov., isolated from oxic soil, a fermentative microaerophile that grows commensally with the thermophilic acetogen Moorella thermoacetica. Appl Environ Microbiol 65: 5124-5133.

Gossner, A.S., Kusel, K., Schulz, D., Trenz, S., Acker, G., Lovell, C.R., and Drake, H.L. (2006) Trophic interaction of the aerotolerant anaerobe Clostridium intestinale and the acetogen Sporomusa rhizae sp. nov. isolated from roots of the black needlerush Juncus roemerianus. Microbiology 152: 1209-1219.

Goupil-Feuillerat, N., Corthier, G., Godon, J.J., Ehrlich, S.D., and Renault, P. (2000) Transcriptional and translational regulation of alpha-acetolactate decarboxylase of Lactococcus lactis subsp. lactis. J Bacteriol 182: 5399-5408.

Grad, L.I., Sayles, L.C., and Lemire, B.D. (2005) Introduction of an additional pathway for lactate oxidation in the treatment of lactic acidosis and mitochondrial dysfunction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 18367-18372.

Gray, K.M. (1997) Intercellular communication and group behavior in bacteria. Trends Microbiol 5: 184-188.

Griffin, H.G., Swindell, S.R., and Gasson, M.J. (1992) Cloning and sequence analysis of the gene encoding L-lactate dehydrogenase from Lactococcus lactis: evolutionary relationships between 21 different LDH enzymes. Gene 122: 193-197.

Guedon, E., Renault, P., Ehrlich, S.D., and Delorme, C. (2001) Transcriptional pattern of genes coding for the proteolytic system of Lactococcus lactis and evidence for coordinated regulation of key enzymes by peptide supply. J Bacteriol 183: 3614-3622.


177

Guedon, E., Jamet, E., and Renault, P. (2002) Gene regulation in Lactococcus lactis: the gap between predicted and characterized regulators. Antonie Van Leeuwenhoek 82: 93-112.

Guedon, E., Sperandio, B., Pons, N., Ehrlich, S.D., and Renault, P. (2005) Overall control of nitrogen metabolism in Lactococcus lactis by CodY, and possible models for CodY regulation in Firmicutes. Microbiology 151: 3895-3909.

Guerrero, R., Piqueras, M., and Berlanga, M. (2002) Microbial mats and the search for minimal ecosystems. Int Microbiol 5: 177-188.

Guerrero, R., and Berlanga, M. (2006) Life's unity and flexibility: the ecological link. Int Microbiol 9: 225-235.

Guillot, A., Gitton, C., Anglade, P., and Mistou, M.Y. (2003) Proteomic analysis of Lactococcus lactis, a lactic acid bacterium. Proteomics 3: 337-354.

Guschin, D.Y., Mobarry, B.K., Proudnikov, D., Stahl, D.A., Rittmann, B.E., and Mirzabekov, A.D. (1997) Oligonucleotide microchips as genosensors for determinative and environmental studies in microbiology. Appl Environ Microbiol 63: 2397-

H

Hartemink, A., Gifford, D., Jaakkola, T., Young, R. (2001) Maximum likelihood estimation of optimal scaling factors for expression array normalization. In: Bittner, M., Chen, Y., Dorsel, A., Dougherty, E. editor. Microarrays: Optical Technologies and Informatics, Proceedings of SPIE. 4266: 132-140.

Hauge, H.H., Mantzilas, D., Moll, G.N., Konings, W.N., Driessen, A.J., Eijsink, V.G., and Nissen-Meyer, J. (1998) Plantaricin A is an amphiphilic alpha-helical bacteriocin-like pheromone which exerts antimicrobial and pheromone activities through different mechanisms. Biochemistry 37: 16026-16032.

Helinck, S., Le Bars, D., Moreau, D., and Yvon, M. (2004) Ability of thermophilic lactic acid bacteria to produce aroma compounds from amino acids. Appl Environ Microbiol 70: 3855-3861.

Henkin, T.M. (1996) The role of CcpA transcriptional regulator in carbon metabolism in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol Lett 135: 9-15.

Hogan, D.A., Vik, A., and Kolter, R. (2004) A Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing molecule influences Candida albicans morphology. Mol Microbiol 54: 1212-1223.

Hogan, D.A. (2006) Talking to themselves: autoregulation and quorum sensing in fungi. Eukaryot Cell 5: 613-619.

Holzapfel, W.H., Haberer, P., Geisen, R., Bjorkroth, J., and Schillinger, U. (2001) Taxonomy and important features of probiotic microorganisms in food and nutrition. Am J Clin Nutr 73: 365S-373S.

Hornby, J.M., Jensen, E.C., Lisec, A.D., Tasto, J.J., Jahnke, B., Shoemaker, R., Dussault, P., and Nickerson, K.W. (2001) Quorum sensing in the dimorphic fungus Candida albicans is mediated by farnesol. Appl Environ Microbiol 67: 2982-2992.

Huang, S., Zhou, H., Katzmann, D., Hochstrasser, M., Atanasova, E., and Zhang, Z. (2005) Rtt106p is a histone chaperone involved in heterochromatin-mediated silencing. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 13410-13415.


178

Huber, W., von Heydebreck, A., Sultmann, H., Poustka, A., and Vingron, M. (2002) Variance stabilization applied to microarray data calibration and to the quantification of differential expression. Bioinformatics 18 Suppl 1: S96-104.

Huttunen, E., Noro, K., and Yang, Z. (1995) Purification and identification of antimicrobial substances produced by two Lactobacillus casei strains. Int. Dairy J., 5: 503-513.

I

Ioannidis, J.P. (2005) Microarrays and molecular research: noise discovery? Lancet 365: 454-455.

Irizarry, R.A., Warren, D., Spencer, F., Kim, I.F., Biswal, S., Frank, B.C., Gabrielson, E., Garcia, J.G., Geoghegan, J., Germino, G., Griffin, C., Hilmer, S.C., Hoffman, E., Jedlicka, A.E., Kawasaki, E., Martinez-Murillo, F., Morsberger, L., Lee, H., Petersen, D., Quackenbush, J., Scott, A., Wilson, M., Yang, Y., Ye, S.Q., and Yu, W. (2005) Multiple-laboratory comparison of microarray platforms. Nat Methods 2: 345-350.

J Jaffrezic, F., de Koning, D.J., Boettcher, P.J., Bonnet, A., Buitenhuis, B., Closset, R., Dejean,

S., Delmas, C., Detilleux, J.C., Dovc, P., Duval, M., Foulley, J.L., Hedegaard, J., Hornshoj, H., Hulsegge, I., Janss, L., Jensen, K., Jiang, L., Lavric, M., Le Cao, K.A., Lund, M.S., Malinverni, R., Marot, G., Nie, H., Petzl, W., Pool, M.H., Robert-Granie, C., San Cristobal, M., van Schothorst, E.M., Schuberth, H.J., Sorensen, P., Stella, A., Tosser-Klopp, G., Waddington, D., Watson, M., Yang, W., Zerbe, H., and Seyfert, H.M. (2007) Analysis of the real EADGENE data set: comparison of methods and guidelines for data normalisation and selection of differentially expressed genes (open access publication). Genet Sel Evol 39: 633-650.

Jarvinen, A.K., Hautaniemi, S., Edgren, H., Auvinen, P., Saarela, J., Kallioniemi, O.P., and Monni, O. (2004) Are data from different gene expression microarray platforms comparable? Genomics 83: 1164-1168.

Jeffery, I.B., Higgins, D.G., and Culhane, A.C. (2006) Comparison and evaluation of methods for generating differentially expressed gene lists from microarray data. BMC Bioinformatics 7: 359.

Jensen, N.B., Melchiorsen, C.R., Jokumsen, K.V., and Villadsen, J. (2001) Metabolic behavior of Lactococcus lactis MG1363 in microaerobic continuous cultivation at a low dilution rate. Appl Environ Microbiol 67: 2677-2682.

Jensen, P.R., and Hammer, K. (1993) Minimal Requirements for Exponential Growth of Lactococcus lactis. Appl Environ Microbiol 59: 4363-4366.

Ji, G., Beavis, R., and Novick, R.P. (1997) Bacterial interference caused by autoinducing peptide variants. Science 276: 2027-2030.

Johnson, M.R., Conners, S.B., Montero, C.I., Chou, C.J., Shockley, K.R., and Kelly, R.M. (2006) The Thermotoga maritima phenotype is impacted by syntrophic interaction with Methanococcus jannaschii in hyperthermophilic coculture. Appl Environ Microbiol 72: 811-818.

Joint, I., Tait, K., Callow, M.E., Callow, J.A., Milton, D., Williams, P., and Camara, M. (2002) Cell-to-cell communication across the prokaryote-eukaryote boundary. Science 298: 1207.


179

Joint, I., Allan Downie, J., and Williams, P. (2007) Bacterial conversations: talking, listening and eavesdropping. An introduction. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 362: 1115-1117.

Jorgensen, C.M., Hammer, K., and Martinussen, J. (2003) CTP limitation increases expression of CTP synthase in Lactococcus lactis. J Bacteriol 185: 6562-6574.

Jorgensen, C.M., Hammer, K., Jensen, P.R., and Martinussen, J. (2004) Expression of the pyrG gene determines the pool sizes of CTP and dCTP in Lactococcus lactis. Eur J Biochem 271: 2438-2445.

Jurata, L.W., Bukhman, Y.V., Charles, V., Capriglione, F., Bullard, J., Lemire, A.L., Mohammed, A., Pham, Q., Laeng, P., Brockman, J.A., and Altar, C.A. (2004) Comparison of microarray-based mRNA profiling technologies for identification of psychiatric disease and drug signatures. J Neurosci Methods 138: 173-188.

K

Kalinowski, J., Bathe, B., Bartels, D., Bischoff, N., Bott, M., Burkovski, A., Dusch, N.,

Eggeling, L., Eikmanns, B.J., Gaigalat, L., Goesmann, A., Hartmann, M., Huthmacher, K., Kramer, R., Linke, B., McHardy, A.C., Meyer, F., Mockel, B., Pfefferle, W., Puhler, A., Rey, D.A., Ruckert, C., Rupp, O., Sahm, H., Wendisch, V.F., Wiegrabe, I., and Tauch, A. (2003) The complete Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 genome sequence and its impact on the production of L-aspartate-derived amino acids and vitamins. J Biotechnol 104: 5-25.

Kandler, O. (1983) Carbohydrate metabolism in lactic acid bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek 49: 209-224.

Keller, L., and Surette, M.G. (2006) Communication in bacteria: an ecological and evolutionary perspective. Nat Rev Microbiol 4: 249-258.

Kestler, H.A., Muller, A., Gress, T.M., and Buchholz, M. (2005) Generalized Venn diagrams: a new method of visualizing complex genetic set relations. Bioinformatics 21: 1592-1595.

Khunajakr, N., Liu, C.Q., Charoenchai, P., and Dunn, N.W. (1999) A plasmid-encoded two-component regulatory system involved in copper-inducible transcription in Lactococcus lactis. Gene 229: 229-235.

Kieronczyk, A., Skeie, S., Langsrud, T., and Yvon, M. (2003) Cooperation between Lactococcus lactis and nonstarter lactobacilli in the formation of cheese aroma from amino acids. Appl Environ Microbiol 69: 734-739.

Kilstrup, M., Jessing, S.G., Wichmand-Jorgensen, S.B., Madsen, M., and Nilsson, D. (1998) Activation control of pur gene expression in Lactococcus lactis: proposal for a consensus activator binding sequence based on deletion analysis and site-directed mutagenesis of purC and purD promoter regions. J Bacteriol 180: 3900-3906.

Kilstrup, M., and Martinussen, J. (1998) A transcriptional activator, homologous to the Bacillus subtilis PurR repressor, is required for expression of purine biosynthetic genes in Lactococcus lactis. J Bacteriol 180: 3907-3916.

Kilstrup, M., Hammer, K., Ruhdal Jensen, P., and Martinussen, J. (2005) Nucleotide metabolism and its control in lactic acid bacteria. FEMS Microbiol Rev 29: 555-590.


180

Kives, J., Guadarrama, D., Orgaz, B., Rivera-Sen, A., Vazquez, J., and SanJose, C. (2005) Interactions in biofilms of Lactococcus lactis ssp. cremoris and Pseudomonas fluorescens cultured in cold UHT milk. J Dairy Sci 88: 4165-4171.

Kleerebezem, M., Quadri, L.E., Kuipers, O.P., and de Vos, W.M. (1997) Quorum sensing by peptide pheromones and two-component signal-transduction systems in Gram-positive bacteria. Mol Microbiol 24: 895-904.

Kleerebezem, M., Boekhorst, J., van Kranenburg, R., Molenaar, D., Kuipers, O.P., Leer, R., Tarchini, R., Peters, S.A., Sandbrink, H.M., Fiers, M.W., Stiekema, W., Lankhorst, R.M., Bron, P.A., Hoffer, S.M., Groot, M.N., Kerkhoven, R., de Vries, M., Ursing, B., de Vos, W.M., and Siezen, R.J. (2003) Complete genome sequence of Lactobacillus plantarum WCFS1. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 1990-1995.

Kleerebezem, R., and van Loosdrecht, M.C. (2007) Mixed culture biotechnology for bioenergy production. Curr Opin Biotechnol 18: 207-212.

Kleerebezem, R., Macarie, H. (2003) Treating industrial wastewater: Anaerobic digestion comes of age. Chem Eng 110: 56-64.

Koebmann, B., Solem, C., and Jensen, P.R. (2005) Control analysis as a tool to understand the formation of the las operon in Lactococcus lactis. Febs J 272: 2292-2303.

Koebmann, B.J., Nilsson, D., Kuipers, O.P., and Jensen, P.R. (2000) The membrane-bound H(+)-ATPase complex is essential for growth of Lactococcus lactis. J Bacteriol 182: 4738-4743.

Koebmann, B.J., Andersen, H.W., Solem, C., and Jensen, P.R. (2002) Experimental determination of control of glycolysis in Lactococcus lactis. Antonie Van Leeuwenhoek 82: 237-248.

Konings, W.N., Lolkema, J.S., Bolhuis, H., van Veen, H.W., Poolman, B., and Driessen, A.J. (1997) The role of transport processes in survival of lactic acid bacteria. Energy transduction and multidrug resistance. Antonie Van Leeuwenhoek 71: 117-128.

Kortekaas, S., Vidal, G., He, Y.L., Lettinga, G., Field, J.A. (1998) Anaerobicaerobic treatment of toxic pulping black liquor with upfront effluent recirculation. J Ferment Bioeng 86: 97-110.

Kothapalli, R., Yoder, S.J., Mane, S., and Loughran, T.P., Jr. (2002) Microarray results: how accurate are they? BMC Bioinformatics 3: 22.

Kowalczyk, M., Cocaign-Bousquet, M., Loubiere, P., and Bardowski, J. (2008) Identification and functional characterisation of cellobiose and lactose transport systems in Lactococcus lactis IL1403. Arch Microbiol 189: 187-196.

Kuipers, O.P., Beerthuyzen, M.M., de Ruyter, P.G., Luesink, E.J., and de Vos, W.M. (1995) Autoregulation of nisin biosynthesis in Lactococcus lactis by signal transduction. J Biol Chem 270: 27299-27304.

Kuo, W.P., Jenssen, T.K., Butte, A.J., Ohno-Machado, L., and Kohane, I.S. (2002) Analysis of matched mRNA measurements from two different microarray technologies. Bioinformatics 18: 405-412.

L

Landaud, S., Helinck, S., and Bonnarme, P. (2008) Formation of volatile sulfur compounds and metabolism of methionine and other sulfur compounds in fermented food. Appl Microbiol Biotechnol 77: 1191-1205.


181

Landry, C.R., Townsend, J.P., Hartl, D.L., and Cavalieri, D. (2006) Ecological and evolutionary genomics of Saccharomyces cerevisiae. Mol Ecol 15: 575-591.

Lapujade, P., Cocaign-Bousquet, M., and Loubiere, P. (1998) Glutamate Biosynthesis in Lactococcus lactis subsp. lactis NCDO 2118. Appl Environ Microbiol 64: 2485-2489.

Larkin, J.E., Frank, B.C., Gavras, H., Sultana, R., and Quackenbush, J. (2005) Independence and reproducibility across microarray platforms. Nat Methods 2: 337-344.

Larsen, R., Buist, G., Kuipers, O.P., and Kok, J. (2004) ArgR and AhrC are both required for regulation of arginine metabolism in Lactococcus lactis. J Bacteriol 186: 1147-1157.

Larsen, R., Kok, J., and Kuipers, O.P. (2005) Interaction between ArgR and AhrC controls regulation of arginine metabolism in Lactococcus lactis. J Biol Chem 280: 19319-19330.

Larsen, R., Kloosterman, T.G., Kok, J., and Kuipers, O.P. (2006) GlnR-mediated regulation of nitrogen metabolism in Lactococcus lactis. J Bacteriol 188: 4978-4982.

Lewenza, S., Visser, M.B., and Sokol, P.A. (2002) Interspecies communication between Burkholderia cepacia and Pseudomonas aeruginosa. Can J Microbiol 48: 707-716.

Li, C.L., Fang, H.H.P. (2007) Fermentative hydrogen production from wastewater and solid wastes by mixed cultures. Crit Rev Environ Sci Technol 37: 1-39.

Li, J., Pankratz, M., and Johnson, J.A. (2002) Differential gene expression patterns revealed by oligonucleotide versus long cDNA arrays. Toxicol Sci 69: 383-390.

Li, X., Weinstock, G.M., Murray, B.E. (1995) Generation of auxotrophic mutants of Enterococcus faecalis. J Bacteriol 177:6866-73

Li, Y., Hugenholtz, J., Abee, T., and Molenaar, D. (2003) Glutathione protects Lactococcus lactis against oxidative stress. Appl Environ Microbiol 69: 5739-5745.

Liu, C., Hu, B., Liu, Y., and Chen, S. (2006) Stimulation of nisin production from whey by a mixed culture of Lactococcus lactis and Saccharomyces cerevisiae. Appl Biochem Biotechnol 129-132: 751-761.

Liu, D., Liu, D., Zeng, R.J., and Angelidaki, I. (2006) Hydrogen and methane production from household solid waste in the two-stage fermentation process. Water Res 40: 2230-2236.

Llamas, I., Keshavan, N., and Gonzalez, J.E. (2004) Use of Sinorhizobium meliloti as an indicator for specific detection of long-chain N-acyl homoserine lactones. Appl Environ Microbiol 70: 3715-3723.

Llanos, R.M., Harris, C.J., Hillier, A.J., and Davidson, B.E. (1993) Identification of a novel operon in Lactococcus lactis encoding three enzymes for lactic acid synthesis: phosphofructokinase, pyruvate kinase, and lactate dehydrogenase. J Bacteriol 175: 2541-2551.

Lockhart, D.J., Dong, H., Byrne, M.C., Follettie, M.T., Gallo, M.V., Chee, M.S., Mittmann, M., Wang, C., Kobayashi, M., Horton, H., and Brown, E.L. (1996) Expression monitoring by hybridization to high-density oligonucleotide arrays. Nat Biotechnol 14: 1675-1680.

Lombardia, E., Rovetto, A.J., Arabolaza, A.L., and Grau, R.R. (2006) A LuxS-dependent cell-to-cell language regulates social behavior and development in Bacillus subtilis. J Bacteriol 188: 4442-4452.

Lopez Del Castillo-Lozano, M., Delile, A., Spinnler, H.E., Bonnarme, P., and Landaud, S. (2007) Comparison of volatile sulphur compound production by cheese-ripening yeasts from methionine and methionine-cysteine mixtures. Appl Microbiol Biotechnol 75: 1447-1454.


182

Loret, M.O., Pedersen, L., and Francois, J. (2007) Revised procedures for yeast metabolites extraction: application to a glucose pulse to carbon-limited yeast cultures, which reveals a transient activation of the purine salvage pathway. Yeast 24: 47-60.

Lubelski, J., de Jong, A., van Merkerk, R., Agustiandari, H., Kuipers, O.P., Kok, J., and Driessen, A.J. (2006) LmrCD is a major multidrug resistance transporter in Lactococcus lactis. Mol Microbiol 61: 771-781.

Ludovico, P., Sousa, M.J., Silva, M.T., Leao, C., and Corte-Real, M. (2001) Saccharomyces cerevisiae commits to a programmed cell death process in response to acetic acid. Microbiology 147: 2409-2415.

Luesink, E.J., van Herpen, R.E., Grossiord, B.P., Kuipers, O.P., and de Vos, W.M. (1998) Transcriptional activation of the glycolytic las operon and catabolite repression of the gal operon in Lactococcus lactis are mediated by the catabolite control protein CcpA. Mol Microbiol 30: 789-798.

Lyon, G.J., Wright, J.S., Muir, T.W., and Novick, R.P. (2002) Key determinants of receptor activation in the agr autoinducing peptides of Staphylococcus aureus. Biochemistry 41: 10095-10104.

M Magnani, D., Barre, O., Gerber, S.D., and Solioz, M. (2008) Characterization of the CopR

regulon of Lactococcus lactis IL1403. J Bacteriol 190: 536-545. Makarova, K.S., Mironov, A.A., and Gelfand, M.S. (2001) Conservation of the binding site

for the arginine repressor in all bacterial lineages. Genome Biol 2: RESEARCH0013. Maldonado, A., Jimenez-Diaz, R., and Ruiz-Barba, J.L. (2004) Induction of plantaricin

production in Lactobacillus plantarum NC8 after coculture with specific gram-positive bacteria is mediated by an autoinduction mechanism. J Bacteriol 186: 1556-1564.

Maligoy, M., Mercade, M., Cocaign-Bousquet, M., and Loubiere, P. (2008) Transcriptome analysis of Lactococcus lactis in coculture with Saccharomyces cerevisiae. Appl Environ Microbiol 74: 485-494.

Manefield, M., de Nys, R., Kumar, N., Read, R., Givskov, M., Steinberg, P., and Kjelleberg, S. (1999) Evidence that halogenated furanones from Delisea pulchra inhibit acylated homoserine lactone (AHL)-mediated gene expression by displacing the AHL signal from its receptor protein. Microbiology 145 (Pt 2): 283-291.

Manjarrez, E.S., Albasi, C., and Riba, J.P. (2000) A two-reservoir, hollow-fiber bioreactor for the study of mixed-population dynamics: design aspects and validation of the approach. Biotechnol Bioeng 69: 401-408.

Maoz, A., Mayr, R., and Scherer, S. (2003) Temporal stability and biodiversity of two complex antilisterial cheese-ripening microbial consortia. Appl Environ Microbiol 69: 4012-4018.

Marquina, D., Santos, A., Corpas, I., Munoz, J., Zazo, J., and Peinado, J.M. (2002) Dietary influence of kefir on microbial activities in the mouse bowel. Lett Appl Microbiol 35: 136-140.

Marshall, E. (2004) Getting the noise out of gene arrays. Science 306: 630-631.


183

Martin, M.G., Sender, P.D., Peiru, S., de Mendoza, D., and Magni, C. (2004) Acid-inducible transcription of the operon encoding the citrate lyase complex of Lactococcus lactis Biovar diacetylactis CRL264. J Bacteriol 186: 5649-5660.

Martinez, B., Zomer, A.L., Rodriguez, A., Kok, J., and Kuipers, O.P. (2007) Cell envelope stress induced by the bacteriocin Lcn972 is sensed by the Lactococcal two-component system CesSR. Mol Microbiol 64: 473-486.

Martinussen, J. (1995) Powerful methods to establish chromosomal markers in Lactococcus lactis: an analysis of pyrimidine salvage pathway mutants obtained by positive selections. Microbiology 141: 1883-1890

Martinussen, J., Andersen, P.S., and Hammer, K. (1994) Nucleotide metabolism in Lactococcus lactis: salvage pathways of exogenous pyrimidines. J Bacteriol 176: 1514-1516.

Martinussen, J., and Hammer, K. (1994) Cloning and characterization of upp, a gene encoding uracil phosphoribosyltransferase from Lactococcus lactis. J Bacteriol 176: 6457-6463.

Martinussen, J., and Hammer, K. (1998) The carB gene encoding the large subunit of carbamoylphosphate synthetase from Lactococcus lactis is transcribed monocistronically. J Bacteriol 180: 4380-4386.

Martinussen, J., Schallert, J., Andersen, B., and Hammer, K. (2001) The pyrimidine operon pyrRPB-carA from Lactococcus lactis. J Bacteriol 183: 2785-2794.

Martinussen, J., Wadskov-Hansen, S.L., and Hammer, K. (2003) Two nucleoside uptake systems in Lactococcus lactis: competition between purine nucleosides and cytidine allows for modulation of intracellular nucleotide pools. J Bacteriol 185: 1503-1508.

McSweeney, C.S., Mackie, R.I., Odenyo, A.A., and Stahl, D.A. (1993) Development of an oligonucleotide probe targeting 16S rRNA and its application for detection and quantitation of the ruminal bacterium Synergistes jonesii in a mixed-population chemostat. Appl Environ Microbiol 59: 1607-1612.

Meadow, N.D., Fox, D.K., and Roseman, S. (1990) The bacterial phosphoenolpyruvate: glycose phosphotransferase system. Annu Rev Biochem 59: 497-542.

Meister, A. (1988) Glutathione metabolism and its selective modification. J Biol Chem 263: 17205-17208.

Melchiorsen, C.R., Jokumsen, K.V., Villadsen, J., Johnsen, M.G., Israelsen, H., and Arnau, J. (2000) Synthesis and posttranslational regulation of pyruvate formate-lyase in Lactococcus lactis. J Bacteriol 182: 4783-4788.

Miller, M.B., and Bassler, B.L. (2001) Quorum sensing in bacteria. Annu Rev Microbiol 55: 165-199.

Mitchell, W.J., Misko, T.P., and Roseman, S. (1982) Sugar transport by the bacterial phosphotransferase system. Regulation of other transport systems (lactose and melibiose). J Biol Chem 257: 14553-14564.

Miyoshi, A., Rochat, T., Gratadoux, J.J., Le Loir, Y., Oliveira, S.C., Langella, P., and Azevedo, V. (2003) Oxidative stress in Lactococcus lactis. Genet Mol Res 2: 348-359.

Moller, K., Olsson, L., and Piskur, J. (2001) Ability for anaerobic growth is not sufficient for development of the petite phenotype in Saccharomyces kluyveri. J Bacteriol 183: 2485-2489.

Monedero, V., Kuipers, O.P., Jamet, E., and Deutscher, J. (2001) Regulatory functions of serine-46-phosphorylated HPr in Lactococcus lactis. J Bacteriol 183: 3391-3398.


184

Moon-van der Staay, S.Y., De Wachter, R., and Vaulot, D. (2001) Oceanic 18S rDNA sequences from picoplankton reveal unsuspected eukaryotic diversity. Nature 409: 607-610.

Morrison, D.J., Mackay, W.G., Edwards, C.A., Preston, T., Dodson, B., and Weaver, L.T. (2006) Butyrate production from oligofructose fermentation by the human faecal flora: what is the contribution of extracellular acetate and lactate? Br J Nutr 96: 570-577.

Mortimer, R., and Polsinelli, M. (1999) On the origins of wine yeast. Res Microbiol 150: 199-204.

Mounier, J., Monnet, C., Vallaeys, T., Arditi, R., Sarthou, A.S., Helias, A., and Irlinger, F. (2008) Microbial interactions within a cheese microbial community. Appl Environ Microbiol 74: 172-181.

Mouret, J-.R. (2006) Modulation de la transition respiro-fermentaire chez Saccharomyces cerevisiae par l’oléate : analyse cinétique et métabolique en culture continue sur substrats mixtes. Thèse INSA Toulouse

Muralidharan, V., Rinker, K.D., Hirsh, I.S., Bouwer, E.J. and Kelly, R.M. (1997) Hydrogen transfer between methanogens and fermentative heterotrophs in hyperthermophilic cocultures. Biotechnol. Bioeng. 56: 268-278.

N Nealson, K.H., Platt, T., and Hastings, J.W. (1970) Cellular control of the synthesis and

activity of the bacterial luminescent system. J Bacteriol 104: 313-322. Neves, A.R., Pool, W.A., Kok, J., Kuipers, O.P., and Santos, H. (2005) Overview on sugar

metabolism and its control in Lactococcus lactis - the input from in vivo NMR. FEMS Microbiol Rev 29: 531-554.

Nickerson, K.W., Atkin, A.L., and Hornby, J.M. (2006) Quorum sensing in dimorphic fungi: farnesol and beyond. Appl Environ Microbiol 72: 3805-3813.

Nicoloff, H., Hubert, J.C., and Bringel, F. (2000) In Lactobacillus plantarum, carbamoyl phosphate is synthesized by two carbamoyl-phosphate synthetases (CPS): carbon dioxide differentiates the arginine-repressed from the pyrimidine-regulated CPS. J Bacteriol 182: 3416-3422.

Nilsson, D., and Lauridsen, A.A. (1992) Isolation of purine auxotrophic mutants of Lactococcus lactis and characterization of the gene hpt encoding hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase. Mol Gen Genet 235: 359-364.

Nilsson, D., and Kilstrup, M. (1998) Cloning and expression of the Lactococcus lactis purDEK genes, required for growth in milk. Appl Environ Microbiol 64: 4321-4327.

Nout, M.J. (1992) Accelerated natural lactic fermentation of cereal-based formulas at reduced water activity. Int J Food Microbiol 16: 313-322.

O

Obodai, M., and Dodd, C.E. (2006) Characterization of dominant microbiota of a Ghanaian fermented milk product, nyarmie, by culture- and nonculture-based methods. J Appl Microbiol 100: 1355-1363.


185

O'Connell-Motherway, M., van Sinderen, D., Morel-Deville, F., Fitzgerald, G.F., Ehrlich, S.D., and Morel, P. (2000) Six putative two-component regulatory systems isolated from Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363. Microbiology 146 (Pt 4): 935-947.

O'Leary V, S., and Woychik, J.H. (1976) Utilization of Lactose, Glucose, and Galactose by a Mixed Culture of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus in Milk Treated with Lactase Enzyme. Appl Environ Microbiol 32: 89-94.

Ohkuni, K., Hayashi, M., and Yamashita, I. (1998) Bicarbonate-mediated social communication stimulates meiosis and sporulation of Saccharomyces cerevisiae. Yeast 14: 623-631.

Orr, W.C., and Sohal, R.S. (1994) Extension of life-span by overexpression of superoxide dismutase and catalase in Drosophila melanogaster. Science 263: 1128-1130.

Oshima, T., Aiba, H., Masuda, Y., Kanaya, S., Sugiura, M., Wanner, B.L., Mori, H., Mizuno, T. (2002) Transcriptome analysis of all two-component regulatory system mutants of Escherichia coli K-12 Mol Microbiol 46: 281-91.

Otto, M., Echner, H., Voelter, W., and Gotz, F. (2001) Pheromone cross-inhibition between Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Infect Immun 69: 1957-1960.

P

Palkova, Z., Janderova, B., Gabriel, J., Zikanova, B., Pospisek, M., and Forstova, J. (1997) Ammonia mediates communication between yeast colonies. Nature 390: 532-536.

Palkova, Z., and Vachova, L. (2003) Ammonia signaling in yeast colony formation. Int Rev Cytol 225: 229-272.

Palmfeldt, J., Levander, F., Hahn-Hagerdal, B., and James, P. (2004) Acidic proteome of growing and resting Lactococcus lactis metabolizing maltose. Proteomics 4: 3881-3898.

Pandey, A., Bringel, F. and Meyer, J.M. (1994) Iron requirement and search for siderophores in lactic acid bacteria. Appl Microb Biotechnol 40: 735-739.

Park, P.J., Cao, Y.A., Lee, S.Y., Kim, J.W., Chang, M.S., Hart, R., and Choi, S. (2004) Current issues for DNA microarrays: platform comparison, double linear amplification, and universal RNA reference. J Biotechnol 112: 225-245.

Papagianni, M., Avramidis, N., and Filiousis, G. (2007) Glycolysis and the regulation of glucose transport in Lactococcus lactis spp. lactis in batch and fed-batch culture. Microb Cell Fact 6: 16.

Passoth, V., Blomqvist, J., and Schnurer, J. (2007) Dekkera bruxellensis and Lactobacillus vini form a stable ethanol-producing consortium in a commercial alcohol production process. Appl Environ Microbiol 73: 4354-4356.

Pedotti, P., t Hoen, P.A., Vreugdenhil, E., Schenk, G.J., Vossen, R.H., Ariyurek, Y., de Hollander, M., Kuiper, R., van Ommen, G.J., den Dunnen, J.T., Boer, J.M., and de Menezes, R.X. (2008) Can subtle changes in gene expression be consistently detected with different microarray platforms? BMC Genomics 9: 124.

Peltonen, T., and Mantsala, P. (1999) Isolation and characterization of a purC(orf)QLF operon from Lactococcus [correction of Lactobacillus] lactis MG1614. Mol Gen Genet 261: 31-41.


186

Perego, M., and Hoch, J.A. (1996) Cell-cell communication regulates the effects of protein aspartate phosphatases on the phosphorelay controlling development in Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci U S A 93: 1549-1553.

Pisman, T.I., and Somova, L.A. (2003) Interaction of a mixed yeast culture in an "autotroph-heterotroph" system with a closed atmosphere cycle and spatially separated components. Adv Space Res 31: 1751-1756.

Pirooznia, M., Nagarajan, V., and Deng, Y. (2007) GeneVenn - A web application for comparing gene lists using Venn diagrams. Bioinformation 1: 420-422.

Plessas, S., Bosnea, L., Psarianos, C., Koutinas, A.A., Marchant, R., and Banat, I.M. (2008) Lactic acid production by mixed cultures of Kluyveromyces marxianus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus and Lactobacillus helveticus. Bioresour Technol 99: 5951-5955.

Poolman, B. (2002) Transporters and their roles in LAB cell physiology. Antonie Van Leeuwenhoek 82: 147-164.

Poolman, B., and Konings, W.N. (1988) Relation of growth of Streptococcus lactis and Streptococcus cremoris to amino acid transport. J Bacteriol 170: 700-707.

Postma, P.W., Lengeler, J.W., and Jacobson, G.R. (1993) Phosphoenolpyruvate: carbohydrate phosphotransferase systems of bacteria. Microbiol Rev 57: 543-594.

Primig, M., Williams, R.M., Winzeler, E.A., Tevzadze, G.G., Conway, A.R., Hwang, S.Y., Davis, R.W., and Esposito, R.E. (2000) The core meiotic transcriptome in budding yeasts. Nat Genet 26: 415-423.

Pritchard, C.C., Hsu, L., Delrow, J., and Nelson, P.S. (2001) Project normal: defining normal variance in mouse gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 13266-13271.

Q

Qin, X., Singh, K.V., Weinstock, G.M., and Murray, B.E. (2001) Characterization of fsr, a regulator controlling expression of gelatinase and serine protease in Enterococcus faecalis OG1RF. J Bacteriol 183: 3372-3382.

Quadri, L.E., Kleerebezem, M., Kuipers, O.P., de Vos, W.M., Roy, K.L., Vederas, J.C., and Stiles, M.E. (1997) Characterization of a locus from Carnobacterium piscicola LV17B involved in bacteriocin production and immunity: evidence for global inducer-mediated transcriptional regulation. J Bacteriol 179: 6163-6171.

Quinn, C.L., Stephenson, B.T., and Switzer, R.L. (1991) Functional organization and nucleotide sequence of the Bacillus subtilis pyrimidine biosynthetic operon. J Biol Chem 266: 9113-9127.

R

Rainey, P.B., and Rainey, K. (2003) Evolution of cooperation and conflict in experimental bacterial populations. Nature 425: 72-74.

Rajagopal, S.N., Sandine, W.E. (1990) Associative growth and proteolysis of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus in skim milk. J Dairy Sci 73: 894-899.


187

Ramage, G., Saville, S.P., Wickes, B.L., and Lopez-Ribot, J.L. (2002) Inhibition of Candida albicans biofilm formation by farnesol, a quorum-sensing molecule. Appl Environ Microbiol 68: 5459-5463.

Ramsay, G. (1998) DNA chips: state-of-the art. Nat Biotechnol 16: 40-44. Raynaud, S., Perrin, R., Cocaign-Bousquet, M., and Loubiere, P. (2005) Metabolic and

transcriptomic adaptation of Lactococcus lactis subsp. lactis Biovar diacetylactis in response to autoacidification and temperature downshift in skim milk. Appl Environ Microbiol 71: 8016-8023.

Redon, E., Loubiere, P., and Cocaign-Bousquet, M. (2005a) Transcriptome analysis of the progressive adaptation of Lactococcus lactis to carbon starvation. J Bacteriol 187: 3589-3592.

Redon, E., Loubiere, P., and Cocaign-Bousquet, M. (2005b) Role of mRNA stability during genome-wide adaptation of Lactococcus lactis to carbon starvation. J Biol Chem 280: 36380-36385.

Reis, M.A., Serafim, L.S., Lemos, P.C., Ramos, A.M., Aguiar, F.R., and Van Loosdrecht, M.C. (2003) Production of polyhydroxyalkanoates by mixed microbial cultures. Bioprocess Biosyst Eng 25: 377-385.

Reizer, J., Novotny, M.J., Panos, C., and Saier, M.H., Jr. (1983) Mechanism of inducer expulsion in Streptococcus pyogenes: a two-step process activated by ATP. J Bacteriol 156: 354-361.

Reizer, J., and Saier, M.H., Jr. (1997) Modular multidomain phosphoryl transfer proteins of bacteria. Curr Opin Struct Biol 7: 407-415.

Renault, P., Gaillardin, C., and Heslot, H. (1989) Product of the Lactococcus lactis gene required for malolactic fermentation is homologous to a family of positive regulators. J Bacteriol 171: 3108-3114.

Rezaiki, L., Cesselin, B., Yamamoto, Y., Vido, K., van West, E., Gaudu, P., and Gruss, A. (2004) Respiration metabolism reduces oxidative and acid stress to improve long-term survival of Lactococcus lactis. Mol Microbiol 53: 1331-1342.

Rhee, S.K., Liu, X., Wu, L., Chong, S.C., Wan, X., and Zhou, J. (2004) Detection of genes involved in biodegradation and biotransformation in microbial communities by using 50-mer oligonucleotide microarrays. Appl Environ Microbiol 70: 4303-4317.

Richard, P., Bakker, B.M., Teusink, B., Van Dam, K., and Westerhoff, H.V. (1996) Acetaldehyde mediates the synchronization of sustained glycolytic oscillations in populations of yeast cells. Eur J Biochem 235: 238-241.

Riedel, K. 2001 N-acylhomoserine-lactone-mediated communication between Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia in mixed biofilms. Microbiology 147: 3249-3262

Rocha, J.M., and Malcata, F.X. (1999) On the microbiological profile of traditional Portuguese sourdough. J Food Prot 62: 1416-1429.

Romano, J.D., and Kolter, R. (2005) Pseudomonas-Saccharomyces interactions: influence of fungal metabolism on bacterial physiology and survival. J Bacteriol 187: 940-948.

Roy, K., Anba, J., Corthier, G., Rigottier-Gois, L., Monnet, V., and Mistou, M.Y. (2008a) Metabolic adaptation of Lactococcus lactis in the digestive tract: the example of response to lactose. J Mol Microbiol Biotechnol 14: 137-144.

Roy, K., Meyrand, M., Corthier, G., Monnet, V., and Mistou, M.Y. (2008b) Proteomic investigation of the adaptation of Lactococcus lactis to the mouse digestive tract. Proteomics 8: 1661-1676.


188

Rudner, D.Z., LeDeaux, J.R., Ireton, K., and Grossman, A.D. (1991) The spo0K locus of Bacillus subtilis is homologous to the oligopeptide permease locus and is required for sporulation and competence. J Bacteriol 173: 1388-1398.

S Saier, M.H., Jr., and Crasnier, M. (1996) Inducer exclusion and the regulation of sugar

transport. Res Microbiol 147: 482-489. Sanchez-Contreras, M., Bauer, W.D., Gao, M., Robinson, J.B., and Allan Downie, J. (2007)

Quorum-sensing regulation in rhizobia and its role in symbiotic interactions with legumes. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 362: 1149-1163.

Sanders, J.W., Leenhouts, K.J., Haandrikman, A.J., Venema, G., and Kok, J. (1995) Stress response in Lactococcus lactis: cloning, expression analysis, and mutation of the lactococcal superoxide dismutase gene. J Bacteriol 177: 5254-5260.

Sanders, J.W., Leenhouts, K., Burghoorn, J., Brands, J.R., Venema, G., and Kok, J. (1998) A chloride-inducible acid resistance mechanism in Lactococcus lactis and its regulation. Mol Microbiol 27: 299-310.

Schadt, C.W., Liebich, J., Chong, S.C., Gentry, T.J., He, Z., Pan, H., Zhou, J. (2005) Design and use of functional gene microarrays (FGAs) for the characterization of microbial communities. Methods Microbiol 34: 331-368.

Schauder, S., and Bassler, B.L. (2001) The languages of bacteria. Genes Dev 15: 1468-1480. Schacherer, J., Ruderfer, D.M., Gresham, D., Dolinski, K., Botstein, D., and Kruglyak, L.

(2007) Genome-wide analysis of nucleotide-level variation in commonly used Saccharomyces cerevisiae strains. PLoS ONE 2: e322.

Schena, M., Shalon, D., Davis, R.W., and Brown, P.O. (1995) Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 270: 467-470.

Schumacher, M.A., Allen, G.S., Diel, M., Seidel, G., Hillen, W., and Brennan, R.G. (2004) Structural basis for allosteric control of the transcription regulator CcpA by the phosphoprotein HPr-Ser46-P. Cell 118: 731-741.

Seghezzo, L., Cuevas, C.M., Trupiano, A.P., Guerra, R.G., Gonzalez, S.M., Zeeman, G., and Lettinga, G. (2006) Stability and activity of anaerobic sludge from UASB reactors treating sewage in subtropical regions. Water Sci Technol 54: 223-229.

Selim, S., Martin-Laurent, F., Rouard, N., Gianinazzi, S., and van Tuinen, D. (2007) Impact of a new biopesticide produced by Paenibacillus sp. strain B2 on the genetic structure and density of soil bacterial communities. Pest Manag Sci 63: 269-275.

Serror, P., and Sonenshein, A.L. (1996) Interaction of CodY, a novel Bacillus subtilis DNA-binding protein, with the dpp promoter region. Mol Microbiol 20: 843-852.

Severgnini, M., Bicciato, S., Mangano, E., Scarlatti, F., Mezzelani, A., Mattioli, M., Ghidoni, R., Peano, C., Bonnal, R., Viti, F., Milanesi, L., De Bellis, G., and Battaglia, C. (2006) Strategies for comparing gene expression profiles from different microarray platforms: application to a case-control experiment. Anal Biochem 353: 43-56.

Shalon, D., Smith, S.J., and Brown, P.O. (1996) A DNA microarray system for analyzing complex DNA samples using two-color fluorescent probe hybridization. Genome Res 6: 639-645.


189

Shi, L., and Reid, L.H., and Jones, W.D., and Shippy, R., and Warrington, J.A., and Baker, S.C., and Collins, P.J., and de Longueville, F., and Kawasaki, E.S., and Lee, K.Y., and Luo, Y., and Sun, Y.A., and Willey, J.C., and Setterquist, R.A., and Fischer, G.M., and Tong, W., and Dragan, Y.P., and Dix, D.J., and Frueh, F.W., and Goodsaid, F.M., and Herman, D., and Jensen, R.V., and Johnson, C.D., and Lobenhofer, E.K., and Puri, R.K., and Schrf, U., and Thierry-Mieg, J., and Wang, C., and Wilson, M., and Wolber, P.K., and Zhang, L., and Amur, S., and Bao, W., and Barbacioru, C.C., and Lucas, A.B., and Bertholet, V., and Boysen, C., and Bromley, B., and Brown, D., and Brunner, A., and Canales, R., and Cao, X.M., and Cebula, T.A., and Chen, J.J., and Cheng, J., and Chu, T.M., and Chudin, E., and Corson, J., and Corton, J.C., and Croner, L.J., and Davies, C., and Davison, T.S., and Delenstarr, G., and Deng, X., and Dorris, D., and Eklund, A.C., and Fan, X.H., and Fang, H., and Fulmer-Smentek, S., and Fuscoe, J.C., and Gallagher, K., and Ge, W., and Guo, L., and Guo, X., and Hager, J., and Haje, P.K., and Han, J., and Han, T., and Harbottle, H.C., and Harris, S.C., and Hatchwell, E., and Hauser, C.A., and Hester, S., and Hong, H., and Hurban, P., and Jackson, S.A., and Ji, H., and Knight, C.R., and Kuo, W.P., and LeClerc, J.E., and Levy, S., and Li, Q.Z., and Liu, C., and Liu, Y., and Lombardi, M.J., and Ma, Y., and Magnuson, S.R., and Maqsodi, B., and McDaniel, T., and Mei, N., and Myklebost, O., and Ning, B., and Novoradovskaya, N., and Orr, M.S., and Osborn, T.W., and Papallo, A., and Patterson, T.A., and Perkins, R.G., and Peters, E.H., and Peterson, R., and Philips, K.L., and Pine, P.S., and Pusztai, L., and Qian, F., and Ren, H., and Rosen, M., and Rosenzweig, B.A., and Samaha, R.R., and Schena, M., and Schroth, G.P., and Shchegrova, S., and Smith, D.D., and Staedtler, F., and Su, Z., and Sun, H., and Szallasi, Z., and Tezak, Z., and Thierry-Mieg, D., and Thompson, K.L., and Tikhonova, I., and Turpaz, Y., and Vallanat, B., and Van, C., and Walker, S.J., and Wang, S.J., and Wang, Y., and Wolfinger, R., and Wong, A., and Wu, J., and Xiao, C., and Xie, Q., and Xu, J., and Yang, W., and Zhang, L., and Zhong, S., and Zong, Y., and Slikker, W., Jr. (2006) The MicroArray Quality Control (MAQC) project shows inter- and intraplatform reproducibility of gene expression measurements. Nat Biotechnol 24: 1151-1161.

Shimizu, H., Mizuguchi, T., Tanaka, E., and Shioya, S. (1999) Nisin production by a mixed-culture system consisting of Lactococcus lactis and Kluyveromyces marxianus. Appl Environ Microbiol 65: 3134-3141.

Shippy, R., Sendera, T.J., Lockner, R., Palaniappan, C., Kaysser-Kranich, T., Watts, G., and Alsobrook, J. (2004) Performance evaluation of commercial short-oligonucleotide microarrays and the impact of noise in making cross-platform correlations. BMC Genomics 5: 61.

Siezen, R.J., Renckens, B., van Swam, I., Peters, S., van Kranenburg, R., Kleerebezem, M., and de Vos, W.M. (2005) Complete sequences of four plasmids of Lactococcus lactis subsp. cremoris SK11 reveal extensive adaptation to the dairy environment. Appl Environ Microbiol 71: 8371-8382.

Sijpesteijn, A.K. (1970) Induction of cytochrome formation and stimulation of oxidative dissimilation by hemin in Streptococcus lactis and Leuconostoc mesenteroides. Antonie Van Leeuwenhoek 36: 335-348.

Simova, E., Beshkova, D., Angelov, A., Hristozova, T., Frengova, G., and Spasov, Z. (2002) Lactic acid bacteria and yeasts in kefir grains and kefir made from them. J Ind Microbiol Biotechnol 28: 1-6.


190

Slavikova, E., and Vadkertiova, R. (1997) Seasonal occurrence of yeasts and yeast-like organisms in the river Danube. Antonie Van Leeuwenhoek 72: 77-80.

Small, J., Call, D.R., Brockman, F.J., Straub, T.M., and Chandler, D.P. (2001) Direct detection of 16S rRNA in soil extracts by using oligonucleotide microarrays. Appl Environ Microbiol 67: 4708-4716.

Smit, G., Smit, B.A., and Engels, W.J. (2005) Flavour formation by lactic acid bacteria and biochemical flavour profiling of cheese products. FEMS Microbiol Rev 29: 591-610.

Sniegowski, P.D., Dombrowski, P.G., and Fingerman, E. (2002) Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics. FEMS Yeast Res 1: 299-306.

Snoep, J.L., de Graef, M.R., Teixeira de Mattos, M.J., and Neijssel, O.M. (1992) Pyruvate catabolism during transient state conditions in chemostat cultures of Enterococcus faecalis NCTC 775: importance of internal pyruvate concentrations and NADH/NAD+ ratios. J Gen Microbiol 138: 2015-2020.

Snoep, J.L., de Graef, M.R., Westphal, A.H., de Kok, A., Teixeira de Mattos, M.J., and Neijssel, O.M. (1993) Differences in sensitivity to NADH of purified pyruvate dehydrogenase complexes of Enterococcus faecalis, Lactococcus lactis, Azotobacter vinelandii and Escherichia coli: implications for their activity in vivo. FEMS Microbiol Lett 114: 279-283.

Sodini, I., Latrille, E., and Corrieu, G. (2000) Identification of interacting mixed cultures of lactic acid bacteria by their exclusion from a model predicting the acidifying activity of non-interacting mixed cultures. Appl Microbiol Biotechnol 54: 715-718.

Sogin, M.L., Morrison, H.G., Huber, J.A., Mark Welch, D., Huse, S.M., Neal, P.R., Arrieta, J.M., and Herndl, G.J. (2006) Microbial diversity in the deep sea and the underexplored "rare biosphere". Proc Natl Acad Sci U S A 103: 12115-12120.

Solem, C., Koebmann, B.J., and Jensen, P.R. (2003) Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase has no control over glycolytic flux in Lactococcus lactis MG1363. J Bacteriol 185: 1564-1571.

Solem, C., Koebmann, B., Yang, F., and Jensen, P.R. (2007) The las enzymes control pyruvate metabolism in Lactococcus lactis during growth on maltose. J Bacteriol 189: 6727-6730.

Southern, E., Mir, K., and Shchepinov, M. (1999) Molecular interactions on microarrays. Nat Genet 21: 5-9.

Sprague, G.F., Jr., and Winans, S.C. (2006) Eukaryotes learn how to count: quorum sensing by yeast. Genes Dev 20: 1045-1049.

Stanley, N.R., Britton, R.A., Grossman, A.D., and Lazazzera, B.A. (2003) Identification of catabolite repression as a physiological regulator of biofilm formation by Bacillus subtilis by use of DNA microarrays. J Bacteriol 185: 1951-1957.

Starrenburg, M.J., and Hugenholtz, J. (1991) Citrate Fermentation by Lactococcus and Leuconostoc spp. Appl Environ Microbiol 57: 3535-3540.

Stiles, M.E., and Holzapfel, W.H. (1997) Lactic acid bacteria of foods and their current taxonomy. Int J Food Microbiol 36: 1-29.

Storz, G., and Imlay, J.A. (1999) Oxidative stress. Curr Opin Microbiol 2: 188-194. Stralis-Pavese, N., Sessitsch, A., Weilharter, A., Reichenauer, T., Riesing, J., Csontos, J.,

Murrell, J.C., and Bodrossy, L. (2004) Optimization of diagnostic microarray for


191

application in analysing landfill methanotroph communities under different plant covers. Environ Microbiol 6: 347-363.

Sun, J., Daniel, R., Wagner-Dobler, I., and Zeng, A.P. (2004) Is autoinducer-2 a universal signal for interspecies communication: a comparative genomic and phylogenetic analysis of the synthesis and signal transduction pathways. BMC Evol Biol 4: 36.

Surette, M.G., Miller, M.B., and Bassler, B.L. (1999) Quorum sensing in Escherichia coli, Salmonella typhimurium, and Vibrio harveyi: a new family of genes responsible for autoinducer production. Proc Natl Acad Sci U S A 96: 1639-1644.

Suzzi, G., Romano, P., Ponti, I., Montuschi, C. (1995) Natural wine yeasts as biocontrol agents. J. Appl. Bacteriol. 78: 304-308

Swift, S., Karlyshev, A.V., Fish, L., Durant, E.L., Winson, M.K., Chhabra, S.R., Williams, P., Macintyre, S., and Stewart, G.S. (1997) Quorum sensing in Aeromonas hydrophila and Aeromonas salmonicida: identification of the LuxRI homologs AhyRI and AsaRI and their cognate N-acylhomoserine lactone signal molecules. J Bacteriol 179: 5271-5281.

Swindell, S.R., Benson, K.H., Griffin, H.G., Renault, P., Ehrlich, S.D., and Gasson, M.J. (1996) Genetic manipulation of the pathway for diacetyl metabolism in Lactococcus lactis. Appl Environ Microbiol 62: 2641-2643.

T Takahashi, S., Abbe, K., and Yamada, T. (1982) Purification of pyruvate formate-lyase from

Streptococcus mutans and its regulatory properties. J Bacteriol 149: 1034-1040. Takano, E., Chakraburtty, R., Nihira, T., Yamada, Y., and Bibb, M.J. (2001) A complex role

for the gamma-butyrolactone SCB1 in regulating antibiotic production in Streptomyces coelicolor A3(2). Mol Microbiol 41: 1015-1028.

Tan, P.K., Downey, T.J., Spitznagel, E.L., Jr., Xu, P., Fu, D., Dimitrov, D.S., Lempicki, R.A., Raaka, B.M., and Cam, M.C. (2003) Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms. Nucleic Acids Res 31: 5676-5684.

Taroncher-Oldenburg, G., Griner, E.M., Francis, C.A., and Ward, B.B. (2003) Oligonucleotide microarray for the study of functional gene diversity in the nitrogen cycle in the environment. Appl Environ Microbiol 69: 1159-1171.

ten Brink, B., Otto, R., Hansen, U.P., and Konings, W.N. (1985) Energy recycling by lactate efflux in growing and nongrowing cells of Streptococcus cremoris. J Bacteriol 162: 383-390.

Thomas, T.D., Ellwood, D.C., and Longyear, V.M. (1979) Change from homo- to heterolactic fermentation by Streptococcus lactis resulting from glucose limitation in anaerobic chemostat cultures. J Bacteriol 138: 109-117.

Thomas, T.D., Turner, K.W., and Crow, V.L. (1980) Galactose fermentation by Streptococcus lactis and Streptococcus cremoris: pathways, products, and regulation. J Bacteriol 144: 672-682.

Thompson, J., and Torchia, D.A. (1984) Use of 31P nuclear magnetic resonance spectroscopy and 14C fluorography in studies of glycolysis and regulation of pyruvate kinase in Streptococcus lactis. J Bacteriol 158: 791-800.


192

Thompson, J., and Chassy, B.M. (1985) Intracellular phosphorylation of glucose analogs via the phosphoenolpyruvate: mannose-phosphotransferase system in Streptococcus lactis. J Bacteriol 162: 224-234.

Thompson, J., Chassy, B.M., and Egan, W. (1985) Lactose metabolism in Streptococcus lactis: studies with a mutant lacking glucokinase and mannose-phosphotransferase activities. J Bacteriol 162: 217-223.

Tiquia, S.M., Wu, L., Chong, S.C., Passovets, S., Xu, D., Xu, Y., and Zhou, J. (2004) Evaluation of 50-mer oligonucleotide arrays for detecting microbial populations in environmental samples. Biotechniques 36: 664-670, 672, 674-665.

V Valentine, D.L. (2002) Biogeochemistry and microbial ecology of methane oxidation in

anoxic environments: a review. Antonie Van Leeuwenhoek 81: 271-282. van Dijken, J.P., Bauer, J., Brambilla, L., Duboc, P., Francois, J.M., Gancedo, C., Giuseppin,

M.L., Heijnen, J.J., Hoare, M., Lange, H.C., Madden, E.A., Niederberger, P., Nielsen, J., Parrou, J.L., Petit, T., Porro, D., Reuss, M., van Riel, N., Rizzi, M., Steensma, H.Y., Verrips, C.T., Vindelov, J., and Pronk, J.T. (2000) An interlaboratory comparison of physiological and genetic properties of four Saccharomyces cerevisiae strains. Enzyme Microb Technol 26: 706-714.

van Lier, J.B., Lens, P.N., and Pol, L.W. (2001) Anaerobic treatment for C and S removal in "zero-discharge" paper mills: effects of process design on S removal efficiencies. Water Sci Technol 44: 189-195.

van Niel, E.W., Hofvendahl, K., and Hahn-Hagerdal, B. (2002) Formation and conversion of oxygen metabolites by Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 19435 under different growth conditions. Appl Environ Microbiol 68: 4350-4356.

van Niel, E.W., Palmfeldt, J., Martin, R., Paese, M., and Hahn-Hagerdal, B. (2004) Reappraisal of the regulation of lactococcal L-lactate dehydrogenase. Appl Environ Microbiol 70: 1843-1846.

Veiga, P., Bulbarela-Sampieri, C., Furlan, S., Maisons, A., Chapot-Chartier, M.P., Erkelenz, M., Mervelet, P., Noirot, P., Frees, D., Kuipers, O.P., Kok, J., Gruss, A., Buist, G., and Kulakauskas, S. (2007) SpxB regulates O-acetylation-dependent resistance of Lactococcus lactis peptidoglycan to hydrolysis. J Biol Chem 282: 19342-19354.

Vendeville, A., Winzer, K., Heurlier, K., Tang, C.M., and Hardie, K.R. (2005) Making 'sense' of metabolism: autoinducer-2, LuxS and pathogenic bacteria. Nat Rev Microbiol 3: 383-396.

Vido, K., Le Bars, D., Mistou, M.Y., Anglade, P., Gruss, A., and Gaudu, P. (2004) Proteome analyses of heme-dependent respiration in Lactococcus lactis: involvement of the proteolytic system. J Bacteriol 186: 1648-1657.

Vido, K., Diemer, H., Van Dorsselaer, A., Leize, E., Juillard, V., Gruss, A., and Gaudu, P. (2005) Roles of thioredoxin reductase during the aerobic life of Lactococcus lactis. J Bacteriol 187: 601-610.

Visser, W., Scheffers, W.A., Batenburg-van der Vegte, W.H., and van Dijken, J.P. (1990) Oxygen requirements of yeasts. Appl Environ Microbiol 56: 3785-3792.


193

W Wadskov-Hansen, S.L., Martinussen, J., and Hammer, K. (2000) The pyrH gene of

Lactococcus lactis subsp. cremoris encoding UMP kinase is transcribed as part of an operon including the frr1 gene encoding ribosomal recycling factor 1. Gene 241: 157-166.

Wadskov-Hansen, S.L., Willemoes, M., Martinussen, J., Hammer, K., Neuhard, J., and Larsen, S. (2001) Cloning and verification of the Lactococcus lactis pyrG gene and characterization of the gene product, CTP synthase. J Biol Chem 276: 38002-38009.

Wagner, M., Nielsen, P.H., Loy, A., Nielsen, J.L., and Daims, H. (2006) Linking microbial community structure with function: fluorescence in situ hybridization-microautoradiography and isotope arrays. Curr Opin Biotechnol 17: 83-91.

Wagner, M., Smidt, H., Loy, A., and Zhou, J. (2007) Unravelling microbial communities with DNA-microarrays: challenges and future directions. Microb Ecol 53: 498-506.

Wang, L.H., He, Y., Gao, Y., Wu, J.E., Dong, Y.H., He, C., Wang, S.X., Weng, L.X., Xu, J.L., Tay, L., Fang, R.X., and Zhang, L.H. (2004) A bacterial cell-cell communication signal with cross-kingdom structural analogues. Mol Microbiol 51: 903-912.

Wang, H., He, X., Band, M., Wilson, C., and Liu, L. (2005) A study of inter-lab and inter-platform agreement of DNA microarray data. BMC Genomics 6: 71.

Waters, C.M., and Bassler, B.L. (2005) Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annu Rev Cell Dev Biol 21: 319-346.

Watson, M., Perez-Alegre, M., Baron, M.D., Delmas, C., Dovc, P., Duval, M., Foulley, J.L., Garrido-Pavon, J.J., Hulsegge, I., Jaffrezic, F., Jimenez-Marin, A., Lavric, M., Le Cao, K.A., Marot, G., Mouzaki, D., Pool, M.H., Robert-Granie, C., San Cristobal, M., Tosser-Klopp, G., Waddington, D., and de Koning, D.J. (2007) Analysis of a simulated microarray dataset: comparison of methods for data normalisation and detection of differential expression (open access publication). Genet Sel Evol 39: 669-683.

Wernisch, L., Kendall, S.L., Soneji, S., Wietzorrek, A., Parish, T., Hinds, J., Butcher, P.D., Stoker, N.G. (2003) Analysis of whole-genome microarray replicates using mixed models. Bioinformatics 19: 53-61.

Wilson, K.H., Wilson, W.J., Radosevich, J.L., DeSantis, T.Z., Viswanathan, V.S., Kuczmarski, T.A., and Andersen, G.L. (2002) High-density microarray of small-subunit ribosomal DNA probes. Appl Environ Microbiol 68: 2535-2541.

Winson, M.K., Swift, S., Fish, L., Throup, J.P., Jorgensen, F., Chhabra, S.R., Bycroft, B.W., Williams, P., and Stewart, G.S. (1998) Construction and analysis of luxCDABE-based plasmid sensors for investigating N-acyl homoserine lactone-mediated quorum sensing. FEMS Microbiol Lett 163: 185-192.

Wittekind, M., Reizer, J., Deutscher, J., Saier, M.H., and Klevit, R.E. (1989) Common structural changes accompany the functional inactivation of HPr by seryl phosphorylation or by serine to aspartate substitution. Biochemistry 28: 9908-9912.

Wodicka, L., Dong, H., Mittmann, M., Ho, M.H., and Lockhart, D.J. (1997) Genome-wide expression monitoring in Saccharomyces cerevisiae. Nat Biotechnol 15: 1359-1367.

Woese, C.R., Kandler, O., and Wheelis, M.L. (1990) Towards a natural system of organisms: proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya. Proc Natl Acad Sci U S A 87: 4576-4579.


194

Wolin, M.J. (1964) Fructose-1,6-Diphosphate Requirement Of Streptococcal Lactic Dehydrogenases. Science 146: 775-777.

Wolin, M.J., Miller, T.L., and Stewart, C.S. (1997) Microbe-microbe interactions. In The Rumen Microbial Ecosystem, 2nd edn. Hobson, P.N., and Stewart, C.S. (eds). London, UK: Blackie, pp. 467–491.

Wouters, J.A., Frenkiel, H., de Vos, W.M., Kuipers, O.P., and Abee, T. (2001) Cold shock proteins of Lactococcus lactis MG1363 are involved in cryoprotection and in the production of cold-induced proteins. Appl Environ Microbiol 67: 5171-5178.

Wu, L., Thompson, D.K., Li, G., Hurt, R.A., Tiedje, J.M., and Zhou, J. (2001) Development and evaluation of functional gene arrays for detection of selected genes in the environment. Appl Environ Microbiol 67: 5780-5790.

Wydau, S., Dervyn, R., Anba, J., Dusko Ehrlich, S., and Maguin, E. (2006) Conservation of key elements of natural competence in Lactococcus lactis ssp. FEMS Microbiol Lett 257: 32-42.

X Xavier, K.B., and Bassler, B.L. (2003) LuxS quorum sensing: more than just a numbers game.

Curr Opin Microbiol 6: 191-197. Xie, Y., Chou, L.S., Cutler, A., and Weimer, B. (2004) DNA Macroarray profiling of

Lactococcus lactis subsp. lactis IL1403 gene expression during environmental stresses. Appl Environ Microbiol 70: 6738-6747.

Xu, H., Boone, C., and Klein, H.L. (2004) Mrc1 is required for sister chromatid cohesion to aid in recombination repair of spontaneous damage. Mol Cell Biol 24: 7082-7090.

Y

Ye, J.J., Reizer, J., Cui, X., and Saier, M.H., Jr. (1994) ATP-dependent phosphorylation of serine-46 in the phosphocarrier protein HPr regulates lactose/H+ symport in Lactobacillus brevis. Proc Natl Acad Sci U S A 91: 3102-3106.

Ye, J.J., and Saier, M.H., Jr. (1996) Regulation of sugar uptake via the phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase systems in Bacillus subtilis and Lactococcus lactis is mediated by ATP-dependent phosphorylation of seryl residue 46 in HPr. J Bacteriol 178: 3557-3563.

Y

Yamani, M.I., Tayeh, S.J., and Salhab, A.S. (1998) Aspects of microbiological and chemical quality of turmus, lupin seeds debittered by soaking in water. J Food Prot 61: 1480-1483.

Yang, Y.H., Dudoit, S., Luu, P., Lin, D.M., Peng, V., Ngai, J., and Speed, T.P. (2002) Normalization for cDNA microarray data: a robust composite method addressing single and multiple slide systematic variation. Nucleic Acids Res 30: e15.


195

Ye, R.W., Wang, T., Bedzyk, L., and Croker, K.M. (2001) Applications of DNA microarrays in microbial systems. J Microbiol Methods 47: 257-272.

Yim, G., Wang, H. H. and Davies, J. (2007) Antibiotics as signalling molecules. Phil. Trans. R. Soc. B 362: 1195-1200.

Yoshida, T., Ellner, S.P., Jones, L.E., Bohannan, B.J., Lenski, R.E., and Hairston, N.G., Jr. (2007) Cryptic population dynamics: rapid evolution masks trophic interactions. PLoS Biol 5: e235.

Z

Zalkin, H., and Dixon, J.E. (1992) De novo purine nucleotide biosynthesis. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 42: 259-287.

Zhang, Y., Zhang, X., Liu, X., Xiao, Y., Qu, L., Wu, L., and Zhou, J. (2007) Microarray-based analysis of changes in diversity of microbial genes involved in organic carbon decomposition following land use/cover changes. FEMS Microbiol Lett 266: 144-151.

Zhu, J., and Mekalanos, J.J. (2003) Quorum sensing-dependent biofilms enhance colonization in Vibrio cholerae. Dev Cell 5: 647-656.

Zomer, A.L., Buist, G., Larsen, R., Kok, J., and Kuipers, O.P. (2007) Time-resolved determination of the CcpA regulon of Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363. J Bacteriol 189: 1366-1381.

Zoetemeyer, R.J., Arnoldy, P., Cohen, A., Boelhouwer, C. (1982) Influence of temperature on the anaerobic acidification of glucose in a mixed culture forming part of a 2-stage digestion process. Water Res 16: 313-321.

Zoetemeyer, R.J., Vandenheuvel, J.C., Cohen, A. (1982) Ph influence on acidogenic dissimilation of glucose in an anaerobic digester. Water Res 16: 303-311.

analyse post-génomique des interactions cellulaires … · ii.4 la cacophonie microbienne ... i.1...

Documents