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RÉSULTATS
INTRODUCTION
MATÉRIEL ET MÉTHODES
Production d’ingrédients laitiers fonctionnalisés par des microorganismes producteurs de composés antifongiques
L. Garnier1, F. Valence2, A. Pawtowski1 , N. Pinon2 , F. Deniel1, L. Galerne1, N. Frotté1, B. Camier2, E. Coton1 et J. Mounier1
1 Université de Brest, EA 3882, Laboratoire Universitaire de Biodiversité et Ecologie Microbienne, ESIAB, Technopôle Brest-Iroise, 29280 Plouzané, France. 2 INRA, UMR1253 Science et Technologie du Lait et de l'Œuf, F-35042 Rennes, France.
Contact: [email protected] www.researchgate.net/profile/Garnier_Lucille
Levures
Champignons filamenteux
Yaourt
Crème fraiche
Fromage
Insatisfaction des consommateurs
Limitation des possibilités
d’exportation
Pertes économiques
Méthodes préventives
Bonnes Pratiques d’Hygiène
Systèmes de filtration de l’air
Emballages sous atmosphère
modifiée
Impact des contaminations fongiques des produits laitiers Moyens de maîtrise des contaminations fongiques dans les produits laitiers
Barrières traditionnelles
Traitement thermique
Ajout de NaCl/sucre
Fermentation
Conservateurs chimiques
Nouvelle méthode
Biopréservation
Utilisation de métabolites
antifongiques issus de
cultures
« bioprotectrices »
QUESTIONS SCIENTIFIQUES I
Quelle est la diversité des contaminants fongiques des produits et de l’environnement laitiers?
II Quels sont les microorganismes présentant une activité antifongique dans un
milieu laitier?
III Parmi ces microorganismes, lesquels présentent une activité dans un produit
réel?
I - Caractérisation de la diversité des contaminants fongiques présents dans les produits laitiers et leur environnement
Crème fraiche Yaourt Fromage Crème
Collecte des échantillons
Isolement et purification des contaminants
Identification des contaminants par séquençage
• Domaine D1-D2 du gène codant l’ARNr 28S • Région ITS • Portion du gène codant la β-tubuline • EF1-α
Champignons filamenteux
Levures
II - Criblage haut-débit du potentiel antifongique de 703 isolats bactériens et fongiques par fermentation de deux substrats laitiers
505 isolats bactériens
198 isolats fongiques
703 isolats criblés… … cultivés dans 2 fractions laitières…
LH: Lait Low Heat reconstitué à 10% + émulsion de
MGLA à 45% (30g MG/l final)
UF: Perméat d’ultrafiltration 6X (stérilisé par filtration 0.22µm) complémenté à 10g/l d'extrait de levure + pourpre de bromocrésol
…et testés contre 4 cibles fongiques, représentatives de la diversité des
contaminants fongiques des produits laitiers,…
Mucor racemosus
Penicillium commune
Galactomyces geotrichum
Yarrowia lipolytica
…en duplicats.
11360
cultures
Incubation à 12°C jusqu’à 8
jours et évaluation de la
croissance fongique
Retentat: rétentat d’ultrafiltration de lait
entier concentré 5 fois (final fat
concentration finale en MG de 45%,
présure (0,03%), inoculé avec un ferment
lactique mésophile et un indicateur de
pH)
Après fermentation (20h) des fractions
laitières par les isolats, 100µl du
milieu fermenté (Fermentat) ont été
ajoutés à la surface de chaque mini
fromage
Incubation 1h à 30°C
and 72h à 20°C 1 puits = 1 mini-fromage
(~2g)
Retentat + Fermentat
Inoculation avec 50 spores
ou cellules de 4 cibles
fongiques
(1 cible/plaque)
Retentat + Fermentat + Cible
fongique
Retentat + fraction laitière non
fermentée
Retentat + Cible fongique
Évaluation de la croissance fongique et score attribué à l’activité
antifongique des fermentats
Aspect visuel
Effet antifongique Aucun Faible Fort Inhibition
totale
Score 0 1 2 3
Exemple de l’effet du milieu LH fermenté par Lactobacillus sp. sur la croissance de P. commune
III – Caractérisation de l’activité antifongique de 2 fermentats après validation et optimisation de leur activité antifongique – exemple d’une contamination par P. commune
Fromage blanc
Fermentat lyophilisé
1 et 2% Inoculation avec P. commune
(50 spores en surface)
Lecture et photo tous les jours
à partir de 9 jours et
comparaison avec les témoins
Incubation à 10 °C
pendant 14 jours Témoin négatif (T-) = (ni fermentat ni cible)
Témoin positif (T+) = (cible sans fermentat)
Témoin avec un conservateur chimique (TS) = (Sorbate à 0,08%)
I - Diversité des contaminants fongiques dans des produits laitiers et dans l’environnement industriel
Diversité des champignons filamenteux (n=132) en fonction du
biotope d’origine (genre)
Diversité des levures (n=43) en fonction du biotope d’origine (genre)
No
mb
re d
e le
vure
s N
om
bre
de
cham
pig
no
ns
fila
men
teu
x
0
10
20
30
40
50
60
70
Acremonium Cladosporium Epicoccum
Exophiala Fusarium Galactomyces
Lewia Microascus (Scopulariopsis sp.) Mucor
Penicillium Phaeosphaeria Phoma
Sordariomycetes Sporodiobolus Stereum
Thamnidium Thanatephorus
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Cream
(n=3)
Cream
cheese
(n=13)
Dairy
environment
(n=63)
Drink (n=5) Fresh
cheese
(n=15)
Hard cheese
(n=48)
Unknown
(n=17)
Yoghurt
(n=8)
Candida Cryptococcus DebaryomycesKluyveromyces Meyerozyma PichiaRhodotorula Trichosporon Yarrowia
II – Principaux résultats du criblage des isolats bactériens et fongiques
Répartition des scores obtenus
par les fermentats UF Répartition des scores obtenus
par les fermentats LH
3,7% 8,2%
88,1%
Forte activité antifongique (score de 2 ou 3)
Faible activité antifongique (score de 1)
Pas d'activité antifongique (score de 0)
0,3% 2,6%
97,2%
Forte activité antifongique (score de 2 ou 3)
Faible activité antifongique (score de 1)
Pas d'activité antifongique (score de 0)
92,2%
1%
3,8% 1% 1% 1%
Lactobacillus
Aureobasisium
Mucor
Rhodotorula
Torulaspora
Verticillium
Répartition par genre, des isolats cultivés en LH, présentant une forte
activité antifongique
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
L. brevis L. buchneri L. casei L.
harbinensis
L.
plantarum
L. reuteri L.
rhamnosus
2 3
Répartition des hauts scores d’activité antifongique obtenus avec du LH
fermenté en fonction de l’espèce de Lactobacillus sp. considérée Nombre de
souches
III – Effet antifongique de LH fermenté par L. paracasei L117 ou L. rhamnosus
CIRM1952 sur le développement de P. commune à la surface d’un fromage blanc
CONCLUSIONS
J9 J10 J11 J12 J13 J14
T-
T+
TS
L. paracasei
1%
L. paracasei
2%
L.
rhamnosus
1%
L.
rhamnosus
2%
Fro
mag
es
bla
ncs
co
nta
min
és
par
P. c
om
mu
ne
Colloque SFR ScInBioS_IBSAM 07 juin 2016
Retard de croissance de 1 jour observé pour LH – L.
paracasei à 1%
Retard de croissance de 1 jour observé et physiologie de P.
commune affectée par LH - L. paracasei à 2%
Retard de croissance de 3 jours observés pour LH – L.
rhamnosus à 1%
Retard de croissance de 4 jours observés pour LH – L.
rhamonsus à 2%
L’étude de la diversité des contaminants fongiques des produits laitiers et de leur environnement a permis la mise en place d’une collection de 175 isolats composée de 43 levures et 132 champignons filamenteux. Au sein de cette collection, 4 cibles fongiques représentatives de cette diversité et issues de produits contaminés ont été utilisées lors des criblages: M. racemosus, P. commune, G. geotrichum et Y. lipolytica. Le criblage de l’activité antifongique de la collection a permis la sélection de 22 isolats bactériens appartenant aux genres Lactobacillus et Propionibacterium. Chacune de ces souches est capable de retarder la croissance de 2 à 4 cibles fongiques. Il a également permis la sélection de 11 isolats fongiques, appartenant aux genres Aureobasisium, Candida, Exophiala, Mucor, Phoma, Pichia, Torulaspora et Trichoderma, capables de retarder la croissance de 1 ou 2 cibles fongiques chacun. De plus, il est important de noter l’impact du substrat de fermentation sur l’activité antifongique des différents isolats. L’optimisation de l’activité antifongique des souches d'intérêt a été réalisée et a permis la sélection de 4 souches bactériennes et 1 souche fongique pour la réalisation de challenge-tests sur produits réels. L’activité antifongique de certains ingrédients fermentés a été validée dans des produits réels et les conditions d’application de l’ingrédient antifongique dans ces produits ont été définies.
Des chalenge-tests à l’échelle pilote vont être réalisés prochainement et l’identification des composés et des mécanismes impliqués dans l’activité antifongique des ingrédients obtenus est en cours. Ainsi, la finalité du projet est d’obtenir un ingrédient antifongique et 100% laitier.
PERSPECTIVES