Biologie  Cellulaire    &    

Biologie  Moléculaire    

L3          UE  5.2  EP1            2014-­‐2015  

Cours  n°  3  :  Vendredi  12  septembre      10h15-­‐12h15  Pré-­‐requis  :  enzymes  TechADNr,  Endonucléases  de  restricIon,    

Chromosome,  ChromaIne,      

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Pré-­‐requis  

•  Enzymes  •  Endonucléases  •  Dualité  •  Stratégies  de  clonage    

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Enzymes  de  base  de  la  technologie  de  l’ADN  recombinant  

Extrémités   ParIe  centrale  

1   2   3   4  

Polymérase  5’-­‐3’  

Kinase   Endonucléase   Endonucléase  de  restricIon  

Exonucléase  5’-­‐3’      ou      Exonucléase  3’-­‐5’  

Phosphatase   Ligase  (5’-­‐P  et  3’OH)  

Méthylase    (protège  de  l’endonucléase)  (Déméthylase)  

5’  

5’  

5’  

5’   3’  

3’  

3’  

3’  

In  vivo  :  Paire  atypique  pour  la  parIe  centrale  de  la  double  hélice  et    désenroulement  (supertour  négaIf)    •  StructuraIon  en  double  hélice  spontanée    à  T°C  modérée  •  hélicase  :  ouverture  double  hélice  iniIaIon  réplicaIon  transcripIon  (et  aux  extrémités  de  l’œil  de  réplicaIon)  •  topoisomérase  :  gesIon  des  contraintes  topologiques  intrachromosomiques  (RéplicaIon,  mouvement  des  chromosomes,  …)  

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5’                                                                          3’  

3’                            5’  

Endonucléases  de  restricIon  :    noIon  considérée  comme  acquise  

Séquence  du  site  de  clivage  pour  l’endonucléase  de  restricIon  EcoRI  

XXGAATTCXX  XXCTTAAGXX  

Définir  les  deux  sites  de  clivages  :  coupe  entre  G  et  A    de  la  séquence  double  brin  GAATTC  avec  libéraIon  d’extrémités  5’P  et  3’  OH  

Définir  l’acIvité  Méthylase  EcoRI  :  MeEcoRI  acIve  sur  la  même  séquence  que  EcoRI  

MéthylaIon  qui  forme  des  (N)  6  méthyladénines    et  empêche  les  séquences  GAATTC  de  la  bactérie  E.  coli  d’être  clivée  par  l’enzyme  EcoR1.  

ADN  double  brin  

Clivage  de  la  séquence  double  brin  GAATTC  avec  libéraIon  de    •  deux  extrémités  «  double  brin  »  :  5’  débordant  de  séquence  AATT  (5’-­‐  3’)    •  et  d’extrémités  «  simple  brin  »  :  3’OH  et  5’  phosphate.  •  Expression  synthéIque  :    FormaIon  d’extrémités  cohésives  EcoRI    

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Dualité  des  Enzymes  de  la  Technologie  de  l’ADN  recombinant  

•  Impliquées  dans  une  foncIon  cellulaire  ou  virale  –  réplicaIon,  correcIon,  réparaIon,  défense,  invasion  …  

•  OuIl  pour  la  manipulaIon  in  vitro  des  acides  nucléiques  

Exemple  :    ADN  polymérase  I  E.  Coli  qui  porte    4  acIvités  disInctes  (cf  chapitre  RéplicaIon)  

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Stratégies  de  clonage  et  d’expression  •  IdenIficaIon  d’une  molécule  (protéine)  issue  d’un  génome  parIculier    

porteuse  d’une  foncIon  cellulaire    •  ou    •  IdenIficaIon  d’un  gène  muté  dans  une  pathologie  

•  Nécessite  de  «  récupérer  ou  purifier    »  une  séquence  d’acide  nucléique  (gène,  ARNm),  de  la  «  manipuler  »  in  vitro  (ex.  transformaIon  ARNm  en  ADNc)  et  de  l’  «  insérer  »  dans  un  «  vecteur  »  (plasmide,  virus,  …)  pour  l’introduire  dans    la  cellule  appropriée  (bactérienne  ou  eucaryote)    permejant  ainsi    la  déterminaIon  de  la  séquence,        la  producIon  de  la  protéine,    l’analyse  de  sa    foncIonnalité,  ou  bien  la  correcIon  du  foncIonnement  cellulaire.    

•  Il  faut  adapter  l’ADNc  passager    aux    zones  foncIonnelles  d’expression  du  système  choisi  pour  obtenir  la  triple  cohérence  (gène,  vecteur,  cellule  hôte).  

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ApplicaIon  :  Stratégie  d’obtenIon  d’une  Banque  ADNc  orientée    

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Définir  un  chromosome  :  aspect  moléculaire  ?  

•  Un  chromosome  est  une  molécule  unique    d’ADN  double  brin  (structurée  en  double  hélice)  :  

•  circulaire    –  pour  le  chromosome  ou  génome  bactérien  –  Pour  le  chromosome    mitochondrial      ou      chloroplasIque  

         •  linéaire  pour  les  chromosomes  eucaryotes*  avec  une  structure  

télomèrique  à  chacune  de  ses  extrémités.    –  Télomère  :  structure  ADN  répéIIve,  organisée  en  tétra-­‐hélice  et  

permejant  la  protecIon  et  la  réplicaIon  des  extrémités  de  chromosome.  

 -­‐  *  A  l’excepIon  du  chromosome  métaphasique  formé  de  2  chromaIdes    issues  de  la  duplicaIon,  lors  de  la  réplicaIon,    d’un  chromosome  et  redonnant  après  la  division  

cellulaire  chacune  un  chromosome  unique    (chromosome  interphasique).      (ChromaIde=1  molécule  d’ADN  db  linéaire)    

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Définir  un  chromosome  eucaryote  :    Aspect  cellulaire  

•  Molécule  d’ADN  double  brin  linéaire    foncIonnalisée  capable  de  se  répliquer,  de  permejre  l’expression  de  l’informaIon  généIque  dont  elle  est  porteuse  et    de    subir  les  opéraIons  de    maintenance  nécessaire    à  la  conservaIon  de  son  intégrité  et  à  son  mainIen  dans  la  cellule.    

TransiIon  :      une  altéraIon  (cf  zone  centrale)  peut  se  produire  sur  la  structure  du  chromosome  avec  des  

conséquences  cellulaires  variables.  

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Un  danger  majeur  :  le  clivage  double  brin    (dans  la  cellule  et  dans  les  manipulaIons  in  vitro)  

•  Double  Strand  Break    :  DSB  

hjp://www.hindawi.com/journals/jna/2010/646109/fig1/   hjp://atlasgeneIcsoncology.org/Deep/DoubleStrandBreaksID20008.html  

 Schéma  (simpliste)  :  Contexte    Génome/Chromosome/ChromaIne/Nucléosome  

DSB  induits  au  cours  de  la  réplicaIon  des  cellules  tumorales  traitées  par  un    inhibiIon  des  topoisomérases  (camptothécine)  

Cellule    tumorale  

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10  DSB/jour/cellule  

camptothécine  

Génomique  

•  Séquençage  des  génomes  (perso  :  1  000  €  )  

•  Taille  et  Nombre  de  gènes    

•  Génomique  foncIonnelle  

•  IntégraIons  sous-­‐jacentes    –  (territoires  cellulaires  et  nucléaires,  complexes  intégraIfs  et  réseaux  géniques)  

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Carte  d'Iden8té  :    Génome  (s)    humain    (polycopié  1  page  7)  

LocalisaIon Noyau

Nature ADN  double  brin  linéaire  

Taille  des  chromosomes   50  000  000  à  250  000  000  pb

Taille  du  génome 3  300  000  000  pb/génome  haploïde Nombre  de  copies diploïde  (sauf  cellules  de  la  reproducIon)

Nombre  de  chromosomes 23  x  2  (cellule  diploïde)

Nombre  de  gènes    (2010) environ  20  000  gènes  codant  une  protéine  idenIfiée  

Taille  moyenne  des  gènes   3000  pb  :  4  exons  totalisant  1350  pb,  protéine  de  450  acides  aminés  

Nombre  unité  de  transcripIon 100  000  à  200  000

Structure  de  gènes   dystrophine  (79  exons  dans    2  400  000  pb),  IIne  (363  exons,  38  000  acides  aminés)  

Nature  des  gènes   ARNt,    ARNr,  ARNm,  miARN,  snARN,    lncARN…

Spécificité nombreux  facteurs  de  transcripIon  et  nombreuses  séquences  régulatrices  de  l'expression  génique  

LocalisaIon Mitochondrie Nature ADN  double  brin  circulaire  unique  par  mitochondrie Taille  du  génome 16  569  pb Nombre  de  gènes 37 Nombre  de  copies  /cellule n  (0,1  %    ADN  total) Spécificité peu  de  recombinaison,  taux  de  mutaIon  élevé

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GesIon  de  l’état  de    compacIon  et  des  mouvements    du  chromosome.    

Système  de  signalisaIon  permejant  une  mise  en  œuvre  rapide  et  fiables  des  foncIons  concernées  

Chromosome  1  humain  taille  :      250  000  000  pb  longueur  physique  8,5  cm  Taille  cellulaire  =  qq  micromètres    (facteur  de  compacIon  :  ordre  de  10  000)  

DSB  

Gènes                                                                                  ChromaIne          Nucléosome    Code  Histone                                                  OrganisaIon  du  génome    Domaines  régulateurs  

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Deux  contraintes  majeures  

CompacIon  maximale  :  Métaphase    Caryotype  spectral  :  photographie  de  l'étalement  chromosomique  après  hybridaIon  

3000  

Chromosomes  métaphasiques   Cycle  cellulaire  

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Chromosome  idenIficaIon  facile  même  si  instabilité  généIque  

Nombre  de  gènes  :  quesIon    plus  problémaIque  

StructuraIon  du  chromosome  eucaryote  

Gène  

Domaine  régulateur  

T   T  C  

Gènes    

Amas  de  gènes    

Gènes    

Chromosome    

Zones  foncIonnelles  de  domaine  

Zones  foncIonnelles  de  domaine  

O OO O

Séquences  intergéniques  Séquences  répétées    

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Structure  du  gène  eucaryote  (protéine)  

Environnement  et  mémoire      

IntégraIon  des  signaux  ou  informaIons  

Modules  ou  ER  

AUG                          stop  

C AAAAAA  

5’  UTR                  codante                            3’  UTR  

Pré-­‐ARN  messager  ou    transcrit  primaire    introns  

ARNm  

Promoteur  Z.  R.  

Gène  

ZR  zone  régulatrice    de  la  transcripIon   ZR  zone  régulatrice    

de  la  transcripIon  

Z.  R.    

Coiffe            extension                                  polyadénylée      

StructuraIon    3D  Site  de  fixaIon  miARN  

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Gènes  de  protéines                  Unités  de  transcripIon  

Isoformes  ARN  

Non  coding  ARN  

Isoformes  protéiques  

Régions  intergéniques  Brin  anI-­‐sens  Introns  

Chaque  gène  peut  être  employé  de  manière  différente    

en  foncIon  de  la  cellule  concernée    

•Niveaux  de  régulaIons                •Réseaux  géniques  •Epissage  alternaIf          •RégulaIon  intégraIve  •miARN    …                    •Richesse  en  protéines  (x10)  •ModificaIons  épigénéIques  

1  gène  =  1  environnement  chromosomique  unique  1  gène  =  1  régulaIon  transcripIonnelle  intégrée  unique  

1  Type  Cellulaire  :  Panorama  d’expression  génique    spécifique,  dépendant  de  l’instant  et  du  micro-­‐environnement.    

Transcrits  mulIples  

(chroma8ne)  

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Puces  ADN    

Technique  1  :    Puces  ADN  /transcriptomique    

Puces  ADN                                                                                                                                                                    gene  array  

1   PréparaIon  des  ARNm  (ou  ARN  cellulaires  totaux)    

2   TranscripIon  inverse  

3   Couplage  des  ADNc  à  des  fluorophores  

4   HybridaIon  sur  support  mulIsondes  ADN    (ex.  20  000  gènes  humains)/lavage  

5   Lecture  de  la  fluorescence    

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Transcriptomique.  :    technique  d’analyse  globlale  uIlisant  les  puces  ADN  qui  permet  de  déterminer  simultanément  le  niveau  d’expression  de  chacun  des  gènes  protéiques  d’un  type    cellulaire  ou  d’un  Issu  dans    pour  une  circonstance  expérimentale  donnée.  Définissant  ainsi  «  panorama  d’expression  génique  »  de  la  cellule  ou  du  Issu.  Ce  panorama  d’expression  génique  est  très  sensible  aux  modificaIons  de  l’environnement  cellulaire  (hormone,  stress,  …).  

Ceje  technique  peut  aussi  être  appliquée  à  l’analyse  de  l’expression  des  gènes  de  miARN,  ou  bien  de  l’ensemble  des  ARN  exprimés  (ARNm  et  ARN  non-­‐codant)    au  sein  d’une  cellule  parIculière.  

Puces  ADN  

hjp://en.wikipedia.org/wiki/File:NA_hybrid.svg  

ReproducIon  effectuée  par  l’Université  François  Rabelais  de  Tours  Avec  l’autorisaIon  du  C  20  rue  des  Grands  AugusIns    75006  Paris  .  F.  C.      

ARN  cellulaires    marquage  

Basée  sur  la  propriété  d’hybridaIon  des  acides  nucléiques    selon  laquelle  les  séquences  nucléoIdiques  complémentaires  se  reconnaissent    et  s’apparient  pour  former  une  double  hélice.  D’une  manière  très  générale,  la    double  hélice  de  l’ADN  est  ouverte  expérimentalement  par  la  soude,  la  chaleurs,  les  solvants  (formamide)  ou  

enzymaIquement  par  les  hélicases.    55  

1-­‐2%    génome  exprimé                ≈    20  000  gènes    Taille  moyenne  3000  pb      Exons      

Sondes  systémaIques  

1   n  10  %  génome  exprimé  180  000  unités  de  transcripIon  StructuraIon  de  la  chroma8ne  Plus  d’ARN  (LncARN,  …)  ,  Moins  de  gènes  

Sondes  géniques  

Conclusion  :  TranscripIon  et  StructuraIon  de  la  chromaIne  concerne  la  globalité  du  génome  et  l’ensemble  des  foncIons  ajachées  aux  acides  nucléiques  

EpigénéIque  ChromaIne  

Puces  ADN  

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ChromaIne  :  règle  des  2  

•  2  niveaux  de  condensaIon  (interphase/métaphase)  

•  2  niveaux  d’organisaIon  (nucléosome/domaine)  

•  2  cibles  de  modificaIons  covalentes  (histone/ADN)  

•  2  approches  analyIques  (spécifique/globale)  

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Chromosome  métaphasique  Microscopie  électronique  

RéplicaIon  DuplicaIon  Centromère  Télomère  ChromaIde  Chromosome  

Principe/excepIon                      1  chromosome  =  1  ADN  double  brin  Sauf   Chromosome  métaphasique   formé  de   2   chromaIdes   reliée   par   le   centromère   et  qui  donneront  un  chromosome  interphasique    dans  chacune  des  deux  cellules  filles     58  

ChromaIne    :  Deux    degrés  de  condensaIon  

•1•  État  décondensé  dans  le  noyau  interphasique        :    Territoires  disIncts  

Microscopie  électronique  

(hjp://academics.hamilton.edu/biology/kbart/image/nucleus.jpg)  

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ChromaIne  :  2  niveaux  d’organisaIon  et  deux  principes  unificateurs  

•  Nucléosome  •  Domaines  régulateurs  

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Nucléosome  

Une  fracIon  importante  de  protéines  de  structuraIon  ou  régulatrices  complètent  la  structure  nucléosomique    in  vivo      

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Autant  d’ADN  que  de  protéines  histones    dans  un  nucléosome,        

Un  nucléosome  :  Quatre  paires  d’histones  

2  H2A  2  H2B  2  H3    2  H4  ou  Octamère    

auquel  peut  se  rajouter  un  histone  H1    

Nucléosome  :  assemblage  doté  d’une  grande  plasIcité  structurale      

Structure  du  nucléosome    

Extension  N-­‐terminales  des  histones  H2A,  H2B,  H3  et  H4  stabilisant  le  nucléosome  

Accessibilité  parIelle  de  la  double  hélice  de  l’ADN  à  certaines  protéines  régulatrices  (zone  hachurée).    

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Histone  H1  permet  de  verrouiller  la  structure  nucléosomique,    pour  des  niveaux  d’organisaIon  supérieurs