Biologie moléculaire

Dans la vie d’un biologiste

Cas clinique hépatite C

Mr X , 47 ans,effectue bilan préopératoire

Le bilan biologique montre:NFS normaleALAT , ASAT: 2 x la normaleAgHBs –Anti-HBs:+Sérologie hépatite C positive

Examens complémentaires à pratiquer

ARN Génotypage Sérotypage viral Charge virale hépatite C Électrophorèse des protéines Bêta 2 microglobuline Bilirubine

Examens complémentaires

ARN: Témoin de la réplication:20% hep C sont ARN négatifPlus sensible que la charge virale:

Amplicor: 50UICV amplicor: 600 à 850 000UIbDNA: 615 à 7 700 000 UI

Mais PCR en temps réel sensibilité: 15UI

Examens complémentaires

Sérotypage ou génotypage: idem , indispensable pour mise sous traitementSérotypage ne donne pas sous type (1,2….)

Mais pas d’influence sur le traitement

Génotypage est plus précis

Traitement et suivi sont conditionnés par le génotype

Examens complémentaires à pratiquer

Charge virale hépatite C ARN Génotypage Sérotypage viral Électrophorèse des protéines Bêta 2 microglobuline Bilirubine

Génotypage se fait par:

Séquençage région NS3

Séquençage région NS5

INNO LIPA

PCR en temps réel

Génotypage

Région 5’ NC le plus fréquent , quelquefois pas sous-typage

NS5: plus de variabilité

INNO LIPA: Bonne technique, facile

PCR en temps réel: avenir!!!!!!!!!

Génotypage se fait:

Séquençage NS3

Séquençage NS5

INNO LIPA

PCR en temps réel

Décision médicale:Mise sous traitement

Avant traitement

Charge virale

Détection de mutations de résistance au traitement par séquençage

Avant traitement

Charge virale: Indiquée pour génotypes 1,4,5Pas nécessaire pour génotypes 2 et 3

Recherche de mutations de résistance:- Pas de nouvelles molécules :

antiprotéases???

Avant traitement

Charge virale

Détection de mutations de résistance au traitement par séquençage

Suivi pendant traitement

ARN mensuel

Charge virale hebdomadaire

Transaminases hebdomadaires

ARN à M6

NFS mensuelle

Hormones thyroïdiennes

Suivi pendant traitement

Génotype 1: charge virale à S12 (consensus 2002) ou à S4 (2006)

Génotypes 2 et 3: ARN à M6

Transaminases tous les mois

NFS tous les mois

Hormones thyroïdiennes: TSH tous les 3 mois

Suivi pendant traitement

ARN mensuel

Charge virale hebdomadaire

Transaminases hebdomadaires

ARN à M6

NFS mensuelle

Hormones thyroïdiennes

Suivi post traitement

ARN mensuel

Charge virale bi-annuelle

ARN à M6 puis 1 an

Génotypage

Séquençage pour mutations de résistance

Suivi post traitement

ARN mensuel

Charge virale bi-annuelle

ARN à M6 puis 1 an

Génotypage

Séquençage pour mutations de résistance

Hépatite B

Mr C , origine asiatique , arrivé en France depuis 6 mois consulte en gastro-entérologie

HAV totaux posHAV IgM: negAg HBs posAnti-HBc pos avec IgM negAg HBe negAnti-HBe posHépatite C neg

Examens complémentaires à demander

ADN B

Sérologie hépatite delta

ADN delta

Génotypage Hépatite B

Anti-HBs

Examens complémentaires à demander

ADN B : indispensable

Facteur de gravité : hépatite delta 5% AgHBs sont infectés par delta

Virus delta: pas de technique commerciale mais techniques de RT-PCR maison et maintenant PCR en temps réel

Génotypage ???

Examens complémentaires à demander

ADN B

Sérologie hépatite delta

ADN delta

Génotypage Hépatite B

Anti-HBs

ADN B

bDNA

PCR classique

PCR en temps réel

TMA

bDNA détecte 25 UI/L

Techniques ADN b

bDNA linéarité : 615 à 7,7 millions UI/ml

Amplicor Linéarité: fonction de la dilution (galère!!!!!!!!) Sensibilité: 200UI/ml

PCR temps réelLinéarité : 54 - 110 millions UI/ml

12 – 50 millions UI/mlSensibilité : 12 UI/ml soit 70 copies/ml

ADN B

bDNA

PCR classique

PCR en temps réel

TMA

bDNA détecte 25 ui

Décision thérapeutique

Patient est mis sous Lamivudine avec une charge virale à 8800 UI/ml

Suivi Médical sous traitement

ADN B mensuel

NFS hebdomadaire

Charge virale hépatite delta

AgHBs mensuel

Suivi Médical sous traitement

ADN B trimestriel

ALAT trimestrielle

Si négativation de l’ADN, faire un AgHbS

La négativation de l’ag HBs est rare sous lamivudine ,

5 à 10% sous interféron

Suivi Médical sous traitement

ADN B mensuel

NFS hebdomadaire

Charge virale hépatite delta

AgHBs mensuel

Au bout de 6 mois , la charge virale par bDNA est < 350UI/ml

Après 2 ans de traitement , la charge virale est de 10000 UI/ml

Quels examens doit on pratiquer?

Génotypage

Charge virale hépatite delta

Ag Hbe

Recherche mutant C/préC

Recherche mutation YMDD

Traitements

Interféron + peg –interféron

Analogues nucléosidiques:

Lamivudine :3TCEmtricitabine: EmtrivaAdefovir: HepseraTenofovir: Vireadclevudineentecavir

Incidence des résistances

Lamivudine: 24% en 1 an 70% en 4 ans

Adefovir 15% en 4 ans

ceci en monothérapie

Intérêt des bi ou trithérapies????

mutation YMDD : la + fréquente , mutation de résistance à la lamivudine, emtricitabine

Pas de résistance croisée entre les différents nucléosidiques et nucléotidiques

Incidence des résistances

Terminalprotein spacer Pol/RT RNaseH

I(G) II(F) A B C D E

1 183 349(rt1)

692(rt344)

845 a.a.

LAMADV

ETV

LdT

L801 L180M V173L A181V

S184GI169T

M204V/I/S

N236T

M202I

M204I

M250V

GVGLSPFLLA YMDD

TDF V1911I A194T

Quels examens doit on pratiquer

Génotypage

Charge virale hépatite delta

Ag HBe

Recherche mutant C/préC

Recherche mutation YMDD

Recherche de résistance à la Lamivudine

Séquençage

Hybridation moléculaire

PCR en temps réel

Phénotypage antivirogramme

Recherche de résistance à Lamivudine

Séquençage

Hybridation moléculaire

PCR en temps réel

Phénotypage antivirogramme