totipotentes

Stade 8 cellulesovocyte fécondé blastocyste cellules souches

embryonnaires (ES)

auto-renouvellement

activité télomérase élevée

pluripotence

Endoderme

PancréasThyroïdePoumonIntestin

Hépatocytes

Mésoderme

CardiomyocytesChondrocytes

AdipocytesLymphocytes, GR

MuscleMacrophagesEndothéliales

Ectoderme

KératinocytesNeurones

Crête neurales(mélanocytes, …)

Germinales

OvocytesSpermatogonies

Transplantation dans des sites « immuno-

privilégiés »

Différentes possibilités d’induction de tolérance

Banque de lignées huES immunotypées

(HLA)

Induction de tolérance par chimérisme hématopoiétique

(MSC)

Génération d’une lignée universelle

(KO HLA classe ½)

transfert nucléaire(clonage thérapeutique)

noyauadulte

cellule adulte

« Clonage thérapeutique »

embryon pré-implantatoire

5 j o u r s

e n c u l t u r e ovocyte

sans noyau

culture des cellules souches

embryonnairesneurones

différenciation

greffe thérapeutique(autogreffe!!)

« Clonage reproductif »

R é - i m p l a n t a t i o n

d a n s l ’ u t é r u s

(Dolly 1998)

« Clonage thérapeutique »

embryon pré-implantatoire

culture des cellules souches

embryonnairesneurones

différenciation

greffe thérapeutique(autogreffe!!)

R é - i m p l a n t a t i o n

d a n s l ’ u t é r u s

« Clonage reproductif »

- statut de l’embryon (âge, droit)- dignité humaine (statut enfant issu du NT)

- marchandisation du corps de la femme- espèces hybride (technique et problèmes)

Impossibilité sur l’homme mais: une barrière technique ne peut être une réponse à une question d’éthique.

p53, le gardien du génome

p53

apoptose

Arrêt du cycle

réparation

cellules somatiques

S

G2 M

G1

S

checkpoint

différenciationterminale

division asymétrique

nanog-

p53 induces differentiation of mouse ES cells by suppressing Nanog expressionNat Cell Biol. 2005

G1G2M

cellules ES

S

Pluripotence des cellules couches embryonnaires (I)

Cellules ES(+ LIF)

- LIFGouttes pendantes

.. . . .0

3

5Jo

urs d

e cu

lture

et d

e di

ffér

enci

atio

nAdhésion et

croissance des corps 20

Culture en suspension(boites de Pétri)

Ectoderme (feuillet externe)

Mésoderme(feuillet médian)

Endoderme (feuillet interne)

Cellules épidermiquesCellules neuronales

Cellules cardiaquesCellules musculairesGlobules rouges…

Cellules pancréatiquesCellules thyroïdiennesCellules pulmonaires

Femelleporteuse

souris chimérique

Pluripotence des cellules couches embryonnaires (II)

Cellules ES

Recombinaison homologue

Cellules ESdont un gène est modifié

Injection dans le blastocyste

Pluripotence des cellules couches embryonnaires (III)

Tératome: Tumeur bénigne ou maligne formée à partir de tissus multiples étrangers à la

région qui l'entoure

Bone

Gut kidney

neuroectoderm

ES

Utilité et perspectives d’utilisation des cellules ESEtude des stades précoces du développement:- Déterminer les conditions de différenciation- Comprendre les pathologies congénitales.

Utilité et perspectives d’utilisation des cellules ESEtude des stades précoces du développement:- Déterminer les conditions de différenciation- Comprendre les pathologies congénitales.

Tests pharmacologiques:- Remplacer en partie essais de toxicité sur l’homme (phase 1). - Tests des effets tératogènes de produits (Thalidomide).

Utilité et perspectives d’utilisation des cellules ESEtude des stades précoces du développement:

- Déterminer les conditions de différenciation- Comprendre les pathologies congénitales.

Tests pharmacologiques:- Remplacer en partie essais de toxicité sur l’homme (phase 1). - Tests des effets tératogènes de produits (Thalidomide).

Utilisation en thérapie cellulaire: - Neurodégénératrices: Parkinson, sclérose en plaque, Alzheimer, chorée de Huntington, para-tétraplégie. - Déficit cellulaire: diabète de type I (HES produisent insuline in vivo); infarctus du myocarde; hépatite. - Manipulation génique des ES avant transplantation pour réverter un phénotype pathologique.

Utilité et perspectives d’utilisation des cellules ESEtude des stades précoces du développement:

- Déterminer les conditions de différenciation- Comprendre les pathologies congénitales.

Tests pharmacologiques:- Remplacer en partie essais de toxicité sur l’homme (phase 1). - Tests des effets tératogènes de produits (Thalidomide).

Utilisation en thérapie cellulaire: - Neurodégénératrices: Parkinson, sclérose en plaque, Alzheimer, chorée de Huntington, para-tétraplégie. - Déficit cellulaire: diabète de type I (HES produisent insuline in vivo); infarctus du myocarde; hépatite. - Manipulation génique des ES avant transplantation pour réverter un phénotype pathologique.

Délivrance de médicamentsproduction massive de protéines recombinantes ou endogènes…

Utilité et perspectives d’utilisation des cellules ESEtude des stades précoces du développement:

- Déterminer les conditions de différenciation- Comprendre les pathologies congénitales.

Tests pharmacologiques:- Remplacer en partie essais de toxicité sur l’homme (phase 1). - Tests des effets tératogènes de produits (Thalidomide).

Utilisation en thérapie cellulaire: - Neurodégénératrices: Parkinson, sclérose en plaque, Alzheimer, chorée de Huntington, para-tétraplégie. - Déficit cellulaire: diabète de type I; infarctus du myocarde; hépatite. - Manipulation génique des ES avant transplantation pour corriger un phénotype pathologique.

Délivrance de médicamentsproduction massive de protéines recombinantes ou endogènes…

Regénération tissulaire contre le viellissement

Thérapie des cancers?

Conditions d’utilisation des cellules ES en thérapie

* Savoir et pouvoir cultiver durablement les cellules ES humaines

* Contrôler leur différenciation de manière sélective

•Pureté cellulaire: FACS, sélection génique, clones

•Contrôler le rejet de tissus

• Eviter les tératomes (indiff. cells?)

* Problème d’éthique lié à l’utilisation d’embryons surnuméraires

Conditions d’utilisation des cellules ES en thérapie

* Savoir et pouvoir cultiver durablement les cellules ES humaines

* Contrôler leur différenciation de manière sélective

* Pureté cellulaire: FACS, antibio, clones

•Contrôler le rejet de tissus

• Eviter les tératomes (indiff. cells?)

* Problème d’éthique lié à l’utilisation d’embryons surnuméraires

Prévalence: ~ 100 000 patients en France

Pathologie: Perte des neurones dopaminergiques de la substance noire (pars compacta)

Symptômes:Tremblements, Rigidité musculaire,Ralentissement des gestes (akinésie, bradykinésie) Instabilité posturale

La maladie de Parkinson

Dopamine neurons derived from embryonic stem cells function in an animal model of Parkinson's disease J KIM*, J M. AUERBACH*†, J A. RODRÍGUEZ-GÓMEZ, I VELASCO, D GAVIN, N LUMELSKY, S LEE†, J NGUYEN†, R SÁNCHEZ-PERNAUTE†, K BANKIEWICZ† & R MCKAY NIH, Bethesda.

Modèle animal de la maladie de Parkinson:Administration de 6-OH-DA dans le striatum détruit les neurones dopaminergiques.

Commutateur de différenciation: promoteur nurr-1 + SHH + FGF8: - Isolement de neurones DOPA (78%) - Injection des cellules dans le striatum.

On retrouve les corps de cellules ES TH+ dans la

région de la greffe (a-c)

mais des prolongements dans le parenchyme du

striatum hôte jusqu’à 2 mm de la greffe (d-g).

Marquage anti-Tyrosine Hydroxylase (TH).

800 rotations/70 min

1 rotation/5 sec

Administration d’amphétamine aux animaux lésés par le 6-OH-DA induit une rotation autour du site d’injection.

By demonstrating efficacy while avoiding tumour formation, Kim et al. have achieved a proof of principle, although ES cells that have been genetically modified in this way might not be desirable for use in people.

800 rotations/70 min

1 rotation/5 sec

Administration d’amphétamine aux animaux lésés par le 6-OH-DA induit une rotation autour du site d’injection.

Embryos lacking the Id1, Id2, and Id3 genes display multiple cardiac abnormalities and die around E13.5.

DiscontinousEndocardial

cell lining

Reducedmyocardial proliferation

B. Injection of a small number of wild-type ES cells carrying a lacZ marker into Id mutant blastocysts resulted in about 20% chimerism of heart tissue and complete rescue of the Id mutant phenotype.

Injection de cellules ES

Niches de ES

Short-range signals

C. Wnt5a, a locally secreted factor, and IGF-1, a bloodstream factor that promotes myocyte proliferation--were identified as potential candidates involved in the rescue process.

Injection de IGF-1 ou cellules ES

Long-range signals

166 genodermatosis (139 genes)

DISORDERS OF KERATINIZATION Ichthyosiform dermatoses Ichthyosis vulgaris X-linked ichthyosis Lamellar ichthyosis Congenital ichthyosiform erythroderma Epidermolytic hyperkeratosis Harlequin fetus Palmoplantar keratodermas Darier disease

DISORDERS OF COHESION Epidermolysis bullosa Kindler syndrome

PIGMENTATION DISORDERS Oculocutaneous albinism Tyrosinase-negative Tyrosinase-positive Ocular albinism Piebaldism Waardenburg syndrome Incontinentia pigmenti Neurofibromatosis type 1 Neurofibromatosis type 2 Tuberous sclerosis

VASCULAR DISORDERS Ataxia-telangiectasia Hereditary hemorrhagic telangiectasia

ECTODERMAL DYSPLASIA SYNDROMES Anhidrotic ectodermal dysplasia Hypohidrotic ectodermal dysplasia with immunodeficiency Hidrotic ectodermal dysplasia

p63-related ectodermal dysplasia Pachyonychia congenita

DISORDERS WITH MALIGNANT POTENTIAL Basal cell nevus syndrome Gardner's syndrome Peutz-Jegher syndrome Xeroderma pigmentosum Epidermolysis bullosa syndromes

dermalfibroblasts

epidermal cells

(K5/K14)

Ectoderm

Mesoderm

Gastrulation derme

épiderme

ectodermalcells

(K8/K18)

BMP-4

Neuroectoderm

BMP-4 NogginChordin

DorsalVentral

Epidermis

Mesoderm

Endoderm DORSALVENTRAL

neuralcells

3 114

stromal fixed-feeders

(- serum) neurons

Days in cultureES cells

Neural precursors (sox-1+)

sox-1

Neural cells(most TH+)

3 114

stromal fixed-feeders

(- serum) neurons

Days in cultureES cells

Neural cells(most TH+)

NeuFNestin

tuJ

3 115

mesenchymal fixed-feeders

(- serum) neurons

Days in cultureES cells

BMP-4

K18

Neural cells(NeuN, NeuroFNestin, β-III tubulin)

3 114

mesenchymal fixed-feeders

(- serum) neurons

Days in cultureES cells

BMP-4

K18

Neural cells(NeuN, NeuroFNestin, β-III tubulin)

serum

K14

BMP-4Contrôle

Iodure dePropidium

contrôle

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4FL1-H

DIOC6

(dommage mitochondrial)apoptotic

cells

living cells

dead cells

DIOC6: -retains in intact cells-excluded in apoptotic cells

Iodure de Propidium: -excluded in living cells-retains in death cells

Iodure dePropidium

BMP-4contrôle

0 200 400 600 800FSC-H

R1

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4FL1-H

58

16

18

8

0 200 400 600 800FSC -H

R1

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4FL1-H

12

6

73

9

DIOC6

(dommage mitochondrial)

BMP-4 induit l’apoptose des cellules ESGambaro et al. (2006) Cell Death Diff. 13. 1075-1087

apoptosespontanée

apoptoseinduite

Caspase-3clivée

- +BMP-4

Procaspase-3

ß-tubuline

Caspase-3clivée

- + - +ß-tubuline

BMP-4

Procaspase-3

contrôle

% d

e ce

llule

s vi

vant

es

20

25

30

35

40

45

50

55

Milieu 1µM 3µM 10µM

ContrôleBMP-4

PD169316

BMP-4

BMP-4 R

Smad 1TAK 1 (MAPKKK)

p38 MK

Apoptosis

PD169316

Gènes cibles: msx-1 et msx-2

Smad-1, 5, 8

P

P

GS box P

P

Type II Type I

BMP-4

Smad-1, 5, 8

P

Smad4+/-

Smad-4

R-Smad

P

Smad-4

BMP-4 induit l’apoptose des ES cells via la voie des Smad

Flag

-Sm

ad-6

Β-ga

l

- + - + - + - +BMP-4

Cleaved Caspase-3

Procaspase-3

ß-tubulin

β -galactosidase

flag

2025303540455055

contrôle AdV- smad-6

% d

e ce

llule

s vi

van

tes

AdV-LacZ

noBMP-4

Smad 6

BMP-4

BMP-4 R

Smad 1TAK 1 (MAPKKK)

p38 MK

Apoptosis

3 104

Sox-1

Jours en culture

ES sur feeders

2

β-III tubuline, NeuN, Nestine, NeuF

β-III tubuline

Nb

ab

solu

de

cellu

les

(x

10-4)

20

16

12

8

4

0

Sox1- Sox1+

+ Ad-Smad6BMP-4 - + - +

% d

e ce

llule

s N

euro

fila

men

t po

siti

ves

Adv Smad6

Adv LacZ

0

5

10

15

20

25

30

Contrôle

_ _ _+ + +BMP-4

BMP-4 induit l’apoptose des précurseurs neuronaux sox-1+

Sox-1 Caspase-3 clivée

co-marquage

NO

BMP-4

ESCommitted neural precursorsox-1+ neurones

(NeuN, NeuroFNestine, β−III tubuline)

K14

+ serum

BMP - 4

apoptosis of neural sox-1+ precursors

sox-1-

précurseur neuroectodermal ?

cellules ectodermales(K8/K18)

Smad

Gambaro et al. (2006) Cell Death Diff. 13. 1075-1087

BMP-4 induit l’apoptose des progéniteurs neuronaux issus de cellules ES

BMP-4 - + - +

∆Np63 is activated during BMP-4-induced ES cell commitment

3 114

mesenchymal fixed-feeders

(- serum) neurons

Days in cultureES cells

BMP-4 ∆Np63

transcriptome analysis +/- BMP-4:

(1979)

(1998)

(1998)

p53

p63

p73

p63 belongs to the p53 gene family

TAp63∆Np63

proapoptotic

cell proliferation

cell adhesion

p21, Notch

lama3, Itgb4, Perp

cellular senescence genomic stability

(SKPs)

ectrodactyly

(Celli J. et al. Cell 1999)

ectodermal dysplasia Cleft lip/palate Ankyblepharon

p63-related ectodermal dysplasia syndromes

Ectodermal Dysplasia

Cleft lip and/or palate

Limb defect

EEC

AEC

ADULT

SHFM

p63-/-p63 WT

(Mills, Nature 1999; Yang, Nature 1999)

What is the function and regulation of p63 during development and in pathology ?

p63 is required for normal ectodermal development

p63-/-p63 WT

No stratified epithelia: skin remains single ectodermal layer.

p63-/-

p63 WT

No limbs: no AER (apical ectodermal ridge) formationand cranio-facial defects

no BMP4

K18 / ∆Np63

ES

BMP-4 ectodermal cells (K8/K18)

neural cells

BMP4 + serum

K14 / ∆Np63

X 40

p63 is not necessary for ectodermal commitmentbut may be required for epidermal fate

epidermal cells (K5/K14)serum

X

tub

ES wt

ES pSuper

ctrl

P63-

1P6

3-2

P63-

3

∆Np63

∆Np63 - + + + + +

∆Np63 is required for epidermal differentiation of ES cells

ES

BMP-4 ectodermal cells (K8/K18)

epidermal cells (K5/K14)

neural cells

serumsh-p63 X

sh-∆Np63:sh-pSuper:

TAp63

ES cells

ECM

BMP-4

Ectodermal progenitors

∆Np63α is necessary to induce epidermal differentiation of ES-derived ectodermal cells

∆Np63

K14

merge

∆Np63α

Target genesKGF-R miR 125 BMP-7 miR 328Notch miR 515-516IKKα miR 720PERP ……ITGB4ITGA6Lamc2U3 ligase,….

New function for p63 during embryonic development ?

3 115Days in cultureES cells

p63

epidermalcells

(K5/K14)

fixed stromalfeeders

(- serum)ectodermal progenitors(K8/K18)

Could p63 replace BMP-4 to induce epidermal fate?

?

3 115Days in cultureES cells

p63

epidermalcells

(K5/K14)

fixed stromalfeeders

(- serum)ectodermal progenitors(K8/K18)

p63 cannot replace BMP-4 to induce epidermal fate

Link to cardiogenesis?

Pluripotent state

Primitive streak

(mesendoderm)

Endoderm

Mesoderm

Cardiac mesoderm

Brachyury, Fgf8

Sox-17

Mesp-1

The cardiac developmental pathways

Tbx5

Islet1 Tbx1

Nkx2.5Mef2c

First Heart Field

Second Heart Field

Anteriorsplanchnic mesoderm

Pharyangeal mesoderm

Left ventricleAtrial

Right ventricleOFT

Cardiac

crescent

Alain Medawar, Matthieu Rouleau

shctrl

shp63

sictrl

si∆Np63

siTAp63

shctrl

shp63

sictrl

si∆Np63

siTAp63

TAp63 is required for in vitro cardiogenesis

EpiblastEpiblast

MultipotentMultipotentCardiovascularCardiovascular

progenitorsprogenitors(Mesp1/2, sox-7(Mesp1/2, sox-7++, Flk1), Flk1)

Cardiac progenitors(Nkx2.5,Tbx5,

Mef2c,Isl1)

Cardiac cells(TpnT, α-actinin)

PrimitivePrimitiveMesodermMesoderm

(Brachyury T)(Brachyury T)

PrimitivePrimitive streak (EMT)streak (EMT)

sh-ctrlsh-p63

Mesp1

6080

100

Day 2 Day 50

102040

Brachyury

81012

Day 2 Day 50246

Fold

Indu

ctio

n / c

trl d

ay 0

Which cells are producing p63?

TnT2

*Day 12

101

102

103

Mlc2vα-actinin0

****

Nkx2.5

0123456789

Day 5 Day 11

*

*

Tbx5

0

10

20

30

40

50

60

Day 5 Day 11

**

*

Islet1

0

40

80

120

Day 5 Day 11

*

EpiblastEpiblast

MultipotentMultipotentCardiovascularCardiovascular

progenitorsprogenitors(Mesp1/2, sox-7(Mesp1/2, sox-7++, Flk1), Flk1)

Cardiac progenitors(Nkx2.5,Tbx5,

Mef2c,Isl1)

Cardiac cells(TpnT, α-actinin)

PrimitivePrimitiveMesodermMesoderm

(Brachyury T)(Brachyury T)

PrimitivePrimitive streak (EMT)streak (EMT)

Alain Medawar

EndodermEndoderm(sox-17(sox-17++))

(primitive and/or extra-embryonic)(primitive and/or extra-embryonic)

Sox17p63 Merge

EpiblastEpiblast

MultipotentMultipotentCardiovascularCardiovascular

progenitorsprogenitors(Mesp1/2, sox-7(Mesp1/2, sox-7++, Flk1), Flk1)

Cardiac progenitors(Nkx2.5,Tbx5,

Mef2c,Isl1)

Cardiac cells(TpnT, α-actinin)

PrimitivePrimitiveMesodermMesoderm

(Brachyury T)(Brachyury T)

PrimitivePrimitive streak (EMT)streak (EMT)

EndodermEndoderm(sox-17(sox-17++))

Alain Medawar

(primitive and/or extra-embryonic)(primitive and/or extra-embryonic)

Sox17p63 Merge

E7.5

Marja L Mikkola, Stockholm)

Cell non-autonomous effect of p63 on cardiogenesis

Matthieu Rouleau

WT ES

GFP-shp63 ES

Beating cells+++

+/-

02468

101214161820

sh-ctrl

% of TnT2+ cells (among GFP+ cells)

sh-p63-gfp

Matthieu Rouleau

Non-cell autonomous effect of p63 on cardiogenesis

WT ES

GFP-shp63 ES

Beating cells+++

+/-

02468

101214161820

sh-ctrl

% of TnT2+ cells (among GFP+ cells)

sh-p63-gfp Mixed ES ++

AmongGFP+ cells

- +sh-ctrl cells

*

Cardiac rescue by exogenous Activin-A

Alain Medawar, Matthieu Rouleau

Matthieu Rouleau, Michel Pucéat

WT

shp63

shp63-GATA

Cardiac rescue by ectopic GATA6%

bea

ting

/EB

s

day of differentiation7 8 9 10

shp63

shp63 + GATA6

WT ES cells

(Yang, Nature 1999; Mills, Nature 1999)

p63 KO mice ?

Matthieu Rouleau, Alain Medawar

wild type newborn heart tissue p63-/- newborn heart tissue

M

M

Myofibrillar fragmentation and disorganization. Mitochondria were randomly distributed, large and swollen

Intracellular Ca2+ transient in embryonic hearts (E10.5)

Fluo

-4 fl

uore

scen

ce F

-F0/

F0

-505

101520

2min

wild type

p63 -/-

-202468

2minMichel Puceat (Evry)

Could p63-related ED patients suffer from unexpected heart defect?

TAp63

From H. Van BOKHOVENFrom H. Van BOKHOVEN

∆Np63

Patient 1 with a systolic murmurPatient 3 with an atrial septal defect

Rinne T. et al. (2008) Human Mol Genet. 17: 1968-77:

Pluripotent state

Primitive streak

(mesendoderm)

Mesoderm

Cardiac mesoderm

Anteriorsplanchnic mesoderm

Pharyangeal mesoderm

Left ventricleAtrial

Right ventricleOFT

Tbx5

Islet1 Tbx1

Nkx2.5Mef2c

Brachyury, Fgf8

Sox-17

Mesp-1

Cardiac

crescentFirst Heart Field

Second Heart Field

The cardiac developmental pathways

Endoderm

Sox-17, activin-A, GATA4/6Wnt,...?

TAp63

Pluripotent state

Primitive streak

(mesendoderm)

Mesoderm

Cardiac mesoderm

Anteriorsplanchnic mesoderm

Pharyangeal mesoderm

Left ventricleAtrial

Right ventricleOFT

Tbx5

Islet1 Tbx1

Nkx2.5Mef2c

Brachyury, Fgf8

Sox-17

Mesp-1

Cardiac

crescentFirst Heart Field

Second Heart Field

The cardiac developmental pathways

Endoderm

Sox-17, activin-A, GATA4/6Wnt,...?

TAp63