atelier 17 transfert non viral de gènes dans les cellules...
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Atelier 17
Transfert non viral de gènes dans les cellules en culture :
Revue des technologies d’électroporation et perspectives de transfection
de cellules en osmolarité extrême
Plate-forme Biogenouest IBiSA « SynNanoVect »
Pascal LOYER, Inserm UMR991, Hôpital Pontchaillou, Rennes
- Solutions for gene and drug delivery -
Rennes
Inserm U1078 (T. Montier) Responsable
UMR CNRS 6521 (P-A. Jaffres)
UMR CNRS 6226 (T. Benvegnu) ENSCR
Inserm UMR991 (P. Loyer)
2 villes et 4 laboratoires :
Brest
Plate-forme « Production de vecteurs de synthèse
et vectorisation de bio-molécules »
Vectorisation : technologies/vecteurs permettant d'améliorer l'efficacité d'un principe actif en augmentant sa biodisponibilité. Principes actifs : molécules bioactives incluant médicaments, acides nucléiques (ADN, siRNA), protéines, etc... Vecteur : structure macromoléculaire capable de véhiculer le principe actif en modifiant sa distribution tissulaire, sa biodisponibilité et/ou ses interactions avec des cellules cibles. Biodisponibilité (propriété pharmacocinétique) des principes actifs : fraction d’un principe actif qui : 1) atteint la circulation sanguine et qui est potentiellement active sur l’organe cible (in vivo), 2) pénètre dans les cellules en culture. Ciblage : l’adressage « spécifique » d’un principe actif vers un organe choisi par une vectorisation présentant un tropisme pour cet organe.
Plate-forme « Production de vecteurs de synthèse
et vectorisation de bio-molécules »
Génération
Encapsulation +
Furtivité +
Ciblage cellulaire
1ère
2ème
Encapsulation
Encapsulation + Furtivité In
dex t
héra
peutique
Principes actifs - acides nucléiques - médicaments
3ème
actuelle
La Vectorisation et nanovecteurs
Liposomes nanoparticules nanocapsules Virus
, etc.
Offre de prestations et de services :
Production de vecteurs de synthèse (lipides cationiques et neutres)
Formulation et caractérisation physico-chimique de nanoparticules
Vectorisation/Transfection d’acides nucléiques et de peptides
(lipofection, électroporation) et imagerie in vitro et in vivo
Recherche & Développement :
Nouveaux vecteurs de synthèse (lipides et polymères) pour la
vectorisation d’acides nucléiques, peptides et de xénobiotiques
Vectorisations optimisées in vitro et in vivo (cellules normales et
transformées) et ciblage cellulaire/tissulaire
CONTACT : www.synnanovect.ueb.eu
Responsable de la plateforme : [email protected]
Les prestations :
Synthèse de vecteurs de synthèse (lipides et polymères cationiques et neutres)
Structure moléculaire du vecteur
Formulation Ciblage
Efficacité du
vecteur
Conception et synthèse
de lipides cationiques et neutres
Caractérisations des
Propriétés physico-chimiques
Passif: caractéristiques physico-chimiques
Actif : Interactions ligands-récepteurs
Caractérisation des propriétés physico-chimiques
SAXS
TEM
(cryofracture) HPTLC
Size distribution(s)
5 10 50 100 500 1000 5000Diameter (nm)
10
20
% in
cla
ss
DLS - Zétamétrie
MOP
Les prestations :
Formulation et caractérisation de nanovecteurs
Vecteurs Applications Molécules délivrées Références
GLB-73 In vitro
(A549, Hela, 16HBE, CFBE41o-, Hep G2…)
In vivo (Intra Veineuse)
pDNA Guillaume-Gable C. et coll,
Hum Gene Ther. 1998
Floch V. et coll
Biochim Biophys Acta. 2000
KLN-5
In vitro
(K562, Daudi, Jurkatt)
Ex vivo
(Cellules dendritiques, Cellules
hématopoïétiques CD34+)
pDNA Montier T. et coll,
Biochim Biophys Acta. 2004
Le Gallo M. et coll,
J Gene Med. 2008
KLN-47
In vitro
(A549, Hela, 16HBE, CFBE41o-, SK-Mel28,
A375, Hepa RG, Hep G2…)
Ex vivo
(cellules épithéliales humaines, hépatocytes
humains…)
In vivo (Intra Veineuse)
pDNA
GCV (> 100kb)
siRNA
Montier T. et coll,
Mol Biotechnol. 2004
Picquet E. et coll,
Bioconjug Chem. 2005
Laurent V. et coll.
Biotechnology J. 2010
Delépine P. et coll,
En préparation
BSV-4 (EP8e)
In vitro
(A549, Hela, 16HBE, CFBE41o-, SK-Mel28,
A375, Hepa RG, Hep G2…)
In vivo (Intra Veineuse)
pDNA
siRNA
Picquet E. et coll,
Bioconjug Chem. 2005
Le Gall T. et coll,
J. Med Chem 2010
Laurent V. et coll
Biotechnology J 2010
MM18-DOPE
In vitro
(A549, Hela, 16HBE, CFBE41o-, SK-Mel28,
A375, Hepa RG, Hep G2…)
pDNA
siRNA
Réthoré G. et coll,
Chem Commun 2007
Laurent V. et coll, Biotech J 2010
Nos vecteurs lipidiques pour la transfection :
www.synnanovect.ueb.eu
P
O
NH
As
I
O
O
KLN 47 Lipophosphoramidate AS
(Floch, Loisel et al. 2000; Guenin, Herve et al. 2000)
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NT 0.5 1 2 4 8 16
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2000
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Via
bility
(%
)
Nos vecteurs lipidiques pour la transfection : KLN47
Cellules HepaRG
Cellules HepaRG : rhodamine-siARN
Les prestations :
Vectorisation et imagerie in vivo (Inserm U1085, Brest) associées à
l’évaluation de paramètres cellulaires et biochimiques (robot d’analyse du sang et
plasma : énumération cellulaire, enzymes hépatiques, ionogrammes)
L’électroporation (Inserm UMR991, Rennes)
Méthode d'introduction de molécules bioactives dans des cellules par l’application d’un
champ électrique de haut voltage pendant quelques millisecondes sur les cellules vivantes
(en suspension). Les membranes cellulaires sont transitoirement « déstabilisées » et les
molécules à vectoriser, présentes dans l'espace extracellulaire, pénètrent par diffusion et
sous l’effet du champ électrique dans les cellules (ex: ADN chargé négativement)
. Voltage : > 1000 volts
. Temps : 10 à 40 millisecondes
. 1 à 3 pulses
. Tampons de resuspension cellulaire pré-définis
Les prestations :
L’électroporation :
La seule méthode non virale de transfert de gènes permettant une
expression significative d’un vecteur d’expression dans des cellules peu ou pas
proliférantes (primaires)
HepaRG progénitrices: Cellules proliférantes
HepaRG différenciées « Hepatocyte-like Cells » :
Cellules quiescent es
Cellules HepaRG progénitrices (proliférantes) ou différenciées (quiescentes) : lipofection KLN47
0
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EP BSV10/DOPE R1 GLB43/DOPE R1 MM18/Chol R2
GF
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%)
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2
4
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14
Flu
ore
sce
nce
ra
tio
V. Laurent, A. Fraix, T. Montier, S. Cammas-Marion, C. Ribault, T. Benvengu, PA. Jaffres, P. Loyer. Biotechnol J, 2010, 5, 314-320.
Contraste plasmide protéine GFP
EP
Liposome
Lipofection vs Electroporation
ADN
Noyau
Endocytose
Sortie des
endosomes
Import
nucléaire
Lipoplexe
Liposome-ligand ADN
Noyau
Endocytose
Sortie des
endosomes
Import
nucléaire
Lipoplexe
Liposome-ligand
L’électroporation :
Transfert d’ADN « nu » versus l’encapsulation pour la lipofection/polyfection
L’électroporation :
Inserm UMR991 : deux technologies d’électroporation
. Système « microporator MP100 » (Digital Bio, LabTech France , 2007)
Disponible sous le nom de système Neon™ (Invitrogen/Life Sciences)
Transfection de cellules HepaRG progénitrices ou différenciées par électroporation (24 tests 0,5 µg pEGFP pour 105 cellules)
0
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15 4 5 3 23 9 16 22 8 2 19 12 20 14 24 7 21 11 6 18 13 10 17 NT
GF
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Via
bility
(%
)
Electroporation (Microporator MP100) :
0
10
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100
5 4 9 3 15 8 12 14 16 20 2 13 7 11 19 17 24 21 6 22 18 10 23 NT
GF
P p
ositiv
e c
ells
(%
)
0
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Via
bili
ty (
%)
V. Laurent, A. Fraix, T. Montier, S. Cammas-Marion, C. Ribault, T. Benvengu, PA. Jaffres, P. Loyer. Biotechnol J, 2010, 5, 314-320. J. Dumont, R. Jossé, C. Lambert, S. Anthérieu, V. Laurent, P. Loyer, MA Robin, A. Guillouzo. Toxicol Appl Pharmacol., 2010, 249, 91-100.
Nucleofector II: « Amaxa System » (2002)
L’électroporation :
Système « 4D-Nucleofector™» (Amaxa/Lonza, 2011)
Core unit
X unit
Y unit
96-well Shuttle
HT-Nucleofector™
384-well plate nucleofector device
V. Laurent, Glaise D, Nübel T, Gilot D, Corlu A, Loyer P. Methods In Mol Biol, 2012, sous presse.
L’électroporation :
Système « 4D-Nucleofector» (Amaxa/Lonza, 2011)
X unit: 2 options Cuvette strip (20 l, 105 cells or « regular » cuvette (100 l, 106 cells)
96-well plate Shuttle Cuvette strip (20 l, 105 cells)
Analyses In situ Analyses ARN-Protéines Criblages banques siARNs (« in situ reading out »)
V
+ -
Phase contrast HepaRG cells GFP
Program ED142
L’électroporation :
Système « 4D-Nucleofector» (Amaxa/Lonza, 2011)
Y unit: For adherent cells Cells cultured in regular 24-well plates and electroporation performed using « dipping electrodes »
R&D de la plate-forme SynNanoVect :
Synthèse de nouveaux vecteurs : Lipides d’Archébactéries (T. Benvegnu, ENSCR)
Diéther Tétraéther
O
OH2N O
OOO O
OHO OH
diester ou diéther
tétraéther
INNOVATION
Halophiles
Marais salants
Thermophiles
Cheminées hydrothermales
LIPOSOME Organisation des lipides en
bicouche
ARCHAEOSOME Organisation des lipides en monocouche
(Brard, Richter et al. 2004; Brard, Laine et al. 2007; Rethore, Montier et al. 2007; (Benvegnu, Rethore et al. 2005; Laine, Mornet et al. 2008; Brevet 2006, ENSCR-CNRS)
R&D : Lipides d’archéobactéries ou archéolipides (T. Benvegnu, ENSCR)
Etudes de stabilité des archaeosomes : relargage de sonde fluorescente
Sonde fluorescente : 4(5)-carboxyfluorescéine
O O
O O O O P
O
O -
M e 3 N + ( C H 2 ) 2 O P
O
O -
O ( C H 2 ) 2 N + M e 3
O
O O
OOHHO
20 % - 95 % pH = 2, t = 10 min
20 % 85 % 95 % pH = 2, t = 5 min
30 % 80 % 70 % lipoprotéines, t = 15h
80 % 30 % 100 % Tensioactif, t = 5s
diPC Diol MB
EPC Conditions
20 %
Diol MB
diPC
1 brevet (2006, co-propriété) avec licence d’exploitation ; Chem. Commun. 2005, (44), 5536-5538.
R&D : Les applications des archaeosomes (T. Benvegnu, ENSCR)
Transfection d’acides nucléiques vers les cellules en osmolarité extrême :
. Cellules d’organismes marins
L’administration par voie orale de liposomes véhiculant des médicaments:
. Ciblage hépatique après absorption intestinale
. Nanoparticules plus petites, plus furtives que les liposomes . biocompatibles et (bio)dégradables capables de s’auto-assembler en architectures macromoléculaires originales . Structures « cargo » pour des médicaments . Groupements latéraux permettant le greffage d’agents de ciblage (peptides hépatotropes) Z.W. Huang, V. Laurent, G. Chetouani, T. Benvegnu, P. Loyer, S. Cammas-Marion, Int. J .Pharm. 2012, 423, 84-92
Nanocapsule Nanosphère
R&D :
Synthèse et évaluation de mono- et copolymères de polyesters/polycarbonates
(S. Cammas-Marion, ENSCR)
. PMLA : poly(acide malique)
Procédure pour accéder aux services :
Prendre contact avec un responsable de site (www.synnanovect.ueb.eu)
Définir le projet – étudier la faisabilité (rédaction d’une fiche projet)
Etablir un devis
Réalisation du projet – cas du prêt de matériel (électroporation):
. Formation d’une ou plusieurs personnes, autonomie d’utilisation avec suivi de consommation (réactifs)
Clôture du projet – rendu de résultats
Facturation
Fiche de satisfaction
Comité de pilotage, de gauche à droite : Thierry Benvegnu, Pascal Loyer, Tristan Montier (Directeur de la plateforme), Paul-Alain Jaffrès
Inserm U1078 (T.Montier, MCU, Directeur) . Nathalie Carmoy (IE) . Tony Le Gall (IR) . Yann Sibrill (AI) . Caroline Denis (TR) . Véronique Laurent (CM)
UMR CNRS6521 (PA.Jaffres, PU) . Hélène Couthon-Gourvès (MCU)
UMR CNRS6226, ENSCR (T.Benvegnu, PU) . Jean-Paul Guegan (AI) . Sandrine Cammas-Marion (CR) . Loïc Lemiègre (MCU) . Jelena Jeftic (PU) . Thomas Vives (AI)
Inserm UMR991 (P.Loyer, CR) . Catherine Ribault (TRE) . Véronique Laurent (CM)