tp master 1 transfection. la transfection des cellules eucaryotes définition et principe transfert...
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TP master 1Transfection
La transfection des cellules eucaryotes
Définition et Principe
Transfert de gènes (ADNc) codant pour une protéine dans une cellule
= protéine exogèneTransfection Infection (méthode virale)
Surexpression de cette protéine grâce à la machinerie cellulaire (transcription/traduction)
ribosomes
ARN
protéineexogène
ADN
(2) Etude in situ
(1) Etude à partir de lysat protéique
(activité enzymatique)
Une cellule eucaryote
Techniques
Réactifs chimiques- Calcium phosphate
- DEAE-dextran
- Liposomes artificiels
Méthodes physiques- Microinjection directe (dans la cellule ou le noyau) :
animaux transgéniques
- Electroporation (perturbation de la membrane par un choc électrique)
- Propulsion de microprojectiles contenant de l’ADN (in vivo) :
plantes
Utilisation de particules virales- Rétrovirus
- Adénovirus
- Particules virales non infectieuses
Réactifs chimiques
DEAE-dextran
1965 par Vaheri et Pagano
Technique classique, in vitro
DEAE-dextran = polymère cationique
Association avec les acides nucléiques chargés négativement
Endocytose cytoplasme noyau
Réactifs chimiques
Calcium phosphate
1973 par Graham et van der Eb
Technique classique et bon marché, in vitro
Mise en contact de l’ADN avec du chlorure de calcium dans un tampon phosphate
Formation d’un précipité entre le calcium et l’ADN
Précipité dans la cellule par endocytose ou phagocytose
Réactifs chimiques
Liposomes artificiels
1980 par Fraley et co.
Efficacité de transfection , fragments d’ADN , types cellulaires , in vitro et in vivo
Liposomes = lipides cationiques (+ lipides neutres)
Réaction avec les acides nucléiques chargés négativement
Compaction de l’ADN = complexe liposomes-ADN
Endocytose cytoplasme noyau
Applications (in vitro)
1. Surexpression de protéines absentes dans un type cellulaire donné :
2. Modifier un gène existant / inhiber l’expression d’un gène existant
Promoteur du vecteur ADNc codant pour la protéine1.1. - sa fonction
- sa localisation in situ
- son interaction avec d’autres protéines de la cellule ou une autre
protéine transfectée (co-transfection avec 2 plasmides)
1.2. - Etude de l’activité d’un promoteur et sa régulation in situ
1.3. - Elaborer une lignée cellulaire immortelle
protéine exogène = Antigène T du virus SV40
- …
Promoteur à étudier Gène rapporteur
Promoteur du vecteur ADNc codant pour l’Ag T
Surexpression de protéines : Mise en évidence
• Transfection d’un ADNc codant pour une protéine non modifiée
- Détection par immunocytochimie ou par Western blot
• Transfection d’une construction possédant l’ADNc d’intérêt et une étiquette (« tag »)
= Protéine de fusion
- GFP (Green Fluorescent Protein)- HA, flag, c-myc … (anticorps)
ADNc tag
protéinede fusion
ribosomes
ARN
protéineexogène
ADN
Etude in situ
Etude de l’activité d’un promoteur : Mise en évidence
promoteur gène rapporteur galactosidase
• Effet de facteurs endogènes (facteurs de transcription)
• Effet de facteurs exogènes sur l’activité du promoteur
- facteurs de croissance ajoutés dans le milieu de culture
- transfection avec une 2ème construction codant pour une protéine pouvant réguler le promoteur étudié = co-transfection
-galactosidase (spectrophotomètre) Luciférase (luminescence)
ribosomes
ARN
protéineexogène
ADN
in situ galactosidase
lysat protéique
activité enzymatique galactosidase
Mesure quantitative
Préparation de l’ADN à transfecter
• Réalisation de constructions plasmidiques : vecteur + ADNc/promoteur-gène rapporteur
• ETUDE catégorie de vecteurs à utiliser
Vecteur commum d’expression
Plasmide GFPtag Plasmide activité promotrice
Vecteur commum d’expression
Promega
Plasmide GFPtag ou étiquette GFP
Promega
Plasmide permettant d’étudier l’activité d’un site spécifique d’un promoteur
Clontech
Transfection transitoire
- Analyse de la transfection à 24-72 h
-Perte du plasmide en quelques jours
Transfection stable
-Transfection à long terme
- L’ADN est généralement intégré au niveau chromosomique
- Isolation des clones cellulaires par dilutions limites (clonage cellulaire)
-Criblage par résistance à un antibiotique des clones possédant l’ADN transfecté (néomycine, hygromycine, …)
- 3-4 semaines
Deux approches
Travaux pratiques de Master BCPP
BUT : Transfecter des cellules COS avec des constructions plasmidiques contenant différents ADNc
Technique des liposomes
Plasmide 1 Plasmide 2 Plasmide 3
Protéine X-GFP Protéine Z-HA galactosidase
Fluorescence directe ImmunocytofluorescenceRéaction enzymatique
colorimétrique
Plasmide 1
Protéine X-GFP
Fluorescence directe (vert)
ADN
*X-GFP
ADN
Z-HA
Plasmide 2
Protéine Z-HA
Immunocytofluorescence
Immunocytofluorescence
(1) Anticorps de souris anti-protéine HA (anticorps primaire)
(1)(2)
*
(2) Anticorps de chèvre anti-IgG de souris
conjugué à la rhodamine (TRITC)
(anticorps secondaire)
*
Plasmide 3
Galactosidase
Réaction enzymatiquecolorimétrique
(cellules bleues)
Avantages
(1) Mise en évidence facile et rapide
(2) Mesure quantitative (in situ) :
nombre de cellules bleues / population totale
(3) Mesure qualitative (dosage colorimétrique : Luciférase)
Rôle de ce type de construction
(1) Vérifier que le type cellulaire utilisé peut être transfecté
(2) Mesurer une efficacité de transfectionSubstrat de l’enzyme = X-gal
Plasmide 1 + 2
Protéine Z - HA+
Protéine X - GFP
Localisation de 2 protéinesau niveau d’une même cellule
Besoin de 2 fluorochomes
• Noyaux (PI: iodure de propidium, DAPI, YOYO, …)
• Filaments d’actine, cytosquelette (rhodamine-phalloïdine)
• Marqueurs spécifiques du réticulum endoplasmique
• Marqueurs membranaires
Mise en évidence de la présence d’une cellule
Marqueurs généraux
=
La cellule en entière ou des structures particulières