Transfection CaPO4 101

Dave Bélanger

Théorie

Mécanisme inconnu

Hypothèses:1. Le précipité formé par le CaCl2 et l’ADN est endocytosé par la cellule

et l’ADN est ensuite dirigé vers le noyau (Maniatis Tome 3 p16.32).2. Le CaCl2 s’ionise en solution. Les ions Ca2+ générés déstabilisent

l’équilibre ionique au pourtour de la cellule et ces derniers traversent la membrane par osmose. Les pompes calciques fonctionnent alors à plein régime pour évacuer le Ca2+ intracellulaire. Se faisant, il se pourrait que la cellules soit plus permissives à l’entrée de plasmides(par exemple) soit par endocytose ou directement via la pompe calcique. (http://www.madsci.org/posts/archives/feb2000/950902447.Cb.r.html)

3. Le déséquilibre des ions Ca2+(intra-et extracelulaire) pourrait aussi créer un changement de voltage à la membrane cellulaire, ce qui rendrait la cellule plus perméable. (http://www.madsci.org/posts/archives/feb2000/950902447.Cb.r.html)

Protocole:

1- La veille, ensemencer les 293T (250 000 cellules /puit 6p)(2x106 cellules / T75)

2- Retirer le milieu des cellules et ajouter 2ml/puit 6p 9ml/T75

3- Préparer les mélanges:

1 puit 6p 1 T75

x ul H2O x ul H2O + 12.4 ul CaCl2 62.5 ul CaCl2

6ug ADN 30-40 ug ADN100 ul 500ul

4- Distribuer goutte à goutte le mélange ci-dessus dans un volume égal de HBS 2X (En injectant de l’air dans le HBS avec un pipet-aid ou en vortexant légèrement)

Protocole (suite):

5- Laisser reposer environ 20 minutes à température pièce.

6- Confirmer visuellement l’absence de gros précipité blanc dans le tube. S’il y en a, jeter. Le précipité doit être minuscule.

7- Distribuer goutte à goutte sur les cellules.

8- Incuber à 37C + 5% CO2.

9- Après de 6h à 24h, laver 2 fois au PBS et mettre du milieu frais.

10- Récolter 48h post-transfection

Sources de problème:

Solution (75% du temps)

ADN (20% du temps)

Cellules (5% du temps)

Manipulation (ça arrive…)

Solutions

Solutions:

CaCl2: 2M CaCl2 2 H20 (Fisher lot 016952) 5.88g20 ml

Filtrer 0.22m, aliquoter, garder à 4°C

H20: Prendre la même eau que celle utilisée pour faire les solutionsci-haut, filtrer 0.22m, garder à 4°C

HBS 2X: 280mM NaCl (Fisher) 1.6g10mM KCl (Fisher lot 006245) 0.075g1.5mM NaH2PO4 (MAT lot 2834A) 0.021g12mM Dextrose (Fisher lot 000199A) 0.2g50mM HEPES (JT Baker lot A01650) 1.2g

100 ml

Ajuster pH entre 7.06 et 7.12 avec NaOH (avant et aprèsavoir complété à 100 ml)

Filtrer 0.22um, aliquoter, congeler à -20°C

Solutions (suite):

1. Le pH est le facteur le plus crucial. Avant de l’ajuster, calibrer le pH-mètre

2. avec les 3 solutions étalons et changer le KCl de l’électrode.

3. L’ajustement doit se faire au centième près, de façon précise et exacte.

4. (pH à confirmer)

5. Utiliser toujours les même poudres (vérifier les numéros de lots)

6. Éviter les cycles gel-dégel pour le HBS

7. Expiration des solutions: environ 6 mois à -20°C

ADN

ADN

1. Purification QIAGEN: Le kit de Sigma peut être bon mais semble présenter plus de variabilité.

2. De 3 à 5 ug d’ADN par ml (3ug/ml est amplement suffisant pour Nl4-3wt).

3. Un ADN visqueux est l’indice d’une trop grande concentration. Il est préférable de le diluer et le doser de nouveau pour avoir une distribution uniforme de l’ADN en solution.

4. Éviter de vortexer l’ADN. Up/down avec un embout est préférable.

5. L’analyse sur gel est important afin de déterminer la qualité de l’ADN. (Dégradation, présence de d’ADN génomique, bande inexpliquée…)

ExempleLes trois formes de l’ADN

Analyse sur gel

Dégradé Génomique Parfait

Cellules

Cellules

En culture: Maintenir à une confluence acceptable (Max 80%) Passage maximal à déterminer Ensemencement: En T75, 400 000 cellules par flasque le

vendredi donne un flasque à 60% le lundi.

Lors de la transfection: Entre 25 et 50% de confluence.

6 puits: Ensemencer 250 000 cellules/puit la veille

T-75: Ensemencer 2x106 cellules/flasque la veille

Cellules trop compactées

Cause possible: Mauvais étalage suite à l’ensemencement, combiné à une attente trop longue entre les passages

Cellules ensemencées à trop faible densité

Croissance en 3 dimensions

Cause possible: Mauvais bris des liens inter-cellulaires suite à la trypsination

Surconfluence

Malgré l’apparence d’un 85-90% de confluence, beaucoup de cellules se sontdétachées et flottent: Signe de surconfluence

…

Cause possible: …

Évaluer la confluence

20% 25% 40%

50% 85%

100%

65%

Prêtes à la transfection

Limite inférieure acceptable Limite supérieure acceptable

Manipulations

Manipulations:

1. Vortex et ADN ne font pas bon ménage2. Température des solutions (Température pièce)3. Incubateur à 5% CO24. Mélange Calcium-HBS = 1/10 du volume final (ex 1 ml dans 10 ml

pour T-75)5. Gros précipité:

1. Mélange trop rapide de ADN-CaCl2 et HBS provoque formation rapide du précipité ce qui le rend trop gros et impropre à une transfection efficace.

2. Gros ADN ou trop grande concentration3. pH des solutions

Ça marche aussi…

Transfection le matin, laver 6 heures après.

En 6 puit, transfecter dans 1 ml au lieu de 2ml nécessite moins de réactifs et est aussi efficace.

Chloroquine: Prévient la dégradation de l’ADN par le lysosome Mettre 100 M final pendant la transfection et laver après

3 à 6 heures

Nouveauté:

Cellules 293T dégelé par l’assistant de recherche

Nouvelle boite « Production virale » contient les plasmides

Solutions HBS et CaCl2 fabriquées maison