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THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE PARIS DESCARTES – PARIS V

U.F.R DES SCIENCES PHARMACEUTIQUES ET BIOLOGIQUES

ECOLE DOCTORALE MEDICAMENT TOXICOLOGIE CHIMIE ENVIRONNEMENT

Spécialité Biologie Moléculaire

Présentée par

Sabine LECOSNIER

Pour obtenir le grade de Docteur de l’Université Paris V

Arrêt de l’élongation de la traduction

d’IGF-1R par blocage stérique

dans les cellules

Thèse dirigée par le Pr. Tula Saison-Behmoaras

Soutenue le 3 décembre 2010 devant le jury composé de :

Dr. Gilles Mirambeau Université de Barcelone Rapporteur

Dr. Jean-Jacques Toulmé INSERM, Bordeaux Rapporteur

Pr. Frédéric Dardel Université Descartes, Paris V Examinateur

Pr. Ramon Eritja Université de Barcelone Examinateur

Pr. Tula Saison-Behmoaras Muséum National d’Histoire

Naturelle, Paris

Directrice de thèse

Remerciements

Je tiens vivement à remercier les Docteurs Gilles Mirambeau et Jean-Jacques Toulmé

d’avoir accepté d’être rapporteurs de cette thèse. Je remercie également les Professeurs Frédéric

Dardel et Ramon Eritja d’avoir accepté d’être membres du jury et de s’intéresser à ce travail.

Je remercie le Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche d’avoir financé mon

doctorat et l’Ecole Doctorale Médicament Toxicologie Chimie Environnement de m’avoir permis de

passer le concours.

Je remercie le Docteur Carine Giovannangeli de m’avoir accueillie dans son unité et son

équipe. Le Professeur Tula Saison-Behmoaras a dirigé et encadré ce travail de thèse. Je te remercie

chaleureusement pour ton soutien et tes conseils, pour ton enthousiasme et ta bonne humeur, et pour

la confiance que tu m’as accordée pendant ce doctorat. Je remercie aussi sincèrement le Docteur

Jean-Christophe François de m’avoir guidée en début de thèse et souvent conseillée par la suite.

J’ai reçu l’aide précieuse de plusieurs personnes pendant ces trois années. Céline Cordier et

Karen Haug m’ont assistée sur ce sujet pendant leurs stages de licence. Je remercie tout

particulièrement Céline, brillante étudiante, qui a réalisé un très bon travail, et avec qui il est très

agréable de faire équipe. Je remercie le Docteur Philippe Simon pour avoir synthétisé plusieurs

molécules pour ce sujet, et pour nos discussions scientifiques. Je suis reconnaissante également envers

Loïc Perrouault pour m’avoir enseigné plusieurs de ses techniques et d’avoir toujours été disponible

pour mes questions.

Un grand merci à tous les gens qui ont séjournés dans ce laboratoire. Une pensée plus

particulière pour:

- Alexandre Ceccaldi pour son humour et sa bonne humeur communicative

- Bernard Tarrou qui a réparé à maintes reprises mes bêtises

- Catherine Sénamaud-Beaufort toujours disponible pour réfléchir avec moi à mes problèmes

expérimentaux ou pour rigoler

- Céline Cordier à qui je souhaite un très bon doctorat, j’espère que tu trouveras cette fameuse

protéine tronquée ou un CPP révolutionnaire

- Christine Champion toujours si agréable et souriante, et que je soupçonne de dormir au labo

- Géraldine Toutirais pour m’avoir initié au LEICA, même si cette machine m’impressionne toujours

autant, mais une pensée aussi bien sûr parce qu’on aura bien ri pendant ces pots

- Gildas Mouta Cardoso qui m’a appris à faire les gels 1D et 2D, à quand les 3D ?

- Kahina Oussédik pour son accueil chaleureux à mon arrivée

- Loïc Perrouault pour ses récits de voyage autour des bonnes cerises de son jardin

- le Lundi gastronomique : merci aux bons pâtissiers du laboratoire

- Patrizia Alberti pour sa bonne humeur et ses conseils sur les analyses spectroscopiques

- le Secrétariat : Cathy, Fara et Patricia, merci pour votre gentillesse et votre aide

- Tiphanie Durfort si sympathique et qui m’a appris à faire les fameuses Western Blot (je ne veux

surtout pas savoir combien j’ai pu en faire)

- Xavier Benigni, d’une part pour ton aide pour l’algorithme de m-fold qui m’aura fait gagner du

temps (ou éviter d’en perdre puisque malheureusement cela n’a rien donné), et d’autre part pour

avoir résolu les petits problèmes informatiques de la noob que je suis

J’ai eu la chance de croiser encore pleins d’autres personnes intéressantes. Je leur souhaite

une bonne continuation. Je pense par exemple à Abdel, Anne-Laure, Céline Moison, Chantal,

Delphine, Elodie, Hélène, Lionel, Loïc Ponger, Paola, Samaher, Sébastien…

J’aimerais aussi remercier Nathalie Nélis, mentor du module Nouveau Chapitre de thèse, qui

m’a aidée à valoriser cette expérience.

Je dédicace ma thèse à mes amis qui m’écoutent, me font rire et rendent ma vie si agréable.

Aux amies de toujours : Sabine, Yas mon cupidon, ma grande sœur Lolie. A mon Chat qui me fait voir

la vie en rose. Aux Gens Biens avec qui je passe de si bonnes soirées, et en particuliers à Jermo qui a

hâte de lire ma thèse.

Je dois aussi évidemment beaucoup à ma famille qui m’a soutenue pendant toutes mes études

et a tant confiance en moi. Je pense plus particulièrement à Mamie et Maman toujours présentes

quand j’ai besoin d’elles. A Papa et à Joël.

5

Table des matières

TABLE DES MATIERES ....................................................................................................................................... 5

TABLE DES ILLUSTRATIONS ............................................................................................................................... 8

INTRODUCTION GENERALE ............................................................................................................................ 11

A. ACIDES NUCLEIQUES ET ANALOGUES THERAPEUTIQUES ........................................................................................ 13

I. Régulation de l'expression des gènes ................................................................................................. 13 1) Régulation génique naturelle .......................................................................................................................... 13 2) Régulation génique artificielle ....................................................................................................................... 14

II. Dégradation de l’ARN messager ........................................................................................................ 19 1) Par la ribonucléase H ..................................................................................................................................... 19 2) Par le complexe RISC .................................................................................................................................... 20 3) Ribozyme ....................................................................................................................................................... 21 4) Problèmes de spécificité ................................................................................................................................. 22

III. Blocage stérique ................................................................................................................................. 26 1) Stratégie antigène ........................................................................................................................................... 26 2) Correction de l’épissage ................................................................................................................................. 30 3) Inhibition de l'initiation de la traduction ........................................................................................................ 33 4) Arrêt de l’élongation de la traduction............................................................................................................. 34 5) Inhibition d’activité enzymatique................................................................................................................... 37 6) Aptamère ........................................................................................................................................................ 38

B. LE RECEPTEUR A L'INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR 1 ............................................................................................ 40

I. La voie de signalisation IGF ................................................................................................................ 40

II. Fonctions physiologiques d’IGF-1R ..................................................................................................... 42 1) Protéine de survie ........................................................................................................................................... 42 2) Protéine de prolifération et de développement ............................................................................................... 42 3) Protéine de différenciation ............................................................................................................................. 43

III. Structure et biosynthèse du récepteur ............................................................................................... 43

IV. Voies de signalisation ......................................................................................................................... 45 1) La voie de signalisation PI3K/AKT ............................................................................................................... 45 2) La voie de signalisation Ras/MAPK .............................................................................................................. 45 3) Translocation mitochondriale de Raf-1 .......................................................................................................... 46

V. Rôle d’IGF-1R dans le cancer .............................................................................................................. 46 1) Surexpression du récepteur ............................................................................................................................ 46 2) Rôle dans la transformation ........................................................................................................................... 47 3) Rôle dans la métastase ................................................................................................................................... 47 4) IGF-1R dans le cancer de la prostate.............................................................................................................. 48 5) IGF-1R: une bonne cible thérapeutique? ........................................................................................................ 49

VI. Stratégies d’inhibition de l’activité d’IGF-1R ...................................................................................... 50 1) Anticorps ........................................................................................................................................................ 50 2) Inhibiteurs de tyrosine kinase ......................................................................................................................... 53 3) Oligonucléotides thérapeutiques .................................................................................................................... 54 4) Dominants négatifs ........................................................................................................................................ 57

OBJECTIFS DE LA THESE .................................................................................................................................. 60

I. Contexte ............................................................................................................................................. 60

II. Objectifs ............................................................................................................................................. 61

III. Plan d’action ...................................................................................................................................... 61

6

RESULTATS ..................................................................................................................................................... 63

A. ARRET DE L’ELONGATION DE LA TRADUCTION D’IGF-1R DANS UN SYSTEME ACELLULAIRE ........................................... 65

I. Séquences des PNA ............................................................................................................................ 66 1) Choix des PNA .............................................................................................................................................. 66 2) Unicité sur le transcriptome ........................................................................................................................... 68 3) Interactions intramoléculaires ou intermoléculaires ....................................................................................... 69

II. Criblage par traduction in vitro .......................................................................................................... 70 1) Méthode de criblage ....................................................................................................................................... 70 2) Une protéine tronquée avec le PNA 959 ........................................................................................................ 71 3) Des inhibitions de la traduction non spécifiques ............................................................................................ 73 4) Conclusion ..................................................................................................................................................... 76

III. Etudes thermodynamiques ................................................................................................................ 77 1) Analyses spectroscopiques ............................................................................................................................. 77 2) Gels retards .................................................................................................................................................... 80 3) Gels dénaturants ............................................................................................................................................. 81 4) Conclusion ..................................................................................................................................................... 86

IV. Etudes complémentaires .................................................................................................................... 87 1) La séquence T4CT4 ........................................................................................................................................ 87 2) Etude d’autres bloqueurs stériques ................................................................................................................. 90 3) Impact de la structure de l’ARNm ................................................................................................................. 93

V. Conclusion .......................................................................................................................................... 96

B. INHIBITION D’IGF-1R DANS LES CELLULES ......................................................................................................... 97

I. Transfection transitoire d’IGF1R-Rluc ................................................................................................ 97 1) Description de l’expérience............................................................................................................................ 97 2) Résultats ......................................................................................................................................................... 98

II. Inhibition d’IGF-1R endogène ............................................................................................................. 99 1) Choix de la lignée cellulaire ........................................................................................................................... 99 2) Inhibition de l’expression de la protéine fonctionnelle .................................................................................. 99 3) Etudes complémentaires .............................................................................................................................. 105 4) Conclusion ................................................................................................................................................... 108

III. Mécanisme d’action ......................................................................................................................... 109 1) Pas de protéine tronquée détectée ................................................................................................................ 109 2) Une inhibition au niveau traductionnelle ..................................................................................................... 112 3) Conclusion ................................................................................................................................................... 113

IV. Effets biologiques ............................................................................................................................. 115 1) Inhibition des voies de signalisation ............................................................................................................ 115 2) Effets sur la prolifération cellulaire .............................................................................................................. 116 3) Effets sur la transformation .......................................................................................................................... 118

DISCUSSION, CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ............................................................................................. 121

I. Un arrêt de l’élongation de la traduction? ....................................................................................... 123 1) Une inhibition au niveau traductionnel ........................................................................................................ 123 2) Pas de dégradation de l’ARNm .................................................................................................................... 123 3) Détecter une protéine tronquée .................................................................................................................... 125 4) Etude mécanistique ...................................................................................................................................... 126

II. Un ciblage plus large ........................................................................................................................ 127 1) Du triplex canonique au triplex partiel ......................................................................................................... 127 2) Prédire un triplex partiel suffisamment stable .............................................................................................. 127 3) D’autres structures possibles ? ..................................................................................................................... 128

III. Forces et faiblesses de la stratégie ................................................................................................... 129 1) Comparaison avec les anticorps et TKI ........................................................................................................ 129 2) Comparaison avec les siRNA et phosphorothioates ..................................................................................... 129 3) Spécificité de la stratégie ............................................................................................................................. 130 4) Mauvaise biodistribution .............................................................................................................................. 131

IV. Conclusion ........................................................................................................................................ 134

7

1) Une nouvelle approche antisens dans les cellules ........................................................................................ 134 2) Inhibition d’IGF-1R et ses effets biologiques .............................................................................................. 135

MATERIELS ET METHODES............................................................................................................................ 137

I. Oligonucléotides ............................................................................................................................... 139 1) Synthèse des PNA au laboratoire ................................................................................................................. 140 2) Calcul des concentrations ............................................................................................................................. 140 3) siRNA .......................................................................................................................................................... 141

II. Transcription et traduction in vitro .................................................................................................. 141 1) Construction des plasmides .......................................................................................................................... 141 2) Transcription in vitro ................................................................................................................................... 142 3) Traduction in vitro ....................................................................................................................................... 142

III. Expériences de dénaturation thermique .......................................................................................... 143 1) Principe ........................................................................................................................................................ 143 2) Matériel ........................................................................................................................................................ 144 3) Préparation de l’échantillon ......................................................................................................................... 144 4) Procédure ..................................................................................................................................................... 144 5) Analyse ........................................................................................................................................................ 144

IV. Gels retards et gels dénaturants ...................................................................................................... 145 1) Radiomarquage des ARN ............................................................................................................................. 145 2) Formation des complexes ............................................................................................................................. 145 3) Gel natif ....................................................................................................................................................... 145 4) Gel dénaturant .............................................................................................................................................. 145 5) Détection radioactive ................................................................................................................................... 146

V. Transfection de cellules .................................................................................................................... 146 1) Culture des cellules ...................................................................................................................................... 146 2) Transfections de cellules .............................................................................................................................. 146 3) Optimisation................................................................................................................................................. 148

VI. Mesure de signaux luciférases ......................................................................................................... 148 1) Matériel ........................................................................................................................................................ 148 2) Optimisation................................................................................................................................................. 149 3) Procédure ..................................................................................................................................................... 149

VII. Purification, quantification et révélation de protéines .................................................................... 149 1) Extraction des protéines ............................................................................................................................... 149 2) Mesure de la concentration en protéines ...................................................................................................... 150 3) Western Blot ................................................................................................................................................ 150 4) Immunoprécipitation .................................................................................................................................... 151

VIII. RT-PCR quantitative ......................................................................................................................... 152 1) Principe ........................................................................................................................................................ 152 2) Extraction des ARN avec traitement à la DNase I ....................................................................................... 152 3) Transcription inverse.................................................................................................................................... 152 4) Amplification des ADNc par qPCR ............................................................................................................. 153

IX. Test de prolifération cellulaire ......................................................................................................... 155 1) Principe ........................................................................................................................................................ 155 2) Procédure ..................................................................................................................................................... 155

X. Tests clonogéniques ......................................................................................................................... 155 1) Principe ........................................................................................................................................................ 155 2) Procédure ..................................................................................................................................................... 156

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................................................................. 157

8

Table des illustrations

Figure 1 : Analogues d'acides nucléiques. ............................................................................................................. 16 Figure 2: Schéma d'un oligodésoxyribo-nucléotide et d'un oligomère de PNA ..................................................... 17 Figure 3 : Régulation génique artificielle. .............................................................................................................. 18 Figure 4 : Mécanisme d'action de la RNase H ....................................................................................................... 24 Figure 5 : Schéma de la dégradation d'un ARNm par un ribozyme. ...................................................................... 24 Figure 6 : Schéma d'un gapmère. .......................................................................................................................... 24 Figure 7 : Le mécanisme d'interférence ARN. ........................................................................................................ 25 Figure 8: Liaisons Hoogsteen ................................................................................................................................. 27 Figure 9 : Schéma des complexes entre ADN double brin et oligonucléotides. ..................................................... 29 Figure 10 : Correction et modulation de l'épissage ............................................................................................... 32 Figure 11: Schéma de l'arrêt de l'élongation de la traduction par un bloqueur stérique. ..................................... 34 Figure 12: Schéma des triplets PNA:ARN:PNA ...................................................................................................... 36 Figure 13 : La voie de signalisation IGF. ................................................................................................................ 41 Figure 14 : Schéma de la structure d'IGF-1R. ........................................................................................................ 44 Figure 15 : Stratégies d’inhibition de la signalisation d’IGF-1R. ............................................................................ 51 Figure 16: Schéma de dominants négatifs d’IGF-1R.............................................................................................. 58 Figure 17: L'agent thérapeutique et sa cible IGF-1R ............................................................................................. 67 Figure 18: Traductions in vitro d'IGF-1R en présence de PNA 959 ........................................................................ 71 Figure 19: Traductions in vitro en présence de PNA .............................................................................................. 72 Figure 20: Tests de spécificité ................................................................................................................................ 74 Figure 21: Courbes d'inhibition de la traduction ................................................................................................... 75 Figure 22: Liaisons Hoogsteen possibles entre un PNA et un duplex ARN:PNA..................................................... 76 Figure 23: Courbes d’association et de dissociation des complexes PNA:ARN ...................................................... 79 Figure 24: Gels retards des complexes PNA:ARN .................................................................................................. 82 Figure 25: Influence du pH sur la formation des complexes 692 et 959 ................................................................ 83 Figure 26: Structures possibles formées par la séquence 692 à pH acide ............................................................. 84 Figure 27: Gels dénaturants .................................................................................................................................. 85 Figure 28: Courbes d’association et de dissociation du PNA 330 .......................................................................... 88 Figure 29: Gels retard et dénaturant du PNA 330 ................................................................................................. 88 Figure 30: Traduction en présence du PNA 330 .................................................................................................... 89 Figure 31: Analyses spectroscopiques du PMO et du LNA 959 .............................................................................. 91 Figure 32: Gels retards du PMO 959 et du LNA 959 .............................................................................................. 91 Figure 33: Traductions in vitro d’IGF-1R avec le PMO 959 et le LNA 959 .............................................................. 92 Figure 34: Influence de la structure de l'ARN sur l’efficacité des PNA ................................................................... 95 Figure 35: Taux d'expression d'IGF1R-Rluc transitoire en fonction de la concentration en PNA .......................... 98 Figure 36: Schéma de la position sur IGF-1R des anticorps utilisés dans les études cellulaires .......................... 100 Figure 37: Western Blots révélant les expressions d'IGF-1R et de l'actine .......................................................... 102 Figure 38: Taux d'expression d'IGF-1R après traitement par les PNA 959 et P1 ................................................. 103 Figure 39: Cinétique d'inhibition d'IGF-1R ........................................................................................................... 103 Figure 40: Taux d'expression d'IGF-1R après traitement avec le PNA 959 et le PNA scramble ........................... 104 Figure 41: Traitements avec les PNA ciblant IGF-1R à 1 µM .............................................................................. 106 Figure 42: Schéma de la structure d'IGF-1R ........................................................................................................ 109 Figure 43 : Tentatives de détection de la protéine tronquée .............................................................................. 110 Figure 44: Inhibition de la chaîne d'IGF-1R ...................................................................................................... 111 Figure 45: Taux d'expression de la protéine IGF-1R et de son ARNm .................................................................. 114 Figure 46: Taux d'expression des ARNm d'IGF-1R après traitement par les PNA 959, N-13 et C-13 ................... 114 Figure 47: Inhibitions de l'activation des voies de signalisation .......................................................................... 115 Figure 48: Effet des oligonucléotides sur la prolifération cellulaire .................................................................... 117 Figure 49: Tailles des colonies formées par les DU145 traitées ou non par le PNA 959 ...................................... 119 Figure 50: La voie Non-Go Decay ........................................................................................................................ 124

9

Figure 51 : La méthode de « Ribosome Density Mapping » ................................................................................ 126 Figure 52 : Structures chimiques de quelques modifications apportées aux PNA ............................................... 133

Tableau 1: Récapitulatifs des PNA arrêtant l'élongation de la traduction ............................................................ 37 Tableau 2: Rôle d'IGF-1R et d'IRS-1 dans la diférenciation ................................................................................... 43 Tableau 3 : Résumé d'études cliniques avec des anticorps dirigés contre IGF-1R ................................................. 52 Tableau 4: Structure des TKI cités ......................................................................................................................... 53 Tableau 5 : Récapitulatif des études inhibant IGF-1R par des stratégies antisens ................................................ 56 Tableau 6: Récapitulatifs des études sur les dominants négatifs d'IGF-1R ........................................................... 59 Tableau 7: Séquences des PNA .............................................................................................................................. 67 Tableau 8 : Résultats des alignements de séquences sur le transcriptome humain ............................................. 68 Tableau 9: Masses des protéines tronquées attendues ........................................................................................ 70 Tableau 10 : Caractéristiques physicochimiques des complexes PNA:ARN ........................................................... 81 Tableau 11: Récapitulatifs des propriétés des PNA 330 et 959, du LNA et du PMO 959 ...................................... 92 Tableau 12: Alignements de séquences sur le transcriptome humain ................................................................ 104 Tableau 13: Effets du LNA 959 et du PMO 959 dans les cellules ......................................................................... 106 Tableau 14 : Séquences des PNA raccourcis ........................................................................................................ 107 Tableau 15: Oligonucléotides utilisés dans ce travail .......................................................................................... 139

Chapitre I :

Introduction générale

A. Acides nucléiques et analogues thérapeutiques

B. Le récepteur à l'Insulin-like Growth Factor 1


Acides nucléiques et analogues thérapeutiques

13

A. Acides nucléiques et analogues

thérapeutiques

I. Régulation de l'expression des gènes

La capacité de réguler l'expression des gènes est d'une importance fondamentale pour la cellule. Elle la

rend capable de répondre aux changements environnementaux et aux signaux de croissance et de

différenciation. La dérégulation de l’expression génique est la cause de nombreuses pathologies. La

possibilité de pouvoir inhiber ou activer sélectivement ces expressions pathologiques ouvre des

perspectives thérapeutiques importantes.

1) Régulation génique naturelle

Contrôler l’expression des gènes nécessite de connaître les mécanismes d’expression de l’information

génétique et les mécanismes de régulation associés. Ces mécanismes sont d'une grande finesse et d'une

grande complexité. Les premières études de régulation génique se sont portées sur les séquences

promotrices de l'ADN et sur l'interaction entre facteurs de transcription et ADN. Par la suite, l'ARN est

apparu non plus comme une simple séquence à traduire mais comme offrant diverses possibilités de

régulation. Par exemple, son épissage alternatif conduit à plusieurs isoformes de protéines et sa

polyadénylation alternative conduit à des taux de traduction variables. De nouvelles voies de

régulation sont découvertes régulièrement. L’épigénétique et les micro ARN (miRNA) qui sont deux

récents sujets d’études viennent s’ajouter aux voies de régulation complexes de l’expression génique.

Ces régulations reposent sur des interactions entre protéines et acides nucléiques (ex : facteur de

transcription sur l'ADN) ou entre acides nucléiques (ex : miRNA et ARN messager). Les premières

sont difficiles à prévoir et à étudier tandis que les propriétés des secondes sont mieux connues et

reposent majoritairement sur des interactions de type Watson-Crick. De plus, les nouvelles techniques

de séquençage et de quantification d’acides nucléiques facilitent beaucoup leur étude.



14

Les génomes de mammifère codent pour de nombreux transcrits antisens naturels, c’est-à-dire des

ARN transcrits à partir du brin antisens. Ils sont fréquemment utilisés par la cellule dans divers

mécanismes de régulation transcriptionnelle et traductionnelle (1), dont:

- la modulation de l’épissage alternatif (ex: THR), de la polyadénylation alternative ou de

la terminaison alternative de transcription.

- l’inhibition de la traduction par des miRNA, régulateurs post-transcriptionnels se liant à

l’ARNm avec une complémentarité partielle.

- l’inhibition de la transcription, telle que dans le cas de l’inactivation du chromosome X

opérée par deux longs transcrits Xist et Tsix. Cette inactivation est requise chez les

mammifères femelles, pour une expression équilibrée des gènes de ce chromosome.

2) Régulation génique artificielle

(a) Première description

En 1978, P. Zamecnik et M. Stephenson ont montré que la réplication du virus du sarcome de Rous

était inhibée par la transfection d’un tridécamère d'ADN complémentaire des extrémités terminales de

l’ARN du virus (2, 3). C’est la première description de régulation artificielle de processus biologique

par l’interaction entre deux acides nucléiques. Le mécanisme d'action était alors inconnu, mais cette

découverte fut suivie de nombreuses autres études. Par exemple, avec un oligodésoxyribonucléotide

(ODN) complémentaire de la séquence de c-myc, l'expression de la protéine induite par des mitogènes

a été inhibée dans des lymphocytes T humains. L'ODN a ainsi empêché leur entrée en phase S (4).

(b) Les oligonucléotides modifiés

Cependant, très vite, on s'est rendu compte de l’inconvénient des oligodésoxyribonucléotides et

oligoribonucléotides: ils sont instables en milieu physiologique. Dans 10% de sérum de veau fœtal, ils

sont dégradés par les nucléases en quelques minutes. Ceci limite leur utilité en tant qu’agents

thérapeutiques. Des analogues ont donc été synthétisés afin d’augmenter leur résistance à la

dégradation par les nucléases. Les bases, les sucres ou le squelette ont été modifiés fournissant ainsi

une large gamme d’analogues aux propriétés différentes. L'affinité, la biodistribution et la toxicité sont

des paramètres variant d’un analogue à l’autre (Figure 1).



15

- 1ère

génération :

Les oligonucléotides (ON) antisens modifiés de première génération les plus utilisés contiennent des

liaisons phosphorothioates, où un soufre vient substituer un oxygène non liant. Faciles à synthétiser,

très solubles dans l’eau, ils résistent mieux à la dégradation nucléolytique (5). Cependant leur affinité

pour de nombreuses protéines cellulaires contenant des sites de liaisons aux polyanions, telles que des

protéines se liant à l'héparine, leur confère une certaine toxicité (6, 7). Enfin, ils sont moins affins que

les ODN pour l'ARN.

- 2ème

génération :

Pour pallier le problème de toxicité, une seconde génération d’oligonucléotide a été synthétisée. Les

positions 2’ des sucres ont subi des substitutions par des groupements tels que O-méthyl, O-méthoxy-

éthyl conduisant respectivement à des 2’-O-méthyl et 2’-O-méthoxy-éthyl (2-MOE) ribonucléotides.

On trouve aussi des substitutions par un fluor. Ceux-ci sont plus stables en milieu physiologique,

moins toxiques et plus affins pour les acides nucléiques que les phosphorothioates (8).

- 3ème

génération :

D'autres modifications ont été réalisées pour les analogues de troisième génération. Tous sont

résistants aux nucléases, ont une forte affinité pour les acides nucléiques et n'ont encore montré aucune

toxicité importante. Parmi eux, on trouve les molécules suivantes:

LNA:

Le ribose peut être modifié pour donner un sucre de conformation restreinte par un pont méthylène

reliant l’oxygène en position 2’ et le carbone en position 4’ du ribose. Ce Locked Nucleic Acid (LNA)

a une affinité sans précédent pour les acides nucléiques. Une substitution d'un désoxyribonucléotide

par un résidu de LNA augmente la température de fusion de 10°C (9).

PMO:

En remplaçant le sucre par un cycle morpholino à 6 atomes et des liaisons phosphorodiamidates, où un

oxygène du phosphate est remplacé par un groupement amine, on obtient des morpholinos

phosphorodiamidates (PMO) très stables vis-à-vis des nucléases, ayant une faible toxicité et une

affinité similaire aux ODN. Ils sont développés par AviBiopharma (10).



16

Figure 1 : Analogues d'acides nucléiques.

Dans la première génération, ce sont les liaisons phosphodiesters qui sont modifiées afin de résister

aux nucléases. Dans la deuxième génération, les sucres sont modifiés pour rendre les ONs moins

toxiques. Enfin dans la troisième génération, c'est tout le squelette qui est modifié. Seules les bases

azotées sont intactes, afin de conserver les liaisons hydrogène Watson-Crick.



17

PNA:

Enfin, en remplaçant le squelette sucre-phosphate par une chaîne pseudopeptidique avec des bras N-

(2-aminoéthyl)-glycine reliant les nucléobases, P.E. Nielsen a synthétisé des Peptide Nucleic Acids

(PNA) (11) (Figure 2).

Ils ont l’avantage d’avoir une forte affinité pour les acides nucléiques. Les duplex PNA:ARN sont plus

stables que les PNA:ADN, eux-mêmes plus stables que les doubles brins d’ADN. Ceci s’explique en

partie par l’absence de répulsions électrostatiques, puisque les PNA sont neutres. Leur nature moins

hydrophile augmente la force d'empilement de paire de bases (base-pair stacking forces) et donc la

stabilité des hybrides. Les PNA sont aussi capables de s'hybrider à des cibles très structurées telles que

les duplex d’ADN, les structures en épingle à cheveux et les quadruplex de guanines (12).

En plus d’avoir une haute affinité, ils ont une forte spécificité. N’importe quel mésappariement a bien

plus d’impact sur l’hybride PNA:ARN ou PNA:ADN que sur un hybride ADN:ADN. Un

mésappariement fait chuter le Tm d’un PNA:ARN ou d’un PNA:ADN de 15°C en moyenne contre

10°C pour un ADN:ADN (13, 14). Pour cette raison, les PNA sont souvent utilisés comme sonde pour

faire la différence entre deux cibles différant d'une ou deux bases (15).

Ils ont une forte stabilité en milieu biologique vis-à-vis des protéases et nucléases (16). Quand les

acides nucléiques non modifiés ont un temps de vie d’environ 15 minutes dans du sérum, les PNA sont

stables dans les cellules pour au moins 48 heures. Ils conduisent aussi à une faible toxicité dans les

cellules. Cependant, comme ils ne sont pas chargés, ils ne sont pas très solubles dans l’eau et pénètrent

faiblement dans les cellules de mammifères.

Figure 2: Schéma d'un oligodésoxyribo-

nucléotide et d'un oligomère de PNA

Les oligomères de PNA sont des analogues

d’acides nucléiques de troisième génération.

Ils sont constitués d’une chaîne pseudo-

peptidique sur laquelle sont greffées des

nucléobases. Ils ont donc des extrémités –NH2

et –CO2H à la place des extrémités 5’P- et 3’-

OH.



18

Les acides nucléiques et leurs analogues synthétiques sont capables de moduler artificiellement

l’expression des gènes, mais du fait de leur nature chimique variée on observe plusieurs types de

mécanisme d’action. En effet, ils peuvent réguler l’expression génique de manière artificielle en

induisant une dégradation enzymatique de l’ARNm ou par blocage stérique de diverses machineries

impliquées dans l’expression des gènes (Figure 3).

Figure 3 : Régulation génique artificielle.

L'ARN messager peut être ciblé sur différentes régions. Sur sa partie 5' terminale, les oligonucléotides

modifiés empêchent l'initiation de la traduction; sur la région codante, ils empêchent l'élongation de la

traduction ou induisent la dégradation de l'ARNm; sur des sites d'épissage, ils modulent l'épissage; sur

la partie 3' terminale, ils inhibent la traduction ou modulent la polyadénylation alternative.



19

II. Dégradation de l’ARN messager

1) Par la ribonucléase H

(a) La ribonucléase H

La ribonucléase H (RNase H) est une ribonucléase ubiquitaire qui hydrolyse l’ARN d’un duplex

ADN:ARN. Ces hybrides peuvent naturellement se former pendant la réplication et la réparation du

génome. S’ils n’étaient pas pris en charge par la RNase H, ces duplex conduiraient à une instabilité de

l’ADN génomique par formation de R-loop.

Dans les premières études montrant l'inhibition de la traduction par des ODN, le mécanisme d’action

n’était pas révélé. En 1987, Dash et al démontrent que les ODN induisent une dégradation

enzymatique de l'ARN messager via une activité similaire à celle de la RNase H (17). Par la suite,

d'autres études viennent confirmer le rôle de cette enzyme. Un ODN ciblant l'ARNm de la -globine

entraîne la dégradation de l'ARNm en présence de RNase H. Ce même ODN injecté dans des ovocytes

de Xénope riches en RNase H entraîne la diminution de la -globine (18). Les

oligodésoxyribonucléotides artificiels inhibent donc l’expression d’une protéine en provoquant la

dégradation enzymatique de l’ARNm cible (Figure 4).

La RNase H est aussi capable de reconnaître les hybrides formés avec les ON de première génération,

tels que les phosphorothioates. Cependant, elle ne peut pas reconnaître les analogues d’acides

nucléiques dont le sucre a été modifié. Pour pallier ce problème, il a été synthétisé des gapmères

composés de désoxyribonucléotides au centre activant la RNase H et de blocs de riboses modifiés aux

extrémités (Figure 5). Seules 5 à 6 bases suffisent à activer la RNase H (19). Les blocs terminaux les

protègent des exonucléases et augmentent leur affinité pour l’ARN cible.

(b) Quelques études cliniques

De nombreux gènes cellulaires et viraux impliqués dans des pathologies sont ciblés par cette approche

antisens. Les études in vivo et les essais cliniques ont montré de bonnes efficacités et tolérances.

ISIS 2302, connu comme Alicaforsen, cible l’ARNm de la molécule d'adhésion intercellulaire 1

(ICAM-1) impliqué dans la réponse inflammatoire. Des essais cliniques pour la colite ulcérée ont été

entrepris récemment (20). Administré par lavement, cet oligonucléotide montre des améliorations

importantes et de longue durée chez les patients. Des essais en Phase III ont commencé.



20

La molécule OGX-011 ou Custirsen est un phosphorothioate dont les extrémités possèdent des

nucléotides modifiés 2-MOE et qui cible l'ARNm de la clusterine, protéine antiapoptotique. Une étude

randomisée comparant docetaxel-custirsen à docetaxel seul montre une augmentation de la survie de 7

mois chez des hommes avec un cancer de la prostate résistant à la castration (21). Des études de

phases III sont prévues.

G3139, connu comme GenAsense ou Oblimersen, cible le codon d’initiation du gène bcl-2, gène

impliqué dans la régulation de l'apoptose. G3139 a été étudié en tant que co-traitement pour divers

cancers tels que la leucémie, le cancer du sein ou de la prostate. Une efficacité a été observée (22)

mais cette molécule n'a pas reçu d’autorisation de mise sur le marché car les mécanismes d’action de

cette molécule ne sont pas clairs. Des effets immunostimulateurs sont suspectés d’être impliqués dans

l’effet antitumoral observé (cf Problèmes de spécificité, p22) (23).

ISIS 113715 est un gapmère ciblant la protéine tyrosine phosphatase 1B (PTP-1B), un médiateur-clé

de la résistance à l'insuline. En phase II avec des patients diabétiques de type II, ISIS 113715 montre

une amélioration statistiquement significative dans de multiples mesures de contrôle du glucose (24).

En fin de compte, un seul agent antisens a été pour le moment approuvé pour la mise sur le marché: le

phosphorothioate Vitravene de chez ISIS ciblant une séquence d'ARNm du cytomégalovirus de la

rétinite. Il est utilisé pour traiter les patients atteints du sida et de la rétinite induite par ce virus. Il

s’administre par injection intraoculaire, ce qui permet de s'affranchir des problèmes de biodisponibilité

(25).

2) Par le complexe RISC

(a) L'interférence ARN

En 1998, Andrew Z. Fire et Craig C. Mello ont montré que l’on pouvait réduire spécifiquement

l’expression de protéines en introduisant de l’ARN double brin dans des cellules du nématode

Caenorhabditis elegans (26). Ce phénomène fut alors nommé interférence ARN (Figure 7). L’ARN

interférent se lie spécifiquement avec l’ARN messager cible, conduisant à la dégradation de celui-ci et,

de ce fait, à une forte inhibition de l'expression de la protéine correspondante. Ces deux chercheurs ont

reçu en 2006 le prix Nobel de Physiologie et de Médecine pour leurs travaux. Ce double brin d’ARN

constitué d’une vingtaine de bases et que l’on nomme «small interfering RNA» (siRNA) est incorporé

dans le complexe RISC (RNA-induced silencing complex). Le brin antisens guide RISC jusqu’à

l’ARN messager cible qui est alors clivé par Argonaute 2, protéine majeure de RISC. La machinerie

de l’interférence ARN est présente dans toutes nos cellules et sert à réguler très finement l'expression



21

de notre génome. Les effecteurs naturels de cette machinerie sont des petits ARN de structure voisine

des siRNA : les microARN.

Pouvoir supprimer l'expression d'une protéine dans les cellules de mammifère donne un potentiel

immense aux siRNA. Souvent plus efficaces que les phosphorothioates, ils ont été largement exploités

pour des études de génomique fonctionnelle. Ils ont aussi été étudiés en tant qu'agents thérapeutiques.

(b) Quelques études cliniques

Bevasiranub, un siRNA ciblant le facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF) a été

développé par Acuity Pharmaceuticals pour traiter la dégénérescence maculaire liée à l'âge. Inhiber

VEGF diminue la formation de néovaisseaux impliqués dans cette maladie. Ce siRNA a montré des

résultats prometteurs dans les souris, a stabilisé la condition des patients et amélioré leurs visions. Il

est actuellement en phase III des essais cliniques (27).

Le virus respiratoire syncytial (RSV) est un virus à ARN simple brin qui cause des infections

respiratoires. 300 000 personnes aux USA et 75 à 120 000 enfants sont hospitalisés chaque année à

cause du RSV. Alnylam Pharmaceuticals a développé un siRNA, ALN-RSV01 ciblant le gène codant

pour la nucléocapside du virus. Il réussit à inhiber la réplication virale dans les poumons. Les essais

cliniques de phase I ont montré une bonne tolérance chez les adultes par voies intranasales (27)

(http://www.alnylam.com). La phase II est planifiée.

3) Ribozyme

Découverts dans les virusoïdes de plantes, les ribozymes « à tête de marteau » sont des molécules

d'ARN ayant la capacité de catalyser la coupure de brins d'ARN à des sites spécifiques. Ils sont

devenus particulièrement intéressants lorsqu'il a été possible de produire des ribozymes ciblant des

séquences d'ARN d'intérêt (28). Depuis, ils sont utilisés pour supprimer l'expression de gènes

spécifiques dans les cellules et des essais cliniques sont en cours. Angiozyme, un ribozyme contenant

des nucléotides modifiés pour le rendre résistant aux nucléases et ciblant le récepteur de VEGF, est

développé par Ribozyme Inc. (29). Après des résultats encourageants en phase I, il est maintenant testé

en phase II pour le cancer rénal (Figure 6).



22

4) Problèmes de spécificité

Bien que leurs efficacités soient démontrées dans plusieurs essais cliniques, de nombreuses études

remettent en cause les approches impliquant les phosphorothioates et les siRNA. En effet, ces

molécules ne sont pas aussi séquence-spécifiques que l'on espérait.

(a) Cibles secondaires

Des cinétiques de coupure ont été réalisées sur différents gapmères en présence de RNase H. L'enzyme

ne requiert que l’appariement de 5 à 6 bases d'ODN pour couper un duplex ODN:ARN (19). Ceci est

problématique d'un point de vue spécificité. En effet, beaucoup de cibles secondaires peuvent être

affectées par la formation de ce petit duplex (6).

Quant aux siRNA, des études cellulaires rapportent des variations d'expression de multiples gènes non

ciblés, appelés off-targets (30). Ces variations peuvent aller jusqu'à diviser par quatre les taux

d'expression, et diminuer les concentrations de siRNA ne fait pas disparaître les off-targets. De

manière surprenante, ce n'est pas les séquences ayant des identités quasi-parfaites qui constituent les

off-targets. Parmi celles trouvées sur micropuces, on ne retrouve quasiment pas de séquence ayant une

identité de plus de 15/19 bases. Ceci est plutôt rassurant puisque cela pourrait représenter des milliers

de gènes. Par contre, on observe que les positions 2-7 ou 2-8 du brin antisens peuvent induire une

inhibition d'expression d'un gène lorsqu'il y a complémentarité sur sa partie 3' UTR. Ceci ne s'est pas

observé sur la partie 5' ou la région codante. On peut donc en conclure que les siRNA se comportent

comme des miRNA, et que ceci constitue un des phénomènes expliquant les off-targets (31).

(b) Stimulation du système immunitaire

Une considération importante pour leur utilisation in vivo est que les siRNA et ONs de première

génération peuvent stimuler le système immunitaire. Cette stimulation peut être avantageuse pour

certaines thérapies mais peut aussi mener à des résultats trompeurs et inattendus.

Les ARN double brin de plus de 21 nucléotides sont reconnus par le récepteur toll-like 3 (TLR3), ce

qui induit l'interféron-et l'interleukine 12. Ce phénomène rend les siRNA de plus de 21 paires de

bases antiangiogéniques, et il a ainsi été démontré que le siRNA Bevasiranub ciblant VEGF n'agissait

pas de manière séquence-spécifique (32). (cf Quelques études cliniques p21)

De plus, les ODN contenant des motifs CpG peuvent aussi stimuler le système immunitaire en étant

reconnus par TLR9, qui déclenche l'inflammation modulée par NF-B. CpG est un motif plus fréquent



23

dans les séquences virales et bactériennes que dans l'ADN de mammifère et le système immunitaire le

reconnaît comme marqueur de l'infection (33).

Enfin, dans une moindre mesure, les phosphorothioates ou les ON modifiés 2'-O-méthyl ne contenant

pas de motifs CpG sont aussi capables d'activer le système immunitaire (34, 35).

(c) Utilisation d'oligonucléotides modifiés

Plusieurs études ont exploré les effets des nucléotides modifiés de deuxième génération sur la

spécificité des phosphorothioates et siRNA. Comme vu précédemment, l'utilisation de blocs de riboses

modifiés aux extrémités permet de construire des gapmères. Ceux-ci diminuent les off-targets puisque

ces blocs ne peuvent induire la coupure par RNase H ou par le complexe RISC. L'utilisation de

chimère permet ainsi de réduire les effets non spécifiques dans les cellules (36). Sur les siRNA,

certains résidus peuvent être remplacés par des 2'-O-méthyl, 2’-fluoro ou 2-MOE sur le brin antisens

sans perdre ses effets d'interférence ARN sur la cible (37).



24

Image issue de (38)

Image issue de (39)

Figure 4 : Mécanisme d'action de la RNase H

La RNase H hydrolyse le brin d'ARN dans un duplex ADN:ARN. Elle libère des extrémités 3'-OH et 5'-

phosphate. Le rôle naturel de cette enzyme est d'éliminer les amorces d'ARN nécessaires à la synthèse

des fragments d'Okasaki, lors de la réplication de l'ADN.

Figure 5 : Schéma d'un gapmère.

Il est constitué de résidus liés par des liaisons phosphorothioates. Les sucres centraux sont des

désoxyriboses hydrolysables par la RNase H et ceux aux extrémités sont des 2-O-méthoxy-éthyl-

riboses (2'MOE) résistants aux nucléases.

Phosphorothioate Backbone

Figure 6 : Schéma de la dégradation d'un ARNm par un ribozyme.

Le ribozyme se lie de manière séquence spécifique à l'ARNm cible et induit sa coupure.



25

Les siRNA utilisent ce mécanisme d’interférence ARN pour dégrader l’ARNm cible. Les substrats

naturels de ce mécanisme sont les miRNA. Les gènes peuvent être éteints par introduction exogène de

siRNA ou par introduction de construction exprimant des short-hairpins RNA (shRNA), des ARN en

épingle à cheveux. Ces derniers sont convertis en siRNA par la machinerie d'interférence ARN faisant

intervenir les enzymes Drosha et Dicer. Le siRNA est ensuite pris en charge par le complexe RISC, qui

coupera l'ARNm cible. S’ils se fixent en 3’UTR sur une séquence contenant des mésappariements, ils

inhibent la traduction sans engendrer de coupure.

Figure 7 : Le mécanisme d'interférence ARN.



26

III. Blocage stérique

Les oligonucléotides de 2ème

et 3ème

génération sont trop différents des acides nucléiques naturels pour

être reconnus par les enzymes cellulaires ou virales. Lorsqu’ils se fixent sur l’ADN ou l’ARN, ils

agissent comme des bloqueurs stériques et interfèrent avec les machineries impliquées dans

l’expression ou la régulation de l'expression des protéines. Ils peuvent agir à chaque étape en

s'hybridant par exemple:

- à l’ADN: ils inhibent la transcription

- à l'ARN pré-messager: ils modulent l’épissage alternatif

- à l’ARN messager: ils interfèrent avec la machinerie ribosomale

Ils peuvent aussi interagir avec:

- des complexes ribonucléoprotéiques et inhiber leurs activités enzymatiques

- des ARN viraux et bloquer la rétro-transcription

- des protéines et bloquer des sites actifs

Les cibles et applications potentielles sont donc très nombreuses. Ces molécules peuvent agir en tant

qu'agents anticancéreux, antibactériens, antiviraux ou antiparasitaires.

1) Stratégie antigène

La stratégie antigène consiste à interférer avec les processus qui impliquent l'ADN double brin

chromosomal. Cela inclut la transcription, la réplication, et d'autres interactions entre protéines et

ADN double brin. Pour cela, les ONs doivent être capables de s'hybrider sur les chromosomes

entourés de protéines chargées positivement. Plusieurs configurations ont été décrites (Figure 9).

(a) Interactions entre ON et ADN double brin

Triplex-forming oligonucléotides (TFO)

En 1957, Felsenfeld et al découvrent qu'une chaîne polyriboadénylique et deux chaînes

polyribourydiliques peuvent former en présence de Mg(II) une structure triple brin (40). Par la suite,

plusieurs études montrent que, dans le grand sillon d'ADN, il existe des groupes donneurs et

accepteurs pouvant former des liaisons hydrogènes avec une oligopyrimidine (41). Ces liaisons

hydrogènes dite d'Hoogsteen permettent de former des triplets T*A.T et C+*G.C (Figure 8). Des

liaisons hydrogènes s’établissent entre l’amine N3 et l’azote (ou oxygène) C4 de la pyrimidine et la

position N7 et l'oxygène (ou amine) C6 de la purine. Les liaisons Hoogsteen permettent aussi de



27

former des triplets A*A.T et G*G.C. Ceci a permis d’utiliser des oligonucléotides poly-TC, poly-TG

ou poly-AG comme ligands pour cibler l'ADN double brin de manière séquence-spécifique. Ces

"triplex-forming" oligonucléotides (TFO) reconnaissent le grand sillon de la double hélice et peuvent

former ainsi avec l'ADN double brin une triple hélice de type ODN:ADN:ADN (Figure 9-1).

Les TFO, interagissant de manière séquence spécifique avec l'ADN, constituent des outils pour

diverses applications. Ils peuvent être couplés à des agents de pontage, de coupure, des facteurs de

transcription ou des nucléases (42).

La formation de triplex avec les TFO poly-TC est forte à pH acide et relativement faible dans les

conditions physiologiques car les cytosines impliquées dans les liaisons Hoogsteen ne sont pas

protonées. Afin de réduire cette dépendance au pH, les cytosines peuvent être remplacées par des

pseudoisocytosines. Celles-ci permettent de s'affranchir de la dépendance au pH sans affecter la

stabilité du triplex (43, 44).

Figure 8: Liaisons Hoogsteen

Les bases sont d’abord reliées par des liaisons Watson-Crick (horizontales). Les liaisons Hoogsteen

(verticales) permettent d’hybrider à l’adénine d’un duplex A.T une deuxième thymine ou une

deuxième adénine. De même, elles permettent d’hybrider à la guanine d’un duplex G.C une deuxième

guanine ou une cytosine protonée.



28

Pour favoriser la formation des complexes, augmenter leurs stabilités et rendre les ON résistants aux

nucléases, des oligonucléotides modifiés sont utilisés. Par exemple, des monomères de LNA

augmentent de manière significative la stabilité des triplex. Il est intéressant de noter qu'un TFO

constitué uniquement de résidus LNA ne peut pas former de triplex (42).

Invasion par formation de triplex:

L'utilisation de PNA polypyrimidiques (ou poly-TC) pour cibler la double hélice d'ADN a conduit à

des complexes d'une très grande stabilité. Cependant, on s'est vite rendu compte que les PNA ne

présentent pas le même type d'interaction avec l'ADN que les autres oligonucléotides. Ils interagissent

avec l'ADN double brin par un mode invasif, dit invasion de brin. Un brin d'oligomère se lie au brin

homopurine d'ADN par liaison Watson-Crick, tandis qu'un deuxième oligomère se lie par liaison

Hoogsteen. On obtient un triplex PNA-ADN-PNA et cela libère un simple brin d'ADN adoptant une

structure D-loop (Figure 9-2).

Pour augmenter l'efficacité d'invasion, des « PNA-pinces » ou bis-PNA sont utilisés. Il s'agit de deux

séquences polypyrimidiques de PNA liés covalemment par un bras flexible (Figure 9-5). Cette

réaction trimoléculaire ne se fait alors plus qu'avec deux molécules, ce qui accélère l'invasion.

L'inconvénient de ces pinces est leurs longueurs (45). Pour être spécifique, une certaine longueur est

nécessaire, mais si les molécules sont trop grandes, elles deviennent trop insolubles et atteignent

difficilement leurs cibles.

Invasion par formation de duplex:

Pendant la transcription ou la réplication, les brins d’ADN se séparent et deviennent une cible pour les

PNA qui peuvent alors piéger cet état. Ils forment des duplex stables avec un brin et le second brin

d’ADN reste dissocié (Figure 9-3) (46).

Invasion par formation de double duplex:

Pour stabiliser ces derniers, il faudrait un PNA complémentaire du brin déplacé (Figure 9-4). Cela

implique que les deux PNA soient pseudocomplémentaires, c'est à dire qu'ils reconnaissent l'ADN

mais aient une faible affinité l'un pour l'autre. Ceci est possible en utilisant des bases modifiées

diaminopurine et thiouracyl à la place respectivement de l'adénine et de la thymine (47). La

composition en bases A et T doit cependant être supérieure à 50%. Cette méthode permet de cibler une

plus grande gamme de séquence.



29

(b) Inhibition de la transcription

Les régions promotrices du génome sont des régions riches en cibles pour les TFO. L'inhibition de la

transcription par des TFO a été décrite pour quelques gènes endogènes, tels que le facteur de

transcription Ets2 dont l'expression est réduite par un TFO ciblant sa région promotrice (48).

L'inhibition de la transcription peut se faire en ciblant des promoteurs avec des PNA formant des

invasions par formation de triplex. L'accès aux facteurs de transcription ou de l'ARN polymérase est

alors bloqué. Vickers et al empêchent l'activation transcriptionnelle par le facteur de transcription NF-

B en bloquant son site de fixation sur la partie 5' régulatrice (49). Le PNA polypyrimidique utilisé

réduit ainsi de manière spécifique l'activation génique dans des cellules en culture. L'inhibition de la

transcription a été aussi observée avec un PNA de séquence non polypyrimidique. Ce PNA cible le

2ème

exon de c-myc et inhibe l'expression de son ARNm dans des cellules dérivées du lymphome de

Burkitt (50).

Cette stratégie peut être aussi exploitée pour les thérapies antirétrovirales. Un PNA riche en purine et

ciblant le site polypurine tract (PPT), essentiel et hautement conservé dans l'ADN proviral du VIH, a

supprimé la réplication virale dans des lymphocytes et macrophages infectés chroniquement (51).

Figure 9 : Schéma des complexes entre ADN double brin et oligonucléotides.

Les oligomères sont en gras. Seuls les PNAs sont capables de former les complexes 2, 3, 4 et 5. Pour

former les complexes 1, 2, et 5, la séquence d'ADN doit être polypurine. Pour le complexe 4, les PNAs

doivent être pseudocomplémentaires.



30

(c) Induction de la transcription

La boucle d'ADN simple brin résultant de l'invasion par formation de triplex est reconnue par les

facteurs d'initiation de la transcription. Ils sont ainsi capables d'initier la transcription sur ce brin libre.

Wang et al utilisent un PNA polypyrimidique ciblant la partie 5' du gène de la -globine (52). La

formation du triplex induit ainsi la transcription de ce gène endogène dans les cellules.

(d) Introduction de mutation et recombinaison

De grands espoirs sont fondés sur les techniques de la réparation génétique des cellules somatiques. En

1998, il a été montré que la fixation d'un PNA-pince a été reconnue par la cellule comme une lésion

mutagénique, ce qui a induit une mutation (insertion ou délétion d'une paire de bases) sur le site de

fixation du PNA. La fréquence de mutation était 10 fois supérieure au bruit de fond (53). La fixation

de la pince sur l'ADN provoquerait une distorsion de l'hélice qui induirait la réparation de l'ADN. Il a

donc été envisagé de se servir de ces PNA pour activer la recombinaison homologue. En

cotransfectant un PNA polypyrimidique et un ADN donneur homologue, la recombinaison dirigée a

été induite sur un gène rapporteur à une fréquence de 0.4% dans des cellules humaines (54).

2) Correction de l’épissage

Pratiquement tous les ARNm eucaryotes sont maturés par un processus d’épissage alternatif. Une

grande partie des maladies génétiques a pour cause un défaut d'épissage d’ARNm dû à une mutation

défavorisant ou inactivant un site d’épissage ou bien à une mutation créant un nouveau site. Pour

corriger ces anomalies, les bloqueurs stériques peuvent agir comme agent de correction en se fixant

sur un site d'épissage anormal ou en recrutant le spliceosome sur une jonction intron-exon inactivée.

(a) Blocage de fausses jonctions intron-exon

Chez les patients atteints de -thalassémie, une mutation dans l'intron 2 du gène de la -globine, sous-

unité de l'hémoglobine crée un site cryptique d’épissage qui conduit à l'incorporation de l'intron dans

l'ARNm mature. Cela aboutit à un décalage du cadre de lecture et l’apparition d’un codon stop

prématuré. La protéine résultante est alors inactive. Des ON qui se fixent sur la séquence intronique

mutée empêchent la reconnaissance de ce site d’épissage cryptique et le spliceosome se redirige vers la

séquence sauvage d’épissage. Des injections intrapéritonéales de PNA couplé à quatre lysines, de 2'-

O-méthoxy-éthyl (55) et de LNA (56) ciblant ce site cryptique corrigent l'épissage dans plusieurs

organes murins (Figure 10A).



31

(b) Exclusion d'exon

Chez les malades atteints de la myopathie de Duchenne, une mutation sur l'exon 23 du gène de la

dystrophine introduit un codon stop prématuré. En se fixant sur le site d’épissage de cet exon, l’ON

rentre en compétition avec la fixation du spliceosome qui se redirige vers une séquence d’épissage en

aval de cet exon. Il en résulte un saut d’exon et une protéine plus courte mais fonctionnelle. Des

injections intramusculaires du PMO AVI-4658 chez des patients atteints de cette myopathie ont été

menées de manière dose-croissante. Les biopsies après injection révèlent que la molécule induit bien

l'expression de la dystrophine dans le muscle traité (57) (Figure 10B). Il est plutôt rare qu'une protéine

puisse se passer d'un exon et rester fonctionnelle. Cela est possible pour des protéines telles que la

dystrophine qui contient des motifs répétés.

Il est plus facile d'induire des sauts d'exon pour rendre une protéine non fonctionnelle. Le récepteur

aux facteurs de croissance épidermaux humains (Her-2) est codé par un gène proto-oncogénique et est

une cible valide pour le traitement de nombreux cancers du sein. Il y est souvent surexprimé ou muté.

Un PNA ciblant une jonction intron-exon de l'exon 19 contenant le domaine catalytique ATP conduit

au saut de l'exon 19 dans les cellules cancéreuses du sein (58).

(c) Inclusion d'exon

Chez les malades atteints d'atrophie musculaire spinale, une mutation sur un site d'épissage de l'exon 7

du gène SMN2 empêche sa reconnaissance par le spliceosome et conduit à une protéine SMN sans

exon 7 et peu fonctionnelle. Avec un antisens bifonctionnel composé d'une séquence reconnaissant le

site muté et d'une queue non complémentaire reconnue par les facteurs d'épissage, l'incorporation de

l'exon est favorisée (59) (Figure 10C).

(d) Modulation d'épissage

Le gène bcl-x a deux variants d'épissage: bcl-xS proapoptotique et bcl-xL antiapoptotique. Ce dernier

est surexprimé dans divers cancers. En bloquant le bon site d'épissage alternatif avec un agent antisens

on déplace l'équilibre vers l'isoforme bcl-xS, ce qui augmente l'apoptose dans les lignées cancéreuses

(60).



32

(Figure issue de (61))

Figure 10 : Correction et modulation de l'épissage

A/ Les sites d'épissage incorrects sont la cible des oligonucléotides. Ceux-ci conduisent à une

correction de l'épissage en masquant les sites incorrects. B/ Un exon contenant une mutation

introduisant un codon stop prématuré peut être sauté, conduisant à une protéine plus petite mais

fonctionnelle. C'est le saut d'exon. C/ Une mutation peut entraîner la non-reconnaissance d'un site

d'épissage. Un oligonucléotide complémentaire de la séquence mutée et contenant une séquence

reconnue par les facteurs d'épissage (SF2/ASF) permet d'inclure à nouveau l'exon muté.

a



33

3) Inhibition de l'initiation de la traduction

Lorsque des -ODN, non reconnues par les nucléases, ciblent différentes régions d'un ARNm dans des

ovocytes de Xénope, on observe que ceux ciblant la région 5' UTR et le codon d'initiation inhibent la

traduction. Ceux ciblant la région codante ne montrent pas d'effet (62). Ces ON ne peuvent pas être

reconnus par la RNase H, ils agissent donc par blocage stérique. Plusieurs autres études confirment

que les ON de 2ème

et 3ème

génération, ciblant ces régions de l'ARNm, peuvent inhiber l'initiation de la

traduction.

En 1997, Baker et al décrivent un antisens 2-MOE ciblant la partie 5' du transcrit d'ICAM-1 et

inhibant l'expression de la protéine dans les cellules HUVEC (63). Ils montrent que le duplex formé

n'a pas d'effet sur l'épissage ou le transport du transcrit, mais interfère bien avec la formation du

complexe d'initiation de traduction 80S. L'ON empêche donc le ribosome d'interagir avec l'ARNm par

blocage stérique.

Cette stratégie antisens a des applications potentielles dans les systèmes procaryotes ou viraux. Leurs

génomes étant largement différents du génome humain, il n'est pas difficile d'identifier des séquences

cibles sélectives. Good et al utilisent des PNA ciblant les régions des codons d'initiation des gènes de

la -lactamase, responsable de la résistance à certains antibiotiques, et de la -galactosidase

d'Escherichia coli (E. coli) (64). Ils inhibent ces protéines de manière dose-dépendante et spécifique in

vivo. Puis ils conjuguent des PNA à des peptides transporteurs qui ciblent l'ARNm d'une protéine

essentielle à la biosynthèse d'acide gras chez E. coli (65). A 2 µM, ce PNA guérit les cultures de HeLa

infectées par E. coli sans aucune toxicité apparente pour les cellules humaines. De plus, Nulf et al

utilisent des PNA et des LNA s'hybridant à la séquence "Internal ribosome entry site" (IRES) sur la

région 5' de l'ARN du virus de l'hépatite C, et inhibe la traduction de l'ARN contenant cet IRES (66).

Cette approche est intéressante pour des traitements anticancéreux. La région du codon d'initiation de

c-myc a été ciblée par le PMO AVI-4126 qui inhibe sa traduction de manière séquence-spécifique. Il

provoque une inhibition significative de la croissance et l'apoptose dans les xénogreffes de cancer de

prostate (67). Les essais de Phase I chez l'homme par administration intraveineuse n’ont pas montré de

toxicité.

La cavéoline-1 humaine, essentielle à la formation de caveolae, invagination de la membrane

plasmique, possède deux isoformes issus de deux codons d'initiation différents. Un PNA peut ainsi

inhiber sélectivement le plus long isoforme en se fixant sur le premier codon d'initiation (68). Cette

stratégie peut donc aussi servir à étudier le rôle de variant de protéine.



34

Les quelques bases suivant l'AUG sont aussi une cible pour l'inhibition de la traduction. Des PNA

ciblant jusqu’à la 38ème

base ont montré une activité antisens (69-71). Cette région est sensible à la

fixation d’un ON car le ribosome la chevauche pendant la phase de reconnaissance de l’AUG et des

tous premiers codons.

4) Arrêt de l’élongation de la traduction

Il a aussi été envisagé d'utiliser des bloqueurs stériques sur la région codante d'un ARNm afin d'arrêter

la machinerie ribosomale lors de l'élongation de la traduction.

Par rapport aux approches d'inhibition de l'expression génique précédentes, celle-ci apporte

potentiellement un intérêt thérapeutique supplémentaire. En effet, la synthèse de la chaîne

polypeptidique étant prématurément arrêtée, cela peut conduire à la formation et l'accumulation d'une

protéine tronquée (Figure 11). Si elle est suffisamment stable dans la cellule, elle peut agir comme un

dominant négatif. Elle aura perdu sa fonction ou son activité enzymatique mais entrera en compétition

pour le ligand ou le substrat de la protéine fonctionnelle. De plus, cibler la région codante offre

potentiellement un plus grand choix de cibles.

Les ARNm contiennent des structures secondaires. Cependant, pour être traduits, ils doivent être sous

forme simple brin. Lors de l'élongation, les ribosomes sont capables de défaire des hélices telles

qu’une hélice parfaite de 27 paires de bases (72). C’est ainsi que les oligonucléotides antisens ciblant

la région codante sont dissociés de leur cible par cette forte activité hélicase des ribosomes (73).

(a) ON couplés à des agents pontants

Pour pallier ce problème de dissociation, il a été attaché aux ON des molécules de pontage qui les lient

covalemment à l'ARN. Ils réagissent spontanément ou par activation photochimique et bloquent

efficacement la machinerie de traduction.

Figure 11: Schéma de l'arrêt de l'élongation de la

traduction par un bloqueur stérique.

Le ribosome en cours de traduction est arrêté par un

oligonucléotide. Ceci interrompt la synthèse de la

protéine et génère une protéine tronquée.



35

Johansson et al arrêtent l'élongation de la traduction dans du lysat de réticulocyte à l'aide d'un 2'-O-

méthyl-oligoribonucléotide couplé à un psoralène (73). L'activation par des UV entraîne la formation

d’une liaison covalente entre l'ARNm et le psoralène. Ce pontage est nécessaire pour empêcher les

hélicases d'ARN de déplacer l'ON de sa cible. De même, des phosphorothioates-pinces

polypyrimidines couplés à un psoralène en 5' s'hybrident à la région codante de c-myc. L'irradiation

UV entraîne une inhibition de la protéine dans des cellules de mélanome (74). L'inconvénient de cette

approche est que l'activation photochimique est difficilement réalisable in vivo.

Boudvillain et al couplent des 2'-O-méthyl avec un agent trans-diaminedichloroplatine (75). Sur un

simple brin d'ON, il est possible avec ce transplatine de former un pont intramoléculaire entre deux

guanines espacées d'un résidu non-guanine. Ce pont 1,3-(G,G) est stable lorsque l'ON est simple brin

et évolue spontanément vers un pontage interbrin lorsque l'ON s'apparie à un ARN complémentaire.

Cette espèce est alors très stable et arrête l'élongation de la traduction. La vitesse de réaction est faible

avec des ODN mais suffisante avec des 2'-O-méthyl. Cet ON réussit ainsi à inhiber l'oncogène Ha-ras

in vitro et on observe une inhibition dose-dépendante de la prolifération cellulaire. Gee et al observent

une protéine tronquée avec le même type de conjugué en ciblant un ARN viral dans un système

acellulaire (76). Cependant, en plus d'être difficiles à synthétiser, ces molécules sont des dérivés de

platine, molécules mutagènes et toxiques.

(b) PNA polypyrimidiques

Les ON de 3ème génération ont une affinité pour l'ARN qui est très forte. Les PNA sont notamment

connus pour être capables de dissocier des structures secondaires très stables (12) et d'arrêter des

machineries enzymatiques (cf Inhibition d’activité enzymatique p37). Ils ont donc été testés sur la

région codante. Il en résulte que les duplex PNA:ARN ne sont pas efficaces pour arrêter l'élongation

de la traduction in vitro ou dans les cellules (77, 78).

Knudsen et Nielsen montrent les premiers que les PNA polypyrimidiques, en formant des triplex de

type PNA2:ARN, réussissent à arrêter l’élongation de la traduction (77). Ils testèrent un PNA

polypyrimidique de séquence H-TTCTTCTTTT-NH2 ciblant la région codante de l’acétyltransférase

chloramphénicol. Le PNA réussît à arrêter l’élongation de la traduction et à générer une protéine

tronquée. D’après sa séquence, ce PNA est susceptible de former un triplex PNA2:ARN. Pour réaliser

des triplex de ce type, les seules liaisons Hoogsteen exploitables sont celles générant des triplets

T*A.T et C+*G.C. Pour former des triplex avec l’ARN, les PNA doivent donc être riches en

pyrimidines et plus particulièrement en thymine. En effet, à pH physiologique, les cytosines

impliquées dans les liaisons Hoogsteen ne sont pas protonées (Figure 12). Des PNA pinces, contenant

des pseudoisocytosines permettant de s’affranchir de la dépendance au pH, ont aussi été testés. Ils

observent que ces PNA arrêtent également l'élongation de la traduction (Tableau 1). Enfin, les PNA



36

non polypyrimidiques testés sur ce même système acellulaire échouèrent à arrêter l’élongation. Ils

concluent alors que les PNA en formant des triplex avec l’ARNm arrivent à arrêter la machinerie

ribosomale. Les Tm de ces PNA polypyrimidiques sont pourtant inférieurs à certains PNA formant des

duplex. La stabilité n'est donc pas le facteur essentiel et l'encombrement stérique du triplex est très

certainement le facteur-clé de ce succès.

Figure 12: Schéma des triplets PNA:ARN:PNA

Pour réaliser des triplex de type PNA2:ARN, les seules liaisons Hoogsteen exploitables sont celles

générant des triplets T*A.T et C+*G.C schématisées ci-dessus. Le premier PNA polypyrimidique

s’hybride par liaisons Watson-Crick tandis que le deuxième s’hybride au duplex par des liaisons

Hoogsteen. On note alors que, dans ces liaisons, les cytosines du deuxième brin de PNA doivent être

protonées, ce qui requiert en théorie un pH 5.5.

L'équipe du Professeur Tula Saison-Behmoaras s'est intéressée à cette stratégie (71, 79, 80). Des

séquences riches en purines d'Ha-ras ont été ciblées par des PNA. Ces études montrent à nouveau que

dans les systèmes eucaryotes seuls les PNA formant des triplex PNA2:ARN, ou tout du moins des

triplex partiels, arrêtent l'élongation du ribosome et génèrent des protéines tronquées (Tableau 1). Les

PNA utilisés dans ces études ne sont pas tous constitués que de pyrimidines. Ils ne forment donc pas

des triplex canoniques mais des complexes de type PNA2:ARN impliquant des liaisons Hoogsteen.

Ceci est encourageant et montre que la séquence cible n'a pas besoin d'être constituée de 100% de

purine pour que cette stratégie soit efficace.

Une exception semble avoir été observée. Des études acellulaires sur l'ARN viral de l'intégrase du

VIH-1 révèlent qu'un PNA formant vraisemblablement un duplex sur la séquence polypurine tract

PPT, génère une protéine tronquée (81). Se trouve-t-on en face d’un cas particulier ? Existe-t-il une

structure plus complexe entre l’ARN de l’intégrase et le PNA ?



37

Tableau 1: Récapitulatifs des PNA arrêtant l'élongation de la traduction

Cible Séquence du PNA

(C vers N)

Protéine

tronquée

Preuve de la

structure triplex Référence

Acétyltransférase

chloramphénicol TTCTTCTTTT Oui Aucune (77)

Acétyltransférase

chloramphénicol CCCTTT-(egl)-TTTJJJ

Inhibition de

la traduction Aucune (77)

Ha-ras humain GGCCCCTCCCGAA Oui Spectrométrie de

masse (79)

Ha-ras humain GCCGTCCCTCACC Oui

Spectrométrie

d’absorption à

260 et 295 nm

(80)

Ha-ras humain CCACGACCACCCC Inhibition de

la traduction

Spectrométrie

d’absorption à

260 et 295 nm

(80)

Intégrase du VIH-1 TTTTCTTTTCCCC Oui

Spectrométrie

d’absorption à

260 nm

(81)

Intégrase du VIH-1 TCTTTTCCCCCCT Oui Forme un duplex (81)

egl : acide 1,8-amino-3,6-dioxaoctanoique ; J : pseudoisocytosine ; Thymines en rouge et cytosines en

vert

5) Inhibition d’activité enzymatique

Les ON peuvent aussi s'hybrider sur des ARN non codants ou des ARN génomiques viraux.

(a) Inhibition de la télomérase

La télomérase est une ribonucléoprotéine contenant un domaine ARN qui se lie aux télomères et un

domaine protéique responsable du maintien de la longueur des télomères lors des divisions cellulaires.

Elle se trouve exprimée dans les cellules cancéreuses et germinales mais pas dans les tissus

somatiques. La partie ARN de la télomérase a été ciblée par des PNA (82). On observe une inhibition

de l'activité télomérique, un raccourcissement des télomères et un arrêt de la croissance cellulaire. Des

chimères LNA/DNA ont aussi été transfectées dans les cellules et se sont révélées être des inhibiteurs

efficaces et sélectifs (83). Avec ces 13-mères constitués de 10 unités de LNA et 3 bases d'ADN, on

obtient dans les cellules une inhibition de plus de 80% de l'activité télomérase.



38

(b) Inhibition de la rétro-transcription virale

Un autre exemple de ciblage d'ARN est celui des ARN génomiques viraux. Lorsqu'un ON se fixe sur

un site d'initiation de la rétro-transcription, il rentre en compétition avec la transcriptase inverse. Il

bloque ainsi la transcription et par la suite la réplication virale. Des PNA ont ainsi bloqué in vitro la

rétro-transcription du virus de l'hépatite B (84) ou du VIH-1 (85).

Des effets de différents ON se fixant sur l'élément TAR du VIH -1 ont aussi été publiés. Cet élément

est présent à plusieurs reprises sur le transcrit du VIH-1. La reconnaissance de ce domaine par la

protéine Tat entraîne la transcription du virus. Le blocage de TAR par un ON inhibe donc la

transcription complète du VIH-1 et la réplication virale (86, 87).

(c) Inhibition de micro ARN

Les microARN (miRNA) sont de petites ARN non codants qui régulent post-transcriptionnellement de

nombreux processus cellulaires. Ils sont donc une cible thérapeutique intéressante. Des ON antisens

ont été utilisés pour bloquer les miRNA et ainsi étudier leurs fonctions ou leurs potentiels

thérapeutiques. miR-122 qui est un miRNA spécifique du foie, a été ciblé par une chimère LNA/2'-O-

Méthyl et un PNA. Ces chimères se sont montrées efficaces pour bloquer l'activité de miR-122 dans

des cellules de foie de rat et d'homme (88). miR-155, exprimé dans le système hématopoïétique, a

aussi été inhibé par un PNA dans des cellules B primaires et dans les souris. Son blocage par le PNA

donne le même profil d'expression génique que les souris déficientes en miR-155 (89).

6) Aptamère

Les aptamères sont de courtes séquences d'ARN ou d'ADN (ou analogues) qui, au contraire des autres

stratégies basées sur des nucléotides, n'interagissent pas avec leurs cibles par complémentarité de base.

Ce sont leurs structures tertiaires ou quaternaires qui déterminent leurs liaisons avec la cible et leurs

activités. Ils peuvent être considérés comme des anticorps chimiques, avec l'avantage d’être peu

immunogènes. Ils sont utilisés pour cibler avec une haute affinité et spécificité des protéines

extracellulaires et cytoplasmiques ou des acides nucléiques structurés. Ils sont obtenus à partir d’une

bibliothèque de séquences qui est criblée en utilisant la technologie SELEX (Systematic Evolution of

Ligands by Exponential Enrichment) pour déterminer rapidement le meilleur aptamère pour une cible

donnée (90).

Ils peuvent en théorie cibler n'importe quelle molécule: extracellulaire ou intracellulaire, protéique ou

nucléique, et sont donc utilisés pour toutes sortes de pathologie, parmi elles (90):



39

- une chimère LNA/2'-O-méthyl agit comme un aptamère ciblant l'élément TAR (trans-

activating response) du VIH-1 et inhibe spécifiquement l'expression dépendante de TAR

in vitro. Contrairement aux ON antisens et siRNA, cette interaction ne requiert pas

l'invasion de la structure cible.

- l'anticoagulant RB006 est un aptamère ciblant le facteur IXa et empêchant la formation de

caillots sanguins. Il est actuellement en phase II des essais cliniques.

- MacugenTM

(Pegatinib), ciblant VEGF, est un aptamère d'ARN modifié par des

fluoropyrimidines. Il a passé avec succès les essais cliniques et a été approuvé par la Food

and Drug Administration (FDA) pour lutter contre la dégénérescence maculaire liée à

l'âge. C’est le deuxième oligonucléotide sur le marché après Vitravene.


IGF-1R

40

B. Le récepteur à l'Insulin-like

Growth Factor 1

I. La voie de signalisation IGF

La voie de signalisation IGF (Insulin-like Growth Factor), présente dans tous les tissus humains, est la

voie principale impliquée dans la croissance des cellules somatiques chez le fœtus. La croissance des

cellules somatiques post-natales implique l’interaction synergique de l’hormone de croissance et des

IGF (91). Cet axe joue aussi un rôle essentiel dans le développement embryonnaire et post-natal, dans

la survie cellulaire et dans le cancer.

Il comporte les médiateurs IGF-1, IGF-2 et l’insuline, dont l’action est modulée par :

- des protéines de liaison IGFBP (IGF Binding Protein)

- des protéases d’IGFBP

- des récepteurs membranaires

L'insuline est sous contrôle strict des taux de glucose sanguins et est excrétée seulement par le

pancréas quand ce taux augmente. IGF-1 est produit dans le foie et les cellules somatiques sous

contrôle endocrinien de l'hormone de croissance GH. Par contre, la production d'IGF-2 est autocrine et

paracrine.

Les IGFBP sont six protéines solubles extracellulaires de haute affinité et spécificité pour les IGF.

Comme elles ont un rôle de stockage et de transport des IGF, elles modulent leurs biodisponibilités.

Moins de 5% des IGF circulent librement. Parmi les IGFBP, IGFBP3 est la forme prépondérante dans

le sérum humain et lie 80% des IGF synthétisés. Leurs taux d'expression ont donc un rôle essentiel

dans la voie IGF. Les médiateurs IGF-1et IGF-2 sont libérés par des protéases spécifiques qui

dégradent les protéines de liaison.

Ces IGF se fixent alors aux récepteurs IGF-1R, IR (Insulin Receptor) ou IGF-2R. IGF-1 et 2 se fixent

principalement sur IGF-1R avec une haute affinité, et avec une plus faible affinité sur IGF-2R et IR.

IGF-2R ne transmet pas de signal, mais régule la biodisponibilité d’IGF-2 en l’internalisant pour qu'il

soit dégradé.


IGF-1R

41

IR et IGF-1R appartiennent à la famille des tyrosines kinases transmembranaires et les domaines

tyrosine kinases sont fortement conservés entre les deux récepteurs (84% de similarité en acides

aminés). Sur le récepteur entier, il existe aussi 70% d’homologie en acide aminés et une forte

homologie en termes de taille et d’organisation d’exons. Ils peuvent se dimériser pour former un

récepteur hybride. IR a deux isoformes qui soit contient l’exon 11(IR-B) soit ne le contient pas (IR-A).

Quand IGF-1R se dimérise avec IR-A, le récepteur hybride lie les 3 médiateurs et quand il se dimérise

avec IR-B l'hybride lie seulement IGF-1 (92, 93) (Figure 13).

Tandis qu'IR est impliqué principalement dans le contrôle des taux de glucose et le métabolisme, IGF-

1R est impliqué dans la transformation, la survie cellulaire, la mitogenèse, et la différenciation

cellulaire (94, 95). Malgré leur forte homologie, IR et IGF-1R ont donc des fonctions physiologiques

très distinctes. Ceci s'explique par le fait que, pendant l'évolution, le besoin de réguler l'entrée du

glucose dans les cellules indépendamment de la prolifération et de la survie cellulaire a conduit à

l'apparition de ce système complexe. Des fonctions supplémentaires, telles que celles liées au

développement ou à la longévité, ont été acquises plus tard (96).

Figure 13 : La voie de signalisation IGF.

Il est constitué des médiateurs IGF-1, IGF-2 et insuline, ligands des récepteurs IGF-1R, IR, IGF-2R et

des récepteurs hybrides IGF-1R/IR. IR existe sous deux isoformes IR-A et B. Les IGF Binding Proteins

(BPs sur le schéma) lient les ligands et servent ainsi de régulateurs. L'activation d'IGF-1R conduit au

recrutement du substrat IRS-1 ou SHC, conduisant respectivement à l'activation de la voie de

signalisation PI3K/AKT ou MAPK. Cet axe IGF propage et régule des signaux de prolifération, de

survie et de métastase.


IGF-1R

42

II. Fonctions physiologiques d’IGF-1R

IGF-1R est impliqué dans la survie cellulaire, la mitogenèse, et la différenciation cellulaire.

1) Protéine de survie

Il existe un grand nombre d’exemples décrivant qu’IGF-1R peut protéger les cellules de l’apoptose in

vitro et in vivo (97). De même, une surexpression du récepteur inhibe l’apoptose induite par une

grande variété de traitements, tels que:

- un manque d'interleukine 3 (IL-3) (98)

- un choc osmotique (99)

- une irradiation avec des rayons X (100)

- une expression de p53 (98)

Ainsi, IGF-1R représente une cible critique en thérapie anticancéreuse pour l’induction de l’apoptose.

La voie de signalisation IGF est connue pour conférer une résistance à certaines chimio ou

radiothérapies. Inhiber le récepteur pendant une chimiothérapie permet de venir à bout de la résistance

et de tuer les cellules tumorales (101, 102). Des oligodésoxyribonucléotides ont aussi été capables en

supprimant l’expression du récepteur de produire une apoptose massive des cellules tumorales in vivo

(103, 104).

2) Protéine de prolifération et de développement

Des souris invalidées pour le gène Igf1r naissent deux fois moins lourdes que les autres et meurent

plus vite (105). L’inhibition de l’expression d’IGF-1R limite aussi l’entrée en phase S des fibroblastes

en présence de facteurs de croissance mitogéniques (106). Ceci souligne qu'IGF-1R est essentiel pour

la croissance et le développement. Le récepteur est exprimé dans tous les types cellulaires, les seules

exceptions connues étant les hépatocytes et les cellules B matures. Dans des conditions physiologiques

normales, IGF-1R stimule la croissance du corps, favorise la survie neuronale et la myélinisation,

favorise le développement mammaire et la lactation. Il est aussi impliqué dans la formation des os et la

fonction rénale (107).


IGF-1R

43

3) Protéine de différenciation

Bien que cela semble contradictoire avec ses propriétés précédentes, IGF-1R peut induire la

différenciation en adipocytes, myoblastes, ostéoblastes, neurones, et cellules hématopoïétiques. Les

cellules hématopoïétiques murines entrent en apoptose lorsqu'elles sont privées d'IL-3, possèdent des

taux d'expression d'IGF-1R très faibles et n'expriment pas IRS-1, substrat du récepteur. L'expression

d'un ADN complémentaire (ADNc) d'IGF-1R dans ces cellules les rend résistantes à l'absence d'IL-3.

IGF-1R a ici un pouvoir antiapoptotique. L'addition d'IGF-1 à ces cellules exprimant IGF-1R conduit à

leur différenciation terminale. Mais, si des ADNc d'IGF-1R et d'IRS-1 sont co-exprimés, alors cela

conduit à la formation de tumeurs chez l'animal (95). Le récepteur envoie donc des signaux différents

à la cellule: un puissant signal antiapoptotique et mitogénique ou un signal de différenciation

conduisant à la mort cellulaire. Ici, le choix entre les deux signaux semble dépendre de la disponibilité

du substrat IRS-1 (Tableau 2).

Tableau 2: Rôle d'IGF-1R et d'IRS-1 dans la diférenciation

IL-3 - - IGF-1 + +

IGF-1R - + + + IRS-1 - - - +

Effets Apoptose Survie Différenciation Formation de

tumeur

III. Structure et biosynthèse du récepteur

IGF-1R est une glycoprotéine transmembranaire contenant un domaine tyrosine kinase et issue de la

dimérisation de deux précurseurs de 180 kDa. Après synthèse, le précurseur est glycosylé par des

protéines chaperonnes. La N-glycosylation contrôle le repliement et la dimérisation du récepteur. Il

s’ensuit une protéolyse spécifique donnant deux chaînes et de poids moléculaires apparents de 135

et 90 kDa respectivement. Les sous-unités et s’associent alors par pont disulfures pour former

l’hétérotétramère 22 mature (91) (Figure 14).

Chez l’homme, le gène Igf1r est localisé sur le bras long du chromosome 15 au locus 15q25-q26. Il

contient environ 100 kb et 21 exons, dont 10 exons pour la sous-unité . Il code pour un ARN

messager d’environ 5,9 kb. L’ADNc contient 4989 paires de bases codant pour 1367 acides aminés


IGF-1R

44

pour le précurseur et 30 acides aminés pour un peptide signal. La sous-unité comporte 707 acides

aminés extracellulaires dont 11 sites de N-glycosylation. La sous-unité comporte 626 acides aminés

dont les 195 premiers sont extracellulaires avec 5 sites de N-glycosylation, et les 24 suivants sont

transmembranaires. Il existe un site d’épissage alternatif en 5’ de l’exon 14 conduisant à deux ARNm

différant de 3 nucléotides CAG dans la région codant pour la partie extracellulaire. Pour l’isoforme

délété de CAG, une Arg remplace Thr-Gly en position 898-899. Cet isoforme a une internalisation

plus faible et une signalisation plus forte (108).

Figure 14 : Schéma de la structure d'IGF-1R.

Le récepteur est constitué de deux sous-unités contenant des domaines riches en cystéines formant

des ponts disulfures entre elles, et de deux sous-unités transmembranaires contenant le domaine

tyrosine kinase. La boucle d'activation de ce domaine contient des résidus importants (Y1131, Y1135

et Y1136 en jaune). La tyrosine Y950 en bleu est, lorsqu'elle est phosphorylée, un site de liaison pour

les substrats de signalisation. Le site de liaison à l'ATP K1003 en rose est aussi une région importante

du récepteur.


IGF-1R

45

IV. Voies de signalisation

L’interaction avec les ligands est suivie de la phosphorylation de la boucle d'activation du récepteur.

Les tyrosines 1131, 1135 et 1136 d'IGF-1R y sont phosphorylées. Cette activation de la kinase

entraîne le recrutement de substrats, tels que la famille des IRS (insulin receptor substrates) ou la

protéine SHC (Src homology 2 domain containing), et induit diverses voies de signalisation. Le

récepteur est ensuite internalisé (Figure 14).

IRS-1 et SHC sont des substrats en compétition se liant à la phosphotyrosine P-Y950 d’IGF-1R. Le

recrutement d’IRS-1 active la voie AKT, tandis que celui de SHC active la voie MAPK (Figure 13). Il

existe une troisième voie qui résulte de la translocation mitochondriale de la kinase Raf-1.

1) La voie de signalisation PI3K/AKT

Après le recrutement d’IRS-1 sur IGF-1R activé, la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) se lie à IRS-

1. Cette interaction augmente la quantité de phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate PIP3, ce qui

conduit à l’activation d’AKT. Celle-ci inhibe des facteurs proapoptotiques incluant:

- Bad (Bcl-2-associated death promoter): Déphosphorylé il forme un complexe avec bcl-2 et

bcl-xL, les inactivant et permettant ainsi l'apoptose déclenchée par Bax et Bak. La

phosphorylation de Bad par AKT libère ces facteurs antiapoptotiques.

- la caspase 9

- des membres de la famille FOX: facteurs de transcription de gènes impliqués dans la

croissance cellulaire,la prolifération et la différenciation.

L’activation d’AKT conduit aussi à l'activation de la protéine antiapoptotique NF-B (107).

Le recrutement d’IRS-1 a donc des effets antiapoptotiques. Ce substrat est d'ailleurs souvent

surexprimé dans des tumeurs humaines et il a été proposé comme biomarqueur pour le cancer.

D'ailleurs, comme cité précédemment (cf Protéine de différenciation p43), sans IRS-1, IGF-IR n'est

pas mitogénique mais conduit plutôt à la différenciation cellulaire.

2) La voie de signalisation Ras/MAPK

Le substrat SHC couple le récepteur à Grb2. Celui-ci forme alors un complexe avec SOS (Son Of

Sevenless), une Ras-GTPase. Cela cause la translocation vers la membrane plasmique de SOS et

l’activation de Ras. L'activation initie alors une voie classique de phosphorylation à travers les

http://en.wikipedia.org/wiki/Ras_%28protein%29

http://en.wikipedia.org/wiki/Small_GTPase


IGF-1R

46

intermédiaires c-raf et MEK (MAP2K ou kinases de protéines kinases activées par des mitogènes)

pour aboutir à l’activation des kinases sérine thréonine mitogene-activé (MAP) et des kinases reliées

aux signaux extracellulaires ERK1 et 2. Une variété de facteurs de transcription, kinases, et autres

enzymes est activée par ces MAPK permettant alors d'induire une réponse cellulaire métabolique,

mitogénique ou de différenciation (93).

3) Translocation mitochondriale de Raf-1

IGF-1R interagit avec les protéines 14.3.3 par ses sérines 1280-1283. Cela résulte en la translocation

mitochondriale de Raf-1 et de Nedd4, une cible des caspases. Un mutant d'IGF-1R pour ces sérines ne

protège plus les cellules de l'apoptose et ne déplace plus Raf-1 et Nedd4. De plus, il est connu que les

protéines 14.3.3 interagissent avec BAD, protéine favorisant la mort cellulaire. Cette troisième voie de

signalisation est donc antiapoptotique (109).

V. Rôle d’IGF-1R dans le cancer

1) Surexpression du récepteur

IGF-1R est fréquemment surexprimé dans des tumeurs humaines, telles que :

- Les cellules cancéreuses cervicales : augmentation du récepteur de 3 à 5 fois comparée aux

cellules ectocervicales normales (110)

- Les tissus issus du cancer du sein humain : augmentation de 10 à 14 fois (111)

- Les sarcomes de la synovie, caractérisés par des métastases du poumon : surexpression d’IGF-

1R associée à un phénotype agressif (112)

- La tumeur stromale gastro-intestinale (113)

- Les adénocarcinomes pancréatiques : surexpression d’IGF-1R corrélée à forte prolifération,

survie, angiogenèse et forte invasivité des tumeurs (114)

L'expression d'IGF-1R est régulée principalement au niveau transcriptionnel. Il est positivement régulé

par plusieurs oncogènes tels que c-myb, et négativement régulé par des suppresseurs de tumeurs tels

que BRCA1, p53 et Wilm's tumor protein 1. Une perte de fonction d'un suppresseur de tumeur ou

d'une surexpression d'un oncogène peut donc engendrer une surexpression du récepteur (115).


IGF-1R

47

Diverses stratégies thérapeutiques destinées à perturber les fonctions d’IGF-1R démontrent une

activité antinéoplasique remarquable. Cette surexpression étant aussi impliquée dans la résistance à

certaines thérapies anticancéreuses, l’inhibition d’IGF-1R permet donc de rendre plus efficaces des

agents cytotoxiques ou de la radiothérapie (cf. Stratégies d’inhibition de l’activité d’IGF-1R p50).

2) Rôle dans la transformation

En 1993, Sell et al montrent les premiers qu’IGF-1R est impliqué dans la transformation cellulaire, en

observant que des fibroblastes embryonnaires de souris inactivés pour Igf1r ne peuvent pas être

transformés par l’antigène SV40T, un oncogène puissant pour les cellules murines en culture (116).

D’autres moyens comme l’activation d’oncogènes (106) ou les carcinogènes chimiques ont échoué à

induire une transformation des cellules inactivées en Igf1r. Une surexpression d’IGF-1R résulte aussi

en une transformation des fibroblastes embryonnaires de souris (117). Ceci mène à croire que le

blocage du récepteur serait une approche thérapeutique valable pour un large spectre de tumeurs

malignes. En effet, une inhibition de ce récepteur peut inverser le phénotype malin des cellules

tumorales et les rendre sensibles à l’apoptose in vivo (118-120). Par ailleurs, une étude montre que

l'inhibition d'IGF-1R par un traitement antisens n'a pas d'effet sur la croissance de cellules de

mélanome en monocouche avec ou sans IGF-1. Cependant l'effet sur la croissance sur agar mou, bon

indicateur de la capacité de transformation, est très important (121). Cela montre qu'IGF-1R n'est pas

indispensable à la prolifération mais est nécessaire à la transformation.

3) Rôle dans la métastase

La surexpression d’IGF-1R est aussi associée à une propension à l’invasion et à la métastase.

L’inhibition d’IGF-1R conduit à la diminution de la formation de métastases pour diverses tumeurs in

vivo (118-120). IRS-1 serait lié à la prolifération et l'apoptose tandis qu'on pense qu'IRS-2, autre

substrat d'IGF-1R, est lié à la motilité et à la métastase. Un traitement par IGF-1 des variants

métastasiques de cancer du sein provoque la phosphorylation d'IRS-2 plutôt que d'IRS-1, au contraire

des lignées parentales. L'utilisation d'un antisens IRS-2 diminue la motilité et la croissance

indépendante d'ancrage induite par IGF-1. Cela souligne qu’IRS-2 joue un rôle important dans le

phénotype malin des cellules cancéreuses du sein (122). Par ailleurs, in vivo, des souris exprimant dans

les glandes mammaires l’antigène T du virus polyoma ont une latence et une incidence de métastases

diminuée si elles sont inactivées en IRS-2 (123).


IGF-1R

48

4) IGF-1R dans le cancer de la prostate

Le cancer de la prostate est le cancer le plus commun chez les hommes. De nombreuses études

épidémiologiques indiquent qu’il y a une forte corrélation entre la dérégulation de l’axe IGF-1 et la

carcinogenèse de la prostate. On sait par exemple que le cancer de la prostate est trouvé à une plus

forte fréquence chez les hommes ayant des taux d'IGF-1 circulants élevés. De plus, dans le

microenvironnement du cancer de la prostate, il existe des protéases telles que des métalloprotéinases,

des capsases et l’antigène spécifique de la prostate PSA, qui digèrent IGFBP-3 et libèrent IGF-1. Les

taux d’IGFBP-3 sont d’ailleurs inversement associés à la carcinogenèse de la prostate (124).

Ses métastases affectent la plupart du temps les os, où IGF-1 y est exprimé en grande quantité. La

formation des métastases y est donc favorisée grâce à une stimulation paracrine. Elles sont initialement

dépendantes d'androgènes. Cependant, le développement vers une indépendance aux androgènes est

inévitable après 12 à 18 mois de thérapie endocrine. Elles sont essentiellement chimiorésistantes et le

besoin de nouveaux traitements est urgent.

Hellawell et al ont montré une augmentation significative des taux d’expression d’IGF-1R et de son

messager dans des cancers primaires de prostate comparée à des épithéliums prostatiques bénins (125).

De plus, dans les cellules cancéreuses dépendantes des androgènes, telles que les LNCaP, les

androgènes induisent l'augmentation de l'expression d'IGF-1R. La progression de ces métastases vers

l'indépendance aux androgènes (cellules C4-2 ou DU145) s'accompagne in vivo d'une forte

augmentation des taux d'IGF-1R et d'IGF-1. Les androgènes ne sont alors plus nécessaires pour activer

la voie IGF mitogénique et antiapoptotique (126).

IGF-1 augmente la capacité invasive des DU145 in vitro et le blocage d’IGF-1R inhibe cette invasion.

Cette invasion passe par l’activation des voies de signalisation MAPK et PI3-K et l’augmentation de

l’activité de métalloprotéases matricielles MMP-2 et 9, identifiées comme fortement associées à

l’invasion des cancers de la prostate (127).

Ces études indiquent que la voie IGF entraîne la prolifération, la survie et la formation de métastase de

ce cancer. IGF-1R est donc bien une cible valide pour le cancer de la prostate.


IGF-1R

49

5) IGF-1R: une bonne cible thérapeutique?

(a) Effets secondaires

L'existence de populations humaines ayant un faible taux d'IGF-1 ou pas d'IGF-1 indique que les

thérapies anti-IGF-1R seront bien tolérées. De plus, il existe des enfants ayant des mutations rendant

IGF-1R dysfonctionnel. Ils présentent des déficits sévères de croissance, mais cela prouve que

supprimer partiellement IGF-IR n'est pas incompatible avec la vie (128). L'ubiquité et le rôle

fondamental de la voie IGF laissent présager tout de même des risques pour des traitements à long

terme. Notamment, son rôle neuroprotecteur incite à une vigilance vis-à-vis de la toxicité au niveau

du système nerveux central.

La forte homologie entre IR et IGF-1R et l'existence de récepteurs hybrides rendent difficile le ciblage

spécifique d'IGF-1R. L'effet attendu du blocage d'IR est une hyperglycémie. Heureusement, des

traitements existent pour ce type d'anomalie et si ce blocage d'IR est limité le traitement devrait être

bien toléré.

(b) Mécanismes de résistance possibles

Le ciblage du récepteur pourrait être rendu inefficace par une voie de signalisation compensatoire

et/ou la présence de mutations activant la signalisation en aval.

Le système EGF (Epithelium Growth Factor) est lui aussi un médiateur de la prolifération et de la

survie des cellules tumorales. Il possède de nombreuses interactions avec la voie de signalisation IGF

qui est parfois responsable de la résistance aux thérapies anti-EGFR. Riedeman et al montrent que

l'extinction d'IGF-1R dans des cellules humaines du cancer du sein conduit à l'augmentation de la

phosphorylation d'EGFR (101). Cependant, ce phénomène n'empêcha pas la diminution de la survie

des cellules tumorales. Ceci indique que l'axe EGF est incapable de compenser la perte d'IGF-1R in

vitro. Cependant, il est possible qu'in vivo l'hyperphosphorylation d'EGFR confère une résistance au

ciblage d'IGF-1R à une petite sous-population de cellules. Le co-ciblage de ces deux axes a été réalisé

dans diverses cellules tumorales telles que des cellules de carcinome de colon, où des inhibiteurs

d'IGF-1R et d'EGFR montrent des effets synergiques (102). Il est donc possible de cibler

simultanément les deux voies en cas de résistance.

Dans le cancer de la prostate, il y a une forte incidence de dérégulation de la voie PI3K/AKT due à une

mutation, voire une perte de fonction, du suppresseur de tumeur PTEN (pour Phosphatase and TENsin

homolog). Cette voie de signalisation se trouve alors suractivée. L'inhibition d'IGF-1R reste pourtant


IGF-1R

50

capable de bloquer la survie cellulaire dans ces cellules qui n’expriment pas de PTEN fonctionnel

(129). De même, des mutations activatrices de B-RAF et N-RAS, composants de la voie

RAS/RAF/MAPK, ne rendent pas les cellules résistantes aux traitements anti-IGF-1R (130).

Ces résultats sont encourageants et constituent des facteurs de succès pour les stratégies d'inactivation

d'IGF-1R.

VI. Stratégies d’inhibition de l’activité d’IGF-1R

L’axe IGF peut être ciblé à différents niveaux. Il est possible de jouer sur l'expression des ligands, sur

leurs biodisponibilités en bloquant les IGFBP, d'utiliser des inhibiteurs d'AKT... Et bien sûr, on peut

aussi bloquer l'activité d'IGF-1R en bloquant sa liaison au ligand ou son domaine tyrosine kinase, en

exprimant des dominants négatifs ou en diminuant son expression par des antisens (Figure 15).

Plusieurs stratégies ciblant IGF-1R ont été étudiées pendant les vingt dernières années et certaines sont

actuellement en essais cliniques de phase I et II. Malgré la présence ubiquitaire du récepteur et ses

fonctions physiologiques essentielles pour l'organisme, cibler IGF-1R entraîne des effets secondaires

acceptables. Les premières études cliniques évaluent la toxicité et l'efficacité du ciblage d'IGF-1R en

tant que monothérapie. Puis, les études s'orientent vers une évaluation du potentiel du ciblage d'IGF-

1R combiné à des chimiothérapies. Les études précliniques montrent en effet que le blocage d'IGF-1R

est capable de venir à bout de chimiorésistances.

1) Anticorps

Les anticorps empêchent le ligand d’interagir avec le récepteur, et déclenchent l’internalisation et la

dégradation du récepteur. Ils constituent une stratégie intéressante pour les oncoprotéines

transmembranaires. Les anticorps monoclonaux constituent à l’heure actuelle la majorité des agents

développés pour cibler IGF-1R et sont les premiers à être entrés en essais cliniques.

Plusieurs anticorps dirigés contre IGF-1R ont montré un fort blocage du récepteur in vivo. Parmi eux,

IMC-A12, un anticorps IgG1 monoclonal humain ciblant IGF-1R, a montré une inhibition de la

croissance rapide et importante sur plusieurs xénogreffes humaines: sein, poumon, colon, pancréas

(131). Plusieurs se trouvent déjà en essais cliniques : AMG479 (Amgen), AVE1642 (Sanofi-Aventis,

IMC-A12 (Imclone), MK0646 (Merck), R1507 (Roche) et CP-751871 (Pfizer). Les profils de toxicité

sont de manière générale favorables et on observe une stabilisation de la maladie ou une réponse sur


IGF-1R

51

une minorité de patients (Tableau 3). Des essais cliniques plus larges sont entrepris en ce moment

avec ces anticorps en combinaison avec des agents anticancéreux, sur de multiples types de cancer. Par

exemple, CP-751871 a été combiné avec du placlitaxel et du carboplatine sur des cancers du poumon

de type "carcinomes non à petites cellules". On observe 54% de réponses objectives par ce traitement,

contre 42% avec la chimiothérapie sans anticorps (132).

Les effets secondaires observés sont une toxicité hématologique et une hyperglycémie.

L'hyperglycémie pourrait être expliquée par le fait que des IGF-1R impliqués dans le contrôle

homéostatique de l'hormone de croissance GH soient inhibés. Cette dérégulation entraînerait une

résistance à l'insuline (132). On observe aussi qu’IR est inhibé sous l'action des anticorps. Une

explication possible serait que les récepteurs hybrides sont aussi internalisés et que, comme IR et IGF-

1R sont voisins dans les rafts lipidiques membranaires, ils sont co-endocytés (133) .

Figure 15 : Stratégies d’inhibition de la signalisation d’IGF-1R.

La voie de signalisation d'IGF-1R peut être bloquée de différentes manières. Plusieurs cibles sont

possibles telles que: AKT, TOR, IGF-1 et IGF-1R. Sur IGF-1R, on peut appliquer diverses stratégies:

inhibition de la liaison au ligand avec des anticorps, inhibition de l'expression du récepteur par des

stratégies antisens et inhibition de la tyrosine kinase par des inhibiteurs. (Image issue de (134))


IGF-1R

52

Tableau 3 : Résumé d'études cliniques avec des anticorps dirigés contre IGF-1R (données issues de (132) )

Anticorps Toxicités Résultats cliniques

A12 Hyperglycémie, anémie, psoriasis Phase I:

Stabilité de la maladie supérieure à 9 mois pour 2 patients

AMG-479 Thrombocytopénie, hyperglycémie

Phase I:

- 1 réponse complète pour le sarcome d'Ewing

- 1 réponse partielle pour une tumeur carcinoïde

- 1 réponse partielle avec du panitumumab chez un

patient réfractaire au cetuximab

AVE1642 Hyperglycémie, hypersensibilité

CP-751,871

Phase I:

- 1 réponse complète pour le sarcome d'Ewing

- 9/27 réponses partielles avec du dexaméthasone

pour des myélomes

Phase II:

- 54% de taux de réponse objective avec du

paclitaxel-carboplatine dans des cancers de

poumons de type "carcinomes non à petites

cellules"

MK0646

Thrombocytopénie, saignements

gastrointestinaux, pneumonites,

Toxicité hépatique

Phase I:

Stabilité de la maladie supérieure à 12 mois pour 2 patients

R1507 Hyperglycémie, lymphopénie,

accident vasculaire cérébral

Phase I:

2 réponses partielles pour le sarcome d'Ewing


IGF-1R

53

2) Inhibiteurs de tyrosine kinase

Les inhibiteurs de tyrosine kinase (TKI), en se liant directement au domaine kinase du récepteur,

bloquent la phosphorylation du domaine intracellulaire. Par rapport aux anticorps, ils ont l’avantage

d’avoir une meilleure biodisponibilité. Cependant, leur conception est compliquée à cause de la forte

homologie avec IR. Des TKI spécifiques d'IGF-1R ont tout de même été développés (Tableau 4).

Les études précliniques démontrent des effets antitumoraux convaincants pour une variété de cancers.

Novartis a conçu des TKI spécifiques: les pyrrolopyrimidines NVP-AEW541 et NVP-ADW742. In

vivo, NVP-AEW541 inhibe la signalisation d’IGF-1R dans des xénogreffes tumorales, et réduit

significativement la croissance de fibrosarcomes (135) et des tumeurs pancréatiques orthotopiques

(136). In vivo, l’activité de NVP-ADW742 a été démontrée pour des lignées de myélomes

chimiorésistantes (137). Un autre inhibiteur, PQIP, avec une prise orale quotidienne, montre une

efficacité antitumorale robuste dans des xénogreffes de cancer colorectal humain (138). XL228

(Exelixis) est actuellement en essais cliniques. Des activités ont été observées pour quelques patients

atteints de leucémie. Les effets toxiques rapportés sont syncope et hyperglycémie. Au contraire des

anticorps, les inhibiteurs de tyrosine kinase, de petites molécules, peuvent passer la barrière hémato-

encéphalique. L'inquiétude avec les TKI est qu'ils puissent inhiber le système IGF dans le cerveau, où

il a un rôle neuroprotecteur (132).

Tableau 4: Structure des TKI cités

Nom de la molécule PQIP NVP-AEW541 NVP-ADW742

Structure chimique de la

molécule


IGF-1R

54

3) Oligonucléotides thérapeutiques

(a) Stratégies antisens

La stratégie antisens est aussi utilisée pour inhiber IGF-1R avec des résultats précliniques intéressants.

Des réductions de l’expression du récepteur et de la croissance tumorale ont été observées in vivo

(Tableau 5).

Des études ont été réalisées avec des siRNA ciblant IGF-1R. Dong et al transfectent dans des cellules

humaines du cancer du poumon un plasmide exprimant un siRNA dirigé contre IGF-1R (139). Cela

conduit à une forte diminution du récepteur ainsi qu'à une activation de l'apoptose. Enfin, des

injections intratumorales du plasmide réussissent à faire régresser des tumeurs préétablies dans des

souris athymiques. D'autres études décrivent un siRNA efficace pour inhiber la survie cellulaire dans

les cellules du cancer de la prostate ou de mélanomes humains même lorsque celles-ci exhibent une

suractivation d’AKT (129, 130).

Les phosphorothioates montrent aussi des effets antitumoraux. Il a été décrit des phosphorothioates

induisant l’apoptose et augmentant la chimiosensibilité dans des cellules tumorales atypiques du

système nerveux central (140). Des oligonucléotides gapmères modifiés aux extrémités par des résidus

2'-O-(2-méthoxy)-éthyl réussirent à induire une dégradation de l'ARNm d'IGF-1R et à ralentir la

progression de xénogreffes de cellules de cancer de la prostate résistant à la castration (141). Enfin des

essais cliniques montrent qu'un traitement ex vivo d'un phosphorothioate anti-IGF-1R sur des cellules

humaines de gliome autologue induit une mort massive des cellules tumorales. A l'exception de

thrombose, le traitement est bien toléré et huit patients sur douze montrent des améliorations cliniques

transitoires (104).

Cependant, comme expliqué précédemment (cf Problèmes de spécificité, p22), d'importants problèmes

de spécificité sont décrits lorsqu'on utilise les siRNA et les phosporothioates in vivo. Leurs cibles

secondaires sont en général nombreuses et une activation du système immunitaire est souvent

observée avec ces traitements. Fogarty et al utilisent des oligonucléotides phosphorothioates

propynylés dirigés contre l’ARNm d’IGF-1R à une concentration catalytique de 10 nM (142). Par un

mécanisme faisant intervenir la RNase H, l’ARNm d’IGF-1R est dégradé. On observe une diminution

du taux de récepteur et une inhibition de la croissance cellulaire de kératinocytes humains. Cependant,

un à deux mésappariements au centre de l'ON n’affectent que modestement l’efficacité. Cette étude est

un exemple de la difficulté qu’il y a à être spécifique avec des agents antisens. L’affinité est

importante pour une bonne activité mais augmente aussi les problèmes de spécificité.


IGF-1R

55

(b) ARN antisens

Les ARN antisens thérapeutiques sont de longs ARN de plusieurs centaines de bases exprimés à partir

d'une construction plasmidique et complémentaires d'un ARN cible. En s'hybridant à leurs cibles ils

inhibent leurs traductions. Des ARN antisens dirigés contre IGF-1R ont été étudiés par Chernicky et al

(143). Ils montrent une efficacité in vivo dans les tumeurs mammaires : l’injection de l’antisens dans

des souris athymiques conduit à un retard de formation des tumeurs et à une réduction importante de

leurs tailles. Nakamura et al ont aussi observé qu’un ARN antisens peut inverser le phénotype

transformé de lignées cancéreuses cervicales humaines et inhiber fortement la tumorigenèse dans les

souris athymiques (144).

(c) Triplex-forming oligonuceotides (TFO)

Dans notre laboratoire, la stratégie antigène a aussi été exploitée pour inhiber IGF-1R. Des

oligonucléotides formant une triple hélice avec l'ADN double brin ont été couplés avec la

camptothécine, inhibiteur de la topoisomérase 1. Lors de la transcription, des hélicases ouvrent et

déroulent l'ADN créant des supertours d'ADN double brin. La topoisomérase 1 intervient alors pour

relâcher l'ADN en coupant transitoirement un brin puis en le religant après rotation de celui-ci autour

du brin intact. La camptothécine empêche la ligation et entraîne donc des coupures stables et une

inhibition de la transcription. Seule, la camptotécine induit tellement de coupures que la cellule est

incapable de les réparer et meurt. Le couplage à un TFO permet de couper spécifiquement un gène

donné, en l'occurrence IGF-1R (145). Lorsque la transcription d'IGF-1R débute, la topisomérase est

recrutée, sa capacité à religuer est inhibée et une coupure génomique apparaît interrompant la

transcription. La coupure est ensuite réparée par la cellule.


IGF-1R

56

Tableau 5 : Récapitulatif des études inhibant IGF-1R par des stratégies antisens

Type

d'antisens Type de cancer Résultats in vitro Résultats in vivo Références

shRNA

Poumons

humains:

lignée A549

Activation de l'apoptose

Inhibition de la croissance

cellulaire

Injections

intratumorales du

plasmide : régression

des tumeurs pré-

établies dans les souris

athymiques

(139)

siRNA

Prostates

humaines:

DU145, PC3,

LNCaP

Augmentation de la

sensibilité à des agents

endommageant l'ADN

(129)

siRNA Mélanomes

humains

Inhibition de la survie

Augmentation de deux fois

de la sensibilité à la

temozolomide et au

cisplatine

(130)

Phosphorothio

ate

Tumeur

teratoïde/rhabdoïd

e atypique du

système nerveux

central

Induction de l'apoptose

Sensibilisation à la

doxorubicine et au cisplatine

(140)

Gapmère

Phosphorothio

ate/2'-O-

méthyl

(20-mères)

Prostate humaine:

lignées PC3 et

LNCaP

Activation de l'apoptose

Inhibition de la croissance

cellulaire

Injections

intrapéritonéales:

- Suppression de la

croissance des

xénogreffes PC3

pré-établies

- Retard de la

progression des

xénogreffes de

LNCaP

(141)

Phosphorothio

ate (18-mères)

Gliomes

autologues

humains

Améliorations

cliniques pour 8

patients sur 12 dont 3

cas de régression

tumorale

(104)


IGF-1R

57

4) Dominants négatifs

Une mutation conférant un phénotype dominant négatif conduit à une perte de fonction. Elle peut

inactiver un domaine d'activité enzymatique ou engendrer un codon stop prématuré. La fonction

biologique du dominant est alors bloquée mais il empêche aussi la protéine fonctionnelle de remplir

son rôle. Par exemple, un dominant négatif de facteur de transcription, dont le domaine d'activation est

altéré et le domaine de liaison à l'ADN conservé, empêchera la protéine sauvage de se lier à son site

génomique. Cela conduit alors à une diminution du taux d'activation du gène. Dans le cas de protéines

qui fonctionnent en dimère, une mutation inactivant le domaine fonctionnel engendre un phénotype

dominant négatif s'il reste capable de se dimériser. Le dimère hybride sera alors non fonctionnel. Dans

le cas de récepteur transmembranaire tel qu'IGF-1R, le dominant négatif conservera sa capacité à se

lier au ligand mais ne pourra plus transmettre le signal intracellulaire. L'effet est double: la quantité de

ligand disponible diminue ainsi que le nombre de récepteur fonctionnel (Figure 16).

L’utilisation de dominants négatifs d'IGF-1R est une stratégie thérapeutique qui montre des résultats in

vivo (Tableau 6). Des récepteurs IGF-1R tronqués, et longs de 482 ou 950 acides aminés sont clonés

dans des adénovirus recombinants et injectés dans des tumeurs. Ils sont capables de supprimer la

tumorigenèse et d’augmenter l’apoptose induite par stress dans des cellules cancéreuses humaines

gastriques et pancréatiques (146, 147). L’injection intratumorale de l’adénovirus contenant le

dominant négatif 482-Stop montre aussi une capacité à supprimer de manière significative la

croissance des xénogreffes de cancer de poumon (148).

Des cellules cancéreuses du colon qui expriment des récepteurs IGF-1R sans domaine tyrosine kinase

ont été injectées dans des souris athymiques et induisent une diminution de la croissance tumorale, une

augmentation de l’apoptose et une suppression des métastases (149).

Le dominant négatif 486-Stop conduit à une apoptose massive des cellules tumorales et une inhibition

des métastases dans les souris athymiques pour diverses lignées prostatiques humaines, une lignée de

carcinome du colon et d’adénocarcinome des ovaires. Un effet secondaire (bystander) est révélé

lorsqu’on coinjecte des cellules cancéreuses sauvages avec des cellules cancéreuses exprimant ce

dominant négatif. Les 486 premiers acides aminés étant extracellulaires, ce dominant négatif est

soluble. Il est sécrété par les cellules et peut avoir un effet antitumoral sur les cellules avoisinantes en

étant capable de se lier à IGF-1 et en diminuant ainsi la quantité de ligand disponible (150). Ce même

dominant négatif inhibe aussi le développement de métastases de cellules cancéreuses du sein (119).


IGF-1R

58

Le dominant négatif 933-Stop qui constitue tout le domaine extracellulaire soluble du récepteur est

aussi sécrété et neutralise les effets d’IGF-1. In vivo, on observe une importante réduction des

métastases et une augmentation du taux de survie atteignant les 90% (151).

Cependant, d'un point de vue thérapeutique, cette approche est limitée par la vectorisation du gène

exprimant le dominant négatif et par la stabilité de son expression. Au contraire des rétrovirus, les

vecteurs adénoviraux sont incapables d'intégrer le génome, ce qui est un avantage en termes de

sécurité mais ne permet pas d'avoir des effets à long terme. De plus, ils sont bien connus pour avoir

des effets immunogènes et proinflammatoires. Afin d’augmenter l’efficacité des adénovirus et de

diminuer les risques de cancer liés aux rétrovirus, des vecteurs de type "adeno-associated virus" ont

été construits. Ils intègrent le gène toujours au même endroit sur une zone inoffensive du chromosome

19 de notre génome. Cependant, l’utilisation de ces vecteurs reste controversée et des améliorations

sont encore à apporter (152). Cela explique peut-être qu'aucune étude clinique n'ait encore été réalisée

avec cette stratégie.

Figure 16: Schéma de dominants négatifs d’IGF-1R

Deux types de dominants négatifs ont été étudiés pour IGF-1R : les dominants solubles et les

transmembranaires manquant de leur domaine kinase. Tous deux sont capables de lier le ligand sans

transmettre de signal intracellulaire. Ils agissent comme des inhibiteurs compétitifs.


IGF-1R

59

Tableau 6: Récapitulatifs des études sur les dominants négatifs d'IGF-1R

Type de

dominant

négatif

Type de

cancer

Résultats in

vitro Résultats in vivo Références

482 STOP

(soluble) et

950 STOP

(transmembra

naire)

Pancréas

humain

Cancer

gastrique

humain

Suppression de

la

tumorigénicité

pour les deux

dominants

Injection intratumorale d'adénovirus

exprimant le dominant 482 STOP

dans la souris:

- Augmentation de la survie des souris

- Diminution de la formation des

métastases

- Associée à une chimiothérapie,

réduction importante du volume des

tumeurs

(146, 147)

482 STOP

(soluble) et

950 STOP

(transmembra

naire)

Poumon

humain

Blocage de

l'activation par

IGF-1de la voie

AKT

Injection intratumorale d'adénovirus

exprimant le dominant 482 STOP:

Suppression significative de la croissance

de la tumeur

(148)

Dominant

manquant du

domaine

kinase

Colon

humain:

lignée

KM12L4

Injections de cellules exprimant ce

dominant dans les souris athymiques:

Diminution de la croissance et de la

formation de métastase du foie

(149)

486 STOP

(soluble)

Prostates

humaines:

lignées

DU145,

LNCaP

Carcinome

de colon

(HCT116) et

de poumon

(Calu-6)

Inhibition de la

transformation

Diminution de la croissance tumorale pour

des xénogreffes exprimant le dominant

négatif

Coinjection de ces mêmes cellules avec la

lignée sauvage entraîne une inhibition de

croissance de la lignée sauvage

(150)

486 STOP

(soluble)

Métastase de

cancer du

sein: MDA-

MB-435

Inhibition la

transformation

et l'invasion

Sensibilisation

au taxol

Croissance en

monocouche

non affectée

Injection de cellules exprimant le dominant

dans la xénogreffe sauvage:

- Pas de diminution de la croissance

- Inhibition de la formation de métastases

(119)

933 STOP

(soluble)

Carcinome

murin du

poumon

hautement

métastasique:

lignée H-59

Inhibition de la

survie, de

l'invasion et de

la prolifération

Xénogreffes de cellules exprimant ce

dominant:

- Diminution de la formation de tumeur

et de la croissance tumorale

- Réduction de 90% de l'incidence des

métastases hépatiques

(151)

Objectifs de la thèse

60


I. Contexte

Les acides nucléiques et leurs analogues synthétiques sont capables de réguler l’expression des gènes

avec spécificité de séquence, en induisant une dégradation enzymatique de l’ARNm ou par blocage

stérique de diverses machineries cellulaires. Les Peptides Nucleic Acids (PNA) sont des analogues

d'acide nucléique qui s'hybrident par complémentarité de base à l'ADN ou l'ARN. Ils ont une forte

affinité pour les acides nucléiques et une grande spécificité de séquence. Ils agissent comme des

bloqueurs stériques et sont capables par exemple d’inhiber la transcription, de corriger de mauvais

épissages ou d’empêcher l'initiation de la traduction.

Les analogues de type bloqueur stérique, en ciblant l’ARN, peuvent empêcher un complexe protéique

de reconnaître sa cible. La région d’initiation de la traduction est par exemple une cible efficace pour

inhiber la synthèse protéique. Cependant, il est plus difficile de résister à la forte activité hélicase du

ribosome qui désapparie des acides nucléiques doubles brins lors de l’élongation de la traduction (78).

Dans des systèmes acellulaires, plusieurs séquences de PNA ont été capables d'arrêter la machinerie

ribosomale lors de l'élongation, en s'hybridant à des régions codantes polypurines complémentaires

(77). Ces PNA polypyrimidiques forment avec l’ARNm des structures triplex de type

PNA:ARN:PNA. Ces triplex sont possibles grâce à la formation de liaisons Hoogsteen qui permettent

à un deuxième brin de PNA de se lier au duplex ARN:PNA. Ces liaisons ne permettent de former que

des triplets T:A:T et C+:G:C, d'où la nécessité des PNA d'être riches en pyrimidines. D'autres PNA,

riches en pyrimidines et formant avec l’ARNm des triplex partiels, réussissent à bloquer l'élongation

de la traduction et à entraîner l'apparition de protéines tronquées (79-81). Enfin, il a été décrit par mon

équipe un PNA ne formant apparemment pas de triplex mais arrêtant malgré tout l’élongation de la

traduction de l’intégrase du VIH-1. Il apparait que le PNA n’a pas nécessairement besoin d’être

polypyrimidique pour être efficace, ce qui est avantageux car cela élargit les cibles potentielles.

Cependant, on ne connaît pas encore bien toutes les règles pour prédire l’efficacité d’un PNA. De plus,

aucune étude cellulaire sur l’arrêt de l’élongation de la traduction n'a été publiée avec des PNA

formant des triplex.

Le récepteur à l'Insulin-like Growth Factor de type 1 (IGF-1R) est un récepteur hétérodimère aux

effets antiapoptotiques et mitogéniques. Il est surexprimé dans de nombreux cancers et est une cible

thérapeutique largement étudiée. L’inhibition de ce récepteur a pour effet de faire régresser des


61

tumeurs pré-établies et d'inhiber la croissance tumorale (139, 141). Plusieurs dominants négatifs de ce

récepteur ont été étudiés. L'injection d'adénovirus exprimant ces dominants entraîne une diminution de

la croissance tumorale et de la formation de métastases (147, 149).

II. Objectifs

Le projet de cette thèse est d'arrêter l'élongation de la traduction d'IGF-1R dans des cellules

cancéreuses humaines et d'étudier les effets biologiques de l'inhibition d'IGF-1R. L'arrêt de

l'élongation de la traduction doit d'une part diminuer la quantité de récepteur et d'autre part engendrer

une chaîne polypeptidique tronquée qui peut agir comme un dominant négatif. Cette étude permettrait

donc de valider cette approche antisens dans les cellules et de développer une nouvelle stratégie pour

inhiber l'activité d'IGF-1R.

III. Plan d’action

Pour arrêter l’élongation de la traduction, nous avons exploité la capacité des PNA riches en

pyrimidines à former des structures triplex résistantes à l’activité hélicase du ribosome. La première

étape fut donc de cribler dans un système acellulaire des PNA riches en pyrimidines et ciblant la

région codante de l’ARNm d’IGF-1R. Les PNA efficaces génèrent des protéines tronquées dans des

systèmes de traduction in vitro. Des études thermodynamiques ont permis de faire un lien entre

efficacité et propriétés physico-chimiques des complexes formés entre le PNA et l’ARN.

On s’est ensuite orienté vers des études cellulaires pour montrer l’efficacité de cette stratégie dans les

cellules. De fortes inhibitions de la traduction d’IGF-1R ont pu être induites par le PNA sélectionné in

vitro. Bien qu’aucune protéine tronquée n’ait été détectée, il a été montré que le PNA agissait bien au

niveau traductionnel. De plus, des effets biologiques ont pu être observés. On a montré que la

diminution de l’expression du récepteur est bien corrélée à une inhibition de l’activation de ses voies

de signalisation en aval et à l’inhibition de la transformation des cellules de cancer de prostate.

Chapitre II :

Résultats

A. Arrêt de l’élongation de la traduction d’IGF-1R

dans un système acellulaire

B. Inhibition d’IGF-1R dans les cellules

et ses effets biologiques

Résultats

Système acellulaire

65

A. Arrêt de l’élongation de la traduction

d’IGF-1R dans un système acellulaire

Le projet principal de cette thèse est de montrer que l’arrêt de l’élongation de la traduction est une

stratégie antisens réalisable dans les cellules. La cible choisie pour ce travail est le récepteur IGF-1R,

une cible thérapeutique largement étudiée pour les thérapies anticancéreuses. L’objectif est donc

d'arrêter l'élongation de la traduction d'IGF-1R dans des cellules cancéreuses humaines et d'étudier les

effets biologiques de l'inhibition d'IGF-1R.

La littérature indique que dans les systèmes acellulaires, les PNA riches en pyrimidines et formant des

triplex PNA2:ARN partiels sont efficaces pour arrêter l’élongation de la traduction (80). La formation

de triplex canoniques n’est donc pas indispensable, ce qui est un avantage car les séquences

polypurines suffisamment longues sur l’ARNm sont rares. Notre équipe a aussi montré qu’un PNA

riche en cytosine, qui ne semble pas former de triplex avec l’ARNm, arrête l’élongation de la

traduction (81). Ce PNA cible la séquence hautement conservée polypurine tract (PPT) de l’ARNm de

l’intégrase du VIH-1, et la protéine tronquée résultante est produite en très grande quantité in vitro. On

peut se demander si ce dernier PNA ne forme pas avec l’ARNm de l’intégrase une autre structure

complexe que le ribosome serait incapable de défaire. Nous avons donc choisi d’utiliser des PNA

riches en pyrimidines pour tenter d’arrêter l’élongation de la traduction, mais en gardant une certaine

réserve sur la nécessité de former une structure triplex.

Les travaux précédents ont porté sur les cibles Ha-ras, l’acétyltransférase chloramphénicol et

l’intégrase du VIH-1, des ARNm de 567, 657 et 956 bases respectivement. L’ARNm d’IGF-1R

contient environ 4100 bases et il est possible que cette grande taille influe sur l’efficacité de la

stratégie.

Avant de passer aux études cellulaires, un criblage de PNA très riches en pyrimidines ciblant l’ARNm

d’IGF-1R doit donc au préalable être fait afin de :

- Valider l’approche sur un ARNm de grande taille in vitro

- Etudier la relation entre les propriétés thermodynamiques des PNA et leurs efficacités.

- Sélectionner un PNA efficace in vitro pour passer aux études cellulaires

Résultats


66

I. Séquences des PNA

1) Choix des PNA

La première étape fut de sélectionner des séquences cibles sur la région codante d’IGF-1R. Les règles

permettant de concevoir des séquences susceptibles de former un triplex partiel n’étant pas bien

définies, nous avons criblé des séquences très riches en pyrimidines de composition diverses. Nous

voulons ensuite étudier le lien entre séquence et efficacité grâce à notre criblage.

Comme un de nos objectifs était de produire un dominant négatif, nous voulions nous assurer que la

chaîne polypeptidique engendrée par l’arrêt de l’élongation serait d’une taille lui permettant de remplir

ce rôle. Le dominant négatif doit pouvoir à la fois se lier au ligand IGF-1 et ne plus transmettre le

signal intracellulaire. Nous nous sommes basés sur les études de dominants négatifs d’IGF-1R déjà

réalisées. Le plus court dominant trouvé contient les 482 premiers acides aminés (146) et le plus long

s’arrête avant le domaine kinase (avant la tyrosine Y1131) (149). Nos séquences cibles ont donc été

choisies sur cet intervalle (Figure 17A).

Pour rechercher ces séquences, le logiciel DNA Pattern a été utilisé sur le site

http://www.bi.up.ac.za/rsa-tools//RSAT_home.cgi. Les motifs recherchés sur l’ADN complémentaire

d’IGF-1R étaient de 14 purines avec deux substitutions possibles. A partir de cette méthode, nous

avons choisi des séquences cibles longues de 17 bases afin que chacune ait une chance d’être unique

sur le transcriptome. Les séquences 476, 692, 883 et 959 ont pu ainsi être choisies. Les trois autres

séquences ont été sélectionnées directement. Le PNA 926 a été choisie car il est très riche en thymine ;

le PNA 968 pour sa richesse en cytosine ; le PNA 558 pour son nombre égal de thymine et de cytosine

(Tableau 7).

Les séquences de PNA sont orientées en antiparallèle par rapport à l’ARNm car c’est l’orientation la

plus stable pour les duplex ARN:PNA (80). L’orientation antiparallèle correspond à l’hybridation de

l’extrémité 5’ de l’ARN avec l’extrémité C-terminale du PNA (Figure 17B). Enfin, une lysine est

ajoutée en C-terminal de chaque séquence de PNA afin d’augmenter la solubilité de cette molécule

neutre.

Résultats


67

Tableau 7: Séquences des PNA

PNA Séquence (N vers C) Composition Position sur IGF-1R

476 TTGTTCCTGGTGTTTAT T10C2G4A1 Chaîne

558 GGCTCCACGTCCTTGTT T6C6G4A1 Chaîne

692 CCCTTTCTCCCCACCAC T4C11G0A2 Chaîne

883 ATACTTCCTGTATTCCT T8C5G1A3 Chaîne extracellulaire

926 TTTTCATATCCTGTTTT T11C3G1A2 Chaîne extracellulaire

959 TTATTTCTCTTTCTATG T11C3G1A2 Chaîne intracellulaire

968 TACAGCACTCCATTCCC T4C8G1A4 Chaîne intracellulaire

Le numéro attribué à chaque PNA correspond au nombre de codons en amont de la séquence cible

(peptide signal compris). Les PNA sont annotés de l’extrémité N-terminale vers la C-terminale. La

position correspond à la sous-unité d’IGF-1R à laquelle appartient la séquence cible.

A

B

Figure 17: L'agent thérapeutique et sa cible IGF-1R

A/ Schéma de la structure de la cible IGF-1R, un hétérotétramère constitué de deux chaînes

extracellulaires et de deux chaînes transmembranaires. Les chaînes reconnaissent le ligand

IGF-1 tandis que les chaînes intracellulaires transmettent le signal grâce au domaine tyrosine

kinase (en noir). B/ Schéma de la structure chimique d’une molécule de PNA. La molécule est

constituée d’une chaîne pseudopeptidique sur laquelle sont greffées des nucléobases. Le PNA est

très affin pour les acides nucléiques et résiste aux dégradations enzymatiques.

Résultats


68

2) Unicité sur le transcriptome

Des PNA tridécamères (13 résidus) se sont déjà montrés efficaces pour arrêter l’élongation de la

traduction (71). La corrélation entre spécificité et taille des analogues d’acides nucléiques est difficile

à déterminer. Plus une séquence est longue, moins elle se répète dans le génome ou le transcriptome.

Cependant, plus elle est longue, plus elle a de cibles secondaires potentielles. En effet, des

mésappariements aux extrémités ne sont pas suffisamment déstabilisants pour empêcher la fixation du

PNA. Nous avons choisi des séquences de 17 bases afin que nos séquences soient uniques dans le

transcriptome.

Afin de vérifier l’unicité sur le transcriptome, nous avons effectué des alignements de séquences sur le

transcriptome humain en utilisant le logiciel Blast sur Ensembl. La recherche s’est faite sur la base de

données «cDNA_ALL », répertoriant tous les ADNs complémentaires connus du génome humain, et

avec la sensibilité « exact match ». Les PNA peuvent se lier de manière antiparallèle à un ARN et avec

une plus faible affinité de manière parallèle. La recherche a donc été faite pour ces deux orientations

(Tableau 8).

Tableau 8 : Résultats des alignements de séquences sur le transcriptome humain

PNA

Cibles en antiparallèle Cibles en parallèle

17/ 17 bases 16/17 bases contiguës 17/ 17 bases

476 IGF-1R aucune aucune


692 IGF-1R CENPP (protéine du

centromère) aucune

883 IGF-1R Rho-related BTB domain

containing 3

Chromosome 9 open reading

frame 35

926 IGF-1R

- Chromosome 7 open reading

frame 44

- RCBTB2 : régulateur de

condensation de chromosome

aucune


968 IGF-1R Thrombospondine type 1

domain containing 1 aucune

Résultats


69

L’unicité des séquences est validée pour tous les PNA en antiparallèle et en parallèle (exceptée pour la

séquence 883 qui, en parallèle, se retrouve complémentaire de l’ARNm de l’Open Reading Frame 35

sur le chromosome 9). Avec un mésappariement aux extrémités, on trouve peu de cibles secondaires et

seulement pour certaines séquences. Cependant, à partir de 15/17 bases contiguës, on trouve des cibles

pour chaque PNA. La longueur choisie pour les PNA est donc une longueur adéquate pour l’unicité de

séquence sur le transcriptome. Malheureusement, on peut s’attendre à ce que les PNA se fixent sur 15

bases contiguës car il est probable que deux mésappariements aux extrémités ne soient pas assez

déstabilisants pour cette molécule si affine pour l’ARN.

3) Interactions intramoléculaires ou intermoléculaires

Les oligonucléotides simples brins sont capables de faire des structures stables telles que des structures

en épingle à cheveux ou des G-quadruplex. Il est intéressant de savoir si ces PNA ont une structure

secondaire qui pourrait diminuer leur interaction avec la cible. Des interactions intramoléculaires ou

intermoléculaires ont donc été recherchées pour chaque PNA. Leur petite taille diminue les possibilités

d’interactions et rend les modélisations fiables.

Sur http://www.bioinformatics.org/sms2/pcr_primer_stats.html, le logiciel PCR Primer Stats permet

d’analyser de courtes séquences afin d’évaluer leurs potentiels en tant qu’amorces de PCR. Il a été

utilisé pour calculer d’éventuelles structures pour nos PNA. Il en résulte qu’aucun ne forme de pince

GC, de boucle en épingle à cheveux ou d’autoassemblage, sauf le PNA 883 qui est capable de former :

ATACTTCCTGTATTCCT

|||| |||| entre deux PNA 883 et, TCCTTATGTCCTTCATA

ATACTT

|||| C une structure en épingle à cheveux TCCTTATGT

Si ces structures sont assez stables, on peut imaginer que le PNA 883 se comporte comme un aptamère

et/ou que son efficacité en tant que bloqueur stérique soit compromise.

Résultats


70

II. Criblage par traduction in vitro

Afin de cribler les différentes séquences de PNA pour l’arrêt de l’élongation de la traduction, nous

avons réalisé des expériences de traduction de l’ARNm d’IGF-1R in vitro.

1) Méthode de criblage

Avant de pouvoir faire des traductions, il faut obtenir l’ARNm. Pour cela, il a d’abord fallu construire

un plasmide contenant l’ADN complémentaire du gène Igf-1r en aval d’un promoteur d’ARN

polymérase de phage, permettant la transcription in vitro (cf Matériels et Méthodes, p142). Le

plasmide doit être digéré à la fin du gène pour arrêter la transcription car aucun signal d’arrêt n’est

présent. Les rendements de transcription sont d’environ 12 µg de transcrit à partir d’1 µg d’ADN. Ceci

est peu mais s’explique par le fait que l’ADNc est très long (4.1 kb). Les ARN sont purifiés de telle

sorte à éliminer la polymérase, des nucléotides dNTP, et des ARN inférieurs à 1 kb issus d’une

dégradation ou d’une transcription interrompue.

Le transcrit est ensuite traduit dans du lysat de réticulocyte de lapin. Le lysat de réticulocyte de lapin

est un système de traduction acellulaire permettant la synthèse protéique in vitro à partir d’ARN

eucaryote. Les extraits contiennent donc les composants macromoléculaires de la traduction : des

ribosomes 80S, des ARN de transfert, des synthétases aminoacyl-ARNt, des facteurs d’initiation,

d’élongation et de terminaison… La traduction se fait en présence de méthionine-35

S qui permet de

radiomarquer les protéines synthétisées. Le lysat est ajouté au PNA et à l’ARNm. La traduction se fait

à 37°C pendant 20 minutes et le produit de traduction est analysé sur un gel SDS-PAGE permettant de

séparer et d’observer le précurseur IGF-1R (155 kDa) et la protéine tronquée attendue (Tableau 9). La

révélation du radiomarquage au 35

S permet d’observer l’effet des PNA sur la traduction.

Tableau 9: Masses des protéines tronquées attendues

PNA 476 558 692 883 926 959 968

Masse (kDa) 50 65 80 100 105 110 110

La masse est évaluée en considérant que le poids moyen d’un acide aminé est de 113 Da.

Résultats


71

2) Une protéine tronquée avec le PNA 959

La traduction d’IGF-1R conduit à la synthèse du précurseur du récepteur, c’est-à-dire à sa forme sans

modifications post-traductionnelles. Celui-ci a une masse de 155 kDa. Des protéines plus petites

peuvent être observées sur les gels (puits sans PNA des Figure 18 et Figure 19). Elles peuvent

correspondre à des traductions commençant à d’autres codons AUG et/ou à des arrêts précoces de la

traduction. Les expériences de traduction sont faites sur des ARNm non dénaturés. Sur un si long

transcrit, on peut supposer que les ribosomes soient parfois stoppés au niveau de régions structurées de

l’ARNm. La dégradation de protéines ou de transcrits semble être une explication moins plausible car

la synthèse de ces protéines est reproductible.

Le PNA 959, tout en inhibant de manière dose-croissante la traduction, induit la production d’une

protéine tronquée (Figure 18 et Figure 19D). Le phosphodiester (PO) de même séquence que le PNA

959 a été utilisé en présence de ribonucléase H (RNase H) lors des traductions. Le PO s’hybride à la

séquence cible et l’ARN hybridé est hydrolysé par la RNase H. Ceci génère ainsi un ARN tronqué

dont la traduction conduit à la synthèse d’une protéine de même taille que la protéine tronquée issue de

l’arrêt de l’élongation de la traduction.

Figure 18: Traductions in vitro d'IGF-1R en présence de PNA 959

L’ARNm d’IGF-1R est mélangé avec des concentrations croissantes en PNA 959 ou avec 0.25 µM de

PO 959. Les traductions sont ensuite réalisées dans du lysat de réticulocyte de lapin en présence de

méthionines marquées au 35

S. La RNase H est ajoutée au lysat contenant le PO dans le but de couper

spécifiquement l’ARNm. Les produits de traduction sont séparés sur un gel SDS-PAGE puis les

protéines sont révélées par autoradiographie.

Résultats


72

Pour les PNA 476, 558, 692 et 926, on observe des inhibitions dose-croissantes de la traduction mais

aucune protéine tronquée n’apparaît aux masses attendues ou à d’autres masses (Figure 19A, B, C,

D). Pour le PNA 883, on observe d’abord une inhibition puis une légère exaltation de la traduction à

0.9 µM. Le PNA 968 induit lui aussi une exaltation et celle-ci est beaucoup plus forte. Aucun des deux

ne génère de protéines tronquées (Figure 19E).

A B C

E

D

Figure 19: Traductions in vitro en

présence de PNAs

L’ARNm d’IGF-1R est mélangé avec des

concentrations croissantes en PNA. Les

traductions sont ensuite réalisées dans du

lysat de réticulocyte de lapin en présence

de méthionines marquées au 35

S. Les

produits de traduction sont séparés sur un

gel SDS-PAGE, puis les protéines sont

révélées par autoradiographie. Les PNAs

ont été utilisés à des concentrations

comprises entre 0.1 et 1 µM,

concentrations calculées dans le volume

final de traduction.

Résultats


73

3) Des inhibitions de la traduction non spécifiques

Dans les cas où une inhibition n’est pas accompagnée d’une protéine tronquée, des contrôles de

spécificité s’imposent pour vérifier si ces inhibitions de la traduction sont spécifiques de la séquence.

Deux types de contrôle de séquence sont possibles :

- en utilisant un PNA contrôle ne ciblant pas IGF-1R

- en utilisant un ARN différent

Un PNA contrôle ciblant le récepteur à l’insuline humain a été choisi. Ce PNA HIR riche en

pyrimidine, de séquence N-terminal vers C-terminal TTCTCTCCTGGCGCCCC-lysine, n’a pas de

cible sur la séquence d’IGF-1R. Des traductions in vitro d’IGF-1R ont été réalisées dans les mêmes

conditions qu’avec les autres PNA. Il en résulte que le PNA HIR inhibe la traduction de manière dose-

dépendante : une inhibition de 50% est mesurée à 0.25 et 0.5 µM et de 70% à 0.75 µM (Figure 20A).

L’ARN de la luciférase Photinus Pyralis, fourni par le kit de traduction, a été traduit en présence de

PNA 476 et 883. On observe des inhibitions dose-croissantes avec le PNA 476 atteignant 60% à 0.75

µM (Figure 20B) et une inhibition non dose-dépendante avec le PNA 883 (Figure 20C). Le profil

atypique du PNA 883 peut sûrement s’expliquer par sa capacité à faire des interactions intra et

intermoléculaires. Plus on augmente sa concentration, plus ces structures sont favorisées, et moins il se

fixe sur l’ARN. On peut aussi émettre l’hypothèse que ces structures agissent comme des aptamères et

inhibent ou exaltent la traduction.

La Figure 21 montre les courbes d’inhibitions d’IGF-1R avec les PNA 476, 558, 692 et 959 et les

contrôles précédemment cités. On remarque que même si les inhibitions avec les PNA ciblant IGF-1R

sont plus importantes, les inhibitions non spécifiques sont loin d’être négligeables. Tandis qu’à 0.75

µM on atteint facilement 70-80% d’inhibition avec les PNA spécifiques d’IGF-1R, on atteint 60-70%

d’inhibition avec les deux contrôles.

Tout ceci porte à croire que ces inhibitions ne sont pas spécifiques de la séquence des PNA. On peut

supposer que les PNA interagissent avec les ARN ribosomaux et ralentissent ainsi la traduction. De

telles inhibitions non spécifiques n’ont pas été observées dans les études précédentes (71, 80) et les

PNA y sont spécifiques jusqu’au moins 1 µM. La différence vient sûrement du fait que l’ARNm

utilisé est celui d’Ha-ras, ARN d’environ 600 bases. L’ARNm d’IGF-1R est presque 7 fois plus grand

et la luciférase (1650 bases soit 62 kb) 3 fois plus grande. Etant beaucoup plus longs, ils sont plus

difficiles à traduire et les interactions avec les ARN ribosomaux deviennent plus pénalisantes. D’autre

Résultats


74

part, les PNA utilisés dans cette étude possèdent 17 bases au lieu de 13 bases pour les études

précédentes, ce qui augmente les interactions possibles avec les ARN ribosomaux.

C

Figure 20: Tests de spécificité

A/ Le transcrit IGF-1R est traduit en présence du PNA HIR à des concentrations croissantes. B et C/

L’ARNm de la luciférease Photinus Pyralis est mélangé avec des concentrations croissantes en PNA

476 ou 883, puis traduit dans du lysat de réticulocyte de lapin.

A B

Résultats


75

Figure 21: Courbes d'inhibition de la traduction

Chaque graphe représente le taux d’expression du précurseur IGF-1R synthétisé ou de la luciférase

synthétisée en fonction de la concentration en PNA. Ces taux d’expression relatifs ont été calculés à

partir de la quantification de chaque gel de traduction. Pour le PNA 959 et 476, deux dose-réponses

indépendantes ont été quantifiées.

Résultats


76

4) Conclusion

Le PNA 959 est le seul à générer une protéine tronquée et dont on peut affirmer qu’il arrête

spécifiquement l’élongation de la traduction dans ce système acellulaire. Les autres PNA n’ont pas

donné de protéines tronquées et les inhibitions de traduction observées ne semblent pas spécifiques de

la séquence.

La question qui se pose est : quelles sont les propriétés du PNA 959 qui le rendent efficace ? On

observe que le PNA 959 comporte un bloc central de 11 pyrimidines riches en thymines. Il a donc de

fortes chances de former les liaisons Hoogsteen nécessaires à la formation d’un triplex PNA2:ARN

stable (Figure 22). Le PNA 926 a la même composition en bases mais ses thymines sont regroupées

aux extrémités et des purines sont présentes en son centre, ce qui est vraisemblablement défavorable

pour former un triplex. Le PNA 692 possède 90% de pyrimidines dont 65% de cytosines. Il est

envisageable que celui-ci forme un triplex. Cependant, dans les liaisons Hoogsteen, les cytosines

doivent être protonées (Figure 22), or leur pKa est inférieur au pH physiologique ce qui défavorise en

théorie les triplex avec des PNA riche en cytosines.

Par conséquent, il est intéressant de faire des études thermodynamiques pour caractériser les propriétés

de ces PNA et déterminer la nature et la stabilité des complexes qu’ils forment avec l’ARNm cible.

Figure 22: Liaisons Hoogsteen possibles entre un PNA et un duplex ARN:PNA

Le résidu pyrimidique du PNA s’hybride à la purine de l’ARN par des liaisons Watson-Crick

(liaisons horizontales) et par des liaisons Hoogsteen (liaisons verticales). La cytosine du deuxième

PNA doit être protonée pour permettre les liaisons Hoogsteen, ce qui nécessite un pH acide.

Résultats


77

III. Etudes thermodynamiques

Le PNA 959 est le seul parmi ces séquences riches en pyrimidines à arrêter l’élongation de la

traduction. Celui-ci est aussi le seul à contenir un large bloc central pyrimidique riche en thymines (8T

sur 11 bases). Des études thermodynamiques ont donc été réalisées dans le but de connaître les

caractéristiques des complexes formés entre les PNA et leurs ARN complémentaires et de confirmer

ou infirmer la nécessité du triplex.

1) Analyses spectroscopiques

Un changement conformationnel peut induire des variations des propriétés d’absorbance d’une

molécule. La dénaturation thermique d’un acide nucléique structuré peut s’accompagner d’un

hyperchromisme (augmentation de l’absorbance) ou d’un hypochromisme (diminution de

l’absorbance) selon la longueur d’onde choisie. Puisque l’empilement des bases fait décroître

l’absorption optique de la solution à 260 nm, l’hybridation d’un complexe PNA:ARN doit diminuer

l’absorbance à 260 nm. Les expériences de dénaturation thermique suivies par spectroscopie

d’absorbance permettent donc de mesurer la stabilité d’une structure en fonction de la température. Le

Tm est la température pour laquelle 50% des molécules sont désappariées ou dénaturées. Nous avons

eu recours à ces analyses spectroscopiques pour déterminer le Tm (température de fusion) des

complexes PNA:ARN.

Des courbes d’association et de dissociation ont été enregistrées entre chaque PNA et son ARN

complémentaire à pH 7. Les absorbances à 260 nm sont normalisées par rapport aux absorbances à

330 nm. A 330 nm, les absorbances sont très faibles et varient de manière monotone avec la

température. Cela permet d’éliminer de potentiels artéfacts. A l’exception du PNA 959, les courbes

d’association et de dissociation de chaque complexe se superposent et présentent une transition qui

marque le passage de la forme associée à dissociée (Figure 23). Ceci suggère la formation de duplex.

Ces transitions conduisent à des variations de l’absorbance à 260 nm de l’ordre de 0.1°C soit environ

20% de variation. La température de demi-transition Tm, qui correspond à la température pour laquelle

50% des molécules sont dénaturées, est déterminée graphiquement en traçant la médiane entre les

lignes de base à basse et haute températures. Elles sont de 68°C pour les PNA 883 et 926, de 78°C

pour les PNA 476 et 968, et de plus de 80°C pour les PNA 558 et 692 (Tableau 10). Pour ces deux

derniers, il n’est pas possible avec cette expérience de déterminer leurs Tm car on n’observe pas de

plateaux à forte températures.

Résultats


78

Ces Tm sont élevés puisque pour un ADN double brin de 17 bases l’ordre de grandeur du Tm est 50°C.

La différence de Tm observée entre les PNA peut s’expliquer par le pourcentage en GC des

oligomères. C’est en effet ceux les plus riches en GC qui forment les complexes les plus stables.

Le PNA 959 a un profil bien différent des autres puisque ses courbes d’association et de dissociation

ne se superposent pas : il y a un phénomène d’hystérésis (Figure 23). La courbe de dissociation ne

présente pas de transition, ce qui est certainement dû à une cinétique de dissociation du complexe trop

lente. Ici, il n’y a pas d’équilibre car la vitesse de chauffage est trop rapide et les facteurs cinétiques

viennent perturber l’étude thermodynamique. Pour réduire l’effet cinétique, on a fait varier la vitesse

de chauffage/refroidissement 0.5, 0.2 ou 0.1°C/min mais le profil des courbes ne change pas. Il

faudrait peut-être pouvoir diminuer d’avantage cette vitesse pour observer une transition de la courbe

de dissociation, mais cela est techniquement impossible. Selon Lacroix et al, les caractéristiques d’une

triple hélice classique sont : un phénomène d’hystérésis à pH neutre, un hypochromisme à 260 nm et

un hyperchromisme à 295 nm signalant la protonation de cytosines (153). La séquence 959 présente

les deux premières caractéristiques. Lors de ces mêmes analyses spectroscopiques, les absorbances à

295 nm ont été mesurées. On n’observe pas de variation significative de l’absorbance en fonction de la

température. Ceci suggére que les trois cytosines du PNA 959 ne sont pas protonées à pH neutre ou

que le signal de la protonation est trop faible. Notons aussi que l’absorbance à 295 nm ne montre pas

non plus de variations significatives avec les autres séquences.

L’ARN 692, riche en guanine se structure. L’analyse spectroscopique de cet ARN seul montre en effet

qu’une structure se forme. Une transition est observée pour les courbes d’association et de

dissociation. Les températures de demi-transition sont pour la courbe d’association et de dissociation

respectivement de 50 et 60°C, ce qui indique pour un ARN de 17 bases qu’une structure stable est en

jeu. Du fait de sa richesse en G (séquence : GTGGTGGGGAGAAAGGG), on peut émettre

l’hypothèse qu’il forme une structure en G-quadruplex. A 260 nm, la dénaturation d’un quadruplex ne

conduit pas à de grandes variations d’absorbance (154), or ici on observe bien une faible variation de

10% (0.04°C sur une moyenne de 0.4°C).

On note aussi que l’ARN 883 seul présente une transition. (Figure 23). On peut évaluer le Tm de la

structure formée à 40°C. On se rappelle que deux brins de PNA 883 sont capables de s’autoassocier et

qu’un brin peut former une boucle (cf Interactions intramoléculaires ou intermoléculaires p69), et il en

va donc de même pour l’ARN complémentaire. Ce profil reflète donc certainement ces interactions

intra et/ou intermoléculaires.

Résultats


79

Figure 23: Courbes d’association et de dissociation des complexes PNA:ARN

Les courbes correspondant aux PNA 476 à 959 sont les courbes d’association et de dissociation des

mélanges PNA et ARN complémentaires. Le mélange est fait dans un tampon contenant 100 mM de

KCl et 10 mM de cacodylate de sodium à pH 7. Pour les courbes des ARN 692 et 883, les solutions

étudiées ne contiennent que de l’ARN dans le tampon. On suit les variations d’absorbances à 260 nm

(normalisées par rapport aux absorbances à 330 nm) en fonction de la température. La vitesse de

chauffage/refroidissement est de 0.5°C/min.

Résultats


80

2) Gels retards

Les tests de mobilités électrophorétiques ou gels retards permettent de révéler les différentes espèces

interagissant avec un ARN ou un ADN. L’ARN radiomarqué est incubé avec des concentrations

croissantes en PNA dans un tampon Tris à pH 8.3. Le mélange est ensuite chargé sur un gel non-

dénaturant thermostaté à 25°C et contenant du tampon TBE à pH 8. La vitesse de migration des

différentes espèces varie suivant la taille, la charge et la forme des complexes. Ces espèces sont

ensuite révélées par autoradiographie. Cette technique a été utilisée pour corroborer l’hypothèse de la

formation d’une structure triplex pour la séquence 959.

Ces gels retards révèlent pour les mélanges ARN/PNA 476, 558, 883, 926 et 968 l’apparition d’un

complexe majoritaire dont l’intensité augmente avec la concentration en PNA et qui correspond

vraisemblablement au duplex (Figure 24).

Pour le PNA 476, des complexes minoritaires, C2 et C3 sur la Figure 24, sont visibles au-dessus du

duplex. Du fait de la richesse en thymine de ce PNA, il n’est pas impossible que des triplex partiels

puissent se former. Le gel retard du PNA 883 présente sous le complexe majoritaire des bandes plus

faibles. Il est possible que ces complexes correspondent à des conformères ne migrant pas à la même

vitesse. Le gel retard du PNA 926 révèle aussi qu’à fortes concentrations en PNA un complexe

migrant plus lentement apparaît. La formation d’une structure triplex n’est pas exclue. Ce PNA, de

même composition que le PNA 959, possède beaucoup de thymines mais celles-ci étant surtout

localisées aux extrémités, sa capacité à faire des triplex partiels stables est plus faible.

Les profils pour les séquences 692 et 959 sont différents puisque deux complexes majoritaires

apparaissent (Figure 25). A pH 8 en présence de PNA et de son ARN complémentaire, un complexe

est visible à faibles concentrations (< 10 nM pour la séquence 692 et < 20 nM pour 959), tandis qu’un

second complexe migrant moins vite apparaît à plus fortes concentrations jusqu’à ce que pratiquement

tout l’ARN soit impliqué dans ce complexe. Ces deuxièmes complexes pourraient être des triplex.

Pour former des liaisons Hoogsteen, les cytosines doivent être protonées, ce qui requiert un pH acide.

Des gels retard à pH 6 stabiliseraient donc ces seconds complexes s’ils étaient des triplex.

Pour le PNA 692, très riche en cytosines, on observe sur la Figure 25 un profil de gel retard à pH 6

(tampon MES) complexe. La Figure 26 illustre des structures qui pourraient être formées entre ce

PNA et son ARN complémentaire à pH acide. Par exemple, la Figure 26B montre une structure, dite

motif-i, faisant intervenir des liaisons entre une cytosine et une cytosine protonée. On peut imaginer

que plusieurs brins de PNA 692 puissent s’associer de la sorte, et qu’un ARN puisse s’y hybrider. Il

est difficile de conclure avec ces gels retards sur la nature du complexe formé à pH 8. Il est probable

que le complexe migrant le moins soit un triplex de type PNA2:ARN ou ARN2:PNA. Les cytosines

Résultats


81

non protonées, contrairement aux purines, ne sont pas déstabilisantes pour le troisième brin et peuvent

tout de même former une liaison Hoogsteen sur deux (Figure 22). La formation d’un triplex partiel

PNA2:ARN est donc possible. De plus, un triplex de type ARN2:PNA peut se former grâce aux

liaisons Hoogsteen de type G:G:C et A:A:T (Figure 8).

Par contre, pour le PNA 959, on observe bien que l’apparition du complexe à faible migration est

favorisée à pH 6. Tout l’ARN est impliqué dans ce complexe à 100 nM de PNA, alors qu’à pH 8 il en

fallait 200 nM. La protonation des trois cytosines du PNA 959 a donc une influence sur la formation

de ce complexe. Ces observations sont cohérentes avec la formation de triplex pour le PNA 959.

3) Gels dénaturants

La Figure 27 montre les gels dénaturants, contenant 7M d’urée. On observe que les complexes formés

avec les séquences 883 et 926 (Tm de 68°C) ne résistent pas à ces conditions dénaturantes, puisque les

complexes sont dissociés. En comparant les rapports d’intensité de la bande du complexe par rapport à

celle de l’ARN libre, on en déduit que les complexes formés avec les séquences 476 et 968 (Tm de

78°C) résistent moins bien que ceux formés avec les séquences 558 et 692 (Tm > 80°C). Il y a donc

une corrélation entre les Tm mesurés et les profils de gels dénaturants. Pour le PNA 959, on observe de

manière très intéressante, qu’à faibles concentrations, où seule la forme duplex est observée en gel

retard, le complexe est dénaturé. Plus la proportion du complexe migrant le moins vite augmente sur le

gel retard, et plus on observe que le complexe résiste aux conditions dénaturantes. En conclusion, le

duplex 959 aurait une stabilité inférieure aux duplex de Tm de 78°C, mais son triplex aurait une

stabilité correspondant à un Tm supérieur à 80°C.

Tableau 10 : Caractéristiques physicochimiques des complexes PNA:ARN

Oligomère Séquence Tm (°C) Gel retard

PNA 476 TTGTTCCTGGTGTTTAT 78 duplex

PNA 558 GGCTCCACGTCCTTGTT 80 duplex

PNA 696 CCCTTTCTCCCCACCAC >80 duplex+complexe

PNA 883 ATACTTCCTGTATTCCT 68 duplex

PNA 926 TTTTCATATCCTGTTTT 68 duplex

PNA 959 TTATTTCTCTTTCTATG Hystérésis duplex+triplex

PNA 968 TACAGCACTCCATTCCC 78 duplex

Résultats


82

Figure 24: Gels retards des complexes PNA:ARN

Les PNA sont mélangés avec leur ARN complémentaires radiomarqués (100 nM ou 750 nM pour

l’ARN 968) dans un tampon contenant 50 mM de Tris à pH 8.3. Les mélanges de concentrations

croissantes en PNA sont chargés sur gel non-dénaturant contenant du TBE. Les séquences des PNA

sont rappelées dans le tableau.

476 TTGTTCCTGGTGTTTAT

558 GGCTCCACGTCCTTGTT

883 ATACTTCCTGTATTCCT

926 TTTTCATATCCTGTTTT

968 TACAGCACTCCATTCCC

Résultats


83

PNA 692 : CCCTTTCTCCCCACCAC

PNA 959 : TTATTTCTCTTTCTATG

Figure 25: Influence du pH sur la formation des complexes 692 et 959

Les PNA sont mélangés avec leur ARN complémentaires radiomarqués (100 nM) dans un tampon

contenant 50 mM de Tris à pH 8.3 ou du tampon MES à pH 6. Les mélanges de concentrations

croissantes en PNA sont chargés sur gel non-dénaturant contenant du TBE à pH 8 ou du MES à pH 6.

Les séquences des PNA sont rappelées.

Résultats


84

A B

CAC

CGGTGGGGAGAAAGGG

AT

CG

CCCTTTCTCCC

GGGAAAGAGGGGTGGTG

CCCTTTCTCCCCACCAC

C

Figure 26: Structures possibles formées par la séquence 692 à pH acide

A/ Sur un duplex ARN:PNA, un deuxième brin de PNA 692 (en noir) peut former des liaisons

Hoogsteen avec l’ARN du duplex et des liaisons Watson-Crick avec un deuxième brin d’ARN 692 (en

bleu). B/ Schéma d’un motif-i issu du repliement d’un oligonucléotide riche en cytosine (représentées

par des triangles). Ce réarrangement est rendu possible à pH acide par la formation de liaisons entre

des cytosines et des cytosines protonées (C)(Images issues de (155))

Résultats


85

Figure 27: Gels dénaturants

Les PNA sont mélangés avec leur ARN complémentaires radiomarqués (100 nM) dans un tampon

contenant 50 mM de Tris à pH 8.3. Les mélanges de concentrations croissantes en PNA sont chargés

sur gel dénaturant contenant 7M d’urée.

Résultats


86

4) Conclusion

Ces études thermodynamiques suggèrent que les PNA contenant des purines en leurs centres forment

des duplex : les analyses spectroscopiques présentent un profil de duplex et les gels retards montrent

un complexe largement majoritaire pour chaque séquence. Le PNA 959 possède une séquence lui

permettant potentiellement de former de nombreuses liaisons Hoogsteen. Ses profils d’analyses

spectroscopiques et de gels retards sont compatibles avec la formation d’un triplex partiel impliquant

le bloc central pyrimidique. En effet, on observe :

- deux complexes en gel retard dont le plus lent devient unique à fortes concentrations, un profil

cohérent avec la formation de triplex,

- une dépendance au pH du complexe le plus lent, suggérant que la protonation des cytosines

favoriserait ce complexe,

- une hystérésis pour les courbes d’association et de dissociation des complexes ARN:PNA

caractéristique d’une triple hélice classique.

D’ordinaire, un PNA formant un triplex avec son ARN complémentaire donne des courbes

d’association à deux transitions. Le fait qu’on observe qu’une seule transition sur la courbe pourrait

signifier que la formation du triplex est si rapide à cette concentration qu’on ne distingue pas le duplex

du triplex.

Pour le PNA 692, les résultats sont moins clairs. On observe que:

- les cytosines ne sont pas protonées dans le complexe formé à pH 7, puisque les profils à 295

nm ne montrent pas d’hyperchromisme,

- le gel retard à pH 8 a un profil cohérent avec la formation d’un triplex à fortes concentrations,

- les analyses à 260 nm ne présentent qu’une transition et pas d’hystérésis.

L’explication que l’on pourrait tenter de donner est qu’à pH neutre il y a formation d’un triplex partiel

avec les thymines et les cytosines non protonées, ces dernières étant capables de former une des deux

liaisons Hoogsteen (Figure 22). A pH acide, des structures plus complexes et de natures inconnues se

forment. Enfin, bien que stable, ce triplex aurait une cinétique de dissociation plus grande que pour le

PNA 959. Ceci expliquerait d’une part qu’on n’observe pas d’hystérésis et d’autre part que le PNA

692 n’arrête pas l’élongation de la traduction.

Résultats


87

IV. Etudes complémentaires

1) La séquence T4CT4

Dans l’article de Boutimah-Hamoudi et al, une séquence de PNA dirigée contre PPT de l’intégrase du

VIH-1 et formant un triplex génère une protéine tronquée. Cette séquence contient le motif

TTTTCTTTT responsable de la formation du triplex (81). Le complémentaire de ce motif a été

retrouvé dans la séquence de l’ARNm d’IGF-1R. Nous avons donc choisi d’étudier la séquence de

PNA TTTGTTTTCTTTTCTTC, complémentaire d’IGF-1R, dans l’espoir qu’il forme un triplex

capable d’arrêter l’élongation de la traduction.

Ce PNA, nommé PNA 330, a les caractéristiques suivantes :

- Séquence (N vers C): TTTGTTTTCTTTTCTTC-lysine, composition T13C3G1A0 , cible sur la

chaîne d’IGF-1R.

- Pas d’interaction intramoléculaire ou intermoléculaire d’après PCR Primer Stats.

- L’alignement de séquences sur le transcriptome humain donne :

PNA Cibles en antiparallèle Cibles en parallèle


330

- IGF-1R

- Mediator

Complex

Subunit 12-

like

- Cytohésine 4

- Adaptator related protein

complex 3B1

- MOB kinase activator-like 2B

UNC homeobox

(a) Analyses thermodynamiques

Les analyses spectroscopiques montrent, comme avec le PNA 959, un phénomène d’hystérésis et la

présence d’une seule transition par courbe d’association ou de dissociation (Figure 28). La courbe

d’association à 295 nm ne montre pas de variations de l’absorbance mais cela n’est pas surprenant

étant donné le nombre faible de cytosines présentes sur la séquence du PNA.

Le gel retard du PNA 330 a un profil atypique, difficile à interpréter et qui ne permet pas de conclure à

la formation d’un triplex (Figure 29A). A partir de 100 nM de PNA, pratiquement tout l’ARN est

impliqué dans deux complexes proches qui résistent aux conditions dénaturantes (Figure 29B). Ces

complexes sont donc très stables.

Résultats


88

Figure 28: Courbes d’association et de dissociation du PNA 330

Courbes d’association et de dissociation du PNA 330 avec son ARN complémentaire, représentant

l’absorbance à 260 nm en fonction de la température.

A B

Figure 29: Gels retard et dénaturant du PNA 330

Des concentrations croissantes en PNA 330 sont ajoutées à son ARN complémentaire à 100 nM

dans du tampn Tris à pH 8.3 A/ Gel retard de ces échantillons. B/ Gel dénaturant contenant 7M

d’urée avec ces échantillons.

Résultats


89

(b) Traduction in vitro

Des tests de traduction in vitro ont été réalisés avec ce PNA 330 sur l’ARNm d’IGF-1R. La protéine

tronquée attendue est de 37 kDa. On observe l’apparition sur le gel d’une épaisse bande comprise entre

environ 37 et 30 kDa (Figure 30). Ceci est interprété comme un continuum de protéines tronquées. La

concentration en PNA à laquelle on observe le plus de protéines tronquées est la même qu’avec la

séquence 959 : 0.25 µM.

Pour expliquer ce continuum de protéines, on peut supposer que l’arrêt du ribosome au niveau du

complexe formé entre le PNA 330 et l’ARNm n’entraîne pas la dissociation du ribosome. Les

ribosomes suivants se heurteraient donc à celui-ci et resteraient bloqués sur l’ARNm produisant des

protéines tronquées de tailles inférieures et rapprochées. A l’inverse, l’arrêt au niveau de la séquence

959 entraîne la dissociation du ribosome et une accumulation de protéine tronquée ayant la même

taille. Cette différence de comportement pourrait être due à des structures de complexes PNA:ARN

différentes ou à la structure secondaire de l’ARNm aux environs de la séquence cible, qui influencerait

la cinétique du ribosome.

(c) Conclusion

Même si les études thermodynamiques ne permettent pas d’affirmer la formation d’un triplex pour ce

PNA 330, sa séquence est potentiellement capable de former des triplex partiels PNA2:ARN. Parmi les

PNA riches en pyrimidine testés, les seules séquences efficaces pour arrêter l’élongation de la

traduction sont donc des séquences très riches en thymine (+ de 65%) et possédant un large bloc

central de pyrimidines.

Figure 30: Traduction en présence du PNA 330

L’ARNm d’IGF-1R est mélangé avec 0.25 µM de

PNA 330. Les traductions sont réalisées dans du

lysat de réticulocyte de lapin en présence de

méthionines marquées au 35

S. Les produits de

traduction sont séparés sur un gel SDS-PAGE puis

les protéines sont révélées par autoradiographie.

Résultats


90

2) Etude d’autres bloqueurs stériques

A notre connaissance aucune étude n’a été faite sur l’arrêt de l’élongation avec d’autres bloqueurs

stériques. Nous avons donc étudié la capacité des chimies LNA et PMO à arrêter l’élongation de la

traduction. Les Locked Nucleic Acids (LNA) et les morpholinos phosphorodiamidates (PMO) sont

connus pour être de bons bloqueurs stériques (cf Régulation génique artificielle, p15). Ils sont utilisés

par exemple pour la correction d’épissage (56, 57) ou l’inhibition de la traduction (66, 67). Les PMO

sont capables de former des triples hélices stables avec un ADN double brin (153). Lacroix et al

décrivent un PMO constitué de 16 nucléotides (8C et 8T) faisant avec l’ADN double brin cible un

triplex au Tm de 52°C à pH acide. Les LNA sont aussi utilisés dans les stratégies antisens. En

modifiant des bases désoxyribonucléotides par des résidus LNA, on augmente fortement la stabilité

des oligonucléotides formant des triplex (TFO). Les règles optimales pour la conception de chimère

LNA formant des triplex sont (9):

- Alterner les nucléotides ADN et LNA

- Maximiser le nombre de LNA thymine

- Le résidu C-terminal est un LNA

On obtient alors la séquence LNA 959 5’-TTATTTCTCTTTCTATG-3’ ou les résidus en gras sont

des résidus LNA.

Pour le PMO, il a fallu choisir une séquence de 25 nucléotides car les duplex formés par les PMO sont

moins stables et 25 nucléotides sont nécessaires pour obtenir un Tm d’au moins 70°C (Tableau 11).

On a choisi la séquence PMO 959 : 5’-CTGCTGTTATTTCTCTTTCTATGGA-3’.

(a) Analyses thermodynamiques

L’analyse spectroscopique du PMO 959 montre qu’il forme un duplex avec son ARN complémentaire.

En effet, on observe des courbes d’association et de dissocation superposables ainsi qu’une unique

transition. Ce profil est caractéristique d’un duplex. Comme attendu, le PMO forme avec son ARN

complémentaire de 25 bases un complexe qui a un Tm de 70°C. Pour le LNA, les courbes sont aussi

superposables mais on observe une légère deuxième transition vers 30°C. Aucun hyperchromisme

n’est observé à 295 nm. On peut noter que le duplex formé par le LNA est beaucoup plus stable, avec

un Tm supérieur à 80 °C (Figure 31).

Les gels retards pour le LNA et le PMO 959 ne laissent apparaître qu’un complexe en présence

d’oligonucléotides, suggérant la formation d’un duplex (Figure 32).

Résultats


91

Figure 31: Analyses spectroscopiques du PMO et du LNA 959

Les courbes d’association et de dissociation des mélanges PMO 959 ou LNA 959 et leurs ARN

complémentaires sont réalisées dans un tampon contenant 100 mM de KCl et 10 mM de cacodylate de

sodium à pH 7.

Gels retards

(b) Traduction in vitro

Les tests de traduction in vitro n’ont pas montré d’arrêt de l’élongation de la traduction, pas même une

inhibition de la synthèse protéique en dessous de 0.5 µM (Figure 33). A partir de 0.75 µM on

Figure 32: Gels retards du PMO 959 et du LNA 959

L’ARN complémentaire à 100 nM est mélangé avec des concentrations croissantes en PMO ou LNA

959 dans du tampon Tris à pH 8.3. Les mélanges sont chargés sur gels retards comme précédemment.

Résultats


92

commence à observer des inhibitions de la traduction qui sont très certainement dues comme pour les

PNA à des effets non spécifiques.

(c) Conclusion

D’après ses profils en analyse spectroscopique et gel retard, le bloqueur stérique PMO 959 forme

simplement un duplex avec son ARN complémentaire. Quant au LNA 959, il présente une légère

transition vers 30°C mais le gel retard présente un profil de type duplex. S’il y a formation d’un

triplex, comme le suggère cette deuxième transition à 30°C, celui-ci semble peu stable et n’est pas

stable à la température de traduction, c’est-à-dire 37°C. Ces bloqueurs stériques n’ont pas non plus été

capables d’arrêter l’élongation de la traduction d’IGF-1R. Une fois encore, on montre la nécessité de

former une structure triplex stable pour arrêter l’élongation d’un ARNm eucaryote.

L’inefficacité du PMO est certainement due à la proportion trop faible de liaisons Hoogsteen

potentielles. De plus, il est possible que sa grande taille soit défavorable à la formation de triplex.

Quant au LNA, il a l’inconvénient d’être moins flexible qu’un PNA ou qu’un

oligodésoxyribonucléotide. Une étude RMN a d’ailleurs montré que la formation d’un triplex entre un

LNA et l’ADN double brin induit une torsion de l’hélice (156). On peut donc en déduire qu’un triplex

LNA2:ARN est difficile à former du fait de la rigidité du LNA.

Tableau 11: Récapitulatifs des propriétés des PNA 330 et 959, du LNA et du PMO 959

Oligomère Séquence Tm (°C) Gel retard Protéines

tronquées

PNA 330 TTTGTTTTCTTTTCTTC Hystérésis indéfini oui

PNA 959 TTATTTCTCTTTCTATG Hystérésis duplex+triplex oui

LNA 959 TTATTTCTCTTTCTATG 80 + 30°C duplex non

PMO 959 CTGCTGTTATTTCTCTTTCTATGGA 70 duplex non

Le LNA est une chimère de résidus Locked Nucleic Acid en gras et de désoxyribonucléotides. Le PMO

est un oligomère de 25 résidus de morpholinos phosphorodiamidates. Le LNA et le PMO sont listés de

l’extrémité 5’ vers 3’ et les PNA de l’extrémité N-terminale vers C-terminale.

Figure 33: Traductions in vitro d’IGF-1R avec le PMO 959 et le LNA 959

Résultats


93

3) Impact de la structure de l’ARNm

Notre équipe a publié une étude sur l’arrêt de l’élongation de la traduction de l’intégrase du VIH-1

dans un système acellulaire (81). Celle-ci révèle que le site polypurine tract PPT, hautement conservé

dans le virus, est une cible privilégiée pour l’arrêt de l’élongation de la traduction. Deux PNA ont été

efficaces pour arrêter la machinerie ribosomale sur ce site et pour générer de grandes quantités de

protéines tronquées in vitro :

- Le PNA ASI : complémentaire de PPT et formant un triplex avec l’ARN

- Le PNA ASII : complémentaire de PPT et formant vraisemblablement un duplex avec l’ARN

Le cas du PNA ASII est intriguant puisqu’il serait le seul exemple décrit où un PNA formant un

duplex réussit à arrêter l’élongation de la traduction. Il est possible que ce PNA forme avec l’ARNm

une structure différente d’un triplex et résistante à l’activité hélicase des ribosomes. Par exemple, un

bloc de six guanines se trouvent trois bases plus loin de celui du site PPT. On peut imaginer qu’il

participe à la formation d’une telle structure. On peut aussi suggérer qu’un PNA se fixe sur chaque

bloc d’hexaguanine et que la succession de ces deux duplex arrête l’élongation.

La protéine de l’intégrase s’exprime en trop faible quantité pour pouvoir être étudiée dans les cellules

eucaryotes. Ceci est dû à la faible stabilité de son ARNm, dont la richesse en bases AT est reconnue

comme anormale par la cellule. L’équipe de Cherepanov et al a donc conçu un gène néosynthétique de

l’intégrase dans lequel, grâce à la redondance du code génétique, chaque codon a été enrichi en G et C

tout en conservant la séquence protéique (157). On obtient ainsi un ARNm stable dans les cellules

eucaryotes, qui possède une séquence et une structure sans aucun rapport avec l’ARNm viral.

Nous avons exploité ce gène afin de déterminer si la structure de l’ARNm sauvage avait un impact sur

l’efficacité des PNA. Le plasmide exprimant l’intégrase synthétique a subi une mutagenèse dirigée

pour rétablir le site PPT qui a été aussi enrichie en G et C. A l'exception de l’avant-dernière cytosine,

on a réussi à rétablir le site PPT.

Séquence PPT : AAAAGAAAAGGGGGGA

PNA ASI : TTTTCTTTTCCCC

PNA ASII : TCTTTTCCCCCCT

Résultats


94

PPT muté : AAGCGAAAGGGCGGCA

PPT rétabli : AAAAGAAAAGGGGGCA

Après avoir construit un plasmide contenant le gène néosynthétique au PPT rétabli, en aval d’un

promoteur convenant pour la transcription in vitro (cf Le plasmide pSP6-IN-muté, p141), nous avons

effectué des tests de traduction in vitro pour évaluer l’efficacité des PNA ASI et ASII à arrêter

l’élongation de la traduction. A partir de l’ARN sauvage, les deux PNA produisent des protéines

tronquées en très grande quantité (Figure 34A). On observe aussi parallèlement une inhibition globale

de la traduction. Avec l’ARN synthétique de l’intégrase, une très faible quantité de protéine tronquée

est observée avec la PNA ASI et aucune protéine tronquée n’est détectée avec le PNA ASII (Figure

34B). Pour les deux, on observe aussi une inhibition de la traduction mais qui est moins forte qu’avec

l’ARN viral. La PNA ASII formant un duplex n’est donc plus capable d’arrêter la machinerie

ribosomale sur un ARN différent de l’ARN viral de l’intégrase, tandis que le PNA ASI formant un

triplex présente plus de difficulté à arrêter l’élongation de la traduction. Il est critiquable dans cette

étude d’avoir un mésappariement à l’extrémité de la cible du PNA ASII car il est possible que les six

guanines du PPT soient requises pour que le PNA puisse arrêter les ribosomes. Malgré tout, le cas du

PNA ASI semble indiquer que l’ARN viral de l’intégrase est un ARNm favorisant l’arrêt de

l’élongation de la traduction.

Il est certes probable que l’accessibilité du site puisse être fortement réduite sur l’ARNm synthétique,

mais l’ARN viral est unique dans sa capacité à donner de telles quantités de protéines tronquées, et

ceci, avec un duplex. Il semble que cet ARN viral soit un cas particulier. Du fait de sa structure,

l’élongation est facilement arrêtée au niveau du site PPT. En conclusion, la structure de l’ARN a un

impact important sur l’efficacité des PNA.

Résultats


95

A

0 0

B

Intégrase sauvage (32 kDa)

Protéine tronquée (18 kDa)

A partir de l’ARN sauvage

A partir de l’ARN synthétique

Figure 34: Influence de la structure de l'ARN sur l’efficacité des PNAs

Traductions in vitro en présence des PNAs ASI ou ASII. A/ Traductions de l’ARN viral sauvage de

l’intégrase. (Image issue de Boutimah-Hamoudi et al (81)). B/ Traductions de l’ARN synthétique de

l’intégrase. La protéine fait 30 kDa au lieu de 32 kDa car le premier AUG est absent. La traduction

commence au deuxième AUG, en phase avec le premier (cf Matériels et Méthodes, p141).

A partir de l’ARN sauvage

Résultats


96

V. Conclusion

Cette première partie de thèse a consisté à cribler différentes séquences très riches en pyrimidine pour

évaluer leurs efficacités en tant que bloqueur stérique de l’élongation de la traduction. Le résultat

montre que seules les séquences contenant un large bloc central pyrimidique très riche en thymine, et

donc potentiellement capables de former suffisamment de liaisons Hoogsteen pour former une

structure triplex stable à pH neutre, génèrent des protéines tronquées.

Le LNA 959 a plus de difficultés à former des triplex du fait de sa rigidité, et les analyses montrent

qu’il est inefficace pour arrêter l’élongation de la traduction malgré sa forte affinité pour l’ARN. En

général, les PMO utilisés dans les stratégies antisens possèdent au moins 25 bases car c’est un

bloqueur stérique moins affin que le PNA ou le LNA. Cependant, il est difficile de trouver des

séquences de cette longueur qui soient très riches en thymine, et la longueur du PMO défavorise

surement la formation de triplex partiel. Le PMO ne semble donc pas être un bloqueur stérique

pertinent pour cette approche. Le PNA est le meilleur bloqueur stérique trouvé pour cette stratégie

d’arrêt de l’élongation de la traduction car sa flexibilité et sa forte affinité semble le rendre plus apte à

former des triplex partiels stables.

Tous les oligonucléotides qui forment des duplex ont été inefficaces malgré leurs fortes stabilités. La

stabilité des complexes n’est donc pas le facteur essentiel pour arrêter l’élongation de la traduction.

Les ribosomes ont une activité hélicase très forte mais sont apparemment incapables de dissocier une

structure triplex même partiel. L’encombrement stérique des complexes pourrait donc jouer un rôle

déterminant dans l’arrêt de la machinerie ribosomale.

Résultats

Etudes cellulaires

97

B. Inhibition d’IGF-1R dans les cellules

et ses effets biologiques

Les objectifs de ces études cellulaires sont de :

- montrer qu’un PNA ciblant la région codante d’un ARNm peut arrêter l’élongation de sa

traduction dans les cellules,

- mettre en évidence une protéine tronquée,

- observer des effets biologiques associés au traitement.

Nous avons choisi de prendre pour cible le récepteur IGF-1R. Cette protéine est surexprimée dans de

nombreux cancers et l’inhibition de son activité conduit à des effets antitumoraux. De plus, des études

sur des dominants négatifs d’IGF-1R montrent des résultats in vivo intéressants. Les chances d’obtenir

des effets biologiques à la fois en bloquant l’élongation de la traduction d’IGF-1R et en générant une

protéine tronquée jouant le rôle de dominant négatif sont donc élevées.

I. Transfection transitoire d’IGF1R-Rluc

1) Description de l’expérience

Dans un premier temps, nous avons travaillé sur un gène exprimé de manière transitoire. Nous avons

utilisé un plasmide pIGF1R-Rluc exprimant IGF-1R dont l’extrémité C-terminale est en fusion avec la

luciférase Renilla Reniformis. La quantité de luciférase synthétisée est quantifiée afin d’évaluer

l’inhibition de la traduction d’IGF1R-Rluc par le PNA 959. Dans les cellules HeLa, on cotransfecte

par nucléofection les plasmides pIGF1R-Rluc et pFluc exprimant la luciférase Photinus Firefly ainsi

que des concentrations croissantes en PNA 959 ou 968. La luciférase Firefly sert de référence et

permet de quantifier les variations de viabilité ou d’efficacité de transfection entre deux échantillons.

Les deux plasmides ont le même promoteur CMV ce qui permet de s’assurer que les effets observés ne

sont pas dus à des variations d’efficacité de transcription. Le PNA 968 sert de PNA contrôle. 24

heures après la transfection, les quantités des deux luciférases sont mesurées séparément par

chimioluminescence.

Résultats

Etudes cellulaires

98

2) Résultats

Les rapports de luciférases Rluc/Fluc sont calculés pour chaque concentration de PNA. Les taux

d’expression sont rapportés au point sans ajout de PNA. On observe une inhibition dose-croissante de

la luciférase Renilla et donc d’IGF1R-Rluc avec le PNA 959 (Figure 35). L’inhibition de la traduction

d’IGF1R-Rluc atteint 50% à 2 µM de PNA 959. Avec le PNA 968, inefficace pour l’arrêt de

l’élongation de la traduction in vitro, on observe des inhibitions inférieures à 15% à 1 et 2 µM tandis

qu’à 4 µM l’inhibition atteint 73%. Ceci suggère que le PNA 959 réussit à inhiber la traduction de ce

gène de fusion de manière spécifique pour des concentrations inférieures à 2 µM.

Figure 35: Taux d'expression d'IGF1R-Rluc transitoire en fonction de la concentration en PNA

Les quantités de luciférases Renilla (Rluc) et Firefly (Fluc) sont mesurées distinctement. Les rapports

Rluc/Fluc sont normalisés par rapport au point sans PNA. Les moyennes et écart-types de ces taux

d’expression sont calculés à partir des triplicatas de deux expériences distinctes pour les

concentrations 0, 1, 2 et 4 de PNA 959 et d’une expérience pour les concentrations 1, 2 et 4 de PNA

968.

Ce résultat très encourageant est le premier exemple montrant qu’un PNA ciblant la région codante

d’un gène réussit à inhiber sa traduction dans les cellules.

Résultats

Etudes cellulaires

99

II. Inhibition d’IGF-1R endogène

1) Choix de la lignée cellulaire

L’inhibition de l’expression transitoire du gène d’IGF-1R par le PNA 959 est très encourageante mais,

pour étudier des effets biologiques, il est pertinent de travailler sur le gène endogène d’IGF-1R. Le

choix de la lignée cancéreuse pour observer ces effets est important. La voie de signalisation IGF joue

un rôle important dans le cancer humain de la prostate. Dans les cellules cancéreuses de prostate

dépendantes des androgènes, telles que les LNCaP, les androgènes induisent l'augmentation de

l'expression d'IGF-1R. De plus, la progression de ces métastases vers l'indépendance aux androgènes

(cellules DU145) s'accompagne in vivo d'une forte augmentation des taux d'IGF-1R et d'IGF-1 (126,

158). Enfin, des études ont montré que bloquer l’activité de ce récepteur par la stratégie antisens (129,

141) ou l’expression de dominants négatifs (150) supprime la croissance tumorale des xénogreffes de

cancer humain de la prostate. Rochester et al montrent que, parmi les lignées cancéreuses de prostate

métastatiques LNCaP, PC3 et DU145, les DU145 sont les cellules exprimant le plus fort taux d’IGF-

1R (129). Elles ont donc été choisies pour les études cellulaires suivantes.

2) Inhibition de l’expression de la protéine fonctionnelle

(a) Description de la méthode

Les PNA étant des molécules neutres et de faible internalisation cellulaire, nous avons choisi de les

transfecter par une technique de perméabilisation membranaire. La nucléofection est une technique

d’électroporation qui permet à toutes sortes de substrats d’atteindre le cytoplasme ainsi que le noyau.

Le PNA est donc introduit dans les cellules DU145 par nucléofection. 24, 48 ou 72 heures après

transfection, les protéines cellulaires sont extraites et des Western blots sont réalisés afin de déterminer

les inhibitions d’expression d’IGF-1R endogène par ce traitement. L’anticorps utilisé pour ces

expériences est l’anticorps C-20 reconnaissant la partie C-terminale de la chaîne du récepteur

(Figure 36). L’anticorps permet de détecter les variations d’expression du récepteur fonctionnel.

Cependant, il ne permet pas de détecter une éventuelle protéine tronquée. L’actine- est utilisée pour

normaliser l’expression d’IGF-1R.

Résultats

Etudes cellulaires

100

Figure 36: Schéma de la position sur IGF-1R des anticorps utilisés dans les études cellulaires

L’anticorps C-20 détecte la partie C-terminale de la chaîne d’IGF-1R et permet de mettre en

évidence une diminution de l’expression de la protéine fonctionnelle. L’anticorps N-20 détecte la

partie N-terminale de la chaîne d’IGF-1R et permet de mettre en évidence une inhibition de la

protéine. L’anticorps H-60 détecte la partie N-terminale de la chaîne d’IGF-1R et permet de

mettre en évidence l’expression d’une protéine tronquée générée par l’arrêt de l’élongation par le

PNA 959.

(b) Inhibition dose-croissante

Le PNA 959 a donc été testé dans les DU145 à différentes concentrations. Dans les expériences

cellulaires, une lysine supplémentaire a été ajoutée au PNA afin d’augmenter sa solubilité et de

diminuer sa tendance à faire des agrégats. 48 heures après traitement avec des doses en PNA 959

comprises entre 0.1 et 1.5 µM, on observe une inhibition dose-croissante de l’expression d’IGF-1R.

La Figure 37 montre certains des films à partir desquels les variations des taux d’expression d’IGF-1R

ont été déduites. Chaque signal d’IGF-1R est d’abord normalisé par rapport au signal de l’actine puis

ce rapport est comparé à celui de l’échantillon sans PNA. A partir de trois dose-réponses

indépendantes, on calcule ainsi que le PNA 959 inhibe 51 ± 16% de la protéine à 0.5 µM, 66 ± 14% à

1 µM, et 89 ± 12% à 1.5 µM (Figure 38).

Des cinétiques ont été réalisées à 1 µM pour déterminer à quel moment l’inhibition est la plus forte et

si le PNA a une efficacité stable sur plusieurs jours. La Figure 39 montre le graphe d’inhibition de

l’expression d’IGF-1R en fonction du temps. On observe que l’inhibition augmente d’environ 15%

entre 24 et 48 heures puis est stable entre 48 et 72 heures à environ 60-65% d’inhibition. Le PNA est

Résultats

Etudes cellulaires

101

donc efficace dès 24 heures comme le montre les études en transfection transitoire, et cette efficacité

est stable sur au moins 3 jours.

(c) Inhibition spécifique de la séquence

Il faut évidemment en parallèle s’assurer que ces effets sont spécifiques de la séquence 959.

PNA P1

Le PNA P1 de séquence AAATTTAGGGATAACAGG-lys-lys a servi de contrôle dans ces

expériences pour les mêmes concentrations. Il ne possède pas de séquence cible sur le transcriptome

humain en parallèle ou antiparallèle. Le PNA P1 induit des exaltations importantes sur cette gamme de

concentrations (0.1 à 1.5 µM) avec des écart-types très grands (Figure 38). Malgré ces écart-types,

l’inhibition observée avec ce PNA P1 n’a jamais dépassé les 20%.

PNA scramble

Une deuxième séquence contrôle appelée PNA scramble, un PNA de même composition que le PNA

959, a été testée. Le PNA possède les propriétés suivantes :

- Séquence (N vers C): TATTCTTGTTCTTATCT-lys-lys, composition T11C3G1A2 avec deux

lysines à l’extrémité C-terminale.

- Pas d’interaction intramoléculaire ou intermoléculaire, d’après le logiciel PCR Primer Stats.

- Pas de cible sur le transcriptome humain en orientation antiparallèle et une en orientation

parallèle (Tableau 12).

Contrairement aux expériences précédentes où les PNA entraient dans les cellules par nucléofection,

ici les DU145 sont perméabilisées à la streptolysine-O (SLO), une toxine bactérienne qui fait des trous

dans la membrane plasmique. Des doses croissantes en PNA 959 et PNA scramble ont été transfectées

dans les cellules et les protéines ont été extraites 48 heures plus tard afin de réaliser des Western blots

(Figure 40). Dans ces dose-réponses, le PNA 959 présente des inhibitions de 55 ± 11% à 1 µM.

Notons, que ces inhibitions sont légèrement plus basses que pour les premières expériences (66%).

Cependant, on observe avec ces expériences que le PNA scramble à 0.5 et 1 µM ne montre ni

exaltation ni inhibition d’IGF-1R endogène. Par conséquent, le PNA scramble valide la spécificité de

séquence.

Résultats

Etudes cellulaires

102

A

IGF-1R 90 kDa

-actine (42 kDa)

Figure 37: Western Blots révélant les expressions d'IGF-1R et de l'actine

Le PNA 959 (A, B et C) et le PNA P1 (A et B) ont été transfectés par nucléofection dans les DU145 aux

concentrations indiquées au-dessus des bandes. Les protéines ont été extraites 24 heures (C) ou 48

heures (A et B) après transfection. Les Western Blots ont été faits avec l’anticorps C-20 pour révéler la

chaîne d’IGF-1R et un anticorps anti--actine pour révéler l’actine qui servira à normaliser

l’expression d’IGF-1R. On observe deux bandes pour IGF-1R qui correspondent à deux isoformes de

la protéine.

B

C

Résultats

Etudes cellulaires

103

Figure 38: Taux d'expression d'IGF-1R après traitement par les PNA 959 et P1

Le PNA 959 et le PNA P1 ont été transfectés par nucléofection dans les DU145 et les protéines ont

été extraites 48 heures après transfection. Les quantités d’IGF-1R ont été mesurées par Western

blots avec l’anticorps C-20 et normalisées par rapport à la quantité d’actine. Ces rapports sont

normalisés par rapport à l’échantillon sans PNA. Les moyennes et écart-types des taux d’expression

obtenus ont été calculés à partir de trois expériences de dose-réponse indépendantes.

Figure 39: Cinétique d'inhibition d'IGF-1R

Le PNA 959 a été transfecté par nucléofection dans les DU145 à 1 µM et les protéines ont été

extraites 24, 48 et 72 heures après transfection. Les quantités d’IGF-1R ont été mesurées par Western

blots avec l’anticorps C-20 et normalisées comme précédemment. Les moyennes et écart-types des

taux d’expression obtenus ont été calculés à partir de trois expériences de cinétiques indépendantes.

Résultats

Etudes cellulaires

104

Tableau 12: Alignements de séquences sur le transcriptome humain

PNA

Cibles en antiparallèle Cibles en parallèle



scramble IGF-1R aucune Zinc finger CCHC domain

containing 7

A

B

µM

µM

Figure 40: Taux d'expression d'IGF-1R après traitement avec le PNA 959 et le PNA scramble

Le PNA 959 et le PNA scramble ont été introduits dans les DU145 par perméabilisation à la SLO et

les protéines ont été extraites 48 heures après transfection. (A) Les Western Blots ont été faits avec

l’anticorps C-20 pour révéler la chaîne d’IGF-1R et un anticorps anti-actine pour normaliser

l’expression d’IGF-1R. (B) Les quantités d’IGF-1R ont été mesurées par Western blots avec

l’anticorps C-20 et normalisées par rapport à la quantité d’actine. Ces rapports sont normalisés par

rapport à l’échantillon sans PNA. Les moyennes et écart-types des taux d’expression obtenus ont été

calculés à partir de trois expériences de dose-réponse indépendantes.

Résultats

Etudes cellulaires

105

3) Etudes complémentaires

(a) Effets de tous les PNA ciblant IGF-1R

On s’est intéressé à l’efficacité dans les cellules de tous les PNA ciblant IGF-1R étudiés dans la partie

in vitro : les PNA 330, 476, 558, 692, 883, 926, 968. Même si des études cellulaires précédentes (78)

indiquent que des duplex ciblant la région codante sont inefficaces pour inhiber la traduction d’un

gène, il est intéressant de le confirmer ou de l’infirmer.

Chaque PNA a donc été transfecté par nucléofection à 1 µM et l’expression d’IGF-1R a été mesurée

48 heures plus tard. La Figure 41B montre un graphe représentant les moyennes des taux d’expression

d’IGF-1R 48 heures après traitement avec les PNA pour trois expériences indépendantes. On observe

que le PNA 330 inhibe l’expression d’IGF-1R de 28 ± 13 %. Cette efficacité confirme que les PNA

produisant des protéines tronquées in vitro sont capables d’inhiber la traduction de leur cible dans les

cellules. Tandis que les PNA 558 et 883 n’induisent que de légères inhibitions non significatives, les

PNA 926 et 968 induisent des inhibitions plus conséquentes (24 ± 9.6% et 25 ± 12.5%

respectivement). Dans ces expériences, le PNA 959 à 1µM inhibe le récepteur de 50 ± 12.8% soit

seulement deux fois plus qu’avec les PNA 926 et 968. Dans les expériences d’inhibition d’IGF1R-

Rluc, on se rappelle aussi que le PNA 968 ne montrait pas d’inhibition jusqu’à 2 µM, puis inhibait

fortement à 4 µM. Plusieurs explications sont envisageables. La première serait que ces effets de

l’ordre de 25% soient dus à des off-targets. Les PNA en se liant sur des régions 5’UTR, des sites

d’épissage et même sur l’ADN peuvent moduler l’expression génique de certains gènes et induire de

manière indirecte des variations d’expression d’IGF-1R. Une autre explication serait que ces duplex

arrivent à arrêter le ribosome lors de l’élongation, dans les cellules. Si le ribosome était déjà ralenti par

une structure secondaire formée sur l’ARNm, on peut imaginer que ces duplex soient capables

d’arrêter le ribosome, avec bien sûr une efficacité inférieure à celle d’un triplex.

Les PNA 476 et 692 ont provoqué une mortalité cellulaire très importante à 1 µM dès 24 heures.

Plusieurs explications sont possibles : soit ils possèdent des cibles secondaires qui inhibées induisent

une apoptose massive, soit les solutions sont contaminées avec un solvant toxique pour la cellule.

(b) Effets du LNA 959 et du PMO 959 dans les cellules

De la même manière, on s’est intéressé aux bloqueurs stériques LNA et PMO ayant la même cible que

le PNA 959. Le LNA 959 et le PMO 959 ont été testés dans les cellules. Des inhibitions de 40% ont

été observées dans une expérience tandis que les autres expériences ont montré des exaltations plus ou

Résultats

Etudes cellulaires

106

moins importantes (Tableau 13). Il est difficile ici de conclure à cause des grandes variations d’effets

entre chaque expérience, mais il semble que ces bloqueurs stériques n’inhibent pas IGF-1R.

A

B

Figure 41: Traitements avec les PNA ciblant IGF-1R à 1 µM

Les PNA ont été introduits par nucléofection dans les DU145 à 1 µM et les protéines ont été extraites

48 heures après transfection. (A) Le Western Blot a été fait avec l’anticorps C-20 pour révéler la

chaîne d’IGF-1R et un anticorps anti-actine pour normaliser l’expression d’IGF-1R. (B) Les

moyennes et écart-types ont été calculés comme précédemment à partir de trois expériences

indépendantes.

Tableau 13: Effets du LNA 959 et du PMO 959 dans les cellules

Expériences LNA 959 à 1 µM PMO 959 à 1 µM

3 expériences indépendantes

par nucléofection

40% d’inhibition 40% d’inhibition

50% d’exaltation Pas d’effet

Pas d’effet 100% d’exaltation

1 expérience par la SLO 20% d’exaltation Pas d’effet

Résultats

Etudes cellulaires

107

(c) Brève étude sur l’importance des résidus du PNA 959

Nous avons voulu savoir si réduire la taille du PNA 959 aurait des effets sur son efficacité. Le PNA a

été raccourci de 1 à 4 résidus sur chaque extrémité (Tableau 14). Ces PNA ont été testés dans les

DU145 à 1 µM et les taux d’expression d’IGF-1R évalués à 48 heures, par trois expériences

indépendantes. Le Tableau 14 indique les pourcentages d’inhibition d’IGF-1R obtenus pour chaque

PNA. On observe que les 4 résidus C-terminaux n’ont pas une grande influence sur l’efficacité du

PNA, puisque leur absence ne fait perdre qu’environ 15% d’efficacité. Ces résidus se trouvent

hybridés du côté 5’ de l’ARNm et donc du côté de l’arrivée des ribosomes. On peut en déduire que le

motif TATG terminal est faiblement impliqué dans la formation et la stabilité du triplex PNA

9592:ARN. Par contre, la perte de 1 à 3 résidus N-terminaux diminue presque de moitié l’efficacité du

PNA 959. On peut émettre l’hypothèse que le doublet TT terminal forme des liaisons Hoogsteen

stabilisant le triplex. Pourtant il est surprenant de constater que le PNA C-13, manquant des 4 résidus

N-terminaux et ayant perdu 3 thymines formant potentiellement des liaisons Hoogsteen, induit les

mêmes inhibitions que le PNA 959.

Tableau 14 : Séquences des PNA raccourcis

PNA Séquence (N vers C) % d’inhibition

PNA 959

(17-mère)

TTATTTCTCTTTCTATG 62 ± 7

N-15 TTATTTCTCTTTCTA 47 ± 6

N-14 TTATTTCTCTTTCT 48 ± 7

N-13 TTATTTCTCTTTC 47,5 ± 3.5

C-13 TTCTCTTTCTATG 61 ± 8.5

C-14 TTTCTCTTTCTATG 30 ± 10

C-15 ATTTCTCTTTCTATG 33 ± 11

C-16 TATTTCTCTTTCTATG 37 ± 16

Ils sont séquencés de l’extrémité N vers C et possèdent deux lysines en C-terminal. Le trait vertical

rouge délimite la partie qui cible l’exon 15 (à gauche) de celle qui cible l’exon 14 (à droite).

Le PNA 959 a la particularité de chevaucher deux exons. Les six résidus N-terminaux ciblent l’exon

15 tandis que les 11 autres ciblent l’exon 14. De plus, il n’y a aucune complémentarité de bases

possible entre les 6 résidus N-terminaux et la partie 3’ de l’intron. Ceci diminue donc la capacité du

PNA 959 et des PNA N-13 à 15 de se fixer sur l’ADN génomique ou l’ARN pré-messager.

Cependant, le complexe formé avec le PNA C-13 pourrait ne pas être trop déstabilisé par ses deux

Résultats

Etudes cellulaires

108

résidus terminaux non complémentaires. L’hypothèse serait donc que le C-13 se fixe sur la jonction

intron-exon de l’ARNm et empêche son épissage ou qu’il arrive à faire une invasion de la double

hélice sur l’ADN génomique. Ces deux phénomènes participeraient à l’inhibition de l’expression de la

protéine.

4) Conclusion

Ces expériences démontrent que le PNA 959 ciblant la région codante d’IGF-1R est capable d’inhiber

cette protéine de plus de 50% de manière séquence-spécifique. Le premier objectif de cette thèse est

donc atteint puisque l’on a montré qu’un PNA riche en pyrimidines ciblant la région codante d’un

gène était capable d’inhiber son expression dans les cellules.

Le PNA 330, arrêtant lui aussi l’élongation de la traduction in vitro, s’est montré à son tour efficace

pour inhiber IGF-1R dans les cellules. Il vient confirmer que cette stratégie d’arrêt de l’élongation de

la traduction est réalisable. Un criblage in vitro permet donc de sélectionner des molécules qui seront

efficaces dans les cellules.

Même si leurs efficacités sont deux fois moindre qu’avec le PNA 959, deux PNA ciblant IGF-1R et

formant un duplex avec l’ARNm se sont révélés capables d’inhiber l’expression d’IGF-1R. De plus,

les variations d’efficacité observées lorsqu’on réduit la taille du PNA soulève des questions sur le

mécanisme d’inhibition de la protéine. En effet, le mécanisme n’est pas démontré. Est-ce bien

l’élongation de la traduction qui est bloquée par le PNA 959 ou une autre étape de l’expression

génique ?

Résultats

Etudes cellulaires

109

III. Mécanisme d’action

Pour prouver de manière indubitable que le PNA 959 entraîne bien l’arrêt de l’élongation de la

traduction, il faudrait détecter la protéine tronquée engendrée par cet arrêt. D’autre part, un de nos

objectifs pour cette stratégie est de produire un dominant négatif et d’étudier ses effets anticancéreux.

La détection de la protéine tronquée est donc très intéressante.

1) Pas de protéine tronquée détectée

(a) Caractéristiques de la protéine tronquée attendue

Pour détecter la protéine tronquée, il faut utiliser un anticorps qui reconnait la partie N-terminale de la

chaîne d’IGF-1R (Figure 36). En effet, dans les cellules, une fois le précurseur d’IGF-1R synthétisé

il est coupé par une protéase qui engendre les chaînes et . La séquence ciblée par le PNA 959

constitue les toutes premières bases codant pour la partie intracellulaire de la chaîne . La protéine

tronquée doit donc contenir les parties extracellulaire et membranaire de cette chaîne (Figure 42). Il y

a 5 sites de N-glycosylations possibles et elle doit contenir théoriquement 217 acides aminés. Une N-

glycosylation alourdissant d’environ 3.5 kDa une protéine, la masse moléculaire attendue pour la

protéine tronquée est de 42 kDa (217x0.113+5x3.5). Par ailleurs, un dominant négatif constituant le

domaine extracellulaire entier d’IGF-1R a une masse de 40 kDa (151). La protéine tronquée

hypothétique contient seulement 22 acides aminés membranaires supplémentaires soit 2.5 kDa

environ. Ceci confirme la masse moléculaire apparente de la protéine tronquée attendue.

Figure 42: Schéma de la structure d'IGF-1R

Le récepteur contient 1367 acides aminés dont 30 acides aminés pour un peptide signal, 707 pour la

chaîne , un site de clivage de 4 acides aminés et 625 acides aminés pour la chaîne

transmembranaire. Le PNA 959 cible les premières bases de la partie intracellulaire et la traduction

doit donc en théorie être arrêtée à la position 929 en rouge.

Résultats

Etudes cellulaires

110

(b) Tentatives de détection

Des Western blots avec l’anticorps H-60 permettant de détecter cette protéine ont été faits sur des

cellules traitées avec le PNA 959. Les protéines ont été extraites 24 ou 48 heures après transfection.

L’anticorps révèle à nouveau que le PNA 959 inhibe IGF-1R-fonctionnel. Le problème est que cet

anticorps n’est pas très spécifique et de nombreuses bandes non spécifiques apparaissent sur les films

et rendent difficiles la visualisation d’une protéine tronquée (Figure 43A). Cependant, ces protéines

non spécifiques sont intéressantes puisque leurs intensités ne varient pas avec la concentration en

PNA, suggérant la spécificité du PNA pour sa cible. Malheureusement, aucun autre anticorps

commercial pouvant remplir ce rôle n’a été trouvé. Des immunoprécipitations ont été réalisées pour

enrichir l’extrait protéique et tenter d’augmenter la spécificité de l’anticorps. Cette étape

d’immunoprécipitation permet en effet d’éliminer quasiment toutes les bandes non spécifiques. La

Figure 43B montre une forte inhibition des isoformes d’IGF-1R- et la présence d’une seule bande

non spécifique. Cette dernière valide que l’on a chargé les mêmes quantités d’immunoprécipitat.

Cependant aucune protéine tronquée n’a été détectée.

A B

Figure 43 : Tentatives de détection de la protéine tronquée

Les DU145 sont traitées avec le PNA 959, et les protéines extraites. (A) Le Western blot est réalisé

sur ces extraits protéiques avec l’anticorps H-60. (B) Une immunoprécipitation a été réalisée sur les

extraits protéiques avec l’anticorps H-60 suivie d’un Western blot avec ce même anticorps.

Résultats

Etudes cellulaires

111

(c) Inhibition de la chaîne d’IGF-1R

L’anticorps N-20 reconnaissant la partie N-terminale de la chaîne permet de détecter les chaînes

issues du récepteur fonctionnel et de la protéine tronquée. L’idée était que si la chaîne est beaucoup

moins inhibée que la chaîne on prouverait le mécanisme d’arrêt de l’élongation. Les Western blots

réalisés avec cet anticorps révèlent toujours de larges bandes diffuses comme décrit dans la notice de

N-20 (Figure 44). On observe de fortes inhibitions (en moyenne 50% pour 1 et 1.5 µM). Pour 1 µM,

on se retrouve avec des inhibitions similaires à celle de la chaîne , tandis qu’à 1.5 µM elles sont plus

légères pour la chaîne . Ceci suggère que la protéine tronquée est dégradée et/ou que l’initiation de la

traduction est inhibée de manière indirecte par la fixation du PNA 959.

(d) Conclusion

Si la protéine tronquée existe, celle-ci est sûrement en faible quantité car les Western blot n’ont pas

permis de la détecter et une inhibition importante de la chaîne est observée. Malheureusement, en si

faible quantité, elle aurait des effets de dominant négatif limités. Des efforts supplémentaires auraient

pu être faits pour détecter cette protéine qui démontrerait le mécanisme d’action. Cependant, on a

souhaité en priorité s’assurer que le transcrit n’était pas affecté par notre traitement.

Figure 44: Inhibition de la chaîne d'IGF-1R

Résultats

Etudes cellulaires

112

2) Une inhibition au niveau traductionnelle

(a) Les mécanismes alternatifs possibles

Les PNA sont des molécules utilisées dans diverses stratégies antigènes ou antisens pour diverses

séqeunces d’acides nucléiques dont l’ADN génomique (50), les sites d’épissage sur l’ARN pré-

messager (58) ou des régions 5’UTR (66) (cf Blocage stérique p26). Ces stratégies peuvent conduire à

des diminutions de l’expression de la cible. Le PNA 959 chevauche deux exons (11 résidus ciblent

l’exon 14 et 6 l’exon 15). Ceci le rend moins apte à interagir avec le gène igf-1r, car les 6

mésappariements sont déstabilisants. Cependant, il est prudent de vérifier que la transcription ou

l’épissage ne sont pas affectées par le PNA.

D’autre part, il existe des voies de dégradation d’ARN qui pourraient affecter le transcrit d’IGF-1R

hybridé au PNA. Ces voies sont des contrôles de la qualité des ARNm et aident à assurer l’intégrité de

l’expression génique. La première voie est la « No-Go-Decay ». Doma et Parker décrivent, dans la

levure, la dégradation d’un ARNm possédant une structure en épingle à cheveux si stable qu’elle

arrête les ribosomes (159). Cet arrêt entraîne la dégradation de l’ARN par une endonucléase, puis les

fragments sont dégradés par les exosomes. La deuxième voie est la voie « Nonsense-mediated mRNA

Decay » (NMD), qui dégrade les ARNm possédant un codon de terminaison prématuré (160). Pendant

l’épissage, des complexes protéiques de jonction d’exon (EJC) s’installent 20 à 24 nucléotides en

amont des jonctions d’exon-exon. Lorsque le premier ribosome traduit le transcrit, il déplace ces

complexes et l’ARNm se réarrange de telle sorte qu’il se circularise. Ce réarrangement permet de

stabiliser l’ARNm et d’augmenter son taux de traduction. Un ARNm contenant un codon stop

prématuré avant le dernier exon conserve le dernier marqueur EJC et ne peut pas se réarranger

correctement. L’ARNm est alors reconnu par la machinerie NMD comme anormal et est dégradé. Si le

PNA 959 se fixe avant le premier tour de traduction alors l’ARNm IGF-1R pourrait être reconnu

comme anormal.

Toutes ces raisons m’ont poussée à vérifier que les taux d’expression du transcrit d’igf-1r étaient

stables, avant de poursuivre la recherche de la protéine tronquée.

(b) Des taux d’ARNm constants

Les DU145 sont transfectées par nucléofection avec 1 µM de PNA 959 ou 0.05 µM de siRNA, et

incubées pendant 48 heures. Le siRNA, décrit par Rochester et al (129), inhibe IGF-1R par un

mécanisme de dégradation de l’ARNm. Il sert donc de contrôle positif. Comme l’inhibition d’IGF-1R

est stable entre 48 et 72 heures après le traitement, les ARNm ont été extraits à 48 heures. Les

Résultats

Etudes cellulaires

113

protéines ont été extraites à partir de la moitié des cellules et les ARNm cellulaires extraits à partir de

l’autre moitié. Les taux d’expression des ARNm d’IGF-1R ont été mesurés par RT-PCR quantitatives

avec GUS- humain comme standard interne. La méthode de comparaison des cycles paliers Ct a été

utilisée pour calculer les taux relatifs d’ARNm. Pour chaque expérience, les taux d’ARN sont

rapportés au taux des cellules nucléofectées sans oligonucléotides. Les taux relatifs de protéines IGF-

1R sont calculés à partir de Western blot comme décrit précédemment.

La Figure 45 montre que, tandis que le siRNA à 0.05 µM induit une diminution significative de 47 ±

7% de l’ARNm, le PNA 959 à 1 µM n’affecte pas les taux d’expression d’ARNm d’IGF-1R.

L’inhibition de 45 ±10% de la protéine n’est donc pas due à des variations de taux d’ARNm.

(c) Le PNA C-13

Nous avions émis l’hypothèse que le PNA C-13 (cf Brève étude sur l’importance des résidus du PNA

959, p107) puisse inhiber IGF-1R en interagissant avec l’ADN génomique ou l’ARN pré-messager.

Des RT-PCR quantitatives ont donc été réalisées afin de valider ou non cette hypothèse.

Une diminution de 17 ± 11% de la quantité d’ARNm pour 1 µM de PNA C-13 est observée (Figure

46). L’expérience n’a été réalisée que trois fois et le test de Student nous indique que ce résultat n’est

pas significatif. Mais, avec le siRNA, une diminution de 50% de l’ARNm induit une diminution de

87% de la protéine. Dans ce cas, on observe un facteur 1.7 entre les inhibitions en protéine et en

ARNm. Si onse permet d’extrapoler au PNA C-13, les 17% de diminution de l’ARNm conduisent

alors à une diminution de (17x1.7 = 31) 31% de la quantité de protéine. Or, le C-14 inhibe en moyenne

de 30% le taux de protéine tandis que C-13 l’inhibe de 61% (Tableau 14). Ces 31% d’écart pourraient

donc être dus à la diminution du taux d’ARNm.

3) Conclusion

Ces résultats suggèrent que le PNA 959 interagit seulement avec l’ARNm mature et n’induit pas sa

dégradation. Les taux d’ARNm d’IGF-1R n’étant pas diminués par le traitement du PNA 959, cela

indique que la transcription et l’épissage ne sont pas affectés et que l’ARN n’est pas dégradé par une

machinerie cellulaire après fixation du PNA. Le PNA inhibe donc bien la synthèse protéique au niveau

traductionnel dans les cellules. Par contre, il semblerait que le PNA C-13 induise une diminution de

l’ARNm d’IGF-1R suggérant qu’il interagit aussi au niveau transcriptionnel et/ou de l’épissage.

Résultats

Etudes cellulaires

114

Figure 45: Taux d'expression de la protéine IGF-1R et de son ARNm

Le PNA 959 a été nucléofecté dans les DU145 à 1 µM et le siRNA à 0.05 µM. Le graphe correspond

à l’analyse quantitative de cinq expériences indépendantes. Pour chaque expérience, les taux d’ARN

d’IGF-1R, normalisés par rapport à GUS-, sont rapportés au taux des cellules nucléofectées sans

oligonucléotides. Le graphe représente les moyennes et écart-types des taux d’expression relatifs de

l’ARNm d’IGF-1R et de la protéine IGF-1R : ns pour non significatif, *** pour p < 0.001.

Figure 46: Taux d'expression des ARNm d'IGF-1R après traitement par les PNA 959 et C-13

Le graphe correspond à l’analyse quantitative de trois expériences indépendantes pour le PNA C-13

et cinq pour 959 à 1 µM. Pour chaque expérience, les taux d’ARN sont rapportés au taux des cellules

nucléofectées sans oligonucléotides. Le graphe représente les moyennes et écart-types des taux

d’expression relatifs de l’ARNm d’IGF-1R.

Résultats

Etudes cellulaires

115

IV. Effets biologiques

Nous avons étudié les effets biologiques induits par l’inhibition d’IGF-1R. Cette protéine est une cible

largement exploitée en thérapie anticancéreuse. L’inactivation de ce récepteur conduit à une

diminution de l’activation de ses voies de signalisation. Celles-ci sont impliquées dans la prolifération,

la survie cellulaire et la transformation. Ces aspects ont été étudiés ci-dessous.

1) Inhibition des voies de signalisation

La liaison d’IGF-1R à son ligand IGF-1 provoque l’activation du domaine tyrosine kinase du récepteur

et la stimulation des voies de signalisation en aval : Ras/mitogen-activated protein kinase (MAPK) and

phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/AKT (91). Une cascade de réponses est déclenchée, favorisant la

prolifération, la survie, la motilité et la croissance tumorale. AKT et ERK1/2 sont des intermédiaires

des voies de signalisation (PI3K)/AKT et MAPK, respectivement (Figure 13, p41). Ils sont

phosphorylés à la suite de l’activation par IGF-1.

Le PNA 959 ou scramble est transfecté dans les cellules DU145 à 0.5 et 1 µM. 24 heures après, le

milieu de culture est remplacé par un milieu sans sérum et donc dépourvu de facteurs de croissance tel

qu’IGF-1. 21 heures plus tard, les cellules sont stimulées avec 100 nM d’IGF-1. Le ligand se lie à

IGF-1R et les voies de signalisation, « au repos » depuis 21 heures, sont d’autant plus activées que les

taux d’IGF-1R fonctionnel sont importants. Les quantités d’AKT et ERK1/2 phosphorylés sont

mesurées par Western blot et normalisées par rapport aux protéines AKT et ERK1/2 totales.

Figure 47: Inhibitions de l'activation des voies de

signalisation

Les cellules DU145 sont perméabilisées à la SLO avec

0.5 µM de PNA 959 ou de PNA scramble. Des Western

blots sont réalisés pour détecter l’expression des

intermédiaires AKT et ERK1/2 phosphorylés (P-AKT

et P-ERK1/2) et non phosphorylés.

Résultats

Etudes cellulaires

116

A 1µM, on observe d’aussi fortes inhibitions de l’activation des voies de signalisation avec le PNA

scramble qu’avec le PNA 959. Par contre, à 0.5 µM on observe que le traitement par le PNA 959

entraîne une inhibition significative des intermédiaires phosphorylés (Figure 47): 72 ± 26%

d’inhibition de la phosphorylation d’AKT et 45 ± 35% d’inhibition de la phosphorylation d’ERK1/2

avec le PNA 959 par rapport au PNA scramble.

A 0.5 µM, le PNA 959 réussit donc à inhiber de manière séquence-spécifique les voies de signalisation

mitogéniques et antiapoptotiques dépendantes d’IGF-1R

2) Effets sur la prolifération cellulaire

IGF-1R est une protéine impliquée dans la prolifération et la survie cellulaire. Nous nous sommes

attachés à évaluer les effets du traitement par le PNA sur la prolifération et la mortalité des cellules

DU145. Les études précédentes nous ont permis d’observer une mortalité à partir d’1.5 µM de PNA

959.

Des études de cytotoxicité ont été réalisées. Les cellules DU145, transfectées par nucléofection avec 1

ou 1.5 µM de PNA 959 ou avec 0.05 µM de siRNA, ont été étalées dans des puits contenant le milieu

de culture supplémenté de sérum. Le nombre de cellules viables présentes dans les puits a été suivi sur

plusieurs jours pour chaque condition. Le test MTS utilisé permet de corréler l’absorbance à 490 nm

avec le nombre de cellules viables. Ces absorbances rapportées par rapport aux cellules traitées sans

oligonucléotides permettent de suivre les inhibitions de prolifération (ou taux de survie) induites par

les différents traitements.

La Figure 48A nous montre que, sur 4 jours, la prolifération est à peine inhibée (maximum 16%) pour

1 µM de PNA 959 ; l’inhibition de prolifération atteint 38% avec le siRNA à 0.05 µM, et atteint 80%

avec 1.5 µM de PNA 959 après 4 jours. Pourtant le tableau de la Figure 48B nous rappelle qu’à 0.05

µM de siRNA et 1.5 µM de PNA 959 on obtient sensiblement les mêmes inhibitions d’expression de

la protéine IGF-1R (80 et 90% respectivement). Il est donc surprenant d’obtenir autant de différence

de viabilité entre ces deux traitements et on peut se demander si cette mortalité est bien due à des

effets spécifiques. On peut en effet émettre l’hypothèse qu’à 1.5 µM le PNA 959 affecte des cibles

secondaires qui accentuent la mortalité cellulaire. De plus, cette observation ne va pas dans le sens des

études publiées sur l’inhibition de l’activité d’IGF-1R.

Résultats

Etudes cellulaires

117

B Inhibition de la protéine Taux de survie après 4 jours

1 µM PNA 959 60% 87%

0.05 µM siRNA 80% 63%

1.5 µM PNA 959 90% 20%

Figure 48: Effet des oligonucléotides sur la prolifération cellulaire

Des triplicatas de tests de prolifération ont été réalisés avec des DU145 nucléofectées avec 1 ou 1.5

µM de PNA 959 ou 0.05 µM de siRNA. L’absorbance à 490 nm est rapportée par rapport à

l’absorbance des cellules sans oligonucléotide. (A) Le graphe représente les moyennes et écart-types

de ces ratios et révèle ainsi les pourcentages de cellules viables pour chaque condition. (B) Le

tableau donne les valeurs des moyennes d’inhibition de protéine IGF-1R et du taux de survie au bout

de trois jours, pour les concentrations en oligonucléotides indiquées.

D’après mes recherches bibliographiques, l’inactivation d’IGF-1R par un inhibiteur de tyrosine kinase

(TKI) n’a pas d’effet sur la prolifération cellulaire dépendante de l’ancrage, même lorsque 90% du

récepteur est inactivé (136, 161). Les études ont recours à des conditions stressantes (privation du

sérum ou agent cytotoxique) pour observer une inhibition de la prolifération des cellules en

monocouche. Ceci suggère qu’IGF-1R a pour fonction de protéger les cellules de l’apoptose, mais que

dans des conditions non stressantes le récepteur n’est pas indispensable à la survie. Un siRNA dans

des cellules de cancer du poumon (139) et un oligonucléotide antisens 2’MOE dans des cellules de

cancer de la prostate (141), inhibant 80-90% d’expression d’IGF-1R, n’entraînent à leur tour que 25%

d’inhibition de prolifération par rapport aux oligonucléotides contrôles, 3 jours après le traitement. Ces

molécules, contrairement aux TKI, nécessitent des lipides cationiques pour entrer dans la cellule. Ce

traitement entraîne un stress qui pourrait être à l’origine de ces 25% de mortalité. Par contre, Fogarty

A

Résultats

Etudes cellulaires

118

et al décrivent un phosphorothioate qui à 15 nM entraîne un arrêt complet de la prolifération (142). Le

contrôle inhibe tout de même 40% de la prolifération ce qui soulève des doutes quant à la spécificité

de l’effet observé. Enfin, D’cunja et al réussissent à diminuer de 70% le taux de survie de cellules de

tumeurs atypiques teratoïdes/rhabdoïdes du système nerveux central avec un phosphorothioate

inhibant 60% de l’expression d’IGF-1R (140). Cet exemple montre donc un profil qui se rapproche du

nôtre.

On peut supposer que la nucléofection induise un stress cellulaire suffisamment important pour que

l’inhibition d’IGF-1R qui la suit soit proapoptotique. Pourtant, il est surprenant d’obtenir de telles

différences de taux de survie entre les différentes conditions. Je suspecte donc des effets non

spécifiques de participer à cette inhibition de la prolifération.

Des conditions stressantes telles que le retrait du sérum ou l’ajout d’éthanol ont été infligées aux

cellules traitées avec 0 ou 1 µM de PNA 959. Etonnement, je n’ai pas réussi à obtenir de différences

de prolifération. Des inhibitions plus fortes du récepteur sont certainement requises pour atténuer

l’effet antiapoptotique d’IGF-1R.

3) Effets sur la transformation

IGF-1R est une protéine cruciale pour la transformation maligne (cf Rôle dans la transformation, p47).

La plupart des études utilisant des dominants d’IGF-1R montrent une inhibition importante de la

transformation cellulaire (119, 150). Nous avons donc voulu évaluer les effets du PNA 959 sur la

transformation des cellules DU145. La plupart des cellules normales montre un phénomène

d’adhérence, c’est-à-dire qu’elles se divisent seulement si elles sont attachées à un support solide

inerte, tel qu’une surface plastique de boîte de culture. Cette nécessité disparaît lorsque les cellules se

transforment. En effet, la transformation est associée à des changements phénotypiques tels que la

perte de l’inhibition de contact, permettant aux cellules de pousser l’une sur l’autre, et l’indépendance

à l’ancrage rendant la cellule capable de former une colonie dans un milieu semi-solide tel que l’agar

mou. Le test clonogénique de formation de colonies sur agar mou est un bon indicateur du phénotype

transformé et de la capacité mitogénique des cellules. En effet, plusieurs cycles de division sont

nécessaires pour qu’une colonie soit détectable.

Des tests de formation de colonies sur agar mou ont été réalisés pour évaluer la capacité à se

transformer des DU145 traitées avec le PNA 959. Les DU145 ont été perméabilisées à la SLO avec

0.5 µM de PNA 959 ou de PNA scramble. 24 heures après traitement, les cellules (104 cellules/boîte)

ont été étalées dans de l’agar mou. Quinze jours plus tard, les colonies furent comptées : 19.6 ± 4.2

colonies avec les cellules perméabilisées sans PNA, 14.7 ± 4.1 avec le PNA scramble et 7.2 ± 2.4 avec

Résultats

Etudes cellulaires

119

le PNA 959. La formation de colonie a donc été réduite de 65% avec le PNA 959 et de 25 % avec le

PNA scramble. La même expérience a été refaite avec des cellules (104 cellules/boîte) étalées dans

l’agar mou directement après la perméabilisation. On observe exactement les mêmes inhibitions.

Au bout de 30 jours des photos des colonies ont été prises avec un objectif 10X. On observe sur la

Figure 49 qu’en plus d’une diminution du nombre de colonies, la taille des colonies semble être

affectée par le traitement avec le PNA 959.

Figure 49: Tailles des colonies formées par les DU145 traitées ou non par le PNA 959

Les DU145 sont perméabilisées avec 0 ou 0.5 µM de PNA 959, puis étalées dans l’agar mou. 30

jours plus tard, des photos des colonies sont prises avec le système de microscopie LEICA et un

objectif de grossissement 10X. Les images sur différentes épaisseurs de gel sont compilées et

enregistrées avec le logiciel Métamorph.

On a donc montré que le PNA 959 inhibait fortement la transformation des cellules DU145 de cancer

de la prostate.

Chapitre III :

Discussion, conclusions et perspectives

Discussion, conclusions, perspectives

123

I. Un arrêt de l’élongation de la traduction?

1) Une inhibition au niveau traductionnel

Nous avons montré que, dans les cellules, le PNA 959 ciblant la région codante d’IGF-1R inhibe

l’expression du récepteur sans affecter le taux d’expression du transcrit. Le PNA interagit donc avec

l’ARNm mature d’IGF-1R et non avec l’ADN génomique. Il interfère ni avec la transcription ni avec

l’épissage. Enfin, cela montre aussi que le PNA n’induit pas la dégradation du transcrit. Bien qu’une

protéine tronquée ait été observée dans le système acellulaire, aucune n’a été détectée dans les cellules.

L’explication la plus probable serait que cette protéine tronquée soit dégradée par le protéasome. On

peut aussi suggérer que le ribosome une fois arrêté par le PNA reste associé à l’ARNm. Ceci

conduirait à l’arrêt successif des ribosomes suivants et indirectement à une inhibition de l’initiation de

la traduction.

Il a été surprenant d’observer que les PNA 926 et 968 inhibent l’expression d’IGF-1R. Même si ces

inhibitions étaient deux fois moins importantes qu’avec le PNA 959, elles laissent planer un doute soit

sur la nécessité absolue de former une structure triplex dans les cellules, soit sur la présence de

mécanisme d’inhibition autre que celui de l’arrêt de l’élongation. En effet, on ne peut pas certifier que

le PNA bloque l’élongation de la traduction dans les cellules sans protéine tronquée. On ne peut

exclure l’hypothèse que la fixation du PNA entraîne une inhibition de l’initiation de la traduction par

un mécanisme inconnu, comme cela est le cas avec les miRNA, ou que l’hybridation du PNA sur

l’ARNm entraîne ou piège le transcrit dans un compartiment empêchant sa traduction. Malgré tout, il

reste probable que ces inhibitions d’IGF-1R, de l’ordre de 25%, soit non spécifiques.

2) Pas de dégradation de l’ARNm

Comment expliquer que l’ARNm d’IGF-1R n’est pas dégradé par les mécanismes de surveillance

décrits précédemment (cf Mécanisme d’action, p112) ?

La voie NMD « Nonsense-mediated mRNA Decay » dégrade les ARNm contenant un codon stop

prématuré. Ce codon stop empêche les ribosomes d’éliminer tous les complexes de jonction d’exon

présents sur le transcrit épissé, et de stabiliser l’ARNm par circularisation. L’ARNm est alors reconnu

comme anormal et dégradé par la voie NMD. Le blocage par un PNA entraîne les mêmes

conséquences à la différence qu’à priori l’arrêt de l’élongation n’est pas suivi d’une réelle étape de

terminaison de la traduction. Or, il semblerait que c’est l’interaction entre les facteurs de terminaison


124

et le complexe EJC le plus proche qui déclenche la voie NMD (162). Ceci explique certainement que

l’ARNm d’IGF-1R hybridé par le PNA échappe à cette voie de surveillance.

La voie NGD « No-Go Decay », décrite par Doma et Parker chez S. cerevisiae, affecte les ARNm

contenant des structures secondaires si stables qu’elles arrêtent complètement les ribosomes (159)

(Figure 50). Cet arrêt provoque une coupure endonucléolytique à proximité du ribosome, suivie de la

dégradation des produits de coupure. Ce mécanisme requiert la protéine Dom34 qui reconnait le site

ribosomal A libre du ribosome, en mimant un ARN de transfert (162). On peut supposer que si le site

A est occupé par un ARN de transfert, Dom34 ne peut pas déclencher la voie NGD. Il se peut que les

ribosomes arrêtés par le PNA 959 se trouvent dans cette configuration. Cette voie NGD est peu

connue et il existe surement des explications au fait que la stratégie antisens d’arrêt de l’élongation de

la traduction échappe à ce mécanisme de surveillance. Il serait d’ailleurs intéressant d’exploiter cette

propriété pour mieux comprendre la voie NGD. Notre stratégie antisens servirait alors d’outil de

biologie moléculaire.

Image issue de (162)

Figure 50: La voie Non-Go Decay

Lorsque l’ARNm possède une structure tellement stable qu’elle bloque le ribosome, la protéine Dom 34

reconnait le site A libre et une coupure endonucléolytique se produit à proximité du ribosome. Cette

coupure est suivie de la dégradation des transcrits coupés. A droite, un schéma du ribosome est

représenté, avec les sites E, P, A occupés par des ARNs de transfert.


125

3) Détecter une protéine tronquée

Il aurait été intéressant d’obtenir une protéine tronquée d’une part pour valider le mécanisme dans les

cellules, d’autre part pour produire un dominant négatif. Ce dominant négatif se serait dimérisé avec

une protéine d’IGF-1R fonctionnelle et aurait eu un double effet : rendre le récepteur inactif et

diminuer la quantité d’IGF-1 disponible. Toutefois, la diminution de l’expression du récepteur est

suffisamment importante pour obtenir des effets biologiques, tels qu’une réduction de la

transformation cellulaire. La production d’un dominant négatif n’est donc pas indispensable pour

l’efficacité de notre approche antisens.

Je n’ai pas pu consacrer suffisamment de temps à la détection de la protéine tronquée. Plusieurs

expériences auraient pu être réalisées afin de la révéler et de valider le mécanisme d’arrêt de

l’élongation dans les cellules :

- Si la protéine tronquée est dégradée par le protéasome, l’utilisation d’inhibiteurs de

protéasome permettrait de la détecter.

- Pour augmenter les taux d’expression de la protéine il est surement préférable d’utiliser un

gène qui s’exprime de façon transitoire avec un promoteur puissant. On pourrait exploiter

le plasmide exprimant IGF-1R en fusion avec la luciférase Renilla. L’inconvénient serait

que le gène endogène produit un transcrit qui n’a pas le même parcours que le gène

recombinant. Les voies de régulation du transcrit endogène sont bien différentes puisqu’il

subit un épissage, possède une partie 5’UTR différente et une queue polyadénylée

interagissant avec de nombreuses protéines. La localisation et l’initiation de sa traduction

de ces transcrits sont affectées différemment.

- On peut aussi envisager de construire un gène recombinant d’IGF-1R étiqueté, par exemple

avec une polyhistidine. L’étiquette permettrait de faire des immunoprécipitations avec un

bon rendement. En règle générale, les étiquettes sont placées en N ou C-terminale, où elles

sont le plus facilement reconnues par leurs anticorps. Le précurseur du récepteur étant clivé

après la traduction, il faut placer l’étiquette sur la partie N-terminale de la chaîne .

Si on réussit à détecter une protéine tronquée, elle sera en faible quantité. Cette nouvelle approche

antisens n’est pas pertinente pour former des dominants négatifs en quantité suffisante pour qu’ils

aient des effets thérapeutiques. En modulant l’épissage Pankratova et al ont réussi à l’aide d’un PNA à

générer un transcrit ayant perdu un exon (58). Le décalage de la phase de lecture introduit un codon

stop prématuré. La protéine issue de ce transcrit n’est pas montrée dans l’étude. Comme le transcrit

possède un codon stop prématuré, il est fort probable que le transcrit soit dégradé par la voie NMD.


126

Cette stratégie n’est peut-être pas non plus adaptée pour générer un dominant négatif. (cf Correction

de l’épissage, p31). Pour obtenir des quantités suffisantes de dominants, la meilleure méthode reste

l’utilisation de gène recombinant inséré dans des vecteurs viraux, mais cela reste limité par les

problèmes de toxicité liés aux vecteurs (cf Dominants négatifs, p57).

4) Etude mécanistique

Une autre méthode qui permettrait de valider le mécanisme d’arrêt de l’élongation serait de détecter la

présence de ribosomes sur les ARNm hybridés. Arava et al décrivent une méthode permettant de

déterminer le nombre de ribosomes présents sur une portion d’ARNm (163) (Figure 51). La première

étape consiste à séparer les ARNm polysomaux suivant leurs poids par sédimentation sur gradient de

sucrose. Les fractions contenant l’ARNm d’intérêt sont collectées et l’ARNm subit une dégradation

spécifique à l’aide d’un antisens et de la RNase H. Dans notre cas, il faudrait utiliser un antisens à

proximité du site du PNA. Les fragments sont à nouveau séparés par sédimentation et les fractions

sont analysées par Northern blot avec une sonde pour chaque fragment. Dans le cas d’un arrêt de

l’élongation de la traduction, on s’attend à ce que le fragment en aval du PNA ne soit pas chargé de

ribosomes tandis que le fragment en amont le soit.

Figure 51 : La méthode de « Ribosome Density Mapping »

(Image issue de (163))


127

II. Un ciblage plus large

1) Du triplex canonique au triplex partiel

L’avantage de bloquer l’élongation de la traduction plutôt que l’initiation est que cela augmente le

nombre de séquences cibles potentielles. La partie 5’UTR de l’ARNm n’est plus la seule cible

possible, la région codante peut être exploitée. Cela permet d’avoir une alternative au cas où la partie

5’UTR soit très structurée ou possède une forte homologie de séquence avec d’autres ARNm.

Le ribosome possède une très forte activité hélicase qui lui permet de défaire des structures stables

d’acides nucléiques lors de l’élongation de la traduction. Cette propriété rend le ciblage de la région

codante difficile. Knudsen et Nielsen montrent que pour arrêter l’élongation de la traduction, des PNA

polypyrimidiques, formant des triplex de type PNA2:ARN, sont requis pour résister à l’avancée du

ribosome (77). Puis, l’équipe du Professeur Tula Saison Behmoaras décrit des PNA, riches en

pyrimidines, formant avec l’ARNm des triplex partiels et bloquant l'élongation de la traduction. Ces

PNA entraînent même l'apparition de protéines tronquées (71, 80, 81). Les PNA n’ayant plus besoin

d’être polypyrimidiques, cette découverte augmente les cibles potentielles. L’inconvénient est qu’on

ne connait pas les règles permettant de prédire si une séquence formera ou non un triplex partiel

suffisamment stable en conditions physiologiques.

2) Prédire un triplex partiel suffisamment stable

Nous avons sélectionné des PNA pour leur richesse en pyrimidines. Comme des séquences

polypyrimidiques n’ont pas été trouvées sur la région d’intérêt, la formation d’un triplex canonique

était donc exclue. Le criblage réalisé dans ce travail montre que les séquences donnant des protéines

tronquées in vitro sont les PNA possédant un large bloc central polypyrimidique constitué

principalement de thymines : PNA 959 de séquence TTATTTCTCTTTCTATG et PNA 330 de

séquence TTTGTTTTCTTTTCTTC. Beaucoup d’éléments appuient l’hypothèse que le PNA 959

forme un triplex partiel très stable. Le PNA 330 forme une structure différente d’un duplex et stable en

condition physiologique. Il est très probable qu’il forme un triplex mais il est plus difficile de

l’affirmer.

D’après ce criblage, il semble que ce type de bloc soit requis pour former une structure arrêtant

l’élongation de la traduction. Pourtant Sénamaud-Beaufort et al, décrivent des séquences de PNA

contenant majoritairement des cytosines et une ou deux purines en milieu de séquence (cf Tableau 1,

p37), formant des triplex et étant efficaces in vitro (80). Ces tridécamères forment-ils plus facilement


128

des triplex partiels du fait de leur longueur ? Les lois prédisant la formation de triplex partiel à partir

de la séquence sont encore peu comprises. Il serait intéressant de faire des études pour savoir quelle est

la longueur minimale pour qu’un triplex partiel puisse arrêter le ribosome, combien de purines sont

tolérées, et à quelles positions…

Pour augmenter la probabilité de former une structure triplex, on peut remplacer les cytosines par des

pseudoisocytosines. Ces dernières peuvent former des liaisons Hoogsteen à pH physiologique, ce qui

permet d’augmenter le nombre de cibles potentielles pour cette approche antisens. L’utilisation de

PNA-pinces est aussi envisageable et permettrait de cibler plus de séquences. Ces pinces ont

cependant l’inconvénient d’être longs et donc peu solubles. Enfin, l’orientation antiparallèle choisie

dans notre étude n’est peut-être pas optimale. D’après Sénamaud-Beaufort et al (80), l’orientation

parallèle diminue la stabilité des duplex PNA:ARN mais augmente la stabilité des triplex PNA2:ARN.

Lesnik et al montrent aussi que les triplex en orientation parallèle ont des températures d’association

plus basses qu’en orientation antiparallèle, mais des températures de dissociation supérieures (164). Il

serait judicieux donc de tester des PNA en orientation parallèle.

3) D’autres structures possibles ?

Boutimah-Hamoudi et al décrivit un PNA polypyrimidique ne semblant pas former de triplex mais

possédant malgré tout une forte efficacité in vitro (81). Ce PNA a soulevé quelques interrogations. La

formation de triplex est-elle vraiment indispensable ? Est-ce que d’autres types de structures

impliquant des PNA peuvent bloquer l’élongation ? Nous n’avons pas pu répondre à ces questions

mais il semble que l’ARNm de l’intégrase du VIH-1, ciblé par ce PNA, constitue un cas particulier.

On peut imaginer que les PNA puissent former des structures avec l’ARNm qui soient insolvables

pour la machinerie ribosomale. Ces molécules très affines et très flexibles ont auparavant surpris en

étant capables d’envahir la double hélice de l’ADN. Le LNA et le PMO 959 étudiés n’ont pas formé

de structure triplex stable, soulignant que le PNA possède une capacité particulière à former des

structures complexes. D’ailleurs, les structures des complexes formés à pH acide par le PNA 692 et

son ARN ne sont pas résolues.

L’étude sur l’intégrase synthétique démontre que la structure de l’ARNm est un paramètre important

pour l’efficacité de la stratégie. D’une part, si la séquence cible est impliquée dans une structure

secondaire, l’accès au PNA est réduit. Le PNA est heureusement capable de défaire des structures très

stables, mais ceci pourrait expliquer pourquoi le PNA 330 est moins efficace que le PNA 959. D’autre

part, si une structure très stable se trouve en aval ou en amont d’un duplex PNA:ARN, on peut

supposer que cette accumulation de structures puisse être trop déstabilisante pour le ribosome, et


129

faciliter l’arrêt de l’élongation de la traduction. Avec le programme m-fold, nous avions tenté de

mettre en évidence une corrélation entre structure de l’ARNm d’IGF-1R à proximité de la séquence

cible et activité du PNA. Aucune tendance n’a pu en être déduite mais il serait plus judicieux de faire

ce genre d’étude sur un petit ARN dont la modélisation soit plus fiable.

III. Forces et faiblesses de la stratégie

1) Comparaison avec les anticorps et TKI

Les deux classes d’agents les plus utilisées pour bloquer la fonction d’IGF-1R sont les anticorps et les

inhibiteurs de tyrosine kinase (TKI). Beaucoup d’essais cliniques ont été réalisés avec les anticorps qui

présentent des effets secondaires acceptables. Il semble que les essais se soient orientés vers des

combinaisons avec des agents anticancéreux. L’anticorps seul n’aurait pas assez d’effets, mais en

combinaison avec d’autres molécules anticancéreuses il augmente leurs effets thérapeutiques. Pour les

TKI, les résultats sont prometteurs et les problèmes de toxicité limités.

De manière générale, l’utilisation d’anticorps ou de molécules inhibitrices présente des inconvénients.

La stabilité des anticorps et le coût de production sont des inconvénients que les PNA évitent. Les

PNA sont beaucoup plus faciles à synthétiser, puisqu’à partir des monomères ils ne requièrent qu’une

simple synthèse peptidique. De plus, ils sont très stables en milieu physiologique et aucun rapport n’a

montré de toxicité in vivo.

Les inhibiteurs sont souvent sujets à des difficultés de spécificité. Les sites ciblés possèdent souvent de

fortes homologies avec d’autres protéines. Par exemple, dans le cas d’IGF-1R, il a été difficile de

discriminer le site actif d’IGF-1R, de celui du récepteur à l’insuline. Les PNA étant des molécules très

spécifiques de la séquence, et les séquences d’acides nucléiques présentant moins d’homologie que les

séquences peptidiques, l’approche antisens décrite dans ce travail ne présente pas cet inconvénient.

Enfin, pour les petites molécules telles que les TKI, leur passage à travers la barrière hémato-

encéphalique peut conduire à des effets secondaires peu souhaitables. Dans le cas d’IGF-1R, cela est

d’autant plus inquiétant que le système IGF a un rôle neuroprotecteur.

2) Comparaison avec les siRNA et phosphorothioates

Les siRNA et phosphorothioates se sont montrés efficaces pour diminuer l’expression d’IGF-1R (cf

Tableau 5, p56). Cependant, ces molécules présentent de nombreux problèmes de spécificité. En plus

de déréguler de nombreuses cibles secondaires (19, 30), ils déclenchent des réponses immunes (32,


130

33) (cf Problèmes de spécificité, p22). Le phosphorothioate ne requiert que six bases contiguës

appariées pour recruter la RNase H et donc dégrader un ARN. Le PNA n’induisant pas de coupure de

l’ARNm, sa liaison sur un site non spécifique a moins d’impact. Cependant, on ne peut pas exclure

quelques effets indésirables dus à la liaison du PNA sur des sites secondaires. Pour un PNA de 17

bases, on trouve de nombreuses cibles sur le génome, et sur le transcriptome il est difficile de trouver

des séquences de moins de 15 bases qui soient uniques. Malgré tout, le PNA reste bien plus spécifique

que le siRNA ou le phosphorothioate, et à ma connaissance aucune étude ne révèle qu’il est reconnu

par le système immunitaire.

Bohula et al, montrent que la structure secondaire de l’ARNm d’IGF-1R peut être un frein à

l’efficacité des siRNA (165). Les régions peu accessibles de l’ARN s’hybrident moins bien aux

siRNA et les taux de coupure sont beaucoup plus faibles. Avec les PNA, les problèmes d’accessibilité

de l’ARN sont réduits car cette molécule a la particularité d’être très affine pour l’ARN et d’être

capable d’envahir des structures stables d’acides nucléiques tels que la double hélice de l’ADN, des

structures en épingles à cheveux très stables ou des G-quadruplex (12).

3) Spécificité de la stratégie

Dans le cas du PNA C-13 on observe une inhibition de 17% de la transcription. Cette inhibition ne

semble pas significative mais il est vraisemblable qu’un PNA contenant un large bloc pyrimidique,

affecte la transcription par une invasion de la double hélice de l’ADN. Le PNA 959 chevauche deux

exons ce qui le rend moins apte à agir au niveau transcriptionnel, mais on peut imaginer qu’un autre

PNA formant un triplex de 17 bases avec l’ADN serait capable d’agir comme un agent antigène. En

théorie, cela donne le même résultat : une diminution de l’expression génique. Cependant, on trouve

sur l’ADN génomique beaucoup plus de séquences cibles secondaires que sur le transcriptome. Des

problèmes de spécificité sont donc envisageables.

Nous avons montré qu’en réduisant la taille du PNA du côté N-terminal, on obtient un 13-mère qui

perd peu d’efficacité. Il serait intéressant d’étudier les cibles secondaires affectées par différentes

longueurs de PNA. En effet, plus le PNA est long, moins il a de cibles de même identité, mais plus il a

de cibles secondaires. Des mésappariements, surtout s’ils sont aux extrémités ne sont pas toujours

suffisamment déstabilisants pour empêcher la fixation d’un oligonucléotide. Le choix de la taille est

donc délicat. Il convient de trouver la taille la plus efficace et ayant le moins de cibles secondaires

possibles. Heureusement, le PNA a l’avantage d’être un analogue d’acide nucléique très sélectif. La

nécessité de formation de triplex augmente aussi la sélectivité du PNA car le mésappariement sera

deux fois plus pénalisant que pour un duplex. On peut donc prédire que les cibles secondaires ne

seront pas si nombreuses.


131

Les tests de viabilité réalisés dans ce travail laissent penser qu’à 1.5 µM, le PNA 959 n’est plus

spécifique. En effet, la mortalité observée est soudainement forte (67% de diminution de taux de

survie entre 1 et 1.5 µM) et il a été montré dans des études précédentes qu’inhiber l’activité d’IGF-1R

n’a pas d’impact direct sur la prolifération cellulaire en monocouche. A cette concentration, le PNA se

fixe certainement sur des cibles secondaires contenant par exemple une dizaine de bases contiguës

complémentaires. Ces variations d’expression conduiraient à une apoptose massive.

Le PNA 959 possède 11 thymines sur 17 bases. On peut s’inquiéter que cette richesse en thymine le

rende capable de s’hybrider aux queues polyadénylées des ARNm. Ceci pourrait certainement

entraîner des effets sur la stabilité des ARNm, sur leurs taux de traductions, voire sur leurs

localisations. Il y a par exemple des protéines de liaisons à la queue polyA, PABP, qui ont une grande

influence sur le devenir de l’ARNm et interviennent par exemple dans la circularisation de l’ARNm

pendant la traduction. Leur bloquer l’accès aux ARN par un PNA serait problématique. Cependant,

comme ces protéines sont présentes sur le transcrit dès sa biogenèse, on peut penser que le PNA n’a

pas accès à cette zone. Rien ne montre que ce phénomène a lieu, mais il pourrait expliquer la forte

diminution des taux de survie observée à 1.5 µM.

4) Biodistribution

Une limitation importante à cette stratégie est que les PNA, molécules neutres, sont peu solubles et ont

une mauvaise biodistribution. Pour pallier le problème de pénétration cellulaire, plusieurs stratagèmes

ont été développés.

Les membranes cellulaires portant des charges négatives, les molécules chargées positivement

interagissent avec les membranes et sont endocytées. Des peptides cationiques, dits « cell-penetrating

peptides » CPP, se caractérisent par leur capacité à être internalisés par les cellules de mammifères et à

transporter des macromolécules avec eux. Ils sont donc greffés aux PNA et de nombreuses études

comparent leurs efficacités. Les plus étudiés sont surement le pTat, la pénétratine, le transportan et les

oligoargines. Leur capacité à transporter les PNA varie énormément en fonction du PNA, du type de

cellule ou de la nature de la liaison entre le PNA et le CPP. Plusieurs études in vivo ont été réalisées.

Par exemple, un PNA conjugué à un peptide riche en arginine a été injecté dans des muscles de souris

et a montré une efficacité antisens 3 fois supérieure au PNA nu, prouvant que le peptide améliore la

biodistribution du PNA sans affecter son affinité pour la cible (166). Un autre PNA conjugué à quatre

lysines a été injecté dans des souris et a montré une activité dans plusieurs organes, tels que le cœur,

les poumons et les muscles (55). La vectorisation de ces conjugués est un sujet d’étude encore en

développement et il n’existe pas de lois permettant de choisir le bon CPP. Notre équipe travaille sur la


132

pénétration cellulaire de PNA conjugués à différents CPP et tente de comprendre le mode

d’internalisation des conjugués.

Des stratégies consistent à ajouter des charges négatives au PNA pour pouvoir le transfecter dans les

cellules à l’aide de lipides cationiques. Par exemple, les PNA peuvent être hybridés à des ADN simple

brin afin de former des duplex chargés. Doyle et al montrent qu’on obtient une certaine activité dans

les cellules par ce procédé, mais l’inconvénient de cette méthode est que les PNA doivent d’abord se

dissocier de l’ADN avant d’atteindre leurs cibles (78). On peut aussi greffer au PNA des groupements

phosphonates (Figure 52A): un tel conjugué n’affecte pas l’affinité du PNA pour l’ARN et peut

augmenter l’activité biologique de 20 fois par rapport à un duplex PNA:ADN (167). Le squelette du

PNA a aussi été modifié afin d’y ajouter des charges. Des dérivés de PNA basés sur des trans-4-

hydroxyl-L-proline, nommé HypNA-pPNA (Figure 52B), sont ainsi transfectés avec des lipides

cationiques dans les cellules et montrent une activité antisens (168). L’inconvénient de ces dérivés est

qu’ils sont moins flexibles que les PNA, ce qui pourrait diminuer leur capacité à former des triplex.

D’autres modifications ont été apportées aux PNA, tel que l’introduction d’un groupement guanidium

donnant des GPNA (Figure 52C). Ceux-ci traversent aussi efficacement la membrane cellulaire que le

domaine de transduction de la protéine Tat du VIH, largement étudié comme transporteur. Les charges

positives du GPNA ne l’empêchent pas de conserver une forte spécificité de séquence, cependant un

oligothymine GPNA se liera à l’ADN en formant un duplex plutôt qu’un triplex. Son encombrement

stérique et les effets électrostatiques jouent certainement un rôle dans sa difficulté à former un triplex

(169).

Des transporteurs peptidiques non covalents permettent d’internaliser des PNA ou des HypNA-pPNA.

Ces peptides amphipathiques forment des nanocomplexes stables avec les PNA sans liaisons

covalentes. Morris et al réussissent à bloquer la croissance de tumeur par injection intraveineuse d’un

HypNA-pPNA anti cycline B1 impliqué dans ce type de complexe (170).

Enfin, le moyen de vectorisation qui semble le plus intéressant dans notre cas serait de conjuguer les

PNA à des ligands du récepteur membranaire IGF-1R. En effet, des études montrent qu’en conjuguant

un PNA ou un siRNA à un analogue d’IGF-1, constitué de cinq acides aminés de conformation D, ont

réussi à internaliser efficacement le conjugué. Le peptide analogue se lie au récepteur et induit son

internalisation par endocytose. Cette approche a le grand avantage de cibler plus sélectivement les

cellules exprimant le plus d’IGF-1R (171). En conjuguant le peptide à un siRNA ciblant IRS-1, on

arrive ainsi à diminuer fortement l’expression du substrat dans les cellules du cancer du sein (172).


133

A B

C

Figure 52 : Structures chimiques de quelques modifications apportées aux PNA

A/ Phosphonates conjugués aux PNA. B/ Structure chimique d’un HypNA-pPNA, C/ Structure

chimique d’un PNA et d’un GPNA polythymines.


134

5) Des concentrations élevées

Contrairement aux siRNA ou phosphorothiates qui s’utilisent à des concentrations catalytiques de

l’ordre du nanomolaire, les bloqueurs stériques requierent des concentrations in vitro de l’ordre du

micromolaire. Ces concentrations peuvent être acceptables pour des traitements locaux mais pour une

utilisation systémique cela peut poser des problèmes. De plus, le PNA est une molécule très stable qui

n’est pas métabolisée et qui risque donc de s’accumuler dans les reins. Cependant, il est possible qu’in

vivo le PNA puisse avoir un effet antitumoral à des concentrations cellulaires plus faibles. En

combinant le PNA à un agent cytotoxique, comme c’est le cas avec les anticorps anti-IGF-1R ou les

inhibiteurs de tyrosine kinase, on peut espèrer augmenter les effets du PNA.

IV. Conclusion

1) Une nouvelle approche antisens dans les cellules

Dans cette thèse, une nouvelle approche antisens pour inhiber l’expression d’une protéine a été décrite

et validée dans les cellules. Cette stratégie consiste à utiliser des PNA complémentaires de la région

codante d’un ARNm pour arrêter l’élongation de la traduction. Pour arrêter la machinerie ribosomale,

les PNA doivent former des structures triplex de type PNA2:ARN. Ces analogues d’acides nucléiques

agissent comme des bloqueurs stériques et inhibent la synthèse protéique. Nous avons commencé par

montrer que dans un système acellulaire l’arrêt de l’élongation de la traduction d’un long ARN était

possible, et qu’un PNA contenant un large bloc central polypyrimidique riche en thymine forme des

triplex partiels suffisamment stables. Dans les cellules, nous avons pu observer une forte activité

antisens. Nous n’avons pu détecter de protéine tronquée, mais les taux d’expression de l’ARNm ne

sont pas affectés par le traitement. Ceci suggère que la régulation a bien lieu au niveau traductionnel et

que l’ARNm n’est pas dégradé. Le mécanisme le plus probable est que l’arrêt de l’élongation est suivi

d’une dégradation de la protéine tronquée. Pour la première fois dans les cellules, nous avons montré

que des PNA étaient capables d’arrêter l’élongation de la traduction. Cette stratégie antisens a

plusieurs avantages : les PNA sont faciles à synthétiser, stables en milieu physiologiques, d’une

grande spécificité de séquence, pas ou peu immunogènes et capables de cibler des séquences

impliquées dans des structures stables. La contrainte de séquence imposée par le triplex ou la

mauvaise biodistribution du PNA sont des limitations sur lesquelles il serait bon de poursuivre les

études, mais pour inhiber la traduction dans les cellules les biologistes ont désormais une autre corde à

leur arc.


135

2) Inhibition d’IGF-1R et ses effets biologiques

Nous avons choisi comme modèle d’étude la protéine IGF-1R, impliquée dans la survie et la

prolifération cellulaire. Par cette approche antisens, l’expression de la protéine a été fortement réduite

et de manière spécifique de la séquence avec 1 µM de PNA. Les voies de signalisation en aval

PI3K/AKT et MAPK, des voies de signalisation mitogénique et antiapoptotique, sont affectées par le

traitement puisqu’on observe une diminution de l’activation des intermédiaires de ces voies. Enfin, la

transformation cellulaire est fortement réduite par le PNA. Je n’ai pas réussi à trouver des conditions

adéquates pour mettre en évidence une diminution de la survie clonogénique des cellules proliférant en

culture monocouche. L’utilisation d’agent cytotoxique en combinaison avec le PNA permettrait

certainement d’observer une différence de prolifération. Beaucoup de travail reste à faire avant de

passer aux études in vivo. Il est important par exemple, de montrer que ce phénomène a lieu dans

d’autres types cellulaires et de trouver un moyen de vectoriser le PNA, par exemple en le couplant à

un CPP ou à l’analogue d’IGF-1 décrit précédemment (cf Biodistribution, p131). Ce travail montre des

résultats encourageants et propose une nouvelle stratégie pour inhiber l’activité du récepteur à l’IGF-1,

protéine d’intérêt thérapeutique majeur.

Chapitre IV :

Matériels et Méthodes


139

I. Oligonucléotides

Tableau 15: Oligonucléotides utilisés dans ce travail

Oligonucléotide

Séquence

(N vers C pour PNA

5’ vers 3’ pour les autres)

Coefficient

d’extinction molaire

(mM-1

.cm-1

)

Fournisseur

PNA

ou

PO

330 TTTGTTTTCTTTTCTTC 155.7

Eurogentec

S.A. (Seraing,

Belgique)

476 TTGTTCCTGGTGTTTAT 152.2

558 GGCTCCACGTCCTTGTT 146.4

692 CCCTTTCTCCCCACCAC 136.6

883 ATACTTCCTGTATTCCT 153.2

926 TTTTCATATCCTGTTTT 149.4

959 TTATTTCTCTTTCTATG 149.6

968 TACAGCACTCCATTCCC 152.0

ARN

330 GAAGAAAAGAAAACAAA 199.2

476 AUAAACACCAGGAACAA 185.3

558 AACAAGGACGUGGAGCC 174.5

692 GUGGUGGGGAGAAAGGG 182.3

883 AGGAAUACAGGAAGUAU 191.5

926 AAAACAGGAUAUGAAAA 195.9

959 CAUAGAAAGAGAAAUAA 197.5

968 GGGAAUGGAGUGCUGUA 178.7

LNA 959 TTATTTCTCTTTCTATG 149.6

PMO 959 CTGCTGTTATTTCTCTTTCTA

TGGA 250.5

GeneTools, LLC

(Philomath,

OR,USA)

ARN antiPMO UCCAUAGAAAGAGAAAUAA

CAGCAG 272.8

IBA

(Göttingen,

Allemagne)

PNA scramble TATTCTTGTTCTTATCT 149.6 Dr Philippe Simon


140

PNA

N15 TTATTTCTCTTTCTA 131.9

Dr Philippe Simon

N14 TTATTTCTCTTTCT 117.2

N13 TTATTTCTCTTTC 109.4

C13 TTCTCTTTCTATG 111.3

C14 TTTCTCTTTCTATG 119.4

C15 ATTTCTCTTTCTATG 133.5

C16 TATTTCTCTTTCTATG 141.5

PO: phosphodiester, LNA: locked nucleic acid, PMO: phosphorodiamidate morpholino, PNA: peptide

nucleic acid

Pour le LNA 959, les bases en gras sont des résidus LNA tandis que les autres bases sont des

désoxyribonucléotides. Les PNA ont tous une ou deux lysines en C-terminal.

1) Synthèse des PNA au laboratoire

Le PNA scramble et les PNA N13-15 et C13-16 ont été synthétisés par le docteur Philippe Simon avec

un synthétiseur automatisé Expedite 8909 (AME biosciences, Sharnbrook, Royaume-Uni), comme

décrit par Mayfield et al (173). Les monomères de PNA ont été achetés chez Link Technologies

(Bellshill, Royaume-Uni). Leurs masses molaires ont été vérifiées par spectrométrie de masse

MALDI-TOF.

2) Calcul des concentrations

Les molécules fournies par les sociétés Eurogentec, IBA et Genetools sont livrées sous forme

lyophilisée et sont resuspendues dans de l’eau bidistillée. Les concentrations sont déterminées par

mesure de l’absorbance à 260 nm avec un Nanodrop ND-1000 (Thermo Scientific, Brébières, France).

Le Nanodrop permet une mesure de l’absorbance rapide et économique des acides nucléiques et de

leurs analogues. Les coefficients d’extinction molaires ont été calculés avec le programme sur

http://rddm503serveur.mnhn.fr/epsilon, qui exploite le modèle du premier voisin selon l’équation :

N-1 N-1

∑ voisin le plus proche) - ∑ individuelle

1 2

voisin le plus proche est la constante pour le voisin le plus proche d’une paire de bases, individuelle est la

constante pour une base individuelle, et N le nombre de résidu.


141

3) siRNA

Le siRNA ciblant IGF-1R humain, décrit par Rochester et al (129), a été commandé chez Sigma

(Lyon, France), a pour coefficient d’extinction molaire = 199 mM-1

.cm-1

et a la séquence suivante :

brin sens: 5'-CAAUGAGUACAACUACCGCdTdT-3'

et brin antisens 5'-GCGGUAGUUGUACUCAUUGdTdT-3'.

II. Transcription et traduction in vitro

1) Construction des plasmides

(a) Le plasmide pIGFIR

Le plasmide pIGFIR a été construit par insertion de l’ADN complémentaire d’IGF-1R de 4.1 kb dans

le vecteur hôte pcDNA3, en aval du promoteur SP6. L’insert est extrait du plasmide pCVNIGF-IR,

donné par le docteur Renato Baserga (Thomas Jefferson University, PA) (150), par digestion avec les

enzymes de restriction Xba1 et BamH1. La digestion est séparée sur gel d’agarose, l’insert est découpé

sur gel et purifié avec le kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen). 100 fmol d’insert et 30 fmol de

vecteur pcDNA3 digéré par les mêmes enzymes sont ligués par 40 unités de T4 DNA ligase (Biolabs).

La ligation est transfectée dans des bactéries compétentes DH5 (Invitrogen) et les bactéries sont

séléctionnées sur boîte LB/agar sous sélection ampicilline. Des clones sont repiqués et cultivés. Leurs

ADNs génomiques sont extraits avec le kit Plasmid Mini ou Maxi, et séquencés par Genome Express

(Meylan, France).

(b) Le plasmide pSP6-IN-muté

Le plasmide pmRFP-INS-C2, fourni par l'équipe du docteur P. Cherepanov (157), contient l’intégrase

synthétique dont l’extrémité N-terminale est en fusion avec la Red Fluorescent Protein. Avec le kit

QuickChange II XL Site Directed Mutagenesis (Stratagene), une mutagenèse dirigée a été faite sur ce

plasmide pour rétablir le site PPT sur le gène néosynthétique de l’intégrase. Les amorces, de séquence

5’-CATCCACAACTTCAAAAGAAAAGGGGGCATCGGTGGCTAC-3’ et son complémentaire, ont

été utilisées et le temps de polymérisation de la PCR a été fixé à 6 minutes pour avoir le temps faire le

tour du plasmide. Le plasmide muté est amplifié et purifié, puis le gène muté de l’intégrase

synthétique est extrait par les enzymes de restriction XhoI et HindIII. Cet extrait est inséré dans le

vecteur hôte pcDNA3, en aval du promoteur SP6, comme décrit ci-dessus (cf Le plasmide pIGFIR,


142

p141). Le codon d’initiation sauvage a disparu sur ce gène, car le gène était en fusion avec la RFP. La

traduction commence donc au deuxième codon AUG, celui-ci se trouvant par chance en phase. On

obtient donc une intégrase plus courte : 30 kDa au lieu de 32 kDa pour la sauvage.

2) Transcription in vitro

Pour transcrire un gène in vitro, il faut que l’ADN complémentaire de ce gène se trouve en aval d’un

promoteur d’ARN polymérases de phages, et que le plasmide soit linéarisé et purifié par une

précipitation à l’éthanol.

La transcription in vitro est faite sur le plasmide linéarisé par BamH1 avec le kit AmpliScribe™ SP6

High Yield Transcription (Epicentre, Madison, WI, USA) et 1 unité d’inhibiteur de ribonucléase

RNasin® (Promega, Charbonnières-les-Bains, France). Ce kit permet de transcrire un gène contenant

un promoteur SP6. On laisse la polymérase agir pendant 4 heures à 37°C. La digestion par BamH1

permet d’arrêter la transcription à la fin du gène puisqu’aucun signal d’arrêt n’est présent sur le

plasmide. Le transcrit est ensuite purifié sur colonne chromatographique Chroma Spin+TE-400

(Clontech, Saint-Germain-en-Laye, France) qui permet d’éliminer les dNTP, de l’enzyme et de tous

les ARN de tailles inférieures à 1000 bases. Cette étape est suivie d’une précipitation à l’éthanol.

3) Traduction in vitro

(a) Principe

Le lysat de réticulocyte de lapin est un système de traduction acellulaire permettant la synthèse

protéique in vitro à partir d’ARN eucaryote. In vivo, les réticulocytes sont des cellules hautement

spécialisées et responsables de la synthèse de l’hémoglobine. Ces cellules ont perdu leurs noyaux mais

contiennent des ARNm et la machinerie de traduction complète nécessaire pour la production à haut

débit de la globine. Ces extraits contiennent donc les composants macromoléculaires de la traduction :

des ribosomes 80S, des ARN de transfert, des synthétases aminoacyl-ARNt, des facteurs d’initiation,

d’élongation et de terminaison… Le traitement aux nucléases des extraits permet d’éliminer l’ARNm

de la globine et de traduire plus efficacement des ARN exogènes même à faible concentration.


143

(b) Procédure

L’ARN (1.6 µg) est pré-incubé avec les oligomères 5 minutes à 37°C. Le mélange est ensuite ajouté à

17 µl de lysat de réticulocyte de lapin traité contre les nucléases (Promega), auquel on ajoute un

mélange d’acides aminés sans méthionine et de la méthionine 35

S (30 µCi). La traduction se déroule à

37°C pendant 20 minutes. Les concentrations d’oligomères correspondent à la concentration dans le

lysat.

On ajoute au lysat 1 unité de RNase H d’E. coli (New England Biolabs) lorsqu’on souhaite induire une

coupure spécifique de l’ARN par un phosphodiester. Il ne faut pas mettre trop de ribonucléase, ni la

mettre pendant la pré-incubation car cela entraîne trop de coupures non spécifiques.

Les protéines synthétisées et radiomarquées sont séparées par un gel Tris-glycine, SDS-PAGE à 12

mA. Le gel est ensuite mis dans un bain de fixation : 10% Ethanol/10% acide acétique pendant 45

minutes puis lavés dans un bain d’eau distillée. Le gel est transféré et séché sur papier Whatman 3MM

et exposé à un écran radiosensible. La révélation de la radioactivité se fait avec un Typhoon (cf

Détection radioactive p146).

III. Expériences de dénaturation thermique

1) Principe

Les expériences de dénaturation thermique suivies par spectroscopie d’absorbance permettent de

mesurer la stabilité d’une structure. Un changement conformationnel peut en effet induire une

variation des propriétés d’absorbance d’une molécule. La dénaturation thermique d’un acide nucléique

structuré peut s’accompagner d’un hyperchromisme (augmentation de l’absorbance) ou d’un

hypochromisme (diminution de l’absorbance) selon la longueur d’onde choisie. Les courbes de

dénaturation thermique d’acides nucléiques à 260 nm présentent ainsi une transition qui marque le

passage de la forme associée ou repliée à dissociée et dépliée. La température de demi-transition Tm,

qui correspond à la température pour laquelle 50% des molécules sont dénaturées peut être

déterminée.


144

2) Matériel

Les absorbances sont enregistrées en fonction de la température, avec un spectrophotomètre Uvickon

XL (BioTek) et des cuvettes de quartz de trajet optique de 1 cm. La température de la cuvette est

régulée par un Peltier Thermosystem et son logiciel LifePower tm (DuSotec GmbH). Ce système

permet de programmer des gradients de température à des vitesses de l’ordre du 0.5°C/min.

LifePower tm permet aussi l’acquisition des données.

3) Préparation de l’échantillon

Le tampon utilisé pour cette expérience ne doit pas absorber dans les longueurs d’onde étudiées, entre

200 et 700 nm, et son pH ne doit pas varier en fonction de la température. Le tampon composé de

cacodylate de sodium (pKa = 6.27 à 25°C) remplit ses conditions avec un pouvoir tamponnant entre

5.0 et 7.4. Les échantillons sont préparés dans un tampon contenant 100 mM de KCl et 10 mM de

cacodylate de sodium à pH 7. Les échantillons contiennent 1 µM d’ARN et 1 ou 2 µM d’oligomères

dans ce tampon. Les échantillons contrôles contiennent 2 µM d’ARN ou 2 µM d’oligomères. Une fois

dans la cuvette, l’échantillon est recouvert d’une goutte d’huile minérale pour éviter l’évaporation.

Lors du préchauffage de la cuve, les bulles éventuelles sont chassées par tapotement.

4) Procédure

Le spectrophotomètre possède un double faisceau qui permet de soustraire le solvant de référence

pendant l’acquisition. La première étape consiste à réaliser une ligne de base entre 190 et 800 nm avec

deux cuves contenant de l’eau bidistillée pour initialiser le signal entre les deux chariots. Le spectre

d’absorbance de l’échantillon est ensuite mesuré entre ces mêmes longueurs d’onde. Enfin, le gradient

de température est programmé : les mélanges sont d’abord chauffés à 90°C, refroidis jusqu’à 10°C,

puis chauffés jusqu’à 90°C à une vitesse de 0,5°C/min. Les absorbances à 260, 295 et 330 nm sont

enregistrées en fonction de la température.

5) Analyse

Des fichiers de données sont générés et traités sous excel. Pour chaque température, l’absorbance à

260 ou 295 nm est corrigée par celle à 330 nm par soustraction, et les courbes A = f(T) sont tracées.

Les Tm sont estimés graphiquement en traçant la médiane entre les lignes de bases à basse et haute

température.


145

IV. Gels retards et gels dénaturants

1) Radiomarquage des ARN

20 picomoles d’ARN sont radiomarqués à leurs extrémités 5’ avec 30 µCi de [γ32

P] ATP (3000

Ci/mmol) et 10 unités de T4 polynucléotide kinase (Biolabs), dans le tampon de la kinase. Le mélange

est incubé entre 30 et 60 minutes à 37°C. Les ARN sont purifiés par des colonnes de chromatographie

micro Bio-Spin 30 (Biorad, Marnes-la-Coquette, France) pour éliminer l’enzyme et l’ATP libre. Ils

sont ensuite stockés à -20°C.

2) Formation des complexes

Un mélange de 100 µM d’ARN non marqués et de 10 nM d’ARN radiomarqués est incubé dans 50

mM Tris, pH 8 ou 50 mM d’acide 2-(N-morpholino)ethanesulfonique (MES), pH 6 avec des

concentrations croissantes en oligomère complémentaire, à 37°C pendant 10 minutes.

3) Gel natif

L’électrophorèse de gel de polyacrylamide en condition native permet d’observer des structures

d’acides nucléiques. Ces espèces migrent en fonction de leurs tailles et de leurs charges apparentes,

qui varient en fonction de leur nature et structure.

10% de sucrose et les colorants xylène-cyanol et bleu de bromophénol sont ajoutés aux échantillons

avant de les charger sur un gel non dénaturant 15% polyacrylamide/bisacrylamide (19/1). Pour les

expériences à pH 8.3, les gels et tampons contiennent du TBE (100 mM Tris, 90 mM acide borique, 1

mM d’EDTA) à pH 8,3, et pour les expériences à pH 6, ils contiennent du MES à pH 6. Le gel migre à

5W et à 25°C grâce à un thermostat. Ces conditions permettent de conserver les structures et de

minimiser la dénaturation.

4) Gel dénaturant

L’électrophorèse de gel de polyacrylamide en condition dénaturante permet de comparer la stabilité

des complexes pré-formés. Les échantillons sont dilués dans un tampon de charge dénaturant


146

contenant 50% de formamide final et des colorants. Ils sont chargés sur un gel dénaturant 12%

polyacrylamide/7M urée, TBE, pré-migré à 70W.

5) Détection radioactive

Les gels sont transférés et séchés sur papier Whatman 3MM et exposés à un écran radiosensible à base

de cristaux de BaFBr:Eu2+

dans une matrice organique (Molecular Dynamics). Ces écrans permettent

la conversion des électrons émis par le rayonnement du 32

P ou 35

S en photons. Une excitation à 633

nm, induisant la réduction et désexcitation des cristaux d’europium de l’écran, conduit à l’émission de

photons à 390 nm. L’instrument Typhoon (Amersham Biosciences) détecte cette émission après avoir

excité les cristaux. L’image générée est analysée avec le logiciel ImageQuant (Molecular Dynamics).

V. Transfection de cellules

1) Culture des cellules

Les HeLa, lignée de cancer du sein, sont cultivées dans du DMEM (Dulbecco's Modified Eagle

Medium) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplémenté par du sérum de veau fœtal (SVF) de Perbio,

et 2mM de L-glutamine (Invitrogen). Pour les DU145, lignée de cancer de la prostate, le DMEM est

remplacé par du RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute) d’Invitrogen. Elles sont toutes

cultivées dans un incubateur à 37°C et 5% de CO2.

2) Transfections de cellules

Les PNA, molécules neutres, ne sont pas transfectables par les lipides cationiques et il faut une

méthode de perméabilisation qui permet au PNA d’entrer dans la cellule par diffusion à travers des

pores.

(a) Par nucléofection

La nucléofection est une méthode d’électroporation développée par Amaxa permettant la transfection

de substrats dans des cellules de mammifères difficiles ou impossibles à transfecter par d’autres

méthodes. L’application d’un champ électrique permet la perméabilisation de la membrane plasmique

et, contrairement à une électroporation classique, de la membrane nucléaire. Les substrats tels qu’un


147

plasmide peuvent atteindre le noyau sans attendre la division cellulaire de la cellule. Cette méthode

permet donc de transfecter des cellules ne se divisant pas telles que les neurones.

Les solutions de PNA sont chauffées 5 minutes à 65°C puis centrifugées 3 minutes à 13 000 rpm afin

de dissocier et de culoter les possibles agrégats. Les électroporations se font à une concentration de

10 000 cellules/µl de tampon avec l’instrument Amaxa Nucleofector (Lonza, Cologne, Allemagne).

Pour les HeLa et les DU145, le kit SE 96-well Nucleofector (Lonza) est utilisé et les programmes

sélectionnés après optimisation sont : CM-113 pour les HeLa et CM-137 pour les DU145. Après

électroporation, les cellules sont laissées 10 minutes à température ambiante. 4 volumes de milieu

supplémenté à 37°C sont ajoutés et les cellules sont ensemencées. Les concentrations d’oligomères

correspondent à la concentration après neutralisation.

(b) Par perméabilisation à la Streptolysine-O

La Streptolysine-O (SLO) est une toxine bactérienne formant une hélice et est toxique pour les

cellules eucaryotes. Sa toxicité résulte de sa capacité à se lier au cholestérol et à former des trous dans

la membrane plasmique. Cette capacité est exploitée pour perméabiliser les cellules et faire entrer des

molécules telles que les PNA. Ces pores ont un diamètre d’environ 13 nm.

Certaines transfections sont réalisées avec de la Streptolysine-O (SLO) (Institute of Medical

Microbiology and Hygiene, Mainz, Allemagne), comme décrit par Faria et al (174). Les cellules sont

trypsinées et lavées plusieurs fois au HBSS (Hank's Buffered Salt Solution) froid. Elles sont

finalement resuspendues à une concentration de 13 millions de cellules/mL dans du HBSS froid. Les

solutions de PNA sont chauffées 5 minutes à 65°C puis centrifugées 3 minutes à 13 000 rpm afin de

dissocier et de culoter les possibles agrégats. L’oligomère et la SLO sont ajoutés aux cellules. Après

de légers pipetages pour homogénéiser, le mélange est placé 15 minutes dans l’incubateur. 9 volumes

de milieu avec SVF sont ajoutés pour refermer les pores induits par la SLO et les cellules sont

replacées dans l’incubateur 20 minutes avant d’être ensemencées. Les concentrations d’oligomères

correspondent à la concentration après neutralisation.

(c) Pourquoi deux méthodes ?

Après un an et demi d’utilisation du Nucleofector, les effets du PNA et du siRNA ciblant IGF-1R ont

disparus dans les cellules DU145. Un PNA conjugué à la fluorescéine ou un plasmide exprimant la

GFP ont pourtant permis de vérifier le bon fonctionnement de l’appareil. La GFP et la fluoréscéine

étaient détectées dans 95% des cellules. La perméabilisation à la SLO a fini par être testée et les effets

d’inhibition d’IGF-1R sont revenus.

http://www.thelabrat.com/protocols/Hanks.shtml


148

3) Optimisation

Le docteur Pierre Vekhoff a procédé à une optimisation qui a permis de sélectionner le programme

CM-137 pour les cellules DU145. L’optimisation se fait avec un plasmide exprimant la GFP que l’on

nucléofecte par différents programmes et tampons. L’efficacité de transfection est estimée par mesure

de la fluorescence au FACS (Fluoresence Activated Cell Sorter). L’efficacité de chaque stock de SLO

est évaluée pour chaque lignée en transfectant un PNA couplé à une fluorescéine. Le FACS permet

d’évaluer les taux de perméabilisation obtenus pour différentes quantités de SLO ajoutées aux cellules.

La mortalité des cellules est évaluée le lendemain dans des puits ensemencés.

VI. Mesure de signaux luciférases

La luciférase est utilisée comme gène rapporteur pour évaluer l’efficacité de transcription d’un

promoteur ou le taux d’expression d’une protéine en fusion avec la luciférase. Le taux d’expression de

la luciférase peut être mesuré facilement et rapidement grâce à ses propriétés photochimiques. En

effet, les luciférases sont une classe d’enzyme catalysant l’oxydation de la luciférine en oxyluciférine.

Cette réaction provoque l’émission d’un photon.

1) Matériel

Le plasmide pIGFIR-Rluc nous a été fourni par le docteur Tarik Issad (INSERM U567, UMR 8104)

(175). Il contient l’ADNc d’IGF-1R dont la partie C-terminale est en fusion avec la luciférase Renilla

reniformis (Rluc). Cette chimère est sous-clonée dans le vecteur hôte pcDNA3 en aval du promoteur

CMV. Le plasmide pCMV-FLuc contient la luciférase Firefly Photinus Pyralis (Fluc) en aval d’un

promoteur CMV.

Le kit Dual Glo luciférase (Promega) permet la mesure sensible, rapide et distincte des luciférases

Rluc et Fluc qui seraient exprimées simultanément par des cellules. Elle discrimine la luciférase Fluc

et Rluc, en permet la mesure de l’activité de l’une puis de l’autre. Le Victor Wallac permet la

détection quantitative d’émission de lumière. Il permet la mesure de luminescence, de fluorescence et

d’absorbance avec une haute sensibilité.


149

2) Optimisation

Le plasmide pIGFIR-Rluc de 10.6 kb ne se transfectait pas dans les Hela avec le programme conseillé

par Amaxa. Une étape d’optimisation a permis de sélectionner le programme CM-113 en mesurant le

signal luciférase avec le kit Renilla luciferase (Promega) et en normalisant par rapport à la

concentration en protéine (cf Mesure de la concentration en protéines, p150).

3) Procédure

Les Hela ont été nucléofectées avec le programme CM-113 et le tampon SE (Lonza) en présence de

pIGFIR-Rluc (0.5µg), de pCMV-FLuc (0.03µg) et de différentes concentrations en PNA. Les cellules

sont ensemencées dans des puits, et 24 heures après elles sont lysées avec le tampon du kit Dual Glo

luciférase. Les taux d’expression des luciférases sont mesurés séparément avec ce même kit et le

Wallac.

VII. Purification, quantification et révélation de protéines

1) Extraction des protéines

1, 2 ou 3 jours après la transfection, les cellules sont lysées et les protéines extraites avec du tampon

RIPA 1X (Pierce, Rockford, IL, USA) supplémenté par un cocktail d’inhibiteurs de protéases

Complete (Roche, Bâle, Suisse).

Pour les analyses des voies de signalisation, 24 heures après la transfection, les cellules sont privées de

sérum pendant 21 heures puis stimulées avec 100 nM d’IGF-1(Peprotech, Neuilly-sur-Seine, France)

pendant 15 minutes. Ceci permet de mesurer les différences d’activation des voies de signalisation sur

un intervalle de temps court. Les protéines sont extraites avec du RIPA de Cell Signalling (Beverly,

MA, USA) contenant des inhibiteurs de phosphatases tels que Na3VO4, du -glycerophosphate de

sodium et du pyrophosphate de sodium. Ils assurent que les protéines AKT et ERK ne seront pas

déphosphorylées.


150

2) Mesure de la concentration en protéines

La concentration des extraits protéiques totaux est déterminée par la méthode Bradford avec le

« Biorad Protein Assay ». Cette méthode de dosage colorimétrique repose sur le changement

d’absorbance induit par la complexation des acides aminés aromatiques et hydrophobes avec le bleu

de Coomassie. Le changement d’absorbance est proportionnel à la quantité de colorant complexé et

donc à la concentration en protéines. Contrairement aux autres méthodes de mesure des protéines, elle

est moins sensible aux interférences par divers agents présents dans les échantillons. Elle est toutefois

affectée par les détergents, et il faudra donc normaliser par rapport au tampon de lyse. Une gamme

d’ovalbumine entre 0 et 10 mg/mL (40 µg/mL final) est utilisée pour normaliser et s’assurer que l’on

se trouve dans une gamme d’absorbance linéaire. 1 µl d’extrait et 3 µl de tampon de lyse sont ajoutés à

250 µl de tampon de Bradford 1X. Pour la gamme, on ajoute 1 µl d’ovalbumine mais 4 µl de tampon

de lyse pour en avoir la même quantité. Les absorbances à 595 nm sont mesurées avec le Wallac et les

concentrations déterminées par rapport à la gamme.

3) Western Blot

30 µg de protéines sont sujets à un gel SDS-PAGE 8%. Le gel de migration subit un transfert vers une

membrane de nitrocellulose Hybond-ECL (Amersham Biosciences) ou une membrane PVDF

(Polyvinylidene fluoride) (Amersham Biosciences) lorsque des stripages sont nécessaires. La

membrane est bloquée avec du lait 5% dans du tampon TBS-T (20 mM Tris, 137 mM NaCl, pH 7.6 et

0,01% Tween 20) pendant 30 minutes à température ambiante. Elle est lavée au TBS-T 3 fois 10

minutes puis coupée pour séparer la protéine d’intérêt de la protéine de référence.

L’expression d’IGF-1R est révélée par blocage avec l’anticorps polyclonal de lapin :

- C-20 (sc-713, Santa Cruz Biotechnology) ciblant la partie C-terminale de la chaine , à une

dilution 1:200,

- ou H-60 (sc-9038, Santa Cruz Biotechnology) ciblant la partie N-terminale de la chaine , à

une dilution 1:200 à 1:500

- ou N-20 (sc-712, Santa Cruz Biotechnology) ciblant la partie N-terminale de la chaine , à

une dilution 1:200

L’expression de la -actine est révélée avec l’anticorps monoclonal de souris A5316 (Sigma) au

1:5000. Pour l’étude des voies de signalisation, les hybridations sont faites avec des dilutions au

1 :1000 d’anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre AKT ou p44/42MAPK phosphorylés (#4058

http://fr.wikipedia.org/wiki/D%C3%A9tergent


151

et #4376 chez Cell Signalling) à 4°C sur la nuit. Les marquages sont révélés comme décrit ci-dessous,

puis dénaturés par un tampon Reblot Plus Mild (2502, Millipore) pendant 10 minutes. L’hybridation

est répétée avec les anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre AKT ou p44/42MAPK totaux

(#9272 et #4695 chez Cell Signalling) à 4°C sur la nuit.

La membrane est lavée 3 fois au TBS-T pendant 10 minutes, puis incubée avec une dilution d’1:5000

d’anticorps secondaire anti-lapin (ou anti-souris pour l’actine) conjugué à la péroxidase

« horseradish » (GE Healthcare), pendant 30 minutes à température ambiante. La membrane est à

nouveau lavée et le marquage révélé par chimioluminescence en utilisant les réactifs ECL Plus

Western Blotting Detection (GE Healthcare Little Chalfont, UK). Les films sont scannés et les

marquages quantifiés par ImageQuant. Chaque bande d’IGF-1R est normalisée par celle de l’actine, et

chaque protéine phosphorylée par rapport à la protéine totale.

4) Immunoprécipitation

1 million de cellules est lysé avec 100 µL de RIPA 1X contenant des inhibiteurs de protéases. 10 µL

d’une solution de Protein A-Agarose (sc-2001 Santa Cruz Biotechnology) sont lavés deux fois avec du

RIPA : 100 µl de RIPA sont ajoutés, le mélange est centrifugé à 1000 rpm pendant 30 secondes et le

surnageant est retiré. Les 100 µL d’extraits protéiques sont ajoutés aux billes de Protéine A avec 200

ng d’anticorps secondaire anti-lapin. Le mélange est incubé une heure dans la glace, puis les billes

sont culotées à 1000 rpm pendant 30 secondes. Cette étape permet de se débarrasser des protéines

ayant une affinité pour les billes de Protéine A et pour l’anticorps anti-lapin. Le surnageant est incubé

avec 1 µg d’anticorps de lapin H-60 (sc-9038 Santa Cruz Biotechnology) pendant une heure dans la

glace. Le mélange est ajouté à 10 µl de solution de Protein A-Agarose lavée au RIPA. Le tout est

incubé sur la nuit, en chambre froide sur une roue. Les billes sont centrifugées à 1000 rpm et lavées 4

ou 5 fois avec du RIPA 1X. Du tampon de charge (contenant 60 mM de Tris-HCl, pH 6.8, 10% de

glycérol, 2% de SDS, et 25 mM de DTT) est ajouté au bille pour dénaturer les protéines

immunoprécipitées et le tout est chargé sur un gel SDS-PAGE et suivi d’un Western blot avec

l’anticorps H-60.


152

VIII. RT-PCR quantitative

1) Principe

La RT-PCR quantitative (RT-qPCR) est une technique destinée à pouvoir quantifier un type d’ARN

initialement présent dans un échantillon. Ce terme désigne l'utilisation de deux techniques successives,

une transcription inverse suivie d’une PCR en temps réel.

Des amorces aléatoires et une rétrotranscriptase permettent de générer des cDNAs à partir de l’extrait

d’ARN cellulaires. L’ADNc d’intérêt est amplifié grâce à des amorces choisies avec précautions. La

PCR se fait en présence de sondes qui fluorescent lorsqu’elles se fixent à de l’ADN double brin

(technologie SYBR). Un seuil de fluorescence est établi par le programme de la machine de PCR en

temps réel. Une fois que la quantité d'ADN amplifié permet aux sondes fluorescentes de dépasser ce

seuil alors on obtient un numéro de cycle PCR appelé "Ct"pour "Cycle Threshold" ou cycle seuil.

C'est cette valeur qui est à la base des calculs pour quantifier l'ADN d’intérêt de façon absolue ou

relative.

2) Extraction des ARN avec traitement à la DNase I

Les extraits d’ARN cellulaires sont obtenus avec le kit RNeasy mini (Qiagen) à partir de culots de

cellules transfectées. Il lyse les cellules et isole l’ARN. Afin d’éliminer toute trace d’ADN génomique

qui pourrait être amplifié par la PCR, un traitement à la DNase I (Qiagen) est réalisé sur la colonne du

kit. Les ARN sont ensuite quantifiés au Nanodrop. Les ARN sont sensibles aux ribonucléases qui sont

très abondantes dans l’environnement. Des précautions doivent être prises pour minimiser les

dégradations, notamment en utilisant de l’eau bidistillée sans RNases, des cônes avec filtres, et en

manipulant les échantillons dans la glace.

3) Transcription inverse

200 ng d’ARN cellulaires sont rétrotranscrits en ADNc avec 1 µL d’AffinityScript (Stratagene, La

Jolla, CA, USA) et 3 µl d’amorces aléatoires dans un volume final de 20 µl. Une première incubation

de 5 minutes à 25°C est suivie d’une incubation de 15 minutes à 42°C. L’enzyme est ensuite dénaturée

par un chauffage à 90°C pendant 5 minutes. Les ADNc peuvent ensuite être stockés à -20°C. Les

échantillons d’une même expérience doivent être tous rétrotrancrits en même temps afin de minimiser


153

les variations d’efficacité de transcription et les problèmes de contaminations. Un contrôle sans

enzyme permettra de vérifier qu’aucun ADN génomique ou contaminant n’est amplifié par la PCR.

4) Amplification des ADNc par qPCR

(a) Choix des amorces

Elles doivent avoir un pourcentage en paire de bases GC compris entre 35 et 65%, avoir des Tm

proches et contenir maximum 22 bases. Elles doivent se trouver sur des exons différents afin de ne pas

amplifier l’ADN génomique ou le pré-messager. En effet, comme le temps d’amplification est court,

ceux-ci ne pourront alors pas être amplifiés. Enfin, elles doivent donner des amplicons entre 80 et 250

nucléotides. Il faut des amorces pour le gène d’intérêt et pour un gène ménage dont l’expression n’est

pas sensé varier selon les conditions. Les deux couples d’amorces doivent avoir des efficacités

similaires.

Les amorces ont été sélectionnées avec le logiciel Probefinder de Roche. Pour le gène IGF-1R humain,

l’amorce sens est : 5’-AAAAACCTTCGCCTCATCC-3’, et l’antisens est : 5’-

TGGTTGTCGAGGACGTAGAA-3. Pour le gène de ménage glucuronidase béta (GUS) humain,

l’amorce sens est : 5’-CGCCCTGCCTATCTGTATTC-3’, et l’antisens est : 5’-

TCCCCACAGGGAGTGTGTAG-3’. Elles ont des Tm de 59 ou 60°C. Elles ont été commandées chez

Sigma et resuspendues avec de l’eau bidistillée sous hotte pour éviter les contaminations. Les

efficacités des couples d’amorces ont été évaluées à partir d’un extrait d’ARN totaux de DU145

rétrotranscrit. Une dilution croissante de ces ADNc ont permis de faire une courbe étalon d’équation :

Ct = k * log([dilution]) + C0

dont on déduit l’efficacité :

E doit être supérieure à 0.95 et les E de chaque couple d’amorces doivent être proches.

(b) Préparation des échantillons

La PCR quantitative (qPCR) se fait avec le kit SideStep II SYBR Green QRT-PCR Master Mix,

auquel on ajoute pour chaque échantillon 300 nM final des amorces sens et antisens et 2 µl d’une

dilution au dizième d’ADNc. 40 cycles de PCR sont opérés avec l’instrument Mx3000P de Stratagene

dans les conditions suivantes: 95°C pendant 30 s, 60°C pendant 1 min, 72°C pendant 1 min. Pour


154

chaque lot d’échantillons dont on souhaite comparer les taux d’ARNm d’IGF-1R, une gamme est

réalisée en faisant des dilutions croissantes avec l’ADNc de l’échantillon non traité. Cette gamme nous

permet de faire des courbes étalons pour chaque couple d’amorces et de vérifier la bonne efficacité de

la qPCR. Après amplification, le logiciel nous fournit alors les efficacités et les Ct de chaque

échantillon. Il y a deux types d’échantillons contrôles dont les Ct doivent être toujours supérieurs à 32

afin d’être sûr de l’absence de contaminations : les échantillons dit NoRT correspondant aux

échantillons contrôles de la réaction de la transcription inverse sans rétrotranscriptase, et les

échantillons dit NC correspondant à une réaction de qPCR sans ADNc.

(c) Analyse

Pour calculer les taux relatifs d’ARNm d’intérêt d’un échantillon par rapport à l’échantillon non traité

de référence, on a utilisé la formule :

(Ct0, IGF-1R – Ctx, IGF-1R)

(Ctx, GUS– Ct0, GUS)

Rx = (1+EIGF-1R) * (1+EGUS)

Où :

Rx: rapport du taux d’ARNm d’IGF-1R dans l’échantillon x par rapport au taux d’ARNm d’IGF-1R

dans l’échantillon référence, avec des taux normalisés par rapport aux taux d’ARNm de GUS dans

chaque échantillon.

EIGF-1R et EGUS : efficacités des amorces d’IGF-1R et de GUS

Ct0, IGF-1R : le cycle seuil de l’échantillon de référence avec les amorces d’IGF-1R

Ctx, IGF-1R : le cycle seuil de l’échantillon x avec les amorces d’IGF-1R

Ctx, GUS : le cycle seuil de l’échantillon x avec les amorces de GUS

Ct0, GUS : le cycle seuil de l’échantillon de référence avec les amorces de GUS

Pour les analyses statistiques, le logiciel Prism5.0a GraphPad a permis l’analyse de test de variance

entre les différentes conditions. Le test post hoc Tukey est ensuite utilisé pour les valeurs p. Elles sont

considérées comme statistiquement significatives lorsque p < 0.05 et se réfèrent toujours à

l’échantillon sans oligonucléotides.


155

IX. Test de prolifération cellulaire

1) Principe

Les tests de prolifération cellulaire sont des tests colorimétriques déterminant le nombre de cellules

viables en culture. Ils permettent d’évaluer la cytotoxicité d’un produit. Le test CellTiter 96®

AQueous Solution Cell Proliferation (Proméga) contient le tétrazolium MTS et la phénazine

méthosulphate PMS, un réactif de couplage d’électron. Le MTS est réduit par les cellules viables en

formazan. La quantité de formazan est directement proportionnelle à la quantité de cellules viables en

culture et se mesure par absorbance à 490 nm.

2) Procédure

Après transfection, les cellules sont étalées dans des puits 96 (500 cellules/puits) contenant du milieu

supplémenté. Au bout d’un, deux, trois ou quatre jours, le nombre de cellules viables est mesuré par le

test CellTiter 96® AQueous Solution Cell Proliferation : 50µL de solution MTS sont dilués dans 1mL

de solution PMS et 20 µL du mélange est ajouté aux puits à mesurer. Les cellules sont incubées

pendant 2 heures à l’étuve dans le noir et l’absorbance à 490 nm est mesurée. Un puits sans cellule

contenant le milieu de culture et la solution MTS/PMS sert de référence.

X. Tests clonogéniques

1) Principe

La plupart des cellules normales montre un phénomène d’adhérence, c’est-à-dire qu’elles se divisent

seulement si elles sont attachées à un support solide inerte, tel qu’une surface plastique de boîte de

culture. Cette nécessité disparaît lorsque les cellules se transforment. En effet, la transformation est

associée à des changements phénotypiques tels que la perte de l’inhibition de contact, permettant aux

cellules de pousser l’une sur l’autre, et l’indépendance à l’ancrage rendant la cellule capable de former

une colonie dans un milieu semi-solide tel que l’agar mou.

Le test clonogénique de formation de colonies sur agar mou est un bon indicateur du phénotype

transformé et un test fiable de la capacité mitogénique de la cellule. En effet, plusieurs cycles de

division cellulaire sont requis pour former des colonies détectables. En général, il y a une très bonne


156

corrélation entre la transformation in vitro et la carcinogenèse in vivo. Ce type de test est donc souvent

utilisé pour mesurer la sensibilité des tumeurs à un agent anticancéreux.

2) Procédure

L’agar noble est dissous dans l’eau, autoclavé et mélangé à du milieu de culture supplémenté en SVF

et L-glutamine. Dans des boîtes de Pétri de 60 mm de diamètre une couche de cette solution d’agar à

0.5% est déposée et laissée à température ambiante jusqu’à gélification. 10 000 cellules perméabilisées

à la SLO avec ou sans PNA sont suspendues dans 3 mL d’une solution d’agar à 0.7% dans du milieu

supplémenté. Ces 3 mL sont ensuite étalés sur la première couche d’agar. Après gélification, du milieu

supplémenté est ajouté sur les couches d’agar. Ce milieu est changé deux ou trois fois par semaine. Au

bout de 15 jours, les colonies sont comptées dans des carrés de 0.5 cm de côté avec un microscope au

grossissement 5X. Au bout de 30 jours, des photos des colonies sont prises avec le système de

microscopie LEICA (Weltzar, Allemagne) et un objectif de grossissement 10X. Les images sur

différentes épaisseurs de gel sont compilées et enregistrées avec le logiciel Métamorph (Universal

Imaging Corp., Marlow, UK).

Chapitre V :

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Jean-Christophe Francois,*,†,1,2 and Tula E. Saison-Behmoaras,*,†,1,2

*Centre National de la Recherche Scientifique, Museum National d’Histoire Naturelle, Unite Mixtede Recherche 7196, Paris, France; and †Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale,U565, Paris, France

ABSTRACT The insulin-like growth factor 1 receptor(IGF-1R) is involved in transformation, survival, mitogen-esis and differentiation. It is overexpressed in manytumors and a validated target for anticancer therapy. Incell-free systems, polypyrimidic peptide nucleic acids(PNAs) can form triplex-like structures with messengerRNAs and halt the ribosomal machinery during the trans-lation elongation. A 17-mer PNA that formed a PNA2:mRNA complex with a purine-rich sequence located inthe coding region of IGF-1R mRNA induced the synthesisof a truncated IGF-1R in vitro. This PNA down-regulatedexpression of the receptor by 70–80% in prostate cancercells without affecting insulin receptor expression thatexhibits high homology with IGF-1R. Inhibition occurs atthe translational level, since the IGF-1R mRNA levelmeasured by quantitative RT-PCR was not affected byPNA treatment. In addition, IGF-1R knockdown by PNAled to an attenuation of phosphorylation of downstreamsignaling pathways, PI3K/AKT and MAPK, involved insurvival and mitogenesis and also to a decrease in celltransformation. Of the steric blockers tested, which in-cluded phosphorodiamidate morpholino oligomers andlocked nucleic acids, PNA was unique in its ability to formtriplex structures with mRNA and to arrest translation elon-gation.—Lecosnier, S., Cordier, C., Simon, P., Francois,J.-C., Saison-Behmoaras, T. E. A steric blocker of translationelongation inhibits IGF-1R expression and cell transforma-tion. FASEB J. 25, 000–000 (2011). www.fasebj.org

Key Words: peptide nucleic acid � IGF signaling � triplex struc-ture � prostate cancer

The insulin-like growth factor 1 receptor (IGF-1R)is a transmembrane tyrosine kinase receptor involved intransformation, survival, mitogenesis, and differentia-tion (1). It functions as a heterotetramer of 2 extracel-lular ligand-binding � subunits and 2 � subunits thatcross the plasma membrane. The � subunits encompassan intracellular domain devoted to the initiation ofsignal transduction cascades. IGF-1R is overexpressedin many tumors, such as cervical (2), prostate (3),breast (4), and pancreatic adenocarcinomas (5). Inhib-iting IGF-1R-mediated signaling deals a severe blow toproliferation of cancer cells. Preclinical evidence show-

ing that targeting IGF-1R is effective in cancer treat-ment has been accumulating for almost 2 decades.Strategies used to block IGF-1R activity include antibod-ies (6–7), small-molecule tyrosine kinase inhibitors(TKIs; refs. 8–10), antisense oligonucleotides and anti-sense expression plasmids (11–13), short-interferingRNAs (siRNAs; refs. 14–15), triplex-forming oligonu-cleotides (16–17), and dominant negative and kinasedefective mutants (18–20). Antibodies and TKIs arecurrently in clinical development and show both effi-cacy and toxicity (21). Although siRNAs effectivelyknock down IGF-1R, these agents have undesirableoff-target effects and are a challenge to deliver (22).

Steric blocking oligonucleotides (ONs) are analogsof nucleic acids that bind sequence specifically tointracellular messenger RNAs (mRNAs) and interferewith splicing or translation without inducing targetmRNA degradation. Their backbones confer nucleaseresistance, and they often form complexes more stablethan those formed with unmodified oligonucleotides.In contrast to antisense oligonucleotides or siRNAs, theRNA-ON hybrid does not need to be recognized bycellular endonucleases, such as ribonuclease H (RNaseH) or argonaute 2, in order to achieve biologicaleffects. Instead, hybrid formation and resultant stericinterference prevent RNA recognition by relevant cel-lular machinery.

These sequence-specific steric blockers have a greatpotential as therapeutic agents for various diseases.When they target splice acceptor or donor sites, theyare able to modulate splicing of premRNA (23). Themost clinically advanced disease target of this type isDuchenne muscular dystrophy (24). Targeted to5�UTR of an mRNA or translation initiation region,ONs prevent translation initiation (25). Targeting ofthe coding region of an mRNA to inhibit translation

1 These authors contributed equally to this work.2 Correspondence: T.E.S.-B., CNRS UMR7196; 57 rue Cuvier,

CP 26, 75231 Paris Cedex 05, France. E-mail: [email protected];J.-C.F., INSERM U565, 57 rue Cuvier, CP 26, 75231 Paris Cedex05, France. E-mail: [email protected]

doi: 10.1096/fj.10-169540This article includes supplemental data. Please visit http://

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10892-6638/11/0025-0001 © FASEB

The FASEB Journal article fj.10-169540. Published online March 14, 2011.

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elongation is more difficult because of the ability of theribosome to unfold secondary structures and, there-fore, to displace ONs bound to mRNA.

Some studies in cell-free systems have demonstratedthat ONs can halt elongating ribosomes, and a few haveshown the synthesis of truncated proteins. These stud-ies have used ONs conjugated to a cross-linking agent,such as platinum (26–27) or polypyrimidinic peptidenucleic acids (PNAs), that form triplexes with mRNA(28–31). PNA oligomers are DNA mimics with a pseu-dopeptide backbone composed of achiral and un-charged N-(2-aminoethyl) glycine units. PolypyrimidicPNA can form triple helical structures in which aPNA:RNA duplex is bound by a second PNA thatinteracts with the RNA strand of the duplex via Hoog-steen base pairing. This PNA2:RNA complex involvesT�A:T and C��G:C base triplets. There has been noreport of translation elongation arrest with steric block-ers within cells. In the present study, we used a pyrim-idine-rich PNA sequence complementary to the codingregion of IGF-1R mRNA. Treatment with the PNAresulted in synthesis of a truncated IGF-1R protein in acell-free system. The PNA also down-regulated expres-sion of IGF-1R in a human prostate cancer cell line.This down-regulation affected downstream signalingpathways involved in survival and proliferation and ledto a significant decrease in transformation of cells.

MATERIALS AND METHODS

Oligonucleotides

RNAs, locked nucleic acids (LNAs), phosphodiester oligonu-cleotides (POs), and PNAs were synthesized by Eurogentec,S.A. (Seraing, Belgium). Phosphorodiamidate morpholinooligomers (PMOs) were synthesized by GeneTools, LLC(Philomath, OR, USA). Sequences are listed in Table 1. ThePNA control, NH2-TATTCTTGTTCTTATCT-lys-lys, a scram-ble sequence of PNA 959, was prepared on an Expedite 8909automated synthesizer (AME Biosciences, Sharnbrook, UK),as described previously (32). The PNA monomers were fromLink Technologies (Bellshill, UK). The siRNA targeting hu-man IGF-1R was previously described by Rochester et al. (14)

and was synthesized at Sigma (Lyon, France). The siRNA hasthe following sequence: sense strand, 5�-CAAUGAGUACAAC-UACCGCdTdT-3�, and antisense strand, 5�-GCGGUAGUU-GUACUCAUUGdTdT-3�.

Spectroscopic experiments

Association and dissociation rates of the PNA, LNA, and PMOcomplexes with 17-nt complementary RNA were estimated bycooling/heating experiments, as described previously (28).Samples were prepared in a buffer containing 100 mM KCland 10 mM sodium cacodylate (pH 7) and contained 1 �MRNA and 2 �M modified oligomer. The mixture was firstheated to 90°C, then cooled to 10°C and heated to 90°C at aspeed of 0.5°C/min. Absorbances at 260 and 330 nm weremeasured during the cooling and heating steps. The differ-ences between these absorbances are represented as a func-tion of the temperature. The reported midpoints of thetransition (Tm) are equal to the maximums of the derivativeof the curves.

Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)

Complementary RNA was 5�-32P end labeled, as describedpreviously (28), and purified using micro-Bio-Spin 30 chro-matography columns (Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, France).A mixture of 100 nM of unlabeled and 10 nM of 32P-labeledcomplementary RNA was incubated in 50 mM Tris (pH 8 or6) with increasing concentrations of PNAs, LNA, or PMO at37°C for 10 min. The mixture was then loaded on 15%nondenaturing polyacrylamide gel or a 12% polyacryl-amide/7 M urea denaturing gel. The gel buffers were either100 mM Tris, 90 mM boric acid, and 1 mM EDTA (TBE) atpH 8.3 or 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES buffer)at pH 6. The nondenaturing gels were thermostatically main-tained at 25°C. Imaging and quantitation were performedwith a Typhoon imager and ImageQuant software (GEHealthcare, Little Chalfont, UK).

In vitro transcription and translation

The plasmid pIGFIR was constructed by insertion of thecDNA of IGF-1R (4.1 kb) into the pcDNA3 host vectordownstream of the SP6 promoter. The IGF-1R expressionplasmid pCVN-IGFIR (expressing the human IGF-1R cDNAdriven by the SV40 promoter) was a gift from Dr. RenatoBaserga (Thomas Jefferson University, Philadelphia, PA,

TABLE 1. Properties of the steric blockers used in this study

Name Sequence Tm (°C) EMSA

PNA 330 TTTGTTTTCTTTTCTTC Hysteresis Duplex�triplexPNA 476 TTGTTCCTGGTGTTTAT 80 DuplexPNA 558 GGCTCCACGTCCTTGTT �80 DuplexPNA 883 ATACTTCCTGTATTCCT 70 DuplexPNA 926 TTTTCATATCCTGTTTT 70 DuplexPNA 959 TTATTTCTCTTTCTATG Hysteresis Duplex�triplexLNA 959 TTATTTCTCTTTCTATG �80 DuplexPMO 959 CTGCTGTTATTTCTCTTTCTATGGA 70 Duplex

PNAs target the coding region of the IGF-1R mRNA. Number indicates the number of codonsbefore the start of the targeted sequence. PNAs are listed from N to C termini and are antiparallel tomRNA. All PNAs contain a C-terminal lysine. LNA denotes a chimeric LNA sequence, whereunderscored bases are LNAs, and the others are deoxyribonucleotides. LNA and PMO are listed from5� to 3� termini. Tm was determined from the UV-melting profiles at 260 nm. EMSAs were performedin nondenaturing polyacrylamide gels at pH 8.3.

2 Vol. 25 July 2011 LECOSNIER ET AL.The FASEB Journal � www.fasebj.org

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USA; ref. 20). The cDNA was excised from pCVN-IGF1R withthe restriction enzymes BamH1 and XbaI. It was subclonedinto pcDNA3 digested with the same enzymes and sequencedby Genome Express (Meylan, France). In vitro transcriptionwas performed on BamH1-linearized pIGFIR with the Ampli-Scribe SP6 high-yield transcription kit (Epicenter, Madison,WI, USA) in the presence of RNasin recombinant ribonu-clease inhibitor (Promega, Charbonnieres-les-Bains, France).The transcript was then purified with a Chroma Spin�TE-400chromatography column (Clontech, Saint-Germain-en-Laye,France), followed by ethanol precipitation. The IGF-1R tran-script (1.6 �g) was incubated with PNAs, PO, LNA, or PMOfor 5 min at 37°C, and the mix was added to rabbit reticulo-cyte lysate (Promega) supplemented with amino acid mix(minus methionine), and 35S-methionine (30 �Ci). Thetranslation was performed at 37°C for 20 min. With PO, 1 Uof Escherichia coli RNase H (New England Biolabs, Hitchin,UK) was added to the final mixture. The 35S-radiolabeledproteins were separated by Tris-glycine, SDS-PAGE. Imagingand quantitation were performed with a Typhoon imager andImageQuant (GE Healthcare).

Transfection of cells

The human prostate cancer cell line DU145 and breastadenocarcinoma cell line MCF-7 (American Type CultureCollection, Manassas, VA, USA) were grown in RPMI 1640and DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), respectively,supplemented with 10% of FBS (Perbio; Thermo Scientific,Brebieres, France) and 2 mM of l-glutamine (Invitrogen) in5% CO2 incubator at 37°C. Transient transfections wereperformed using the Amaxa Nucleofector electroporationsystem (Lonza, Koln, Germany) with the Cell Line 96-wellnucleofector kit SE and the program CM-137. Cells were alsopermeabilized with streptolysin-O, as described by Faria et al.(33). Cells transfected without oligomer are called the un-treated sample and were used as references in each experi-ment.

Western blot analyses

Following transfection, cells were seeded on plates and cul-tured. After indicated times, cells were harvested, and cellularproteins were extracted with RIPA 1� (Pierce, Rockford, IL,USA) supplemented with Complete protease inhibitor cock-tails (Roche, Basel, Switzerland). Cellular proteins (30 �g)were subjected to reducing SDS-PAGE and transferred tomembranes. Expression of IGF-1R was evaluated by blottingwith a 1:200 dilution of rabbit polyclonal antibody against theC-terminal region of human IGF-1R-� (sc-713; Santa CruzBiotechnology, Santa Cruz, CA, USA) for 1 h at roomtemperature and normalized using an antibody against �-ac-tin (A5316; Sigma). Expression of IR was evaluated by blot-ting with a 1:200 dilution of mouse monoclonal antibody(sc-09; Santa Cruz Biotechnology) overnight at 4°C andnormalized using the anti-�-actin antibody.

For analysis of signaling pathways, at 24 h after transfec-tion, cells were serum starved for 21 h and then stimulatedwith 100 nM of IGF-1 (Peprotech, Neuilly-sur-Seine, France)for 15 min. Proteins were extracted with RIPA containingphosphatase inhibitors (Cell Signaling, Beverly, MA, USA).Blots were performed with 1:1000 dilutions of rabbit poly-clonal antibodies against human phosphorylated AKT, totalAKT, phosphorylated p44/42MAPK, and total p44/42MAPK(Cell Signaling) overnight at 4°C.

Membranes were incubated with a 1:5000 dilution ofsecondary antibody conjugated to horseradish peroxidase(GE Healthcare), and bands were visualized by chemilumi-

nescence with ECL Plus Reagents (GE Healthcare). Westernblot films were then scanned in tif format in grayscale usingan Epson Expression 1600 Pro flatbed scanner (Epson,Nagano, Japan), followed by band quantification using eitherImageQuant or ImageJ 1.43 software (U.S. National Institutesof Health, Bethesda, MD, USA) following the method out-lined at lukemiller.org (http://lukemiller.org/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-image-j/). Data arepresented as means � sd. Statistical analyses were conductedusing Prism 5.0a software (GraphPad, San Diego, CA, USA).Comparisons among groups were performed with the 1-wayANOVA test. If statistical significance was found, the Tukeypost hoc test was used. Values of P 0.05 were considered tobe statistically significant; asterisks in figures indicate compar-ison to untreated samples.

RT-qPCR

Total cellular RNA was prepared using the RNeasy Mini Kit(Qiagen, Valencia, CA, USA) with DNase I treatment. Of eachsample, 200 ng was reverse transcribed into cDNA using Affinity-Script and random primers (Stratagene, La Jolla, CA, USA).With SideStep II SYBR Green QRT-PCR Master Mix (Strat-agene), qPCR was performed using the primers for humanIGF-1R: sense, 5�-AAAAACCTTCGCCTCATCC-3�, and anti-sense, 5�-TGGTTGTCGAGGACGTAGAA-3�. Human GUS � wasamplified as a control: sense, 5�-CGCCCTGCCTATCTGTATTC-3�, and antisense, 5�-TCCCCACAGGGAGTGTGTAG-3�. Theprimers were designed with Roche’s Probefinder and synthe-sized by Sigma. Forty cycles of the following thermocyclingconditions were used: 95°C for 30 s, 60°C for 1 min, 72°C for 1min on a Stratagene Mx3000P instrument. The comparativecycle threshold method was used to calculate relative quantitiesof mRNA.

Soft agar colony formation assay

DU145 cells, permeabilized with streptolysin-O, were trans-fected with buffer, 0.5 �M PNA 959, or PNA scramble andplated immediately or after 24 h. Practically, 104 cells weresuspended in RPMI containing 10% FBS and 2 mM ofl-glutamine with 0.3 or 0.7% agar and plated in 60-mm plasticPetri dishes on top of a precast semisolid 0.5% agar under-layer. After 15 or 21 d, colonies �0.05 mm were counted indishes with a microscope at �5. Colonies were photographedwith a Leica microscope system (Leica Microsystems, Wetzlar,Germany) and a �10 objective. Images at different depthswere compiled and recorded with Metamorph (UniversalImaging Corp., Marlow, UK).

RESULTS

Characteristics of PNA:RNA complexes

We showed recently that T-rich PNAs can form triplexstructures at physiological pH with complementaryRNAs (28, 31). Triplex formation involves T�A:T andC��G:C base triplets stabilized by Watson-Crick andHoogsteen bonds. Cytosines must be protonated toform Hoogsteen bonds, which requires acidic pH. Weselected 6 T-rich PNAs targeting the coding region ofIGF-1R mRNA for in vitro analysis (Table 1). We chose17-residue PNAs in order to have unique targets withinthe human transcriptome. PNAs were synthesized witha C-terminal lysine to enhance their solubility. The

3INHIBITION OF IGF-1R TRANSLATION BY A STERIC BLOCKER

sequences of PNAs 959 and 330 are most likely to formpartial-triplex structures of those tested, since these twoPNAs have the highest numbers of thymine (11 and 13,respectively) and a large central block of pyrimidines.UV-melting curves and EMSAs were performed tocharacterize the complexes formed by each PNA with a17-nt complementary RNA.

Spectroscopic analyses revealed that the heating andcooling curves were superimposable for all PNA:RNAcomplexes except for complexes formed with PNAs 330and 959 (Fig. 1 and Table 1). In these cases, tempera-tures of dissociation and association were different,suggesting that complexes were not at equilibriumduring the experiment, which gave rise to hysteresis.This observation is consistent with triplex formation(28). For all of the complexes, midpoints of associationand dissociation curves were high (70–85°C). To-gether, these results suggested that the 17-mer PNAsform very stable complexes with RNA involving duplex-or triplex-like structures even at neutral pH (Fig. 1 andTable 1).

EMSAs were performed to corroborate the hypothe-sis of triplex formation. Figure 2A shows that in nonde-naturing conditions, a single complex that correspondsto the duplex was formed between the RNA and PNA926. Similar results were obtained with PNAs 558, 883,and 476 (data not shown). At pH 8.2, in the presence ofPNA 959 and 100 nM complementary RNA, one com-plex was observed at low PNA concentrations (20nM), whereas a slower migrating second complex ap-peared at higher PNA concentrations. Above 100 nM,only the slower migrating complex persisted (Fig. 2B).We also carried out an EMSA at pH 6 in order to allowcytosine protonation and increase triplex stability. Fig-ure 2C shows that the concentration of PNA 959required to form the triplex was 2 times less at pH 6than under conditions of basic pH. Therefore, cytosineprotonation is involved in the complex stability, asexpected for triplexes formed with a cytosine-contain-ing third strand. The EMSA of PNA 330 and comple-

mentary RNA shown in Fig. 2D was quite different fromthat obtained with PNA 959. There were two bandsformed at both low and high PNA 330 concentrations.Although we do not have firm evidence that the com-plex formed is a triplex structure, the hysteresis shownin UV-melting curves suggests that it is not a duplexstructure. To explore the stability of these complexes,we analyzed the samples on a denaturing polyacryl-amide (7 M urea) gel. Under denaturing conditions(Fig. 2E), the complexes formed by PNA 959 and by330 with respective complementary RNAs were morestable than the complex formed between PNA 926 andits complementary RNA. It is noteworthy that com-plexes 330 and 959 were resistant to these denaturingconditions, emphasizing the very high stabilities ofthese complexes.

Translation elongation arrest and production of atruncated protein in cell-free system

Cell-free translation of IGF-1R mRNA was performed inthe presence of the PNAs targeting the coding region. Asexpected, PNAs 959 and 330, which presumably formtriplexes with target sequences, were the only PNAs ofthose tested that halted translation elongation and re-sulted in formation of truncated proteins (Fig. 3). For thePNA 959, the mass of the truncated protein was 109kDa, similar to the mass of polypeptide chain obtainedafter RNase H cleavage of the RNA duplexed in thepresence of a phosphodiester PO of the same basesequence (Fig. 3A). Interestingly, the proteins generatedin the presence of PNA 330 migrated as a smear on thepolyacrylamide gel, suggesting that a continuum of trun-cated products was produced (Fig. 3B). A possible expla-nation is that when the elongating ribosome stalls at thePNA block, it remains associated with the mRNA stallingribosomes behind it, which are carrying even shorterpolypeptides. In the case of PNA 959, the arrest of theelongating ribosome may induce its dissociation from the

Figure 1. Spectroscopic analyses. Melting profiles of the complexes formed with indicated 17-mer PNAs (2 �M) andcomplementary RNA (1 �M) in a buffer containing 100 mM KCl and 10 mM sodium cacodylate at pH 7. Mixture was first heatedto 90°C, then cooled to 10°C, and then heated to 90°C at a speed of 0.5°C/min. Absorbances at 260 and 330 nm were measuredduring the cooling and heating steps. For PNA 926, the heating and cooling profiles are superimposed. This is not the case forPNAs 959 and 330; a hysteresis was observed, and heating curves are shifted toward higher temperatures than cooling curves.


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mRNA, thereby allowing the accumulation of a singletruncated polypeptide chain. Degradation of a PNA 330-induced truncated protein might also lead to the ob-served continuum of protein products. Although PNAs476 and 558 formed stable duplexes, they did not pro-duce truncated proteins. This screening suggests, asshown previously (30), that duplex structures are not ableto stop elongating ribosomes on an eukaryotic mRNA.

We also assessed the ability of other chemistries toblock elongation. LNAs and PMOs are known to begood steric blockers (34–36). Rules for design ofchimeric LNAs optimal for triplex formation (37) werefollowed. Our molecule alternates LNA and DNA nu-cleotides and maximizes the number of thymine LNAresidues, and the C-terminal residue is an LNA. For thePMO, we chose a 25-nt sequence. This length is neces-

Figure 2. EMSA. A–D) Mixture of 100 nM of unlabeled and 10 nM of 32P-labeled RNA was incubated in 50 mM Tris buffer (pH8 or 6 as indicated below the gels) with increasing concentrations of indicated PNA. Mixture was allowed to hybridize for 10 minat room temperature and then was loaded on 15% nondenaturing polyacrylamide gel. Gels and buffer contained TBE bufferat pH 8.3 or MES buffer at pH 6. A) PNA 926, pH 8. B) PNA 959, pH 8. C) PNA 959, pH 6. D) PNA 330, pH 8. E) Indicatedcomplexes analyzed on a 12% polyacrylamide/7 M urea denaturing gels. Bottom bands are unhybridized RNAs; slowermigrating bands are RNA:PNA hybrids.

Figure 3. Effect of PNAs on cell-free translation of IGF-1R mRNA. In vitro transcribed IGF-1R mRNA was preincubated with PNA 959,PO 959, LNA 959, or PMO 959 at the concentrations indicated above the lanes and translated in rabbit reticulocyte lysate with35S-methionine as described in Materials and Methods. Reactions were carried out for 20 min at 37°C and analyzed by SDS-PAGE. POwas used in presence of RNase H to produce a control of truncated protein size. In this cell-free system, the IGF-1R protein is notprocessed, and its precursor (155 kDa) is observed. A) PNA and PO 959. B) PNA 330. C) LNA and PMO 959.


sary to form a duplex with Tm � 70°C. Although PNA959 formed a triplex-like structure, neither the LNA ofthe same sequence nor the PMO 959 did, as shown bythe absence of hysteresis profile in melting experiments(Table 1). Figure 3C shows that these oligomers alsofailed to stop translation elongation. This indicates thatPNAs are more prone to formation of triple helicesunder physiological conditions than were these othermodified oligomers.

PNA 959 specifically inhibits IGF-1R expressionin prostate cancer cell line DU145

Overexpression of IGF-1R protein induces growth, neo-plastic transformation, and protection from apoptosis.Furthermore, this receptor is reportedly up-regulatedduring the progression to androgen-independent pros-tate cancer in vivo (38), and expression of an antisenseRNA complementary to IGF-1R blocks the growth of ratprostate tumors in vivo (39). This suggests that theIGF-1R has potential as a target for treatment ofandrogen-independent prostate cancer. Among meta-static prostate cancer lines DU145, PC3, and LNCaP,DU145 cells have the highest IGF-1R levels (14). Thus,we chose to work with androgen-independent DU145cells.

PNA 959 and the PNA control containing 2 C-termi-nal lysines were introduced into the cells by nucleofec-tion. To assess the expression of functional IGF-1R-�after the treatment, immunoblotting analysis using anantibody targeting the C terminus of IGF-1R was per-formed on total cell lysates (Fig. 4A, B). Figure 4B showsthat in cells treated with 1 �M PNA 959, a stronginhibition of IGF-1R expression was achieved, whereasthe control PNA sequence did not affect IGF-1R levels.

Figure 4C shows IGF-1R inhibition as a function of PNAconcentration; almost complete inhibition of IGF-1Rwas observed at 1.5 �M PNA 959, 48 h after treatment.At 1 �M PNA 959, kinetic studies indicated that theinhibition increased over time and reached 66 � 14%inhibition between 24 and 48 h, and this level wasmaintained up to 72 h (data not shown). Although PNA330 formed complexes as stable as those formed withPNA 959, the latter was almost twice as efficient as theinhibitor of IGF-1R expression in cells at 1 �M (Sup-plemental Fig. S1). Therefore, we chose PNA 959 forthe subsequent cellular experiments.

The insulin receptor (IR) is structurally and func-tionally related to IGF-1R. The homologous targetsequence of PNA 959 in IR transcript shares 10 bases (8contiguous) over 17 in common with the IGF1-R tran-script (Supplemental Fig. S2). Supplemental Fig. S3shows that IR is not affected under conditions whereIGF1-R was down-regulated by PNA 959 treatment.Therefore, PNA 959 is selective for IGF-1R.

Mechanism of the cellular inhibition

To obtain further insight into the mechanism by whichPNA 959 causes the IGF-1R down-regulation, we haveinvestigated its effect on IGF-1R mRNA level. UnlikesiRNAs, steric blockers do not induce target mRNAhydrolysis. Therefore, as a positive control, we haveused a previously described siRNA that specificallytargets IGF-1R in DU 145 cells (14). Figure 5 shows thatthe treatment of DU 145 cells with 0.05 �M of siRNAdecreased protein levels by 76.8 � 12.4%. The decreaseof IGF-1R protein level was concomitant to the decreaseof mRNA level by 47 � 7% as quantified by RT-qPCR.We have quantified the mRNA levels in the experi-

Figure 4. Effect of PNAs on expression of IGF-1R in DU145 cells. A) Structure of IGF-1R. This heterotetramer is composed of2 extracellular ligand-binding � subunits and 2 transmembrane � subunits linked by disulfide bonds. The � subunits carry theintracellular tyrosine kinase domain and transduce the signal. PNA 959 produces a truncated protein, whose � subunit retainsthe membrane domain but not the intracellular domain. B) Inhibition of expression of IGF-1R in DU145 human prostate cancercells with PNA 959. DU145 cells were nucleofected with PNA or left untreated and were seeded on plates. Total protein wasextracted after 48 h. Immunoblotting was performed with a C-terminal antibody against IGF-1R-� (90 kDa) and an antibodyagainst �-actin (42 kDa). The 2 bands stained with anti-IGF-1R-� correspond to the 2 known isomers of the protein. C) IGF-1Rprotein levels were quantified by densitometry after correcting for �-actin protein levels on immunoblots of three sets ofindependently prepared lysates. Levels were calculated by comparison with untreated sample. Plot corresponds to quantitativeanalysis of 3 independent experiments with means � sd. ns � nonsignificant, **P 0.01; ***P 0.001.


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ments, where, compared to the scramble sequence, 1�M PNA 959 inhibited the IGF-1R protein level by 66 �14% (see Fig. 4). Figure 5 shows that in similar condi-tions, IGF-1R mRNA level was not affected, whereasIGF-1R was down-regulated by 44%. This indicates thatPNA 959 that interacts with the mRNA does not induceits degradation. The PNA most probably acts as a stericblocker in DU 145 cells, as it inhibits protein synthesisat a translational level. Our data show that PNA 959does not inhibit transcription of the IGF-1R gene.Although PNAs may bind to genomic DNA after strandinvasion (40), it is not the case for the PNA 959sequence that spans the junction of exon 14 (on 11bases) and exon 15 (on 6 bases) (Supplemental Fig.S2). Moreover, our data show that the PNA-mRNAhybrid is not detected by nonsense-mediated mRNAdecay (NMD) machinery that degrades mRNAs thathave in-frame premature termination codons (41).

Biological effects of IGF-1R knockdown by PNA 959

The binding of IGF-1R to its ligand IGF-1 results intyrosine kinase activation and stimulation of the down-stream signaling pathways Ras/MAPK and phosphati-dylinositol 3-kinase (PI3K)/AKT (1). A cascade ofresponses is triggered from proliferation to survival andmotility and, potentially, tumor progression. AKT and

ERK1/2 are intermediates of the signaling pathwaysPI3K/AKT and MAPK, respectively. They are phosphor-ylated on IGF-1 binding. We chose to work at 0.5 �M ofPNA 959 in order to assess biological effects when 50% ofreceptor expression was inhibited. At 2 d after transfec-tion of PNA 959 into DU145 cells, we observed a decreasein IGF-1-induced phosphorylation of the signaling inter-mediates AKT and ERK1/2 (Fig. 6). PNA 959 treatmentspecifically inhibited the phosphorylation of AKT andERK1/2 by 64 and 79%, respectively. PNA scramble didnot affect pAKT level and induced a weak inhibition(20%) of pERK1/2. The inhibitions were maintained forat least 3 d (data not shown). Therefore, treatment of cellswith PNA 959 inhibits phosphorylation of importantregulators of cell growth and survival.

IGF-1R is crucial for malignant transformation (42);therefore, we assessed the effects of PNA 959 on celltransformation. Anchorage-independent growth in thesemisolid medium of soft agar is a strong indicator ofthe transformed phenotype and a stringent test ofmitogenic capacity, because several cycles of cell divi-sion are required to form detectable colonies. There-fore, soft agar colony formation assays were performedto assess the ability of DU145 cells treated with the PNAto transform. Cells were seeded in soft agar 24 h afterPNA 959 treatment. Cells treated with 0.5 �M PNA 959formed few, small colonies, in sharp contrast to un-treated cells (64% inhibition; P0.01), whereas thosetreated with 0.5 �M PNA scramble formed numerouscolonies with larger diameter (32% inhibition, P0.05;Fig. 7 and Supplemental Fig. S4). When cells wereseeded in soft agar directly after PNA treatment, colonyformation was reduced by 65% with 0.5 �M PNA and by25% with 0.5 �M PNA scramble. Altogether, these

Figure 6. Effect of PNA 959 on IGF signaling. DU145 cells,permeabilized with streptolysin-O, were transfected with buf-fer, 0.5 �M PNA 959, or 0.5 �M control PNA. After 24 h,cultures were serum starved for 21 h, then stimulated with 100nM of IGF-1 for 15 min. Total cell proteins were extracted.Levels of phosphorylated AKT and phosphorylated ERK1/2were determined by immunoblotting; after a gentle strippingstep, levels of total AKT and ERK1/2 were determined.

Figure 5. Expression of IGF-1R mRNA in the presence ofsiRNA or PNA 959 in DU145 cells. Expression levels of IGF-1RmRNA were measured by RT-qPCR. DU145 cells were nucleo-fected with 1 �M PNA 959 or 0.05 �M siRNA and incubatedfor 48 h. Protein extractions and Western blot analyses wereperformed with half of the cells. mRNA was extracted fromthe other half and retrotranscribed, and cDNA was analyzedby qPCR with GUS-� as an internal standard. Comparativecycle threshold method was used to calculate relative quanti-ties of mRNA. For each experiment, inhibition was calculatedcompared to levels of mRNA from untreated cells that areassigned as 100% (not shown). Plot corresponds to quantita-tive analysis of 5 independent experiments with means � sd.***P 0.001.


results show PNA 959 specifically and strongly inhibitedtransformation of these prostate cancer cells.

DISCUSSION

In this study, we demonstrate a new approach forinhibition of IGF-1R expression. A PNA complemen-tary to a coding region in the IGF-1R mRNA served asa steric blocker, inhibiting translation elongation fromthe IGF-1R mRNA. In cell-based assays, the PNA effec-tively silenced IGF-1R gene expression and inhibitedclonogenic survival. The two main classes of agents thathave been used to block IGF-1R function are antibodiesand TKIs. Both approaches are in preclinical or clinicaldevelopment. Although promising, toxic effects, suchas hyperglycemia or hematological or metabolic toxic-ity, are observed (21). Moreover, since IGF-1 signalinghas neuroprotective effects, there are some concernsthat TKIs that can cross the blood-brain barrier wouldhave neurological toxicity. Among nucleic acid-basedstrategies, siRNAs that knock down IGF-1R have beenreported, but may trigger host immune responses (43–44) and deregulate nontargeted genes (45). Antisenseoligonucleotides also encounter specificity problems,since short heteroduplexes of 6 bp are sufficient to berecognized and cleaved by RNase H (46). The stericblocker approach may have a higher specificity thanstrategies dependent on RNA cleavage, since binding toa secondary site is less likely to induce a biologicaleffect. The IGF-1R is implicated in several cancers,

including both prostate and breast cancer. To showthat IGF-1R down-regulation in androgen-independentDU 145 prostate cancer cell line is not cell-type specificphenomenon, we have transfected the PNA 959 inMCF-7 human breast cancer cells. Supplemental Fig. S5shows that in MCF-7 cells treated for 24 h with 1 �MPNA 959, a strong inhibition of IGF-1R expression wasachieved, whereas the control scramble PNA had noeffect. Therefore, IGF-1R that is considered as a ratio-nal therapeutic target in both prostate and breastcancer can be targeted by steric blocker antisense PNA.PNAs are well tolerated in cells (47) and are highlyspecific, as single mismatches greatly destabilize PNA:RNA complexes (48). By targeting the mRNA, the PNAstrategy circumvents a major obstacle to design antibod-ies and TKI, which is the high homology between IRand IGF-1R. Moreover, unlike siRNAs and antisenseoligonucleotides, PNAs can invade stable secondarystructures of mRNA (49). A limitation of our strategy isthat PNAs are uncharged molecules that are poorlytaken up by mammalian cells. To overcome the prob-lem of delivery, PNAs conjugated to cell-penetratingpeptides have been widely studied (50). A PNA conju-gated to four lysines systemically injected into mice hadactivity in organs, including heart, lung, and muscle(23). Another possible solution to the uptake problemis to conjugate the PNA to oligophosphonate groups (51).

We hypothesize that the PNA investigated here in-hibits IGF-1R expression by sterically blocking transla-tion elongation; however, this mechanism was notabsolutely confirmed in cells. In cellular experiments,we showed that the inhibition occurred at a transla-tional level and that the mRNA was not degraded.Although we detected a truncated form of the proteinin our cell-free translation system, the truncated pro-tein was not observed in DU145 cells, and use of anantibody targeting the N-terminal region of IGF-1R didindicate a decrease of the receptor expression (data notshown). One possible reason is that the truncatedproteins may be degraded by proteasomes. Anotherreason could be that the ribosomes halted at the PNAblock remain associated with the mRNA and preventother translation cycles. Finally, we cannot rule out thepossibility that in cells, the PNA affects translationinitiation or that the PNA induces localization of themRNA to a compartment that prevents its translation.

The LNA that we tested was designed to form atriplex structure, but we did not detect an LNA2-RNAcomplex. In both the LNA and the 17-mer PNA 959,only 3 bases on either side of the central block of 11pyrimidines cannot form Hoogsteen bonds with themRNA. These flanking residues may be an obstacle totriplex formation for the charged and less flexible LNAbut not the PNA. The tested PMO was also inactive. Ourdata support the hypothesis that the triplex is necessaryto stop translation elongation on eukaryotic mRNAs.All PNAs that formed duplex structures were inactivedespite the high stability of complexes measured inthermal denaturation studies. It appears that bulkrather than stability is the essential parameter for

Figure 7. Effect of PNA on anchorage-independent colonyformation by DU145 cells. DU145 cells, permeabilized withstreptolysin-O, were transfected with buffer or 0.5 �M PNA959 or PNA scramble and plated after 24 h. Data areexpressed as percentage control colony formation for un-treated cells. Plot corresponds to quantitative analysis of 2independent experiments with means � sd. Compared withcontrol scramble PNA-transfected cells, growth of PNA 959-transfected cells lines was significantly reduced. *P 0.05;**P 0.01.


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inhibition of elongating ribosomes in the eukaryotesystem. The advantage of blocking elongation ratherthan translation initiation is that the complex can beformed anywhere on the mRNA, not just at the 5�-endmRNA. Further, with incorporation of pseudoisocyto-sines in one PNA strand, the pH dependence of theHoogsteen bonds can be avoided (52), making se-quences containing cytosines potential targets. In addi-tion to therapeutic applications, PNA steric blockerscould be used as tools to understand mechanisms ofmRNA regulation or to study the translation elonga-tion. Evidence suggests that IGF-IR signaling is re-quired for survival and growth when prostate cancercells progress to androgen independence.

The authors thank Loïc Perrouault and Karen Haug for theirtechnical assistance. The authors are grateful to Dr. RenatoBaserga (Kimmel Cancer Center, Thomas Jefferson University,Philadelphia, PA, USA) for providing human IGF-IR cDNA. Thiswork was supported by the Institut National de la Sante et de laRecherche Medicale and the Centre National de la RechercheScientifique. S.L. and C.C. are doctoral fellows supported by theFrench Ministry for Research.

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Received for publication July 22, 2010.Accepted for publication March 3, 2011.


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Résumé Les Peptide Nucleic Acids (PNA), analogues synthétiques d’acides nucléiques, interfèrent par blocage

stérique avec diverses machineries impliquées dans la régulation des gènes. Dans des systèmes

acellulaires, il a été montré que certaines séquences de PNA ciblant les régions codantes d’ARN

messagers arrêtent l’élongation de la traduction. Ces séquences riches en pyrimidines ont la

particularité de former des triplex PNA2:ARN. Grâce aux liaisons Hoogsteen, les bases pyrimidiques

d’un deuxième brin de PNA peuvent s’hybrider aux purines de l’ARN d’un duplex ARN:PNA. Si les

triplex sont suffisamment stables, ils résistent à la forte activité hélicase des ribosomes et arrêtent la

machinerie ribosomale. Le but de ce travail était d’arrêter l’élongation de la traduction du récepteur à

l'Insulin-like Growth Factor de type 1 (IGF-1R) dans des cellules cancéreuses humaines en utilisant

des séquences de PNA riches en pyrimidines. IGF-1R est un récepteur aux effets antiapoptotiques et

mitogéniques, et surexprimé dans de nombreux cancers. Il est une cible thérapeutique largement

étudiée et la diminution de son expression a pour effet d'inhiber la croissance tumorale et d’induire la

régression des tumeurs préétablies. Nous avons commencé par un criblage dans un système acellulaire

qui nous a permis de sélectionner deux séquences de PNA efficaces. Ce criblage montre que la

stratégie peut s’appliquer à un ARN très long et que les PNA efficaces contiennent un bloc central de

pyrimidines avec une très forte proportion en thymine. Ces PNA ont ensuite été testés dans des

cellules issues d’un carcinome de la prostate. Une inhibition forte et spécifique de l'expression du

récepteur a été observée. La mesure du niveau du messager par RT-PCR quantitative montre qu’il

n’est pas affecté par le traitement. L’ARNm n’est donc pas dégradé et l’inhibition se fait bien au

niveau traductionnel. La diminution de l’expression du récepteur est corrélée à une inhibition de

l’activation de ses voies de signalisation en aval et à l’inhibition de la transformation des cellules de

cancer de la prostate. Nous avons donc montré pour la première fois que l’arrêt de l’élongation de la

traduction par des PNA est réalisable dans les cellules, et nous avons développé une nouvelle stratégie

pour inhiber l’activité du récepteur à l’IGF-1.

Abstract Peptide Nucleic Acids (PNA), synthetic analogs of nucleic acids, intefere by steric blockade with

cellular machineries involved in gene regulation. In cell-free system, some PNA sequences targeting

coding regions of mRNAs halted the translation elongation. Theses pyrimidine-rich sequences have

the ability to form triplex PNA2:ARN. Thanks to Hoogsteen bonds, pyrimidine residues of a second

strand of PNA can hybridize to purines of a RNA:PNA duplex. If the triplex are stable enough, they

resist to the strong helicase activity of the ribosomes and halt the ribosomal machinery during the

translation elongation. Our aim was to block the translation elongation of the Insulin-like Growth

Factor 1 receptor (IGF-1R) in human cancer cells by using 17-mer pyrimidine-rich PNAs. IGF-1R is a

receptor with antiapoptotic and mitogenic effects, and is overexpressed in many cancers. It is a widely

studied therapeutic target and its down-regulation induces tumor growth decrease and tumor

regression. We started with a screening in a cell-free system, which enabled the selection of two

efficient PNA sequences. This screening indicated that the strategy can be carried out with a long

RNA and that efficient PNAs have a central block of pyrimidines with a large proportion of thymines.

These PNAs have then been used in prostate carcinoma cells. A strong and specific downregulation of

the receptor was observed. The measure of the mRNA level by quantitative RT-PCR showed that it

has not been affected by the treatment. Therefore, IGF-1R mRNA is not degraded and the protein

downregulation is at a translational level. The inhibition of the receptor was correlated to inhibitions of

its downstream signaling pathways and of cell transformation. Therefore, we showed for the first time

that arrest of translation elongation by PNAs in cells could be a new strategy to inhibit IGF-1R

activity.

arrêt de l’élongation de la traduction d’igf-1r par …...d’igf-1r par blocage stérique...

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