apport des nouvelles techniques dans la détection des anomalies … · 2016-10-05 · les 3...
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Apport des nouvelles techniquesdans la détection des anomalies du génome
des Syndromes Myélodysplasiques
V Eclache DESC -2015
Introduction • Les MDS sont des hémopathies clonales
– Sans anomalie spécifique unique – Clonalité de l’X par HUMARA uniquement chez les
femmes Anomalies CC sont surtout Des pertes de chromosomes (-7, -Y) – Des délétions 5q-; 7q-, 20q-, 17p-, 12p-, 11q-, 13q-… – Des trisomies +8, +11,+21 – Peu de translocations réciproques
▪ Le caryotype est indispensable à la prise en charge des SMD ▪ Diagnostic (selon OMS 2008)
▪ Pronostic (IPSS)
▪ Les études collaboratives portant sur un grand nombre de patients ont
amélioré les connaissances sur la valeur pronostique des anomalies
cytogénétiques ▪ 20 sous groupes d’anomalies cytogénétiques dont l’impact sur la survie globale et la
transformation en LAM ont été établis
▪ Répartis en 5 sous-groupes pronostiques cytogénétiques (très bon,-très mauvais) dans
l’IPSS- R ( Greenberg, 2012)
▪ Pronostic des anomalies chromosomiques isolées et des anomalies doubles
▪ Vérification statistique en analyses uni- et multivariées
Introduction -2
Places et limites respectives de la CC et de la FISH
Limites respectives de la CC et du FISH
FISH EGR1
Caryotype de très mauvais pronostic (> 3anomalies)
Pb des SMD à caryotype normal : environ 60% des cas Pour un caryotype identique : évolutions différentes Mécanismes des délétions interstitielles ? les zones connues de pertes et gains portent des gènes qui contribuent à la pathogénèse des SMD : exemple de la del(5q) - happloinsuffisance de RPS14 sur le 5q, analogie avec anémie constitutionnelle de Blakfand Diamond - miR145 & 146a réguleraient les gènes impliqués dans la mégakaryopoïèse Caséine Kinase11 (sensibilité au LEN) et d’autres gènes dans et au dehors de CDR ! Chromothripsis : del complexes ? !! Intérêt des nouvelles technologies d’exploration du génome mise en évidence de nouveaux mécanismes
Intérêt des nouvelles technologies pour les SMD à K Nx
Nouvelles technologiessans culture cellulaire
• CGH puces BACS puis oligonucléotides • SNP array • Séquençage ciblé • Séquençage Haut débit
A- CGH
B- SNP
Uniquement gain et pertes de régions
-CNV
Visualise les 2 allèles Perte d’hétérozygotie CNV Confirmation de l’anomalie somatique
Maciejewski, J. P. et al. Blood 2008;112:965-974
Confirmation par RQ-PCR ou FISH
Del 21
CD 3+
Gondek LP , Blood 2008
Différents types de lésions touchant le chromosome 7 et impact sur la survie
Délétion Perte d’hétérozygotie
*Non détectées par la CC survie
CC et SNP nal SNP anormal CC anormal
Anomalies chromosomiques et UDP detectées par SNP arrays dans 175 cas de MDS, MDS/MPD, et LAMs.
Augmentation du nombre d’anomalies détectées en particulier dans les LAMs Réduction du nombre de cas non informatifs
Gondek LP .Blood. 2008 1;111:1534-42.
Pronostic s’aggrave avec le nbr d’anomalies
Détection d’une nouvelle anomalie récurrente
Clonage et séquençage
Vérifier le caractère acquis
TET2
Delhomeau F et al,NEJM 2009
Birnbaum Br J Haematol. 2009 145:788-800
Anomalies mises en évidence par la CGH array
Mutation du gène ASXL1dans 11% des MDS et 43% de LMMC rôle d’ASXL1 dans la progression vers la LAM
Prot associée complexe polycomb qui régulent l’expression des gènes Homéotiques. (régulation des histones et de la voie de WNT)
Dunbar, A. J. et al. Cancer Res 2008;68:10349-10357
Identification de mutations nonsens de c-Cbl (11q23.3) dans des MDS/MPD
E3 ubiquitine ligase Impliquée dans la régulation de tyrosine kinase Gène supresseur de tumeur
Apport des techniques CGH et SNP
Augmentation de la résolution du caryotype grâce aux techniques de SNP A et CGH-A qui sont :
- Indépendantes de la division des cellules - Peuvent détecter les déséquilibres génétiques cryptiques et les UPD Ne peuvent détecter les clones minoritaires (< 25% cellules anormales) L’analyse complexe doit suivre des critères strictes d’exclusion de polymorphisme Outil de recherche: reconnaissance de nouvelles microdélétions/ microduplications et de
gènes cibles mutés Ces techniques devraient compléter le caryotype mais sont difficiles à utiliser en routine
diagnostique (plate formes dédiées) Etudes cliniques préliminaires montrant une influence de ces anomalies cryptiques sur le
pronostic des patients SMD
Méthode Résolution
Sensibilité (% cell anormales)
Détection des UPD
Nécessite Cellules en
division
Distinction entre clones individuels
Caryotype sur métaphases
Faible (10 à 15%) Non Oui Oui
FISH Faible (élevée) Non Non Oui
CGH arrays Elevée (20-30%)
Non Non Non
SNP arrays Très Elevée (20-30%)
Oui Non Non
Résolution de la CGH 200pb vs 10-15 Mb pour la CC
Essai QMPSF corrélation avec la CyC et aCGH
• 12 patients avec SMD, caryotypés, étudiés en aCGH Agilent 44K
• 20 gènes cibles sélectionnés dans régions délétées en CC et aCGH
• QMPSF : pcr multiplex, analyse de fragments
• Puis 69 patients supplémentaires
• Identification de del(7q) cryptiques et del(17p) avec CN
Stanopoulos et Bastard
QMPCF résultat
À chaque région : 1 pic en fonction de la taille du fragment amplifié Comparaison à témoin normal, différence des hauteurs des pics
Cellules CD34 médullaires triées n=33 Résultats
!!• Caryotypes AN: 15/33 dont 13 ont des anomalies de nombre dans les régions ciblées par
la QMPSF
• QMPSF anormales : 17/33, dont12 sur 13 anomalies de nombres détectées par CC
• 5 délétions non identifiées par CC impliquent :12p, 20q, and 7q • Des délétions cryptiques du chromosome 7q sont aussi détectées
Stamatoullas A et al , Leuk Res 2012
Séquençage haut débit
Plusieurs techniques encore complexes et couteuses !Fragments génomiques de 200 à 400 pb Whole exome, whole génome !Spectrométrie de masse pour génotypage !Permet de détecter des remaniements équilibrés des mutations géniques !Meilleure compréhension des mécanismes
Séquençage haut débit : Principe du NGS
Matériel biologique : ADN ou ARN !Etapes communes aux différentes technologies : - Fragmentation enzymatique de l’ADN !- Préparation d’une banque d’ADN (library) par ligation d’adaptateurs !- Amplification clonale !- Séquençage générant des signaux (luminescent ou fluorescent !- Détection des signaux émis et conversion en séquence
Les 3 principales variations de protocole de NGS. Le séquençage simple donne les informations sur les variations nucléotidiques, la technique paired-end permet de détecter des remaniements de petites tailles, la technique mate-paired est adaptée à la détection de remaniements de structure du génome (translocation chromosomique).
Établissement des banques de fragments et amplification avant séquençage. L’ADN est tout d’abord fragmenté, les extrémités sont “ réparées” et ligaturées à des adaptateurs (petits rectangles verts). Selon les constructeurs, 2 méthodes d’amplification sont proposées le plus souvent.a. Amplification en émulsion (ePCR).b. Amplification in situ sur la lame de verre.
Avantages et inconvénients du NGS
• Très grande sensibilité de détection (1 copie par cellule) • Lecture de séquences de plus en plus longues en un temps de plus en plus court 20 Mb/run – 100 bp/read en 2006 700 Mb/run – 700 bp/read en 2012 • Coût de – en – élevé avec l’apparition de NGS de paillasse! une application en diagnostic ! Inconvénients • Quantité de données recueillies (traitement et stockage des données, recours à un bio-informaticien) !• Problèmes au niveau insertions/délétions pas toujours détectées !• Ethique !
Mutations somatiques dans les MDS recherche de nouveaux gènes candidats
• Utilisation du NGS et de la spectrométrie de masse pour rechercher des mutations somatiques dans des régions « hotspots » de 111 gènes sur une cohorte de + 900 patients et leur implications cliniques (Bejar 2011)
• Vérification de l’ADN constitutionnel !
• Suivi par des études de tout le génome ou de tout l’éxome !
• Amélioration des connaissances
Bejar, Ebert; NEJM 2011
18 mutations récurrentes analysées
Anomalies 50% pats
CBL, BRAFF, RAS, Jak2
Bejar el al, NEJM 2011; 364(26):2491
Analyse multivariée de l’impact de 5 mutations sur la survie de 428 patientsBejar el al, NEJM 2011; 364(26):2491
!Facteur de risque
!Risque de décès
(95% IC)
!p
Age > 54 ans vs <55 ans
!1.8
!0.004
IPSS !Int-1 vs faible Int-2 vs faible Fort vs faible
!!2.29 3.45 5.85
!!< 0.001 < 0.001 < 0.001
Mutations !TP53 mut vs non EZH2 mut vs non ETV6 mut vs non RUNX1 mut vs non ASXL1 mut vs non
!!2.48 2.13 2.04 1.47 1.38
!!< 0.001 < 0.001 0.03 0.047 0.049
Modifications épigénétiques• 1-Methylation • Méthylation : profils différents entre Cellules normales et Cellules de
SMD • Méthylation en 5’ des cytosines dans régions promotrices riches en
CpGdinucléotides par DNMT3A / B • Statut de méthylation des cytosines influence transcription des gènes • Des gènes régulateurs de méthylation des cytosines sont mutés dans les
MDS : TET2, DNMT3A; IDH1- IDH2
• 2-Modification des histones • Contribuent à la régulation de l’expression des gènes • Chromatine ouverte ou fermée • EZH2 régule la balance auto renouvellement cellulaire/différenciation
Si mutations de DNMT3A, TET2, IDH1: modification méthylation des cytosines
Graubert Blood 2011
Maintient état répressif
isoCitratedehydrogénase
Triméthylation De la lysine 27
Répression de la transcription
Ilots CpG
5Méthyl Cytosine
5-AZA
AG-221
I- HDAC
Implications thérapeutiques importantes : traitement par les agents déméthylants ex: 5 aza -cytidine AMM dans le traitement des MDS de Haut grade
DNMT3A : mutations dans 8% des SMD, évolution vers LAM Souris-/-avantage compétitif, dominance clonale !TET2 : mutations dans 11 à 26% des SMD 37 à 44% des SMD/MPN 11 à 24% des LAM Pas d’influence sur la survie Augmentent l’auto renouvellement des CSH !IDH1/IDH2 : mutations dans 4 à 10% des SMD, plus si sAML Pronostic péjoratif !Les mutations de TET2, IDH1/H2 sont mutuellement exclusives
À la recherche de nouvelles anomalies du métabolisme de la 5-hydroxyméthylcytosine !-Les mutations de TET2 empêchent la formation de 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC, intermédiaire de déméthylation)(Ko, Nature 2010 ; Guo, Cell 2011) !-Les mutations d’IDH1/2 bloquent la fonction de TET2 (Figueroa, Cancer Cell 2010) !- Il est vraisemblable que d’autres mutations que TET2 et IDH1/2 affectent le taux de 5-hydroxyméthylcytosine, mais celles-ci restent inconnues !!
CTRL TET2 TET2 MUT WT
Reséquençage ciblé -! Non concluant (métabolisme IDH, réparation ADN) !Mutations IDH ! rares !Exomes !Mutations de splice Défaut d’épissage de TET2 ?
Autre avancées récentes : découvertes du rôle des Mutations touchant les gènes de l’Epissage (spliceosome)
Étape 1 : Le complexe U1 reconnait le site donneur en 5’
Étape 2 : SF1 et U2AF65 reconnaissent le point de branchement intronique !!
Étape 3 : U2AF35 reconnait le site accepteur en 3’et s’associe aux protéines SR
Étape 4 : Le complexe U2 et ses cofacteurs SF3A/B sont recrutés !
Spliceosome : complexe de 5 petits ribonucléoprotéines nucléaires snRNPs + autres protéines U2AF1 rôle dans l’épissage du premRNA : évènement initiateur U2AF1 se lie au dinucléotide accepteur de intron cible SF3B1 reconnaît le site donneur à jonction intron-exon (22 heat domains) donne complexe U2snRNP
Site donneur Site accepteurPoint de branchement
!!U2AF1
Reproduit d’après Abdel-Wahab et al. Cancer Cell 2008
!RARS et RARS-T +++ LMMC +++
Autres SMD
Mutations fréquentes
U2AF1
Mutations rares
Mutations des gènes de l’épissage dans les SMD
SF3A, PRPF40B, U2AF65, SF1, LUC7L2, PRPF8 Mutation de SF3B1 entraine down régulation
du réseau de gènes des voies mitochondriales
Mutations de gènes de l’épissage dans les SMD
• Spliceosome (Yoshida) : mutation de la voie de l’épissage dans SMD par whole exome sequencing
• Mutations des différents intervenants du spliceosome • Mutations exclusives U2AF1, SF3B1 • Lié à sous type de SMD • Tôt dans la progression • Mutation de U2AF1 serine 34 : (Graubert) 8.7% SMD de
novo • Événement précoce car id qqsoit chiffre de blastes • Favoriserait progression vers LAM
Nouvelle mutation SF3B1 localisé en 2q33
- Mutations hétérozygotes, substitution, exon 12 à 15 sans perte d’hétérozygotie. Il existe une mutation principale de SF3B1 : K700E. (Papaemmanuil oct 2011 sur 2087 échantillons)
Un modèle murin SF3B1 +/- reproduit la maladie. down regulation de gènes déterminant les fonctions mitochondriales
!- La mutation paraît largement exclusive par rapport aux autres mutations
déjà décrites.- Jamais de mutation dans les formes congénitales.
- Mutations liées à la présence de sidéroblastes, 75-78 % pour les RARS, 63 % pour les RCMD-RS et de 70 % pour les RARS-T versus 14- 20% des SMD – GB augmentés, plaq aussi, anomalies erythro, peu de blastes
• Le pronostic est le même que celui des ARSI à K nal ou Interm 1 • Patnaik jan2012; Damm nov 2011
Architecture génomique d’une cohorte de 738 MDS et SMP/SMD
Les anomalies sont regroupées par pathologies selon OMS
Associations préférentielles en vert SF3B1 avec les ARS SRSF2 et LMMC Ou exclusives en brun
Papaemmanuil E et al. Blood 2013;122:3616-3627
CNV d’un patient avec del(5q) 85% des anomalies CyC sont dépistées en aSNP
SF3B1 :24% TET2 :22% SRSF2: 14%
Mutations oncogéniques m e e dans les MDS !A :Anomalies détectées par CYC 33% , séquençage 74% ou les 2 combinés 78% B : mutations et An CyC réparties selon les entités OMS
C: Appariement entre les anomalies CyC et moléculaires retrouvées chez plus de 10 patients En bleu : les associations > au hasard En brun : associations quasi exclusives
Les mutations de l’épissage sont exclusives TET2 et IDH2 anomalies de hydroxyméthylation de l’ADN
Predicting leukemia-free survival.
Papaemmanuil E et al. Blood 2013;122:3616-3627
Le risque de transformation en LAM augmente avec le nombre de mutations dans les gènes oncogéniques
TET2 m corrélé au taux d’Hb les plus élevés Del(5)q aux taux d’Hb les plus bas
IDH2,WT1, NRAS, STAG2 et caryo complexe correllent avec les taux de blastes les plus hauts SF3B1 le plus bas
Outcome by whether driver mutations are clonal or subclonal.
Papaemmanuil E et al. Blood 2013;122:3616-3627
La présence d’une mutation oncogénique impacte la transformation en leucémie de la même façon qu’elle soit clonale ou sous clonale
Conclusion• Le caryotype garde une place importante pour le diagnostic
et le pronostic (Révision de IPSS en 2012 Greenberg et al) • Complété par la FISH en cas d’échec !
• Techniques CGH ou QMPCF peu développées !
• Mutations par NGS: de plus en plus d’étude !
• Vers de nouveaux scores pronostiques incluant les mutations les plus fréquentes
Eviter le naufrage !
!• Cytogénétique • Mutations
– Fondatrices – Epi génétiques – Sous clonales – ….