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Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing)dans le management de la sécurité
et de la qualité des aliments
Aurélien Maillet
NGS Industry Manager
Contexte
2
Quelle est la source de contamination de mon produit ?
Est-ce que la pathogène identifié vient de mon environnement ou
d’un fournisseur ?
Comment puis-je être sûr que le pathogène identifié dans mon
environnement n’est pas responsable d’une TIAC ?
Pathogènes
Pourquoi mon conditionnement est gonflé ?
Pourquoi mes produits font l’objet de réclamations clients ?
Comment puis-je réduire mes coûts de non-qualité ?
Altération/Incident de fabrication
Caractérisation et identification
3
...
Classe
Ordre
Famille
Genre
Espèce
Sérotype
Type
Souche
Virulome
Résistome
NiveauxIsolat bactérien
Caractérisation niveau 1 - Molecular subtyping / Ribotyping
(Riboprinter®)
- MLST
- PFGE
Caractérisation niveau 2
NGS
Identification- MALDI-TOF
-16S ARNr (500pb-1500pb)
- ITS2
Communauté
microbienne
Caractérisation du
microbiome
- Culture
microbiologique
NGS
Des millions de brins d’ ADN séquencés à haut débit en in 1 seule analyse
Next Generation Sequencing (NGS)
4Source : http://www.nature.com/nrg/journal/v11/n1/abs/nrg2626.html,
"Next generation sequencing"
Plateformes de séquençages développées après 2005
Des technologies de plus en plus utilisées …
5
ISO/TC 34/SC 9 : Microbiology
WG 25 Whole-genome sequencing for typing and genomic
characterization
ILSI Europe Food Safety Task Force (Nestlé, Unilever, Mondelez, Arla, Mc Donald’s,
Mérieux NutriSciences ...)
‘Next Generation Sequencing (NGS): Translation into Practice’.
http://ilsi.eu/task-forces/food-safety/microbiological-food-safety/
6
NGSWhole Genome
Sequencing (WGS) Metabarcoding
SOURCE : ACTEMIUM, SCIENCE PHOTO LIBRARY, ISTEMA-HUMANO.COM.AR
Next Generation Sequencing (NGS)
Communauté
microbienneIsolat bactérien
NGS pour l’IndustrieAgroalimentaire
7
Extraction de l’ADN
Analyse des séquences par Bioinformatique
Echantillon
alimentaire ou
environnementalIsolat
bactérien
ADN ADN
PCRSéquençage
du génome
complet
(WGS)
Metabarcoding
Caractérisation du génome
Typage isolats bactériens
Composition
microbienne
Communauté microbienne
8
WGS Metabarcoding
ID & Phylogénie
8Diversité Ecosystème
NGS pour l’Industrie Agroalimentaire
Source : Leopold et al J. Clin. Microbiol. July 2014 vol. 52 no. 7 2365-2370 Source: Antimicrob. Agents Chemother. February 2011 vol. 55 no. 2 623-630
9
WGS
ID & Phylogénie
9
NGS pour l’Industrie Agroalimentaire
Source : Leopold et al J. Clin. Microbiol. July 2014 vol. 52 no. 7 2365-2370 Source: Antimicrob. Agents Chemother. February 2011 vol. 55 no. 2 623-630
Whole Genome Sequencing (WGS)
◼ Le Whole Genome Sequencing (WGS) permet d’obtenir la sequence d’ADN complète d’un génome bactérien en uneseule fois
◼ Détails précis sur les microorganismes : gènes, plasmides, facteurs de virulence, sérotype, gènes de résistance (désinfectants, antibiotiques).
◼ Le WGS permet d’évaluer des différences au niveaunucléotidique
◼ Relations phylogénétiques entre isolats (typage)
◼ Niveau le plus fin de caractérisation bactérienne
Source: Teresa M. Bergholz et al. Applied and Environmental Microbiology 82(3) · November 2015Source : Leopold et al J. Clin. Microbiol. July 2014 vol. 52 no. 7 2365-2370
10Source: Antimicrob. Agents Chemother. February 2011 vol. 55 no. 2 623-630
WGS comment ça marche ?
11
WGS pour quoi faire ?
Meilleure connaissances (études rétrospectives)
▪ Base de données d’isolats et de leur historique
(caractérisation précise des évènements passés de
contamination/évolution des différents isolats)
▪Evènement de persistance de pathogènes
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Traçabilité et résolution de crises/TIAC
▪ Ingrédient responsable dans une recette complexe
▪ Origine des contaminations
▪ Lien entre TIAC et source alimentaire
Management de la sécurité des aliments
▪ Monitoring des environnements de production
▪ Meilleure prévention des risques bactériens
Passé
Présent
Futur
13
WGS Exemple
PERSISTANCE DE LISTERIA CHEZ UN FABRICANT DE LEGUMES
SURGELES
Contrôles positifs redondants dans les produits finis
Destruction de lots/déchets /coûts de production et analyses élevés
Le processus de fabrication est-il maitrisé ?
D’où vient la contamination ?
Utilisation du WGS
Prélèvements produits/Environnement de production
14
WGS Exemple
Lm Trémis
Lm Tapis
Convoyage
Lm Tunnel de
Surgélation
Lm Produit
15
WGS Exemple
1029 km
1431 km
Tour Eiffel
ColiséeSagrada Familia
16
WGS Exemple
1029 SNP
1431 SNP
Tour Eiffel
ColiséeSagrada Familia
Peu éloigné LointainProche Distinguable DifférenteIndistinguable
17
WGS Exemple
Lm Trémis
Lm Tapis
Convoyage
Lm Tunnel de
Surgélation
Lm Produit1500 SNP
1000 SNP
5 SNP
Distinguable DifférenteIndistinguable
18
WGS Exemple
PERSISTANCE DE LISTERIA CHEZ UN FABRICANT DE LEGUMES
SURGELES
Contrôles positifs redondants dans les produits finis
Destruction de lots/déchets /coûts de production et analyses élevés
WGS :
Identification de la source de contamination
Mesures correctives:
Procédures de nettoyage adaptées
Changement équipements/surfaces
Contexte
19
Quelle est la source de contamination de mon produit ?
Est-ce que la pathogène identifié vient de mon environnement ou
d’un fournisseur ?
Comment puis-je être sûr que le pathogène identifié dans mon
environnement n’est pas responsable d’une TIAC ?
Pathogènes
Pourquoi mon conditionnement est gonflé ?
Pourquoi mes produits font l’objet de réclamations clients ?
Comment puis-je réduire mes coûts de non-qualité ?
Altération/Incident de fabrication
Contexte
20
Quelle est la source de contamination de mon produit ?
Est-ce que la pathogène identifié vient de mon environnement ou
d’un fournisseur ?
Comment puis-je être sûr que le pathogène identifié dans mon
environnement n’est pas responsable d’une TIAC ?
Pathogènes
Pourquoi mon conditionnement est gonflé ?
Pourquoi mes produits font l’objet de réclamations clients ?
Comment puis-je réduire mes coûts de non-qualité ?
Altération/Incident de fabrication
21
Metabarcoding
21Diversité Ecosystème
NGS pour l’Industrie Agroalimentaire
MetabarcodingComment ça marche ?
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Matrice Alimentaire
et/ou
Environnementale
Extraction de
l’ADN bactérien
Séquençage d’un
gène bactérien
universel Composition/
Empreinte bactérienne
des échantillons
Metabarcoding
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Genre 1
Genre 2
Genre 3
…
Genre N
Ech
an
tillo
n1 …
Ech
an
tillo
n2 … …
Rela
tive A
bundance
(%)
100
10
1
0.1
0
Composition bactérienne des
échantillons
Heatmap Barplot
Source: Mérieux NutriSciences
Diversité d’échantillons
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◼ Environnement de production
◼ Matières premières, Matières en cours de fabrication, Produits finis
◼ Incidents de Fabrication
https://www.slideshare.net/yashgajwani1/microbiology-of-milk-59033370 http://canacopegdl.com/images/spoilage/spoilage-14.jpg
Mauvaises odeurs
Mauvais goût
Réclamations clients
Metabarcoding Exemple
Utilisation du
METABARCODING
Identification de toute la
communauté bactérienne du
produit au cours de sa durée de vie
Source: Mérieux NutriSciences
ALTEROBIO25
Identification de la
population d’altération
du produit au cours de
sa durée de vie
J0 J14 J21 J28
Quelle est l’origine de l’altération de mon
produit ?
Echantillons
Environnementaux
Metabarcoding Exemple
Utilisation du
METABARCODING
Identification de toute la
population bactérienne de
l’usine de production
(équipements, surfaces, …)
Source: Mérieux NutriSciences
ALTEROBIO
Knights et al., 2011 26
Comparaison des données
produits/environnement
« Machine Learning »
Réception/Filletage Traitement Packaging
Mauvaises odeurs
Mauvais goût
Réclamations clients
Metabarcoding Exemple
Source: Mérieux NutriSciences
ALTEROBIO27
METABARCODING :
Identification de la flore d’altération
Identification de la source de contamination
Mesures correctives:
Procédures de nettoyage plus ciblées
Révision plan de nettoyage/plan de contrôle
ou
Adaptation atmosphère conditionnement/Biopréservation
Take home messages
28
WGSInvestigation pathogènes
Caractérisation isolats
Typage/Résistance stress
Attribution de source de contamination
Meilleure maîtrise process
MetabarcodingInvestigation flores d’altération/incident de fabrication
Caractérisation du microbiote d’un produit ou d’un environnement d’usine
Compréhension écologie produit/environnement
Meilleure maîtrise process Extension durée de vie
29
Merci de votre attention
Typage Bactérien
30
Levels
...
Class
Order
Family
Genus
Species
Serotype
Type
Strain
➢ Comparaisons isolat/isolat pour déterminer leur proximité
➢ Investigations épidémiologiques
➢ Identifications de routes de transmission d’agents infectieux
?
?
?
?
?????
◼ Méthodes Phénotypiques
◼Ex: Sérotypage
Typage Bactérien
31
➢ Nécessite un œil
expérimenté
➢ Sérums onéreux
➢ Faible pouvoir
discriminant
➢ Rapide
➢ Peut être standardisé
Owais et al., 2014
◼ Méthodes moléculaires
◼Ex: MLST
Typage Bactérien
32Aanensen DM, Spratt BG (2005) The multilocus sequence typing network: mlst.net Nucleic Acids Res. Jul
1;33(Web Server issue):W728-33
◼ Méthodes moléculaires
◼Ex: MLST
Typage Bactérien
33
➢ Temps d’analyse
pouvant être
importants
➢ Faible pouvoir
discriminant -> 7
gènes
➢ Pas disponible pour
toutes les bactéries
➢ Caractérisation précise
➢ Schémas complets pour
un certain nombre
d’espèces bactériennes
◼Ex: PFGE
Typage Bactérien
34
Source : PulseNet CDC
◼Ex: PFGE
Typage Bactérien
35
➢ Temps d’analyse importants
(4 à 5 jours)
➢ Coûts élevés de mise en
place (équipement, logiciel
d’analyse, réactifs)
➢ Nécessite un personnel très
qualifié
➢ Biais d’analyses
➢ Pouvoir discriminant
important
➢ Grande résolution
➢ Reproductible
➢ Applicable à un grand
nombre d’espèces
bactériennes
◼Ex: PFGE
Typage Bactérien
36Adapté de Tunover et al., 1995
Quelles analyses ?
37
wgSNP
(L. monocytogenes)
≈ 3 000 000 basepairs
wgMLST
wgMLST
(L. monocytogenes)
4797 loci
(hqSNP)-based clustering pipelines
wgSNP
Quelles analyses ?
38
wgMLST SNP
Unité de mesure
Polymorphisme de
gène – plusieurs type
de mutation
Uniquement mutation
de nucléotide simple
Pré-requisBase de données
génique
Génome de référence
complet et de très
bonne qualité
Avantages
Rapide – ne dépend
pas de génomes de
référence
Résolution extrême –
méthodes publiées
Inconvénients
Base de données
géniques à mettre à
jour – Accès aux
bases de données
difficile – Expertise
bioinformatique
Génome de référence
– Ressource
informatique
importante -
Expertise
bioinformatique
Quelles analyses ?
39
wgSNP
(L. monocytogenes)
≈ 3 000 000 basepairs
wgMLST
wgMLST
(L. monocytogenes)
4797 loci
Indistinguable Distinguable Distinguable DifférenteIndistinguable
(hqSNP)-based clustering pipelines
wgSNP
◼ Microbial population shift
Products shelf life studies
40
unclassified
Pseudomonas 55%
Lactococcus, Leuconostoc….
Production date Use by Date (UBD) UBD + 10
Source: Mérieux NutriSciences
41
Etude de Durée de Vie de Produits
Source: Mérieux NutriSciences
◼ Microbial population shift
Production date Use by Date (UBD) UBD + 10
Coagulated UHT milk
Off odors
No culture on petri dishes
Food Defect
Other
Unclassified
Cellulomonas
Dermacoccus
Microbacterium
Propionibacterium
Chryseobacterium
Barnesiella
Alistipes
Pedobacter
Clostridium
Finegoldia
Staphyloccocus
Streptococcus
Massilia
Pseudomonas
Akkermansia
gen
re
Ab
on
da
nc
e r
ela
tive
(%
)
100
10
1
0.1
0
Spoiled Milk Ref
16S METABARCODING use
Whole bacterial community
identification within the spoiled product
and comparison with a non spoiled
product (Ref)
Chryseobacterium within the
spoiled product (90% relative
abundance) / absent within the Ref
Source: Mérieux NutriSciences 42
Thermoresistant
proteases
Random
blown-packed effect
Packaging defect
Food Defect
ReferenceSpoiled Product
METABARCODING use
Whole bacterial community
identification within the spoiled product
and comparison with a non spoiled
product (Ref)
Source: Mérieux NutriSciences
mapaq.gouv.qc.ca43
Lactobacillus within the spoiled
product (57% relative abundance)
/ absent within the reference
44
Dominant population culture on
appropriate media
Lactobacillus enumeration
Species Identification
Mass Spectrometry MALDI-TOF
Lactobacillus buchneri
Food Defect