Anomalies des voies de

signalisation et SMP :

explorations au laboratoire

d’Hématologie

Eric Lippert eric.lippert@u-bordeaux.fr

hématopoïèse normale

immatures

matures

moel

le

sang

syndrome myéloprolifératif

LMC PV TE MFP

Les principaux syndromes myéloprolifératifs

Les « grands SMP » :

Les SMP « Philadelphie-négatifs »

Les SMP plus rares :

LPNN SHE / LCE

Robb, Oncogene (2007) 26:6715

Ugo et al., Exp Hematol, 2004

Les syndromes myéloprolifératifs sont caractérisés par une

pousse autonome des progéniteurs hématopoïétiques

Pousse endogène (sans EPO)

de BFU-E dans une maladie

de Vaquez.

Méthyl-cellulose

La différenciation

érythroblastique terminale

requiert de l’EPO, sauf dans

les maladies de Vaquez

Ugo et al., Exp Hematol, 2004

Pour savoir où c’est activé, on peut inhiber

pharmacologiquement

Contrôle positif

Inhibiteur de JAK2 -> abolition totale

de la différenciation terminale

Inhibiteur de PI3K -> abolition totale

de la différenciation terminale

Inhibiteur de MAPK -> abolition partielle

de la différenciation terminale

Inhibiteurs de Src -> abolition partielle

de la différenciation terminale

Le séquençage de JAK2 retrouve une mutation

c.1849G>T,p.Val617Phe

James, Nature, 2005(234):1144

WT allele

Mut allele 3’ 5’ T

3’

G

M A

Taq

Taq

C/A 5’ 3’

WT allele

Mut allele

3’ 5’ T

3’ 5’ G

Taq

C/A 5’ 3’

3’ 5’ G

Taq

5’ T

Taq

3’

G

27%

88%

56%

10%

48%

89%

d'après Blood, 2006(108):1865

100

80

60

40

20

0 Pou

rcen

tage

JA

K2V

617F

PV TE MP

La mutation JAK2V617F n’est pas exprimée de la même façon

dans les différents SMP

Kralovics et al., N Engl J Med 2005;352:1779-90.

TE PV

Scott et al., Blood. 2006 ;108(7):2435

Critères OMS de SMP

Vardiman et al., WHO classification of

hematological malignancies 2008

Barbui et al., Blood 2012, 120:5128

IPSET-Thrombose : mutations JAK2 mais pas leucocytose

891 TE « OMS », rétrospectif

La mutation de JAK2 entraîne un sur-risque de thrombose

+ Campbell et al., Lancet 2005;366:1945

Impact de la charge allélique

Vannucchi et al., Blood 2007, 110:840

Vannucchi et al, Leukemia 2007

Impact pronostique de la mutation ? Oui : Campbell et al., Blood 2006;107:2098

Barosi et al.,Blood 2007;110:4030

Non : Tefferi et al., Leukemia 2008;22:756

Guglielmelli et al., Haematologica

2009;94:144

Impact pronostique de la charge

allélique ? Oui : Tefferi Leukemia 2008;22:756

Guglielmelli, Haematologica 2009;94:144

Le statut mutationnel JAK2 a une valeur pronostique plus

discutée dans la myélofibrose

De plus, fortes charges dans PV et TE favorisent la survenue de MF

JAK2 exon 14

FAM TAMRA

JAK2 exon 14

FAM TAMRA

JAK2 exon 14

FAM TAMRA

JAK2 exon 14

FAM TAMRA

A

B

C

D

AS-Forward

Forward

AS-Forward

Forward

Reverse

AS-Reverse

Reverse

AS-Reverse

probe

probe

probe

probe

• Importance de connaître la technique

– Sensibilité ?

– Faux-positifs ?

– Faux-négatifs ?

• Aucune technique parfaite

– La biologie clinique N’EST PAS une science exacte !

d'après Blood, 2006(108):1865

100

80

60

40

20

0 Pou

rcen

tage

JA

K2V

617F

PV TE MP

HRM in a slide

amplification melting

HRM principle

Melting + Annealing

Hétéroduplex melting

A

T

C

G

T A

C G

Homoduplex melting

Melting of referent sample

température

flu

ore

scen

ce

HRM

T A

C

G

C A

T G

C A

T G

-dF dT

Normalized and temperature shifted

difference plot

COST Training School, NÎMES, 2011 A. EVRARD, S. CARILLO

• Mutations de l’exon 12

– Phénotype de PV (EPO basse souvent)

– Pas toujours facile à mettre en évidence

– Rares

=> centres spécialisés

d'après Blood, 2006(108):1865

100

80

60

40

20

0 Pou

rcen

tage

JA

K2V

617F

PV TE MP

Ding, Blood (2004) 103:4198

de Pecquet et al., Blood, 2010

Les mutations de MPL activent le récepteur… et JAK2

• Mutations de MPL

– Pas de phénotype spécifique (TE ou MF, pas PV)

– Pas toujours facile à mettre en évidence

• HRM

• Séquence (mais petits clones)

• PCR-AS : W515K, W515L (mais rate des mutations rares)

– Rares (mais exclusive des autres mutations)

JAK2VF

MPL

?

JAK2ex12 ?

JAK2VF

JAK2VF

MPL

?

Polyglobulie de Vaquez

Thrombocytémie essentielle

Myélofibrose

Autres : - TET2 - ASXL1 - EZH2 - SRSF2 - DNMT3A… D’après Chauveau et coll., hématologie

N Engl J Med. 19 déc 2013;369(25):2391 N Engl J Med. 19 déc 2013;369(25):2379

Exome sur 6 MFP 168 MPN 2-12 mutations /génome 2 à 32 mutations 1 seule mutation récurrente : gène CALR Cohortes de validation :

53%

7%

33%

7%

Polyglobulie de Vaquez (n=920)

Thrombocytémie essentielle (n=2156)

Myélofibrose (n=534)

58%

4%

23%

15%

JAK2V617F

Mutation MPL

Mutation CALR Triple Négatif

96%

2% 2%

MutationJAK2exon 12 PV JAK2 sauvage

D’après Chauveau et coll., hématologie

Les mutations de CALR sont (quasi) exclusives des SMP à prédominance Mk

Pour qui ?

- suspicion TE ou MF - JAK2V617F -> CALR ex 9 si JAK2V617F neg -> MPL ex 10 si CALR neg - pas pour les polyglobulies - pas résolu pour - ARS-T (<2%), - thromboses splanchniques (plutôt non)

(Haslam & Langabeer, BJH 2014 : 0/144

Turon et al., J Hepatol 2014 : 4/209 mais ont SMP (3TE, 1MF))

Faut-il rechercher les mutations de CALR ?

Rumi et al., Blood 2014;123(10):1544-51

Finazzi et al., Blood 2014;124(16):2611-2

Mais ne modifie pas IPSET-thrombose

Les TE mutées sur CALR thrombosent moins

Klampfl et al., NEJM, 2013;369(25):2379-90

Les mutations CALR définissent un groupe favorable dans les

MF… mais ça dépend du type de mutation

Cabagnols et al., Leukemia. 2015 ;1:249-52

Exons 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Exon 9 3’ UTR

TGTCG

Délétions

Insertions TTGTC

A

B

Domaine N-terminal Domaine P Domaine C-terminal KDEL

Domaine N-terminal Domaine P

Domaine N-terminal Domaine P

C Protéine normale

Protéine après mutation de type 1

Protéine après mutation de type 2

Domaine C-terminal

Domaine C-terminal

Les mutations de CALR entraînent un décalage de phase

D’après Chauveau et coll., hématologie

Comment recherche-t-on les mutations de CALR ?

Comment recherche-t-on les mutations de CALR ?

Chi et al., Ann Hematol, aop 2014

Vannucchi et al., Leukemia, aop

Utilisation d’anticorps spécifiques des mutants CALR

Crt : 60 kDa, homologue Cnx Lectine, lie les GP avec un seul Glc Lie ions (Ca++, Zn…) Lie ERp57 (thiol oxydoreductase) Site lectine reconnaît Glc1 et Man

Zone liaison Ca++ hte affinité

Zone liaison Ca++ basse affinité (tamponne le Ca du réticulum)

Lynch & Michalak, BBRC 2003; 311: 1173

Les mutations de CALR : conséquences fonctionnelles ?

• Mutations de CALR

– Deuxième par ordre de fréquence pour TE et MFP

– Toujours changement de cadre => changement de taille

– Analyse de fragments, HRM, séquence (peu (pas ?) de faibles clones)

LMC PV TE MFP

Les principaux syndromes myéloprolifératifs

Les « grands SMP » :

Les SMP « Philadelphie-négatifs »

Les SMP plus rares :

LPNN SHE / LCE

Les syndromes myéloprolifératifs "rares"

Réarrangement du PDGFR

Mécanisme physiopathologiques

Domaine HLH

La fusion augmente le profil d’expression du récepteur car soumet le gène au promoteur du partenaire

=>activité en conséquence

PDGFR Gène partenaire

5’

Promoteur Régulation

ADN 3’

Fusion ETV6-PDGFRB Fusion FIP1L1-PDGFRA

FIP1L1

Région JM

PDGFR

Transcription +++

0,0001

0,001

0,01

0,1

1

10

100

Co

pie

s o

f P

DG

FRA

/10

0A

BL1

1 2 3 4 5

Categories of patients

A

0,1

1

10

100

1000

Co

pie

s o

f P

DG

FRB

/10

0A

BL1

B

1 2 3 4 5

Categories of patients

Hyperéosinophilies : intérêt du dosage quantitatif des 3’ PDGFRA et PDGFRB

LMC PV TE MFP

Les principaux syndromes myéloprolifératifs

Les « grands SMP » :

Les SMP « Philadelphie-négatifs »

Les SMP plus rares :

LPNN SHE / LCE

Maxson et al., N Engl J Med 2013;368:1781-90.

Mutations de CSF3R dans les LCN/LMCa

Piazza, Nature Genet 2012 45:18

Mutations de SETBP1 dans les LMCa et LMMC

Kröger et al, Blood 2007 Lange et al, Haematologica 2013

Kiladjian et al, Blood 2008

Suivi de traitement : Interféron

Allogreffe

La quantification de JAK2 permet de suivre le traitement

Charg

e a

lléliq

ue (

%)

Temps (mois)

La quantification de CALR permet de suivre le traitement

Cassinat et al., N Engl J Med 2014; 371:188

Mansier et al., J Mol Diag, en révision

Conclusions

Depuis 10 ans, les SMP Philadelphie-négatifs sont entrés dans l’ère moléculaire Conséquences en termes de : • Physiopathologie (et développement de drogues) • Diagnostic (marqueur moléculaire pour plus de 80%) • Evaluation pronostique (scores pour greffe) • Suivi moléculaire

O2

EPO

GR

Semenza, Blood (2009) 114:2015

Kaushansky, JCI, (2005)115:3339

Murat, Blood (2002) 99:3066

Semenza, Blood (2009) 114:2015

Richmond, Trrends in Cell Biology (2005)15 :146

Physiopathologie

Partenaire de fusion

Domaine TK

Très grande variété de partenaire s de fusion

Domaine TK systématiquement conservé dans tous les réarrangements