Quand et comment rechercher les bactries anarobies ?F. Mory A. Lozniewski Laboratoire de Bactriologie CHU de Nancy

Les bactries anarobieshypersensibles loxygne ou ses drivs produisent leur nergie et effectuent leurs biosynthses sans avoir recours loxygne molculaire

Les bactries anarobiesimplantation O2 de ces bactries in vivoO2 O2 O2 O2 O2 O2

FLORE EXOGENE

O2

O2

FLORE ENDOGENE

O2

prcautions particulires pour le recueil, le transport et la culture des prlvements

Quand rechercher les bactries anarobies ?

Sang (hmocultures) : systmatiquement Reemergence of anaerobic bacteremia 12 10

% dhmocultures positives bactries anarobies

8 6 4 2 0 1993 1996 2000 2004

Daprs Lassmann et al. Clin Infect Dis 2007

Suppurations fermes Systmatiquement si:gaz (crpitement : gangrne gazeuse) odeur ftide de lchantillon grains jaunes (actinomycose?) examen morphologique vocateur

Suppurations fermes En fonction de la localisation

Systme nerveux central abcs empymes

Tte et cou infections oculaires sinusites et otites chroniques abcs pri-amygdaliens abcs dentaires

Voies ariennes infrieures abcs pulmonaires pleursies purulentes pneumopathies dinhalation ?

Sphre intra-abdominale Pritonites Infections des voies biliaires Abcs hpatiques et intraabdominaux

Sphre gnitale Abcs annexiels, endomtrites

Os et articulations Arthrites,ostites, ostomylites

Peau et tissus mous Abcs, phlegmons Cellulites, fasciites, myoncroses Ulcres infects, pied diabtique

Quand ne pas rechercher des bactries anarobies ?

Prlvements provenant de sites normalement coloniss par des bactries anarobies : Prlvements oro- ou naso-pharyngs Expectorations et autres prlvements respiratoires non protgs Selles (sauf contexte particulier : C. difficile ) Effluents digestifs (liquides obtenus via stomies) Urines recueillies par voie naturelle Ecouvillonnages cutano-muqueux sans contexte particulier (prlvements vaginaux, urtraux, )

Comment rechercher les bactries anarobies ?

Prlvements : recueilAsepsie Eviter la contamination par la flore physiologique locale Eviter le contact avec loxygne Ralisation hmoculture : flacon anarobie collection purulente seringue (+ aiguille) biopsie sachet anarobie couvillon milieu de transport

Prlvements : conservation et transportConservation et transport : temprature ambiante Acheminement le plus rapidement possible au laboratoire Survie nanmoins de certaines espces anarobies plusieurs heuresdans pus > 1 ml biopsie > 1 cm3

24 hcouvillons dans milieu de transport

Prise en charge au laboratoirePrlvement Examen macroscopique Ensemencement Examen microscopique

Milieux glossArobiose 10% CO2 Anarobiose

Milieux liquidesStandard Rgnr puis paraffin

Examen macroscopique Odeur ftide (H2S, AG volatils) Fluorescence rouge / lumire UVcertaines espces de Prevotella et Porphyromonas

Coloration noire des tissus ou pusbacilles Gram ngatif pigments

Grains actinomycosiques

Examen microscopique Coloration de Gram Certaines espces de Clostridium apparaissent Gram Clostridium ramosum Clostridium clostridioforme Autres

Examen en contraste de phaseMobilit ? Spores ?

Orientation diagnostique Choix des milieux (milieux spciaux)

Milieux solides non slectifs5% de sang (sang laqu : pigmentation plus rapide des bacilles Gram pigments) vitamine K1 (1 mg/l) hmine (5 mg/l)

slectifsantibiotiques : aminosides, nomycine-vancomycine ou acide nalidixique-colistine BBE : bile esculine-gentamicine phnyl-thyl-alcool

ventuellement rduits en anarobiose (24 h)

Milieux liquides milieu denrichissement et de survie diffrents milieuxRosenow cystin Schaedler Bouillon cur-cervelle Wilkins Chalgren

prparation quasi extemporane rgnrs puis paraffins ou incubs en anarobiose

Conservation des milieux temprature ambiante pour viter la dissolution de loxygne dans les milieux basse temprature

Incubation : anarobioseincubation quasi immdiate aprs lensemencement incubation 48 h dure : 2 15 jours voire plus selon les espces recherches (Actinomyces spp., Porphyromonas spp. : 15 j) dure minimale totale : 7 jtoxicit de O2 pour bactries en phase exponentielle de croissance)

Les systmes dobtention de lanarobiose Chambre anarobie mlange gazeux :N2 80-90% H2 5-10% CO2 5-10% N2 (balayage)

O2+H2 H2O catalyseur : sel de palladium anarobiose continue

Jarres anarobies sachets gnrateurs danarobiose : obtention anarobiose en 1 2 h ou systme avec vacuation remplacement : anarobiose plus rapide/sachets

Sachets avec gnrateurs

Quel que soit le systme : toujours contrler lanarobiose : indicateur doxydo-rduction rsazurine > bleu de mthylne

Examen des culturesPus anarobie flore souvent mixte ( anarobies anarobies facultatifs arobies) Suspicion de bactries anarobies odeur nombre de colonies sur glose incube en anarobiose > nb de colonies sur glose incube sous CO2 ou en arobiose aspects des coloniespigmentation fluorescence en lumire UV

Milieux solides repiquage des colonies suspectes vrifier :le caractre anarobie strict de la bactrie certaines bactries anarobies strictes peuvent pousser sous CO2 Actinomyces spp. Propionibacterium spp. Bifidobacterium spp. Clostridium tertium

la puret de la culture (coloration de Gram)

Milieux liquides coloration de Gram risolement : sur milieux gloss (incubs en anarobiose et sous CO2) en labsence de croissance sur milieu glos initial

Rincuber !

Identification prsomptiveAspect et odeur des colonies colonies pigmentes sur glose au sang : Prevotella spp., Porphyromonas spp., Actinomyces odontolyticus colonies creusant la glose : B. ureolyticus aspect et odeur des colonies : C. difficile envahissement de la glose : C. septicum, C. tetani double zone dhmolyse : C. perfringens

Aspect aprs coloration de Gram bacilles Gram - fusiformes bacilles Gram + ramifis : Propionibacterium spp., Actinomyces spp. bacilles Gram + sporuls

Identification prsomptiveKana. (1 mg) Bactries Gram ngatif Bacteroides du groupe fragilis Prevotella spp. Porphyromonas spp. Fusobacterium spp. Veillonella spp. Vanco. (5 g) Colistine (10 g) Bile (1 mg) Vert brillant (100 g) S S S R

R RS R S S

R R S R R

R V R S S

R S S V

Bactries Gram positif

V

SR

R

RS : rsistance de la plupart des espces SR : sensibilit de la plupart des espces

Identification : mthodes conventionnellesGaleries commercialises mtabolisme : API 20Ancessit dune croissance bactrienne incubation en anarobiose (24-48 H)

activits enzymatiques : Rapid ID 32A, Rapid ANA IIincubation en atmosphre normale (4-5 H)

Identification : mthodes conventionnellesAnalyse des produits terminaux du mtabolisme (acides gras volatils ou non volatils) CPG laboratoires spcialiss

Mthodes gnotypiquesSquenage de gnes ADN codant lARN 16S Autres gnes (housekeeping genes)

Bactrimies

Bacteroides du groupe fragilisClostridium spp. CGPA Fusobacterium spp.

Infections de la sphre digestive

Bacteroides du groupe fragilisClostridium spp. Eggerthella lenta CGPA Prevotella spp. Fusobacterium spp.

Infections gnitales Endomtrites - salpingites

Prevotella spp. CGPA Porphyromonas spp. Fusobacterium spp.

Actinomyces spp. Eubacterium nodatum

Infections sur DIU

Infections de la sphre ORLPhlegmons, angines rcidivantes Fusobacterium spp. Prevotella spp. Porphyromonas spp. Actinomyces spp. Sinusites chroniques, sinusites Prevotella spp. aigus dorigine dentaire, sinusites Fusobacterium spp., nosocomiales Porphyromonas spp. CGPA Otites moyennes chroniques Prevotella spp. Fusobacterium spp., Porphyromonas spp. CGPA P. acnes

Infections de la peau et des tissus mousDermohypodermites avec fasciite ncrosante polymicrobiennes Clostridium spp., Bacteroides spp., Fusobacterium spp., CGPA Dermohypodermites avec fasciite ncrosante monomicrobiennes Clostridium spp. (C. perfringens) Myoncroses C. perfringens, C. septicum, C. novyi, C. histolyticum, C. sordellii, Bacteroides spp., Fusobacterium spp., CGPA

Infections osto-articulairesCGPA P. acnesClostridium spp. Prevotella spp. Fusobacterium spp. Bacteroides du groupe fragilis

En conclusion

Faut-il rechercher les bactries anarobies en routine ?Non ?

Difficult et cot de lanalyse bactriologique Dlai de rponse long

Oui !!

Les espces anarobies les plus frquemment impliques en pathologie humaine peuvent tre isoles en utilisant des moyens de transport et de culture adapts et disponibles identifies par des mthodes simples et au moyen de systmes commercialiss dans un dlai raisonnable

Oui !!

Dlai compatible avec une rvaluation prcoce de lantibiothrapie infections monomicrobiennes (bactrimies) bactries croissance rapide (Bacteroides du groupe fragilis, C. perfringens)

Cots secondaires une prise en charge inapproprie > cots de lanalyse bactriologique

Abcs crbraux Empymes

Clostridium spp.

P. acnes

Prevotella spp. Fusobacterium spp. CGPA Actinomyces spp.

Prevotella spp. Fusobacterium spp. CGPA Actinomyces spp.Eubacterium spp. Veillonella spp.

Suppurations pleuro-pulmonaires