Accréditation N’oubliez pas les ANAEROBIESces inconnus maltraités

C. Neut, L. DubreuilUniversité de Lille II, France

Quand faut-il rechercher les anaérobies ?

Nécessité ou non de milieux de transport

Milieux d’isolement – type d’anaérobiose

Identifier comment, jusqu’à quel niveau ?

Quel méthode pour l’antibiogramme?

Souches de référence

Quels antibiotiques faut-il tester et durée d’incubation ?

Retrospective study of anaerobic bacteremia

Salonen CID 1998 26:1413

Blood cultures positive for anaerobes 81 patients

Clinically significant bacteremia57 patients

Clinically insignificant bacteremia24 patients

Initial tt effective 49%

Initial tt ineffective Changed to effective 32%

Initial tt ineffective Not changed 19%

5% died

17% died

55% died

QUAND FAUT-IL RECHERCHER LES ANAEROBIES ?

QUAND FAUT-IL RECHERCHER LES ANAEROBIES ?

Mauvaise odeur de l’échantillon (souvent tardif)Présence de gaz dans une lésion,

Formation d’abcès, gangrène, nécrose de tissuInfections chroniques

Foyers proches des muqueuses[dentaires, orofaciales, abdominales, gynécologiques (sauf MST)]

Infections secondaires à des morsures humaines ou animales

QUAND FAUT-IL RECHERCHER LES ANAEROBIES ?

QUAND FAUT-IL RECHERCHER LES ANAEROBIES ?

Infections tumorales (bronchiques, coliques et utérins)

Infections où les anaérobies sont toujours en cause : dentaires,péritonites, infections post-chirurgicales abdominales pneumonies d ’aspiration, otites et sinusites chroniquesinfections des extrémités chez le diabétique)

QUAND FAUT-IL RECHERCHER LES ANAEROBIES ?

Coloration noire du pus ou fluorescence rouge du prélèvementPrésence d ’un pus ou grain de soufre (Actinomyces)

A l’examen direct présencede leucocytes altérés et flore très abondante polymorphe

de formes caractéristiques d’anaérobies Fusobacterium, ClostridiumCulture stérile ou isolement d ’un seul germe sans rapport avec l ’aspect polymorphe de l ’examen direct.Selle stérile

Clostridium tetani

Actinomyces israelii

Infections intra-abdominalesInfections intra-abdominales

Bactéries IB AH P A

B. fragilis +++ +++ +++2 +++Prevotella ++ ++ ++ ++Fusobacterium ++ ++1 ++ ++Clostridium +++ +++ +++ +++Eubacterium + + + +Peptostreptococus ++++ +++ +++ +++

Espèces associées spécifiquement : 1 F. necrophorum ; 2 Bilophila wadsworthia

IB = infections biliaires, AH = abcès hépatique, P = péritonites, A = appendicites

Infections en O.R.L.Infections en O.R.L.

Bactéries SC OC ID ALVB. fragilis + +Prevotella +++ +++ +++ ++Porphyromonas ++ ++ +++ +Fusobacterium +++ +++ +++ 1 ++++Clostridium + + +Eubacterium + + + +Peptostreptococus ++++ +++ +++ +++

Espèces associées spécifiquement : 1 F. necrophorum + spirochètes; 2 P. gingivalis, P. intermedia, B. forsythus + E. corrodens, Capnocytophaga, S. milleri

SC = sinusites chroniques, OC = otites chroniques, ID = dentaires, A LV= angines

Infections de la peau et des tissus mousInfections de la peau et des tissus mous

Bactéries UD AR MH MA ASB. fragilis +++ +++Prevotella + + +++ +++ ++1Porphyromonas + + +++ +++ +++Fusobacterium + + +++ +++ +++Clostridium + +++ ++2Peptostreptococus ++ ++ +++ ++ +++

Espèces associées spécifiquement : 1 B. ureolyticus; 2 C. perfringens et C. tetani, + E. corrodens, Capnocytophaga, Pasteurella

UD = ulcère de décubitus, AR = abcès rectal,escarre, MH et MA = morsures humaines ou animales, AS= abcès du sein

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Recherche et identification

Il est donc possible • - de prévoir les espèces qui seront isolées selon la

pathologie • - de selectionner les bactéries qui doivent être

identifiées et leur sensibilité aux antibiotiques déterminée.

• NB hémocultures , LCR, biopsies cérébrales, osseuses > toutes bactéries

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Don Whitley AES

Ruskinn

Rechercher simplement des bactéries anaérobies

Le prélèvement– Éviter l’écouvillon– Utiliser un cryotube contenant 1,5 mL d’un milieu de

transport réduit et introduire à la seringue quelques microlitres du prélèvement

• Un tube déjà rempli réduit la quantité d’air• Le réducteur favorise la survie• Ne pas conserver au froid

Le transport

• Le plus rapidement possible• Mais: survie des bactéries anaérobies jusque

24h dans le milieu de transport sans changement important des proportions bactériennes

Les milieux réduits

• Milieux pré-réduits prêt à l’emploi• « Régénération » des milieux liquides juste

avant l’ensemencement• Stockage de quelques géloses en sachet

anaérobie au froid jusqu’à l’emploi

Les milieux de culture

• Gélose avec 5% de sang:– Gélose Columbia– Gélose Wilkins-Chalgren– Gélose Brucella

• Préparer juste avant l’emploi ou stocker au froid en anaérobiose

L’ensemencement

L’incubation

• En chambre anaérobie• En jarre• En sachet individuel (jusque 4 boites)

– Avantages: observation des boites possibles sans casser l’anaérobiose

Observation après culture

Vérification du type respiratoire

• Ensemencer un tube de Veillon• La culture anaérobie est passée en milieu

liquide paraffiné (milieu de Rosenow ou autre milieu liquide de préférence avec l’indicateur d’Andrade)

Aspect de la culture en milieu liquide

1- Tube rose, faible production de gaz:Gram: petit bac Gram-:forte présomption de Bacteroides

ou Prevotella2- Tube jaune, avec ou sans production de

gaz: Gram: cocci Gram+bac Gram- (Fusobacterium)bac Gram+ (Clostridium)

Identification phénotypique

• Difficile sauf pour Bacteroides

• Très facile et fiable par spectrométrie de masse

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Sensibilité aux antibiotiques• Lister les résistances naturelles• Choisir antibiotiques standard :Amox; amox+ clavu,

pip-taz, imipenem, clinda, metro, vanco• Si abcès cérébral ou os

Levofloxacine et rifampicineSi multirésistance

Linézolide, moxifloxacine, tigécycline, chloramphénicolIncuber 48h et relire le métronidazole à 5 jours

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Sensibilité aux antibiotiques

• Ajouter des règles négatives1- ne pas tester la céfoxitine (B. fragilis)2- ne pas rechercher les ß-lactamases sur B. fragilis3- Souche plus sensible à amox+ clavu /amox ne signifie pas production de ß-lactamaseß-lactamase des Prevotella préférer E test amox

Résistance naturelle des anaérobiesRésistance naturelle des anaérobies

Résistance naturelle:

triméthoprime, aztréonam, fosfomycine (sauf Fusobacterium)

acide nalidixique et quinolones classiques

aminoglycosides (kanamycine 75 mg/l, néomycine 20mg/L)

en fonction des espèces

métronidazole : Propionibactéries et Actinomyces

rifampicine : F. necrophorum et F. mortiferum

céphalosporines : C. difficile

vancomycine : C. innocuum

Taux de résistance à la clindamycine de 1977 à 2008

1

8 1013

1612 13

2329 28

33 3238

35

05

10

1520253035

40

1977 1985 1989 1993 1997 2000 2006

Résistance à la clindamycine 2006

Bacteroides fragilis 39%

Fusobacterium 11% (F. necrophorum)

C. difficile 72%

Autres clostridia 46%

P. acnes 25%

Peptostreptococcus sp 25% ( Finegoldia magna)

Ensemble des anaérobies 30,8%

Clostridium autres que C. perfringens et C. difficile

ßlactamase produite par : C. butyricum,

C. clostridioforme, C. ramosum

Résistance naturelle : vancomycine (C. innocuum)

C. innocuum intrinsic resistance to vancomycinC. innocuum intrinsic resistance to vancomycin

Mory, Dubreuil, Leclercq JCM 1998

For most clostridia MIC Vancomycin 0.5-2 mg/L range

C. innocuum 28 strains

Vanco MIC 8-16 mg/L MIC90 16mg/L

Teicoplanin MIC 0.25-1mg/L MIC90 0.5 mg/L

Inhibition zone diameter 14-16mm but 46% > 17 mm

Resistance among clostridia of the RIC group

Low-level intrinsic resistance :

C. ramosum : vancomycin, linezolid, daptomycin

C. innocuum : vancomycin daptomycin

C. clostridioforme: teicoplanine, daptomycin, ramoplanin

Les mousquetaires anaérobiesdes infections pulmonaires et O.R.L

Prevotella et Porphyromonas

Prevotella non pigmentéesP. oris, P. buccae, B. buccalis, P. veroralis

P. bivia, B. disiens

Prevotella pigmentéesP. melaninogenica, P. intermedia, P.corporis, P. denticola

Porphyromonas

P. gingivalis, P. endodontalis, P. asaccharolytica

Role of ß-lactamases from gram neg anaerobesRole of ß-lactamases from gram neg anaerobes

Nord-Brook

ß-lactamases excreted by Prevotella or Fusobacterium caused clinical failures when patients were treated by penicillins

otitis - sinusitis-dental abcess-lung abcess-recurrent tonsillitis

0

5

10

15

20

25

0.01 0.03 0.06 0.12 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 64 128 256

Distribution des CMI de l ’amoxicillineen fonction de la production de ß-lactamase

Nb de souches

mg/l

Prevotella

Sensibilité des Fusobacterium

1990-1993 : 336 souches 4,7% des souches ß-lac+

Résistance naturelle : macrolides bas niveau

Sensibilité : pénicillines (si ß-lactamase -) ,

pénicillines + inhibiteurs (si ß-lactamase +),

streptogramines, métronidazole

Résistance acquise : clindamycine

F. necrophorum bithérapie ?

Sensibilité aux FQ des Prevotella et Fusobacterium

Antibiotique Prevotella FusobacteriumCMI 50% 90% 50% 90%

Ciprofloxacine 1 4 2 4Ofloxacine 2 8 1 4Lévofloxacine 2 4 1 2

Moxifloxacine 0,12 0,5 0,12 1

Bacteroides du groupe fragilis

Bacteroides et Parabacteroides

B. fragilis, B. thetaiotaomicronP.distasonis, P. merdae

B. caccae, B. ovatus, B. vulgatusB. uniformis, B. stercoris

B. eggerthii,B.intestinalis, B. nordii, B. salyersaeB. caccae, B. coprocla,B. dorei, B. finegoldii,

P. johnsonii, B. massiliensis,B. plebeius

Phénotypes de résistance parmi les souches de B. fragilis imipénème sensibles

Antibiotique type hyperproduction de ßlactamase ou/et absence sauvage de porine ou carbapénèmase silencieuse

(80) (10) (6) (2) (1)

Ticarcilline S R R R R

Coamoxyclav S S S/I I/R R

Ticar+ clavu S S S S I/R

Pipéra+tazo S S S S I

Imipenem resistance : B. fragilis

MIC in mg/l

imipenem 128

cefoxitin 128

piperacillin >128

carbapenemase : metalloenzyme, zinc dependant

inhibited by EDTA, not by clavulanic acid.

Règle de lecture interprétative : toute souche imipenem R est résistante à toutes les ß-lactamines

Taux de résistance à l ’imipénème de 1984 to 2008

0

1

21,5

4

1

2,6

0,8 0,8

000,5

11,5

22,5

33,5

4

1984 1988 1994 1997 1998 2000 2001 2002 2003 2008

AMX TIC PIP

CEF FOX CTT

AMC TCC PTZ

CTX IMP

ERY

TE

MTR

CM

C

AMX TIC PIP

CFT CFX CTT

AMC TCC PTZ

CTX IMP MTZ

ERY CLN

TE CM

B. fragilis metronidazole-R

Disk diffusion test

difficult to apply for slow growing organisms

May indicate :

B. fragilis High resistance level to clindamycin (MIC >128 mg/l)

carbapenemase production

metronidazole resistance (to be confirm by E test)

Clostridia, Prevotella and Fusobacterium ß-lactamase production

(to be confirm by E test : MIC ≥ 0.38 mg/l)

MIC in agar dilution ≥0.5 mg/l

Peptostreptococcus High resistance level to clindamycin

E test and anerobesE test and anerobes

reading at 24h 64% of strains including 77% of B. fragilis group48h 95% 100%

Agreement with agar reference method (+1log ) 85%Major discrepancies 1.7%, very major discrepancies 1.7%

very major errors 16.6% (24h) 2.5% B. fragilis (48h)37.5% 0 % Clostridia

tendancy to lower MIC if Mc farland 0.5E test 100µl on a 150mm Petri dish = 6,000 CFU/mm2

Steers replicator 2mm2 / spot = 40,000 CFU/mm2

Amoxicillin-clavulanate resistance rates from 1985 to 2008

01

54

75,6

6,6

4 4,3 4,35,5

14,2

02

468

10

121416

1984 1992 1994 1997 1998 2000 2001 2002 2003 2004 2006 2008

B. fragilis S or Intermediate to metronidazole

H. Marchandin et al.

Detection of nim genes by PCR in :

• 7 isolates of the Bacteroides fragilis grouplocalization MIC geneSigmoid abcess 64 nimA (x2)Pancreas fluid 16 nimA (x2)Blood 4 nimBPus (sacrum) 4 nimEPus (intra-abdominal) 4 nimDAscitic fluid 8 nimDPeritoneal fluid 4 nimB

• 1 isolate of Veillonella sp.Sacrum scab 4 nimE

Results (2)

1 5 40 28 27 26 25 24 22 21 20 19 18 17 16 T- M T- 23 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 7 39 14 15

458

pb

Detection of nim genes by PCR

PCR + 7 Bacteroides fragilis group1 Veillonella sp.

Metronidazole resistance in France

French resistant strains MTZ-R

1 Prevotella buccae and 3 strains of P. loescheii CMI = 16 mg/L

1 B. fragilis MIC = 64 mg/L

H. Marchandin et al. Anaerobes 2002;8:137

Veillonella nim E in a metronidazole-susceptible Veillonella sp. strain MIC = 4 mg/L

H. Marchandin, Dubreuil, AAC 2004 48:3207

Metronidazole resistance

B. fragilis & B. ovatus from appendicetomy MIC >32 mg/l : failure in Koweit

Rotimi et al. Clin Microbiol Infect 1999 ; 5:166-169

B. fragilis MIC =256 in New Delhi with clinical failureChauldry, Emerging Infect Dis 2001,7,485-486

B. fragilis MIC >32 mg/L in SeattleShapiro et al. J Clin Microbiol 2004 ;42:4127-4129

B. fragilis in Hungary (Nagy et al.), Poland (Wojcik)

Prevotella loescheii MIC 12 mg/L subdural empyema

in Cardiff Sandoe JAC 2001;47:366-367.

Metronidazole resistance

C. difficile MIC =16 mg/L in Hong Kong, Madrid and CardiffWong et al.Diagn Microbiol Infect Dis 1999 ;34:1-6

Pelaez AAC 2002,46:1647-1650 Brazier et al. JAC 2001;48:471-472

Equine isolates in Sacramento MIC = 32 mg/lJang et al. Clin Infect Dis 1997, S2�66-267

Finegoldia magna MIC >128 mg/L Cape TownTheron et al. JAC 2004; 54 :240-242

C. perfringens in Edinburgh MIC >32 mg/L Faris et al. J Infect 1999,2:164-165.

Anaerobes & E-test ou MICE in routine

inoculation McFarland 1 in brucella broth (or Schaedler)

agar medium Brucella+blood 5% + vitK1 + supplements or MH-F

drying 10mn

incubation in anaerobiosis as soon as possible

reading after 24 or 48h of incubation

48h if clindamycin

E -test vs ATB ANA bioMérieux

E test* ATB ANA**

% McFarland 1,48h CA-SFM NCCLS

Agreement 95.1 94.3 94.4

Minor discrepancies 3.8 4.8 3.8

Major errors 0.5 0.3 0.7

Verymajor errors 0.6 0.6 0.6

Preference for CA-SFM metronidazole,amoxicillin and Gram+

NCCLS amoxicillin and gram negative

*Pierrard **Dubreuil

Metronidazole hetero-resistance in C. difficile

• Detection 9/73 patients

Disk diffusion (5µg) after 5 days of incubation

• Susceptible: 28 -30 mm• Resistant: 10-22 mm or no zone of inhibition,• Squatter colonies inside the inhibition zone after 5 days of incubation• Nearly same results using freshly isolated strains and E test strips after

a 5 days incubation period

Pelaez et al.; J Clin Microbiol 2008, 46:3028

Metronidazole hetero-resistance clinical impact ?

• Relapses in patients treated with metronidazole :

• Heteroresistant strains 44% (4/9)• Susceptible strains 15.6% (10/64)

» P=0.06

» Sanchez-Somolinos et al., Clin Inf Dis 2008 47:818

Clinical failure linked to heteroresistanceamong anaerobes

• B. fragilis • Prevotella and metronidazole• Eggerthella lenta and imipenem

• Initial empiric treatment failed anaerobe alone in all blood cultures +

• susceptible strains at 48h heteroresistance

• anaerobic infection cured by an adequate therapy

31/10/2011 66

A savoir• Detection résistance possible par antibiogramme• Confirmation par E test ou MICE• ATB Biomérieux possible si souche pousse sur

Wilkins Chalgren• Pas de recherche du gène nim• Recherche gène cfiA interessant avec commentaire

pour le clinicien• Hétérorésistance 5J pour métronidazole,clindamycine

31/10/2011

[Multirésitance aux antibiotiques]

B. fragilis

Mythe

ou

réalité

31/10/2011

Multirésistance aux antibiotiquesAmoxicilline > 128 Amoxicilline + ac clavulanique >128Ticarcilline >256 Ticarcilline + ac clavulanique >256Pipéracilline >256 Pipéracilline + Tazobactam > 256Céfoxitine, Céfotétan, Céfotaxime, ceftriaxone > 64Imipénème, Méropénème, Faropénème >128Erythromycine, Azithromycine, Clindamycine >128Ofloxacine 64 Sparfloxacine 16 Métronidazole 8 Chloramphénicol 8

Activité du linézolide sur les anaérobies stricts

Ecart CMI 5O CMI 90

B. fragilis 2-4 4 4

Fusobacterium 0,06-2 0,5 1

Prevotella 0,06-8 2 2

P. acnes 0,25-1 0,5 0,5

Peptostreptococcus 0,25-2 1 2

Clostridium 0,06-4 2 4

Activité de la tigécycline sur les cocci à Gram positif

0

5

10

15

20

0.06 0.25 1 4 16 16 64Cocci ̂ gram +

Cocci ˆ gram +

Activité de la tigécycline sur les Bacteroides du groupe fragilis

05

10152025

0.06 0,25 1 4 16

B. fragilis

B. thetaiota

Autres

B. fragilis B. thetaiota Autres

Detection of resistant anaerobes is needed

Bacteroides fragilis imipenem

fragilis group clindamycin, amox+ clavu

decreased susceptibility to metronidazole

Fusobacterium penicillinase and clindamycin

Prevotella ß-lactamase and clindamycin

+ métronidazole

Veillonella métronidazole

Clostridium clindamycin, ß lactamase

intrinsic resistance to glycopeptides

C. difficile vancomycin and metronidazole

ConclusionNeed of antibiotic surveys

Metronidazole resistance is widespreading in many anaerobic genera

Decreased susceptibility to metronidazole : detection requires longer incubation time on solid media.

PCR detection of nim gene may miss resistant strains

Look at glycopeptides & lipopeptides resistance

......... and multiresistant strains