différenciation des cellules épithéliales frédéric andré umr inserm 911-marseille...

Différenciation des cellules épithéliales

Frédéric AndréUMR Inserm 911-Marseille

frederic.andre@pharmacie.univ-mrs.fr

épithélium

• Les cellules épithéliales sont étroitement juxtaposées pour constituer des feuillets, appelés épithélium, qui ont pour fonction principale le revêtement ou la constitution de glande.

• Les épithélium se caractérisent par :

des mécanismes d’adhésion intercellulaire, d’adhésion avec la matrice extracellulaire et par leur différenciation (absorption, sécrétion, barrière)

différenciation??

• C’est l’ensemble des processus aboutissant à l’acquisition, par une cellule donnée, de structures et de fonctions spécialisées

Pourquoi l'intestin pour modele?

• Différenciation au cours de l'organogénèse

• Différenciation chez l'adulte le long de l'axe crypte-villosité

Organogénèse de l'intestin

endoderme

mésenchyme

Intestin adulte

• Principal organe d'absorption

• Barrière entre milieu extérieur et le milieu intérieur

• Possede de nombreuses modifications structurales permettant d’accroître la surface d’absorption

Structure de l'intestin:les replis transversaux

Structure de l'intestin:les villosités

Structure de l'intestin:les microvillosités

Les différentes zones

col

crypte

villosité

Les quatres principaux types de cellules

Cellules en gobelet (à mucus)

Cellules entéroendocrines

Cellules de Paneth

Cellules absorbantes(entérocytes)

Les entérocytes

donc…

2 spécifications différentes

4 types cellulaires différents

Localisations différente

Et pourtant proviennent de la même cellule

Devenir d'une cellule souche

Auto-renouvellement

Prolifération

Spécification(absorbtion ou secretion?)

Tris(rester dans les cryptes ou migrer?)

Différenciation

MORT

Cellules souchesdivision asymétrique

balance

prolifération différenciation

Un cas particulier: la restitution intestinale

blessuredédifferenciationmigration

proliférationdifférenciation

Quels facteurs induisent la différenciation cellulaire?

Décidément, l’environnement est à la mode…

Matriceextracellulaire

Et les cellules du mésenchyme ???

La matrice extracellulaire

D'après de Duve C: une visite guidée de la cellule

La matrice extracellulaire

Ensemble des macromolécules extracellulaire du tissu conjonctif

Une vieille expérience...Matrice extracellulaire et différenciation

PL ECM

Cellules de crypte

PL ECM

Cellules de villosité

La lame basale

La lame basale

Les isoformes de laminine

Les isoformes de laminine dans l'intestin

Laminines et organogénèse

Laminin isoforms: biological roles and effects on the intracellular distribution of nuclear

proteins in intestinal epithelial cells

INSERM, Unit 381, 67200 Strasbourg, France.

Turck N, Gross I, Gendry P, Stutzmann J, Freund JN, Kedinger M, Simon-Assmann P, Launay JF.

Experimental Cell Research 303 (2005) 494-503

Cellules CaCo2

Ln-10

Ln-1

Ln-2

Ln-5

Rôle dans:L’adhésionLa proliférationLa différenciation

isoformes de laminine et adhésion des cellules intestinales

étalement

conclusions

• Les isoformes de ln ont des effets differents sur l'adhésion et l'étalement des cellules.

• La ln -10 est la plus adhésive, suivie de la ln-2 et ln-5 et de la ln-1.

• Les isoformes de ln sont donc distincts fonctionnelement.

ISOFORMES DE LAMININE ET PROLIFERATION

ISOFORMES DE LAMININE ET

PROLIFERATION

Conclusions

• Morphologie des cellules: clones plus petits lorsque les cellules sont déposéee sur ln-1. (cellules plus compactes sur ln-1)

• Prolifération: ln-2, ln-5 et ln-10 mais pas la ln-1 augmentent la prolifération des cellules

• Ln-2, ln-5 et ln-10 fournissent des stimuli de prolifération.

ISOFORMES DE LAMININE ET DIFFERENCIATION

ARNm

protéines

conclusion

• Seule la ln-1 induit la différentiation des enterocytes

• via l'induction du facteur de transcription cdx-2?

Cdx-2 et differenciation

• Gene homeotique retrouvé dans l’intestin.

• Transfection des cellules Caco-2 par:

• Cdx-1 sens: surexpression de cdx-1

• Cdx-1 antisens: association avec l'ARNm de cdx-1 endogène; sous expression de cdx-1

• Cdx-2 sens: surexpression de cdx-2

Cdx-2 et differenciation

Courbe de croissance

ctrlcdx1S

Cdx1AS

cdx2S

Cdx-2 et differenciation

ARNm

Cdx-2 et differenciation

protéines

conclusion

Cdx-2 induit la différenciation des cellules intestinales

Conclusion générale

• Les isoformes de ln n'ont pas la même fonctionnalité.– ln-1 induit la différenciation– ln-2, ln-5, ln-10 stimulent l'adhésion et la

prolifération

Les isoformes de ln participeraient à l'equilibre prolifération/différenciation.

Autres systèmes cellulaires...

La ln-1 induit aussi la différenciation des glandes mammaires...

Elle contrôle la transcription des protéines du lait

Le mecanisme fait intervenir STAT 5

La ln-1induit aussi la différenciation des glandes thyroïde...via d’autres facteurs de

transcription

Comment peut on aller plus loin dans l'étude?

Etudes in vivo...

Intégrines...

Autres facteurs de transcription...

Pathologies associées à un defaut de laminine...

TD 1

Rappel

MigrationDifferenciation

• Rôle important de la Matrice extracellulaire dans la différenciation intestinale.

• Mais elle n’est certainement pas le seul stimulus de différenciation

• Autre hypothèse: le processus est dirigé par une horloge moléculaire intracellulaire.

  p27(Kip1) is an inducer of intestinal

epithelial cell differentiation.

Quaroni A, Tian JQ, Seth P, Ap Rhys C.

• Section of Physiology, Cornell University, Ithaca, New York 14853, USA

• Am J Physiol Cell Physiol. 2000 Oct;279(4):C1045-57.

balance

prolifération différenciation

Cyclin-dependent kinase inhibitors (CKI)

• Il en existe plusieurs: p27 Kip1 (p27), p21 Cip1/WAF1 (p21), p16…

• Correlation entre l’expression de cki et le degré de différenciation.– surexpression de p21 dans les cellules intestinales différenciées

– p27 dans les kératynocytes: l’augmentation de l’expression de p27 est concomittant avec la différenciation. Un oligonucléotide antisens de p27 inhibe la differenciation.

– Rôle de p27 dans la différenciation des cellules intestinales?

Méthode

• Utilisation de la lignée HIEC6: cellules issues de cryptes• Surexpression par infection de:

• Vecteur seul Adnull• p16 Adp16• p21 Adp21• p27 Adp27

Analyse de la prolifération, des différentes phases du cycle cellulaire,de la morphologie des cellules, de l’expression de marqueurs de différenciation

Contrôle de l’expression des ckis

Les cellules sont infectées à différentes concentrations d’adenovirus.Apres 24 heures analyse des differentes protéines par Western blot

Contrôle de l’expression des ckis

• Analyse par immunocytochimie de l’expression des cki

Conclusions

• L’infection des cellules par l’adenovirus + cDNA exogène induit l’expression des ckis

• La surexpression de P21 entraine l’expression de P27 (P27 sous le contrôle de p21?)

Cki et prolifération

A:1 jour après infectionB: effet dose de l’adenovirussur la prolifératiopnC: étude cinétique

Brdu (bromodeoxyuridine)

Ac X-Brdu

Ac X-Ac X-Brdu

Cki et prolifération

A:1 jour après infectionB: effet dose de l’adenovirussur la prolifératiopnC: étude cinétique

Conclusions

• P16, P21 et P27 inhibent la prolifération• de facon dose-dépendante.• Plus d’éfficacité pour P27, p21 puis P16• L’effet de P27 est irreversible

Surexpression des cki et cycle cellulaire

Pic G1

Pic G2-S-M

Intensité de fluorescenceContenu en ADN

Nom

bre

de c

ellu

les

Cki et cycle cellulaire

Conclusions

• P16, P21 et P27 augmentent la quantité des cellules en phase G0/G1et diminue le nombre de cellules en phase S

Cki et morphologie

Conclusions

• L’expression des CKI entraine:• p16: cellules polygonales mais pas de

microvillosité• p27: cellules polygonales avec presence de

nombreuses microvillosités.• p21: 20-40% des cellules sont polygonales avec

des microvillosité.• p27 induit une differenciation morphologique

cki et expression de la DPP IV

Proteine

ARNm

Activité enzymatique

cki et expression de la DPP IV

Conclusions

• p27et dans une moindre mesure p21 induisent l’expression de la DPPIV fonctionnelle. Localisation a la membrane plasmique.

• Polarisation??????

Comment faire pour déterminer si l’expression de la DPPIV est

polarisée?

cki et expression de l’APN

cki et expression de l’APN

Conclusions

• p27et dans une moindre mesure p21 induisent l’expression de l’APN.

En conclusion

Autres systèmes cellulaires...Premier article montrant le rôle de p27 dans la différenciation des cellules epithéliales.

Et en 2005?Même rôle dans les cellules épithéliales

bronchiques

Comment peut on aller plus loin dans l'étude?

In vivo…Il existe d’autres facteurs que les CKI. Souris KO pour P21… l’intestin est

normal.Cancer: dans les carcinomes la P27 est souvent

sous-exprimée. Cette sous expression est associée à une augmentation de l’agressivité

des cancers.Mêmes résultats pour prostate et estomac.

Pourquoi la surexpression de P21 induit la différenciation