différenciation des cellules épithéliales frédéric andré umr inserm 911-marseille...
TRANSCRIPT
épithélium
• Les cellules épithéliales sont étroitement juxtaposées pour constituer des feuillets, appelés épithélium, qui ont pour fonction principale le revêtement ou la constitution de glande.
• Les épithélium se caractérisent par :
des mécanismes d’adhésion intercellulaire, d’adhésion avec la matrice extracellulaire et par leur différenciation (absorption, sécrétion, barrière)
différenciation??
• C’est l’ensemble des processus aboutissant à l’acquisition, par une cellule donnée, de structures et de fonctions spécialisées
Pourquoi l'intestin pour modele?
• Différenciation au cours de l'organogénèse
• Différenciation chez l'adulte le long de l'axe crypte-villosité
Organogénèse de l'intestin
endoderme
mésenchyme
Intestin adulte
• Principal organe d'absorption
• Barrière entre milieu extérieur et le milieu intérieur
• Possede de nombreuses modifications structurales permettant d’accroître la surface d’absorption
Structure de l'intestin:les replis transversaux
Structure de l'intestin:les villosités
Structure de l'intestin:les microvillosités
Les différentes zones
col
crypte
villosité
Les quatres principaux types de cellules
Cellules en gobelet (à mucus)
Cellules entéroendocrines
Cellules de Paneth
Cellules absorbantes(entérocytes)
Les entérocytes
donc…
2 spécifications différentes
4 types cellulaires différents
Localisations différente
Et pourtant proviennent de la même cellule
Devenir d'une cellule souche
Auto-renouvellement
Prolifération
Spécification(absorbtion ou secretion?)
Tris(rester dans les cryptes ou migrer?)
Différenciation
MORT
Cellules souchesdivision asymétrique
balance
prolifération différenciation
Un cas particulier: la restitution intestinale
blessuredédifferenciationmigration
proliférationdifférenciation
Quels facteurs induisent la différenciation cellulaire?
Décidément, l’environnement est à la mode…
Matriceextracellulaire
Et les cellules du mésenchyme ???
La matrice extracellulaire
D'après de Duve C: une visite guidée de la cellule
La matrice extracellulaire
Ensemble des macromolécules extracellulaire du tissu conjonctif
Une vieille expérience...Matrice extracellulaire et différenciation
PL ECM
Cellules de crypte
PL ECM
Cellules de villosité
La lame basale
La lame basale
Les isoformes de laminine
Les isoformes de laminine dans l'intestin
Laminines et organogénèse
Laminin isoforms: biological roles and effects on the intracellular distribution of nuclear
proteins in intestinal epithelial cells
INSERM, Unit 381, 67200 Strasbourg, France.
Turck N, Gross I, Gendry P, Stutzmann J, Freund JN, Kedinger M, Simon-Assmann P, Launay JF.
Experimental Cell Research 303 (2005) 494-503
Cellules CaCo2
Ln-10
Ln-1
Ln-2
Ln-5
Rôle dans:L’adhésionLa proliférationLa différenciation
isoformes de laminine et adhésion des cellules intestinales
étalement
conclusions
• Les isoformes de ln ont des effets differents sur l'adhésion et l'étalement des cellules.
• La ln -10 est la plus adhésive, suivie de la ln-2 et ln-5 et de la ln-1.
• Les isoformes de ln sont donc distincts fonctionnelement.
ISOFORMES DE LAMININE ET PROLIFERATION
ISOFORMES DE LAMININE ET
PROLIFERATION
Conclusions
• Morphologie des cellules: clones plus petits lorsque les cellules sont déposéee sur ln-1. (cellules plus compactes sur ln-1)
• Prolifération: ln-2, ln-5 et ln-10 mais pas la ln-1 augmentent la prolifération des cellules
• Ln-2, ln-5 et ln-10 fournissent des stimuli de prolifération.
ISOFORMES DE LAMININE ET DIFFERENCIATION
ARNm
protéines
conclusion
• Seule la ln-1 induit la différentiation des enterocytes
• via l'induction du facteur de transcription cdx-2?
Cdx-2 et differenciation
• Gene homeotique retrouvé dans l’intestin.
• Transfection des cellules Caco-2 par:
• Cdx-1 sens: surexpression de cdx-1
• Cdx-1 antisens: association avec l'ARNm de cdx-1 endogène; sous expression de cdx-1
• Cdx-2 sens: surexpression de cdx-2
Cdx-2 et differenciation
Courbe de croissance
ctrlcdx1S
Cdx1AS
cdx2S
Cdx-2 et differenciation
ARNm
Cdx-2 et differenciation
protéines
conclusion
Cdx-2 induit la différenciation des cellules intestinales
Conclusion générale
• Les isoformes de ln n'ont pas la même fonctionnalité.– ln-1 induit la différenciation– ln-2, ln-5, ln-10 stimulent l'adhésion et la
prolifération
Les isoformes de ln participeraient à l'equilibre prolifération/différenciation.
Autres systèmes cellulaires...
La ln-1 induit aussi la différenciation des glandes mammaires...
Elle contrôle la transcription des protéines du lait
Le mecanisme fait intervenir STAT 5
La ln-1induit aussi la différenciation des glandes thyroïde...via d’autres facteurs de
transcription
Comment peut on aller plus loin dans l'étude?
Etudes in vivo...
Intégrines...
Autres facteurs de transcription...
Pathologies associées à un defaut de laminine...
TD 1
Rappel
MigrationDifferenciation
• Rôle important de la Matrice extracellulaire dans la différenciation intestinale.
• Mais elle n’est certainement pas le seul stimulus de différenciation
• Autre hypothèse: le processus est dirigé par une horloge moléculaire intracellulaire.
p27(Kip1) is an inducer of intestinal
epithelial cell differentiation.
Quaroni A, Tian JQ, Seth P, Ap Rhys C.
• Section of Physiology, Cornell University, Ithaca, New York 14853, USA
• Am J Physiol Cell Physiol. 2000 Oct;279(4):C1045-57.
balance
prolifération différenciation
Cyclin-dependent kinase inhibitors (CKI)
• Il en existe plusieurs: p27 Kip1 (p27), p21 Cip1/WAF1 (p21), p16…
• Correlation entre l’expression de cki et le degré de différenciation.– surexpression de p21 dans les cellules intestinales différenciées
– p27 dans les kératynocytes: l’augmentation de l’expression de p27 est concomittant avec la différenciation. Un oligonucléotide antisens de p27 inhibe la differenciation.
– Rôle de p27 dans la différenciation des cellules intestinales?
Méthode
• Utilisation de la lignée HIEC6: cellules issues de cryptes• Surexpression par infection de:
• Vecteur seul Adnull• p16 Adp16• p21 Adp21• p27 Adp27
Analyse de la prolifération, des différentes phases du cycle cellulaire,de la morphologie des cellules, de l’expression de marqueurs de différenciation
Contrôle de l’expression des ckis
Les cellules sont infectées à différentes concentrations d’adenovirus.Apres 24 heures analyse des differentes protéines par Western blot
Contrôle de l’expression des ckis
• Analyse par immunocytochimie de l’expression des cki
Conclusions
• L’infection des cellules par l’adenovirus + cDNA exogène induit l’expression des ckis
• La surexpression de P21 entraine l’expression de P27 (P27 sous le contrôle de p21?)
Cki et prolifération
A:1 jour après infectionB: effet dose de l’adenovirussur la prolifératiopnC: étude cinétique
Brdu (bromodeoxyuridine)
Ac X-Brdu
Ac X-Ac X-Brdu
Cki et prolifération
A:1 jour après infectionB: effet dose de l’adenovirussur la prolifératiopnC: étude cinétique
Conclusions
• P16, P21 et P27 inhibent la prolifération• de facon dose-dépendante.• Plus d’éfficacité pour P27, p21 puis P16• L’effet de P27 est irreversible
Surexpression des cki et cycle cellulaire
Pic G1
Pic G2-S-M
Intensité de fluorescenceContenu en ADN
Nom
bre
de c
ellu
les
Cki et cycle cellulaire
Conclusions
• P16, P21 et P27 augmentent la quantité des cellules en phase G0/G1et diminue le nombre de cellules en phase S
Cki et morphologie
Conclusions
• L’expression des CKI entraine:• p16: cellules polygonales mais pas de
microvillosité• p27: cellules polygonales avec presence de
nombreuses microvillosités.• p21: 20-40% des cellules sont polygonales avec
des microvillosité.• p27 induit une differenciation morphologique
cki et expression de la DPP IV
Proteine
ARNm
Activité enzymatique
cki et expression de la DPP IV
Conclusions
• p27et dans une moindre mesure p21 induisent l’expression de la DPPIV fonctionnelle. Localisation a la membrane plasmique.
• Polarisation??????
Comment faire pour déterminer si l’expression de la DPPIV est
polarisée?
cki et expression de l’APN
cki et expression de l’APN
Conclusions
• p27et dans une moindre mesure p21 induisent l’expression de l’APN.
En conclusion
Autres systèmes cellulaires...Premier article montrant le rôle de p27 dans la différenciation des cellules epithéliales.
Et en 2005?Même rôle dans les cellules épithéliales
bronchiques
Comment peut on aller plus loin dans l'étude?
In vivo…Il existe d’autres facteurs que les CKI. Souris KO pour P21… l’intestin est
normal.Cancer: dans les carcinomes la P27 est souvent
sous-exprimée. Cette sous expression est associée à une augmentation de l’agressivité
des cancers.Mêmes résultats pour prostate et estomac.
Pourquoi la surexpression de P21 induit la différenciation