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LIONEL STÉPHAN

AMÉLIORATION DE LA TRANSPLANTATION DE MYOBLASTES UN TRAITEMENT POSSIBLE DE LA

DYSTROPHIE MUSCULAIRE DE DUCHENNE

Utilisation de la forme active de la vitamine D3 et obtention d’une tolérance immunologique

par l’administration de drogues cytoréductrices

Thèse présentée à la Faculté des études supérieures de l’Université Laval

dans le cadre du programme de doctorat en microbiologie et immunologie pour l’obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph. D.)

FACULTÉ DE MÉDECINE UNIVERSITÉ LAVAL

QUÉBEC

2008 ©Lionel Stéphan, 2008

Résumé La dystrophie musculaire de Duchenne, maladie héréditaire causée par la mutation

du gène codant la protéine appelée dystrophine, se caractérise par une dégénérescence

musculaire progressive et létale. Présentement, c’est une maladie incurable. La

transplantation de cellules myogéniques (TM) est une des approches thérapeutiques

envisagées pour améliorer la condition et l’espérance de vie des patients. Cette thérapie

consiste à prélever des myoblastes d’un donneur sain et de les transplanter dans les muscles

d’un patient dystrophique. Cette approche comporte plusieurs difficultés, dont la survie des

myoblastes post-transplantation. Premièrement, les myoblastes injectés meurent rapidement

et massivement, le succès de la transplantation ne reposant alors que sur une faible portion

de cellules transplantées. Tous les facteurs impliqués dans cette mortalité cellulaire ne sont

pas encore déterminés. Néanmoins, il est établi que la régénération musculaire se base sur

les capacités de prolifération et de différenciation des myoblastes. Le premier article de

cette thèse propose l’administration de la forme active de la vitamine D3 pour compenser la

perte initiale des myoblastes injectés. Nous avons confirmé l’effet mitogénique et

morphogénique de la vitamine D3 sur les myoblastes humains permettant ainsi, via son

administration, d’augmenter le succès des TMs. La deuxième partie de cette thèse traite du

rejet immunitaire lié à la TM allogénique. Actuellement, pour bloquer ce rejet, les

approches cliniques proposent une immunosuppression soutenue des patients, se révélant

toxique à long terme et augmentant le risque de contracter des maladies iatrogènes. Une

autre procédure, moins délétère, repose sur le développement d’une tolérance

immunologique, via l’établissement d’un chimérisme hématopoïétique mixte. Pour obtenir

ce chimérisme, les procédures existantes nécessitent un lourd conditionnement des patients,

incluant l’injection d’anticorps bloquants ou déplétants, ainsi qu’une irradiation

pancorporelle. Le deuxième article de ce manuscrit propose l’administration de drogues

cytoréductrices, déjà connues et approuvées en clinique. Ce protocole conduit au

développement d’un statut de tolérance stable ainsi que le maintien à long terme des TMs.

Les travaux effectués au cours de cette thèse proposent donc deux solutions pour

circonvenir à la destruction précoce et plus tardive des myoblastes transplantés. Ces deux

approches pourraient réduire l’aspect invasif de l’essai clinique basé sur la TM.

ii

Abstract Duchenne muscular dystrophy is a fatal neuromuscular recessive disease

characterized by widespread muscle damage throughout the body. No cure is currently

available this disease. Myoblast transplantation (MT) is an interesting approach to enhance

the life quality and life expectancy of patients. This therapy consists in harvesting

myoblasts of a non-dystrophic donor and in transplanting them in dystrophic muscles. This

approach involves many drawbacks and predominantly the loss of the grafted cells in post-

transplantation period. Firstly, an important part of injected myoblasts quickly dies

following their injection. Thus, the graft success relies on the survival of a little proportion

of grafted cells. The pathways involved in this important death of cells are not well

established. However, following a muscle injury, the muscular regeneration depends on the

proliferation and the differentiation of myoblasts. In a first study, we propose an

administration of the activated form of vitamin D3 on human myoblasts to compensate the

early loss of injected cells. Actually, some previous studies demonstrated that this vitamin

acted directly on myoblasts, regulating their proliferation and fusion. We have confirmed

these effects and demonstrated that the administration of the vitamin D3 enhances the

success of human MT. The second part of this thesis broaches the specific immune

rejection associated with the allogeneic MT. Currently, Duchenne patients are treated with

chronic immunosuppression for MT. However, the problem in humans is that the long-term

use of immunosuppressive treatments has adverse effects: nephrotoxicity, increased cancer

risk etc... Mixed-haematopoietic chimerism is a promising approach to circumvent

sustained immunosuppression but most of proposed protocols need antibodies treatment or

host irradiation. The second study of this thesis shows that we have developed a protocol

based on a short term administration of two cytoreductive drugs, both approved for clinical

use. The mixed-chimerism development obtained with our conditioning regimen promotes

donor specific stable tolerance. Taken together, this thesis gives two solutions to

circumvent the early and late destruction of transplanted myoblasts. These approaches

could be further included in the clinical essay developed for the Duchenne muscular

dystrophy by promoting the efficiency and decrease the clinical risk related to the MT.

Avant-Propos Comme pensait Confusius (Kong Fu Zi) « C’est du doute que jaillit la lumière ». Et

bien, ces études doctorales m’ont particulièrement bien éclairé. Dans l’univers de la

recherche, il faut avoir de l’opiniâtreté, de la conviction, de l’acharnement, de la

compassion, de l’humilité et la capacité à accepter un nombre considérable de coups de

bâton avant d’avoir comme récompense la reconnaissance de ses pairs. Pour pouvoir

supporter ces conditions, il est indispensable d’avoir la foi en son travail. Heureusement

pour moi et heureusement pour la recherche, je me suis rendu à l’évidence qu’il me

manquait cette foi pour continuer dans cette voie. Néanmoins, l’expérience que j’ai acquise

au cours de ces années sera certainement profitable au développement de mes projets

actuels…

Je tiens tout d’abord à remercier mon directeur de thèse, le Dr. Jacques-P.

Tremblay, pour m’avoir accueilli dans son laboratoire. Il m’a donné la chance de voir ce

qu’était la recherche au Canada. Son expérience, sa gentillesse et son professionnalisme

m’ont guidé tout au long de ma thèse. C’est grâce à des hommes comme lui que la

recherche avance à pas de géants.

Je voudrais naturellement remercier mes collègues de travail. Anciens et jeunes du

laboratoire, vous m’avez apporté beaucoup de joie et de soutien. Vous avez été une équipe

formidable avec laquelle j’ai partagé des moments extraordinaires. J’ai eu beaucoup de

chance d’être étudiant au sein de cette équipe. Une pensée particulière pour ce Québécois

sans lequel les soirées dans le vieux Québec auraient certainement été moins colorées.

Merci pour tout Philippe, mon ami à jamais.

Je tenais également à remercier ma famille, et plus spécialement mes parents. Vous

avez cru en moi jusqu’au bout, merci pour tout, votre éducation et bien entendu votre

amour m’ont aidé incontestablement à poursuivre mes études.

Je terminerai par le soutien de ma famille par alliance qui me va droit au cœur… Et

bien sûr, tout mon amour pour ma femme, ma petite Québécoise. Merci pour tout Isabelle

St-Pierre, ton soutien, ta patience, ta compréhension, ton amour… Je t’aime plus que tout.

« Tout ce qui ne nous tue pas nous rend plus forts ». Friedrich Wilhelm Nietzsche.

Table des matières Chapitre 1 : Introduction.........................................................................................................1 1 Quelques notions de myologie........................................................................................1

1.1 Les types de tissus musculaires ..............................................................................1 1.1.1 Le tissu musculaire strié squelettique .................................................................1 1.1.2 Le tissu musculaire strié cardiaque...................................................................12 1.1.3 Le tissu musculaire lisse ...................................................................................15

2 La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD)...........................................................16 2.1 Myopathies et dystrophies musculaires ................................................................16 2.2 Historique de la dystrophie musculaire de Duchenne ..........................................16 2.3 Étiologie................................................................................................................18 2.4 La dystrophine et son complexe protéique associé...............................................19

2.4.1 Gène de la dystrophine et mutations.................................................................19 2.4.2 La dystrophine ..................................................................................................19 2.4.3 Protéines associées............................................................................................20

2.5 Pathologie .............................................................................................................24 2.5.1 Prévalence.........................................................................................................24 2.5.2 Signes cliniques ................................................................................................24 2.5.3 Histopathologie du tissu musculaire strié squelettique.....................................27 2.5.4 Histopathologie du tissu musculaire strié cardiaque.........................................30 2.5.6 Histopathologie du tissu musculaire lisse.........................................................31 2.5.7 La DMD et le système nerveux central ............................................................31

2.6 Modèles d’études animaux ...................................................................................31 2.6.1 Dystrophie murine ............................................................................................32 2.6.2 Dystrophie canine .............................................................................................33 2.6.3 Dystrophie féline...............................................................................................34

3 Approches thérapeutiques.............................................................................................35 3.1 Thérapies pharmaceutiques...................................................................................36

3.1.1 Inhibition de la myostatine ...............................................................................36 3.1.2 Administration de glucocorticoïdes ..................................................................37 3.1.3 Administration d’aminoglycosides ...................................................................37

3.2 Thérapies géniques ...............................................................................................38 3.2.1 Les adénovirus ..................................................................................................38 3.2.2 Les oligonucléotides .........................................................................................40 3.2.3 Approche plasmidique ......................................................................................43

4 Thérapie cellulaire ........................................................................................................44 4.1 Transplantation et immunité .................................................................................44

4.1.1 Notions d’immunobiologie ...............................................................................45 4.1.2 Cellules du système immunitaire ......................................................................46 4.1.3 Le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH)............................................64 4.1.4 Immunobiologie du muscle ..............................................................................65

4.2 Transplantation et rejet immunitaire.....................................................................70 4.2.1 Généralités ........................................................................................................70 4.2.2 Transplantation d’organes.................................................................................71 4.2.3 Greffe de cellules souches hématopoïétiques ...................................................72

vi

4.2.4 La greffe de peau ..............................................................................................73 4.2.5 Immunologie de la réaction d’allogreffe ..........................................................73

4.3 La transplantation de cellules myogéniques (TM) ...............................................77 4.3.1 Complémentation génique ................................................................................77 4.3.2 Renforcement de la capacité myogénique ........................................................80 4.3.3 Les limites de la transplantation de cellules myogéniques ...............................81 4.3.4 Premiers essais difficiles...................................................................................81 4.3.5 Quelles cellules transplanter ? ..........................................................................82 4.3.6 Comment les transplanter ?...............................................................................86

Chapitre 2: Survie des cellules transplantées........................................................................89 1 Perte cellulaire à court terme ........................................................................................89

1.1 Causes ...................................................................................................................89 1.2 Solutions précédemment envisagées ....................................................................91

1.2.1 Le facteur de croissance hépatique (HGF) .......................................................92 1.2.2 Les facteurs de croissance fibroblastiques (FGF).............................................93 1.2.3 Les récepteurs du HGF et des FGFs .................................................................95 1.2.4 Les facteurs de croissance de la famille des insulines (IGF)............................95 1.2.5 La famille des molécules appartenant au TGF-β ..............................................96 1.2.6 Le facteur inhibiteur de leucémie (LIF)............................................................97

2 Article I : Le 1,α25-dihydroxycholécalciférol augmente le succès des transplantations de myoblastes humains chez la souris SCID. .......................................................................98

2.1 Résumé..................................................................................................................98 2.2 Abstract.................................................................................................................99

3 Title : 1,25-dihydroxyvitamin D3 increases the transplantation success of human muscle precursor cells in SCID mice..................................................................................100

3.1 Introduction.........................................................................................................100 3.2 Materials and Methods........................................................................................102

3.2.1 Human muscle precursor cell (hMPC) culture ...............................................102 3.2.2 Fusion assay....................................................................................................102 3.2.3 In vitro proliferation assay..............................................................................103 3.2.4 In vitro cellular mortality assay ......................................................................103 3.2.5 Hoechst/PI labeling protocol ..........................................................................103 3.2.6 Animals and conditioning...............................................................................104 3.2.7 Graft success evaluation .................................................................................104 3.2.8 In vivo cellular mortality and proliferation assay...........................................105 3.2.9 Statistical analysis...........................................................................................106

3.3 Results.................................................................................................................107 3.3.1 In vitro Fusion Assay......................................................................................107 3.3.2 In vitro Proliferation Assay.............................................................................107 3.3.3 In vitro Mortality Assay..................................................................................107 3.3.4 Graft Success ..................................................................................................108 3.3.5 In vivo Mortality and Proliferation.................................................................108

3.4 Discussion...........................................................................................................110 3.4.1 MPC transplantation success is reduced by cell death ...................................110 3.4.2 1,25-D3 signalization pathways in skeletal muscle cells................................110 3.4.3 1,25-D3 enhanced hMPC proliferation and fusion.........................................111 3.4.4 Possible interaction of 1,25-D3 with the specific and innate immunities ......112

vii

3.4.5 1,25-D3 did not reduce apoptosis ...................................................................112 3.5 Conclusion ..........................................................................................................113

4 Perte cellulaire à moyen et long terme........................................................................120 4.1 Causes .................................................................................................................120 4.2 Solutions précédemment envisagées ..................................................................121

4.2.1 Immunosuppression ........................................................................................121 4.2.2 Tolérance immunologique ..............................................................................122

5 Article II : Induction d’une tolérance pour des greffes allogéniques par un protocole de myéloablation partiel ne requérant ni anticorps ni irradiation du receveur. .......................138

5.1 Résumé de l’article II..........................................................................................139 5.2 Abstract...............................................................................................................139

6 Title : Induction of tolerance across fully mismatched barriers by a non myeloablative treatment excluding antibodies or irradiation use...............................................................140

6.1 Introduction.........................................................................................................140 6.2 Materials and methods ........................................................................................142

6.2.1 Animals...........................................................................................................142 6.2.2 BMT................................................................................................................143 6.2.3 MPC culture....................................................................................................143 6.2.4 MPC transplantation (MT)..............................................................................144 6.2.5 Skin transplantation ........................................................................................144 Blood and muscle collection.......................................................................................144 6.2.6 Immunohistochemical detection of Dystrophin..............................................144 6.2.7Immunohistochemical detection of CD4 or CD8 T cells ...................................144 6.2.8 Elispot .............................................................................................................145 6.2.9 Statistical analysis...........................................................................................146

6.3 Results.................................................................................................................146 6.3.1 Cyclophosphamide/Treosulfan combination permits bone marrow engraftment 146 6.3.2 Clonal deletion of allo-reactive T cells occurred in response to BMT after the TTCB treatment ..........................................................................................................147 6.3.3 The TTCB treatment led to long-term survival of fully allogeneic MPC transplantation (MT). ..................................................................................................147 6.3.4 No increase of T-cell mediated activity was observed in the grafted TAs of the TTCB treated mice......................................................................................................148 6.3.5 The TTCB treated mice developed a donor specific tolerance.......................149

6.4 Discussion...........................................................................................................150 Discussion générale ............................................................................................................162 Conclusion générale............................................................................................................171 Bibliographie ......................................................................................................................172

Liste des tableaux Tableau1………………………………………………………….......................................11

Tableau2………………………………………………………….....................................130

Liste des figures Figure 1 : Hercule de Farnèse.. ..............................................................................................2 Figure 2 : Anatomie et histologie du muscle strié squelettique.............................................5 Figure 3 : Anatomie et histologie du tissu musculaire cardiaque.. ......................................14 Figure 4 : Photographie du premier patient de Guillaume Boulogne de Duchenne............17 Figure 5 : Schématisation du complexe glycoprotéique associé à la dystrophine...............22 Figure 6 : Signes cliniques de Gowers.. ..............................................................................26 Figure 7 : Dégénérescence d’un muscle squelettique touché par la dystrophie musculaire

de Duchenne. ................................................................................................................29 Figure 8 : Mécanisme moléculaire de la correction génomique médiée par les

oligodésoxynucleotides.................................................................................................42 Figure 9 : Schématisation de l’hématopoïèse ......................................................................48 Figure 10 : Récepteur d’une cellule lymphocytaire de type T et ses sous unités

membranaires................................................................................................................51 Figure 11 : Sélection positive et négative au sein du thymus..............................................53 Figure 12 : Représentation schématique d’une immunoglobuline (Ig).. .............................58 Figure 13 : Maturation des lymphocytes B..........................................................................61 Figure 14 : Immunobiologie du muscle...............................................................................67 Figure 15 : Lois de la transplantation. .................................................................................75 Figure 16 : La transplantation de myoblastes. .....................................................................79 Figure 17 : 1,25-D3 increases hMPC differentiation.........................................................114 Figure 18 : 1,25-D3 enhances hMPC proliferation ...........................................................115 Figure 19 : The 1,25-D3 does not reduce the hMPC mortality induced by staurosporin,

TNF-α or glucose oxydase. ........................................................................................116 Figure 20 : 1,25-D3 improves the graft success of hMPCs. ..............................................117 Figure 21 : FK506 does not interfere with the 1,25-D3 treatment. ...................................118 Figure 22 : In vivo mortality and proliferation index of hMPCs.......................................119 Figure 23 : Schématisation de l’activation des lymphocytes T.. .......................................128 Figure 24 : Tolerance induction protocol and MPC transplantation chronology ..............155 Figure 25 : Peripheral mixed-chimerism level evaluation.................................................156 Figure 26 : Clonal deletion of allo-reactive T cells occurs in response to TTCB

conditioning. ...............................................................................................................157 Figure 27 : Stable mixed chimerism led to long-term survival of several fully allogeneic

MPC transplantations..................................................................................................158 Figure 28 : The success of MPC transplantation in mixed-chimeric mice is similar to that

observed in FK506 chronically immunosuppressed mice. .........................................159 Figure 29 : No increase of T-cell mediated activity was observed in the grafted TA of

mixed-chimeric mice. .................................................................................................160 Figure 30 : Mixed-chimeric mice developed a stable donor specific tolerance. ...............161 Figure 31 : Signalisation intracellulaire dépendante de la forme active de la vitamine D3

....................................................................................................................................164

Chapitre 1 : Introduction

1 Quelques notions de myologie Le muscle symbolise depuis l’aube de l’humanité la force. La statue du héros grec

Héraclès de Farnese, sculptée par Glykon au 3e siècle après. J.-C., témoigne de cette pensée

(Figure 1). La myologie a ouvert ce concept en attribuant également aux muscles, des

fonctions de motricité et de thermogenèse. L’ensemble de ces fonctions est attribuable à la

succession des contractions et relâchements musculaires.

1.1 Les types de tissus musculaires Les tissus musculaires représentent un ensemble de muscles. Ces tissus sont classés

en trois catégories selon la fonction et la structure histologique des muscles qui les

composent. On parle ainsi de tissus musculaires striés squelettiques, striés cardiaques et de

tissus musculaires lisses (Tortora & Grabowski 1993). Ces trois tissus seront abordés

successivement, cependant l’accent sera mis sur le muscle strié squelettique qui est en

relation directe avec la thématique de cette thèse.

1.1.1 Le tissu musculaire strié squelettique

1.1.1.1 Développement embryologique Tous les muscles squelettiques des vertébrés dérivent de cellules souches originaires

de structures embryonnaires mésodermiques appelées somites. Lors du développement de

l’embryon, la différenciation de ces cellules souches est régulée par des signaux, positifs ou

négatifs, provenant des structures embryonnaires voisines. Les cellules souches, une fois

différenciées, expriment fortement les facteurs MyoD et Myf5 (facteurs de transcription de

type hélice-boucle-hélice)(Charge & Rudnicki 2004). Ces cellules en prolifération, MyoD

et/ou Myf5 positives, sont appelées cellules myogéniques (myoblastes). À l’instant où ces

cellules sortent de leur cycle prolifératif, elles deviennent des myocytes. Elles expriment

alors des facteurs de transcription tels que la myogénine et le « Myogenic Regulatory

Factor 4» (MRF4). Il faut noter aussi que les gènes codants pour

2

Figure 1 : Hercule de Farnèse. Découvert en 1546 dans les thermes de Caracalla à Rome, est une des pièces majeures de la collection Farnèse à Naples. Il s'agit d'une statue colossale en marbre. Cette copie romaine, datant du IIIe siècle après Jésus-Christ., reproduit en l'agrandissant un original grec en bronze de la fin du IVe siècle avant Jésus-Christ, du sculpteur grec Lysippe de Sicyone.

3

la chaîne lourde de la myosine et de la phosphate créatine kinase (PCK) musculaire

s’expriment dans les myocytes. Enfin, les myocytes, en fusionnant entre eux, forment un

syncytium qui donnera par la suite une fibre musculaire ou myotube. Pendant le

développement musculaire, une sous population de cellules myogéniques, restent

quiescentes et demeurent à la surface des fibres musculaires. Ces cellules sont appelées les

cellules satellites du muscle (Mauro 1961). L’origine embryologique de ces cellules

demeure hypothétique (Shi & Garry 2006). Classiquement nous considérons que ces

cellules sont aussi majoritairement d’origine somitique (Armand et al 1983), mais de

récentes études laissent penser que les cellules satellites pourraient dériver de la

vascularisation aortique, et plus précisément de l’aorte dorsale embryonnaire (De Angelis et

al 1999; Shi & Garry 2006). Somme toute, le muscle squelettique adulte se définit comme

étant un tissu stable constitué de myotubes post-mitotiques multi-nucléés (Charge &

Rudnicki 2004).

1.1.1.2 Histologie Le tissu musculaire squelettique (Figure 2) doit sa nomenclature au fait qu’il est

relié au squelette et impose ainsi un mouvement à l’ensemble de la structure osseuse.

Toutefois, certains muscles squelettiques peuvent être attachés à la peau, à d’autres muscles

ou encore à des structures fibreuses (fascias). La dénomination striée provient de la

structure histologique musculaire, qui dévoile au microscope électronique une succession

de bandes claires ou sombres.

Un tissu conjonctif appelé fascia profond enveloppe chaque structure musculaire.

Cette protection, formée de tissus conjonctifs fibreux, maintien les muscles ensemble et les

sépare en groupe fonctionnel. Le fascia permet le mouvement libre des muscles, sert de

support aux systèmes nerveux, sanguin, lymphatique et remplit les espaces interstitiels

musculaires.

Trois autres structures conjonctives, l’épimysium, le périmysium et l’endomysium,

viennent renforcer et protéger davantage le muscle squelettique. L’épimysium enveloppe

tout le muscle, le périmysium, situé dessous, entoure des faisceaux de 10 à 100 fibres

4

musculaires distinctes. Enfin, l’endomysium sépare chacune des fibres musculaires

composant le faisceau musculaire.

5

Figure 2 : Anatomie et histologie du muscle strié squelettique. (Tortora et al) 1994.

6

Les fibres musculaires ou myotubes, sont disposées en rangs parallèles et mesurent

de 10 à 100 µm de diamètre. La longueur des fibres est très variable selon les muscles

observés, néanmoins, certaines d’entre elles peuvent atteindre la taille de 30 cm de long. La

membrane plasmique de ces fibres est appelée sarcolemme et délimite le cytoplasme

nommé sarcoplasme. Les myotubes correspondent à la fusion de nombreuses cellules

musculaires, appelées myoblastes. Les noyaux des fibres musculaires sont situés en

périphérie du sarcoplasme, entre le sarcolemme et le réticulum sarcoplasmique. Les

mitochondries sont disposées en rangées dans toute la fibre musculaire et situées en

périphérie du sarcoplasme comme les noyaux. Finalement, le sarcoplasme est composé

d’un très grand nombre de petits filaments agencés longitudinalement dans la fibre

musculaire. Ces filaments sont les myofibrilles.

Les myofibrilles sont principalement et respectivement constituées de deux types de

myofilaments : la myosine et l’actine. L’enchevêtrement de ces filaments forme les stries

transversales, claires ou sombres, qui donnent cet aspect strié au muscle squelettique

lorsqu’il est observé au microscope. L’ensemble de ces sillons délimite des structures

fonctionnelles, appelées sarcomères, et jouent un rôle prépondérant dans la contraction

musculaire (Figure 2).

Les deux protéines majeures de la contraction musculaire sont la myosine et

l’actine. Les myofilaments de myosine comptent près de 200 protéines du même nom. Ces

molécules ressemblent à deux pipes entrecroisées ; les queues pointent vers le milieu du

sarcomère (bande M) alors que les cheminées sont orientées vers les myofilaments fins

d’actine. Les queues des molécules sont parallèles et forment le corps du filament de

myosine ; les cheminées font saillies en spirales autour de ce corps. Ces têtes de myosine

déplacent les myofilaments d’actine vers le centre du sarcomère pendant la contraction

musculaire.

Les myofilaments d’actine s’étendent depuis des points d’ancrage appelés disque Z.

La composition protéique de ces filaments indique la présence d’actine, de troponine et de

tropomyosine. Les myofilaments d’actine, qui glissent le long des filaments de myosine

lors de la contraction, contiennent les sites de liaison aux têtes de myosine.

7 Enfin un troisième type de myofibrilles, composé de titine et appelé filament

élastique, vient achever la structure des fibres musculaires. Lors de la contraction

musculaire, cette myofibrille assure une stabilité aux myofilaments de myosine en les

ancrant aux disques Z.

Toutes les fibres musculaires squelettiques n’arborent pas la même structure et la

même fonction. La teneur en myoglobine, protéine qui permet le stockage de l’oxygène

dans le muscle, varie selon le type de fibres musculaires. C’est cette différence de

concentration qui est à l’origine de la classification première des myotubes. Les fibres sont

dites rouges ou blanches selon qu’elles contiennent une quantité élevé ou faible en

myoglobine. On note également que les fibres rouges possèdent plus de mitochondries et de

capillaires que les blanches. Enfin, les fibres musculaires se distinguent également par leur

vitesse de contraction, par leur résistance à la fatigue et par leur rythme de métabolisation

de la molécule d’ATP (Adénosine triphosphate). Tous ces critères permettent de classer les

fibres musculaires en trois catégories :

Les fibres de type I : Oxydatives à contractions lentes.

Ces fibres sont résistantes à la fatigue et contiennent un taux élevé de myoglobine,

de mitochondries et de capillaires. Elles produisent facilement de l’ATP par voie de

synthèse aérobie, d’où leur nom d’oxydatives. Cependant, elles catabolisent lentement

l’ATP, générant ainsi des contractions lentes. Ces fibres constituent essentiellement les

muscles de posture.

Les fibres de types II A : Oxydatives à contractions rapides.

Ces fibres sont résistantes à la fatigue, et produisent des contractions rapides. À

l’instar des fibres de type I, elles ont une forte concentration en myoglobine, mitochondries

et capillaires. Ces fibres sont retrouvées en grand nombre par exemple dans les muscles des

membres inférieurs des « sprinters ».

Les fibres de type II B : Glycolytiques à contractions rapides.

8 La vascularisation de ces fibres est peu développée impliquant une voie métabolique

de type anaérobie glycolytique. Ainsi, la concentration en glycogène au sein de ces fibres

est élevée. Très peu de mitochondries sont dénombrées et la teneur en myoglobine est

faible. Ces fibres à contractions rapides, mais peu endurantes, se retrouvent principalement

dans les muscles des membres supérieurs.

1.1.1.3 Régénération Le muscle strié squelettique est un tissu stable présentant un renouvellement peu

fréquent de ses fibres. En effet, les lésions mineures qui surviennent quotidiennement dans

les muscles, engendrent un renouvellement cellulaire lent et diffus. Ainsi, dans un muscle

de rat adulte, chaque semaine, seulement 1 à 2 % des noyaux des myotubes sont remplacés

(Decary et al 1997; Schmalbruch & Lewis 2000). Cependant, le tissu musculaire

squelettique présente une forte capacité de régénération lors de dommages plus sévères.

Ces dommages peuvent être provoqués par des exercices musculaires intensifs, des lésions

physiques ou bien encore des lésions chimiques. Les maladies génétiques affectant le

système musculaire, nommées myopathies, sont aussi responsables de détériorations plus

ou moins sévères des tissus musculaires. Quelques soient les origines du traumatisme, la

régénération musculaire s’effectue en deux phases : la phase dégénérative et la phase

régénérative (Charge & Rudnicki 2004; Shi & Garry 2006).

1.1.1.3.1 Phase dégénérative L’évènement premier de la phase dégénérative est la nécrose des fibres musculaires.

Cette nécrose est déclenchée lors de la rupture du sarcolemme des myotubes. Les zones de

lésions peuvent être localisées ou diffuses selon l’importance du traumatisme infligé au

muscle. La perméabilité des fibres endommagées est augmentée permettant une diffusion

des protéines musculaires dans les compartiments extracellulaires. Ainsi, la PCK, qui

normalement n’est détectée qu’au niveau du sarcoplasme, se retrouve alors au niveau

sérique. Cette accumulation sérique est observée chez l’homme ou chez d’autres modèles

d’études lorsqu’ils sont soumis à des exercices physiques intenses. La présence de PCK

dans le sérum est aussi un moyen diagnostique pour les myopathies telles que les

dystrophies musculaires (Coulton et al 1988; Nicholson et al 1979; Percy et al 1979).

L’intégrité des fibres musculaires étant touchée, des colorants de faible poids moléculaire

9

peuvent de ce fait pénétrer les myofibrilles endommagées. À titre d’exemple, les

colorations à l’Evans Bleu ou au procion orange révèlent, sur des coupes histologiques de

muscles, des zones où des myofibrilles ont été lésées (Brussee et al 1997; Straub et al 1998;

Straub et al 1997). La rupture des fibres provoque également une perte de l’homéostasie

calcique au sein du tissu musculaire. Il est tout à fait envisageable que la protéolyse

dépendante du calcium aggrave de ce fait la dégénération tissulaire (Alderton & Steinhardt

2000). Par exemple, les calpaïnes qui sont des protéases activables par le calcium, peuvent

entre autre cliver les myotubes et des protéines sarcoplasmiques. En conséquence, elles

participent au processus dégénératif des muscles endommagés.

Des cellules de l’inflammation, résidentes du muscle, s’activent très rapidement

après un traumatisme musculaire sévère. Il s’agit des macrophages résidents. De récentes

études démontrent que les facteurs cellulaires libérés par ces macrophages sont à l’origine

de l’infiltration massive qui survient dans la phase dégénérative précoce du tissu

musculaire (Rappolee & Werb 1992; Tidball 1995). Chronologiquement, les neutrophiles

(1-6 heures post-trauma) (Fielding et al 1993; Orimo et al 1991), puis les macrophages (48

heures post-trauma) (Orimo et al 1991; Tidball 1995), se succèdent au sein du muscle lésé.

Ces cellules pénètrent le muscle par diapédèse. La capacité phagocytique des neutrophiles

est activée lors de la phase dégénérative. De plus, il a été clairement démontré que les

neutrophiles participent à la destruction des fibres musculaires par des mécanismes

impliquant directement la superoxyde dismutase et indirectement par le peroxyde

d’hydrogène et la myéloperoxydase (Tidball 2005). Les macrophages phagocytent les

débris cellulaires et pourraient participer à la régénération musculaire en activant les

cellules satellites (Merly et al 1999; Robertson et al 1993). De nombreux autres facteurs

viennent influencer directement ou indirectement la réponse inflammatoire au niveau

musculaire, cependant, l’importance et la fonction exacte de chacun d’eux demeurent

nébuleuse (Fan et al 1996; Skuk et al 2002a; Skuk et al 2003).

1.1.1.3.2 Phase régénérative La phase régénérative succède à la phase dégénérative du tissu musculaire. La

prolifération des cellules satellites constitue le premier évènement clef du processus

régénératif. L’injection de colchicine (inhibiteur de la division cellulaire) ainsi que

10

l’irradiation des muscles réduisent considérablement la capacité de réparation des tissus

musculaires (Pietsch & McCollister 1965; Quinlan et al 1995). Ces résultats corroborent le

fait que la division des cellules satellites contribue au processus de réparation. De plus, il

est communément établi que l’expansion des cellules satellites suffit à restaurer l’intégrité

des fibres musculaires détruites (Grounds et al 2002; Irintchev & Wernig 1987). Le

deuxième évènement majeur impliqué dans la réparation musculaire repose sur la capacité

de différenciation des cellules satellites. Cette différenciation cellulaire est comparable à

celle qui se produit lors du développement embryonnaire du muscle. Ainsi, les cellules

satellites prolifèrent puis se différencient en myocytes, répondant à des facteurs tissulaires

libérés lors du trauma musculaire. Ces myocytes finiront par fusionner soit entre eux, soit

avec les fibres détruites (Charge & Rudnicki 2004). Plusieurs marqueurs des cellules

satellites (plus ou moins établis) définissent leur état de quiescence ou de prolifération

(Tableau 1)(Charge & Rudnicki 2004). Ces dernières années, plusieurs équipes ont

démontré l’existence d’autres populations cellulaires qui contribuent à la réparation des

fibres lésées. Ces populations cellulaires ont des origines diverses (cellules souches

hématopoiétiques, mésoangioblastes…). Cependant, le degré de leur participation ainsi que

les mécanismes qu’ils impliquent restent à définir (Shi & Garry 2006). Enfin, la phase

régénérative revêt quelques traits histologiques distincts. Sur des coupes de muscles

fraîchement restaurés, les nouvelles myofibrilles apparaissent plus petites et sont centro-

nucléées. Les myotubes néo-formés sont souvent basophiles du fait de la forte synthèse

protéique dans le sarcoplasme et une forte expression de chaîne lourde de myosine y est

aussi détectée (Whalen et al 1990). En considérant une fibre selon un plan longitudinal, il

est constaté que la centro-nucléation s’observe soit continuellement au sein des fibres néo-

formées, soit sporadiquement sur des fibres réparées. Cette observation suggère que la

fusion des cellules satellites n’est pas diffuse mais focalisée aux sites de rupture fibrillaire

(Blaveri et al 1999). Enfin, la régénération musculaire étant achevée, les fibres musculaires

grossissent et les noyaux regagnent la périphérie du sarcoplasme. Ainsi, dans un cadre

physiologique normal, le muscle régénéré revêt la même apparence et retrouve la même

fonctionnalité qu’un muscle non lésé.

11

État cellulaire

Marqueurs Moléculaires Quiescent Prolifération

Membrane plasmique M-cadherine +/- +

Syndécan-3 + + Syndécan-4 + + c-met + + VCAM-1 + + NCAM + + Glyoprotéine

Leu-19 + +

CD34 +/- +/- Cytosquelette Desmine - + Facteurs de transcription Pax7 + +

Myf5 +/- + MyoD - + MSTN + +/-

Tableau 1 : Cette table représente l’expression de marqueurs des cellules satellites en fonction de leur état. Un signe (+) désigne une expression marquée du marqueur, un signe (-) une absence d’expression. La combinaison des deux signes représente une faible présence du marqueur. Myostatine (MSTN); Molécule d’adhésion cellulaire vasculaire de type-1 (VCAM-1); Molécule d’adhésion cellulaire neurale (NCAM). Chargé et al 2004.

12

1.1.2 Le tissu musculaire strié cardiaque Le tissu musculaire cardiaque (Figure 3) compose la paroi du cœur. À l’instar du

muscle squelettique ce tissu est strié. Cependant, ces contractions sont involontaires. De

plus, certaines des fibres qui le composent sont dotées d’autorythmicité, leur permettant

d’établir une cadence inhérente et alternative de contractions et de relâchements.

Les fibres du tissu musculaire cardiaque sont de forme parallélépipédique et font

près de 14µm de large. Elles sont composées de cellules mononuclées appelées

cardiomyocytes. Les noyaux de ces cellules sont au centre du sarcolemme. Bien que

ressemblant à celui des fibres musculaires squelettiques, le sarcolemme des myotubes

cardiaques contient plus de mitochondries. Ces mitochondries sont par ailleurs plus

volumineuses. Enfin, l’unité sarcomèrique est également semblable à celle observée dans le

tissu musculaire strié squelettique (Figure 3). L’ensemble des fibres musculaires cardiaques

se ramifient et s’anastomosent formant ainsi deux réseaux distincts. Les oreillettes,

définissant la partie supérieure des cloisons cardiaques, constituent le premier réseau. Les

ventricules, définissant la partie inférieure du cœur composent quant à elles le deuxième

réseau. Pour un réseau donné, chaque fibre s’interconnecte au niveau d’épaississements

transverses irréguliers du sarcolemme appelés disques intercalaires (Figure 3). Ces disques

comprennent des desmosomes et des jonctions lacunaires. Ces structures assurent

réciproquement entre les fibres, un maintien structural et un passage des potentiels d’action

musculaires qui sont à l’origine des contractions cardiaques. Ainsi lorsqu’une fibre est

stimulée, toutes les autres fibres du réseau le sont également. De ce fait, chaque réseau se

comporte comme une unité fonctionnelle.

Les fibres musculaires cardiaques sont des fibres à contractions perpétuelles et

extrêmement rapides. Cette distinction majeure avec les fibres qui composent le tissu

musculaire strié squelettique implique que le tissu musculaire cardiaque bénéficie d’une

bonne vascularisation et de la présence d’un nombre conséquent de mitochondries de

grande taille. Conséquemment, le muscle cardiaque utilise la voie de synthèse aérobie

comme mode principal de production de l’ATP. Enfin, à la différence du muscle strié

squelettique, le muscle cardiaque peut se contracter sans stimulation nerveuse extrinsèque

13

ou hormonale. En effet, des fibres cardiaques spécialisées lui confèrent une capacité

contractile autonome.

14

Figure 3 : Anatomie et histologie du tissu musculaire cardiaque. Tortora et al 1994.

15

1.1.3 Le tissu musculaire lisse Le muscle lisse est non strié et sa contraction est de type involontaire. Les fibres qui

le composent contiennent des filaments intermédiaires et des corps denses qui fonctionnent

comme les disques Z. Nous distinguons deux types de muscles lisses. Le muscle lisse

viscéral (mono-unitaire) se retrouve dans les parois des viscères et des petits vaisseaux

sanguins. Les fibres sont disposées en réseau. Le muscle lisse multi-unitaire se retrouve

dans les gros vaisseaux sanguins, les muscles érecteurs des poils et dans l’œil. Les fibres

fonctionnent indépendamment les unes des autres.

La durée de contraction et de relâchement du muscle est plus longue que celle du

muscle strié squelettique et cardiaque. Les fibres du muscle lisse se contractent en réaction

aux influx nerveux, aux hormones et à certains facteurs locaux. Enfin, le tissu musculaire

lisse a la capacité de s’étirer considérablement sans produire de tension.

16

2 La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD)

2.1 Myopathies et dystrophies musculaires Les myopathies sont des maladies qui touchent les muscles. Elles se caractérisent

par une atrophie des tissus musculaires conséquente à une dégénération progressive de ces

mêmes tissus. Les dystrophies sont des myopathies dont l’origine symptomatique est le

plus souvent liée à une mutation du gène codant pour une protéine sarcoplasmique appelée

dystrophine (Koenig et al 1988). Les dystrophies sont donc des maladies génétiques. Une

des principales dystrophies recensées, de part sa prévalence et sa sévérité, est la dystrophie

musculaire de Duchenne (DMD). La DMD est une maladie infantile létale associée à

l’absence de dystrophine dans les tissus musculaires (Franzini-Armsrong 1994).

2.2 Historique de la dystrophie musculaire de Duchenne Les premières descriptions de cas pouvant s’apparenter à la DMD furent

répertoriées dans la première moitié du XIXème siècle (Tyler 2003). Ainsi, Charles Bell

(1774-1842), Gaetano Conte (1798-1858), Richard Partridge (1805-1873) et William John

Little contribuèrent à dresser le tableau pathologique de ce qui allait devenir la DMD. Cette

dystrophie doit son nom à Guillaume Benjamin Amand Duchenne. Ce physiologiste

Français (1806-1875), natif de Boulogne sur mer, fit en 1861 la description détaillée d’un

patient (Figure 4)(Tyler 2003) atteint de dystrophie dans un feuillet intitulé « De

l’électrisation localisée et de son application à la pathologie et à la thérapeutique »

(Duchenne 1861). Cependant la paternité de la DMD reste controversée, puisque quelques

années auparavant (1851-1852) un anglais du nom de Edward Meryon (1807-1880) fit la

description de plusieurs cas identiques à celui décrit par Guillaume Duchenne (Meryon

1851). Edward Meryon attribua les causes de la maladie à une carence en éléments

nutritionnels (Tyler 2003). G. Duchenne, lui, pensa tout d’abord, que la maladie avait une

origine cérébrale « Paraplégie hypertrophique de l’enfance d’origine cérébrale » (Duchenne

1861). Puis en 1868, des études plus poussées, notamment d’un point de vue histologique,

permirent à G. Duchenne de conclure à une origine

17

Figure 4 : Photographie du premier patient de Guillaume Boulogne de Duchenne (Cas I, Joseph Sarrazin). Kenneth, L. Tyler 2003

18

musculaire de la maladie qu’il nommait alors « paralysie musculaire pseudo-

hypertrophique ou paralysie myo-sclérosique » (Duchenne 1868a; 1868b). Il associa la

pseudo-hypertrophie musculaire, observable dans les premières années des patients, à

l’invasion du tissu musculaire par du tissu conjonctif et adipeux (Duchenne 1872b). Enfin,

il remarqua que des séances d’hydrothérapie et de massothérapie complétées de

stimulations électriques pouvaient améliorer la condition des patients dans les phases

précoces du développement de la maladie (Duchenne 1872a). C’est ainsi que G. Duchenne

laissa son nom à la DMD en se différenciant de E. Meryon par une étude étiologique plus

approfondie et en présentant une première approche thérapeutique.

2.3 Étiologie En 1886, Sir William Richard Gowers (1845-1915) remarqua qu’il y avait des cas

isolés de DMD, sans antécédent familial. La fréquence de ces cas était toutefois moins

élevée que les cas avec antécédents. De plus, il constata que pour les familles touchées les

cas déclarés étaient toujours du côté maternel. Au début des années 1980, deux équipes de

recherche démontrèrent que les patients touchés par la DMD avaient des altérations

(translocation ou délétion) dans le Chromosome X. À chaque fois, les erreurs

chromosomiques survenaient dans la bande 1 de la région 2 du bras court (noté Xp21)

(Francke et al 1985; Verellen-Dumoulin et al 1984). Parallèlement, un autre groupe de

recherche remarqua qu’il y avait des polymorphismes de séquence d’ADN (acide-

désoxyribonucléique) dans la région Xp21 au sein des familles où la DMD survenait. Ainsi,

des patients ne présentant aucune délétion ou translocation chromosomique pouvaient être

touchés par la DMD (Davies et al 1983). Le groupe de Kunkel et Monaco isola un ARN

messager (ARNm) correspondant à un gène, de la région Xp21 de patients atteints de

DMD, où des délétions y étaient fréquentes (Kunkel et al 1985; Monaco et al 1986).

L’ARNm ainsi isolé avait une taille de 14 kilobases (kb). La séquence nucléotidique

correspondante amena à la découverte de la dystrophine, protéine qui était jusqu'alors

inconnue (Hoffman et al 1988). Ainsi, la DMD se définit comme étant une maladie

génétique héréditaire récessive conduisant à l’altération du chromosome X dans la région

Xp21. Cette altération engendre une absence d’expression de dystrophine au sein du tissu

musculaire (Hoffman et al 1987).

19

2.4 La dystrophine et son complexe protéique associé

2.4.1 Gène de la dystrophine et mutations Le gène de la dystrophine est un des plus gros gènes connus puisqu’il affiche une

taille faramineuse de 2.4 mégabases. (Mb) d’ADN soit environ 1% de l’ADN du

chromosome X. La séquence codante est composée de 79 exons séparés par des introns de

200 kb. Seulement 0.6% du gène code pour l’ARNm de la dystrophine (Franzini-Armsrong

1994). Diverses mutations peuvent survenir dans le gène de la dystrophine et induire une

DMD. Ces mutations touchent soit de larges segments génomiques (par délétions ou

duplications) soit de plus petits fragments (par mutations ponctuelles ou micro délétions)

(Franzini-Armsrong 1994). Les mutations impliquant de grandes portions d’ADN

constituent 60 à 70% des cas de DMD (10, 87, 128), le reste des cas étant imputables aux

petites mutations (Franzini-Armsrong 1994). Les grandes mutations sont sensiblement plus

fréquentes dans les exons ou les introns de tailles importantes. Ces zones de fortes

probabilités mutationnelles sont appelées « points chauds » (Den Dunnen et al 1989;

Koenig et al 1989; Koenig et al 1987). Enfin, il ne semble pas exister de corrélation entre la

taille de la mutation et la sévérité de la maladie (Monaco et al 1988). Cependant, il est

établi que les mutations modifiant le cadre de lecture de l’ADN conduisent à une synthèse

protéique partielle. Ainsi, la partie carboxy-terminale de la dystrophine est souvent

manquante chez les patients atteints de DMD (Beggs et al 1991; Koenig et al 1989;

Monaco et al 1988).

2.4.2 La dystrophine La dystrophine est une protéine qui représente 2% des protéines sarcoplasmiques

exprimées dans le muscle (Ervasti & Campbell 1993). La présence de plusieurs promoteurs

ainsi que l’épissage alternatif des pré-ARNms conduit à la production de plusieurs

isoformes de dystrophine. L’isoforme prédominant se retrouve dans le muscle squelettique

et cardiaque. C’est une protéine d’environ 427 kDa contenant 3685 acides aminés (Davison

& Critchley 1988; Koenig et al 1988). La séquence protéique de la dystrophine est

relativement bien conservée entre différentes espèces telles que l’homme, les rongeurs et le

poulet (Franzini-Armsrong 1994). Cette protéine peut être divisée en quatre domaines :

20 La séquence formée par les premiers 240 acides aminés (en commençant par la

partie amino-terminale) a une forte homologie avec le domaine de liaison à l’actine. De ce

fait, la dystrophine et l’actine sont liées (Matsumura et al 1993).

La seconde portion de la protéine, la plus longue, compte près de 2400 acides

aminés. En fait c’est une séquence répétitive de 100 acides aminés (Emery 1993; Gomez et

al 1977). Chaque séquence forme une structure de type hélicoïdale.

Le troisième domaine de 280 acides aminés affiche une homologie de 24% avec la

partie carboxy-terminale de l’α-actine (Koenig et al 1988).

Enfin la quatrième portion de la protéine, composée de 420 acides aminés, présente

une forte homologie avec une autre protéine appelée utrophine (Love et al 1993; Love et al

1989; Love et al 1991). Cette partie carboxy-terminale est très importante puisqu’elle se lie

à un complexe protéique associé au sarcolemme servant ainsi de pont physique entre le

sarcoplasme et la membrane plasmique.

Deux isoformes de même longueur sont exprimées dans le cerveau (Boyce et al

1991; Gorecki et al 1992). Enfin, il existe quatre autres variantes de dystrophine contenant

uniquement le premier exon. Il s’agit des protéines Dp260 (260kDa), Dp140 (140kDa)

Dp116 (116kDa) et Dp71 (71kDa) (Byers et al 1993; D'Souza et al 1995; Feener et al 1989;

Lidov et al 1995; Muntoni et al 2003). Ces dernières isoformes ne possèdent pas de

domaine de liaison à l’actine. Ceci suggère que ces isoformes pourraient avoir des

fonctions différentes que celles attribuées à leur homologue de 427kDa.

La dystrophine exprimée dans le tissu musculaire s’accumule en grande partie sur la

face cytoplasmique du sarcolemme (Watkins et al 1988; Zubrzycka-Gaarn et al 1988). La

distribution de cette protéine est assez homogène néanmoins, son expression est encore plus

marquée aux jonctions myotendineuses et neuromusculaires (Arahata et al 1988; Bonilla et

al 1988; Byers et al 1991; Carpenter et al 1990; Zubrzycka-Gaarn et al 1988).

2.4.3 Protéines associées La dystrophine ne possède pas de domaine transmembranaire propre. Néanmoins, la

dystrophine est fortement encrée au sarcolemme via un complexe protéique (Figure 5)

21

appelé « dystrophin associated protein » (DAP) (Ehmsen et al 2002). Ce complexe est

composé de 18 protéines : la laminine-α2 (mérosine), les dystroglycans (α et β), les

sarcoglycans (α, β, δ, ε et γ), la sarcospan, la dystrobrévine, les syntrophines (α1, β1 et β2),

la « nitrique oxyde synthase neuronale » (nNos), la « microtubule associated

serine/threonine kinase 205 kDa» (MAST205), la syncoiline, la cavéoline-3 et la Grb2.

22

Figure 5 : Schématisation du complexe glycoprotéique associé à la dystrophine. nNOS (Neuronal oxyde nitrique synthase). Des mutations survenant dans la dystrophine vont conduire au développement d’une DMD (Dystrophie musculaire de Duchenne) ou d’une DMB (Dystrophie musculaire de Becker). Les mutations survenant dans les sarcoglycans vont induire des DMCts (Dystrophie musculaire des ceintures type 2C, 2D, 2E, 2F). Les mutations survenant dans la mérosine vont conduire au développement d’une DMC (Dystrophie musculaire congénitale).

23

L’interaction de la dystrophine avec ce complexe protéique laisse deviner leur rôle

de support, pour la structure musculaire, via la formation d’un pont entre le cytosquelette

d’actine sarcoplasmique et la matrice extracellulaire (Ervasti & Campbell 1991; 1993).

L’absence de dystrophine se traduit par une disparition du complexe DAP au niveau du

sarcolemme chez les patients DMD ainsi que dans le modèle de souris dystrophique (cf.

chapitre 1 : 2.6) (Ibraghimov-Beskrovnaya et al 1992; Matsumura et al 1994). La rupture

du lien entre l’intérieur et l’extérieur des fibres musculaires fragilise le sarcolemme et

facilite la destruction des myotubes lors d’un effort physique (Moens et al 1993; Petrof et al

1993). Il est intéressant de noter que des mutations survenant dans les gènes codant pour les

protéines du DAP sont à l’origine de plusieurs types de dystrophies (Figure 5) (Dalkilic &

Kunkel 2003; Durbeej & Campbell 2002). En conséquence, il apparaît évident que la

dystrophine et son complexe protéique associé assurent un rôle crucial pour le maintien de

l’intégrité des fibres musculaires.

En outre, la position de la dystrophine et du DAP au niveau membranaire laisse

entrevoir une fonction de ce complexe dans la signalisation intracellulaire. À titre

d’exemples, la liaison de l’α-sarcoglycan à la laminine extracellulaire peut induire le

recrutement membranaire de molécules de signalisation telles que Rac1 (Oak et al 2003).

D’autres molécules du DAP (Nos, Grb2) peuvent également acheminer des signaux

intracellulaires (Brenman et al 1995; Yang et al 1995). De ce fait, il semble que le

complexe dystrophine-DAP puisse avoir une fonctionnalité importante autre que celle de

soutien. La non conduction de certains signaux cellulaires pourrait également contribuer

partiellement au développement de la pathologie de la DMD.

Enfin, certaines études laissent suggérer que la dystrophine participerait au maintien

de l’homéostasie du calcium. Chez les patients ainsi que chez les souris dystrophiques, la

concentration de calcium intracellulaire est anormalement élevée (Fong et al 1990; Turner

et al 1991). Par ailleurs, la culture de myotubes de patients DMD ou de souris

dystrophiques a révélé une augmentation de l’activité des canaux calciques affectant la

perméabilité du sarcolemme (Fong et al 1990; Iwata et al 1993; Vandebrouck et al 2002).

La perte de l’homéostasie du calcium pourrait être une des causes impliquées dans

24

l’augmentation du statut inflammatoire des muscles des patients DMD (Porter et al 2003;

Porter et al 2002; Spencer et al 2001; Spencer & Tidball 2001). Cependant, il reste

beaucoup d’investigations à faire pour comprendre l’ensemble des mécanismes impliqués.

2.5 Pathologie

2.5.1 Prévalence La DMD est la forme de dystrophie la plus fréquente. La prévalence de cette

maladie est environ de 1/3500 nouveaux-nés mâles (Emery 1993). Étant donné que la

DMD est liée au chromosome X, presque tous les patients atteints sont mâles. Cependant,

certains cas de patientes étant diagnostiquées DMD sont recensés. Ces patientes ont

concurremment un syndrome de Turner (un seul chromosome X) ou un syndrome de

Turner de type mosaïque (X/XX ou X/XX/XXX). Encore plus exceptionnellement, des cas

de DMD sont décelés chez des patientes ayant un profil chromosomique sexuel standard

(X/X) (Ferrier et al 1965; Jalbert et al 1966; Walton 1956). Ce diagnostique s’explique par

une déficience de compensation du chromosome sain vis-à-vis du chromosome touché

(Gomez et al 1977).

2.5.2 Signes cliniques Les premiers signes cliniques de la DMD sont décelables à la période néonatale.

Premièrement, les patients ont une concentration sérique de PCK très élevée, témoignant

d’un statut de dégénérescence musculaire. Puis, des biopsies musculaires révèlent, après

analyse histologique, la présence de fibres musculaires nécrotiques (Arikawa et al 1991;

Prelle et al 1992). Bien que le poids et la taille des patients soient normaux à la naissance,

un ralentissement de la croissance survient dans les premières années de l’enfance (Eiholzer

et al 1988). Quelques signes précoces sont épisodiquement rapportés par les parents tels

qu’un léger retard mental, de la difficulté à courir ou encore à se déplacer dans les escaliers

(Firth et al 1983). Entre 3 et 6 ans, les enfants présentent fréquemment une lordose

pathologique et une faiblesse musculaire, contraignant les patients à effectuer la manœuvre

de Gowers (Figure 6) (Tyler 2003) pour passer de la position horizontale à la position

verticale. À ce stade, les muscles les plus touchés sont les muscles proximaux et les

muscles situés dans la partie inférieure du corps. Entre 6 et 11 ans, la force des muscles du

25

torse et des jambes baisse sensiblement et de façon linéaire (Allsop & Ziter 1981; Cohen et

al 1982). Les réflexes tendineux diminuent jusqu’à disparaître dans les muscles les plus

faibles. La capacité des patients à marcher sur une courte distance ou à se redresser décroît

rapidement entre 7 et 8 ans (Brooke et al 1981). Après une dizaine d’années, et plus

spécialement après que les patients aient perdu leur mobilité, la grosseur de tous les

muscles des jambes et du torse diminue progressivement.

26

Figure 6 : Signes cliniques de Gowers. Cette manœuvre de redressement est caractéristique des enfants atteints de dystrophie musculaire de Duchenne. Cette série de photos a été réalisée à Paris à l’hôpital Bicêtre sur un enfant âgé de douze ans et atteint de dystrophie de Duchenne.Kenneth, L. Tyler 2003.

27

Cette période régressive est également marquée par la réduction de la capacité respiratoire

des patients (Fukunaga et al 1991; Inkley et al 1974). En phase terminale, les infections

respiratoires, la rétention de dioxyde de carbone et l’anoxémie causent le décès d’environ

40% des patients. Les autres meurent par insuffisance cardiaque (Mukoyama et al 1987).

Une étude de cas entre 1980 et 1984 a révélé que la mort survenait en moyenne à 20 + 3.9

ans (Franzini-Armsrong 1994).

2.5.3 Histopathologie du tissu musculaire strié squelettique La dystrophine et son complexe glycoprotéique associé assurent la stabilité de la

structure musculaire. Notamment, la dystrophine joue un rôle clef lorsque les fibres

musculaires sont physiquement sollicitées. La déficience en dystrophine chez les patients

atteints de DMD cause une rupture du lien entre la matrice extracellulaire et le

cytosquelette d’actine des fibres musculaires (Franzini-Armsrong 1994), fragilisant les

fibres à l’effort. La conséquence immédiate est la destruction plus fréquente et plus massive

des myotubes (Carpenter & Karpati 1979; Lotz & Engel 1987; Mokri & Engel 1975; 1998).

La succession de phases de dégénérescence et de régénération musculaires explique

l’évolution de l’histopathologie du muscle classiquement décrite chez les patients

(Franzini-Armsrong 1994). La plupart des éléments caractérisant ces phases sont regroupés

dans les diverses coupes histologiques de muscle strié squelettique provenant d’un patient

DMD (Figure 7).

Les zones musculaires en phase dégénérative se distinguent par la présence de

myotubes nécrotiques (Gilbert & Hawk 1963; Pearce & Walton 1962; Pearson 1962). Les

fibres en nécrose n’ont plus de membrane plasmique mais conservent leur membrane basale

(Mokri & Engel 1975; 1998). Des altérations de la membrane plasmique de myotubes non

nécrotiques sont également visibles en microscopie électronique (Bradley & Fulthorpe

1978; Carpenter & Karpati 1979). La fréquence pathologique des ruptures des myotubes est

à l’origine du taux sérique élevé en PCK des patients atteints de DMD. Cette particularité a

permis le développement d’un test enzymatique utilisé fréquemment en clinique pour

diagnostiquer les patients dystrophiques (Brooke et al 1983; Zellweger et al 1972). La

28

nécrose tissulaire est aussi à l’origine de la présence permanente de cellules inflammatoires

infiltrantes (Engel & Biesecker 1982; Oberc & Engel 1977). Les cellules sont localisées

aux sites péris-vasculaires ainsi qu’autour du périmysium et de l’endomysium (Arahata &

Engel 1984).

29

Figure 7 : Dégénérescence d’un muscle squelettique touché par la dystrophie musculaire de Duchenne. (A) Illustration de l’histologie d’un muscle sain : Les myotubes ont un aspect polygonal, sont de tailles normales et disposés de façon étriquée. Les myotubes sont séparées par un mince tissu conjonctif (l’endomysium) et regroupées en faisceaux séparés par le périmysium. (B) Des signes distinctifs d’un muscle en dégénérescence apparaisse progressivement dans les muscles dystrophiques : Les flèches désignent différents stades de nécrose des myofibrilles. La tête de flèche marque un myotube nouvellement formée. Dans l’ensemble, les myotubes sont plus petits et apparaissent plus arrondies suite à l’épaississement des tissus conjonctifs. Les petits grains désignent une infiltration cellulaire et enfin, l’astérisque marque la présence d’un tissu adipeux infiltrant le muscle. (C) et (D) correspondent à un stade plus avancé de la maladie. Skuk Daniel 2004.

30

Les muscles des patients se réparent en suivant le processus physiologique de la

phase régénérative. La formation de nouvelles fibres est caractérisée par la présence de

fibres de plus petites tailles, centro-nucléées, et basophiles (Franzini-Armsrong 1994). Les

fibres de types II sont préférentiellement remplacées par des fibres de type I (Dubowitz

1974). Les patients DMD voient également leur nombre de fibres IIB décliné en faveur des

fibres IIC (Dubowitz 1974; Imoto & Nonaka 2001; Minetti et al 1991; Nonaka et al 1981;

Webster et al 1988). Les cellules satellites participent à cette restauration tissulaire. Le

nombre moyen de cellules satellites par fibre musculaire est 3 à 7 fois plus élevé chez les

patients DMD (Ishimoto et al 1983; Wakayama et al 1979). Cependant, même si leur

nombre est plus élevé, la sollicitation permanente des cellules satellites accélère leur

sénescence (Blau et al 1983; Webster & Blau 1990). L’évolution de la DMD chez un

patient pourrait être représentée par la victoire progressive et inéluctable de la phase

dégénérative musculaire sur la phase régénérative.

Enfin, il est important de noter l’invasion progressive du tissu musculaire par du

tissu conjonctif et adipeux (Duchenne 1868b; Meryon 1851). La fibrose n’apparaît pas en

période néonatale, mais elle devient évidente vers l’age de 4-5 ans (Franzini-Armsrong

1994). Ce tissus fibreux est essentiellement composé de collagène de type III (Stephens et

al 1982). La présence de tissu fibreux et adipeux au sein du tissu musculaire, est à l’origine

de la pseudo hypertrophie des muscles gastrocnémiens des patients (Figure 7). Bien qu’il

soit aisé d’attribuer la fibrose à l’inflammation chronique du tissu musculaire, il n’en est

pas de même pour expliquer l’invasion adipeuse. Quoiqu’il en soit, les tissus adipeux et

fibreux sont les constituants majeurs des muscles striés squelettiques des patients atteints de

DMD (Figure 7).

2.5.4 Histopathologie du tissu musculaire strié cardiaque L’absence d’expression de dystrophine au niveau cardiaque est une des causes

principales du décès des patients. La dégénérescence cardiaque touche les ventricules,

l’atrium et le système contractile autonome du cœur (Farah & Suneja 1993; Perloff et al

1967; Sanyal & Johnson 1982; Sanyal et al 1978). Peu à peu, les cardiomyocytes sont

remplacés par du tissu conjonctif fibreux diminuant la contractilité et le rythme du muscle

31

cardiaque (D'Orsogna et al 1988; Farah & Suneja 1993). À la différence du muscle strié

squelettique, l’évolution de la DMD au niveau cardiaque est plus lente, se traduisant par

l’immobilité du patient bien avant son décès (D'Orsogna et al 1988; Hunsaker et al 1982).

De plus, même si 40% des patients meurent d’une insuffisance cardiaque, cette insuffisance

est souvent liée à l’hypertension pulmonaire et à l’insuffisance respiratoire suscitée par la

dégradation plus marquée du diaphragme (Yotsukura et al 1988).

2.5.6 Histopathologie du tissu musculaire lisse Bien que l’infiltration du muscle lisse par des cellules inflammatoires soit

répertoriée chez les patients dystrophiques (Huvos & Pruzanski 1967), peu de signes

pathologiques visibles sont attribuables à la déficience en dystrophine dans ce tissu.

Toutefois, des vomissements, des douleurs et dilations abdominales ainsi que des troubles

digestifs peuvent parfois survenir chez les patients (Barohn et al 1988; Robin & de 1963).

2.5.7 La DMD et le système nerveux central Certains patients dystrophiques peuvent souffrir d’un léger retard mental. Cette

observation fut établie dès les premiers cas de DMD décrits (Tyler 2003). Le retard survient

en bas âges, ne semble pas progressif et ne pourrait pas être imputable à un développement

moteur anormal. La capacité verbale des patients est affectée mais les fonctions cognitives

demeurent inchangées (Dubowitz 1967; Marsh & Munsat 1974; Worden & Vignos 1962;

Yoshioka et al 1980; Zellweger & Hanson 1967). Il ne semble pas impensable qu’une

déficience en dystrophine pourrait corréler avec l’émergence de troubles neurologiques.

Cependant, que ce soit dans les cellules corticales ou dans les cellules de Purkinje, le rôle

cellulaire de la dystrophine reste à déterminer.

2.6 Modèles d’études animaux Les cas de déficiences en dystrophine se limitent seulement à quelques espèces

animales. Ainsi, à titre d’exemple, le singe génétiquement proche de l’Humain ne

développe pas de dystrophie. De plus, il existe une variabilité notoire entre les formes de

dystrophie qui peuvent survenir dans les différentes espèces touchées. Les cas spontanés de

dystrophie sont pour l’instant répertoriés chez 3 espèces autres que l’Humain. Ces trois

espèces sont les muridés, les canidés et les félidés. L’utilisation des modèles animaux

32

dystrophiques est indispensable au développement d’approches thérapeutiques.

Malheureusement, aucun modèle n’est parfaitement adéquat pour répondre aux attentes

expérimentales.

2.6.1 Dystrophie murine C’est en 1984 qu’une mutation dans l’exon 23 (445) fut identifiée sur le

chromosome X de la souris C57Bl/10JScSn (mdx). En outre, cette souris présentait un taux

sérique élevé de PCK ainsi que quelques autres signes pathologiques laissant présager une

homologie de mutation avec le gène de la dystrophine humain (Bulfield et al 1984). Ce fut

officiellement confirmé en 1987 après la découverte du gène de la dystrophine (Hoffman et

al 1987). La mutation affecte la partie amino-terminale de la dystrophine donnant ainsi une

protéine tronquée incapable de s’encrer au sarcolemme. À l’instar de l’Homme, le

complexe protéique associé à la dystrophine fait également défaut (Ohlendieck et al 1993).

Cependant, à la différence de l’Homme, la souris mdx n’est que peu affectée par sa

mutation. La nécrose des fibres musculaires est quasiment indécelable à la naissance,

augmente rapidement après une vingtaine de jours, régresse aux alentours de soixante jours

puis demeure épisodique jusqu'à la mort des souris. Dans la plupart des muscles, les fibres

nécrotiques sont remplacées continuellement par de nouvelles fibres et non par du tissu

conjonctif. Curieusement, les fibres restent centronucléées et ce, même après leur

maturation (Karpati & Carpenter 1986; Karpati et al 1988a). À trois mois, 70 à 80% des

fibres musculaires des cuisses sont centro-nucléées (Tanabe et al 1986; Torres & Duchen

1987). Les fibres de type II sont, similairement aux patients DMD, préférentiellement

remplacées par des fibres de type I (Carnwath & Shotton 1987; Head et al 1992). Le

diaphragme est le muscle le plus touché par la maladie. Le nombre de fibres nécrotiques et

la présence de zone fibreuse différencient le diaphragme des autres muscles. Néanmoins,

les souris mdx ne souffrent pas d’insuffisance respiratoire (Grounds & McGeachie 1992).

Les mécanismes expliquant la faible gravité de la dystrophie chez la souris mdx ne sont pas

encore pleinement établi. Toutefois certaines hypothèses constituent un début

d’argumentation convainquant. Tout d’abord, les cellules satellites des souris mdx semblent

avoir un potentiel réplicatif plus élevé que les cellules humaines (DiMario et al 1989;

DiMario & Strohman 1988; Grounds & McGeachie 1992). Ceci permettrait d’augmenter

33

temporellement la capacité régénératrice musculaire. Enfin, la protéolyse dépendante du

calcium, amplificatrice de la destruction des myotubes (Alderton & Steinhardt 2000), est

absente chez les souris mdx (DiMario et al 1989). L’utilisation de la souris mdx est

fréquente pour le développement de nombreuses thérapies pour la DMD. La possibilité de

reproduire ces souris, le faible coût de leur maintien, ainsi que l’évolution bénigne de leur

dystrophie facilite leur usage en recherche fondamentale. Néanmoins, de part sa robustesse,

elle ne présente pas un modèle idéal de DMD.

D’autres souris dystrophiques ont été produites par mutagenèse chimique. Toutes

ces souris arborent comme la souris mdx une absence marquée en dystrophine, mais ne

développent que peu de fibrose et d’adipose (Cox et al 1993b).

2.6.2 Dystrophie canine Plusieurs signes cliniques similaires à ceux observés chez la DMD font du modèle

canin dystrophique un bon modèle (Cooper et al 1990; Cooper et al 1988; McCully et al

1991; Valentine & Cooper 1991; Valentine et al 1990; Valentine et al 1986; Valentine et al

1988; Valentine et al 1989; Valentine et al 1992). Seule la partie amino-terminale de la

dystrophine canine peut être détectée à l’aide d’anticorps chez les chiens atteints de la

maladie. La mutation est causée par un changement d’une base A pour G à l’intérieur d’un

site d’épissage consensus situé à l’extrémité 3’ de l’intron 6, ce qui résulte en une protéine

manquant les exons 6 à 8 (Gaschen et al 1992; Sharp et al 1992). La maladie a été très bien

caractérisée chez les Golden Retriver, mais n’est pas exclusive à cette race. Les Terriers

Irlandais, les Rottweilers ainsi que les Samoyèdes peuvent également être touchés. Le taux

sérique en PCK des chiens dystrophiques est élevé dès la naissance et augmente encore

plus lors d’un effort physique. Entre la huitième et la dixième semaine, les chiens

dystrophiques sont affublés d’une stature rigide, ont une démarche chancelante, et

éprouvent de la difficulté à ouvrir la mâchoire et à se nourrir. Le rétrécissement de la base

de leur langue provoque une salivation excessive. La dégénérescence musculaire

s’accompagne d’une fibrose. L’atrophie musculaire qui en résulte conduit à la paralysie des

membres postérieurs et au développement d’une scoliose (Valentine et al 1992). Enfin, les

chiens dystrophiques développent des signes de cardiomyopathies (Valentine et al 1986).

Le modèle de chien dystrophique représente un intérêt certain pour l’établissement de

34

thérapies en faveur de la DMD. Cependant, les coûts exorbitants, que peuvent entraîner

l’hébergement et l’achat de tels animaux, ne permettent pas d’approches fondamentales. Il

ne peut être utilisé que dans des protocoles pré cliniques.

2.6.3 Dystrophie féline Jusqu’à présent, peu de formes de dystrophies félines ont été étudiées (Carpenter et

al 1989; Gaschen et al 1992). Le site de mutation n’a pas encore été identifié. La partie

amino-terminale de la dystrophine est exprimée normalement mais, l’expression de la partie

carboxy-terminale est atténuée (Gaschen et al 1992). Les premiers signes de la maladie

apparaissent à un ou deux ans. Les chats atteints ont une langue épaissie, développent une

pseudo hypertrophie des muscles postérieurs et éprouvent beaucoup de difficulté à se

déplacer. Une échocardiographie permet de révéler des signes de cardiomyopathies. Les

biopsies musculaires montrent la présence de fibres nécrotiques. Ainsi, bien que présentant

des signes semblables à ceux observés chez les cas de DMD, la rareté des cas de

dystrophies félines ne permettent pas d’utiliser cet animal en recherche pour le

développement d’une thérapie.

35

3 Approches thérapeutiques Les thérapies développées dans le cadre des myopathies, notamment de la DMD, se

doivent d’atteindre au moins un des effets thérapeutiques suivant : ralentir voire arrêter la

dégénérescence musculaire ; estomper les divers signes cliniques en corrigeant l’origine de

la pathologie ; restaurer la capacité musculaire des patients. Presque 150 ans se sont écoulés

depuis la description des premiers cas de DMD et presque 20 ans depuis que le gène codant

pour la dystrophine fut identifié. Néanmoins, il n’existe pour l’instant aucun traitement

curatif pour cette maladie. La difficulté à établir une thérapie efficace est particulièrement

due aux obstacles représentés par le remplacement ou la réparation du gène défectueux.

Pareillement, la pluralité des pathologies associées à la dégénérescence musculaire

permanente oblige les équipes de recherche à travailler sur « un terrain miné ». Pour

l’instant, les palliatifs se limitent à améliorer le confort et la qualité de vie des patients.

Pour ralentir un peu l’atrophie musculaire, des séances de physiothérapies peuvent être

prescrites. Pour augmenter la mobilité des patients, cannes puis chaises roulantes

électriques ont été mises à leur disposition. Pour augmenter leur capacité respiratoire les

patients sont mis sous assistance respiratoire. Également, des interventions chirurgicales

lourdes peuvent être envisagées pour les patients qui développent une lordose pathologique.

Des barres métalliques sont alors vissées le long de la colonne vertébrale pour éviter son

affaissement (Franzini-Armsrong 1994).

De 1940 à 1979, une pléthore de drogues et d’agents fut administrée aux patients.

L’ensemble de ces traitements ne rentrait pas dans le cadre d’études scientifiques contrôlées

rigoureusement. Aucun des traitements prescrits ne donna des résultats convaincants. Parmi

eux nous noterons : la vitamine E, des androgènes, des stéroïdes anabolisants avec ou sans

digitoxine, des nucléosides, des nucléotides, de l’adrénaline, des vasodilatateurs, de la

glycine, autres acides aminés etc.… Puis, au début des années 80, les traitements proposés

entrèrent dans des programmes scientifiques plus sévèrement encadrés (Franzini-Armsrong

1994). Actuellement, les thérapies pharmaceutiques, géniques et cellulaires constituent

l’ensemble des approches envisagées pour traiter la DMD. Ces différentes approches seront

tour à tour abordées. Cette section inclura l’approche pharmaceutique et génique.

36

L’emphase sera mise sur la thérapie cellulaire (section 5), puisque les deux articles de cette

thèse s’articulent autour de cette dernière.

3.1 Thérapies pharmaceutiques Plusieurs stratégies pharmaceutiques ont été proposées pour répondre aux

problèmes liés à la DMD. De nombreux composés tels que la vitamine E (Backman et al

1988), le sélénium, le mazindol (Zatz et al 1986; Zatz et al 1988) se sont avérés inefficaces.

Malgré tout, l’approche pharmaceutique demeure une approche thérapeutique

contemporaine.

3.1.1 Inhibition de la myostatine Les cellules satellites sont des cellules myogéniques en phase quiescente situées

entre la lame basale et le sarcolemme. Ces cellules ont la capacité de réparer les lésions des

fibres musculaires (cf. chapitre 1 : 1.1.1.3). Les cellules satellites des patients DMD ont une

capacité proliférative réduite et deviennent plus rapidement sénescentes que des cellules

satellites de sujets sains (Blau et al 1983; Blau et al 1985). La myostatine est une molécule

de la famille du « Transforming Growth Factor –β » (TGF–β) qui est un inhibiteur de la

croissance musculaire. Les mécanismes impliqués dans l’hypertrophie musculaire des

animaux ayant une mutation dans le gène codant pour la myostatine ont été pour la plupart

bien définis (Kambadur et al 1997; McPherron et al 1997; McPherron & Lee 1997). Une

récente étude associe l’hypertrophie musculaire de souris myostatine (-/-) à l’augmentation

de la capacité proliférative et au retardement de la phase différenciative de leurs cellules

satellites (McCroskery et al 2003). En outre, il a été rapporté que l’inhibition de la

myostatine au sein de la souris mdx permettait d’augmenter leur masse musculaire

(Bogdanovich et al 2002). D’autres observations intéressantes ont été énoncées telles

qu’une baisse significative de la dégénérescence des fibres musculaires ainsi qu’une

réduction du taux sérique de PCK (Bogdanovich et al 2002). Ces résultats suscitent

néanmoins un questionnement « Comment améliorer le profil pathologique des patients

dystrophiques en augmentant la masse d’un muscle néanmoins dépourvu de

dystrophine ? ». Plusieurs investigations restent à effectuer pour justifier ce type

d’approche thérapeutique. Il faut concurremment garder en mémoire que les résultats

37

préliminaires d’inhibition de la myostatine ont été obtenus chez la souris mdx qui ne

représente pas un modèle d’étude suffisant.

3.1.2 Administration de glucocorticoïdes Les glucocorticoïdes, tels que la prednisone, ont démontré une certaine efficacité à

ralentir la progression de la DMD (DeSilva et al 1987; Fenichel et al 1991; Mendell et al

1989). Cette molécule visait à réduire l’inflammation chronique des muscles des patients

DMD. Malgré cela, il semblait peu envisageable de traiter continuellement un patient avec

des glucocorticoïdes compte tenu des effets secondaires qui leurs sont associés.

L’utilisation du déflazacort, un dérivé de la prednisone, entraînant moins d’effets néfastes,

apparaît comme un traitement palliatif prometteur (Bonifati et al 2000; Mesa et al 1991). Il

a donné de bons résultats chez la souris mdx (Anderson et al 1996; Anderson & Vargas

2003; Anderson et al 2000). Une récente étude clinique chez des patients atteints de DMD a

révélé que l’administration de glucocorticoïdes (déflazocort, prédnisolone) permettait

d’augmenter temporairement (six mois à un an) la force musculaire des patients. Cette

augmentation se traduisait par un gain de mobilité des patients. Le régime le plus efficace

semblait être l’administration de prédnisolone. La liste des effets secondaires engendrée par

ces traitements est assez conséquente mais reste admissible cliniquement. Cependant, ces

essais ne permettaient pas d’évaluer les risques d’une administration à long terme (Manzur

et al 2004).

3.1.3 Administration d’aminoglycosides Quelques mutations provoquant le développement d’une DMD (10%) sont dues à la

formation prématurée d’un codon stop à l’intérieur de la séquence codante de la

dystrophine. Certaines études visent à supprimer ce codon en causant une relaxation de

l’ARNm lors de la reconnaissance des codons par la machinerie traductionnelle. (Barton-

Davis et al 1999a; Palmer et al 1979). Le traitement de souris mdx à la gentamicine à tout

d’abord laisser une bonne impression quant à son potentiel thérapeutique. Une

augmentation de 10 à 20% du niveau d’expression de dystrophine et du DAP a été

répertoriée chez les souris traitées (Barton-Davis et al 1999a). Malheureusement les

résultats ont été inexistants lors de la première tentative clinique (Wagner et al 2001) et

38

pour couronner le tout, de nouvelles expériences effectuées chez la souris n’ont pas

reproduits les premiers résultats obtenus (Dunant et al 2003).

3.2 Thérapies géniques L’étiologie de la DMD est liée à l’absence d’expression de dystrophine viable.

L’ensemble des thérapies géniques vise à exploiter la machinerie cellulaire des patients

pour lui faire traduire une séquence génique codant pour la dystrophine ou pour une

protéine mimant sa fonction. Certaines équipes de recherche ont tout d’abord vérifié que

l’expression de dystrophine chez la souris mdx permettait de modifier son profil

pathologique (Cox et al 1993a; Phelps et al 1995; Sakamoto et al 2002). Les souris

exprimant la dystrophine pleine longueur ne montraient quasiment plus de signes

pathologiques et ce, même si seulement 70% du niveau d’expression de la protéine étaient

atteint (Goyenvalle et al 2004; Phelps et al 1995). De plus, il semblerait qu’une correction

partielle de l’expression de dystrophine permettrait une amélioration significative de profil

pathologique des souris traitées (DelloRusso et al 2002; Phelps et al 1995). Diverses

approches ont été développées depuis afin de répondre aux exigences requises à une

application clinique.

3.2.1 Les adénovirus

3.2.1.1 Adénovirus de première génération Une des principales avenues en thérapie génique est l’utilisation de vecteurs viraux

capable d’introduire l’ADNc (~14kb) de la dystrophine dans les fibres dystrophiques. Les

adénovirus ont été souvent utilisés à cette fin. La capacité d’encapsulation des adénovirus

de première génération, étant d’environ 8 kb, nécessita l’utilisation d’un ADNc de

dystrophine tronqué (~6.3 kb) appelé mini dystrophine. Les adénovirus de première

génération ont ainsi été les premiers vecteurs permettant de délivrer un ADNc tronqué de

dystrophine dans des souris mdx (Kumar-Singh & Chamberlain 1996; Petrof et al 1995).

Toutefois, les adénovirus provoquaient une réponse immunitaire importante, de type

cellulaire ainsi qu’humorale, et ne permettaient qu’une expression transitoire de la mini

dystrophine. Ces limitations amenèrent au développement de nouvelles générations

d’adénovirus (Amalfitano & Parks 2002).

39

3.2.1.2 Helper dependent adénovirus Les « helper dependent Adenovirus » (hdAd) sont des adénovirus dépourvus des

séquences codant pour les protéines virales. Ils induisent de ce fait une réponse immunitaire

réduite et permettent l’encapsulation de gènes plus grands (36 kb) (Acsadi et al 1996; Parks

et al 1996). Des souriceaux mdx traités avec ces vecteurs viraux ont montré une bonne

restauration de l’expression du complexe dystrophine-DAP (DelloRusso et al 2002; Dudley

et al 2004; Gilbert et al 2003). Le traitement de souris mdx adulte s’est révélé plus

problématique dû au manque d’efficacité des adénovirus à infecter un muscle mature. En

effet, le récepteur cellulaire de surface des adénovirus est le « coxsackie-adenovirus

receptor » (CAR). L’expression de ce récepteur est fortement diminuée au cours du

développement musculaire réduisant ainsi la capacité infectieuse des adénovirus

(Nalbantoglu et al 1999). L’utilisation in vitro d’héparane sulfate a permis de contourner ce

problème en augmentant la transduction des adénovirus (Bramson et al 2004). Néanmoins,

il est apparu que la fréquence des phases dégénératives et régénératives musculaires

réduisait également l’efficacité des adénovirus (Bramson et al 2004).

3.2.1.3 Les « adeno-associated virus » Les « adeno-associated » virus (AAV) à l’instar des hdAd, déclenchent une réponse

inflammatoire réduite en comparaison aux adénovirus. Cependant, leur capacité

d’encapsulation est faible (~4kb). La micro dystrophine a permis de contourner ce

problème (Gregorevic et al 2004; Wang et al 2000; Watchko et al 2002). Ainsi, l’injection

systémique d’AAV-micro dystrophine, à des souris adultes mdx, a permis l’infection de

presque tous les muscles striés squelettiques ainsi que du muscle cardiaque (Gregorevic et

al 2004).

L’utilisation des vecteurs viraux est une approche intéressante pour traiter la DMD.

L’injection systémique de virus contenant l’ADNc de la dystrophine pleine longueur ou des

séquences réduites telles que la mini ou la micro dystrophine permettrait d’atteindre des

muscles difficiles d’accès comme le diaphragme et le cœur. L’affaiblissement de ces

muscles étant à l’origine du décès des patients, leur traitement se révèle incontournable

pour réduire la létalité de cette maladie. Néanmoins, la réaction immunitaire imputable à

l’utilisation de vecteurs viraux est le problème majeur qui freine le développement de

40

thérapie en phase clinique. Ainsi, et ce même si les hdAd ou les AAV ont un caractère

immunogénique plus faible que les adénovirus, l’injection de fortes doses de ces vecteurs

viraux peut provoquer une réaction inflammatoire létale (Muruve et al 1999; Muruve et al

2004). Même si certaines améliorations ont été apportées pour réduire la réponse

immunitaire (Jiang et al 2004; Mok et al 2005), il n’en demeure pas moins qu’une grande

efficacité des vecteurs viraux ne pourrait être atteinte qu’en traitant des enfants en bas âges

(moins de particules virales à utiliser) avec cependant des doses conséquentes de virus. Il

semble difficile pour l’instant de concevoir une telle approche aussi bien techniquement

qu’éthiquement.

3.2.2 Les oligonucléotides

3.2.2.1 Le saut d’éxon Les oligonucléotides anti-sens sont composés de portions d’ARNs. Ils ont été

utilisés en premier lieu pour bloquer l’évènement de la traduction. La liaison des AONs

(antisens-oliglonucleotides) à l’ARNm conduit à la dégradation du complexe ainsi formé

(Good 2003). De plus, il a été décrit que les AONs pouvaient cibler les régions régulatrices

de l’épissage des ARNs pré-messager altérant ainsi l’épissage en question (Kole & Sazani

2001). De nombreux cas de DMD sont dus à des délétions du gène causant un changement

du cadre de lecture (Koenig et al 1989). Les délétions qui n’entrainent pas de changement

du cadre de lecture semblent générer un profil dystrophique adouci tel que le profil de

patients atteints de DMB. Ainsi, l’altération de l’épissage de l’ARNm codant pour la

dystrophine, par saut de l’éxon, permettrait de générer des protéines partiellement

tronquées mais gardant une certaine fonctionnalité. Les patients passeraient ainsi d’un

profil Duchenne à un profil Becker. Cette preuve de principe a été publiée il y a une dizaine

d’années (Dunckley et al 1998; Wilton et al 1997). Depuis, plusieurs thérapies ont vu le

jour chez la souris mdx (Mann et al 2001; van Deutekom et al 2001; Wilton et al 1999),

certaines ayant débouchées à des essais cliniques (Wilton & Fletcher 2006). Pour l’instant

la voie d’administration consiste en une injection intramusculaire, mais des tests réalisés

chez la souris visent une administration systémique (Alter et al 2006; Lu et al 2003; Sirsi et

al 2005; Williams et al 2006). Néanmoins, cette approche est limitée par le fait qu’il faut

construire autant d’AONs qu’il y a de mutations possibles. Certes, un nombre relativement

41

petit de délétions représente une bonne partie des cas de DMDs (Aartsma-Rus et al 2003),

mais en l’absence d’éxamen diagnostique moléculaire précis et systématique, cette therapie

n’est pas applicable. Enfin, une des limites intrinsèque à cette approche demeure son effet

transitoire. En effet, les AONs sont instables dans la cellule. Chez les souris mdx traitées,

les niveaux détectables d’expression de dystrophine ont été obtenus par injections

séquentielles d’AONs. Malheureusement, les niveaux d’expression ont decliné selon une

demie-vie variant de 2 à 4 mois (Lu et al 2003). Ainsi, une thérapie basée sur cette

approche impliquerait une répétition fréquente d’injections d’AONs. La seule façon de

remédier à ce probleme serait d’utiliser un vecteur viral pour stabiliser l’expression des

AONs (De Angelis et al 2002; Denti et al 2006; Goyenvalle et al 2004). Mais cela

confronterait cette therapie au même défi éthique qui se dresse devant l’administration de

vecteurs viraux en systémique.

3.2.2.2 Correction génomique Les mutations ponctuelles du gène de la dystrophine représentent jusqu'à 15% des

cas de DMD. L’utilisation d’oligodésoxynucléotides (Figure 8), permet de réparer ce style

de mutations. La souris mdx fut un excellent modèle pour vérifier ce principe. En effet, la

déficience en dystrophine chez cette souris est due à une mutation ponctuelle générant un

codon stop dans le gène codant pour la dystrophine. Ainsi les premières expériences

réalisées chez cette souris donnèrent des résultats encourageants. La correction fut

démontrée au niveau génomique ainsi qu’au niveau de l’ARNm (Bertoni et al 2005;

Bertoni & Rando 2002; Rando et al 2000). L’expression de dystrophine fut aussi décrite in

vitro et in vivo. Une tentative similaire fut également réussie chez le chien dystrophique

(Bartlett et al 2000). À l’instar des AONs, l’utlisation des oligodésoxynucléotides

requièreraient une ingéniérie constante de ces vecteurs pour chaque zone de mutation. De

plus, il faut noter la faible efficacité de cette approche, puisque seulement 1 à 5% des

cellules traitées produisent de la dystrophine. Enfin, même si la correction au sein des

cellules répondantes est permanente et donc intéressante, il n’en demeure pas moins qu’il y

a un renouvellement cellulaire important lors du roulement des évènements de

dégénérescence/ régénérescence musculaire (Rando 2007).

42

Figure 8 : Mécanisme moléculaire de la correction génomique médiée par les oligodésoxynucleotides. Dans cet exemple, le phénotype sauvage G-C est remplacé par une hypothétique mutation de bases T-A. L’oligodésoxynucléotide présente une parfaite homologie de séquence avec la zone entourant la mutation à l’exception de la base mutée. Ce non appariement au niveau de la base mutée est corrigé par la machinerie endogène de réparation de l’ADN en deux phases successives.

43

3.2.3 Approche plasmidique Cette approche consiste à injecter en intramusculaire de l’ADN plasmidique codant

pour la dystrophine (Wolff et al 1992). Cette stratégie simpliste permet de contourner

l’utilisation des vecteurs viraux, qui peuvent potentiellement provoquer des réponses

immunes ou détériorer la cellule infectée (par leur toxicité ou par mutagenèse d'insertion).

En effet, l’injection d’ADN plasmidique ne semble pas engendrer de réponse immunitaire

de type cellulaire contre les fibres exprimant la dystrophine d’origine plasmidique (Zhang

et al 2004). Plusieurs paramètres tels que la taille, la concentration et la séquence du

promoteur ont été testés (Bartlett et al 1996; Manthorpe et al 1993; Wells et al 1998; Wolff

et al 1991). Des résultats encourageants obtenus chez la souris ont permis d’amener au

développement d’un essai clinique (Romero et al 2002; Romero et al 2004; Zhang et al

2004). Toutefois, même si aucun effet néfaste ne fut répertorié, le niveau d’expression de

dystrophine détecté après traitement fut très faible (Romero et al 2004). Plusieurs

approches ont été testées pour augmenter la distribution, et l’expression des plasmides

injectés. Parmis ces approches nous noterons l’utilisation de l’électroporation, des

ultrasons, ainsi que la co-injection d’enzymes (hyaluronidase) (Aihara & Miyazaki 1998;

Danialou et al 2002; Mennuni et al 2002; Schratzberger et al 2002; Taniyama et al 2002).

Bien que l’augmentation de l’expression génique du plasmide transféré par ces méthodes

soit notable, il est difficile d’envisager une telle méthode pour traiter tous les muscles des

patients notemment des muscles tels que le diaphragme et le cœur. De ce fait, une

distribution systémique des plasmides semble plus convaincante. Ainsi, l’injection au

niveau des cuisses par voie intra-artérielle de plasmides codant pour la dystrophine a été

effectuée chez la souris et chez le singe (Zhang et al 2001; Zhang et al 2004). Seulement 1

à 5% de fibres positives pour la dystrophine ont été comptabilisées chez les animaux ainsi

traités témoignant de la faible efficacité de cette approche. Enfin, une question persiste

quant au potentiel de l’injection plasmidique comme principe curatif de la DMD. En effet,

l’injection de plasmides chez la souris a révélé que l’expression des transgènes restait

détectable plusieurs mois après injection. Néanmoins, il y a une perte significative de cette

expression au cours du temps (Molnar et al 2004). Ce facteur est important considérant

qu’une expression permanente du transgène de la dystrophine est nécessaire pour être

44

efficace. Pour remédier à ce problème, il faut noter que l’utilisation récente de plasmides

intégratifs offre une solution intéressante (Quenneville et al 2004; Quenneville et al 2007).

4 Thérapie cellulaire La thérapie cellulaire a vu le jour au cours des années 80, dans les services

d'hématologie et les établissements de transfusion sanguine, avec le développement des

techniques de greffe de moelle osseuse. D'autres formes de thérapie cellulaire sont apparues

pendant ces dernières années (cellules souches hématopoïétiques du sang circulant et

fœtales, cellules immunocompétentes, endothéliales, nerveuses, cellules des îlots de

Langerhans, kératinocytes, hépatocytes…), pour la plupart encore au stade expérimental,

mais porteuses de grands espoirs thérapeutiques. Parmi elles, la transplantation de cellules

myogéniques (TM) correspond à la stratégie cellulaire développée pour répondre aux

problèmes liés aux myopathies.

Au cours de la première partie de ce chapitre, les transplantations dans leur sens

médical le plus large seront évoquées. Le rôle du système immunitaire dans le cadre d’une

transplantation est prépondérant et le succès des greffes intentées repose sur la

compréhension des mécanismes immunitaires impliqués. Ainsi, les principaux intervenants

cellulaires et moléculaires reliés à l’acceptation du transplant par le receveur seront

abordés. Puis, la transplantation sera introduite dans ce contexte immunitaire.

La deuxième partie de ce chapitre mettra l’accent sur la TM en tant que telle. En

effet, plusieurs approches expérimentales sont envisagées pour transplanter des cellules

myogéniques. Les cellules utilisées ainsi que leurs modes d’administration peuvent varier

et influencer grandement les résultats escomptés. Parmi les approches abordées, la TM par

injections intramusculaires sera évoquée puisqu’elle constitue l’approche thématique de

cette thèse. Les difficultés liées à cette transplantation seront soulignées à l’instar des

problèmes associés aux autres types de TM.

4.1 Transplantation et immunité Depuis la première transplantation rénale en 1956 (Harrison et al 1956; Merrill et al

1956), les transplantations d’organes ont bénéficié de progrès remarquables aussi bien du

45

point de vue chirurgicale qu’immunologique. La diversité des tissus et des organes s’est

également élargie (moelle osseuse, cœur, foie etc et la durée de vie des transplants a

augmenté à moyen terme. Cependant l’évolution à long terme des greffons (10 à 20 ans)

pose encore de nombreux problèmes non résolus dont la plupart sont liés à

l’immunobiologie.

4.1.1 Notions d’immunobiologie L’immunité peut être définie comme l’ensemble des mécanismes biologiques

permettant à un organisme pluricellulaire de maintenir la cohérence des cellules et des

tissus qui le constituent et d’assurer son intégrité. Ce processus s’effectue par l’élimination,

de ses propres constituants altérés, des substances étrangères et des agents infectieux

auxquels l’organisme est exposé. Cette fonction met en jeu deux catégories de mécanismes,

apparus successivement au cours de l’évolution des espèces et étroitement intriquées dans

les organismes supérieurs. La première est l’immunité « non spécifique » ou naturelle de

mise en jeu immédiate. L’autre est l’immunité spécifique, acquise ou adaptative, qui se

développe en quelques jours et qui est caractérisée par une mémoire immunologique.

Immunités naturelle et spécifique impliquent, au niveau moléculaire, une capacité de

distinction ou de reconnaissance, entre les constituants de l’organisme ou le « soi » et les

autres molécules dont l’ensemble constitue le « non soi ». Également, les deux types

d’immunité mettent en jeu des cellules (immunité à médiation cellulaire) et des molécules

en solution dans les liquides biologiques (immunité humorale). L’ensemble constitue le

système immunitaire dont l’organisation générale ressemble à celle du système nerveux

central : traitement d’un nombre conséquent d’informations, forte intégration et régulation

faisant appel à des médiateurs ou « molécules messages ».

L’immunité naturelle utilise les fonctions d’exclusion du revêtement cutanéo-

muqueux et la mise en jeu de signaux d’activation entre des ensembles de molécules

plasmatiques (complément, coagulation) et des cellules [(polynucléaires, neutrophiles,

macrophages, cellules « natural killer » (NK)]. Cette immunité conduit notamment à la

réaction inflammatoire.

46 L’immunité spécifique utilise les mécanismes effecteurs de l’immunité naturelle en

y ajoutant quelques propriétés. En effet, cette immunité implique la reconnaissance de

constituants appelés antigènes (Ag) par des molécules complémentaires très diversifiées

(récepteurs d’Ags). Ces récepteurs d’Ags peuvent être des molécules d’immunoglobulines

(Ig) ou anticorps (Ac). Les récepteurs antigéniques sont aussi présents sur des cellules de

l’immunité spécifique (les lymphocytes T et B) et sont appelés respectivement : TCR « T

cell receptor » ou BCR « B cell receptor ». Néanmoins la reconnaissance antigénique dans

le cas des TCRs et BCRs ne peut s’effectuer uniquement si l’Ag est présenté par une

molécule du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH).

La plupart des cellules du système immunitaire sont d’origine hématopoïétique.

Seuls les lymphocytes T et B (LT et LB) ont la capacité d’assurer l’immunité spécifique.

Cependant, un grand nombre d’autres cellules hématopoïétiques participent directement à

l’induction, la régulation et l’expression de la réponse immunitaire spécifique, en même

temps qu’elles assurent l’immunité naturelle de mise en jeu rapide. Il s’agit des

polynucléaires (neutrophiles, éosinophiles basophiles), des mastocytes et des cellules de la

lignée monocytes/macrophages dont les multiples formes tissulaires constituent le système

réticulo-histiocytaire. L’ensemble de ces cellules va brièvement être détaillé dans la section

suivante. Cependant, étant donnée l’importance des cellules de l’immunité spécifique dans

le cadre de la transplantation ainsi que dans le contexte de cette thèse, l’accent sera mis sur

les LTs ainsi que sur les cellules présentatrices d’Ags (CPA).

4.1.2 Cellules du système immunitaire Les cellules matures du système immunitaire dérivent des cellules souches

hématopoïétiques pluripotentes. Ces cellules sont localisées dans le foie, pendant la vie

fœtale, puis dans la moelle osseuse. La mitose de ces cellules conduit à la formation d’une

nouvelle cellule souche et d’une cellule qui va s’engager dans l’une des lignées

érythrocytaire, mégacaryocytaire, granulocytaire ou lymphoïde (Figure 8). Cette

différenciation cellulaire, qui se passe au niveau médullaire, s’appelle l’hématopoïèse.

L’hématopoïèse est caractérisée par des étapes séquentielles de différenciation. Ces

étapes sont définies par des modifications phénotypiques, avec expression de molécules

47

membranaires, et par des propriétés fonctionnelles particulières à certains stades de

maturation. La prolifération et la différenciation de chaque lignée sont contrôlées par des

signaux extracellulaires, sous forme de contact membranaire ou par l’action de cytokines et

de facteurs de croissance.

4.1.2.1 Les polynucléaires

4.1.2.1.1 Polynucléaires neutrophiles Ces cellules représentent 60 à 70% des leucocytes du sang. La demi vie des

neutrophiles est de l’ordre de 4 à 10 heures après avoir quitté la moelle osseuse. Les

neutrophiles ont la capacité de migrer en réponse à un signal chimiotactique. Par leurs

récepteurs aux molécules du complément et leur récepteurs aux Acs, ils fixent et

phagocytent les particules opsonisées par ces derniers. Ils jouent donc un rôle essentiel dans

la défense contre les microorganismes à réplication extracellulaire, principalement les

bactéries et les levures. Ils interviennent aussi lors des lésions tissulaires.

4.1.2.1.2 Polynucléaires éosinophiles Représentant 3% des cellules des leucocytes, les éosinophiles se localisent, après un

bref passage dans le sang, dans les tissus infectés ou endommagés. Lorsqu’ils sont activés

par des Acs, ces cellules sécrètent beaucoup de cytokines cytotoxiques.

48

Figure 9 : Schématisation de l’hématopoïèse

49

4.1.2.1.3 Polynucléaires basophiles Les basophiles constituent moins de 1% des leucocytes. Lorsqu’ils sont tissulaires,

ces cellules sont appelées mastocytes. Basophiles et mastocytes possèdent des récepteurs

aux Igs de type E (cf. chapitre 1 : 4.2.2.2.2). La fixation des Igs sur leurs récepteurs de forte

affinité provoque une dégranulation de plusieurs facteurs impliqués dans la réaction

d’allergie.

4.1.2.2 Lignées lymphocytaires Les lymphocytes T et B se différencient à partir des cellules souches

hématopoïétiques par un stade intermédiaire de cellules souches lymphoïdes. Ces deux

lignées lymphocytaires sont caractérisées, à la différence des autres cellules de l’organisme,

par une différenciation en deux phases : la phase centrale et la phase périphérique.

La phase centrale de différenciation a lieu dans le thymus pour la lignée des LTs et

dans la moelle osseuse pour la celle des LBs. Au sein du microenvironnement de ces

organes lymphoïdes centraux, les cellules lymphoïdes subissent un phénomène de

différenciation irréversible. Cette différenciation est caractérisée par des réarrangements de

segments géniques aboutissant à l’expression membranaire d’un récepteur d’Ags le TCR ou

BCR. Cette phase centrale comporte en outre un processus de sélection, par des molécules

du CMH associées à des peptides pour les LT, et par les épitopes de l’Ag qui interagissent

avec le BCR pour les LBs.

La phase périphérique de différenciation a lieu dans les organes lymphoïdes

périphériques. Elle dépend d’un signal activateur induit par l’interaction du BCR avec

l’épitope antigénique et celle du TCR avec un peptide associé à une molécule du CMH.

D’autres molécules membranaires doivent interagir pour apporter les co-signaux

nécessaires à l’activation.

Les LTs activés lors de la phase périphérique se différencient en LTs effecteurs,

cytotoxiques ou sécréteurs de cytokines, permettant l’activation des macrophages. D’autres

LTs se différencient après activation en LTs à mémoire. Leur activation induit une

50

expansion clonale par prolifération des LTs exprimant une même espèce moléculaire de

TCR.

Les LBs activés subissent un processus d’expansion clonale et de différenciation

soit en LBs à mémoire, soit en plasmocytes, étape terminale de différenciation des LBs.

Ces plasmocytes sécrètent les Acs de structure très voisine de celle des BCRs dont ils sont

issus. Ces molécules d’Acs ont cependant pour la plupart subi des mutations somatiques et

une sélection par l’Ag au sein des centres germinatifs des organes lymphoïdes

périphériques.

4.1.2.2.1 Lymphocyte T

4.2.2.1.1.1 Le récepteur des lymphocytes T Les TCRs sont des hétérodimères formés par l’association de deux chaînes

polypeptidiques α et β ou γ et δ (Figure 9). Environ 90% des LTs circulants portent des

TCRs de type αβ les autres portant des TCRs de type γδ. Le site de liaison des TCRs αβ

interagit avec des peptides présentés par des molécules du CMH de classe I ou II. Les

récepteurs γδ peuvent lier des épitopes non associés aux molécules du CMH. Cependant,

ces derniers n’étant pas d’intérêt direct avec cette thèse, ils ne seront pas abordés.

Les TCRs sont associés sur la membrane des LTs au complexe moléculaire CD3.

Ce complexe est nécessaire pour la transduction des signaux provoqués par l’interaction

des TCRs avec l’Ag. Le complexe TCR/CD3 est également associé pour la majorité des

LTs à des molécules invariantes : CD4 ou CD8. Ces molécules interagissent respectivement

avec le CMH de classe II ou de Classe I et participent à la transduction du signal activateur

via le CD3.

Le site de liaison de l’Ag au sein des TCRs est formé de 3 régions hypervariables,

déterminant la complémentarité des deux chaînes Vα et Vβ. L’extrême diversité des

récepteurs portant les sites de liaison à l’Ag (paratope) est obtenue par leur structure

bicaténaire hétérodimérique et par la combinaison des réarrangements géniques. Ce

réarrangment des gènes codant pour les TCRs, se déroule au cours de la maturation des

LTs.

51

Figure 10 : Récepteur d’une cellule lymphocytaire de type T et ses sous unités membranaires.

52

Le répertoire des TCRs est modulé par les stimulations antigéniques et par les mécanismes

de sélections thymiques. Chaque LT utilise une combinaison de segments géniques qui sera

maintenue dans l’ensemble des cellules issues de ce LTs. Les proliférations monoclonales

seront donc définies par la présence d’un clone cellulaire dont les cellules filles

exprimeront le même récepteur. Il est important de noter que l’expansion clonale des LBs

suit les mêmes règles.

4.2.2.1.1.2 Maturation des LTs Les cellules lymphoïdes, qui quittent la moelle osseuse pour gagner le thymus afin

de maturer, s’appellent des prothymocytes ou thymocytes corticaux. Ces prothymocytes

n’expriment pas encore le complexe CD4 ou CD8. Ces cellules ont une activité

recombinase permettant le réarrangement des gènes codant pour les chaînes γ et δ. Un petit

contingent de cellules γδ+ exprimant le CD3 mais CD4/CD8 négatif, quitte alors le thymus.

Sur d’autres thymocytes, l’expression de la chaîne pTα (substitut de la chaîne α) est induite

par la synthèse des chaînes CD3. Ceux-ci deviennent des thymocytes doubles positifs CD4

et CD8. Ces cellules blastiques en division forment alors des petites cellules et procèdent au

réarrangement et à l’expression de la chaîne α. Ces cellules font l’objet des sélections

positives et négatives. Les cellules cessant de transcrire les gènes CD4 ou CD8, deviennent

alors des thymocytes matures simples positifs CD4+/CD8- ou CD4-/CD8+ (Figure

10)(Richard A. Goldsby 2006) .

Les LTs ayant des réarrangements non fonctionnels des segments géniques, codant les

chaînes du TCR, comme celles n’ayant pas subi de sélection positive ou ayant fait l’objet

d’une sélection négative, meurent par apoptose. Leurs débris sont alors phagocytés par les

macrophages du thymus. Ceci représente 98% des lymphocytes formés au sein du thymus.

Les autres se différencient en LTs matures dans la zone médullaire corticale.

53

Figure 11 : Sélection positive et négative au sein du thymus.

Goldsby (2006)

54

4.2.2.1.1.2.1 Sélection positive Cette étape de la maturation thymique contrôle le réarrangement des gènes de la

chaîne α du TCR et l’expression des co-récepteurs CD4 et CD8. Les réarrangements de la

chaîne α se poursuivent jusqu’à ce que les cellules fassent l’objet d’une sélection positive

ou bien meurt. Une même cellule peut donc « essayer » successivement plusieurs chaînes α.

Environ 1/3 des LTs matures exprime deux chaînes α différentes. Mais en règle générale un

seul des deux TCRs est capable de reconnaître une molécule du CMH du soi, l’autre n’étant

pas fonctionnel. Ce mécanisme de production successive de plusieurs chaînes α augmente

les chances de survie par sélection positive participe à la fréquence élevée des LTs matures

allo-réactifs.

La sélection positive s’applique aux thymocytes doubles positifs CD4/CD8. Cette

sélection conduit à l’expression de thymocytes simples positifs CD4+ ou CD8+.

L’interaction du TCR avec un peptide associé à une molécule de classe I ou II entraîne

respectivement l’arrêt de l’expression des molécules CD4 et CD8. Cette présentation du

CMH est assurée par les cellules épithéliales corticales. La survie des thymocytes dépend

de la capacité de reconnaissance de leur TCR avec les molécules du CMH des cellules

épithéliales corticales.

La cellule épithéliale corticale thymique est une cellule critique pour la sélection

positive des lymphocytes T. Les cellules épithéliales corticales forment un réseau qui

permet un contact étroit entre les récepteurs T des cellules double-positives et les molécules

de CMH des cellules stromales.

Il est clairement établi que les cellules épithéliales corticales thymiques sont à

l’origine de la sélection positive des lymphocytes T. Une expérience ingénieuse l’a

démontré. Des souris dont les gènes du CMH de classe II sont éliminés ne produisent pas

des cellules T CD4+. Pour examiner le rôle de l'épithélium thymique dans la sélection

positive, un gène de classe II du CMH, placé sous la commande d'un promoteur limitant

son expression aux cellules épithéliales corticales thymiques, a été présenté comme

transgène dans ces souris mutantes. Des cellules LTs CD4+ se sont alors développées. Une

autre variante de cette expérience proposait l’utilisation d’un transgène du CMH de la

55

classe II exprimé au niveau du thymus et contenant une mutation empêchant toute

intéraction avec un LT CD4+. Dans ce contexte, très peu de cellules CD4+ peuvent se

développer. Des études équivalentes de l'interaction du CD8 avec des molécules du CMH

de classe I prouvent que la liaison de TCR/CMH est également nécessaire pour la sélection

positive des cellules CD8.

Le rôle critique de l'épithélium thymique dans la sélection positive soulève une

question : Est-ce que la présentation antigénique dans l’épithélium thymique est la même

que dans les autres tissus lymphoïdes ? Pour l’instant ce n'est pas clair. Cependant, il est

établi que l'épithélium thymique se différencie suite à l’action des protéases qui sont

employées pour dégrader la chaîne invariable « Li »par exemple. La cathepsine L de

protéase domine dans l'épithélium cortical thymique, tandis que la cathepsine S semble être

la plus importante dans les autres tissus. Conséquemment, le développement des cellules

TCD4+ est sévèrement touché chez les souris KO pour la cathépsine de type L. Les cellules

épithéliales thymiques semblent présenter à leur surface une densité importante de

molécules de CMH de classe II qui ont conservé la chaîne-associée invariable « CLIP) ».

Cependant, ils présentent également une gamme d'autres peptides. Il reste à savoir si les

complexes CMH-peptides sont présentés par ces cellules ont toutes les caractéristiques

requises pour la sélection positive (Richard A. Goldsby 2006).

4.2.2.1.1.2.2 Sélection négative Une fois la sélection positive effectuée dans la zone corticale, les thymocytes se

dirigent vers la zone médullaire où ils vont subir la sélection négative. Cette sélection est

exercée par des cellules dendritiques et les macrophages de la jonction cortico-médullaire.

Ces cellules présentent des peptides endogènes ou issus des protéines du milieu

extracellulaire. Les affinités entre les TCRs et les CMH peuvent varier de faible à forte. La

sélection négative permet la discrimination entre les différentes affinités. Elle élimine ainsi

les thymocytes qui réagissent fortement aux interactions entre le CMH présentant un

peptide du soi. Cette sélection est importante pour développer une tolérance au soi. Les

mécanismes précis de la sélection négative ne sont pas encore connus, néanmoins il est

établi que les cellules meurent par apoptose.

56 Toutes les protéines d’un individu ne sont pas exprimées au niveau du thymus.

Cependant, les peptides qui existent dans d'autres tissus que le tissu thymique, ou qui sont

exprimés à différentes étapes de la vie d’une personne, comme après la puberté,

rencontreront les cellules de T matures qui auront le potentiel de répondre en leurs

présences. Néamoins, il y a des mécanismes qui empêchent les cellules de T matures de

répondre en présence de tels antigènes (4.2.2.2.3).

La sélection négative peut être effectuée par différentes cellules du thymus. Les plus

importantes sont les cellules macrophages et les cellules dendritiques dérivées de la moelle

osseuse. Ce sont ces cellules présentatrices d’antigènes qui activent également les cellules

de T matures dans les tissus lymphoïdes périphériques. Les antigènes présentés par ces

cellules sont donc la source principale des réponses autoimmunes potentielles qui peuvent

se développer en périphérie. C’est pourquoi il est capital d’éliminer dans le thymus des

cellules T répondant à de tels peptides

Il est claire que la sélection positive et négative dépendent toutes les deux de

l’intéraction des peptides présentés par les cellules thymiques et des TCRs des cellules T

qui sont en maturation. Une question persiste. Comment une même interaction peptide-

CMH/TCR du soi conduit elle à la survie de cellules ou à leur mort ? Pour l’instant la

réponse n’est pas encore claire. Il faut prendre deux éléments en considération pour

résoudre un tel problème. Le premier, c’est que les interactions qui régissent la sélection

positive impliquent plus de spécificité que celles qui régissent la sélection négative. Le

second, c’est que la conséquence des interactions qui conduisent à la sélection positive ou

négative doit différer. La seule hypothèse recevable pour l’instant repose sur la notion

d’avidité. Si l’avidité de la liaison entre le TCR et le complexe peptide-CMH est élevée,

alors la cellule rentre en apoptose et est donc suprimée (sélection négative). Cependant, si

l’interaction est faible alors la cellule survit (sélection positive). Puisqu’il y a

vraisemblablemt plus de complexes qui se lient faiblement que fortement, alors il y a une

sélection positive d’un large répertoire de cellules T qui seront sélectionées négativement

par la suite. La deuxième hypothèse repose sur le fait que le signal délivré par un peptide du

soi (Richard A. Goldsby 2006)

57

4.2.2.1.1.2.3 Cas particulier : Les superantigènes murins. Les super-antigènes endogènes murins Mls sont des produits de gènes du virus des

tumeurs mammaires intégrés dans le génome cellulaire et transmis à la descendance. Ces

super-antigènes viraux induisent, par sélection négative, la délétion de thymocytes. Les

thymocytes ainsi éliminés sont ceux qui possèdent un TCR ayant des chaînes β appartenant

aux familles d’homologie qui interagissent spécifiquement avec le super-antigène. Cette

particularité permet notamment de mettre en évidence expérimentalement une délétion

thymique clonale spécifique.

4.1.2.2.2 Lymphocyte B

4.1.2.2.2.1 Le récepteur des cellules LBs (BCR) Le récepteur des lymphocytes B est composé d’une immunoglobuline (Ig)

transmembranaire et de deux hétérodimères liés par des ponts disulfures appelés Ig-α/Ig-β.

Les chaînes Ig-α et Ig-β possèdent une longue queue cytoplasmique qui leur permet

d’interagir avec des molécules de signalisation intracellulaire.

4.1.2.2.2.2 Les immunoglobulines (Ig) Les principaux acteurs de la réaction humorale sont les immunoglobulines, appelées

aussi anticorps. Ces molécules sont produites par les LBs. Les immunoglobulines sont

constituées de quatre chaînes peptidiques : deux chaînes légères identiques de 25 kDa et

deux chaînes lourdes identiques de 50 kDa et plus (Figure 11). Chaque chaîne légère est

liée à une chaîne lourde par des ponts disulfures. Enfin les deux chaînes lourdes sont

également reliées entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaîne contient des régions

constantes et des régions variables. Les régions variables sont constituées d’environ 110

acides aminés et sont différentes pour chaque LB. Généralement, un LB ne produit qu’un

seul type d’Ig spécifique. À l’intérieur des régions variables se retrouvent les régions

hypervariables. Il existe trois de ces régions par chaîne lourde et légère et elles constituent

de 15-20% du domaine variable. Les régions hypervariables sont les portions des Igs qui

lient les Ags. La portion de l’Ag qui est reconnue par les Igs se nomme épitope. La

diversité du répertoire de reconnaissance des Ags par les Igs est attribuable à quelques

processus majeurs.

58

Figure 12 : Représentation schématique d’une immunoglobuline (Ig). Les chaînes L (légères) κ et λ sont formées de 2 domaines, un domaine variable (Vκ ou Vλ) et un domaine constant (Cκ ou Cλ). Les chaînes H (lourdes) comportent un domaine N-terminal variable (VH) et 3 (pour les Igδ, Igγ, Igα) ou 4 (pour les Igµ, Igε) domaines constants (CH). Chacun des domaines variables et VL et VH possède 3 zones hypervariables ou régions déterminant la complémentarité. Le paratope est formé par la juxtaposition dans l’espace des zones hypervariables séparées par des régions plus conservées (régions charpentes). L’action de la papaïne sur l’Ig libère 2 fragments FAB monovalents et un fragment FC.

59

Tout d’abord, les régions variables sont formées par la recombinaison des gènes V et J pour

les chaînes légères et V, D et J pour les chaînes lourdes. Également, les gènes V existent en

plusieurs copies différentes à l’intérieur du génome. Toutefois, une seule de ces copies sera

sélectionnée aléatoirement. Ainsi, la combinaison des chaînes lourdes et légères, lors de la

formation d’une molécule d’Ig complète, augmente la diversité du répertoire des Acs.

Enfin, le LB mature subit des mutations au niveau des gènes de la région variable

réarrangés.

Il existe 5 classes différentes d’immunoglobulines : IgG, IgM, IgA, IgE, IgD.

Chaque classe d’Ig se distingue par le type de leur chaînes lourdes : γ, µ, α, ε, δ. Chaque

classe peut aussi posséder différentes chaînes légères : κ ou λ. Chaque Ig est composée de

deux chaînes lourdes identiques et de deux chaînes légères identiques. De plus, les IgG et

IgA se subdivisent en sous-classe, dû à des différences mineures en acides aminés de leurs

chaînes γ et α. Chez l’humain, les IgA se sub-divisent en deux (α1 et α2) et les IgG en

quatre (γ1, γ2, γ3 et γ4). Chez la souris, seulement les Igs se subdivisent en quatre sous

classes (γ1, γ2a, γ2b et γ3). Les classes d’Ig possèdent des activités biologiques différentes

dues à la séquence distincte des régions constantes de leurs chaînes lourdes. Ainsi, les IgG

peuvent traverser le placenta, les IgG et les IgM activent la voie classique du complément

et les IgE possèdent une haute affinité avec les récepteurs des Ig sur les mastocytes et les

basophiles.

4.1.2.2.2.3 Maturation des LBs Cette étape centrale conduit de la cellule souche lymphoïde à la cellule B mature qui

exprime IgM et/ou IgD membranaires (Figure 12) (Révillard 2001). Les cellules

lymphoïdes provenant de la moelle osseuse, se différencient en cellules progénitrices (Pro-

B). Ces cellules expriment le CD45R, une tyrosine phosphatase (appelée également B220

chez la souris). Puis les cellules passent du stade pro-B à pré-B. Cette différenciation est

sous le contrôle des cellules stromales par interactions membranaires et fait également

intervenir une cytokine appelée interleukine-7 (IL-7). Les intéractions membranaires des

cellules pro-B avec les cellules stromales impliquent des molécules d’adhésion telles que le

VLA-4 et VCAM-1 (présentes respectivement sur les cellules B et les cellules stromales).

60

Suite à ces contacts cellulaires, les cellules pro-B expriment alors un récepteur appelé c-kit.

Le ligand de ce récepteur est le SCF (stem cell factor). C-kit est une tyrosine kinase et son

activation déclenche la prolifération et la différenciation des cellules pro-B en pré-B. Pour

parachever leur maturation, les cellules pré-B se mettent à exprimer le récepteur à l’IL-7.

La sécrétion d’IL-7 par les cellules stromales est essentielle à la maturation des cellules pré-

B. La cellules pré-B mature exprimera alors le récepteur à l’IL-2 et commencera le

réarrangement génique de la chaîne lourde d’immunoglobuline. L’expression

d’immunoglobulines de type M à la surface des lymphocytes pré-B leur confère un

nouveau degré de maturation et s’appellent alors lymphocytes B immatures. Les LBs

immatures, n’exprimant que l’IgM membranaire, font l’objet d’une sélection négative par

l’Ag. Lorsque la cellule B immature exprime une IgM à sa surface, sa survie dépend de la

nature des signaux qu’elle recevra par ce récepteur. Si un LB immature ne réagit pas contre

un Ag du soi, la cellule est sauvée et elle poursuivra sa différenciation. Cependant, si les

LBs immatures reçoivent un signal par leur BCR dû à une interaction avec un Ag du soi,

alors 4 possibilités peuvent survenir : la mort par apoptose, la production d’un nouveau

récepteur réarrangé, l’induction d’un état de non-réponse permanente aux antigènes

(anergie) et l’ignorance.

61

Figure 13 : Maturation des lymphocytes B. Lors de la première stimulation antigénique, les LBs vont se transformer en plasmocytes sécrétant essentiellement des immunoglobulines de types M. Lors de la deuxième stimulation antigénique, les LBs mémoires se transforment en plasmocytes sécrétant essentiellement des immunoglobulines de type G, A ou E selon la nature de la stimulation.

Révillard 2001.La cellule B immature subira une délétion clonale par apoptose en

réagissant aux antigènes du soi par plusieurs récepteurs simultanément. Néanmoins, la

cellule B immature peut encore réarranger sa chaîne légère et exprimer un nouveau

récepteur à sa surface, qui pourrait être non réactif au soi, on parle alors de « receptor

editing ». Si la cellule B immature reçoit un faible signal par son récepteur, causé par une

62

réactivité de faible valence (cas des antigènes solubles), elle devient alors inactive et ce de

façon permanente (anergie). Ces cellules migrent aux organes lymphoïdes secondaires,

mais mourront relativement tôt, dû à leur incapacité de s’activer. Finalement, les LBs

immatures, possédant une faible affinité aux antigènes du soi resteront en état d’ignorance

face à leur antigène (ignorance). Néanmoins, ces cellules ignorantes pourraient être

impliquées dans le développement de maladies auto-immunes s’activant contre un antigène

du soi lors de circonstances particulières.

La différenciation terminale des LBs conduit aux LBs à mémoire et aux

plasmocytes. Cette différenciation s’accompagne de modifications morphologiques, de

changements dans l’expression de molécules membranaires et d’une diminution

progressive des Igs de surface avec augmentation des Igs cytoplasmiques. La régulation de

la production d’Acs s’effectue donc au cours du stade de différenciation situé entre le LB

mature et le plasmocyte. Le maintien d’un taux d’Acs stable dans le sérum (par exemple

après vaccination) met donc en jeu l’activation répétée de nouveaux LBs matures et leur

différenciation en plasmocytes à courte durée de vie.

4.1.2.3 Cellules présentatrices d’antigènes (CPA)

4.1.2.3.1 CPA « professionnelles » Les cellules dendritiques du tissu conjonctif de différents organes (cœur, foie, rein,

muscle…), les dendrocytes I et II du derme et les cellules de Langerhans de l’épiderme sont

les principales CPA permettant l’induction d’une réponse des LTs à un Ag exogène. Ces

cellules sont d’origine hématopoïétique (CD45+). Ces cellules présentent constitutivement

le CMH de classe I et de classe II à leur surface lorsqu’elles sont dans leurs tissus

respectifs. Puis, lors d’une stimulation par l’Ag ou par différents types de cytokines, les

CPA perdent leur morphologie dendritique et deviennent arrondies. Elles migrent alors vers

le ganglion lymphatique régional où elles se localisent dans le cortex profond dans lequel

elles retrouveront alors leur profil inter-digité. L’expression des molécules du CMH est très

fortement augmentée à la membrane et leur taux de renouvellement est très faible.

Conséquemment, les cellules après avoir capté et apprêté l’Ag en périphérie et l’avoir

transporté jusqu’au ganglion, vont présenter pendant plusieurs jours les mêmes peptides

d’origine exogène à un grand nombre de LTs passant au contact de leurs prolongements

63

dendritiques. C’est cette interaction des CPA avec les LTs qui permet l’induction d’une

réponse immunitaire T spécifique.

Un autre type de CPA sont les cellules dendritiques folliculaires. Ces cellules ne

sont cependant pas d’origine hématopoïétique (CD45-). Elles fixent l’Ag sur leurs

récepteurs membranaires et l’exposent de façon prolongée aux LBs dans les centres

germinatifs ganglionnaires. Cette présentation antigénique est nécessaire à la maturation

des LBs. En effet, les LBs exposés à l’Ag présenté par les cellules dendritiques folliculaires

reçoivent deux types de signal : soit un signal de survie et de différenciation en cellules B

mémoires, qui passent dans la circulation lymphatique, soit un signal de différenciation en

plasmocytes qui gagnent la zone médullaire ganglionnaire puis pour la plupart, la moelle

osseuse. L’absence d’interaction efficace BCR/Ag conduit à l’apoptose des LBs. Ce

processus de sélection positive par l’Ag est à l’origine de la maturation d’affinité des

anticorps.

4.1.2.3.2 CPA « non professionnelles » Les LBs peuvent dans certains cas participer à la présentation antigénique aux LT

CD4+ pour le développement d’une réponse Ac dépendant des LTs. En effet, les LBs

reconnaissent l’Ag par leurs Igs membranaires et peuvent l’internaliser. Le peptide

antigénique est alors dégradé et présenté par le CMH de classe II des LBs.

La présentation de l’Ag aux LT CD4+ peut être également assurée par des cellules

endothéliales, et épithéliales exprimant des molécules de classe II du CMH après

stimulation par l’INFγ ou des mastocytes. Les LTs CD8+, quant à eux, interagissent avec

toutes les cellules exprimant des molécules de classe I du CMH. Cette interaction induit

une lyse de la CPA par cytotoxicité et/ou la synthèse de différentes cytokines (INFγ,

TNFα).

De plus, les monocytes/macrophages peuvent par leur capacité phagocytique

absorber des bactéries, parasites, levures et débris cellulaires. Puis, les peptides

antigéniques résultants de la destruction des absorbas exogènes peuvent être présentés par

le CMH de classe II aux LT CD4+ et induire une réponse T spécifique (cf. chapitre 1 :

4.3.6.2).

64

4.1.3 Le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) L’ensemble des gènes du CMH code pour des molécules qui s’expriment à la

surface des cellules. Ces molécules appartiennent chez l’humain au système HLA («

Human Leukocyte Antigen »). Ce système est impliqué fortement dans le rejet des greffes

inter espèces non identiques génétiquement (allogéniques). Les gènes HLA se retrouvent

sur le chromosome 6 (bande p 21.3), tandis que chez la souris, les gènes codant pour les

CMH sont appelés H-2 et se retrouvent sur le chromosome 17 (Benjamini 1996). Le CMH

a une organisation relativement conservée au sein des espèces animales. Il s’agit d’un

système multigénique, multiallélique, d’expression codominante. Le CMH comprend 3

classes de gènes qui s’assemblent pour former des molécules différentes : CMH de classe I,

II et III. Les locus du CMH de classe I inclus les gènes HLA-A, B et C pour l’humain et H-

2K, D et L pour la souris. Les locus du CMH de classe II regroupent les gènes HLA-DP,

DQ, DR pour l’humain et I-A, I-E chez la souris. Les gènes des CMHs de classe III codent

entre autre pour des facteurs impliqués dans le système du complément. Les molécules des

CMH de classe I sont des glycoprotéines hétérodimériques transmembranaires composées

d’une chaîne α de 44 kDa et d’une chaîne légère appelée β2-microglobuline (β2M, non

codée par le locus CMH) de 12 kDa. La partie extracellulaire de la chaîne α est divisée en

trois domaines globulaires : α1, α2 et α3. Les domaines α1 et α2 servent à la liaison d’un

antigène et sont des régions variables, tandis que le domaine α3 est essentiellement

conservé. La variabilité des domaines α1 et α2 permet la liaison d’un grand nombre de

peptides aux molécules de CMH. Les CMH de classe I sont exprimés sur toutes les cellules

somatiques et leur reconnaissance est restreinte aux lymphocytes CD8+. Les peptides,

présentés par les CMHs de classe I, sont endogènes. C’est à dire qu’ils sont généralement

synthétisés à l’intérieur de la cellule à l’instar des antigènes viraux. Ces antigènes sont

découpés en peptides par le protéasome dans le cytosol. La longueur des peptides capables

de se lier à la niche peptidique du CMH de classe I varie de 10 à 20 acides aminés. Le

polymorphisme de la niche peptidique des différents allèles permet ainsi différentes

affinités à différents peptides. D’autres résidus polymorphiques de la molécule de classe I

forment des contacts avec les TCRs. Ainsi, les TCRs interagissent spécifiquement avec les

CMHs et le peptide qu’ils présentent. Les CMHs de classe II sont composés de deux

65

chaînes polypeptidiques non covalentes (α et β). Ces deux chaînes sont codées aux locus

des CMHs de classe II. Comme les molécules de classe I, les CMHs de classe II possèdent

un polymorphisme élevé et chaque allèle est exprimé en co-dominance. Cette expression

co-dominante permet l’association des chaînes α et β des deux allèles, générant ainsi

plusieurs molécules différentes pouvant être exprimées à la surface d’une même cellule. La

distribution des molécules de classe II est plus limitée que celle de classe I. Les molécules

de classe II s’expriment de manière constitutive et seulement sur les cellules comme les

LBs, les cellules dendritiques et les cellules de l’épithélium thymique. L’ensemble de ces

cellules appartenant à la famille des CPAs. Plusieurs autres types cellulaires dont les

macrophages et les myoblastes expriment le CMH de classe II sous induction par des

facteurs comme l’INFγ. Les molécules de classe II se retrouvent également sur les LTs

humains activés, mais sont absents chez la souris. La liaison d’un CMH de classe II est

restreinte à un TCR exprimé sur les lymphocytes T CD4+. La fonction phagocytaire des

CPAs, exprimant les CMHs de classe II, permet la présentation de peptides exogènes par

ces molécules. Les particules phagocytées par les CPAs se retrouvent dans les endosomes

pour être clivées par des protéases. Les endosomes fusionnent avec les vésicules de

l’appareil de Golgi contenant les CMHs de classe II (Abbas et al 1991). Les CMHs de

classe II se retrouvent ensuite à la surface des CPAs pour permettre une présentation d’Ags

aux lymphocytes T.

4.1.4 Immunobiologie du muscle La liste des principaux acteurs du sytème immunitaire venant d’être dressée, il est

intéressant, dans le contexte de cette thèse, d’établir un lien entre ces derniers et le tissu

musculaire. En effet, le muscle peut, dans certaines circonstances, être le terrain de

réactions immunitaires. Cet état survient dans le cas de maladies autoimmunes,

d’infections, de dommages musculaires et lors de l’application de traitements tels que les

thérapies cellulaire ou génique (Dalakas & Hohlfeld 2003; Prud'homme et al 2001; Vincent

2002). Outre la participation classique des cellules du système immunitaire dans ces

réactions, le muscle devient lui-même acteur de ces réponses immunitaires intramusculaires

(Hohlfeld & Engel 1994). Ce rôle actif du muscle repose principalement sur l’expression,

par les myoblastes ou par les fibres musculaires, des molécules du CMH et de

costimulation (Nagaraju 2001). De plus, la capacité des myoblastes à sécréter des

66

cytokines, des chémokines ainsi qu’à exprimer des molécules d’adhésion cellulaires vient

renforcer le degré de participation du tissu musculaire dans la réaction immunitaire

impliquées dans la phase de l’inflammation (Figarella-Branger et al 2003; Nagaraju 2001)

(Figure 14).

67

(Heinz Wiendl et al. 2005)

Figure 14 : Immunobiologie du muscle. Ce schéma représente toutes les molécules exprimées ou sécrétées par un myoblaste de façon constitutive ou induite.

68

4.1.4.1 Le muscle exprime les CMHs classiques de type I, II et non classique de type HLA-G

Les myoblastes humains expriment constitutivement le CMHI (HLA-A,-B,-C)

(Goebels et al 1992; Hardiman et al 1993; Hohlfeld & Engel 1990b; Mantegazza et al 1991;

Michaelis et al 1993; Nagaraju et al 1998; Roy et al 1991; Wiendl et al 2000). Le niveau

d’expression de ces molécules est augmenté en présence de cytokines proinflammatoires

(INFγ, TNFα, IL1-α; 1-β) et de chémokines (MIP-1α). Notons que la présence de TGF-β

provoque l’effet opposé (Marino et al 2003). Quant à l’INF-γ, il induit l’expression du

CMHII au niveau des myotubes et des myoblastes (Goebels et al 1992; Mantegazza et al

1991; Michaelis et al 1993). Il est intéressant de noter que dans les conditions

physiologiques, ni le CMHI, ni le CMHII ne sont exprimés par les fibres musculaires.

Cependant dans le cadre de certaines myopathies (polymyosite), l’expression du CMHI et

du CMHII est augmentée (Emslie-Smith et al 1989; Karpati et al 1988b). En dehors de

l’expression des CMH classiques, les myoblastes arborent dans certaines conditions le

CHMI « non-classique » appelé HLA-G. HLA-G est un CMH de classe Ib qui est relié

structurellement au CMHIa (HLA-A, -B, -C). Le rôle immunobiologique de ce CMH n’est

pas encore clairement connu, mais il est incontestablement impliqué dans le non-rejet du

fœtus par la mère (Carosella et al 2001; Diehl et al 1996). L’expression de cette molécule

de CMH a notemment été détectée dans les tissus musculaires provenant de patients atteints

de myopathies inflammatoires telle que la polymyosite. Cette expression serait

supposément reliée aux fortes concentrations en cytokines dans les tissus musculaires

atteints (Wiendl et al 2000). En exprimant à leur surface diverses molécules du CMH, les

myoblastes empruntent le costume des CPAs. Par ailleurs, le fait que leur machinerie de

présentation de l’Asg soit belle et bien fonctionnelle, vient renforcer cette idée (Ferrer et al

2004; Hohlfeld & Engel 1991; Inukai et al 2000; Kloetzel & Ossendorp 2004; Kumamoto

et al 1997).

4.1.4.2 Le muscle exprime d’autres molécules participant à la réaction immunitaire. Nous avons vu que les myoblastes semblaient s’approprier un rôle de CPAs.

Cependant pour être réellement efficaces, d’autres molécules doivent venir compléter leur

profil de CPAs comme les molécules de costimulation, par exemple. Les myoblastes

69

n’expriment pas en culture les molécules de costimulation classique que sont le B7-1

(CD80) et le B7-2 (CD86) (Behrens et al 1998; Bernasconi et al 1998). L’INFγ et le TNFα

ne modifient pas ce profil de non-expression. Cependant, les myoblastes peuvent exprimer

d’autres molécules de costimulation. ICOS-L « Inducible Costimulator Ligand » appartient

à la famille B7. L’expression physiologique d’ICOS-L est faible voire néant dans le

muscle, mais forte en présence de TNFα, comme c’est le cas dans les myopathies

inflammatoires (Schmidt et al 2004; Wiendl et al 2003b). Le récepteur de cette molécule se

trouve sur les LTs activés. L’intéraction d’ICOS-L avec son récepteur favorise la

costimulation des LTs CD4 et CD8 (Greenwald et al 2005; Wiendl et al 2003b). Un second

membre de la famille des molécules B7, le B7-H1 est retrouvé sur les myoblastes stimulés

par l’INFγ. À l’opposé d’ICOS-L, B7-H1 inhibe l’activation des LTs CD4 et CD8 et réduit

leur production de cytokines (Chen 2004; Wiendl et al 2003a). Le CD40, autre molécule de

costimulation participant à la régulation de l’activation des LTs, est exprimé par les

myoblastes humains. Son niveau d’expression dépend des concentrations d’INFγ et de

TNFα auxquels les myoblastes sont exposés (Behrens et al 1998; Sugiura et al 2000).

Chez la souris, il a été observé que les fibres musculaires synthétisaient des

chemokines lors d’injection d’oligonucléotides contenant des motifs CpG non-méthylés.

Ces chemokines attirent les cellules impliquées dans la phase de l’inflammation et sécrétant

entre autre de l’INFγ (Stan et al 2001). Cette cytokine pousse alors les myotubes à exprimer

le CMHII et d’autres molécules impliquées dans la présentation de l’Ag. Ces résultats sont

particulièrement problématiques si nous considérons les thérapies impliquant l’injection

d’ADN nu (cf chapitre des thérapies géniques). Les « toll-like receptor » (TLR)

contribuent, via leur capacité à capter des pathogènes ou des signaux endogènes du danger,

à établir un lien entre la réponse immunitaire innée et adaptative. In vitro, les myoblastes

expriment constitutivement le TLR de type 3 (Schreiner et al 2006). La fixation d’ADN

double brin ou d’ARN double brin au TLR des myoblastes active la cascade dépendante du

NF-κB et augmente la sécrétion de nombreuses cytokines (Figure 14) (Schreiner et al

2006).

Ainsi, il existe une multitude de molécules exprimées ou sécrétées par le tissu

musculaire qui peuvent participer étroitement à des réactions immunitaires survenant dans

70

le muscle. La liste des ces molécules n’est pas exhaustive (Figure 14). Enfin, il reste

beaucoup d’études à effectuer pour établir clairement toutes leurs implications dans

l’inflammation ainsi que vis-à-vis des thérapies intentées dans le cadre des myopathies ou

dystrophies.

4.2 Transplantation et rejet immunitaire

4.2.1 Généralités Le devenir d’un transplant dépend essentiellement de la réaction immunologique du

receveur vis-à-vis d’Ags de transplantation propres au donneur et portés par le greffon.

Parmi les nombreuses substances antigéniques faisant l’objet d’un polymorphisme au sein

d’espèces (allotypes), la transplantation a permis d’identifier un ensemble d’Ag tissulaires

codés par des gènes alléliques définissant des systèmes d’histocompatibilité. Par exemple,

le système des groupes sanguins A, B, O correspond à des molécules tissulaires très

fortement antigéniques. L’un de ces systèmes très impliqué dans le rejet des transplants par

le receveur est le CMH. Un ensemble d’autres systèmes d’histocompatibilité appelés

mineurs codent des Ags de transplantation qui sont soit des super antigènes (cf. chapitre 1 :

4.2.2.1.2.3) soit des Ags présentés sous formes de peptides en association avec les produits

du CMH du donneur ou bien du receveur.

La réaction immunologique du receveur envers les Ags portés par le greffon met en

jeu essentiellement des LTs et des Acs. Ces derniers, engagés dans une réaction du receveur

envers les Ags du donneur, induisent des lésions tissulaires caractéristiques. Également, il

survient des perturbations des fonctions biologiques du transplant, décrites sous le nom de

réaction de rejet ou de crise de rejet. Selon leurs mécanismes immunopathologiques et leur

intensité, ceux-ci peuvent être suraiguës, aiguës ou chroniques, réversibles ou irréversibles.

Lorsque le receveur est incapable de rejeter un greffon allogénique, par déficit

immunitaire pathologique ou consécutif à une immunosuppression, et si ce greffon contient

des LTs, ces derniers peuvent reconnaître les Ags du receveur et induire une réaction du

greffon contre l’hôte « graft versus host disease » (GVHD).

71 En transplantation on parle classiquement d’autogreffe lorsque donneur et receveur

sont le même individu, de greffes syngénique ou isogreffe lorsqu’ils sont génétiquement

identiques (jumeaux homozygotes), d’allogreffe lorsqu’ils sont génétiquement différents

mais de la même espèce et enfin de xénogreffe lorsqu’ils appartiennent à des espèces

animales différentes.

4.2.2 Transplantation d’organes Tous les receveurs d’organes allogéniques sont soumis à un traitement

immunosuppresseur, maintenu tant que le transplant demeure fonctionnel. Les doses

d’immunosuppresseurs peuvent néanmoins être progressivement diminuées (phénomène

d’adaptation du greffon).

Le rejet suraigu se manifeste dans les heures qui suivent le rétablissement de la

continuité vasculaire par un infarctus du transplant, parfois associé à une coagulopathie de

consommation. L’un des mécanismes de ces rejets suraigus est la fixation sur l’endothélium

vasculaire d’Acs préformés chez le receveur. Ce type de rejet peut être évité en effectuant

antérieurement à la transplantation certains tests immunologiques qui permettent de

s’assurer (le plus souvent) de l’absence de ces Acs préformés.

Le rejet aigu survient à partir du 4ème jour après la greffe, il se traduit parfois par

des signes généraux (fièvre, malaise), des signes fonctionnels ou biologiques qui dépendent

de l’organe transplanté. Le mécanisme essentiel est une infiltration du greffon par des

cellules LTs du receveur. Une étude histologique du transplant montre des altérations

typiques du rejet aigu : LTs activés, éosinophiles, monocytes, augmentation de l’expression

des Ags, CMH présents sur l’endothélium et l’épithélium consécutive à la production locale

de cytokines (INFγ, TNFα). Les crises de rejet aigu constituent une urgence médicale, leur

réversibilité dépend de la précocité de leur traitement. La présence d’un infiltrat de cellules

mononucléées à la biopsie peut exister en l’absence de rejet et n’a pas de valeur

pronostique.

Les rejets chroniques se traduisent par la détérioration lente, progressive et

irréversible des fonctions du transplant. Les lésions histologiques associent une fibrose

72

périvasculaire et interstitielle et des lésions vasculaires. L’aspect agiographique est celui

d’un « arbre mort ».

4.2.3 Greffe de cellules souches hématopoïétiques Les autogreffes de moelle osseuse s’adressent essentiellement à des malades atteints

de différentes formes de leucémies, lymphomes ou cancers métastatiques résistants aux

autres traitements. Les patients sont conditionnés par radiothérapie et/ou chimiothérapie à

dose létale ou supra létale, puis réinjectés avec leur propre moelle débarrassée des cellules

tumorales. Dans ce type de greffe, il n’y a évidemment pas de GVHD.

Les allogreffes peuvent s’adresser à des nourrissons atteints de diverses formes de

déficit immunitaire sévère, dont le système immunitaire pourra être reconstitué par apport

de cellules souches de la moelle osseuse. Cependant, dans l’immense majorité des cas, les

allogreffes de moelle osseuse sont réalisées chez des malades atteints de leucémies aiguës

ou de leucémies myéloïdes chroniques. Ces malades sont soumis à un lourd protocole

d’immunosuppression associant irradiation totale et chimiothérapie immédiatement avant la

greffe. Puis, la reconstitution de leur système immunitaire s’effectue progressivement.

Les principales complications de ces greffes sont la survenue de GVHD,

d’infections et de tumeurs. Les réactions aiguës de GVHD sont classées en 4 grades de

sévérités. Ces réactions se manifestent par la fièvre, divers signes cutanés, une hépatite

cholestatique et des lésions intestinales (diarrhées). Ces formes aiguës sont généralement

réversibles par administration d’immunosuppresseurs. Les GVHDs chroniques induisent

des signes cutanés, hématologiques, et des réactions auto-immunes. Les infections sont

typiquement des infections opportunistes à virus du groupe Herpès (en particulier

pneumopathies à cytomégalovirus), à bactéries encapsulées (Haemophilus influanzae) ou à

protozoaires (Janeway 2001). Des lymphomes associés au virus d’Epstein-Barr peuvent

apparaître sous immunosuppression intensive ou dans le cadre d’une GVHD chronique. Il

est important de noter que l’affaiblissement du système immunitaire dû à l’utilisation

indispensable et prolongée d’immunosuppresseurs favorise le développement de ces

infections opportunistes.

73

4.2.4 La greffe de peau Les allogreffes de peau font l’objet d’un épaississement et d’une induration du 6ème

au 8ème jour par infiltration périvasculaire du derme par des cellules mononucléées

(lymphocytes, macrophages). La peau greffée se nécrose du 8ème au 10ème jour. Enfin,

l’élimination du greffon fait place à la cicatrisation. Les temps moyens de survie des

allogreffes atteignent 3 à 4 semaines chez les brûlés du fait du déficit immunitaire. Les

greffes d’épiderme cultivé in vitro (kératinocytes dépourvus de cellules de Langerhans

déposés sur une couche de collagène) ne sont, en principe pas rejetées.

4.2.5 Immunologie de la réaction d’allogreffe

4.2.5.1 Lois de la transplantation Le développement de lignées de souris consanguines, homozygotes au niveau du

CMH, a permis de réaliser les observations suivantes connues sous le nom de « lois de la

transplantation », qui s’appliquent aux animaux non traités par des immunosuppresseurs

(Figure 13).

Les greffes, isogéniques entre deux souris d’une même lignée n’induisent pas de

rejet. Les greffes allogéniques entre deux lignées incompatibles pour le CMH induisent le

rejet aigu irréversible d’une greffe. Ce rejet est plus tardif si l’incompatibilité ne porte que

sur des systèmes mineurs d’histoincompatibilité. Une deuxième greffe du même donneur

est rejetée plus rapidement, ce qui implique l’induction d’une mémoire immunologique

spécifique vis-à-vis des Ags d’histocompatibilité du donneur. Par ailleurs, les greffes de

chaque lignée parentale à un hybride de première génération sont acceptées, alors que les

greffes de l’hybride à l’une ou l’autre des lignées parentales sont rejetées. Ce phénomène

correspond au fait que l’expression des produits du CMH des deux haplotypes de l’hybride

est co-dominante, chaque cellule de l’organisme exprime les Ags des deux lignées

parentales. Il est important de noter que le rejet est dû aux LTs. En effet, il n’apparaît pas

dans les souris athymiques.

74

4.2.5.2 Présentation des allo-antigènes L’activation des LTs allo-réactifs du receveur par les Ags de transplantation du

donneur met en jeu deux mécanismes complémentaires : la reconnaissance indirecte et la

reconnaissance directe.

La reconnaissance directe fait intervenir des CPA du donneur (cellules dendritiques

tissulaires, endothélium vasculaire ou cellules épithéliales stimulées par de l’INFγ au cours

d’une crise de rejet). Les TCRs des LTs CD4+ et CD8+ interagissent par réaction croisée,

avec des complexes peptides/molécules du CMH du greffon.

75

Figure 15 : Lois de la transplantation.

76

La reconnaissance indirecte fait intervenir les CPAs du receveur. Les peptides associés aux

molécules de classe II du CMH proviennent des protéines solubles et des protéines

cellulaires libérées lors de la cytolyse des cellules du donneur. Les peptides associés aux

molécules de classe I dérivent quant à elles des protéines synthétisées par des cellules du

transplant. Les protéines polymorphiques au sein de l’espèce (codées par des gènes

alléliques) ainsi que les protéines d’agents infectieux localisés dans le greffon (cas du

cytomégalovirus) peuvent interagir avec des LTs du receveur. Ce type d’activation

indirecte des LTs joue un rôle important dans les rejets aigus tardifs et les rejets chroniques.

4.2.5.3 Mécanismes effecteurs de la réaction de rejet. Trois composantes interviennent dans la dégénérescence du transplant : la

production de cytokines, les cellules T cytotoxiques alloréactives et les alloanticorps.

Les LTs CD4+ allo-réactifs, stimulés par les Ags couplés au CMH de classe II

portés par l’endothélium du greffon, les cellules dendritiques (exemple : cellules de

Langerhans de l’épiderme) et les cellules CD8+, activées par les Ags couplés au CMH de

classe I, produisent une première vague de cytokines (IL-2, INFγ, TNFα). Puis, ces

cytokines stimulent à leur tour la production d’IL-1, de TNF, d’IL-6 et d’IL-8 et

l’expression d’Ag présentés par le CMH de classe II présent sur les cellules endothéliales.

La deuxième vague de cytokines augmente la perméabilité vasculaire et provoque

l’infiltration caractéristique par les cellules mononucléées et, à plus long terme, la

prolifération endothéliale.

Les cellules T cytotoxiques détruisent les cellules du transplant par reconnaissance

des Ags associés au CMH de classe I. En effet, cette reconnaissance engendre la synthèse

de lymphokines (granzyme, perforine, TNF…), qui vont provoquer la mort des cellules du

transplant. En plus de cette réaction spécifique, d’autres cellules (monocytes,

polynucléaires neutrophiles et éosinophiles) stimulées par les cytokines, peuvent participer

à la lyse des cellules du greffon.

Enfin, les allo-anticorps se fixent sur les Ags du transplant. Le recouvrement des

cellules du donneur par ces allo-anticorps (opsonisation) peut engendrer leur phagocytose,

77

par les macrophages tissulaires, mais également leur lyse, par fixation du complément. Bien

que les principes de lyse cellulaire induite par le complément ne soient pas abordés dans

cette thèse, il est important de mentionner ce mécanisme qui est en outre responsable des

lésions vasculaires qui surviennent dans le cadre du rejet chronique d’un organe.

Cette relation étroite entre le système immunitaire et la survie du greffon est à

l’origine d’une des principales barrières biologiques auxquelles se heurte le développement

de la transplantation de cellules myogéniques.

4.3 La transplantation de cellules myogéniques (TM) La transplantation de cellules myogéniques (TM) se définit par l’injection à un

patient dystrophique de cellules, provenant d’un donneur sain, capables de ce différencier

en tissus musculaires striés et de réparer les fibres lésées des patients. Les principes de cette

approche datent du début des années 1980 (Partridge et al 1978). Le terrain d’étude de la

TM est essentiellement le muscle strié squelettique ainsi que le muscle cardiaque. Par ce

biais, cette thérapie vise premièrement à ralentir voir à arrêter la dégénérescence

musculaire. Puis, s’appuyant sur le contrôle de la détérioration musculaire, la TM s’attelle à

restaurer la capacité musculaire des patients traités. Pour parvenir à répondre à ces attentes,

la TM repose sur deux dogmes : la complémentation génique et le renforcement de la

capacité myogénique des muscles traités (Figure 14) (Skuk et al 2000)

4.3.1 Complémentation génique Lipton et Schultz furent les pionniers de la TM (Lipton & Schultz 1979). Ils

observèrent que l’injection de cellules musculaires conduisait à la formation de deux types

de fibres musculaires. Premièrement, ils distinguèrent des fibres de petites tailles

constituées des cellules injectées. Deuxièmement, ils décrivirent un autre type de fibres.

Les cellules musculaires du donneur avaient été incorporées par les fibres du receveur. Ils

les nommèrent : fibres hybrides. Un phénomène de complémentation génique survenait au

sein des ces fibres. En effet, le syncytium des fibres hybrides contenait des protéines codées

par les noyaux de l’hôte et par ceux du donneur (protéines exogènes) (Skuk 2004). Dans le

contexte de la DMD, la déficience en dystrophine pouvait de ce fait être compensée au sein

des fibres hybrides. Cette complémentation s’est vérifiée chez la souris mdx pour la

78

dystrophine, chez la souris dy/dy pour la mérosine (un modèle murin de dystrophie

congénitale caractérisée par l’absence de mérosine) et chez la souris SJL pour la dysferline

(un modèle murin de dysferlinopathie) (Leriche-Guerin et al 2002; Partridge et al 1989;

Vilquin et al 1996). Le principe de complémentation génique fut également et

indiscutablement confirmé en 1995 chez des patients atteints de DMD par l’équipe de

Mendell (Mendell et al 1995). Plusieurs autres études cliniques vinrent par la suite appuyer

ce résultat (Skuk et al 2006; Skuk et al 2004).

79

Figure 16 : La transplantation de myoblastes. La cible du transfert de myoblastes (ou de cellules myogéniques) est le muscle squelettique. (1) Le tissu musculaire peut être prélevé d'un donneur. (2) Les cellules satellites, situées en périphérie des fibres musculaires (3), peuvent être cultivées et proliférées in vitro (4). Après avoir obtenu un nombre suffisant de cellules, elles peuvent être implantées dans le muscle (5) pour participer à la régénération induite au site d’injection par les dommages causés par les injections. Avant la transplantation, les cellules peuvent être modifiées génétiquement pour exprimer des gènes traceurs (comme la β-galactosidase) ou des gènes candidats comme la dystrophine. Le panneau (6) montre une coupe transversale des fibres multinucléées générées dans le biceps d'un singe greffé avec des cellules marquées à la β- Galactosidase.

Skuk et al 2000.

80

Chez la souris mdx, l’expression de dystrophine par complémentation a permis de

protéger les fibres musculaires à l’effort physique (Brussee et al 1998). De plus, le nombre

de fibres exprimant la dystrophine semblait se maintenir dans le temps par rapport aux

fibres ne l’exprimant pas (Morgan et al 1993). Cependant, la complémentation génique ne

permet pas d’assurer une expression des protéines exogènes dans l’ensemble de la fibre

hybride. L’expression est localisée au site nucléaire (domaine nucléaire) des noyaux du

donneur qui ont fusionné sporadiquement le long de la fibre du receveur (Pavlath et al

1994). Cette restriction dépend de la capacité des protéines à se détacher ou à s’ancrer sur

les divers composants stationnaires des myotubes (Hall & Ralston 1989). En outre, la

dispersion des ARNms qui codent pour la dystrophine se limite autour du noyau qui les a

produit (Ralston & Hall 1992). Chez la souris mdx ayant subi une TM, le domaine

nucléaire de la dystrophine exogène a été estimé à 500 µm de long (Kinoshita et al 1998).

4.3.2 Renforcement de la capacité myogénique La force produite par un muscle est proportionnelle aux nombres et aux diamètres

de ses fibres musculaires. Dans le cadre des myopathies, plus spécifiquement de la DMD,

la diminution du nombre de fibres musculaires et de leurs tailles est particulièrement

marquée et croissante au cours de l’évolution de la maladie. De ce fait, il semble évident

que plus la succession de phases dégénératives et régénératives du muscle s’opèrent, plus la

quantité de noyaux exogènes incorporés par les fibres du receveur devrait augmenter. La

résultante de ce phénomène devrait être une augmentation de la force des muscles traités.

Ce principe a été démontré chez des souris ayant subi des dommages musculaires

irréversibles (cryo-dommages, irradiation). Ainsi, la perte de masse musculaire engendrée a

été restaurée à la suite d’une TM (Alameddine et al 1994a; Alameddine et al 1994b;

Irintchev et al 1997a; Irintchev et al 1997b; Wernig & Irintchev 1995; Wernig et al 2000).

Ce concept laisse à penser qu’un patient atteint de DMD, dont l’évolution de la maladie est

assez avancée pourrait retrouver sa capacité musculaire. Néanmoins, ce principe se base sur

une présence encore suffisante de fibres des patients.

Par ailleurs, des expériences effectuées chez la souris renforcent l’idée que les

cellules musculaires injectées sont recrutées aux cours des phases régénératives se

81

déroulant bien après leur injection (Gross & Morgan 1999; Yao & Kurachi 1993). Ainsi les

cellules exogènes injectées peuvent être considérées comme une source potentielle de

cellules satellites (Heslop et al 2001). Ce résultat est d’un intérêt primordial pour justifier la

TM comme approche thérapeutique. En effet, une seule séance de plusieurs TM pourrait

avoir un effet à long terme sur les patients traités, les cellules injectées participant

continuellement à la régénération musculaire des patients. Subséquemment à une TM, il a

été observé chez des patients atteints de DMD que plusieurs cellules issues du donneur

pouvaient se positionner et rester autour des fibres du patient. Ce résultat intéressant vient

étayer la possibilité de retrouver des cellules musculaires injectées en position de cellules

satellites (Gussoni et al 1997).

4.3.3 Les limites de la transplantation de cellules myogéniques

4.3.4 Premiers essais difficiles L’engouement provoqué par les résultats obtenus chez la souris (Morgan et al 1987;

Morgan et al 1990; Partridge et al 1989), précipita les premiers essais cliniques de TM.

Malheureusement, ces premières tentatives donnèrent des résultats assez peu convaincants

(Huard et al 1991; Huard et al 1992; Karpati et al 1993; Karpati et al 1992; Mendell et al

1995; Miller et al 1997; Neumeyer et al 1998; Tremblay et al 1993). L’analyse des sites

d’injection ne révélait que peu de fibres exprimant de novo la dystrophine. De plus, la

détection spécifique de la dystrophine d’origine du donneur n’étant pas effectuée, il était

difficile de tirer des conclusions claires quant à l’origine de la dystrophine observée (Skuk

2004). Néanmoins, la présence de dystrophine chez les patients traités, même faible,

encouragea les chercheurs à déterminer quelle pouvait être l’origine des limitations de la

TM chez l’homme. Ainsi, les résultats obtenus grâce à l’expérimentation animale, dans son

ensemble, amenèrent à la conclusion suivante.

82

La transplantation de cellules myogéniques est limitée par :

la capacité myogénique des cellules transplantées,

le mode d’administration des cellules à transplanter,

la survie des cellules injectées.

4.3.5 Quelles cellules transplanter ? Indubitablement, les cellules utilisées à des fins de transplantation peuvent être soit

des cellules différenciées, soit indifférenciées. Les cellules différenciées doivent être

similaires à celles qui constituent le parenchyme de l’organe ou du tissu ciblé. Les cellules

indifférenciées doivent être capables de se spécifier en cellules qui constitueront le

parenchyme de l’organe ou du tissu ciblé. En raison leurs caractéristiques propres, les

cellules différenciées qui composent le tissu musculaire squelettique ne peuvent être

transplantées. Les myotubes sont longs, et leur syncytium très spécialisé ne peut leurs

permettre d’entrer en mitose. De ce fait, le succès d’une TM repose sur l’utilisation de

cellules indifférenciées présentant incontestablement une capacité myogénique. Il existe

plusieurs types de cellules qui offrent cette capacité. Ces cellules participeraient toutes plus

ou moins à la phase physiologique de régénération musculaire (Charge & Rudnicki 2004).

La difficulté à bien définir ces différents types cellulaires amène une certaine variabilité

quant aux résultats de leur transplantation. Néanmoins, leur utilisation offre divers

avantages thérapeutiques.

Par ailleurs, il est important de noter que dans le cadre de cette thèse, la

transplantation de cellules myogéniques est basée sur la transplantation de myoblastes

(TM). Les diverses sections suivantes apporteront plus de précisions quant aux myoblastes,

mais permettront aussi de couvrir l’ensemble des types cellulaires utilisés dans le cadre des

TMs.

4.3.5.1 Cellules myogéniques résidentes du tissu musculaire strié Le tissu musculaire squelettique bien que nettement différencié, possède en son sein

des cellules satellites. Ces cellules mononuclées sont accolées au sarcolemme et englobées

par la lame basale qui entoure chaque fibre musculaire (Mauro 1961). Comme cela a été

83

abordé précédemment (cf. chapitre 1 : 1.1.1.1 et 1.1.1.3.2), les cellules satellites constituent

un réservoir de cellules myogéniques impliquées dans la régénération musculaire ainsi que

dans l’embryogenèse. Les cellules mononuclées résultantes de l’activation et de la

prolifération des cellules satellites vont devenir des myoblastes (Lewis 1915). Ces

myoblastes vont enfin se différencier en myocytes et fusionner entre eux ou avec les fibres

musculaires lésées. Les cellules satellites peuvent être isolées in vitro à partir d’une biopsie

musculaire par digestion enzymatique. Elles peuvent proliférer en culture et fusionner en

myotubes (Konigsberg 1960). Il a été aussi démontré que l’injection de myoblastes issus de

culture primaire conduisait à l’expression de protéines du donneur dans le tissu musculaire

squelettique de singes (Kinoshita et al 1996; Kinoshita et al 1995a; Skuk et al 2000; 2002b;

Skuk et al 1999b) et d’humains (Mendell et al 1995; Skuk et al 2004).

Diverses expériences, réalisées chez la souris, soulèvent l’existence d’autres sous

populations cellulaires présentant des capacités myogéniques similaires aux myoblastes.

Ces cellules n’auraient pas pour origine les cellules satellites mais pourraient entre autre

provenir des péricytes qui sont juchés autour du système vasculaire (Asakura et al 2002;

Tamaki et al 2002). Quoiqu’il en soit, qu’ils soient originaires des cellules satellites ou non,

les myoblastes représentent une population cellulaire d’intérêt pour la fonctionnalité

thérapeutique d’une TM. En outre, il est possible d’obtenir une culture cellulaire enrichie

en myoblastes à partir d’une biopsie musculaire. Cette purification est possible grâce à

l’expression de certains marqueurs de surfaces exprimés par les myoblastes. Ainsi, chez le

singe (Skuk et al 2000), le chien (Ito et al 1998b), la souris (Belles-Isles et al 1993) et chez

l’homme (Huard et al 1994b), les cultures primaires de cellules musculaires ont pu être

enrichies en myoblastes. Les cultures primaires de souriceaux sont particulièrement riches

en fibroblastes. Les fibroblastes ont la particularité d’adhérer rapidement aux pétris de

culture par rapport aux myoblastes. Il est ainsi possible de récupérer les cellules non

adhérentes afin d’enrichir la culture cellulaire en myoblastes (Polinger 1970; Yaffe 1968).

La facilité à obtenir des cultures primaires de myoblastes associée à leur potentiel

myogénique avéré, a conduit à l’aboutissement d’essais cliniques dont les résultats étaient

assez prometteurs (Charge & Rudnicki 2004; Skuk et al 2004).

84 Récemment, certaines équipes de recherche focalisent leurs efforts sur des cellules

souches présentes dans le tissu musculaire squelettique de souris. Il s’agit des cellules

MDSCs, « muscle derived stem cells ») qui offrent une certaine plasticité cellulaire. Les

MDSCs offrent des capacités ostéogéniques, adipogéniques, chondrogéniques et

hématopoïétiques (Deasy et al 2001). De plus, les MDSCs possédant une forte capacité

prolifératrice (Deasy et al 2001), leur confère un avantage pour le développement de

thérapies géniques. En effet, comme cela a été évoqué dans l’ensemble de la sectiona 3.2, la

thérapie génique s’accompagne souvent d’une réponse immunitaire dirigée contre les

vecteurs utilisés pour modifier génétiquement les cellules. Une manière de contourner

partiellement le problème est de combiner la thérapie génique et cellulaire. Cette

combinaison est appelée : thérapie génique ex vivo. Par ce biais, des cellules isolées à partir

d’une biopsie musculaire d’un patient atteint de DMD peuvent être modifiées

génétiquement in vitro. Cette modification cellulaire s’effectue à l’aide de vecteurs viraux

ou plasmidiques et permet une restauration de l’expression la dystrophine. Les cellules

modifiées sont par la suite transplantées. Ainsi dans le cadre de cette transplantation

autologue, seul le transgène est exogène au receveur, limitant la réaction immunitaire

(Quenneville et al 2004). Cette approche nécessite une modification des cellules

transplantées sans altération de leur capacité myogénique (Quenneville et al 2004). De plus,

les cellules d’intérêt doivent posséder originellement une bonne capacité myogénique

(Skuk 2004). Malheureusement, les cellules myogéniques qui sont issues de patients DMD

n’ont qu’un faible potentiel prolifératif (Webster & Blau 1990). Ainsi, l’utilisation des

MDSCs, présenterait un avantage indéniable, subséquemment à leur fort potentiel

prolifératif, dans le développement de la thérapie génique ex vivo.

En outre, certaines études suggèrent que les MDSCs seraient à l’origine de la

formation cellules satellites (Seale et al 2000). Chez la souris, la transplantation de ces

cellules souches, bénéficiant d’un meilleur potentiel prolifératif (Deasy et al 2001), semble

donner de meilleurs résultats que la TM (Deasy et al 2001). De plus, le nombre de fibres

positives pour la dystrophine comptabilisées dans des muscles de souris mdx, transplantés

avec ces cellules souches était 10 fois supérieur à celui observé dans des muscles

transplantés avec des myoblastes (Qu-Petersen et al 2002). Toutefois, ce résultat fut

controversé par un autre groupe de recherche qui ne vit aucune différence selon le type de

85

cellules injectées (Mueller et al 2002). Cette dissimilitude des résultats serait peut être liée à

l’insuffisance d’études physiotypiques préalables à l’injection des MDSCs (Charge &

Rudnicki 2004). Pour l’instant, la difficulté à établir une définition précise des marqueurs

caractérisant les cellules souches d’origine musculaire freine leur éventuelle utilisation en

clinique. Plusieurs études fondamentales restent à effectuer pour mieux les caractériser.

4.3.5.2 Cellules myogéniques non résidentes du muscle

4.3.5.2.1 Cellules issues de la moelle osseuse La participation à la régénération musculaire de cellules issues de la moelle osseuse

fut démontrée au début des années 80 (Meyer & Yarom 1983). Depuis, plusieurs travaux

ont mis en évidence la capacité de cellules issues des lignées hématopoïétique et stromale à

se différencier in vitro en cellules de la lignée myogénique (Bittner et al 1999; Ferrari et al

1998; Gussoni et al 1999; LaBarge & Blau 2002).

L’importance de la différenciation de cellules de la lignée hématopoïétique en

cellules myogéniques ne réside pas seulement dans la diversification de disponibilité de

sources cellulaires aptes à être employées dans le cadre d’une TM. Pour traiter

complètement un patient dystrophique avec une thérapie cellulaire, cela impliquerait que

tous les muscles soient traités. L’administration systémique de cellules à capacité

myogénique réduirait ainsi considérablement le niveau de difficulté d’une thérapie

cellulaire. Une étude encourageante chez la souris mdx confirma qu’une administration

systémique de cellules souches hématopoïétiques, issues de souris non dystrophiques,

conduisait à l’apparition de quelques fibres dystrophiques dans quelques muscles (Ferrari et

al 1998; Gussoni et al 1999). Cependant, le nombre de fibres positives pour la dystrophine

étant excessivement faible subséquemment à cette administration systémique n’argumentait

pas en la faveur d’un développement thérapeutique possible de cette méthode. De plus, une

étude effectuée chez un patient dystrophique vint étayer le manque d’efficacité de cette

approche. En effet, souffrant également d’une déficience immunitaire liée au chromosome

X, un patient DMD reçu une greffe de moelle osseuse à l’age d’un an. Néanmoins, peu de

fibres exprimant de la dystrophine étaient distinguables 13 ans plus tard (Gussoni et al

2002). Pour parachever le tout, l’enrichissement de la moelle en cellules exprimant des

protéines spécifiques aux cellules du muscle squelettique (matures ou non) ne permit pas de

86

potentialiser l’approche (Corti et al 2002). Ces résultats décevant pourraient s’expliquer par

la faible participation des cellules souches hématopoïétiques dans le cadre d’une

régénération musculaire (Grounds 1983; Robertson et al 1992; Rosenblatt & Parry 1992;

Schultz et al 1986; Wakeford et al 1991; Weller et al 1991).

Par ailleurs, il a été démontré chez la souris que les cellules mésenchymateuses de la

moelle osseuse (cellules stromales) étaient capables de se différencier en myotubes

(Grigoriadis et al 1988; Wakitani et al 1995). Inopportunément, il semblerait que l’injection

de ces cellules mésenchymateuses chez le singe ne semble pas conduire à leur

différenciation en cellules musculaires (Skuk & Tremblay 2003).

4.3.5.2.2 Autres cellules ? Les fibroblastes sont des cellules faciles à cultiver et faciles à prélever. Le gène

MyoD1 (cf. chapitre 1 : 1.1.1.1) est un gène important pour le développement

embryologique du tissu musculaire. Il est également impliqué dans la différenciation des

cellules satellites en myocytes. L’introduction de MyoD1 dans des fibroblastes leur a donné

des capacités myogéniques (Huard et al 1992). Une fois transplantés dans des muscles de

souris, les fibroblastes exprimant MyoD1 sont capables de fusionner (faiblement) avec des

myotubes de la souris hôte (Huard et al 1998). En outre, la galectine-1, (une lectine sécrétée

par les myoblastes et les myotubes in vitro) est capable de modifier les fibroblastes issus du

derme en cellules myogéniques (Goldring et al 2002). L’ensemble de ces études donne un

bon espoir quant à l’utilisation de fibroblastes comme cellules myogéniques. Il reste

néanmoins beaucoup de travail à effectuer avant de penser à cette possibilité pour une

éventuelle approche clinique.

4.3.6 Comment les transplanter ? Les patients atteints de DMD présentent une déficience en dystrophine qui touche

l’ensemble des muscles striés. Or le tissu musculaire constitue un ensemble tissulaire plutôt

vaste puisqu’il représente 40 à 50 % du poids d’un individu adulte (Franzini-Armsrong

1994). De ce fait, les thérapies cellulaires envisagées se doivent pour être efficaces de

« semer » les cellules d’intérêts dans des « champs » musculaires les plus étendus

possibles. Pareillement, la technique de distribution utilisée ne doit pas entraver la capacité

myogénique des cellules mais au contraire et idéalement l’augmenter.

87

4.3.6.1 Administration systémique L’importance de la vascularisation du système musculaire confère à l’administration

systémique de cellules myogéniques le statut de solution idéale pour le développement

d’une thérapie cellulaire. Notamment, cette stratégie de distribution cellulaire permettrait

d’atteindre des muscles importants (cœur, diaphragme) et pourtant difficiles d’accès pour

des injections intramusculaires. Pour l’instant les résultats obtenus chez les modèles murins

sont toutefois peu convaincants. En effet, l’injection de myoblastes, que cela soit par voie

intra veineuse ou intra péritonéale, s’avère pour l’instant infructueuse (Partridge 1991). La

délivrance de cellules myogéniques par voie intra artérielle donne par contre des résultats

plus convaincants. Mais, ces résultats dépendent de la provocation simultanée de

dommages aux fibres musculaires et aux vaisseaux qui leurs sont juxtaposés (Neumeyer et

al 1992; Torrente et al 2001). Cette condition au bon fonctionnement de l’administration

intra artérielle, réduit de ce fait l’avantage de cette approche par rapport aux injections

intramusculaires. L’utilisation de cellules myogéniques qui seraient capables de migrer du

sang vers le muscle et ce dans un contexte ne nécessitant ni dommages vasculaires ou

musculaires pourrait remédier au problème. Une récente étude effectuée chez la souris,

montre que les mésangioblastes, cellules isolées à partir des vaisseaux sanguins présents

dans le tissu musculaire squelettique, offriraient cette capacité migratoire (Sampaolesi et al

2005; Sampaolesi et al 2003). Ces résultats ont été confirmés chez le chien dystophique

(Sampaolesi et al 2006). Cette nouvelle avenue thérapeutique basée sur les mésangioblastes

offre de grandes possibilités. Cependant, il faudrait être capable de confirmer le potentiel de

ces cellules chez l’homme et ne pas oublier que l’administration de ces cellules par voie

systémique pourrait engendrer de graves problèmes si ces cellules venaient à se loger dans

les poumons par exemple. En effet, 3 des chiens ayant reçu ces cellules en systémique sont

décédés suite à des complications d’ordre pulmonaire.

4.3.6.2 Administration localisée La distribution de myoblastes par injection intramusculaire (Figure 14) est

classiquement la méthode utilisée dans le contexte des TMs. Plusieurs avantages sont

associés à l’injection de myoblastes dans le tissu musculaire strié. Premièrement, cette

méthode permet de délivrer, dans le muscle traité, un nombre suffisant de myoblastes et de

s’assurer ainsi de la formation de fibres hybrides ou de néo fibres à un niveau appréciable

88

(Skuk 2004; Skuk & Tremblay 2003). Deuxièmement, l’injection en elle-même provoque

une succession de bris au niveau musculaire. La déstructuration éparse de la matrice

extracellulaire, qui en résulte, ouvre une voie physique aux cellules injectées leur

permettant d’approcher les myotubes de l’hôte. Parallèlement, la rupture des myotubes

augmente leur probabilité d’incorporer les cellules myogéniques injectées. Enfin,

conséquemment à l’injection, le processus physiologique de régénération musculaire qui

s’instaure va lui aussi faciliter la fusion des cellules du donneur avec les myotubes du

receveur (Charge & Rudnicki 2004).

Malgré ces traits plutôt avantageux, l’injection intra musculaire de myoblastes est

néanmoins affublée d’un point limitant. En effet, la dispersion des cellules après leur

injection est quasiment nulle. De ce fait, les cellules du donneur fusionnent majoritairement

avec des fibres du receveur qui sont proches des sites d’injections (Skuk et al 2000; 2002b).

Ces observations effectuées sur la souris et le singe furent confirmées dans le cadre

d’injections de myoblastes réalisées sur des patients atteints de DMD (Skuk et al 2004).

Cette constatation pourrait entre autres expliquer la faible efficacité des premières TMs

effectuées en clinique où les injections de myoblastes étaient peu nombreuses et trop

distancées par rapport au volume musculaire greffé. Deux facteurs incontournables

participent à l’amenuisement des TMs effectuées en intra-musculaire. Tout d’abord, les

myoblastes injectés n’ont qu’une faible capacité à migrer dans le muscle (El Fahime et al

2002). Ensuite, les myotubes situés en dehors des trajectoires d’injections ne sont pas

nécessairement endommagés, et de ce fait n’offrent pas aux cellules injectées de participer

à un processus de régénération musculaire (Skuk 2004). Plusieurs travaux effectués sur les

modèles murins ont démontré qu’il était possible d’augmenter la capacité migratoire des

cellules myogéniques injectées (Caron et al 1999; Huard et al 1994a; Ito et al 1998a). Par

contre, ces résultats n’ont pas été encore reproduits dans d’autres modèles d’animaux

comme le singe. Enfin pour favoriser la fusion des myoblastes injectés avec les fibres de

l’hôte, deux procédés sont utilisés seuls ou en combinaison chez la souris. L’injection de

notexine (Huard et al 1994b; Skuk et al 1999a; Vilquin et al 1995), avant ou simultanément

à l’injection de myoblastes, (phospholipase myotoxique issue extraite d’un venin de

serpent) permet de détruire les fibres musculaires et favorise ainsi le processus de

régénération musculaire. La bupivicaïne (anesthésique) a démontré des propriétés similaires

89

chez les rongeurs (Cantini et al 1994; Pin & Merrifield 1997). Toutefois, l’utilisation de tels

composés ne peut évidemment être envisagés chez l’homme. Parallèlement, l’irradiation

ionisante préalable des muscles transplantés permet d’augmenter l’efficacité des TMs. En

effet, lors du processus de régénération musculaire, les cellules myogéniques de l’hôte

peuvent faire compétition aux cellules injectées. Les radiations ionisantes détruisant les

cellules myogéniques de l’hôte, favorisent la participation des myoblastes injectés à

fusionner avec les myotubes du receveur. Ce principe a été vérifié maintes fois chez les

rongeurs (Alameddine et al 1994b; Huard et al 1994b; Morgan et al 1990; Vilquin et al

1995; Wernig et al 2000), mais à l’instar de la notexine et de la bupivicaïne il n’est pas

pensable d’utiliser un tel procédé chez les patients atteints de DMD.

Chapitre 2: Survie des cellules transplantées

1 Perte cellulaire à court terme

1.1 Causes La survie d’un organe fraîchement transplanté est rapidement hypothéquée par les

mécanismes du rejet suraigu (cf. chapitre 1 : 4.3.6). Ce rejet survient dans les minutes voir

les heures qui précèdent la transplantation. L’existence chez le receveur d’Acs circulants,

préformés et dirigés contre le donneur, est à l’origine de ce rejet. Ce problème est devenu

rarissime en clinique puisqu’il est évité par une détection systématique, antérieure à la

transplantation, de la présence éventuelle de ces Acs chez le receveur. Les patients

dystrophiques ont bénéficié d’examens similaires pour assurer la survie des myoblastes

transplantés lors d’un essai clinique récent (Skuk 2004). Néanmoins plusieurs autres

facteurs, autres que ceux impliqués dans le rejet suraigu, compromettent la survie des

cellules injectées. Tout d’abord, la survie post-transplantation des myoblastes peut être

influencée par les conditions de culture qui précèdent leur injection (Rando et al 1995).

Puis, il a été établi que les myoblastes transplantés, à la différence des organes, étaient

potentiellement plus fragiles à certains mécanismes de mortalité cellulaire tels que l’anoïkis

(Zvibel et al 2002). Enfin, certaines évidences pointent l’inflammation comme étant un des

facteurs grandement impliqués dans la mort précoce des myoblastes transplantés (Hodgetts

et al 2003; Skuk et al 2003; Skuk et al 2004).

90 L’implication du système immunitaire dans la mort précoce des myoblastes

s’appuie sur plusieurs expériences effectuées chez la souris. Premièrement, il a été

démontré que l’irradiation létale de souris permettait de réduire la mortalité précoce des

myoblastes transplantés. Cette augmentation de la survie des myoblastes a également été

observée avec l’injection d’un anticorps anti-LFA-1 (présent sur les leucocytes et

participant à leur activation). Néanmoins, les myoblastes injectés mouraient similairement

qu’ils soient transplantés à des souris immunodéficientes (SCID) ou immunocompétentes

(Guerette et al 1997a; Guerette et al 1997b). Ce résultat permettait déjà d’exclure une

participation du système immunitaire spécifique dans la mortalité précoce des myoblastes.

De plus, d’autres études venaient renforcer l’idée de la participation des macrophages et

neutrophiles à la destruction rapide des myoblastes injectés. Une augmentation de la survie

a été obtenue en utilisant des myoblastes génétiquement modifiés et exprimant le TGF-β

(Merly et al 1998). Ce résultat fut également observé lors de l’utilisation de myoblastes

exprimant une protéine antagoniste pouvant se lier au récepteur à l’IL-1 (Qu et al 1998).

Ces résultats peuvent s’expliquer par le fait que les neutrophiles et les macrophages, qui

infiltrent rapidement le muscle, produisent des radicaux oxygénés et des protéases qui

détruisent les myoblastes lorsqu’ils interagissent avec eux (Guerette et al 1997b; Skuk et al

2002a). Néanmoins le rôle des macrophages et des neutrophiles dans la mort précoce des

myoblastes a été remis en question. En effet, une étude a révélé que la déplétion de ces

deux types de cellules n’engendrait pas de variation quant à la survie des myoblastes

(Sammels et al 2004). Toutefois, cette étude contradictoire montrait quelques lacunes.

Enfin, comme cela a été décrit dans la section 1.1.1.3, la régénération musculaire suite à un

dommage plonge les cellules injectées dans un contexte inflammatoire (Charge & Rudnicki

2004). Ce contexte pourrait participer à la destruction des myoblastes injectés, notamment

lorsque ceux-ci sont introduits dans un muscle dystrophique où la succession des phases de

dégénérescence et de régénération est constante. Quoiqu’il en soit, et bien que les

mécanismes de l’inflammation responsables de la mort des myoblastes restent à établir, il

semble évident que le taux élevé de mortalité précoce des myoblastes transplantés soit

imputable en partie à l’inflammation. Ainsi, l’amalgame des conditions de culture, de

l’anoïkis et de l’inflammation provoquent la perte d’une grande partie (~75%) des

91

myoblastes dans les premiers jours (2 à 3 jours) qui suivent leur transplantation (Skuk et al

2003).

Heureusement, la forte mortalité des myoblastes transplantés n’empêche pas en soit

le succès de la TM. Ceci peut s’expliquer par la combinaison de deux facteurs.

Premièrement, toutes les cellules ne meurent pas. Deuxièmement la prolifération des

cellules survivantes permet de compenser partiellement ou totalement la perte initiale des

myoblastes injectés (Beauchamp et al 1999; Skuk et al 2002a; Skuk et al 2003). En se

basant sur ces deux principes, il semble évident qu’en augmentant la survie des myoblastes

transplantés, on devrait augmenter le nombre de cellules capables de participer à la

réparation musculaire et donc améliorer le résultat de la TM. Malheureusement, comme

cela vient d’être mentionné, les causes de la mortalité précoce des myoblastes ne sont pas

encore bien définies. De plus, les degrés d’implication des différents facteurs intervenant

dans cette mort cellulaire ne sont pas encore clairement évalués. Ainsi, il devient difficile

d’élaborer une approche pour réduire cette perte de cellules et augmenter le succès de leur

transplantation.

1.2 Solutions précédemment envisagées Une autre alternative, pour compenser la perte initiale des myoblastes injectés, vise

à favoriser le processus de régénération musculaire. Le processus de réparation des muscles

repose entre autre sur l’augmentation de l’activité de prolifération et/ou de différenciation

des myoblastes (Charge & Rudnicki 2004). L’utilisation de facteurs qui modulent ces

activités pourrait potentialiser l’action des myoblastes qui survivent à la mortalité survenant

dans les premiers instants après leur transplantation.

L’étude physiologique du muscle, après un bris musculaire, a permis de révéler

l’existence de plusieurs facteurs sécrétés participant à la régénération musculaire. Ce

processus finement orchestré implique l’activation des cellules satellites leur permettant de

proliférer et de se différencier afin de réparer les fibres lésées. Cette activation cellulaire

suit une chronologie précise mettant en jeu la régulation de facteurs de transcription, qui à

leur tour, vont moduler l’expression de gènes spécifiques aux cellules musculaires.

L’ensemble de ce processus repose sur des interactions cellulaires. Conjointement, la

92

régénération musculaire tient compte des interactions cellulaires avec la matrice

extracellulaire et avec des facteurs sécrétés par le compartiment extracellulaire. Il est

notamment établi que l’altération d’un muscle provoque la libération, au sein de l’espace

extracellulaire, de plusieurs molécules biologiquement actives. Ainsi, il a été démontré que

des extraits de muscles, préalablement endommagés, contenaient des substances mitogènes

pour les cellules satellites. Ces substances ne se retrouvaient pas dans des extraits

provenant de muscles intacts (Bischoff 1986; Chen & Quinn 1992). Différents types de

stimuli ont été proposés comme étant à l’origine de l’activation des cellules satellites

(Grounds 1999). Le nombre considérable d’études réalisées in vitro a permis de grossir le

catalogue des facteurs touchant la prolifération et/ou la différenciation des myoblastes.

Néanmoins peu d’entre eux ont conduit à des études in vivo démontrant leur implication

dans la régénération musculaire suite à un dommage musculaire. De plus, l’utilisation de

ces facteurs dans le cadre d’une TM n’est pas monnaie courante. Ainsi, les sections

suivantes vont introduire quelques facteurs qui ont démontré une certaine capacité in vivo à

participer à la régénération musculaire. Certaines fois ces facteurs ont même contribué à

l’augmentation du succès d’une TM Les mécanismes cellulaires par lesquels ils ont

contribué à cet effet seront brièvement abordés. Enfin, le premier article de cette thèse

introduira un nouveau facteur qui conduit à l’amélioration de la TM : le 1-α,25-

dihydroxycholecalciferol.

1.2.1 Le facteur de croissance hépatique (HGF) L’« Hepatocyte Growth Factor » (HGF), est un facteur de croissance ayant une forte

activité mitogénique. Cette capacité lui a été attribuée lorsqu’il fut déposé sur des cultures

hépatocytaires (Nakamura et al 1989; Nakamura et al 1986). Par la suite le HGF s’est

révélé comme un des plus importants facteurs impliqués dans la régénération des organes

(Charge & Rudnicki 2004). Également, de façon plus contextuelle, le HGF se révèle être un

des régulateurs clefs de la régénération musculaire via son effet sur les cellules satellites

(Charge & Rudnicki 2004). La première association entre le HGF et la régénération

musculaire fut effectuée alors que le transcrit, du HGF, fut détecté dans les broyats de

muscles en régénération (Jennische et al 1993). Depuis, il est communément établi que les

transcrits de HGF ainsi que les concentrations en HGF augmentent lors de la phase précoce

d’un muscle en régénération. De plus, la quantité de HGF produite est directement corrélée

93

avec le degré de dommages infligés au muscle (Suzuki et al 2002; Tatsumi et al 1998;

Tatsumi et al 2001). Des études, réalisées in vitro, ont démontré que le HGF pouvait

stimuler les cellules satellites quiescentes et ainsi augmenter la prolifération cellulaire au

sein de cultures de myoblastes. Néanmoins, cette augmentation de la prolifération

s’accompagnait d’une diminution de la différenciation des myoblastes, réduisant ainsi leur

capacité à fusionner pour former des myotubes (Allen et al 1995; Armand et al 1983; Miller

et al 2000; Tatsumi et al 1998). L’implication du HGF dans la prolifération et la

différenciation des myoblastes fut renforcée par une expérience utilisant une lignée de

myoblastes exprimant une forme activée du récepteur du HGF (c-met). La différenciation

de ces cellules fut alors inhibée (Francavilla et al 1997). Par ailleurs, l’injection de HGF

dans des muscles endommagés a engendré le blocage du processus de réparation. Ce

résultat démontrait la capacité des myoblastes à proliférer (leur quantité ayant triplé au

cours de l’expérience) mais leur incapacité à fusionner en présence de HGF (Miller et al

2000). De ce fait, l’HGF semble plus important dans la phase précoce de la régénération

musculaire. Ce concept fut démontré par la diminution de la sécrétion de HGF à partir du

moment où le dommage est effectué dans un muscle. De plus, l’injection tardive de HGF

n’influençait aucunement le processus de régénération appuyant l’argumentation d’une

fonction précoce dans le processus de réparation (Miller et al 2000). D’autre part, il

semblerait que le HGF joue un rôle dans la migration des myoblastes aux sites de

réparation des lésions musculaires. En effet, une étude in vitro, effectuée sur des lignées de

myoblastes de souris, a mis en évidence l’activité chémotactique de ce facteur (Bischoff

1997; Suzuki et al 2000). Ainsi, le HGF apparaît comme fortement impliqué dans le

processus de réparation musculaire. Cependant, son utilisation pour la greffe de myoblastes

ne permettrait que d’augmenter la prolifération des cellules injectées dans une période

limitée à quelques heures post-transplantation.

1.2.2 Les facteurs de croissance fibroblastiques (FGF) À l’instar du HGF, plusieurs « Fibroblastic Growth Factors » (FGF), sont considérés

comme étant des activateurs de la prolifération et comme des inhibiteurs de la

différenciation des myoblastes (Charge & Rudnicki 2004). Un de ces FGFs, le FGF-6 est

spécifiquement exprimé dans le muscle. De plus, son expression est augmentée suite à un

bris musculaire (deLapeyriere et al 1993; Floss et al 1997; Kastner et al 2000). Néanmoins,

94

son implication dans la phase de régénération musculaire est plus controversée. Une équipe

a observé que la capacité de régénération, de souris déficientes pour le FGF-6, était

diminuée (Floss et al 1997). Ce déficit de régénération était caractérisé par la diminution du

nombre de cellules positives pour les marqueurs MyoD et de myogénine. En opposition,

une autre équipe n’observa aucune défaillance de la régénération musculaire en réponse à

l’injection de notexine, à un écrasement musculaire ou chez des souris FGF-6 déficientes et

dystrophiques (mdx) (Fiore et al 1997; Fiore et al 2000). Ce désaccord n’est

malheureusement pas encore éclairci (Charge & Rudnicki 2004). Un autre FGF, le FGF-2,

a montré (in vitro) des propriétés mitogéniques sur les myoblastes (Charge & Rudnicki

2004). Par ailleurs, l’injection intramusculaire, à des souris mdx, d’un Ac anti-FGF-2 au

moment où la lésion musculaire est effectuée, a permis de réduire le nombre et le diamètre

des fibres en régénération. Cette observation soulevait le rôle possible (in vivo) du FGF-2

dans la prolifération et/ou la différenciation des myoblastes (Lefaucheur & Sebille 1995b).

Par ailleurs, l’injection aux souris mdx de FGF-2 semblait promouvoir la prolifération des

cellules satellites et favoriser la régénération musculaire (Lefaucheur & Sebille 1995a).

Enfin, le prétraitement de culture de myoblastes au FGF-2 a permis d’augmenter le succès

de leur transplantation dans des souris mdx (Kinoshita et al 1995b). Cependant, l’utilisation

de modèles murins autre que la souris mdx ne permit pas de conforter ces résultats

(Mitchell et al 1996). Ce problème amena à conclure que, selon les modèles utilisés, le

FGF-2 ne constituait pas un facteur essentiel du processus de régénération. Malgré tout,

même si les FGFs ne semblent pas jouer un rôle critique dans la réparation musculaire, via

l’intermédiaire des cellules satellites, leurs actions dans ce mécanisme de régénération

pourraient être imputable à leur rôle dans la revascularisation musculaire (Lefaucheur et al

1996).

Quatre récepteurs pour les FGFs (1 à 4) ont été identifiés jusqu’à présent, chacun

ayant une affinité différente pour chaque FGF. Les récepteurs 1 et 4 sont les plus exprimés

sur les cellules satellites. En outre, le récepteur 1 est surexprimé lors de la phase

d’activation des cellules satellites en réponse à une exposition au FGF-1 (Sheehan & Allen

1999). Cet effet est exacerbé si les cellules sont simultanément exposées au HGF.

Toutefois, le récepteur 1 n’est pas un récepteur spécifique au muscle puisqu’il est présent

sur les fibroblastes.

95

1.2.3 Les récepteurs du HGF et des FGFs Les récepteurs aux FGFs et le récepteur au HGF (c-met), sont des récepteurs

transmembranaires à tyrosine kinase. Une fois leurs ligands respectifs liés, les récepteurs

dimérisés s’auto-phosphorylent et activent une cascade de signalisation complexe. FGFs et

HGF sont dépendants des héparanes sulfates qui facilitent l’activation de leurs récepteurs

ainsi que la transduction du signal (Rapraeger 2000). Les protéoglycans liés aux héparanes

sulfates (HSPG) se trouvent sur la surface des toutes les cellules et dans la matrice

extracellulaire de mammifères. Les syndécans (protéïnes de la famille des HSPGs) sont

particulièrement impliqués dans la signalisation cellulaire des FGFs et/ou du HGF.

L’identification des syndécans 3 et 4 à la surface des cellules satellites (quiescentes ou

actives) permet de supporter l’hypothèse d’une action des FGFs et/ou du HGF dans

l’activation initiale de ces cellules (Cornelison et al 2001). Néanmoins, aucune utilisation in

vivo de ces principes n’a été appliquée à la greffe de myoblastes.

1.2.4 Les facteurs de croissance de la famille des insulines (IGF) Les « Insuline-like Growth Factors » (IGF) de type 1 et 2 (IGF-1, IGF-2) sont

depuis longtemps référencés comme étant des régulateurs de la croissance et du

développement de nombreux tissus (Charge & Rudnicki 2004). Pourtant, ce n’est que

récemment que leurs interventions dans l’activité musculaire ont été mises en évidence. En

effet, la régulation paracrine et autocrine de ces hormones est fortement associée au

développement et à la réparation musculaire. L’IGF-1 et l’IGF-2 sont capables (in vitro)

d’augmenter la prolifération et la fusion des myoblastes (Charge & Rudnicki 2004). Ce qui

donne à ces hormones un avantage par rapport au HGF et au FGFs (qui n’augmentent que

la prolifération) quant à leur utilisation pour la TM. L’administration d’IGF-1 (localisée ou

non) a démontré dans de nombreux cas l’augmentation de la masse musculaire des souris

traitées (Adams & McCue 1998; Barton-Davis et al 1998; Chakravarthy et al 2000;

Coleman et al 1995; Musaro et al 2001). Cet effet hypertrophique de l’IGF-1 a été attribué

à l’activation de la prolifération des cellules satellites ainsi qu’à l’augmentation de la

synthèse protéique (Bark et al 1998; Barton-Davis et al 1999b; Musaro et al 1999;

Semsarian et al 1999). Lors de la régénération musculaire, les niveaux d’expression de

l’IGF-1 et de l’IGF-2 sont augmentés (Bakay et al 2002; Edwall et al 1989; Krishan &

Dhoot 1996). De plus, ces deux hormones semblent améliorer le phénotype musculaire de

96

souris âgées ou dystrophiques (Barton et al 2002). En effet, l’observation du muscle de

souris dystrophiques (mdx : mIGF+/+), exprimant fortement l’IGF-1 au niveau du muscle

strié squelettique, a révélé une augmentation du nombre et du volume des fibres

musculaires (Barton et al 2002). Par ailleurs, l’IGF-1 pourrait permettre d’améliorer la

régénération musculaire en augmentant la survie des myoblastes (Lawlor et al 2000; Lawlor

& Rotwein 2000). Néanmoins aucune étude tangible in vivo n’est venue confirmer cette

hypothèse (Charge & Rudnicki 2004). Enfin, les IGFs pourraient être impliqués dans les

processus de réinnervation qui surviennent après un dommage musculaire (Caroni &

Grandes 1990; Vergani et al 1998). Ainsi, bien que le rôle des IGFs dans la régénération

musculaire soit évident, l’ensemble des mécanismes qui le régissent reste à définir. Par

exemple, toutes les IGFs ne semblent pas intervenir au même moment du processus de

réparation d’un muscle lésé (Charge & Rudnicki 2004). Une étude intéressante a été

effectuée en utilisant de l’IGF-1 dans le contexte d’une TM. Cette étude démontrait

l’efficacité de l’administration d’IGF-1 sur la greffe de myoblastes dans des souris mdx

ayant subi un cryodommage. Néanmoins, cette efficacité n’était visible que si les muscles

des souris étaient irradiés avant la transplantation (Brimah et al 2004). Ce qui ne serait pas

envisageable pour un patient dystrophique.

1.2.5 La famille des molécules appartenant au TGF-β Les facteurs de croissance appartenant à la famille du TGF-β sont des cytokines

essentielles pour la régulation de la croissance cellulaire (Chen et al 2002). Ces facteurs

sont depuis longtemps connus pour leur activité inhibitrice de la prolifération et de la

différenciation des myoblastes (Lefaucheur et al 1996; Lefaucheur & Sebille 1995b).

Cependant leurs interventions au niveau de la régénération musculaire restent confuses et

complexes (Charge & Rudnicki 2004). Plus récemment, la myostatine (MSTN) a été

identifiée comme nouveau membre de la famille des TGFs (McPherron et al 1997). Cette

molécule a un effet inhibiteur sur la croissance musculaire (McPherron et al 1997). En

effet, des souris mutées et déficientes pour la MSTN exhibaient une hypertrophie et une

hyperplasie musculaire (McPherron et al 1997). Cet effet fut démontré par la suite sur

d’autres modèles murins (302, 360) et étendu à d’autres espèces, par l’identification de

mutations à l’intérieur du gène de la MSTN. Toutes ces espèces avaient en commun une

97

musculature très développée (Grobet et al 1997; Karim et al 2000; McPherron & Lee

1997). Le récepteur de la MSTN est le Act RIIB (activin receptor type II) (Lee &

McPherron 2001). Des études in vitro ont démontré que l’expression de la MSTN était

élevée pendant les stades de différenciation et de fusion (Kocamis et al 2001). Par ailleurs,

d’autres études ont montré qu’à hautes concentrations, la MSTN inhibait la prolifération

d’une lignée de myoblastes de souris (cellules C2C12) (253, 254, 309). D’autres études in

vivo ont révélé que la production endogène de MSTN était responsable de l’inhibition de la

prolifération des cellules satellites (Kocamis et al 2001; Lee & McPherron 2001). Pour

l’instant la littérature sur cette molécule et sur les mécanismes de son activité sont

particulièrement en croissance. Il reste beaucoup à apprendre sur cette molécule

extraordinaire dont l’inhibition provoque une transformation de la musculature qui fait un

peu penser à « l’incroyable Hulk ». Des études récentes réalisées dans notre laboratoire

(Benabdallah et al 2005) indique qu’une inhibition de la MSTN augmente le succès d’une

greffe de myoblastes.

1.2.6 Le facteur inhibiteur de leucémie (LIF) Le « Leukemia Inhibitory Factor » (LIF) et a des activités liées à la régénération

musculaire. Le LIF stimule (in vitro) la prolifération des myoblastes via des mécanismes

cellulaires qui ne modifient pas la différenciation et la fusion des myoblastes (17, 44, 294,

320). Cet effet in vitro du LIF, sur la prolifération des myoblastes, semble impliqué

l’activation de la voie de signalisation des JAK2-STAT3 (Spangenburg & Booth 2002).

L’administration de LIF in vivo au site d’un dommage musculaire ou bien dans un muscle

de souris mdx permet d’augmenter le processus de régénération musculaire. Cette

conséquence visible est due à l’augmentation de la prolifération des myoblastes ainsi qu’à

l’augmentation de la taille des fibres réparées (Kurek et al 1997). En outre, l’utilisation de

souris déficientes en LIF a permis de démontrer que les bris musculaires chez ces souris

étaient nettement moins bien réparés en comparaison aux mêmes dommages réalisés chez

une souris de phénotype sauvage (Kurek et al 1997). De plus, l’administration de LIF aux

souris déficientes permettait de restaurer un niveau standard de régénération musculaire

(Kurek et al 1997). Enfin, il a été observé, chez l’homme et chez la souris, qu’après un bris

musculaire, le niveau de transcription de LIF était sensiblement augmenté (Reardon et al

98

2000). Bien que l’IL-6 ait beaucoup d’homologie avec le LIF, l’administration d’IL-6 ne

semble pas moduler la régénération musculaire (Kami & Senba 1998; Kurek et al 1996).

2 Article I : Le 1,α25-dihydroxycholécalciférol augmente le succès des transplantations de myoblastes humains chez la souris SCID.

Le premier article de cette thèse introduit un nouveau facteur susceptible

d’améliorer la transplantation des myoblastes : la forme active de la vitamine D3. Pour

permettre cette amélioration, cette molécule se doit d’augmenter la prolifération et/ou la

différenciation et/ou le niveau d’apoptose des myoblastes transplantés. J’ai contribué à

toutes les expériences réalisées et rédigé l’article. Manaf Bouchentouf a effetué la mise au

point de la quantification de mortalité et de prolifération des myoblastes in vivo. Philippe

Mills a effetué la mise au point du test de prolifération in vitro. Jean-François Lafrenière a

contribué à la bonne rédaction de cet article et à sa correction. Cet article a été accepté dans

la revue Cell Transplantation (Stephan et al 2007).

2.1 Résumé La transplantation de myoblastes humains constitue une approche thérapeutique

intéressante pour les traumatismes musculaires et les myopathies. Quelques études

antérieures ont démontré que la 1,25-dihydroxyvitamine-D3 (1,25-D3) agissait directement

sur les myoblastes en régulant leur prolifération et leur fusion. Également, la vitamine 1,25-

D3 semble impliquée dans la régulation de l’apoptose de certains autres types cellulaires et

pourrait ainsi contribuer à protéger les myoblastes humains transplantés. De ce fait, nous

avons étudié si la vitamine 1,25-D3 nous permettait d’augmenter le succès de nos greffes

de myoblastes humains. L’effet de cette vitamine sur la prolifération, la fusion et la survie

des myoblastes humains a d’abord était mesuré in vitro. Afin de déterminer par la suite

l’effet in vivo de cette vitamine, des myoblastes humains ont été greffés dans le Tibialis

anterior de souris SCID traitées ou non avec la vitamine 1,25-D3. Le succès de greffe, la

prolifération ainsi que la survie des cellules transplantées ont été évalués. La vitamine 1,25-

D3 augmente la prolifération et la fusion des myoblastes humains, in vitro et in vivo.

Cependant, cette vitamine ne protège les myoblastes ni de divers facteurs pro-apoptotiques

(in vitro) ni de la mort cellulaire qui survient lors de la période post-tranplantatoire.

99

Néanmoins, la vitamine 1,25-D3 permet d’augmenter le succès des greffes puisque le

nombre de fibres exprimant la dystrophine humaine a significativement augmenté chez les

souris traitées. Ce résultat peut être partiellement attribuable à l’augmentation de la

prolifération et de la diffenciation des myoblastes transplantés. Ainsi, l’administration de

cette vitamine pourrait contribuer à augmenter le potentiel thérapeutique de la

transplantation de myoblastes.

2.2 Abstract Human muscle precursor cell (hMPC) transplantation is a potential therapy for

severe muscle trauma or myopathies. Some previous studies demonstrated that 1, 25-

dihydroxyvitamin-D3 (1,25-D3) acted directly on myoblasts, regulating their proliferation

and fusion. The 1,25-D3 is also involved in apoptosis modulation of other cell types and

may thus contribute to protect the transplanted hMPCs. We have therefore investigated

whether 1,25-D3 could improve the hMPC graft success. The 1,25-D3 effects on hMPC

proliferation, fusion and survival were initially monitored in vitro. HMPCs were also

grafted in the Tibialis anterior of SCID mice treated or not with 1,25-D3 to determine its in

vivo effect. Graft success, proliferation and viability of transplanted hMPCs were evaluated.

The 1,25-D3 enhanced proliferation and fusion of hMPCs in vitro and in vivo. However,

1,25-D3 did not protect hMPCs from various pro-apoptotic factors (in vitro) or during the

early post-transplantation period. The 1,25-D3 enhanced hMPC graft success since the

number of muscle fibers expressing human dystrophin was significantly increased in the

TA sections of 1,25-D3 treated mice (166.75 + 20.64) compared to the control mice (97.5 +

16.58). This result could be partly attributed to the improvement of the proliferation and

differentiation of hMPCs in presence of 1,25-D3. Thus, 1,25-D3 administration could

improve the clinical potential of hMPC transplantation currently developed for muscle

trauma or myopathies.

100

3 Title : 1,25-dihydroxyvitamin D3 increases the transplantation success of human muscle precursor cells in SCID mice.

3.1 Introduction Human muscle precursor cell (hMPC) transplantation is a promising clinical

strategy to repair severe muscle injuries (Holzer et al 2005), prevent cardiac insufficiency

(Suzuki et al 2001; Vilquin & Marolleau 2004) and delay the problems of inherited

myopathies (Skuk 2004). Briefly, hMPC transplantation consists of injecting in host muscle

hMPCs harvested from a healthy donor or from the host himself. In the case of hereditary

myopathies, the hMPC transplantation permits genetic complementation (as a vehicle of

normal genes) (Skuk & Tremblay 2003). As an example, in Duchenne muscular dystrophy

(DMD) patients, donor hMPCs fused with damaged host muscle fibers, introduce their

nuclei containing the normal dystrophin gene and thus restored dystrophin expression

(Brussee et al 1998; Skuk 2004). However, the graft success is limited due to an important

death of cells (70%) following their injection (Skuk & Tremblay 2003). It is well

established that following a muscle injury, the muscular regeneration relies on the

proliferation and the differentiation of muscle precursor cells (MPCs) (Charge & Rudnicki

2004). Thus, improvement of transplanted hMPC proliferation and/or fusion with host

fibers may be a promising strategy to improve hMPC transplantation success (Lafreniere et

al 2006; Skuk & Tremblay 2003).

It has been demonstrated that basic fibroblast growth factor (bFGF) or insulin like

growth factor type I (IGF-I) modulated the differentiation or the proliferation of MPCs

(Allen & Boxhorn 1989). Moreover, some studies reported that IGF-I and/or bFGF

improved MPC graft success (Brimah et al 2004; Kinoshita et al 1995b). However, bFGF

stimulated MPC proliferation but depressed their differentiation. In contrast, IGF-I

demonstrated a pronounced stimulation of differentiation but only stimulated proliferation

to a small extent (Allen & Boxhorn 1989; Brimah et al 2004). Even if the combination of

these two factors produced encouraging results for hMPC transplantation (Allen &

Boxhorn 1989; Brimah et al 2004), it is still of interest to find other agents improving

hMPC proliferation and fusion.

101 Classically, the hormonally active vitamin D3, 1,25α-dihydroxyvitamin D3 (1,25-

D3) interacts with its receptor [vitamin D receptor (VDR)] to induce or repress the

expression of a variety of genes (Kutuzova & Deluca 2004; White 2004), and thereby carry

out many of the physiological actions of vitamin D. In addition, 1,25-D3 induces, non-

transcriptional responses involving activation of transmembrane signal transduction

pathways via a putative novel membrane receptor. Conversely, the VDR might also

participate in hormone-induced non-genomic responses (Boland et al 2005; Capiati et al

2002). Thus, it has been demonstrated that 1,25-D3, via a modulation of protein tyrosine

phosphorylation, stimulates proliferation of skeletal muscle myoblasts and promotes their

differentiation in myotubes (Bellido et al 1993; Boland et al 2005; Boland et al 1995;

Boland et al 1985; Capiati et al 2002; Capiati et al 1999). Furthermore, the presence of

VDR has been previously detected in human skeletal muscle cells and tissues (Bischoff-

Ferrari et al 2004; Bischoff et al 2001; Costa et al 1986; Demay 2003). Thus, the 1,25-D3

could also have proliferative and differentiative effects on hMPCs.

Additionally, 1,25-D3 is commonly known to be involved in regulation of cell

apoptosis (Boland et al 2005; Riachy et al 2002). Interestingly, a significant inflammatory

process, involving pro-inflammatory cytokines and oxidative stress, is associated with

hMPC transplantation. This inflammatory environment plays a crucial role in the early

death of donor hMPCs (Skuk et al 2002a).

The goal of the present study was to determine whether 1,25-D3 promotes hMPC

transplantation success in the Tibilalis anterior (TA) of SCID mice. We have investigated

whether 1,25-D3 increased hMPC proliferation and differentiation in vitro and protected

them from cell death induced by cytokines and oxidative stress after the in vivo

transplantation. Finally, hMPC transplantation success was monitored in SCID mice treated

with 1,25-D3. Proliferation, differentiation and viability of transplanted hMPCs were

analyzed to understand the mechanisms, which could be involved in this observed

enhancement of graft success.

102

3.2 Materials and Methods

3.2.1 Human muscle precursor cell (hMPC) culture HMPCs were obtained from a postmortem biopsy of a 13-month-old boy (Huard et

al 1994b). Briefly, myogenic cells were released from minced fragments by enzymatic

dissociation. After 1 h of incubation in collagenase (600 UI/ml; Sigma-Aldrich, St. Louis,

Missouri, USA), cells were then incubated for 30 min in Hank's buffer salt solution (HBSS)

including 0.1% trypsin and 0.02% EDTA w/v (Gibco). HMPCs were cultured in modified

MCDB120 medium (Hyclone, Logan, UT, USA) complemented with 10% fetal bovine

serum (FBS, Invitrogen, Burlington, Ontario, Canada), 10 ng/mL of basic fibroblast growth

factor (Strathmann Biotec AG, Hamburg, Germany), 100 units/mL of penicillin, and 100

µg/mL of streptomycin (Invitrogen). Cells were always kept below 80% confluence.

For all the in vitro experiences, the 1,25-D3 (17936, Sigma) was reconstituted (1

mg/mL) in ethanol. This stock of solution was then diluted in culture media to obtain the

concentration required. The same amount of ethanol as in the 1,25-D3 culture medium was

added to all the control culture media.

3.2.2 Fusion assay This method has been described previously by Lafreniere et al. (Lafreniere et al

2006). Briefly, the hMPC differentiation was evaluated by determining a fusion index,

which represents the percentage of nuclei included in myotubes (i.e., cells with at least than

3 nuclei). To measure this fusion rate of the hMPCs in presence of 1,25-D3, 1 x 105 cells

were plated in 3 x 6-well Costar plates When 50–60% confluence was reached, the cells

were rinsed with HBSS and incubated in a differentiation medium (serum free culture

medium completed with 10 µg/mL insulin), which contained or not pharmacological (1.10-

6 M) or physiological (1.10-8 M) 1,25-D3 concentrations (Riachy et al 2002). The

differentiation medium was changed every 48 h, and cells were fixed after 4.5 days using

4% paraformaldehyde 0.01 M phosphate buffer. Fixed cell nuclei were stained with DAPI

(4′, 6-diamidino-2-phenylindole) and observed with a UV lamp microscope using the

appropriate filter (magnification x 10). At the same time, myotubes were identified with

standard light microscopy (magnification x 10). Three pictures were taken for each well

103

with both microscopy methods. Approximately 800 nuclei were manually counted per

picture (18 pictures per group).

3.2.3 In vitro proliferation assay To measure 1,25-D3 effect on hMPC proliferation rate, 50 000 cells/well were

initially plated in 6-wells plates (Corning Inc., MA, USA). After a 24 hours incubation, the

antibiotic free culture medium was added with or without 1.10-6 or 1.10-8 M 1,25-D3.

Media were changed 48 hours later. To determine cell population, 6 wells were harvested

and separately counted with a haematocytometer for each time point (0, 48, 96 hours).

3.2.4 In vitro cellular mortality assay Several concentrations of staurosporin, TNF-α (Sigma) and glucose oxydase (Gox)

(Sigma) were tested in preliminary experiments to induce the highest cell mortality

(apoptosis + necrosis). The concentrations and the durations that were used to induce cell

death were as follows: staurosporin (2 µM during 16 hours), TNF-α (30 ng/mL during 24

hours) and Gox (0.1 U/mL during 24 hours) (Bouchentouf et al 2004).

HMPCs were cultured during 48 hours (5% CO2, 37 °C) in T25 flasks (Corning,

Plaza Corning, NY, USA) containing complete culture medium in presence or not of a

pharmacological concentration of 1,25-D3 (1.10-6M). Following 1,25-D3 pretreatment,

cells were harvested, washed with Hank’s balanced salt solution (HBSS, Sigma) and plated

at 1.5 x 106 cells/flask with fresh complete medium containing either staurosporin (2 µM

during 16 hours), TNF-α (30 ng/mL during 24 hours) or Gox (0.1 U/mL during 24 hours).

Apoptosis was detected 24 hours later by flow cytometry using the Hoechst-

33342/Propidium Iodide (PI) (Sigma, Aldrich, St-Louis, MO, USA) labeling method

described by Shah et al (Shah et al 1996).

3.2.5 Hoechst/PI labeling protocol HMPCs were washed with HBSS and stained in 50 µL of PI (20 µg/mL) during 30

min at 4ºC in the dark. The suspension was fixed with 25% ethanol solution for 5 min.

Hoechst 33342 solution (25 µL, 112 µg/mL) was then added for 1 hour at 4ºC in the dark.

The labeling of the cells was determined by FACS.

104

3.2.6 Animals and conditioning Female SCID mice, 6 to 8 weeks old (Charles River laboratory International,

Wilmington, MA, USA), were used as hosts for the transplantation of hMPCs. 1,25-D3

(Sigma) was dissolved in ethanol 100 % (1 mg/mL) and then diluted in corn oil.

Twelve mice were administrated 1,25-D3 orally (5 µg/kg p.o three times per week),

from day –7 to day 30 relative to the time of hMPC transplantation. This dose of 1,25-D3

has been selected in conformity with a protocol reporting a physiological effect in mice,

without sign of hypercalcaemia (Cantorna et al 1998b; Gregori et al 2001). Twelve control

mice received vehicle only. Six of these control SCID mice and six of the 1,25-D3 treated

mice were injected intraperitoneally with a daily dose of FK506 during a 30 days period

post-transplantation (2.5 mg/kg/day, Fujisawa Pharmaceutical Co. ltd, Osaka, Japan).

All experiments were conducted in accordance of the Laboratory Animal Care and

Use Ethics Committee of Laval University.

3.2.7 Graft success evaluation Mice were injected in both TAs (8-10 sites of injections) with 1 x 106 hMPCs

suspended in 10 µL of HBSS using a glass micro-pipette (Drummond Scientific Co.,

Broomall, PA, USA). Mice were sacrificed after 4 weeks and grafted TAs were harvested.

TAs were then placed in a 30% sucrose solution, embedded in OCT (Miles Inc., Elkhart,

IN), frozen in liquid nitrogen and serially sectioned at 12 µm using a Microm cryostat.

Cryostat sections were incubated with a mouse anti-human-dystrophin antibody

(Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle, UK) followed by a goat anti-mouse IgG biotin-

conjugated (Dakocytomation, Mississauga, Ont., Canada) and with a streptavidin-Cy3

conjugated (Sigma). Non-specific binding sites were blocked for all immuno-histochemical

detections with FBS 10% in PBS. Human dystrophin staining was observed with a UV

lamp microscope using the appropriate filter.

The number of human dystrophin positive fibers was determined for each TA

section. The mean of the 3 best sections was calculated. Thus, to evaluate the graft success,

105

the number of human dystrophin positive fibers was represented by the mean obtained for

all the TAs of a group.

3.2.8 In vivo cellular mortality and proliferation assay

3.2.8.1 Transplantation of male radioactively labeled MPCs HMPCs were cultured during 48 hours before the transplantation in MCDB120

containing 0.25 µCi/mL [methyl-14C] thymidine (Amersham, Montreal, QC,Canada).

HMPCs (1 x 106 cells) were grafted as described above in female SCID mice treated or not

with 1,25-D3. Three control mice and three 1,25-D3 treated mice were sacrificed for each

time point (T0, T48, T72, T96 hours). Both grafted TAs were harvested at the indicated

time points and snap-frozen in liquid nitrogen. The muscles were harvested and the DNA

was extracted using the Qiagen DNA minikit (Qiagen, Mississauga, Ontario, CA).

3.2.8.2 Quantification of cell death using radioactive labeling To measure the rapid cell death following transplantation, the amount of radio-

activity was measured on the DNA extracts using a liquid scintillation counter (Mod,

Wallac 1409, Woodbridge, Ontario, Canada). The percentage of radio-activity at all time

points and conditions and were calculated relative to the T0 value.

3.2.8.3 Evaluation of MPC survival and proliferation To evaluate the survival and the proliferation of the transplanted hMPCs, the

presence of human Y-specific DNA was determined by real-time PCR (Rotor-gene 3000,

Sydney, Australia) in the same DNA extracts used to quantify cell death by radioactivity. A

standard curve was obtained by PCR amplification of DNA extracted from 12 female SCID

mouse muscles transplanted with various numbers of human male myoblasts (0.25, 0.5, 1.0

and 2.0 x 106 cells, 3 mice for each cell number). The standard curve was obtained by

analyzing the SYBRgreen DNA incorporation at 32 cycles (Step 1 at 94°C during 30 sec,

Step 2 at 57°C during 30 sec and Step 3 at 72°C during 20 sec) using human Y

chromosome specific primers (sens: 5’-CGTCAGACGACCCATGAA-3’ and anti-sens 5’-

CTCGGTGCATGGCCTGTA-3’). No Y-specific DNA was detected in the DNA extracted

of female SCID mouse muscles. The PCR amplification results obtained in different hMPC

106

transplanted muscles was compared to the standard curve to determine the quantity of

living cells.

The proliferation of transplanted hMPCs quantified by the proliferation index: i.e.,

the percentage of Y-specific DNA divided by the mean percentage of radio-labeled DNA

measured in the same DNA extract. The mean proliferation index was then calculated for

each group of SCID mice.

3.2.9 Statistical analysis Data were expressed as the means + SD of each experimental group. Differences

among groups were statistically analyzed using a one way ANOVA test. A value of p<0.05

was considered significant.

107

3.3 Results

3.3.1 In vitro Fusion Assay A fusion assay was used to evaluate the effect of 1,25-D3 on hMPC differentiation

rate. Cells were cultured 5 days in presence or not of two different concentrations of 1,25-

D3 (1.10-6M or 1.10-8M). To identify the fused nuclei, light microscopy and DAPI

coloration pictures were merged for each experimental condition. The fusion index

represents the percentage of nuclei in myotubes (cells with at least 3 nuclei). In this

experimental context, untreated hMPCs were partially differentiated (49.4 + 1.45%, figure

15). The fusion index was increased (p<0.001) for both 1,25-D3 concentrations (55.34 +

1.44% for 1.10-8M and 61.54 + 1.7% for 1.10-6M). Moreover, the fusion index for the

pharmacological 1,25-D3 concentration (1.10-6M) was significantly enhanced compared to

the physiological 1,25-D3 concentration (p<0.001).

3.3.2 In vitro Proliferation Assay To determine whether 1,25-D3 enhances hMPC proliferation, a basic cell count was

performed. HMPCs were incubated in MCDB120 culture medium complemented with

1.10-6M or 1.10-8M 1,25-D3 and cell populations were evaluated at 0, 48 and 96 hours. As

shown in figure 16, the hMPC population doubled in approximately 35 to 40 hours.

Interestingly, the proliferation of hMPCs in presence of 1.10-6M 1,25-D3 was enhanced at

48 and 96 hours compared to the control (p<0.001). For the physiological dose, 1.10-8M

1,25-D3, the proliferation curve of hMPCs was comparable to the control. The results were

also confirmed at 48 hours by a fluorescence-based proliferation assay (Cyquant, data not

shown).

3.3.3 In vitro Mortality Assay HMPCs were cultured 48 hours in presence or not of 1,25-D3 (1.10-6M). The

medium was then removed and cells were cultivated 24 hours with staurosporin, TNF-α or

Gox. Apoptosis was detected by flow cytometry using the Hoechst-PI (figure 17). For the

different pro-apoptotic treatments, the mean level of hMPC mortality without 1,25-D3 was

important (82.83 + 0.56% for the staurosporin, 86.29 + 0.86% for the TNF-α and

108

84.17 + 0.47% for the Gox). These levels of hMPC mortality induced by the pro-apoptotic

factors were not significantly decreased in presence of 1,25-D3 (87.03 + 1.71% for the

staurosporin, 91.24 + 1.72% for the TNF-α and 83.73 + 0.56% for the Gox). Thus, hMPCs

pre-treated with 1,25-D3 are not protected from cell death induced by different pro-

apoptotic factors.

3.3.4 Graft Success SCID mice were transplanted with 1 x 106 hMPCs. Half of these mice received

1,25-D3 orally from day –7 to day 30 relative to the time of hMPC transplantation. In

addition, half of the 1,25-D3 treated or control mice were injected daily with FK506 (as

mentioned in methods) starting the day of hMPC transplantation. TAs of all mice were

harvested one month after the graft. An immunohisto-chemical staining was performed to

observe the presence of human dystrophin positive fibers resulting from the fusion of the

transplanted hMPCs with the host mouse muscle fibers. As shown in figure 18A, the mean

number of muscle fibers expressing human dystrophin was significantly increased

(p<0.001) in the TA sections of 1,25-D3 treated mice (166.75 + 20.64), compared to the

control mice (97.5 + 16.58). Representative pictures of untreated or 1,25-D3 treated TA

sections are shown in the figure 18B.

A sustained FK506 immunosuppressive treatment is currently associated with

hMPC transplantation to Duchenne muscular dystrophy patients to avoid graft rejection

(Camirand et al 2004; Skuk et al 2004). We have assessed whether this immunosuppressive

conditioning has adverse effects on the 1,25-D3 treatment (figure 19). The FK506

administration to the 1,25-D3 treated mice did not alter the graft success improvement

described above. The mean number of human muscle positive fibers in mice that received

both FK506 and 1,25-D3 remained elevated (166.16 + 21.18) compare to mice that

received no drug (103 + 18.32) or only FK506 (92 + 14.03).

3.3.5 In vivo Mortality and Proliferation Radioactively labeled male hMPCs were transplanted in female SCID mice to

follow their death and proliferation. Half of these SCID mice transplanted with hMPCs

were administered 1,25-D3 orally (5 μg/kg three times per week). TAs were harvested at 0,

109

48, 72 and 96 hours after hMPC transplantation. Radio-activity and the presence of hMPC

Y-specific DNA within each TA were measured in the same DNA extracts and expressed

as percentages of the T0 value (respectively black and white columns in figure 20A). The

percentage of radio-activity post-transplantation initially dropped rapidly to 30% at 48

hours and then decreased more slowly to 7% at 96 hours as shown in figure 6A (black

bars). This lost of radioactivity is due to the death of the transplanted cells as previously

reported by our group (Skuk et al 2002a; Skuk et al 2003). The percentage of hMPC Y-

specific DNA (white bars) also decreased at 48, 72 and 96 hours compared to T0. However,

the percentage of hMPC Y-specific DNA was always higher than the percentage of radio-

activity (figure 20A) because the lost of male DNA due to cell death was partially

compensated by cell proliferation. For each time point, there was no significant difference

in the percentage of radio-activity between the control and the 1,25-D3 treated mice.

Interestingly, at 96 hours, the percentage of hMPC Y-specific DNA was significantly

higher (p<0.01) in 1,25-D3 treated mice (33.25 + 1.67) than in control mice (26.36 + 2.26).

To determine the proliferation of viable hMPCs, an index of hMPC proliferation was

calculated by dividing the percentage of hMPC Y-specific DNA by the percentage of radio-

activity for the same muscle (figure 20B). Interestingly, we observed that hMPCs

proliferated constantly, in 1,25-D3 treated as well as in control mice, since the proliferation

index increased progressively. Moreover, this proliferation index being around 2, at 48

hours after the transplantation and around 4, at 96 hours after the transplantation, the hMPC

population doubling time in vivo (48 hours) was slightly higher than the doubling time

observed in vitro (36-40 hours in figure 16). Moreover, the proliferation index in mice

treated with 1,25-D3 was significantly increased at T96 hours (5.15 + 0.33, p<0.001)

compared to the control group at the same time (3.84 + 0.26).

110

3.4 Discussion

3.4.1 MPC transplantation success is reduced by cell death The transplantation of hMPCs is a promising treatment to increase the repair of

damaged muscles and to delay the severe problems of inherited myopathies. The originality

of this approach is that the in vivo proliferation of hMPCs, before their fusion, may

increase the number of cells able to either fuse later with damaged host muscle fibers or

with each others to form neo-fibers resulting exclusively from the fusion of transplanted

cells (Skuk et al 2004). Moreover, recent results obtained by our group indicated that MPCs

participate in the repair of damaged fibers more than two weeks after their transplantation

(Bouchentouf et al 2006). Thus hMPC transplantation could permit to treat severe muscle

injuries. It has been demonstrated in SCID mice that hMPCs participated to the muscle

regeneration with a high degree of efficacy (Huard et al 1994b). Furthermore a recent

clinical trial confirmed that hMPC transplantation could restore dystrophin expression in

DMD patients (Skuk et al 2004; Skuk D 2005). However, one of the main problems facing

this therapy is the high loss of about 60-70% of the grafted cells in the first 48 hours post-

transplantation (figure 20A, black and white columns). This observation confirms previous

results obtained in our laboratory or by other teams (Bouchentouf et al 2004; El Fahime et

al 2003; Fan et al 1996; Skuk et al 2002a; Skuk et al 2003; Suzuki et al 2004).

Nevertheless, this important drop of viable cells was partially balanced by the proliferation

of transplanted cells (Skuk et al 2003). This result was confirmed (figure 20A) with the

partial compensation by cell proliferation of the lost of male DNA due to cell death. In

addition, it has been reported that an enhancement of the MPC fusion could contribute to

the improvement of the graft success (Brimah et al 2004; Lafreniere et al 2006). Therefore

it seems evident, that to promote effectively muscle regeneration, hMPCs must encounter

an environment that improves their proliferation, fusion and survival.

3.4.2 1,25-D3 signalization pathways in skeletal muscle cells There is evidence that MAPK cascades are involved in the regulation of myogenesis

(Wu et al 2000). 1,25-D3 stimulates the proliferation of myoblasts and their differentiation

into myotubes (Boland et al 2005), and activation of tyrosine phosphorylation pathways

111

mediates its effects on muscle growth. In proliferating myoblasts, 1,25-D3 rapidly

promotes tyrosine phosphorylation of ERK-1/2, PLCγ (Morelli et al 2000). Ras, c-Src, Raf-

1 and MAPKK (also known as MEK) participate in the activation of ERK-1/2 by 1,25-D3

(Buitrago et al 2003; Morelli et al 2001); moreover, in muscle cells, the ERK cascade is

positively regulated by PKCa through Raf-1 activation (Buitrago et al 2003; Morelli et al

2001), and by Ca2C and calmodulin-dependent protein kinase II at the level of c-Src

(Buitrago et al 2003; Morelli et al 2001). Through these mechanisms, 1,25-D3 causes

translocation of ERK-1/2 from the cytoplasm to the nucleus in an active phosphorylated

form and induces the synthesis of the growth-related protein c-myc and stimulation of

muscle cell proliferation (Buitrago et al 2001). The signaling pathways involved in the

differentiation of skeletal muscle cells remain to be established. Nevertheless, the relative

contribution of ERK-1/2, p38, and JNK-1/2 through reorganization of actin cytoskeleton

could participate in muscle cell differentiation (Buitrago et al 2006).

3.4.3 1,25-D3 enhanced hMPC proliferation and fusion We thus initially investigated the 1,25-D3 effect on hMPC proliferation and fusion.

Several studies demonstrated that 1,25-D3 enhanced the proliferation and the

differentiation of chicken embryonic myoblasts (Boland 1986; Boland et al 1995; Boland et

al 1985; Capiati et al 1999; Zanello et al 1997). In accordance with these results, we

observed, that a 1.10-6M 1,25-D3 clearly enhanced the in vitro proliferation of hMPCs

(figure 16). Moreover, we demonstrated that 1,25-D3 improved hMPC fusion relative to the

untreated control (figure 15). As expected, the in vivo proliferation of grafted hMPCs was

similarly increased, compared to the control group, at 96 hours post-transplantation (figure

20A, white columns, and 20B). Thus, we conclude that the improvement of hMPC

transplantation observed (figure 18A and 18B), could partially be due to the proliferative

effect of 1,25-D3. The increased hMPC differentiation induced by 1,25-D3 was also

demonstrated in vitro (figure 15). This 1,25-D3 effect could also be responsible in part for

the improved graft success. However, it remains presently difficult to evaluate, whether it is

the 1,25-D3 effect on proliferation or on differentiation, which plays the most important

role in the increased graft success.

112

3.4.4 Possible interaction of 1,25-D3 with the specific and innate immunities

Several previous studies reported that 1,25-D3 also modulates the immune

peripheral tolerance (Adorini et al 2003; Berer et al 2000; Bhalla et al 1984; Bouillon et al

1995; Gregori et al 2001; Gregori et al 2002; Penna & Adorini 2000; Rigby et al 1987).

SCID mice were thus used in the present study to exclude the possibility that the improved

graft success involved a modulation of the specific immune response.

A significant inflammatory process is associated with hMPC transplantation and

there are some significant evidences concerning the modulation of the innate immunity by

1,25-D3 (Cantorna et al 1998b; Hullett et al 1998). In the early post-transplantation period,

a high hMPC mortality was observed in control mice as well as in 1,25-D3 treated mice

(figure 20A). This result suggests that innate immunity modulation by 1,25-D3 should not

be involved in the enhanced hMPC graft success.

Clinical trials based on allo-transplantation of hMPCs currently used FK506

immunosuppression (Skuk et al 2004; Skuk D 2005). Some studies reported a positive

synergy between FK506 and 1,25-D3 (Mathieu et al 1994; van Etten et al 2000). As

described in figure 19, the number of human dystrophin positive fibers was unchanged in

1,25-D3/FK506 treated mice compared with mice treated with 1,25-D3 alone. This result

suggests that FK506 administration to DMD patients will not reduce the improvement of

hMPC graft success produced by 1,25-D3 treatment. Additionally, 1,25-D3 and its analogs

seems to be potent dose-reducing drugs for immunosuppressors such as FK506 (van Etten

et al 2000), making them potentially interesting for clinical use in hMPC transplantation.

3.4.5 1,25-D3 did not reduce apoptosis In the present study, we also investigated whether 1,25-D3 protects hMPCs during

the early post-transplantation period. The mechanisms involved in the early death of

transplanted cells remain unclear (Fan et al 1996; Skuk et al 2002a; Skuk et al 2003).

However, some studies demonstrated that the myoblast graft success could be improved by

preserving them from diverse pro-apoptotic factors (Bouchentouf et al 2004; El Fahime et

al 2003). As observed in our in vitro experiments (figure 17), hMPCs pre-treated with 1,25-

D3 were not protected from cell death induced by different pro-apoptotic factors such as

113

TNF-α, oxidative stress or staurosporin. Each of these factors are involved in diverse

apoptotic signaling pathways, which should be participating in vivo in the early death of

transplanted cells (Bouchentouf et al 2004). Thus, as expected from the in vitro experiment

(figure 17), 1,25-D3 administration did not reduce the death of the cells transplanted in

muscles in vivo (figure 20A, black columns). Indeed a similar drop of the percentage of

hMPC radio-activity was observed in the 1,25-D3 treated and in the control mice.

Nevertheless, hMPC graft success was significantly increased in 1,25-D3 treated mice

relative to control mice (figure 18A and 18B). Thus 1,25-D3 did not improve the success of

hMPC transplantation by a reduction of early hMPC death.

3.5 Conclusion This study demonstrates for the first time that 1,25-D3 increases hMPC proliferation

and fusion. This property was observed in vitro for the fusion and in vitro/in vivo for the

proliferation. This proliferative and differentiative effect could partially contribute to

hMPC transplantation improvement observed in the 1,25-D3 treated mice. We have also

established that 1,25-D3 treatment does not, however, protect the grafted hMPCs from the

high mortality, which occurs in the early post-transplantation period. Thus 1,25-D3 did not

increase the MPC graft success through a mechanism involving a reduction of early cell

death. Further investigations should be done to understand which other 1,25-D3 properties

and by which signaling pathways this vitamin could be involved in the improvement of

hMPC transplantation. Nevertheless, in regard of the results obtained in this study, we

conclude that 1,25-D3 or its analogs (Amuchastegui et al 2005) could be good candidates to

improve therapies based on hMPC transplantation.

We thank AFM (Association Française contre les Myopathies) for the financial support of this research project.

114

Figure 17 : 1,25-D3 increases hMPC differentiation

HMPCs were allowed to differentiate for 5 days in modified MCDB120 supplemented with different concentrations of 1,25-D3 (10-6M or 10-8M) or without 1,25-D3 (Control). One 6 wells plate was used for each condition. The fusion index is the percentage of nuclei in myotubes (cells with at least 3 nuclei) relative to the total number of nuclei. This fusion index was established for each group by counting approximately 800 nuclei per picture (3 pictures per well for each of the 6 wells of each group). The * represents a p<0.001 and δ a p<0.001, relative respectively to the control and to the 10-8M group.

115

Figure 18 : 1,25-D3 enhances hMPC proliferation

HMPCs were initially plated during 24 hours in five 6 well plates containing modified MCDB120 proliferation medium. HMPCs were then harvested separately from each well of one of the 6 well plates and counted to establish the T0 values. 10-8M and 10-6M 1,25-D3 were then added to each of the wells of 2 plates for each concentration. Cells from 6 wells for each 1,25-D3 concentration were harvested and separately counted with a haematocytometer at 48 and 96 hours. This figure represents the mean number of cells counted for each group. The * represents a p<0.001 and δ a p<0.001, relative respectively to the control and to the 10-8M group.

116

Figure 19 : The 1,25-D3 does not reduce the hMPC mortality induced by staurosporin, TNF-α or glucose oxydase.

HMPCs were placed during 48 hours in culture medium supplemented (white bars) or not (black bars) with 1,25-D3 (1.10-6M). Following 1,25-D3 pretreatment, cells were harvested, washed and plated. Finally cells were cultured 24 hours in the absence (Control) or with 2 µM staurosporin (STAU) or 30 ng/mL tumor necrosis factor (TNF-α) or 0.1 U/mL glucose oxydase (Gox). This figure represents the percentage of hMPC mortality, determined by Hoechst/PI staining, for each condition.

117

Figure 20 : 1,25-D3 improves the graft success of hMPCs.

Twelve SCID mice received 1,25-D3 orally (1,25-D3), from day –7 to day 30 relative to the time of hMPC transplantation. Twelve control mice received only the vehicle (Control). All mice were transplanted at day 0 with 1.106 hMPCs in both TAs and sacrificed on day 30.

(A) The mean number of muscle fibers expressing human dystrophin was determined for each group (* p<0.001 compared to the control group).

(B) Representative TA sections of control (left panels) or 1,25-D3 treated SCID mice (right panels).

118

Figure 21 : FK506 does not interfere with the 1,25-D3 treatment.

Twelve SCID mice received 1,25-D3 orally, from day –7 to day 30 relative to the time of hMPC transplantation (1,25-D3). Twelve control mice received only the vehicle (Control). To determine whether FK506 immunosuppression interfered with 1,25-D3 improvement of MPC transplantation, half of the 1,25-D3 treated mice were additionally injected intramuscularly with FK506 (FK506+1,25-D3). As control, half of mice receiving only the vehicle were additionally injected with FK506 (FK506). FK506 was daily administrated during a period of 30 days post-transplantation. The mean number of human dystrophin positive fibers was determined for each group. The * indicates a p<0.001 and δ a p<0.001 relative respectively to the control and the FK506 group.

119

Figure 22 : In vivo mortality and proliferation index of hMPCs.

HMPCs were radio-labeled with [methyl-14C] thymidine before their transplantation in both TAs of SCID mice treated or not with 1,25-D3. Control and treated mice were sacrificed at 0, 48, 72 and 96 hours and both grafted TAs where harvested. DNA was extracted from each muscle (n=6 for each time and condition).

(A) The amount of radio-activity and the presence of Y-specific DNA within each TA were measured on DNA extracts (respectively black and white columns). The percentages of radio-activity or Y-specific DNA were calculated as a percentage of the T0. (The * indicates a significant difference with an ANOVA, i.e., p<0.01)

(B) The in vivo proliferation of transplanted hMPCs was evaluated by calculating the proliferation index i.e., the percentage of Y-specific DNA divided by the percentage of radio-activity measured in the same TA. The mean index represents, at each time point, the mean values obtained for each group of SCID mice. (The * indicates a significant difference with an ANOVA, i.e., p<0.01).

120

4 Perte cellulaire à moyen et long terme

4.1 Causes Le succès de la TM à long terme est directement compromis par les mécanismes de

rejet aigu. En effet, sans immunosuppression adéquate, la quantité de myoblastes du

donneur dans les muscle transplantés est extrêmement faible une semaine après injection, et

nulle un mois post-transplantation (Kinoshita et al 1996). Comme cela a été décrit (cf.

chapitre 1 : 4.3.6.3) le rejet aigu est le mécanisme par lequel les LTs cytotoxiques du

receveur détruisent l’allogreffe. Cette réponse implique tout d’abord l’interaction entre les

TCRs des LTs et les molécules de CMH de classe I des cellules du donneur. Bien que les

molécules du CMH de classe I soient habituellement faiblement exprimées sur les fibres

musculaires matures (Appleyard et al 1985; Karpati et al 1988b; Ponder et al 1983), leur

expression s’observe toutefois lors de la régénération musculaire, et dans les muscles des

patients atteints de DMD (Cifuentes-Diaz et al 1992; Curnow et al 1998; Mantegazza et al

1991; Michaelis et al 1993; Wiendl et al 2005). Par ailleurs, en dehors du fait que des

protéines du donneur soient présentées indirectement aux LTs (cf. chapitre 1 : 4.3.6.2),

certaines études laissent à penser que les myoblastes eux-mêmes pourraient servir de CPAs

(Goebels et al 1992). En effet, les myoblastes ne sont pas capables d’exprimer

ordinairement le CMH de classe II. Néanmoins, son expression ainsi que l’expression de

certaines molécules membranaires propres aux CPAs et participant aux présentations

antigéniques, pourrait être induite en présence de certaines cytokines (Curnow et al 1998;

Hohlfeld & Engel 1990a). Cependant, cette hypothèse est sujette a beaucoup de

controverses (Skuk & Tremblay 2003).

La TM allogénique, effectuée chez des souris immunocompétentes, a révélé la

présence de cellules lymphocytaires infiltrantes au niveau des tissus greffés (Guerette et al

1995a; Irintchev et al 1995; Skuk et al 2002a; Wernig et al 1995). Cette infiltration se

caractérise par la présence de poches de LTs CD8+ et CD4+. Ces LTs présentaient tous des

signes d’activation distincts (présence de récepteurs à L’IL-2, expression de granzyme B…)

(Guerette et al 1996; Guerette et al 1995b). L’invasion et la destruction des myotubes par

les LTs CD8+, considérée comme un signe de lymphotoxicité T dépendante, furent aussi

conjointement observée (Irintchev et al 1995). La destruction des myotubes observée ne

121

semble pas concerner seulement les néo-fibres ou les fibres hybrides mais également les

fibres de l’hôte. Ceci pourrait être du à la sécrétion continue de cytokines par les LTs

présents (Irintchev et al 1995; Wernig et al 1995). En outre, le rejet aigu de la greffe de

myoblastes ne requière pas nécessairement une incompatibilité antigénique majeure. En

effet, une simple différence pour des antigènes mineurs peut à elle seule provoquer un rejet

aigu de la TM. Ceci a été démontré chez la souris par l’injection de myoblastes issus d’un

mâle chez une femelle syngénique (Boulanger et al 1997). Les myoblastes ainsi greffés ont

tous été rejetés. L’ensemble de ces observations de rejet a été confirmé chez le chien (Ito et

al 1998b) et chez le singe (Kinoshita et al 1996; Skuk 2004).

4.2 Solutions précédemment envisagées

4.2.1 Immunosuppression Le maintien de la survie d’un greffon chez un patient transplanté nécessite une

immunosuppression destinée à contrôler la réaction immunitaire induite par les LTs allo-

réactifs. Les premiers médicaments immunosuppresseurs étaient des antimitotiques et des

corticostéroïdes. La découverte fortuite des propriétés immunosuppressives de la

cyclosporine (CsA) par J.F. Borel en 1976 (Borel et al 1976), a conduit à rechercher plus

systématiquement l’effet de molécules biologiques sur la réponse immunitaire. C’est ainsi

que le FK506, la rapamycine, l’acide mycophénolique, la déoxyspergualine ont été

sélectionnés, permettant une action plus sélective. Les Acs antilymphocytes, les

immunotoxines, cytokines et molécules de fusion bloquant certaines interactions

cellulaires, sont venus diversifier la panoplie des traitements immunosuppresseurs. D’autres

molécules immunosuppressives sont en cours de développement, mais aucune d’entres

elles, utilisée en administration prolongée, n’a démontré une efficacité certaine pour

endiguer une réaction immunitaire néfaste sans induire un déficit immunitaire iatrogène

plus ou moins profond.

Le déficit immunitaire lié à des conditions immunosuppressives prolongées peut

provoquer l’apparition d’infections opportunistes telles que la pneumocystose, la

toxoplasmose, la listériose, la légionellose, l’aspergillose, la cryptosporidiose. De plus, les

infections virales sont fréquentes. Les plus remarquables sont les infections à

cytomégalovirus (transmises par l’organe ou la moelle greffés), les réactivations d’infection

122

par les virus herpès HSV1 et HSV2, le virus d’Epstein-Barr, les virus de la varicelle-zona,

du papillome et de l’hépatite (Allison AC 1993). Enfin, l’amoindrissement du système

immunitaire par une immunosuppression soutenue favorise l’apparition de pathologies

tumorales. Tous ces effets néfastes associés à l’immunosuppression soutenue nécessitent

des mesures de prophylaxie et de surveillance ainsi qu’un ajustement rigoureux des

traitements immunosuppressifs en fonction des risques et des bénéfices escomptés pour le

malade.

Dans le contexte de la TM, l’immunosuppression a une contrainte supplémentaire.

En effet, les myoblastes greffés ne doivent pas être détruits par les immunosuppresseurs, et

leur capacité myogénique ne doit pas non plus être perturbée. Ainsi, différents

immunosuppresseurs ont été testés pour satisfaire à ces exigences (Tableau 2). De ces

expériences, c’est l’administration de tacrolimus (FK506) qui a donné les meilleurs

résultats en TM chez la souris et chez le singe (Skuk 2004). Basé sur ces observations, le

FK506 fut également utilisé avec succès dans un essai de phase clinique I (Skuk et al

2004). Néanmoins, même si le FK506 s’avère être l’immunosuppresseur qui convient le

mieux à la TM, son administration à long terme est évidemment affligée d’effets

secondaires similaires à ceux liés à l’immunosuppression soutenue. De plus l’utilisation

prolongée de FK506 facilite l’apparition de problèmes de néphrotoxicité, d’hépatotoxicité,

et de neurotoxicité (Bennett 1998; Neu et al 1997; Schreiber & Crabtree 1992; Tanabe et al

1996). Tous ces effets néfastes viennent noircir l’espérance d’utiliser le FK506 pendant une

longue période de traitement.

4.2.2 Tolérance immunologique

4.2.2.1 Description La tolérance, du latin tolerare (soutenir, supporter), correspond, médicalement

parlant, à l’aptitude d’un organisme à supporter sans symptômes morbides l’action d’un

médicament, d’un agent physique ou chimique déterminé. C’est aussi la capacité d’un

individu à accepter les effets, la présence, d’un facteur extérieur. La tolérance

immunologique reprend ces deux concepts puisqu’elle se définit comme étant un état de

non réponse du système immunitaire d’un individu en présence d’un antigène n’appartenant

pas au « soi ». Néanmoins, la réponse immunitaire de ce même individu demeure

123

fonctionnelle envers tout autre antigène. La tolérance immunologique présente cet

avantage, face à l’immunosuppression soutenue, de ne pas réduire les défenses

immunitaires des patients tolérisés contournant de fait les risques de développement

d’infections opportunistes et de tumeurs. Néanmoins, l’obtention de ce statut de tolérance

en clinique fait figure de « quête du Saint Graal ». En effet, l’induction de tolérance repose

sur les premiers travaux de Brent, Billingham et Medawar (Starzl 2000) effectués au début

des années 1950. Depuis, beaucoup de protocoles ont été développés chez la souris, mais

peu ont abouti chez le singe ou le chien. Quant à l’existence de protocoles au niveau

clinique, très peu de tentatives ont vu le jour et aucune n’a été reconduite (Fehr & Sykes

2004).

124

Immunosuppression Résultat de la TM chez la souris

Résultat de la TM chez

le singe

Résultat de la TM chez l’Homme

Problèmes reliés

Cyclophosphamide Négatif Non décrit Négatif Cette drogue détruit les cellules en prolifération. Elle détruit les myoblastes transplantés

Cyclosporine A Positif Non décrit Controversé En dose thérapeutique,

provoque une inhibition de la fusion des myoblastes; bloque la différenciation et induit l’apoptose des myoblastes de souris; inhibition de l’hypertrophie du muscle strié squelettique par inhibition de la calcineurine.

Mycophenolate

mofétil Négatif Non décrit

seul, Positif en

combinaison avec le

tacrolimus

Non décrit Inhibition de la fusion des myoblastes de souris.

Sirolimus Positif Non décrit Non décrit Non décrit

Tacrolimus Positif Positif Positif Inhibition de

l’hypertrophie du muscle strié squelettique par inhibition de la calcineurine.

Tableau 2 : Résumé des immunosuppressions tentées dans le cadre d’une transplantation de myoblastes.

Skuk 2004.

125

L’établissement d’une tolérance immunologique doit répondre à trois critères

essentiels :

1) l’absence d’une réponse spécifique dirigée contre le donneur,

2) l’absence d’une infiltration lymphocytaire destructrice dans le site de l’allogreffe,

3) la préservation de la réponse immunitaire à un haplotype autre que celui du

donneur, témoignant de la fonctionnalité de l’immunité spécifique du receveur tolérisé.

Les sections qui suivent vont tout d’abord survoler les principaux mécanismes sur

lesquels repose l’induction de tolérance. Puis, la tolérance sera abordée selon deux voies

différentes : la tolérance périphérique et la tolérance centrale. Ces deux types de tolérance

impliquent la combinaison des divers mécanismes immunologiques qui seront évoqués ci-

après. Les principes de la tolérance périphérique et centrale seront tour à tour explicités.

Enfin, un bref survol des différentes études pré-cliniques et cliniques sera effectué pour

chacune de ces voies de tolérisation. Néanmoins, l’accent sera mis sur la tolérance centrale

qui introduira directement le deuxième article de cette thèse.

4.2.2.2 Mécanismes de l’induction de tolérance L’ensemble des mécanismes immunologiques impliqués dans l’établissement d’un

statut de tolérance ne sera pas abordé en détail dans cette thèse puisqu’il constituerait une

thèse en soi. De plus, le manque d’études mécanistiques effectuées chez le primate et chez

l’homme restreint les notions abordées ci-après à des études plus fondamentales effectuées

chez les rongeurs. Néanmoins, un résumé succinct des divers outils immunitaires impliqués

dans la tolérisation d’un receveur s’impose pour nous guider vers le deuxième article de

cette thèse.

On distingue 4 mécanismes immunologiques qui sont impliqués dans l’acceptation

par l’hôte de la présence cellulaire ou organique du donneur. Ces mécanismes sont

essentiellement les mêmes que ceux qui permettent le maintien de la tolérance envers les

antigènes du soi. Il s’agit de : la délétion, l’anergie, la régulation/suppression et l’ignorance.

Cependant, une des différences importantes entre la tolérance aux antigènes du soi par

126

rapport aux allo-antigènes, est la très importante proportion, dans le répertoire

lymphocytaire général de cellules T précurseurs et allo-réactives vis-à-vis du CMH du

donneur. En effet, les cellules T allo-réactives représentent 5 à 10% du répertoire

lymphocytaire chez la souris (Suchin et al 2001). De ce fait, l’établissement d’un protocole

de tolérance implique nécessairement de bloquer ou de détruire cette importante population

de cellules T précurseurs allo-réactives.

4.2.2.2.1 La délétion clonale Comme son nom l’indique, la délétion clonale représente un mécanisme de

destruction des clones lymphocytaires réagissant contre les antigènes du donneur. La

délétion clonale peut survenir dans le thymus (organe lymphoïde primaire) ou dans les

organes lymphoïdes secondaires. Les termes de délétion centrale et de délétion périphérique

sont respectivement utilisés en fonction de l’organe lymphocytaire (primaire ou secondaire)

où la délétion s’effectue.

Bien que le thymus subisse une involution pendant la puberté, il continue à être

fonctionnel chez les adultes (Douek & Koup 2000) et joue un rôle important dans le

maintien de la tolérance au soi. Le thymus est impliqué dans la maturation des lymphocytes

T et la délétion centrale repose sur les mêmes principes que l’éducation thymiques des

thymocytes (cf. chapitre 1 : 4.2.2.1.2) (Manilay et al 1998). La délétion centrale implique la

destruction, au sein du thymus du receveur, des clones allo-réactifs néoformés lorsqu’ils

sont mis en présence des antigènes du donneur. Cette mise en présence peut être obtenue de

deux façons différentes qui seront abordées à la section du développement de tolérance

centrale (cf. chapitre relié).

La délétion des lymphocytes allo-réactifs en périphérie est aussi capitale pour le

développement d’une tolérance (Li et al 1999; Wells et al 1999). En effet, la destruction

seule des lymphocytes T allo-réactifs néoformés n’est pas une condition suffisante à

l’établissement d’une tolérance. Il est nécessaire de bloquer les clones matures présent en

périphérie (Fehr & Sykes 2004). La délétion périphérique implique indépendamment deux

types de mort cellulaire : la mort active et la mort passive. Dans ces deux cas les cellules

meurent par apoptose, mais utilisent des voies apoptotiques distinctes. La mort cellulaire

active est provoquée par une activation soutenue et prolongée des lymphocytes T

127

« activation induced cell death ». Les mécanismes impliqués dans cette apoptose sont fins

et complexes. Néanmoins il est communément établi que la principale voie de signalisation

qui soutient ce mécanisme fait intervenir le système « Fas/Fas ligand » ainsi que le

récepteur au TNF-α. La mort passive s’effectue par l’absence de facteurs de croissance.

Elle survient lorsque les lymphocytes allo-réactifs sont activés mais en absence d’IL-2.

Cette apoptose est indépendante de la voie du « Fas/Fas ligand » ainsi que celle du

récepteur au TNF-α (Sayegh & Turka 1998; Van Parijs & Abbas 1998). Ainsi, tous les

immunosuppresseurs bloquant la sécrétion de l’IL-2 provoquent la destruction des clones

allo-réactifs lorsque ceux-ci sont activés. À l’inverse, l’IL-2 est nécessaire à la délétion

clonale reposant sur la mort active (Li et al 1999; Wells et al 1999).

4.2.2.2.2 L’anergie L’activation des lymphocytes T requièrent au moins deux signaux (Figure 15) (Fehr

& Sykes 2004). Tout d’abord leur activation nécessite un signal dépendant d’une

présentation antigénique conforme ou de toutes autres molécules déclenchant un signal via

le TCR. Puis, conjointement au premier signal, les lymphocytes T doivent recevoir un

signal de costimulation indépendant de la présentation antigénique et médié par les

molécules de costimulation (Figure 15). Ces molécules sont par exemple l’association

récepteur/ligand : CD28/CD80, CD154/CD40. Actuellement les signaux indépendants de la

présentation antigénique sont divisés en deux : d’un côté les signaux se basant sur

l’interaction récepteur/ligand avec un ligand solide, de l’autre, les signaux se basant sur

l’interaction récepteur/ligand avec un ligand sécrété (tels que les cytokines comme l’IL-2)

(Fehr & Sykes 2004). Quoiqu’il en soit, si les signaux médiés par le TCR ne sont pas

supportés par les autres signaux, alors les lymphocytes T entrent dans un statut d’anergie.

128

Figure 23 : Schématisation de l’activation des lymphocytes T. Classiquement, l’activation des cellules T requière au moins deux signaux : Un signal dépendant de l’interaction du récepteur des lymphocytes T (TCR) avec le complexe majeur d’histocompatibilité présentant un antigène (CMH/peptide) (1), puis un deuxième signal indépendant de la présentation antigénique et mettant en jeu les molécules de costimulation (2 et 3). Plus récemment, la signalisation indépendante de la présentation antigénique a été scindée en deux signaux distincts. Le signal (2) correspondant à l’interaction des molécules de costimulation entre la cellule présentatrice d’antigènes (CPA) et le lymphocyte T, le signal (3) représentant la voie autocrine de stimulation des lymphocytes par l’interleukine 2 (IL2) et son récepteur (IL2-R). Autres abréviations : NFAT (facteur nucléaire des cellules T activées); NF-κB (facteur nucléaire kappa B).

129 L’anergie se définit alors comme un état réfractaire des cellules T qui, après un

premier contact avec l’antigène, deviennent incapables d’être activées. Il est également

important de noter que suite à une anergie, les lymphocytes T ont une durée de vie plus

courte et meurent par apoptose.

4.2.2.2.3 La régulation/suppression

Les cellules T régulatrices, principalement les cellules exprimant les « clusters » de

différenciation CD4/CD25 sont actuellement « sous le feu » de l’actualité immunologique.

Beaucoup de publications sont parues ces dernières années sur les lymphocytes T

régulateurs. L’immunorégulation dépendante de ces lymphocytes T est un des mécanismes

principaux responsables du maintien de l’homéostasie des lymphocytes T et de la tolérance

envers des antigènes spécifiques (Bach et al 1968). La régulation/suppression a été mise en

évidence dans les modèles de tolérance infectieuse où, après induction d’une tolérance chez

un receveur A1 vis-à-vis d’un donneur B, celle-ci peut être transmise à un autre receveur

syngénique A2 par injection de cellules TCD4+CD25+ de A1 (T régulateurs) (Qin et al

1993). La liste des marqueurs candidats permettant l’identification des lymphocytes T

régulateurs s’accroît continuellement et inclut une expression du CD45RB (faible

expression) (Hara et al 2001), du CD152 (Kingsley et al 2002), du CD62L (L-sélectine)

(Herbelin et al 1998), du « glucocorticoïd-induced tumor-necrosis factor » (GITR)

(Zelenika et al 2002), du CD122 (chez les cellules humaines seulement) (Levings et al

2001). Cependant, le facteur de transcription FOXP3 (Hori et al 2003) semble récemment

se démarquer comme étant le facteur exprimé par les lymphocytes T régulateurs.

Un nombre croissant d’évidences expérimentales et cliniques suggèrent que les

cellules T régulatrices jouent un rôle important dans le maintien du statut de tolérance

(Wood & Sakaguchi 2003). Au moins trois mécanismes se démarquent et semblent être

importants dans ce sens. Des études précliniques et cliniques suggèrent que les effets des

lymphocytes T régulateurs requièrent la production d’IL10 et de TGF-β (Hara et al 2001;

Torrealba et al 2004). Les fonctions des lymphocytes T CD4/CD25 semblent être

particulièrement affectées par l’expression des molécules de surface GITR (McHugh et al

2002; Shimizu et al 2002) et CTLA-4 « cytotoxic T lymphocyte antigen 4 » (Kingsley et al

2002). Ces molécules semblent participer à un effet régulateur par contacts cellulaires

130

(Jiang & Lechler 2003; Wood & Sakaguchi 2003). Enfin, les lymphocytes T régulateurs

pourraient également être impliqués dans l’inhibition de la maturation (et ainsi des

fonctions) des cellules dendritiques (Vendetti et al 2000).

La régulation/suppression via les cellules régulatrices a été plus qu’étudiée

expérimentalement ces dernières années. Cependant, la connaissance clinique du rôle de ce

mécanisme de régulation dans la tolérance immunologique reste mince (Newell et al 2006).

Il n’est donc pas encore envisageable de développer un protocole de tolérance basé sur les

lymphocytes T régulateurs dans le cadre de la TM.

4.2.2.2.4 L’ignorance L’ignorance est le dernier des mécanismes connus permettant le développement

d’une tolérance dans le cadre d’une transplantation allogénique. La situation d’ignorance

correspond, physiologiquement parlant, à la non rencontre entre les cellules lymphocytaires

et les alloantigènes. Ceci peut arriver dans deux situations distinctes : soit aucun allo

antigène ne peut atteindre et être présenté au système lymphoïde de l’hôte, soit les cellules

T ne peuvent atteindre les antigènes exogènes. Dans un contexte de transplantation ces

situations peuvent survenir lors de greffes non vascularisées (greffe allogénique de cornée

par exemple) (Lafferty et al 1983; Starzl & Zinkernagel 2001). Également, la protection de

cellules greffées dans des sites immuno-protégés (encapsulation des îlots de Langerhans)

(Duvivier-Kali et al 2001), peut conduire à un échec de la présentation des alloantigènes du

donneur aux lymphocytes T du receveur. Malheureusement, ce mécanisme d’ignorance

n’est pas applicable à une greffe d’organe qui nécessite une vascularisation. Dans le cadre

de la TM, les cellules injectées ont besoin de fusionner avec les fibres de l’hôte rendant

également impossible toute isolation (avec des biocapsules par exemple) vis-à-vis du

système immunitaire. Pour l’instant, ce mécanisme de tolérance n’est donc pas

envisageable dans le cadre de la TM.

4.2.2.3 Induction de tolérance Au cours de ces 15 dernières années, la compréhension des mécanismes

immunologiques impliqués dans l’établissement d’un statut de tolérance a

considérablement augmenté. Cependant la transposition des protocoles viables chez la

souris aux primates non-humains ainsi qu’à l’homme reste difficile (Fehr & Sykes 2004;

131

Kean et al 2006). C’est pourquoi, les sections suivantes mettront l’accent sur les protocoles

de tolérance qui ont été effectués chez les primates non-humains et chez l’homme.

L’ensemble des protocoles intentés se répartiront selon deux principes de tolérances : la

tolérance périphérique et centrale.

4.2.2.3.1 Induction tolérance périphérique La tolérance périphérique repose sur les mécanismes d’anergie, de délétion

(périphérique), et de régulation (Dong et al 1999). Cela fait plus de trente ans que fut posé

le concept d’activation des cellules T via des molécules de costimulation (Bretscher &

Cohn 1970) et maintenant dix ans que les principales voies d’activation furent identifiées.

Les voies d’activation qui sont pour l’instant les plus connues et utilisées dépendent

de l’association des molécules CD80 et CD86 avec le CD28 (Figure 15) ainsi que de

l’association du CD40 avec son ligand le CD154. Le blocage de ces deux voies de

costimulation a notamment permi le développement d’une tolérance allogénique chez la

souris (Larsen et al 1996). S’appuyant sur ce résultat, des protocoles reprenant les mêmes

principes ont été effectués chez les primates non-humains. En ce qui concerne le blocage de

la voie dépendante du CD28, deux méthodes ont été tentées. Il s’agissait de bloquer la

liaison du CD28 au CD80 ou au CD86 via l’utilisation d’Acs bloquants (Birsan et al 2003;

Haanstra et al 2003; Hausen et al 2001; Kirk et al 2001; Montgomery et al 2002; Ossevoort

et al 1999) ou d’une protéine de fusion appelée CTLA-4 Ig (Kirk et al 1997; Larsen et al

2005; Levisetti et al 1997). L’utilisation en monothérapie d’Ac bloquant le contact du

CD80 et/ou du CD86 n’a pas fonctionné. L’utilisation de la protéine de fusion n’a pas

donné de meilleurs résultats (quoiqu’une prolongation de la vie des reins greffés). Il faut

noter aussi que le rejet survenait après arrêt de l’administration des ces molécules bloquant

les voies de costimulation. Les résultats décevant résultant de l’administration de CTLA-4

Ig furent attribués à la mauvaise affinité du CTLA-4 Ig pour le CD80 et le CD86 de singe.

Pour remédier à ce problème le CTLA-4 Ig fut remplacé par le LEA29Y (belatacept), une

version mutée du CTLA-4 IG. Les résultats en monothérapie ne furent pas beaucoup

améliorés (L S Kean). Malgré tout, l’administration combinée et prolongée de LEA29Y

avec de la rapamycine et des Ac bloquant les récepteurs de L’IL-2 permis de réduire la

toxicité des protocoles d’allogreffes de rein (Vincenti et al 2005).

132 Le blocage de la liaison du CD154 au CD40 s’est construit sur l’utilisation d’Ac

anti-CD154. La plupart des Ac utilisés permirent un prolongement de la survie des

allogreffes de rein chez le singe (Fehr & Sykes 2004). Néanmoins, tous les animaux traités

en monothérapie développèrent des problèmes de rejet chronique accompagnés

d’infiltration de cellules mononuclées au niveau du greffon. Des résultats similaires ont

également été rapportés pour les greffes de cœur et d’îlots de Langerhans. De ce fait le

statut de tolérance n’a pas été considéré comme atteint avec ces approches (Fehr & Sykes

2004; Kean et al 2006). Il en va de même avec la combinaison d’Ac anti-CD154 avec le

CTLA-4 Ig ou des Ac anti-CD80/CD86 (Montgomery et al 2002; Pearson et al 2002) Pour

couronner le tout, l’utilisation en clinique d’un traitement basé sur l’administration d’anti-

CD154 a été affligée de l’apparition d’un évènement thromboembolique (Knechtle et al

2001). L’utilisation en clinique d’anti-CD154 fut de fait suspendue.

La stratégie qui consiste en une déplétion drastique et transitoire des cellules T

alloréactives est conceptuellement assez différente du blocage des molécules de

costimulation. Le principe repose sur l’élimination des cellules T du receveur qui survient

lors du pic de l’activation immunitaire reliée à la transplantation. La repopulation retardée

des clones lymphocytaires est supposée favoriser la prise de la greffe ainsi que

l’établissement d’un statut de tolérance. Chez le primate, le résultat le plus encourageant fut

obtenu lors de l’utilisation d’une toxine diphtérique modifiée couplée à un anti-CD3 de

singe Rhésus (IT) (Neville et al 1996). La première administration en monothérapie de cette

molécule provoqua la mort de plusieurs singes et n’empêcha pas le rejet (2/3) des greffes de

rein intentées. (Fehr & Sykes 2004). Néanmoins, combinée à 14 jours d’administration de

déoxyspergualine (DSG), l’IT amena à la survie des allogreffes de rein (au-delà d’un an)

chez 75% des singes Rhésus transplantés. La DSG est une drogue connue pour interférer

avec le facteur nucléaire NFκB, facteur notamment impliqué dans la signalisation

dépendante de nombreuses cytokines. Ce régime fut appelé STEALTH (Thomas et al

2001). Néanmoins, la repopulation des cellules T nécessita 6 mois post-traitement ce qui est

considérable et pourrait fragiliser le système immunitaire des patients traités. De plus, l’IT

n’a pas d’affinité pour le CD3 humain (Fehr & Sykes 2004).

4.2.2.3.2Induction de tolérance centrale

133 La tolérance centrale est dépendante de la délétion thymique des clones alloréactifs.

Cette délétion peut entre autre être obtenue en injectant directement dans le thymus des

antigènes du donneur. Toutefois, cette méthode ne permet pas un apport thymique continu

en allo antigènes et de ce fait conduit au développement d’une tolérance transitoire (Fehr &

Sykes 2004).

Pour stabiliser la délétion thymique, il est important de faire exprimer en

permanence les allo antigènes par les cellules thymiques. Ceci s’avère possible avec le

chimérisme hématopoïétique. A l’origine, le mot chimère (chimaera en grec) désigne un

monstre mythologique dont l’apparence est un mélange de lion (tête et poitrail), de chèvre

(ventre) et de dragon (queue), bref un excellent exemple de tolérance immunologique

poussée à son extrême. Le chimérisme hématopoïétique reprend un peu ce concept

puisqu’il implique l’existence d’un système sanguin mixte où cellules du donneur et du

receveur coexistent. Les fondations du chimérisme hématopoïétique s’appuient sur la greffe

de moelle osseuse. En effet, la moelle osseuse est le berceau des cellules souches

hématopoïétiques. Ces cellules ont la capacité de se différencier en plusieurs cellules de la

lignée hématopoïétique. Les cellules une fois différenciées gagnent le système sanguin

périphérique et pour certaines d’entre elles (cellules dendritiques par exemple) s’installent

dans le thymus. Ainsi des cellules provenant de l’haplotype du donneur peuvent participer à

l’éducation thymique des thymocytes néoformés (qui peuvent entre autre avoir l’haplotype

du receveur comme de l’hôte) (Starzl 2004). Le statut de tolérance ainsi induit, via

l’établissement d’un chimérisme hématopoïétique, est communément considéré (chez les

rongeurs) comme la plus robuste des approches thérapeutiques (Sykes 2001). Ce concept

fut également épisodiquement vérifié chez l’homme dès 1991 d’abord pour des greffes de

rein (Sayegh et al 1991) puis de poumon (Svendsen et al 1995a; Svendsen et al 1995b;

1999; Svendsen et al 1995c) et de foie (Kadry et al 2003). Malheureusement, l’obtention du

chimérisme hématopoïétique n’est pas une étape facile à atteindre. En effet, deux

importants facteurs sont à prendre en considération pour obtenir du chimérisme :

La suffisance des cellules de moelle du donneur capables de reconstituer à un

niveau acceptable une partie des lignées hématopoïétique du receveur.

134 L’efficacité de la destruction où de l’anergie des clones matures alloréactifs du

receveur afin d’assurer la survie des cellules dérivant de la moelle osseuse du donneur.

Pour répondre au premier problème, il est nécessaire d’aborder la notion de niveau

de chimérisme. Il existe plusieurs échelles de chimérisme qui représentent la proportion de

cellules d’haplotype du donneur que l’on retrouve dans le sang périphérique du receveur.

Le microchimérisme désigne un état où la proportion des cellules du donneur ne dépasse

pas 1% des cellules hématopoïétiques du receveur. Le microchimérisme est détecté par des

techniques ultrasensibles, comme par amplification en chaîne par polymérisation

« polymerase chain reaction » (PCR). L’implication du microchimérisme dans la survie des

greffes n’a pas été démontrée clairement (Elwood et al 1997; Schlitt et al 1994; Wood &

Sachs 1996). Le macrochimérisme correspond à une proportion de cellules du donneur

supérieure à 1%. Le macrochimérisme se subdivise également en chimérisme mixte ou

partiel (>1% et <100% des cellules du donneur) et en chimérisme total (100% des cellules

du donneur). Toutefois, le chimérisme mixte offre certains avantages par rapport au

chimérisme total, incluant une immunocompétence supérieure (Ildstad et al 1986; Singer et

al 1981) et une susceptibilité réduite de GVHD (Ildstad et al 1986). C’est l’efficacité des

méthodes de myéloablation qui détermine le niveau de chimérisme obtenu. En effet, la

myéloablation favorise la nidation des cellules souches hématopoïétiques du donneur et de

ce fait le développement d’un chimérisme (Sykes 2001). Une myéloablation partielle

conduira à un chimérisme partiel et une myéloablation totale à un chimérisme total.

L’obtention d’un chimérisme mixte apparaît comme le choix le plus judicieux, tant par la

diminution des risques encourus par le receveur que par l’efficacité de ce type de

chimérisme pour répondre aux besoins de l’établissement d’une tolérance immunologique.

Les protocoles de myéloablation partielle, développés chez les rongeurs ou chez les

primates et appelés également par extension abusive non-myéloablatifs, s’appuient sur

l’irradiation du corps du receveur ou sur l’administration de drogues myéloablatives (Fehr

& Sykes 2004; Kean et al 2006). Bien que les protocoles qui utilisent l’irradiation du

receveur affichent une certaine efficacité quant à l’établissement d’un chimérisme mixte,

leur utilisation en clinique est peu appréciée, voir proscrite (Fehr & Sykes). L’autre façon

d’effectuer une myéloablation nécessite le recours à l’utilisation d’agents alkylants et de

certains agents anti-néoplasiques. L’utilisation des ces agents est accompagnée d’une

135

certaine toxicité, dépendamment de la dose utilisée. Parmi ces agents, il y a le

cyclophosphamide (Mayumi & Good 1989), le busulfan (Tomita et al 2000), le diméthyl

myleran (de Vries-van der Zwan et al 1998), la fludarabine (Pan et al 2003) et le treosulfan

(van Pel et al 2003; 2004).

La deuxième condition à remplir pour obtenir du chimérisme hématopoïétique

implique que lorsque la place est faite pour accueillir la moelle du donneur, il devient

capital de s’assurer que celle-ci ne soit pas rejetée par les clones alloréactifs du receveur.

Pour répondre à ce problème plusieurs approches ont été envisagées. La déplétion et/ou

l’anergie efficace des clones alloréactifs a été rapportée chez les rongeurs dans des

protocoles ayant recours à l’irradiation (thymique et/ou sur l’ensemble du corps) (Sharabi

& Sachs 1989) ainsi que l’utilisation d’Ac déplétants/bloquants (Nikolic et al 2001; Tomita

et al 1996b; Wekerle et al 1999). Comme cela a été mentionné au début du chapitre sur la

tolérance, beaucoup de protocoles ont été testés chez les rongeurs mais peu d’entre eux ont

vu le jour sur les primates humains ou non humains. Parmi ces protocoles deux ont retenu

l’attention de cette thèse.

La première approche est basée sur l’utilisation de l’Ac anti-CD154. Les premiers

protocoles utilisant cet Ac furent développés chez les rongeurs. Ces protocoles visaient à

bloquer les signaux de co-stimulation entre le CD40 et son ligand (CD154) (Figure 15).

L’anti-CD154 fut utilisé dans des protocoles de développement de tolérance périphérique

mais l’ensemble de ces protocoles ne conduisit qu’à une prolongation de la survie des

greffes intentées (Fehr & Sykes 2004). Les protocoles impliquant une transplantation de

moelle osseuse (BMT : « Bone Marrow Transplantation ») associée à une administration

d’anti-CD154, amenèrent (chez la souris) au développement d’un chimérisme

hématopoïétique mixte. L’obtention du chimérisme permit d’aboutir à un statut de

tolérance à long terme. Deux de ces protocoles requéraient une irradiation corporelle

généralisée (TBI : « Total Body Irradiation) d’une intensité de 3Gy (Wekerle et al 1998).

Pour palier au recours à l’irradiation, des protocoles utilisant des drogues cytoréductrices (à

action plus ciblée que l’irradiation) furent également intentés avec succès chez la souris.

Ces drogues étaient le busulfan (Adams et al 2001) ou la fludarabine associée à du

cyclophosphamide (Pan et al 2003). Enfin, pour augmenter l’effet de l’anti-CD154,

136

l’ensemble des protocoles cités ci-dessus impliqua l’administration conjointe d’autres Ac

bloquants ou déplétants tels que le CTLA-4 Ig (Adams et al 2001; Wekerle et al 1999),

l’anti-CD8 (Ito et al 2001) ou de cyclophosphamide (Guo et al). De part ces résultats, deux

protocoles utilisant l’anti-CD154 furent développés pour effectuer des greffes allogéniques

de myoblastes. L’un de ces protocoles visait à obtenir une tolérance périphérique sans

passer par un chimérisme hématopoïétique. Malheureusement, et en suivant la logique des

tentatives similaires d’établissement de tolérance périphérique, l’anti-CD154 ne conduisit

qu’à une prolongation de la survie des transplantations de myoblastes (Camirand et al

2002). La combinaison d’une BMT accompagnée d’une myéloablation partielle par TBI

(3Gy) joint au protocole utilisant l’anti CD-154 donna des résultats très satisfaisants. En

effet, pour la première fois, une greffe de myoblastes était capable de tenir à long terme

sans immunosuppression soutenue (Camirand et al 2004). De plus, l’utilisation de l’anti-

CD154 ne se limita pas à une des tentatives restreintes aux rongeurs. En 1995, une équipe

de recherche proposait un protocole chez le primate non-humain basé sur l’établissement

d’un chimérisme hématopoïétique. Le traitement était très lourd puisqu’il impliqué une TBI

par irradiation (3Gy), une irradiation thymique (7Gy), une déplétion des cellules T par

administration d’immunoglobulines anti-thymocytes, une splénectomie et 4 semaines sous

cyclosporine. Ce conditionnement servit néanmoins à permettre la tenue à long terme (>1

an) d’une greffe de moelle osseuse allogénique suivie d’une greffe de rein du même

haplotype que le donneur (Kawai et al 1995; Kawai et al 1999). Il est intéressant de noter

que cette greffe tenue malgré le caractère transitoire du macrochimérisme observé. Pour

« adoucir le traitement » la splénectomie fut remplacée par la suite par l’administration

d’anti-CD154 (Kawai et al 2002; Kawai et al 2004). Les greffes de rein furent supportées

par tous les singes cynomolgus (Macaca fascicularis) qui développèrent du

macrochimérisme transitoire. Ces résultats très encourageants conduirent à la production

d’un anti-CD154 qui reconnaissait le CD154 humain. Le premier patient qui reçu cet Ac

souffrit de complications thromboemboliques (Kawai et al 2000). Ce problème est

néanmoins contournable chez le singe Cynomolgus par l’utilisation de ketorolac (un anti-

inflammatoire non stéroïdien) (Koyama et al 2004). Ces tentatives fortement intéressantes,

réalisées sur le singe, conduirent à la réalisation d’une expérience sur deux patients

humains. Le protocole incluait une cytoréduction au cyclophosphamide, un traitement avec

137

des immunoglobulines anti-thymocytes, une irradiation thymique et 3 à 9 mois

d’administration de cyclosporine A (Fehr & Sykes 2004). Les deux patients qui reçurent

une greffe de moelle et une transplantation rénale provenant du même donneur,

développèrent du macrochimérisme transitoire et ne rejetèrent pas leur greffe (Buhler et al

2002). Cependant, l’évaluation de la morbidité de ce type de protocole, même partiellement

myéloablatif, fut vue par beaucoup comme excessive vis-à-vis des traitements basés sur une

immunosuppression classique (Guenther & Madsen 2005). Les plus grandes réticences des

cliniciens reposent sur le risque inconnu à long terme que représente une TBI partielle, la

méconnaissance de l’activité clinique détaillée des Ac utilisés, ainsi que la lourdeur

thérapeutique du traitement dans son ensemble (Guenther & Madsen 2005). La lourdeur

thérapeutique d’un traitement est d’autant plus importante lorsque le protocole est appliqué

à un enfant (dystrophique en l’occurrence). Pour accabler le verdict, il faut rappeler que les

Ac utilisés chez les rongeurs, voir même, chez les primates non humains, ne sont pas

toujours disponibles pour une utilisation clinique. Il faut souvent produire ces Acs. De ce

fait, le manque de recul, quant aux effets cliniques de ces nouveaux Acs, combiné au coût

que pourrait entraîner leur production et leur utilisation, freinent considérablement

l’aboutissement des protocoles de tolérance basés sur l’induction de chimérisme

hématopoïétique.

La deuxième approche envisagée pour obtenir un chimérisme hématopoïétique

débouchant sur l’établissement d’un statut de tolérance allogénique, se base sur l’utilisation

de drogues cytoréductrices. C’est cette approche qui est abordée dans le deuxième article de

cette thèse.

138

5 Article II : Induction d’une tolérance pour des greffes allogéniques par un protocole de myéloablation partiel ne requérant ni anticorps ni irradiation du receveur.

Ce deuxième article propose une approche thérapeutique basée sur l’utilisation

exclusive de drogues cytoréductrices afin de permettre un développement de tolérance

immunologique applicable à une greffe allogénique de myoblastes. L’auteur principal est

l’investigateur prépondérant de cette étude, il a contribué à toutes les expériences réalisées

et rédigé l’article. Pichavant Christophe a mis au point la technique d’ELISPOT, Manaf

Bouchentouf et Phillippe Mills ont participé aux greffes de myoblastes et la mise en forme

informatique des photos effectuées. Saloua Tagmouti a participé aux greffes de peaux,

Geoffrey Camirand a contribué à la bonne rédaction de cet article, et David Rothstein a

révisé celui-ci avant publication. Cet article a été accepté dans la revue Cell Transplantation

(Stephan et al 2006).

139

5.1 Résumé de l’article II Le principal avantage du chimérisme hématopoïétique mixte est de permettre de

contourner les protocoles impliquant une immunosuppression soutenue. Cependant,

l’ensemble des approches permettant d’aboutir à ce statut de chimérisme requière

l’utilisation massive d’anticorps et/ou l’irradiation de l’hote. Une première expérience

visant à obtenir du chimérisme et combinant l’administration de Busulfan et de

Cyclophosphamide donna des résultats prometteurs. Parallèlement, de récentes publications

ont révélé à la différence du Busulfan que l’administration de Treosulfan était nettement

moins toxique. Pour l’instant, la transplantation de myoblastes (TM) nécessite une

immunisation soutenue des patients dystrophiques. Cet article propose une approche

expérimentale moindrement toxique permettant d’obtenir de la tolérance pour la TM. Ainsi,

des souris dystrophiques C57Bl10J mdx/mdx ont reçu une transfusion donneur-spécifique,

une dose de cyclophosphamide combinée à 3 doses de Treosulfan et une transplantation de

moelle provenant de nos souris donneuses BALB/c. Ce traitement (TTCB) fut administré

aux souris mdx, avant une première TM dans le Tibialis anterior (TA) de BALB/c. Une

seconde TM fut réalisée 100 jours après dans les TA opposés. Les résultats ont démontré

que toutes les souris ayant reçu le traitement TTCB ont développé un chimérisme

hématopoïétique mixte. Également, nous avons détecté, dans les deux TAs greffés, la

présence de fibres musculaires du donneur et ce longtemps après la TM. Seule une légère et

basale infiltration lymphocytaire fut décelée dans les muscles greffés. De plus, les souris

traitées demeuraient capables de rejeter une greffe provenant d’un tiers donneur. Ainsi, le

chimérisme hématopoïétique mixte, obtenu via le traitement TTCB, nous a permis de

développer une tolérance immunologique stable conduisant à l’acceptation à long terme

d’une TM allogénique et ce sans avoir recours à une immunosuppression soutenue. Par la

suite, ce protocole pourrait être appliqué à la TM pour les patients dystrophiques ou pour

d’autres types de transplantations.

5.2 Abstract Mixed-chimerism approach is a major goal to circumvent sustained

immunosuppression but most of proposed protocols needed antibodies treatment or host

140

irradiation. Another promising experience involved a Busulfan combined with

Cyclophosphamide treatment. Additionally, recent publications demonstrated that, differing

to Busulfan, treosulfan administration not presented severe organ or hemato toxicities.

Currently, Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) patients are treated with chronic

immunosuppression for muscle precursor cell transplantation (MT). We have developed a

safely tolerance approach within this cellular allo-transplantation therapy background.

Thus, we have conditioned, prior to a donor BALB/c MT, the dystrophic mouse model

C57Bl10J mdx/mdx, with our treatment based on a donor specific Transfusion, then a

Treosulfan treatment combined with single Cyclophosphamide dose and finally a donor

Bone marrow transplantation (TTCB). A first MT was performed in all mixed-chimeric

mice resulting from the TTCB treatment in the left Tibialis anterior (TA) muscles. A

second MT from the same donor strain was performed 100 days later in the right TA

without any additional therapy. Results show that all treated mice developed permanent

mixed-chimerism. Long-lasting donor positive fibers were present in both TAs of the mice,

which received MT after the TTCB treatment. Only basal level of infiltration was observed

around donor fibers and mixed-chimeric mice rejected third-party haplotype skin grafts.

Thus, mixed-chimerism development with this TTCB conditioning regimen promotes

donor specific stable tolerance avoiding costimulatory blockade antibodies or irradiation

use and side effects of sustained immunosuppressive treatments. This protocol could be

eventually applied for MT to DMD patients or others tissue transplantations.

6 Title : Induction of tolerance across fully mismatched barriers by a non myeloablative treatment excluding antibodies or irradiation use.

6.1 Introduction Rejection of organ or cell allo-transplantation is currently prevented with

immunosuppressive drugs such as cyclosporine, FK506, mycophenolate mofetil, etc.

Although these drugs are very effective for this purpose, their non-specific immuno-

suppression increases recipient’s risks of developing opportunistic infections and

malignancies. Moreover their use is associated with some toxicities (Bennett 1998;

Falkenhain et al 1996; Glover et al 1997; Neu et al 1997; Penn 1998; Tanabe et al 1996). In

141

addition, chronic rejection is not well controlled by these immunosuppressive agents. An

alternative approach to permit graft acceptance by the host immune system is to induce

immunological tolerance. The establishment of mixed hematopoietic chimerism has several

advantages over other tolerance-inducing methods. In mixed-chimeras, tolerance to both

host and donor is permanently established leading to the absence of both graft-versus-host

and host-versus-graft diseases (Sharabi & Sachs 1989; Wekerle & Sykes 1999). Many

protocols to induce mixed-chimerism have been investigated, but most of them required

antibody treatment or irradiation of the host (Camirand et al 2004; de Vries-van Der Zwan

et al 1994; Kawai et al 2004). An interesting protocol based on stable multi-lineage

chimerism involved a non-myeloablative treatment with Busulfan (BUSILVEX ®) in mice

primed with allogeneic spleen cells followed by a single dose of an immunosuppressive

drug, Cyclophosphamide (PROCYTOX ®) (Tomita et al 2000). However, Busulfan

administration is associated with severe organ and hemato-toxicity, which may not be

avoided, even after reduced-intensity conditioning (Kroger et al 2001; Ringden et al 1999;

Schetelig et al 2002; Slavin et al 1998; Storb et al 1997).

A Busulfan analog already used in clinics is Treosulfan (OVASTAT ®), a prodrug

of a bifunctional alkylating cytotoxic agent. It is indicated for oral or intravenous treatment

of human advanced ovarian cancer (Duncan & Clayton 1985; Gropp et al 1998; Masding et

al 1990; Meden et al 1997). Recently, a successful combination of Treosulfan with

Cyclophosphamide or fludarabine has been tested as a new preparative regimen before

allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in several patients with haematological

malignancies (Beelen et al 2005; Casper et al 2003; 2004). Furthermore, last years, a few

groups have obtained mixed-chimerism and tolerance specific induction, in mouse models,

with non myeloablative conditionings including Treosulfan (Ploemacher et al 2004; van Pel

et al 2003; 2004). However, these protocols still required depleting antibodies, which are

not always available or accepted for clinical use.

In the context of muscle precursor cell allo-transplantation (MT) as clinical

approach for the Duchenne muscular dystrophy (DMD), a sustained FK506

immunosuppression is required to prevent a MT rejection in mice (Camirand et al 2001),

monkeys (Kinoshita et al 1996; Skuk et al 2000) and humans (Skuk et al 2004). DMD is a

142

fatal neuromuscular genetic recessive disease characterized by widespread muscle

degeneration throughout the body. No cure is currently available for this disease, which is

caused by the deficiency of a subsarcolemmal protein called dystrophin. MT consist to

improve the strength of at least some muscles in DMD patients (Skuk et al 2004). Briefly,

normal muscle precursor cells (MPC) harvested from a healthy donor are injected in

skeletal muscles of DMD patients, fuse with host muscle fibers, introduce their nuclei

containing the normal dystrophin gene and thus restore dystrophin expression (Kinoshita et

al 1995a; Skuk et al 1999a; Skuk et al 2000; Skuk et al 2004; Skuk et al 1999b; Skuk &

Tremblay 2000). As in all allo-transplantation conditions, one of problems facing this

therapy is the specific immune reaction directed against transplanted cells and hybrid

muscle fibers that they form (Guerette et al 1994; 1995a; Guerette et al 1996; Guerette et al

1995b; Guerette et al 1997b).

The goal of the present study is thus to test whether an antibody and radiation free

tolerance induction protocol, supported by a mild myeloablative agent regimen

conditioning, permits a stable allo-transplantation such as MT for the DMD.

To avoid the rejection BALB/c myogenic cells without a constant FK506

administration, C57Bl10J mdx/mdx mice were treated with our tolerance inducing protocol

called TTCB: i.e., a donor specific Transfusion, followed by a Treosulfan treatment

combined with single Cyclophosphamide dose and a donor Bone marrow transplantation.

We have demonstrated that without antibodies or radiation conditioning, all TTCB treated

mice developed stable multi-lineage mixed-chimerism and stable immunological tolerance

towards fully allogeneic myogenic cells and skin.

6.2 Materials and methods

6.2.1 Animals BALB/c mice (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA; H-2d) were used as

fully allogeneic donors. C57BL/10 J mdx/mdx mice (H-2b), which lack dystrophin

expression, were used as hosts. C3H mice (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA; H-

2k) were used as third-party haplotype donors. All experiments were conducted in

accordance of the Laboratory Animal Care and Use Ethics Committee of Laval University.

143 Donor specific transfusion (DST) and drug treatments

A DST consisting in a single dose of male and female adult BALB/c splenocytes

(1x108, intravenously) was done in mdx recipients 3 days before the BALB/c BMT.

Briefly, spleen were harvested and crushed in a cell strainer. The cell suspension was

filtered through a 70 µm nylon mesh (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) before

assessing cell viability using trypan blue. Cells were suspended in RPMI medium 1640

(Gibco, Burlington, ON) before intravenous injection. Treosulfan (500 mg/kg or 650

mg/kg) graciously obtained from Medac research (Medac, Wedel, DE) was dissolved in

37°C sterile water and intravenously administered (100 µL/mouse, at days -3, -2, -1 before

BMT). Cyclophosphamide (200 mg/kg) was dissolved in sterile water and administered

intraperitoneally (day –1 before BMT).

6.2.2 BMT Bone marrow cells (BMC) were obtained by flushing femoral and tibialis bones

from donor BALB/c mice with Hank’s balanced salt solution (HBSS; Sigma, St-Louis,

USA). BMCs were T cells depleted by a treatment with anti-CD90/Thy-1 (RT-550-PABX;

Medicorp, Montreal, QC, Canada) and with complement (low-tox M rabbit complement,

Cedarlane, Hornby, ONT, Canada). BMT (day 0) consisted of a 40×106 freshly harvested

adult BALB/c BMC intravenous injection.

6.2.3 MPC culture Newborn BALB/c mice (Jackson Laboratory, H-2d) were used for primary MPC

cultures as previously described (Cossu et al 1980). Briefly, arm and leg muscles were

dissociated with collagenase (600 IU/ml; Sigma, St-Louis, MO) and dispase II (2 mg/ml;

Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). The cell suspension was grown in DMEM

(Gibco, Burlington, ON) supplemented with 15% fetal calf serum and a mixture of

penicillin G (10 000 IU/ml) and streptomycin (10 mg/ml). After two days in culture, cells

were harvested and frozen in 40% DMEM, 50% fetal bovine serum (FBS) and 10%

dimethyl sulfoxide, until MT.

144

6.2.4 MPC transplantation (MT) The hind legs of mdx mice, which received or not the TTCB treatment, were

irradiated (20 Gy) to inhibit host MPC proliferation and thus reduce competition with

grafted MPCs (Wakeford et al 1991). Prior to MT, 1×106 BALB/c MPCs were suspended

in 10 µL of notexin (5 µg/ml) to induce myofiber necrosis without affecting the blood

vessels and peripheral nerves (Harris et al 1974). The Tibialis anterior (TA) of untreated or

treated mdx mice (H-2b) were injected in several sites with these fully MHC allogeneic

BALB/c MPCs (H-2d).

A positive control group for MT received a sustained immunosuppression during 1

month with FK506 (IM, 2.5 mg/kg/day) (Fujisawa Pharmaceutical Co. ltd, Osaka, Japan).

6.2.5 Skin transplantation Full thickness tail skin ~1 cm2 from BALB/c (H2-b) and third-party (C3H; H2-k)

were grafted on the dorsum of the mixed-chimeric mice 30 days after the BMT. Similar

skin grafts were performed on untreated or FK506-treated mdx/mdx mice and represented

respectively negative and positive control groups. Skin grafts were considered rejected

when less than 10% of the graft remained viable.

Blood and muscle collection Mouse blood was collected on days 30 and 130 post BMT. TA injected with MPCs

were dissected, placed in a 30% sucrose solution, embedded in OCT (Miles Inc., Elkhart,

IN), frozen in liquid nitrogen and serially sectioned at 12 µm using a Microm cryostat.

6.2.6 Immunohistochemical detection of Dystrophin Cryostat sections were incubated with a rabbit anti-mouse-dystrophin antibody

(Camirand et al 2004), followed by a goat anti-rabbit IgG conjugated with Alexa 488, or

Alexa 546 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA).

6.2.7Immunohistochemical detection of CD4 or CD8 T cells Cryostat sections were incubated with a rat anti-CD4 antibody (clone GK 1.5;

ATCC, Rockville, MD), or a rat anti-CD8 antibody (clone YTS 169; gift from Dr.

Waldmann, Oxford University, Oxford, UK). Sections were then incubated with a biotin-

145

conjugated rabbit anti-rat antibody (clone E0468, Dakocytomation, Mississauga, ONT),

followed by incubation with streptavidin-Cy3 (Sigma).

For all Immunohistochemical detections, non-specific binding sites were blocked

with FBS 10% in PBS and staining was observed with a UV lamp microscope using the

appropriate filter.

6.2.8 Elispot Spleen cells from untreated or mixed-chimeric mice were harvested and used as

effectors. Spleen cells from BALB/c or C3H mice were harvested and used as stimulators.

Cells were purified by Ficoll (Ficoll-Paque Plus, 17-1440-03, Amersham Bioscience AB,

Uppsala, SWE) in order to isolate peripheral blood mononuclear cells. Stimulator cells

were irradiated (20 Gy) and co-cultured (ratio 1:1) with effector cells for 48 hrs. Roughly

1x104 cells were placed on the coated plates of INFγ ELISPOT kit (Immuno-assay kit,

KME1235, Biosource International, Ca, USA) and incubated for 48 hrs. The spots were

then revealed with the reagent from the ELISPOT kit. Resulting spots were counted in each

well with a microscope. The mean number of spots in wells containing mixed-chimeric

mouse lymphocytes alone was evaluated and corresponded to the basal level of activity.

The mean level of activation was also calculated in the other wells containing both effector

and stimulator cells. The relative activity was the level of activation divided by the basal

activity level.

Flow cytometry

Blood samples of the treated mdx mice were harvested 30 days and 3 months post

BMT to determine the level of micro-chimerism. Blood samples of mdx and BALB/c mice

were also collected as negative and positive controls for H-2d haplotype. Briefly, blood

cells were stained with an anti-MHC class I H-2d haplotype (clone 34-2-12, BD

Biosciences, Mississauga, ONT, CA) specific for the donor BALB/c strain. The chimerism

level in different hematopoietic cell populations was determined with a phycoerythrin-

coupled anti-CD90 (clone RM5504-3, Cedarlane), and Cy5-coupled anti-CD4 (clone L3T4,

BD bioscience) or a Cy5-coupled anti-CD8 (clone 53-67, BD Biosciences). An anti-

146

FcγIIIR (clone 2.4G2, BD Biosciences) was added to the first incubation to block non-

specific FcγR binding of labelled antibodies.

A three-color FACS analysis was performed to analyze the expression of TCRs on

the host T cells. Blood cells from treated or untreated mdx mice were harvested at 3 months

post BMT. Cells were labelled with phycoerythrin-conjugated anti-Vβ11 or anti-Vβ8.1/8.2

mouse antibody (respectively clone CTVB11 or KJ16, Cedarlane), and Cy5-CD4 mouse

antibody (L3T4, BD Biosciences). The percentage of mdx-derived CD4 cells that were

Vβ11 or Vβ8.1/8.2 represents the number of CD4+ and Vβ+ cells gated on a total event of

1x104 leukocyte cells (discriminated by FACS with size scatter and forward scatter)

divided by the total CD4+ cell population gated with the same method. The labelling was

analyzed with a flow-cytometry (Epics XL, Coulter, Miami, FL).

6.2.9 Statistical analysis. A Fisher PLSD test was used for statistical analysis using the Stat View software

(SAS Institute inc, Cary, NC) and P <0.05 was considered statistically significant.

6.3 Results

6.3.1 Cyclophosphamide/Treosulfan combination permits bone marrow engraftment

The conditioning regimen, called TTCB was done to mdx/mdx recipients as shown

in figure 24. Blood samples were collected 30 and 230 days after the BMT, to determine

the peripheral chimerism level using cell-specific markers for CD90, CD4 and CD8 (Figure

25). Thirty days after the BMT all TTCB treated mice had significant levels of mixed-

chimerism for leukocytes (3-81%), CD4 lymphocytes (1-51%) and CD8 lymphocytes (1-

29%). Significant levels of mixed-chimerism were also observed 230 days after the BMT.

However, leukocyte mean mixed-chimerism decreased from 28% to 13% (p<0.05),

between 30 and 230 days post BMT (Figure 25A). In figure 25D, TTCB mice were

classified in function of their CD90 mixed-chimerism level measured 30 and 230 days post

BMT. Thirty days after the BMT, most of mice (69%) had a leukocyte mixed-chimerism

level between 15% and 35%. This distribution was changed 230 days after the BMT, since

an equal number of mice were distributed between [1.5 %-15%] and [15 %-35%] ranges of

147

leukocyte chimerism level. This observation coincides with the decrease of the mean

mixed-chimerism mentioned above.

Two mice (numbers 5 and 13) died between the 30th and 230th days after the BMT.

We cannot exclude that these mice developed a GVHD since they both presented a

significant level of mixed-chimerism. However, no evident clinical sign of GVHD, such as

a sudden loss of weight, was observed (data not shown).

6.3.2 Clonal deletion of allo-reactive T cells occurred in response to BMT after the TTCB treatment

Vβ T-cell receptors (TCR) were used to evaluate anti-donor reactivity and verify

whether our protocol resulted in deletion of host cells bearing anti-donor reactivity, an

evaluation of central tolerance (Cossu et al 1980; Harris et al 1974; Hoffman et al 1990;

Tomita et al 1996a; Tomita et al 2000; Wekerle et al 1998). Two hundred days after the

BMT, a deletion of Vβ11 TCR-bearing CD4+ T cells was observed in the peripheral blood

of mice that received the TTCB tolerigenic treatment (Figure 26). Thus, the percentages of

Vβ11 TCR CD4+ T cells were significantly lower in TTCB treated mdx mice than in

untreated mdx mice (p<0.01), and were similar to the levels seen in untreated BALB/c

mice. As a control, the percentage of Vβ8, which should not be deleted in any strain of

mice, was also examined. No significant differences in the percentage of CD4 cells

expressing Vβ8 were detected in mdx mice before and after receiving the TTCB treatment,

demonstrating the specificity for deletion of Vβ11 TCR-bearing CD4+ T cells and

involving a central tolerance establishment.

6.3.3 The TTCB treatment led to long-term survival of fully allogeneic MPC transplantation (MT).

Mdx mice received the TTCB treatment, followed 30 and 130 days later, by two

MTs respectively in the left TA (MT1 in TA.L), and in the right TA (MT2 in TA.R). To

assess MT survival and fusion with the remaining muscle fibers of mdx mice, both injected

TAs were harvested 100 days after MT2 (Figure 24). Dystrophin expression (Figure 27) in

whole TA section of a grafted muscle was determined by immuno-histochemistry (of note,

MPCs do not express dystrophin before their fusion with muscle fibers). An average of

340.91+ 63.03 fibers (MT1 in TA.L) dystrophin positive fibers were observed in left TA

148

muscles of TTCB treated mice. Rare dystrophin-positive fibers (~5-10 fibers/muscle

section) were present in muscles of naive mdx mice. Similarly, low frequency (6.6 + 3.7

fibers/muscle section) dystrophin-positive fibers were observed in muscles of mdx control

mice, which did not received the TTCB treatment but received a MT (Figure 27B, 28). A

high number of dystrophin positive fibers (277+ 41 fibers) was observed in mdx mice

immunosuppressed daily with FK506 (Figure 27A, 28). This shows that similar high-level

engraftment of MPCs did occur when immunological rejection was prevented either with

FK506 or with the TTCB treatment. Importantly, mice that received the TTCB treatment

had significant long-term MPC engraftment as evidenced by high-levels of dystrophin

expression 200 days after MT1 (Figure 27C, 28) in MPC-grafted TA.L.

Since several successive MTs will be required to treat several muscles in DMD

patients, the immunological tolerance induced by the TTCB treatment should resist to

several donor stimulations. Therefore, MT2 was done as a challenge to assess the

persistence of the tolerance. Dystrophin expression was examined in both injected TA

muscles 100 days after the MT2. Interestingly (Figure 27D, 28), the mean number of

dystrophin positive fibers was not significantly different in both grafted TA (TA.L:

340.91+ 63.03 fibers; TA.R: 331+ 39.42 fibers), demonstrating that a second allograft did

not affect the survival of the original allograft. Moreover, the number of muscle fibers

expressing dystrophin in TA.L or TA.R was similar to that observed after a sustained

FK506 administration.

6.3.4 No increase of T-cell mediated activity was observed in the grafted TAs of the TTCB treated mice.

Signs of a cellular immune reaction against the transplanted MPCs and against the

muscle fibers resulting from their fusions were also assessed. This includes assessment of

infiltration by CD4 and CD8 lymphocytes. Therefore, TA sections of mixed-chimeric mice,

which received MT, were evaluated for signs of muscle fibers invasion by cytotoxic cells.

The presence of CD4 and CD8 lymphocytes around the dystrophin-positive fibers was

investigated by immuno-histochemistry. TAs from untreated mdx/mdx mice grafted with

BALB/c MPCs were the positive controls for lymphocyte staining. High numbers of CD4

and CD8 lymphocytes infiltrated these positive control muscles (Figure 29). Non-grafted

149

TAs from untreated mdx/mdx were used as negative controls for lymphocyte staining and

exhibited a low level patchy focal lymphocytic infiltrates containing both CD4 and CD8

cells (Figure 29). Such a lymphocyte infiltration has previously been reported in the mdx

muscles and attributed to the permanent inflammatory reaction present in these muscles

where fibers are frequently in degeneration/regeneration (Spencer et al 2001). Comparable

low levels of CD4 and CD8 infiltrations were observed in the MPC grafted TA muscles of

the mice that previously received the TTCB treatment. Interestingly, the second allograft

(TA.R) had no effect in the stability of this specific immune unresponsiveness against MT

since no increased infiltration was observed.

6.3.5 The TTCB treated mice developed a donor specific tolerance. The anti-donor immune response was also investigated in the mixed-chimeric mice.

To test this, all the mice that received the TTCB treatment and that had been successfully

grafted with BALB/c donor MPCs were sacrificed 200 days after MT1. Spleen cells were

collected, and the frequency of reactive T cells producing IFNγ, a type 1 cytokine, was

measured by a modified ELISPOT assay. Spleen cells obtained from untreated mdx/mdx

mice were used as positive controls. T cells from chimeric mice did not react in presence of

stimulator cells of a BALB/c donor (Figure 30A). In contrast, T cells of chimeric mice

showed an increased IFNγ production in presence of stimulator spleen cells of a third-party

allogeneic (C3H) mouse. These data indicate that tolerance to the BALB/c MT induced in

TTCB treated mice was strictly associated with the abrogation of anti-BALB/c type 1

immune response. T-cells from TTCB treated mice consistently showed strong stimulation

and secretion of IFNγ in presence of stimulator cells of a third-party haplotype. Finally, the

level of IFNγ production was equivalent when T-cells from TTCB treated mice were in

presence of C3H T-cells and when T-cells from untreated mdx mice were in presence of

either BALB/c T-cells or C3H T-cells. This result indicated that the immune system of the

TTCB mice conserved its capacity to respond to an allogeneic stimulation as well as

immune system of untreated mdx mice. In order to support these in vitro results, an

additional group of 6 mdx/mdx mice received the TTCB treatment. However, considering

the variation and the time dependant decrease of mixed-chimerism level, observed between

the 13 TTCB treated mice of the first experiment, the dose of Treosulfan dose was

increased from 500 mg/kg (1st experiment) to 650mg/kg. Their levels of mixed-chimerism

150

were also quantified as described above 30 and 230 days after the BALB/c donor BMT.

Interestingly, as illustrated in figure 30B, thirty days after the BMT all mice, which

received a TTCB treatment including a higher dose of Treosulfan, developed high and

homogeneous mixed chimerism levels for leukocyte (46.55+3.74%), CD4+ (34.7+6.37%)

and CD8+ (16.92+4.39%) lymphocyte populations. Moreover, in opposite to the first

experiment, 230 days after the BMT mixed-chimerism level remained homogeneous

between the TTCB treated mice and increased for leukocyte (68.64+ 3.74%), CD4+

(68.34+11.43%) and CD8+ (65.91+8.1%) lymphocyte populations (p<0.01). These mixed-

chimeric mice then received allogeneic skin graft from both BALB/c and C3H donors.

Untreated and FK506 treated mdx/mdx mice were also similarly grafted and respectively

corresponded to our negative and positive control groups. As showed in figure 30C,

untreated mice promptly rejected both skin grafts (1-3 weeks post grafting). FK506-treated

mice preserved skin grafts until the end of FK506 treatment period, and then rejected it (1-4

weeks after the end of the FK506 treatment). TTCB treated mice fast rejected third-party

donor skin graft (1-2 weeks post-grafting). Importantly, however, this rejection of C3H

donor skin did not precipitate rejection of donor-specific BALB/c skin graft, which

survived throughout the follow-up period, i.e., 10 weeks. Thus the development of mixed-

chimerism by the TTCB treatment allowed to a long-lasting donor-specific tolerance.

6.4 Discussion Sustained immunosuppression increases infection and cancer risks (Bennett 1998;

Falkenhain et al 1996; Glover et al 1997; Neu et al 1997; Penn 1998; Tanabe et al 1996).

An alternative method to permit graft acceptance by the host is the induction of

immunological tolerance. An established approach depends on central immune system

tutoring through the development of mixed hematopoietic chimerism (Sharabi & Sachs

1989; Wekerle & Sykes 1999). Several strategies for tissue or organ transplantations,

developed in many animal models such as mouse or monkey, already allow permanent or

transient mixed-chimerism development. However, most of them involve irradiation

conditioning associated with depleting or blocking antibodies (Camirand et al 2004; de

Vries-van Der Zwan et al 1994; Kawai et al 2004; Ploemacher et al 2004; van Pel et al

2003; 2004). Moreover, the mAbs used for these treatments are not available or not already

151

approved for clinical use. A promising alternative method proposed the combination of

alkylators, Busulfan and Cyclophosphamide, and a single donor spleen cell transfusion

(Tomita et al 2000). All mice treated with this conditioning regimen developed stable

multilineage chimerism. Furthermore, Tomita et al. demonstrated in that publication that all

components of this regimen were required for the establishment of a firm mixed chimerism

(Tomita et al 2000). However, Busulfan toxicity compromises this therapy finality (Casper

et al 2003; 2004; Kroger et al 2001; Ringden et al 1999; Ritchie et al 2001; Schetelig et al

2002; Slavin et al 1998; Storb et al 1997). This study proposes a conditioning regimen

called TTCB, which is based on Treosulfan administration. The low dose of Treosulfan

(Figure 25 and 30) used in this TTCB treatment should be considered as a non

myeloablative conditioning regimen (Ploemacher et al 2004). This new conditioning

regimen is well tolerated as expected since none of treated mice developed any signs of

GVHD, and only 2 of 19 mice died after the beginning of protocol for unknown causes. As

demonstrated following the TTCB treatment, a stable multi-lineage mixed-chimerism was

obtained for leukocytes and more especially for both CD4 and CD8 T cell populations. In

the first experiment (Figure 25), the mixed-chimerism levels were variable in TTCB treated

mice. However, this variability did not prevent the establishment of central tolerance

(Figure 24). In addition, all treated mice presented comparable stable clonal deletion level,

230 days after the BMT, independently of their mixed-chimerism level indicating that all of

them had acquired central tolerance. In the second experiment, the TTCB treated mice

(Figure 30) showed elevated and uniform mixed-chimerism levels 30 and 230 days post

BMT, probably due to the higher dose of Treosulfan administrated (3 x 650 mg/kg instead

of 3 x 500 mg/kg). In this second experiment, increased mixed-chimerism levels were

observed in the TTCB treated mice between the 30th and the 230th days post BMT

(p<0.01). A previous study in mice, involving T-cell depletion with an anti-CD3 mAb

combined with a Treosulfan treatment, demonstrated that similar uniform levels of mixed-

chimerism were obtained. However, this protocol required not only the use of a monoclonal

antibody but also higher doses of Treosulfan, i.e., three consecutive administrations of 1500

mg/kg (van Pel et al 2003).

The second aim of this study was to evaluate the application of a protocol of

tolerance induction in the context of an allotransplantation for a cellular therapy. Currently,

152

no effective treatment for DMD exists and MT represents a potential treatment since

normal MPCs, carrying the wild type dystrophin gene, can fuse with and provide the pre-

existing muscle fibers with a normal dystrophin gene. However, MT faces several technical

problems. Because MPCs have a weak motility in vivo, multiple injections are required to

reach a good incorporation of the donor MPCs throughout a given skeletal muscle (Skuk et

al 2000). Because of this problem, many MTs at different times would be needed to restore

efficiently the dystrophin expression in several muscles of DMD patient. Therefore, strong

and stable tolerance is essential to avoid a repeated tolerigenic treatment before each MT.

Our present results are important in this context because for the first time, a regimen

exclusively based on drugs currently approved for human used, allowed tolerance induction

for allogeneic MT. Indeed, in agreement with the potential clinical application requiring

several consecutive MTs in DMD patients, all mice receiving the TTCB regimen

demonstrated long-term engraftment and donor specific tolerance to a re-challenge with

allogeneic MPCs.

Even without any allogeneic MT, the presence of activated lymphocytes

(CD44high, CD4 or CD8) was increased in mdx mouse muscles compared to those of the

non-dystrophic allelic strain, i.e., C57BL10J mice (Spencer et al 2001). However, the

frequency of activated T cells was not elevated in mdx lymph nodes, suggesting a muscle-

specific T cell activation. Moreover, it has been demonstrated that T cells promote mdx

pathology and suggested that immune-based therapies may provide benefit to DMD

patients (Spencer et al 2001). A previous tolerigenic protocol, by our group, using co-

stimulatory blockade with anti-CD45Rb and anti-CD154, revealed an increased

lymphocyte infiltration in MPC-grafted muscles of mixed-chimeric mdx/mdx mice even

though dystrophin positive fibers formed by the transplanted MPCs persisted (Camirand et

al 2004). Our present results showed (Figure 29) that in TTCB treated mice, the presence of

CD4 or CD8 T cells was not increased in grafted TA compared with the mdx/mdx standard

TA. Thus our protocol avoided a muscle specific response, which may have been present

with the co-stimulatory blockade protocol.

Finally, the TTCB treated mice significantly maintained reactivity to unrelated

antigenic challenge as demonstrated by third-party skin graft rejection. The tolerance

153

specificity was confirmed by the inactivity of the T cells of the TTCB treated mice towards

BALB/c spleen cells, while in contrast a high reactivity was present against the spleen cells

of a third-party (C3H) (Figure 30A). Additionally, the reactivity level of the C3H activated

T cells was similar for TTCB treated or native mdx mice suggesting that specific immune

system of TTCB treated mice has conserved his original capacity to respond to allo-

antigens.

The present study demonstrates that Treosulfan, in a protocol requiring no

irradiation and using only drugs already approved for clinical use, permitted to obtain a safe

and sustained donor specific immunological tolerance for MT in mice. Moreover, given

that Treosulfan is already reported to have a low toxicity profile in hematopoietic stem cell

transplantations, the merits of including Treosulfan in non myeloablative regimen in

clinical setting, such as for dystrophic patients, should be seriously evaluated (Beelen et al

2005; Casper et al 2004; Scheulen et al 2000).

This study also shows that multiple MPC injections after a drug-induced tolerance,

leads to stable dystrophin expression in a large number of muscle fibers (Figure 28). The

level of dystrophin expression obtained in the present study has been previously shown to

improve strength and decrease exercise-induced injury (Alameddine et al 1994a;

Alameddine et al 1994b; Alameddine et al 1994c; Brussee et al 1998; Irintchev et al 1997a;

Irintchev et al 1997b; Liu et al 2005). Moreover, some of the transplanted MPCs will not

fuse immediately and will remain as quiescent satellite cells, which will be able to repair

subsequent damage induced by normal muscle activity (Alameddine & Fardeau 1990;

Gussoni et al 1999; LaBarge & Blau 2002; Lee et al 2000). Additionally, we have shown

that excellent distribution of MPCs can be achieved even when transplanted into larger

muscles of non-human primates with up to 70% to of the fibers expressing a donor gene

(Skuk et al 2000). Finally, a recent patient study showed a successful MT, which restored

around 50% of dystrophin expression in the grafted area (Skuk D 2005). Associated with

the monkey and murine studies noted above (Alameddine et al 1994a; Alameddine et al

1994b; Alameddine et al 1994c; Brussee et al 1998; Irintchev et al 1997a; Irintchev et al

1997b; Liu et al 2005; Skuk et al 2000), MT coupled with TTCB treatment could be

expected to improve strength, quality of life and perhaps the life span of DMD patients.

154

Moreover this approach may be useful to improve TTCB as a potential tool for other cell,

organ or tissue transplantations.

This work was supported by:

ROTRF (Roche Organ Transplantation Research Fondation) AFM (Association Française contre les Myopathies) Acknowledgement: This work has been revised by Dr Skuk.D

155

Figure 24 : Tolerance induction protocol and MPC transplantation chronology

Time course of a non-myeloablative conditioning treatment (called TTCB) and of MPC transplantations (MT1 and MT2, 1x106 BALB/c MPCs) The TTCB treatment includes: Treosulfan (TREO, 3 doses of 500 mg/kg), BALB/c donor specific Transfusion (DST, 1x108 spleen cells), Cyclophosphamide (CYP, 1 dose of 200 mg/kg), and BALB/c donor Bone marrow transplantation (BMT, 40x106 CD90-depleted bone marrow cells). The level of mixed-chimerism level was analyzed at days 30 and 230. Mice were sacrificed 230 days after the BMT, blood and both grafted Tibialis anterior (TA.L and TA.R) were collected.

156

Figure 25 : Peripheral mixed-chimerism level evaluation

Levels of peripheral blood mixed-chimerism were evaluated in mice, which received the TTCB conditioning regimen. The level of mixed chimerism at 30 and 230 days after the BMT are represented respectively in white and in black columns. This analyze was performed for the leukocyte cell population and the CD8 or CD4 T-cell population, respectively, A, B, C. Note that mice 5 and 13 died between days 30 and 230. The distribution of mixed-chimeric mice at 30 and 230 days after the BMT according to the percentage of donor haplotype CD90 cells is represented (D).

157

Figure 26 : Clonal deletion of allo-reactive T cells occurs in response to TTCB conditioning.

Clonal deletion level of donor-reactive CD4+ Vβ11+ cells was assessed in peripheral blood samples of mixed-chimeric mice (n=11). The mixed-chimeric mouse group was compared with untreated donor (BALB/c, n=5) and recipient (mdx, n=5) mouse strains. Peripheral CD4+ cells in mixed-chimeric mice were assessed on day 230 post BMT for Vβ8 (control) or Vβ11+ (donor reactive) T-cell receptor (TCR) (*p<0.001 compared with untreated mdx mice).

158

Figure 27 : Stable mixed chimerism led to long-term survival of several fully allogeneic MPC transplantations.

Dystrophin expression was detected by immuno-histochemistry using an anti-dystrophin anti-serum in cryostat sections of the TA muscles of mdx mice grafted with BALB/c MPCs (magnification X100). A: Mdx mice chronically immunosuppressed with FK506 shown 30 days after MPC injection. B: Untreated mdx mice 40 days after MPC injection. C: Mixed-chimeric mdx mice showed 200 days after the first MPC injection (MT1) in left TA (TA.L). D: Mixed-chimeric mdx mice showed 100 days after the second MPC injection (MT2) in right TA (TA.R).

159

Figure 28 : The success of MPC transplantation in mixed-chimeric mice is similar to that observed in FK506 chronically immunosuppressed mice.

Mean number of dystrophin positive fibers in TA muscle sections of mice that received allogeneic BALB/c MPC transplantation. Dystrophin positive fibers were individually counted in photographs of cryostat section of the muscle of the mixed-chimeric mice TA (n=11) 200 days after the first MPC injection in left TA (MT1/TA.L) or 100 days after the second (challenge) MPC transplantation in right TA (MT2/TA.R). A similar procedure was used for chronically FK506 immunosuppressed mdx mice (n=5; FK506) and for untreated mdx mice (n=5; control (-)). TAs of FK506 or control (-) group were harvested 40 days after the MPC injection. (*p<1x10-7 compared with control (-)).

160

Figure 29 : No increase of T-cell mediated activity was observed in the grafted TA of mixed-chimeric mice.

Signs of a cellular immune reaction against the transplanted MPCs and against the muscle fibers resulting from their fusion were assessed by immuno-histochemistry. This included assessment of infiltration by CD4 and CD8 T-cells with a red immunofluorecence staining (Streptavidine-Cy3) and localization of dystrophin-positive fibers with green immunofluorecence staining (Alexa 488). Whole TA muscle sections in A and 10X magnifications of the same sections in B are represented. TA of untreated mdx mice grafted with donor BALB/c MPCs and collected 7 days after the MPC injection were considered as positive control (Control(+)).Non-grafted TA muscles of untreated mdx mice were the negative controls (Control(-)). Mixed-chimeric mice injected with BALB/c donor MPCs for a second time in the right TA (MT2/TA.R) were sacrificed 100 days after this second MPC injections and both TAs were collected. Both stainings were performed on TA sections, combining dystrophin (dys) and CD4 staining or dystrophin and CD8 staining. The merges represent the respective staining associations, i.e., dys/CD4 or dys/CD8.

161

Figure 30 : Mixed-chimeric mice developed a stable donor specific tolerance. T-cell activity of mixed-chimeric mice in presence of donor BALB/c or third-party C3H spleen cells

was evaluated by the INFγ-ELISPOT method (A). Spleen cells of diverse mice were mixed in a 1:1 ratio. Spleen cells of mice, which developed mixed chimerism following the TTCB treatment, were mixed with BALB/c or C3H spleen cells (respectively BALB/TTCB, n=10 or C3H/TTCB, n=6). Spleen cells of mdx mice were mixed with BALB/c or C3H spleen cells (respectively BALB/mdx, n=5 or C3H/mdx, n=5). As reference of basal T-cell activity, the mean number of spots/well was calculated for spleen cells alone of mixed-chimeric mice (n=6). The ratios of the mean number of spots/well is illustrated for each cell combination and for basal T-cell activity (*p<0.001 compared with BALB/TTCB combination). Levels of peripheral blood mixed-chimerism were evaluated in 6 mice, which received the TTCB treatment (B). The levels of mixed chimerism 30 and 230 days after the BMT are represented for the leukocyte cell population and for the CD8 and CD4 T-cell populations. Skin graft survival was determined for mice, which received the TTCB regimen (C). Untreated mdx mice (n=5) or FK506 treated mdx mice (n=5) received simultaneously BALB/c and C3H skin grafts. Similar skin grafts were performed 30 days after BALB/c BMT on mice, which received the TTCB regimen (n=6). (*** marked the end of FK506 administration).

162

Discussion générale L’ensemble des travaux réalisés au cours de cette thèse visait à améliorer le

potentiel clinique de la TM appliquée à la dystrophie musculaire de Duchenne. À cette fin,

deux approches ont été tentées pour contrecarrer la destruction des myoblastes survenant

après leur greffe et réduisant de ce fait le succès clinique de cette transplantation.

Compensation de la perte précoce des myoblastes transplantés

La première vague de mortalité cellulaire qui frappe les myoblastes apparaît dans

les premières heures qui suivent leur injection. Cette observation avait été effectuée par

notre laboratoire ainsi que par d’autres équipes de recherche. Elle a été de nouveau

confirmée au cours de l’étude qui constitue le premier article de cette thèse. Ainsi, près de

60 à 70% des myoblastes humains, greffés dans des souris SCID, sont détruits dans les 48

heures post-transplantation. Néanmoins, cette perte cellulaire ne prévient pas complètement

le succès de la transplantation. En effet, les cellules greffées qui survivent peuvent

proliférer et ultérieurement fusionner entre elles ou avec les fibres de l’hôte. En outre,

plusieurs études ont démontré l’importance, en période post-traumatique, que pouvaient

avoir la prolifération, la fusion et la survie des cellules myogéniques sur la régénération

musculaire (Charge & Rudnicki 2004). De ce fait, la première étude de cette thèse visait à

améliorer le succès d’une transplantation de myoblastes humains, en greffant ces derniers

dans un contexte favorisant leur prolifération, leur différenciation et leur survie.

La forme active de la vitamine D3 (VD3) produit plusieurs effets susceptibles de

répondre à cette attente. Ses effets mitogéniques et morphogéniques ont été préalablement

décrits sur des myoblastes d’embryon de poulet (Boland et al 1995; Boland et al 1985). Les

mécanismes d’action de la VD3 sur ces cellules sont encore sous investigation. Néanmoins,

il semble que les effets mitogéniques et morphogéniques de cette molécule soient

imputables à son récepteur membranaire (Figure 31). Les voies de signalisation cellulaire

passant par la phosphorylation des tyrosines aisni que par les « MAP »kinases et JUNK

kinases sont impliquées dans la prolifération et la différenciation des myoblastes de souris

et d’embryons de poulet (Boland et al 2005; Buitrago et al 2006). Ceci laisse penser que les

effets de la vitamine D3 sur la modulation de la prolifération et myoblastes sont

163

principalement médiés par son récepteur membranaire. Toutefois, une participation du

récepteur nucléaire n’est pas à exclure (Buitrago et al 2006). Ce même récepteur

membranaire est notamment présent à la surface des myoblastes humains (Bischoff et al

2001).

164 différenci

Figure 31 : Signalisation intracellulaire dépendante de la forme active de la vitamine D3. Le 1α25-dihydroxycholécalciférol agit sur les cellules par des mécanismes génomiques et non-génomiques. Classiquement, il est établi que la forme active de la vitamine D3 interagit avec l’ADN pour déclencher une synthèse de protéines dont le promoteur reconnaît le VDR. Des études plus récentes démontrent que la forme active de la vitamine D3 induit une réponse biologique plus rapide en passant par des voies de signalisation intracytoplasmiques.

165

Notre première étude révèle effectivement que la VD3 a in vitro des effets bénéfices sur la

prolifération et la différenciation des myoblastes humains. De plus, nous avons démontré

que l’administration de cette molécule augmente in vivo la prolifération des myoblastes

injectés et favorise la réussite de leur transplantation. Cependant, il est difficile de discerner

et de quantifier l’impact de chacun des effets sur la prolifération et sur la différenciation sur

l’amélioration du succès de la TM. Malgré tout, nos expériences sur la mortalité des

myoblastes nous permettent d’écarter la possibilité que la VD3 influence la survie des

myoblastes transplantés. En effet, même si cette molécule réduit l’apoptose induite par des

cytokines pro-inflammatoires (Boland et al 2005; Riachy et al 2002), elle s’avère inefficace

sur les myoblastes humains.

En dehors du fait que la VD3 agit sur ces cellules, cette molécule se distingue par

ses effets sur la réponse immunitaire. Premièrement, la VD3 semble diminuer l’efficacité

de la réponse immunitaire innée qui se déroule dans les premiers instants qui précèdent la

transplantation (Cantorna et al 1998a; Cantorna et al 1998b; Cantorna et al 1998c; Hullett

et al 1998). Deuxièmement, la VD3 agit sur les mécanismes de tolérance immunitaire

périphérique (Adorini et al 2003; Berer et al 2000; Bhalla et al 1984; Gregori et al 2001;

Gregori et al 2002; Penna & Adorini 2000). Les expériences réalisées in vivo avec la VD3

ont été faites chez des souris SCID. L’utilisation de ces souris a permis d’exclure que la

VD3 améliore le succès de greffe de myoblastes humains via une modulation de

mécanismes de tolérance périphériques, les souris SCID n’ayant pas de lymphocytes. De

plus, la VD3 n’augmente pas chez ces souris la survie des myoblastes transplantés. Ce

résultat indique que la mortalité des myoblastes due à l’inflammation ne semble pas

influencée par l’administration de VD3. Toutefois, même la VD3 ne présente pas d’intérêt

d’un point de vue immunitaire à la vue des transplantations de myoblastes humains

effectuées la souris SCID, sa participation à l’augmentation de succès d’une allogreffe n’est

pas à exclure. En effet, l’application en clinique d’une TM allogénique requière

l’immunosuppression au FK506 des patients traités. Or, il est présentement établi que

l’administration de VD3 agit en synergie avec le FK506 et permet ainsi de réduire la dose

de FK506 prescrite pour une efficacité immunosuppressive équivalente (Mathieu et al

1994; van Etten et al 2000). Notre étude (article I), démontre que l’administration conjointe

166

de VD3 et de FK506 n’interfère pas sur l’augmentation du succès de greffe enregistré avec

l’administration de VD3 seule. Néanmoins, il reste à effectuer des tests qui confirmeraient

qu’une administration de VD3 puisse réduire la dose efficace de FK506.

En conclusion de notre première étude, nous pensons qu’un traitement basé sur

l’administration de VD3 pourrait améliorer le succès des transplantations de myoblastes à

des patients Duchenne. À première vue, l’augmentation de la prolifération des cellules

transplantées joue un rôle dans ce résultat. L’augmentation de la fusion des myoblastes

observée in vitro pourrait également participer au renforcement de la capacité myogénique

des cellules transplantées. En outre, il reste à effectuer des études plus fondamentales sur

les myoblastes humains pour comprendre par quels mécanismes cellulaires la VD3 module

les capacités mitogéniques et myogéniques des myoblastes humains. Enfin, il ne faut pas

oublier que la VD3 est déjà utilisée en clinique par exemple pour le traitement de

problèmes osseux. Sa posologie est donc très bien documentée et ceci favorise donc une

application possible en clinique pour la TM. Cependant, les doses efficaces qui ont été

administrées aux souris SCID pourraient très bien chez l’être humain correspondre à des

doses susceptibles de provoquer une hypercalcémie (Hathcock et al 2007). L’utilisation

d’un analogue de la VD3 (Amuchastegui et al 2005) ne causant pas d’hypercalcémie

pourrait palier à ce problème. Il faudrait cependant confirmer l’effet de ces analogues sur la

TM.

Assurer la survie à long terme des myoblastes transplantés sans immunosuppression

soutenue

La réponse immunitaire spécifique suite à une TM allogénique est à l’origine de la

deuxième vague de mortalité cellulaire qui frappe les myoblastes après leur transplantation.

Toutefois, à la différence de la première vague de perte cellulaire, cette dernière annihile

complètement le résultat de la greffe, tous les myoblastes du donneur ainsi que les fibres

musculaires qu’ils ont formées par leur fusion sont detruits. Actuellement, les patients

subissant une allogreffe sont tous sous immunosuppression soutenue. Ce type de traitement

est également nécessaire pour les patients dystrophiques qui reçoivent une TM (Skuk et al

2004; Skuk D 2005). L’administration en continue de FK506, est le traitement qui donne

présentement les meilleurs résultats pour la TM. Malheureusement, ce traitement est un

167

frein majeur pour la prolongation des essais cliniques puisqu’il est toxique à long terme et

pourrait de ce fait réduire l’espérance de vie des patients traités même si la greffe rétablit

l’expression de dystrophine. Une alternative à l’immunosuppression soutenue consiste à

induire une tolérance immunologique via l’établissement d’un chimérisme hématopoïétique

mixte. Pour que cette approche fonctionne, il faut détruire tous les clones alloréactifs de

l’hôte. Puis il faut réaliser une greffe de moelle osseuse efficace provenant du même

donneur que l’organe (ou les cellules) transplanté. Beaucoup de protocoles ont été

développés chez la souris mais très peu ont été testés et surtout validés chez les primates

non-humains et chez l’homme. Pour l’instant, pour obtenir un chimérisme hématopoïétique

mixte, les conditionnements des receveurs les plus prometteurs requièrent l’utilisation

d’anticorps bloquants ou déplétants ainsi que l’irradiation thymique ou pan corporelle du

receveur. Ces conditionnements sont encore jugés trop invasifs pour être utilisés chez

l’humain. Quant à l’utilisation d’anticorps bloquants ou déplétants, leur disponibilité est

encore faible et le recul thérapeutique les concernant est trop court. Néanmoins il est

important de noter que dans le cadre d’une TM, un protocole nécessitant l’utilisation

d’anticorps déplétants ou bloquants a été réalisé avec succès chez la souris mdx (Camirand

et al 2004). Cependant les anticorps équivalents ne sont pas disponibles pour les antigènes

humains. Ils devraient donc être produits et validés pour utilisation clinique, un processus

très couteux.

Une autre approche pour obtenir du chimérisme hématopoïétique mixte consiste à

utiliser des drogues cytoréductrices pour détruire les clones alloréactifs et détruire

partiellement la moelle du receveur pour permettre un « enracinement » de la moelle du

donneur. Ce concept a été développé avec succès en 2000 et implique l’administration de

busulfan et de cyclophosphamide (Tomita et al 2000). Cette approche a conduit chez la

souris au maintien à long terme de greffes de peaux pleinement allogéniques. Bien que le

résultat obtenu soit très intéressant, l’administration de busulfan est hématotoxique et

organotoxique. Par ailleurs, ces effets délétères persistent même après réduction de la

quantité de busulfan administrée (Ringden et al 1999; Ritchie et al 2001). Le deuxième

article de cette thèse proposait de remplacer le busulfan par un dérivé moins toxique du

busulfan : le tréosulfan. À l’origine le tréosulfan était administré aux patientes souffrant de

cancer ovarien. Puis, bénéficiant d’une toxicité réduite en comparaison avec le busulfan, le

168

tréosulfan fut inclu, chez l’enfant, dans des protocoles de transplantation de cellules

souches hématopoïétiques. Il faut noter que l’un de ces traitements cliniques propose une

administration conjointe de tréosulfan et de cyclophosphamide. Enfin, ces dernières années,

le tréosulfan a été utilisé avec succès, chez la souris, dans des protocoles d’établissement de

chimérisme hématopoïétique. Néanmoins ces protocoles proposent encore une déplétion

des clones lymphocytaires alloréactifs par des anticorps.

L’utilisation en clinique du tréosulfan et du cyclophosphamide offre une avenue

intéressante pour la conception d’un protocole de développement de tolérance,

particulièrement pour le traitement d’un enfant. C’est pourquoi nous avons mis au point un

tel protocole, chez le modèle murin dystrophique, basé sur l’administration conjointe de ces

deux drogues. Nous avons dénommé l’ensemble de ce protocole de conditionnement :

TTCB, pour « Transfusion, Treosulfan, Cyclophosphamide, Bone marrow

transplantation ». Ce protocole a conduit au développement stable d’une tolérance aux

allogreffes de peaux et aux allotransplantations de myoblastes. Notre première tentative

révèle chez les souris traitées l’établissement d’un chimérisme hématopoïétique mixte.

Nous avons enregistré une certaine variabilité inter-souris n’influençant toutefois

aucunement le résultat positif des TMs. Nous avons répété un protocole identique en

augmentant la dose de tréosulfan, et obtenu un chimérisme mixte constant chez toutes les

souris. Par ailleurs, un chimérisme similaire avait été obtenu chez les souris par une autre

équipe utilisant le tréosulfan. Néanmoins, les doses de tréosulfan administrées étaient

supérieures à celles utilisées dans notre protocole (van Pel et al 2003). En ce qui concerne

le chimérisme mixte, nous avons démontré que ce chimérisme reposait sur des mécanismes

d’induction de tolérance centrale. L’implication d’une tolérance périphérique n’a pas été

démontrée. Cependant, une étude réalisée chez la souris a révélé que les mécanismes de

tolérance périphérique intervenaient dans les premiers jours qui suivaient la transplantation

de moelle osseuse. Ces mécanismes semblent nécessaires à l’établissement du chimérisme

hématopoïétique mais n’influenceraient pas le maintien à long terme de la greffe

(Bigenzahn et al 2005). Pour que le TTCB réponde parfaitement aux critères de la TM, il ne

doit pas interférer avec la capacité myogénique des cellules transplantées. Également, il

faut prendre en considération la répétition des injections de myoblastes dans le temps pour

traiter une grande surface musculaire. La tolérance établie doit donc résister à plusieurs

169

transplantations successives. Notre étude a démontré que le TTCB permettait au receveur

d’être greffé plusieurs fois sans répéter le protocole tolérigénique et sans nuire aux

premières greffes effectuées. Nous avons donc un protocole qui induit une tolérance forte et

stable face aux TMs. Enfin, compte tenu du résultat des greffes, nous pouvons conclure que

le TTCB ne nuit pas à la capacité myogénique des cellules injectées.

Une bonne tolérance se définit également par l’absence de lymphocytes infiltrants

dans la zone de greffe. La première tentative de développement de tolérance pour la TM

s’appuyant sur l’induction d’un chimérisme hématopoïétique mixte nécessitait l’utilisation

d’anticorps anti-CD154 et anti-CD45RB (Camirand et al 2004). Elle donna de bons

résultats et permit l’acceptation à long terme de TMs allogéniques. Curieusement, des

poches éparses d’infiltration lymphocytaire étaient présentes dans les zones de greffe. Les

lymphocytes infiltrés ne présentaient cependant pas de signe d’activation et n’influaient pas

sur l’acceptation des fibres néoformées par le receveur. Bien que l’origine de ces poches

d’infiltrats lymphocytaires ne soit pas encore clairement définie, leur présence pourrait

soulever quelques inquiétudes. Nous avons vérifié si ces infiltrations lymphocytaires se

répétaient dans nos souris traitées avec le TTCB. Nous avons remarqué la présence de

lymphocytes dans les muscles transplantés. Toutefois, nous n’avons observé aucune

différence significative d’infiltration lymphocytaire basale entre un muscle non greffé de

souris dystrophique (Spencer et al 2001; Spencer & Tidball 2001) et un muscle greffé. De

ce fait, nous pouvons donc émettre l’hypothèse que le traitement TTCB permettrait de

contourner une réaction lymphocytaire spécifique contre des antigènes spécifiques au

muscle qui pourrait survenir dans le cas d’un protocole basé sur le bloquage des voies de

costimulation lymphocytaire.

En conclusion de notre deuxième étude nous pensons que le TTCB peut s’avérer un

traitement potentiel pour circonvenir à l’immunossuppression des patients dystrophiques et

ainsi permettre d’assurer la réussite durable d’une TM. La stabilité du statut de tolérance

obtenu avec le traitement TTCB face à la répétition de plusieurs TM, renforce l’idée

prometteuse de son application possible en clinique. Pour parfaire le tout, la combinaison

des deux drogues cytoréductrices incluse dans le protocole du TTCB est déjà utilisée chez

les enfants souffrant d’une leucémie grave. Par ailleurs, le passage du traitement TTCB sur

170

des grands animaux est présentement sous investigation dans notre laboratoire. Le singe

Cynomolgus a été choisi en raison de la forte similarité entre le système immunitaire de

l’homme et celui des primates non-humains. Le chien fait également parti des projets

d’investigation sur le TTCB. Le singe ne développant pas de dystrophie, il est important de

tester le modèle de tolérance du TTCB sur le chien dystrophique. Ce passage est nécessaire

pour appliquer la TM sur un modèle dystrophique qui se rapproche le plus de l’homme.

Néanmoins ces étapes ne sont pas sans difficultés. Pour le singe, la posologie du

cyclophosphamide et du tréosulfan se rapproche de l’enfant en termes de dose. Néanmoins,

les mécanismes immunitaires impliqués dans l’induction de tolérance chez les primates

non-humains sont potentiellement différents de ceux de la souris. En effet, il a été rapporté

lors d’un protocole d’induction de tolérance, basé sur le chimérisme, que des

allotransplantations de rein ont été acceptées à long terme par le receveur alors que le

chimérisme observé n’était que transitoire (Kawai et al 2004). Cette donnée stipule que

dans un protocole d’induction de chimérisme hématopoïétique les mécanismes de tolérance

périphérique ont un rôle différent à jouer dans le maintien d’une allogreffe que ceux de la

souris. Pour le chien, outre la particularité de son système immunitaire, sa sensibilité aux

agents alkylants nécessite une étude dose/réponse plus sérée pour le cyclophosphamide et

le tréosulfan que pour le singe. De plus, aucun protocole sur le chien n’a encore requis

l’administration de tréosulfan.

Conclusion générale Plusieurs thérapies potentielles pour traiter la dystrophie musculaire de Duchenne

sont en développement. La TM est pour l’instant une des rares thérapies qui a déjà produit

des résultats positifs dans un essai clinique. Cette approche offre la possibilité de restaurer

une expression stable de dystrophine et d’augmenter la capacité régénérative des muscles

transplantés (Bouchentouf et al 2006). Cependant, il faut voir en cette thérapie une solution

palliative efficace et non pleinement curative. En effet, la faible distribution des cellules

transplantées et la difficulté à atteindre des organes comme le cœur et le diaphragme

cantonne l’application de la transplantation de cellules myogéniques à une zone curative

limitée. Néanmoins, la TM pourrait contribuer à augmenter l’espérance et la qualité de vie

des patients atteints de dystrophie musculaire de Duchenne. Pour atteindre cet objectif et

compte tenu de la fragilité des patients, il faut que cette méthode soit la plus efficace et la

moins invasive possible. L’objectif de cette thèse était de contribuer à cette perspective. Au

travers des études de ces manuscrits, l’ensemble des méthodes développées avait pour trait

commun l’utilisation de drogues dont la connaissance et le recul clinique étaient éprouvés.

En premier lieu, l’administration de la forme active de la vitamine D3 offre la possibilité

d’aider les cellules myogéniques transplantées à participer à la réparation des muscles

greffés. Enfin, le traitement TTCB permet d’assurer la survie à long terme de la TM, sans

avoir recours à une immunosuppression et en se basant sur une administration de drogues

cytoréductrices déjà utilisées chez l’enfant. Il reste encore beaucoup de travail à réaliser

pour confirmer ces résultats sur des modèles animaux supérieurs et plus proche

physiologiquement de l’homme. Toutefois, ces deux études pourraient conjointement,

s’insérer ultérieurement dans les essais cliniques en cours de TM et ainsi contribuer à la

finalisation de ce grand défit scientifique.

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