agrégats moléculaires, villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 dissociation en phase gazeuse de...

Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001

Dissociation en phase gazeuse de complexes non-Dissociation en phase gazeuse de complexes non-covalents: un outil pour l'étude de la reconnaissance covalents: un outil pour l'étude de la reconnaissance

moléculaire. moléculaire. Réalités et espoirs.Réalités et espoirs.

Valérie Gabelica, Frédéric Rosu, Nives Galic, Edwin De PauwUniversité de Liège (Belgique)


Les interactions non covalentesLes interactions non covalentes

+ +

Ponts salinsLiaisons HydrogèneDipole-DipoleDipole-Dipole induit

Interactions« hydrophobes »


Comment produire ces espèces « fragiles » en phase Comment produire ces espèces « fragiles » en phase gazeusegazeuse

1/T

Ln k Désorption d’ions

Décomposition


Les sources d’ions: la source MALDILes sources d’ions: la source MALDI

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From Leonid V. Zhigilei web site

From Finnigan


Source Electrospray

Concentration: 10-6 – 10-3 MSolvent: H2O (+ MeOH, CH3CN)

Cone de Taylor

Les sources d’ions: l’électrosprayLes sources d’ions: l’électrospray


Manipulation des ionsManipulation des ions

Activation par collisions MS/MS

MS2MS1

Régimes d’activation: haute énergie: keV (secteurs)Basse énergie: quadrupôlesSlow heating: pièges à ions!!! Source CID!!!


(AB)+

E0(2)

Er

E0(1)Einternal

Reaction coordinate

A+ + B

[Ligand + Substrat] Ligand + Substrat

[E(A+) + E(B)] – E(AB+) = E0 - Er

On mesure la STABILITE CINETIQUE ou LABILITE

Les dissociations unimoléculairesLes dissociations unimoléculaires

kuni


k(E ) G‡ (E E0)

hN (E )

k(E ) s E E0

E

DOF 1

RRKM

RRK

• Les calculs sont difficiles pour les systèmes à grand nombre de degrés de liberté• Peut-on toujours appliquer les modèles statistiques ?• Comment obtenir la distribution d’énergie interne ?• L’activation collisionnelle des systèmes à grand nombre d’atomes est mal connue

Constantes de vitesse statistiquesConstantes de vitesse statistiques


Les spectromètres de masse Les spectromètres de masse Le QTOF (MSLe QTOF (MS22))


Temps d’activation: 3 ms to 10 s

Les spectromètres de masseLes spectromètres de masseLe piège à ions (MSLe piège à ions (MSnn))


ExemplesExemples

• Duplexes DNA

• Complexes Duplexes-Ligands

• Complexes cyclodextrine-ligands

• Complexes Proteine(s)-Proteine(s)


Les duplexes ADNLes duplexes ADN

NN

O

O

Sugar

CH3

H NN

N

NSugar

NH

H

Major groove

Minor groove

NN

O

N

Sugar

HH

NN

N

NSugar

H

O

NHH

Major groove

Minor groove

T A

C G

On peut calculer l’énergie d’interaction sur base d’un modèles de proches voisins:nombre de liaisons H

CG:3 AT:2 stacking


L’évolution des duplexes DNAL’évolution des duplexes DNA

• Dissociation

• Fragmentations B B


Les duplexes DNA et leurs complexesLes duplexes DNA et leurs complexes

OH

NHN

NH N

N

NH+

N

NH

NHO

N

NH O

NH2NH2

NH

NH2

NH2

O

N

NH

NHO

N

NH O

NH2

NH2

O

NNH

O

+ +

+

NH

NH2NH2

NH2NH2

+

+

NHN

N

NH2NH2

NH2NH2

+

+

Netropsin (432)

Distamycin A (481)

Hoechst 33258 (425)

DAPI(278)

Berenil (281)

N+

NH2

NH2 C2H5

Br

N

NH

NH

SCH3

O O

N

N

N

O

Ethidium Bromide (314 + 79)

Amsacrine (363)

Ascididemin (286)

Ligands du petit sillon

Intercalants


quadrupole (t 1-10 µs)

piège à ions (t = 30 ms)

Duplex: d(CGCGAATTCGCG)2

Les duplexes DNA: dissociation ou fragmentation ?Les duplexes DNA: dissociation ou fragmentation ?


Comparaison entre duplexes d’énergie d’interaction Comparaison entre duplexes d’énergie d’interaction croissantecroissante

Sequence % of CGbasepairs

A d(5’-CGTAAATTTACG-3’)2 33 %

B d(5’-CGCGAATTCGCG-3’)2 67 %

C d(5’-CGCGGGCCCGCG-3’)2 100 %


Compétition dissociation-fragmentationCompétition dissociation-fragmentation


Origine de l’influence du régime de collisionsOrigine de l’influence du régime de collisions

Chauffage lent

Activation rapide

S

- ++ -


Maintien de la structure en double hélice en phase Maintien de la structure en double hélice en phase gazeusegazeuse

5’-AAATCGCGGCGCTAAA-3’ 3’-TTTAGCGCCGCGATTT-5’

Hn-n = -136.8 kcal mol-1

5’-GGGCTATAATATCGGG-3’ 3’-CCCGATATTATAGCCC-5’


5’-AGACTGTGAGTCAGTG-3’ 3’-TCTGACACTCAGTCAC-5’


5’-GGGCTTTTAAAACGGG-3’ 3’-CCCGAAAATTTTGCCC-5’



Minor groove bindersComplexes Duplexes-droguesComplexes Duplexes-drogues

OH

NHN

NH N

N

NH

NNH

NHO

N

NH O

NH2NH2

NH

NH2

NH2

O

N

NH

NHO

N

NH O

NH2

NH2

O

NNH

O

Netropsin Distamycin AHoechst 33258

ligands du petit sillon

1:1 complex 2:1 complex

ou

Intercalation « random » entre les paires de bases

Intercalatants

N+

NH2

NH2 C2H5

N

NH

NH

SCH3

O O

N

NN

O

Ethidium Amsacrine Ascididemin


•Complexes5- avec ligands du petit sillon

•Complexes5- avec intercalants

(GC+H)5-

C2-G3- Hoechst (NR3H+)30 eV

1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800m/z0

100

%

(GC+N)5-

C2-(G+N)3- Netropsin (NR4

+)30 eV

1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800m/z0

100

%(GC+A)5-(GC)5-

Amsacrine(neutral )12 eV

1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900m/z0

100

%

Ethidium(NR4

+)25 eV

(GC+E)5-G3-

C3- (G+E)3-C2-

(C+E)2-

MS/MS pour la détermination rapide du mode de MS/MS pour la détermination rapide du mode de complexationcomplexation

1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800m/z0

100

%


Changement de conformation Contribution entropique et enthalpique

(contribution à H >0, S > 0)Transfert hydrophobe Contribution entropique (S < 0)Création de liaisons intermoleculairesEffet enthalpique (H < 0)

Contribution de l’intercalation à l’énergie libre Contribution de l’intercalation à l’énergie libre de liaisonde liaison


Daunorubicin (R = H) Doxorubicin (R = OH)

ds+D5-

ds+D5-

ds5-

ds5-

R = OH

R = H

Stabilité cinétique relative des intercalants (1)Stabilité cinétique relative des intercalants (1)

O

O

OH

OH

OH

O

O

CH2R

O

OMe

NH2OH

CH3

Spectres MS/MS dans des conditions identiques


Intercalants: intercalation « random »Stabilité cinétique relative des intercalants (2)Stabilité cinétique relative des intercalants (2)

NH

N

CH3+

NH

N

CH3

+

Cryptolepine

Neocryptolepine

ds+C5-

ds+NeoC5-


Comportement en solutionComportement en solution

• Titrages, mesure des constantes de stabilité ou expériences de compétition


Spécificité des complexes en solutionSpécificité des complexes en solutionvsvs

stabilité cinétique en phase gazeusestabilité cinétique en phase gazeuse

(ds+C)5-

(ds)5-

(ds)4-

(ds+2C)5-

(ds)5-

(ds+neoC)5- (ds+neoC)4-

(ds+C)4-

(ds)4-

(ds+2C)4-

En solution: ESI full scan

duplex5-

(duplex+C)5-

(duplex+neoC)5-

duplex5-

En phase gazeuse MS/MS

I (com

plex

)/I

(dup

lex)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

2.4Cryptolepine

Neocryptolepine

33% 66% 100% 33% 66% 100%

Specificité de séquence


Détermination de la cible biologiqueDétermination de la cible biologique

(FP+neoC)+

(FP)+

(FP)+

(FP-O-FP)+

(FP-O-FP+ C)+

(FP-FP+neoC)+

(FP-O-FP)+

(FP-FP)+

Complexe hème-cryptolepine

Complexe hème-neocryptolepine.

Le mode de fixation est différent


Interactions hydrophobes fortes dans l’eauPlus longues sont les chaînes, plus forts les complexes

L’électrospray peut-il produire des complexes spécifiques?

n K Calorimetry(M-1)

Complex in MS

4 no complex Yes5 24 1 Yes6 93 1 Yes7 629 21 Yes8 1786 83 Yes

10 Yes12 Yes

COO–

CH2 n

COO–

Conformation in solution

Les complexes de cyclodextrinesLes complexes de cyclodextrines


n(CH2)

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Co

ll.

En

. 5

0 %

23.0

23.5

24.0

24.5

25.0

n(CH2)

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Co

ll. E

n. 5

0 %

10.5

11.0

11.5

12.0

12.5

13.0

Complexes 2-

L’information reste-elle spécifique en phase gazeuse L’information reste-elle spécifique en phase gazeuse ??

Complexes 1-

n = 7

Taux de survie


Influence de la forme des ionsInfluence de la forme des ions

From Clemmer’s web site


Exemples de fragmentation Exemples de fragmentation « shape dependant »« shape dependant »

Résultats du groupe de D. Clemmer


Energ

ie

1-mer 7-mer 14-mer

Nombreuses applications aux complexes multiproteines

Deduction de la symétrie des complexes: GroEL

Topologie des complexes par MS/MSTopologie des complexes par MS/MS

(C. Robinson, Current opinion in biology, 1999)


Hot topicsHot topics

• Mesures de vitesse d ’échange H/D (S.R. Kass, JASMS, sous presee)

• ECD et analyse du maintien des liaisons non covalentes durant la fragmentation

(R. Zubarev Rapid Comm. Mass Spectrom. 2001; 15 (19) : 1849-1854.)

• Dissociation avec répartition inégale des charges (J.S. Klassen, Anal. Chem, 2001, 73, 4647-4661)


o De la conformation des ions produitso De l’énergie transférée lors des collisions (source CID ou

MS/MS)o Des déplacements cinétiques qui peuvent être importants o De la contribution entropique o De la validité des théories statistiques

La spectrométrie de masse et la MS/MS sont utilisées dans le cas de complexes de plus en plus « gros » . Si, dans les cas favorables, les complexes semblent transportés « intacts » et de manière quantitative en phase gazeuse (MS simple), on ne connaît quasi rien:

Conclusions: nouvelles questionsConclusions: nouvelles questions

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