universite cheikh anta diop de dakar · 2013. 1. 8. · universite cheikh anta diop de dakar ....
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UNIVERSITE CHEIKH ANTA DIOP DE DAKAR
ECOLE INTER - ETATS DES SCIENCES ET MEDECINE VETERINAIRES (EISMV)
ANNEE 2007 Ndeg 23
Contribution agrave lrsquoeacutetude de la valorisation des proteacuteines drsquohydrolysats obtenues par hydrolyse enzymatique des
co-produits (tecircte viscegraveres) de la Sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) au Seacuteneacutegal
THESE Preacutesenteacutee et soutenue publiquement le 06 juillet 2007 devant la faculteacute de Meacutedecine de pharmacie et drsquoodonto-stomatologie de Dakar pour obtenir le
grade de
DOCTEUR VETERINAIRE (DIPLOcircME DrsquoETAT) Par
Rose Eliane PENDA Neacutee le 03 deacutecembre 1980 agrave Yaoundeacute (CAMEROUN)
Jury
Preacutesident M Niama DIOP SALL Professeur agrave la Faculteacute de Meacutedecine de Pharmacie et drsquoOdonto ndash Stomatologie de Dakar
Directeur et Rapporteur de Thegravese M Malang SEYDI
Professeur agrave lrsquoEISMV de Dakar Membres M Germain Jeacuterocircme SAWADOGO
Professeur agrave lrsquoEISMV de Dakar
M Serge Niangoran BAKOU Maicirctre de Confeacuterence Agreacutegeacute agrave lrsquoEISMV de Dakar
Co-Directeurs de thegravese Serigne khalifa Babacar Sylla Attacheacute de recherches agrave lrsquoEISMV de Dakar Bellancille Musabyemariya Assistante agrave lrsquoEISMV de Dakar
DEDICACES Je deacutedie ce travail
A Dieu tout puissant le creacuteateur et le pourvoyeur de toutes choses et de toutes
œuvres humaines
A mes parents PENDA Apollinaire et SAMI Marie qui mrsquoont donneacute la vie lrsquoamour et la joie de vivre Trouvez ici toute mon affection et mon respect pour lrsquoeacuteducation que vous mrsquoavez donneacute Lrsquoamour du travaille le sacrifice de soi et la perseverance quelque soit les epreuves et les embuches Que ce travail soit une fierteacute pour vous
A mes fregraveres Penda Herveacute Penda Elyseacute Penda apolinaireII et mon beacutebeacute
Penda Reneacute et mes sœurs Essomba Daniel Tchamba Martial et Penda
Christine qui mrsquoont encourageacutes et soutenus
A mon neveu mon petit hamed
A mes feu grands parents Yonkeu Charles et Nkou Christine je sais que de lagrave
haut vous veillez sur moi Reposez en paix Que DIEU ait pitieacute de vos acircmes
A mes grands parents LITOUKE Leacuteon et Ngo Penda Rose Merci pour vos
conseils et votre amour
A mes oncles mes tantes mes cousins et mes cousines
A la famille BILLONG EDIMA vous mrsquoavez prise comme votre fille Je
nrsquooublierais jamais votre gratitude et votre affection Que la paix et la prospeacuteriteacute
habitent toujours dans votre maison
A la famille NGOTTE je beacuteni DIEU de vous avoir connu je ne saurais vous
remercier a travers les mots
A mon Beau fregravere Hubert Toudic merci pour les sacrifices faits pour moi
A Siriel Gaelle Eva Elisabeth Fabien Junior Natou Wawa Denis Nous
avons passeacute de tregraves bon moment agrave Dakar merci pour votre amitieacute
A Mrsquosik Dounia et Andela Abessolo votre amitieacute et votre soutien pendant ces 6
derniegraveres anneacutees resteront agrave jamais dans ma meacutemoire Merci pour votre
affection
xv
A Naomie Kenmogne malgreacute les eacutepreuves notre amitieacute est resteacute intacte a
travers se travail je te teacutemoigne toute mon affection
A Moundjoa Christian
A Stella Abessolo Sandrine Tene Rachel Bend Christelle Bobda Doris
Sadi Mme Ichakou Hermine Kwin Nathalie Laeticia Sabine Bouba
A mes camarades
Salifou Arouna Hellow Jean-Marc Serge Mpouam Ndam kamanzi
Shyaka Walbadet Yapi Doumbou Mosus zombou Tcheuffo Moctar
Natacha Carine Viviane
A mes proches relations et amis de Dakar et drsquoailleurs et agrave tous ceux que je ne
saurais citer car la liste est exhaustive mais que je porte dans mon cœur
A la CAVESTAS et agrave lrsquoAEVD
A la promotion SAMBA SIDIBE (34e promotion)
Au Cameroun ma chegravere patrie
Au Seacuteneacutegal mon pays hocircte
xvi
REMERCIEMENTS
Nous tenons agrave exprimer notre immense gratitude agrave lrsquoendroit de tout
ceux qui ont œuvreacutes de pregraves ou de loin agrave lrsquoaccomplissement de ce
travail
Professeurs Malang Seydi
Docteurs KSB Sylla Bellancille Musabemarya Alain kamga Waladjo Serge
Bakou Babacar Sene
Tout le personnel du service drsquoHIDAOA
Tout le personnel de lrsquoEISMV de Dakar
Madame DIOUF de la bibliothegraveque de lrsquoEISMV de Dakar
Tout le personnel du mini resto
A Clara Gregoire Dr Gilles Hakou Dr Ngono Patrick Samuel Zoumbou Kasseacute
Ndongo Dr Ekoga Mve Daniel Chancellin Dr wounkou Christian Tcheuffo
Ma tregraves chegravere patrie le Cameroun et le Seacuteneacutegal mon pays drsquoaccueil
Tous ceux que nous nrsquoavons pas citeacutes et qui de pregraves ou de loin ont rendu ce
travail possible
A tous veuillez recevoir lexpression de notre profonde gratitude
HOMMAGES A NOS MAITRES ET JUGES
xvii
A notre preacutesident de jury Monsieur Niama Diop SALL Professeur agrave la
Faculteacute de Meacutedecine de pharmacie et drsquoOdonto-Stomatologie de
Dakar Vous nous faites lrsquoinsigne honneur malgreacute vos multiples occupations de
preacutesider ce jury Votre abord facile et la spontaneacuteiteacute avec laquelle vous avez
reacutepondu agrave notre sollicitation nous ont beaucoup marqueacute Veuillez trouver ici
lrsquoexpression de notre profonde et sincegravere gratitude
A notre Directeur et Rapporteur de Thegravese Monsieur Malang SEYDI
Professeur agrave lrsquoEISMV de Dakar Vous avez accepteacute drsquoencadrer et de diriger
ce travail avec rigueur scientifique et pragmatisme Nous avons eacuteteacute fascineacute par
votre abord facile et votre simpliciteacute Vos qualiteacutes scientifiques et humaines
nous ont profondeacutement marqueacute Trouver ici lrsquoassurance de notre profonde
gratitude
A notre Maicirctre et Juge Monsieur Germain Jeacuterocircme SAWADOGO
Professeur agrave lrsquoEISMV de Dakar Nous sommes tregraves sensible agrave lrsquohonneur
que vous faites en acceptant de juger ce travail malgreacute vos multiples
occupations Vous nous avez apporteacute une preuve suppleacutementaire de ce que nous
pensons de vous Vos qualiteacutes intelectuelles et humaines forcent respect et
admiration Trouvez ici lrsquoassurance de notre profonde gratitude
A notre Maicirctre et Juge Monsieur Serge Niangoran BAKOU Maicirctre de confeacuterences agreacutegeacute agrave lrsquoEISMV de Dakar vous nous faites un grand
honneur de juger ce modeste travail Vos qualiteacutes scientifiques votre grand
dynamisme et votre abneacutegation devant le travail suscite chaque jour lrsquoadmiration
des eacutetudiants et le respect de vos paires Veuillez recevoir maicirctre nos sincegraveres
remerciements et profondes consideacuterations Vous ecirctes un model pour nous
xviii
xix
A mes Co-Directeurs de Thegravese monsieur Khalifa Babacar Seacuterigne SYLLA
et Madame Beacutellancille MUSABEYEMARIYA Assistants agrave lrsquoEISMV de
Dakar Ce travail est aussi le vocirctre Trouvez ainsi les assurances de notre sincegravere
reconnaissance
LISTE DES TABLEAUX
Tableau I Nomenclature de la sole tropicale
Tableau II classification systeacutematique de la sole tropicale
Tableau III Les 20 acides amineacutes
Tableau IV Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Tableau V Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Tableau VI Classification des proteacuteases
20
LISTE DES FIGURES Figure 1 carte des villages cocirctiers de pecircche de la reacutepublique du Seacuteneacutegal
(source direction des pecircche maritimes 2003) Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de lrsquohydrolyse
enzymatique
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Figure 8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
21
LISTE DES ABREVIATIONS DPM Direction des Pecircches Maritimes AA Acides Amineacutes AAI Acide Amineacutes Indispensables IFN Institut Franccedilais de Normalisation EC Enzyme Classification ATP Adeacutenosine Triphosphate pH Potentiel Hydrogegravene degC Degreacute Celsius FAO Food Agricultural Organisation EISMV Ecole Inter-Etat des Sciences et Meacutedecine Veacuteteacuterinaires HIDAOA Hygiegravene des Industries des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine
Animale IFREMER Institut Franccedilais de Recherche et drsquoExploitation de la Mer INRA Institut Nationale de Recherche Agricole
22
LISTES DES PHOTOS
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation de lrsquoenzyme Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
Photo 7 hydrolysat dans les tubes Falcon
TABLE DES MATIERES INTRODUCTION 1 PREMIERE PARTIE SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 4 CHAPITRE 1 Geacuteneacuteraliteacutes sur la pecircche au Seacuteneacutegal 5 11 Environnement naturel 5
12 Historique de la pecircche au Seacuteneacutegal 5
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees 8
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche 8
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis 9
21 Nomenclature 9
22 Classification systeacutematique 9
23 Caracteacuteristiques morphologiques 9
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae 9
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis 10
24 Reacutepartition geacuteographique 10
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson valorisation et utilisation 12
31 Deacutefinition et composition 12
32 Valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes 12
33 Les hydrolysats de poisson 15
331 Deacutefinition 15
332 Les avantages 15
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson 16
3331 En alimentation animale 16
3332 Inteacuterecircts fonctionnels 17
34 Production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee Les peptides 17
16
341 Geacuteneacuteraliteacutes sur les proteacuteines 17
3411 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des proteacuteines 19
3412 Les proteacuteines de poisson 20
34121 La fraction myogegravene soluble 21
34122 La fraction myofibrillaire 21
342 Les peptides 21
3421 Les Sources azoteacutees 21
3422 Inteacuterecircts nutritionnelles des peptides 23
3423 Activiteacutes biologiques des peptides 24
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE 25
41 Les enzymes 25
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes 25
412 Nomenclature et classification 26
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle 26
4122 Nomenclature et classification officielle 26
413 Les principales classes drsquoenzymes 28
42 Lrsquohydrolyse enzymatique 29
421 Deacutefinition et principe 29
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse 30
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique 30
42 31 Influence de la tempeacuterature 31
4232 Influence du pH 32
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices 33
Conclusion partielle 34
17
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE ndash DISCUSSION ET
RECOMMANDATION
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES 36
11 Mateacuteriel 36
111 Mateacuteriel biologique 36
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale 36
1112 Constitution des lots 37
112 Mateacuteriel enzymatique 37
113 Mateacuteriel technique 38
1131 Materiel de preacutelegravevement 38
1132 Mateacuteriel de laboratoire 38
12 Meacutethodes 39
121 Hydrolyse enzymatique 39
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses 40
1212 Hydrolyse courte dureacutee 41
122 Filtration 41
123 Centrifugation 41
124 La matiegravere segraveche 42
13 Analyses biochimiques 42
131 Deacutetermination de la teneur en eau 42
132 Dosage des proteacuteines totales 43
1321 Principe 43
1322 Mode opeacuteratoire 43
1323 Expression des reacutesultats 44
CHAPITRE 2 RESULTATS 45
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse 45
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes 45
18
19
2 3 Poids du culot et du surnageant 46
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant 47
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot 48
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS 49
31 Discussion 49
311 Discussion des reacutesultats 49
3111 La matiegravere segraveche 49
3113 Les proteacuteines 49
312 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes 50
3121 Lrsquohydrolyse enzymatique 50
3122 La matiegravere segraveche 51
3123 Le dosage des proteacuteines 51
32 Recommandations 54
CONCLUSION GENERALE 56
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 58
INTRODUCTION
Les oceacuteans constituent une richesse alimentaire tregraves diversifieacutee (poissons
algues crustaceacutes coquillages mollusques) Selon la FAO plus de 130 millions
de tonnes de poissons sont actuellement pecirccheacutes ou eacuteleveacutes chaque anneacutee dans le
monde
Les produits de la mer peuvent ecirctre consommeacutes frais congeleacutes seacutecheacutes ou encore
transformeacutes La politique environnementale actuelle incite de plus en plus les
industriels agrave prendre en comptes les deacutechets geacuteneacutereacutes par tous proceacutedeacutes de
transformation des poissons Crsquoest pourquoi apregraves lrsquoexploitation des parties
nobles des poissons des chercheurs se sont inteacuteresseacute aux co-produits Les co-
produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterables lors des
opeacuterations traditionnelles de production
Comme le montre le diagramme 1 la production de filet de la sole tropicale est
agrave lrsquoorigine de plusieurs sources de co-produits solides tecirctes viscegraveres carcasse
et peaux En effet des eacutetudes ont reacuteveacuteleacute que les co-produits de poissons sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecircts notamment les proteacuteines Un des
outils pour la reacutecupeacuteration efficace des proteacuteines des co-produits est lrsquohydrolyse
enzymatique elle est appliqueacutee pour ameacuteliorer les proprieacuteteacutes fonctionnelles et
alimentaires des proteacuteines Le but principal de lhydrolyse des co-produits de
poissons est dobtenir le reacutetablissement possible et maximum de tous les
composants valables tout en maintenant leurs qualiteacutes Ainsi le potentiel du
proceacutedeacute drsquohydrolyse enzymatique controcircleacutee sur les co-produits (tecirctes viscegraveres)
de la sole tropicale issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale en
filet de poisson va ecirctre eacutetudieacute durant ce travail
20
DEBARQUEMENT
RECEPTION LAVAGETRIAGE
PESEE
STOCKAGE EN CHAMBRE FROIDE (sous glace fondante)
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
PELAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration peaux
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
FILETAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration carcasse+ viscegraveres
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu jets dans des paniers)
TREMPAGE (eau glaceacutee et chloreacutee 2degC 1 agrave 2mn concentration 2ppm)
PARAGECONDITIONNEMENT (en films plastiques)
EMBALLAGE (caisses de polystyregravene)
PESEE
GLACcedilAGE (glace isoleacutee du produit)
SCELLAGE
ETIQUETAGE
ENTREPOSAGE REFRIGERE (0 - +4degC)
EXPEDITION
Diagramme 1 Principales eacutetapes de transformation de la sole tropicale en filet
21
Le but de ce travail est la libeacuteration et le dosage des proteacuteines des co-produits
de la sole tropicale De cet objectif geacuteneacuteral deacutecoule les objectifs speacutecifiques
suivants
Hydrolyser les co-produits (tecirctes viscegraveres) agrave lrsquoaide drsquoune proteacutease
Seacuteparer la phase soluble (surnageant) de la phase insoluble (culot) par
centrifugation
Obtenir la matiegravere segraveche de ces deux phases
Doser les proteacuteines totales agrave partir des matiegraveres segraveches obtenues
Pour reacutepondre agrave ces objectifs ce travail se deacuteclinera en deux parties ougrave des
eacuteleacutements de reacuteponses apparaicirctront Une premiegravere partie portant sur lrsquoeacutetude
bibliographique puis une deuxiegraveme partie preacutesentant les analyses effectueacutees et
les reacutesultats obtenus Faisant suite aux conclusions des perspectives seront
eacutemises pour la conduite de futurs travaux
22
PREMIERE PARTIE SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
23
CHAPITRE 1 Geacuteneacuteraliteacutes sur la pecircche au Seacuteneacutegal
11 Environnement naturel
Au large des cocirctes Seacuteneacutegalaises situeacutees agrave lrsquoextreacutemiteacute ouest du continent africain
se heurte le courant marin des canaries venu du Nord et des courants deacuteriveacutes du
courant du Golfe de Guineacutee Des upwellings(remonteacutee drsquoeau froides riches en
sels nutritifs le long de la pente du plateau continental) remontent eacutegalement de
la couche drsquoeau profonde le long de la pente du plateau continental La
tempeacuterature de lrsquoeau de mer en surface ne descend jamais en dessous de 15degC au
cours de lrsquoanneacutee Les fleuves Seacuteneacutegal Gambie et Casamance se jettent dans
lrsquooceacutean atlantique et apportent des sels mineacuteraux pendant lrsquohivernage De plus
du sable riche en sels inorganiques est apporteacute du deacutesert du Sahara par les vents
Le riche environnement naturel preacuteciteacute augmente la productiviteacute de la mer et
creacutee les pecirccheries classeacutees parmi les plus riches drsquoAfrique Des vents violents
qui soufflent au passage de lrsquohivernage agrave la saison segraveche et au passage de la
saison segraveche agrave lrsquohivernage rendent souvent la mer agiteacutee mais en geacuteneacuteral la
zone maritime est calme ce qui permet agrave la population de profiter en toute
seacutecuriteacute des bienfaits de la mer (DPM CRODT 2006)
12 Historique de la pecircche au Seacuteneacutegal
La pecircche a pendant longtemps eacuteteacute une activiteacute monopoliseacutee par certaines
ethnies
les Guet Ndariens de Saint-Louis situeacute agrave lrsquoembouchure du fleuve Seacuteneacutegal
les Lebous aux environs de Dakar
les Nyominka vivant principalement au Saloum
Ces ethnies ont utiliseacute des pecirccheries cocirctiegraveres sur une longueur drsquoenviron 2000
km allant des cocirctes de la Mauritanie au Nord agrave la cocircte de la Sierra Leone au
Sud en suivant le deacuteplacement saisonnier des bancs de poissons La pecircche
artisanale srsquoeffectuait sur des pirogues avec pagaies ou de petites embarcations agrave
24
voile Les captures eacutetaient fournies aux habitants de lrsquointeacuterieur du pays sous
formes de produits fumeacutes ou seacutecheacutes (DPM CRODT 2006)
Lrsquoancecirctre de la pirogue seacuteneacutegalaise remonterait au XVIe siegravecle Elle eacutetait
constitueacutee au deacutepart drsquoun simple tronc eacutevideacute propulseacute agrave la pagaie Vers le deacutebut
du XVIIe siegravecle on assiste agrave lrsquoapparition de la voile Les eacuteperons faisant office
de brise-lames et les bordes sont rajouteacutes au cours du siegravecle suivant Enfin le
moteur hors-bord apparaicirct vers 1950
On distingue deux saisons de production une saison de faible capture de juin
agrave octobre ougrave les volumes des produits diminuent et une saison de forte
production allant de novembre agrave juin Les captures de la pecircche artisanale sont
principalement des espegraveces peacutelagiques alors que les produits de la pecircche
industrielle sont des espegraveces benthiques
Selon la direction des pecircches maritimes (DPM 1996) du ministegravere de
lrsquoeacuteconomie maritime en 1996 lrsquoeffectif de la flottille seacuteneacutegalaise eacutetait le
suivant 11 600 pirogues dont 9 300 motoriseacutees (80) 212 chalutiers dont 60
chalutiers eacutetrangers (28) 6 sardiniers dont 2 sardiniers eacutetrangers (33) 62
thoniers eacutetrangers (97) Les principales prises sont les petits peacutelagiques
(sardinelles chinchards maquereaux) qui repreacutesentent 72 des prises Le reste
correspond agrave des espegraveces benthiques (crevettes ceacutephalopodes rougets dorades
soleshellip)
25
Figure1 Carte des villages cocirctiers de pecircche de la Reacutepublique du Seacuteneacutegal
(source Direction des pecircches maritimes 2003)
26
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees
Depuis trois deacutecennies le secteur de la pecircche a connu une forte croissance au
Seacuteneacutegal Les captures ont eacuteteacute multiplieacutees par huit en 32 ans Les deacutebarquements
des flottilles seacuteneacutegalaises et eacutetrangegraveres ont atteint en 1996 plus de 415 000
tonnes En 1997 le volume deacutebarqueacute est passeacute agrave 421 000 tonnes et en 1998 agrave
425 000 tonnes Cette eacutevolution eacutetant principalement lieacutee agrave lrsquoaugmentation des
petits peacutelagiques mis agrave terre par la pecircche artisanale
(DPM 2003)
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche
Au Seacuteneacutegal la pecircche maritime constitue un eacuteleacutement cleacute de lrsquoeacuteconomie avec une
production en valeur de 150 milliards de FCFA environ soit 2 du PIB national
et 16 du PIB du secteur primaire en 2003 Par ailleurs la population active
dans ce secteur est drsquoenviron 600 000 personnes en comptant lrsquoemploi direct et
indirect repreacutesentant environ 17 de la population active totale Les
exportations de produits halieutiques du pays eacutetaient drsquoenviron 2 milliards pour
130 000 tonnes en 2000 et mecircme ulteacuterieurement celles-ci continuaient de
constituer la plus importante source drsquoacquisition de devises du pays Ces
exportations permettent actuellement de payer pregraves de la moitieacute de la facture
peacutetroliegravere
(Ministegravere de lrsquoeacuteconomie et des finances direction de la deacutemographie et des
statistiques 2005)
Gracircce agrave leur disponibiliteacute les produits de la mer peuvent donc apparaicirctre comme
un apport nutritionnel tregraves important drsquoun point de vue alimentaire les produits
halieutiques contribuent pour 60 agrave lrsquoapport en proteacuteine animales des
populations Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de
proteacuteines couvrant 75 de leurs besoins En 1997 la consommation moyenne
annuelle de poisson au Seacuteneacutegal eacutetait de 26kg par habitant pour une
consommation mondiale de 135 kg par habitant (NDOYE ET COLL 2002)
27
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis
21 Nomenclature
Tableau I Nomenclature de la sole tropicale
Nom scientifique
Nom franccedilais En vernaculaire (en wolof)
Nom FAO Nom anglais
Cynoglossus senegalensis
Sole tropicale Tapaleacute Sole-langue Seacuteneacutegalaise
tongue sole
(SERET 1981)
22 Classification systeacutematique
Cynoglossus senegalensis est classeacute comme indiqueacute dans le tableau ci-dessous
Tableau II classification systeacutematique de la sole tropicale
Classe Osteacuteichtyens
Ordre Pleuronectiformes
Famille Cynoglossidae
Genre Cynoglossus
Espegravece senegalensis
(SERET 1981)
23 Caracteacuteristiques morphologiques
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae
Ce sont des poissons marins agrave corps plat diminuant progressivement de largeur
vers lrsquoarriegravere Les deux yeux assez petits sont situeacutes sur le cocircteacute gauche Le
museau est arrondi La bouche est petite infegravere plus au moins arqueacutee Le bord
du pregrave-opercule nrsquoest pas libre et est recouvert par la peau et des eacutecailles Il nrsquoy
a pas de rayons eacutepineux agrave la dorsale et agrave lrsquoanale La dorsale deacutebute en avant de
lrsquoœil dorsal Les rayons de la dorsale et de lrsquoanale sont confluents avec ceux de
28
la caudale qui se termine en pointe Les nageoires pectorales sont absentes ou
rudimentaires Seule la pelvienne de la face oculeacutee est preacutesente elle est situeacutee
sur la ligne meacutediane Le corps est recouvert par des eacutecailles cteacutenoiumldes ou
cycloiumldes (SERET 1981)
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis
Le corps est plat et allongeacute les nageoires dorsale et anale rejoignent la caudale
qui se termine en pointe Les yeux situeacutes sur le cocircteacute gauche du corps ont un
espace assez large entre eux Le museau est largement arrondi le crochet rostral
plutocirct court srsquoeacutetend jusqursquoau niveau de la narine anteacuterieure La bouche srsquoeacutetend
au-delagrave de lrsquoœil ventral La nageoire dorsale compte 119-125 rayons lrsquoanale 93-
99 rayons et la caudale 12 rayons On compte 124-138 eacutecailles tubuleacutees le long
de la ligne margino-dorsale Une ligne lateacuterale meacutediane est visible sur la face
aveugle
Sur la face oculeacutee le corps est plus ou moins uniformeacutement brun plus ou moins
fonceacute avec des reflets verdacirctres visibles sur le vivant la reacutegion de lrsquoopercule
est souvent noiracirctre La face aveugle est blanchacirctre
(SERET 1981)
Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
29
24 Reacutepartition geacuteographique
Cynoglossus senegalensis est une espegravece tregraves cocirctiegravere par rapport aux autres
espegraveces de la famille des cynoglossidae Elle freacutequente les zones sablo vaseuses
cocirctiegraveres entre 10 et 110 megravetres mais les prises maximales sont reacutealiseacutees entre 5
et 15 megravetres de profondeur Elle est connue de la Mauritanie agrave lrsquoAngola Les
reacutepartitions bathymeacutetriques de cette espegravece observeacutees au Seacuteneacutegal Togo-Benin
au Congo et au Cameroun sont similaires
(SERET 1981)
30
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson deacutefinition valorisation et
utilisation
31 Deacutefinition et composition
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
des opeacuterations traditionnelles de production
Les principaux co-produits de poisson rencontreacutes sont la tecircte la peau les
chutes de filetage les arecirctes centrales les viscegraveres le foie et selon les peacuteriodes
de pecircche les eacuteleacutements reproducteurs tels que les œufs ou la laitance (figure3)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
En vue drsquoune valorisation les co-produits sont traiteacutes selon le mecircme protocole
de conservation que les parties destineacutees agrave la production alimentaire
garantissant ainsi leur absence drsquoalteacuteration
32 les voies de valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes
Le produit deacuteriveacute est le produit commercial obtenu agrave partir drsquoun co-produit Un
co-produit pourra donner plusieurs produits deacuteriveacutes (figure4) Ainsi
la tecircte de poisson pourra ecirctre valoriseacutee en tant que farine de poisson huile
ou destineacutee agrave la nutrition
la chair sur les arecirctes en farine de poisson la chair hacheacutee et huile
31
la peau en farine de poisson collagegravene geacutelatine cuir
les viscegraveres en farine de poisson huile vitamines
la carcasse en farine de poisson collagegravene geacutelatine mineacuteraux
(GUERARD et Coll 2004)
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Ces produits sont qualifieacutes de produits deacuteriveacutes et non de produits finis car ils
sont geacuteneacuteralement commercialiseacutes sous forme drsquoingreacutedients crsquoest-agrave-dire sous
forme de produits intermeacutediaires pour la nutrition humaine animale pour la
dieacuteteacutetique la cosmeacutetique Neacuteanmoins certains co-produits (foies œufs) peuvent
ecirctre vendus agrave lrsquoeacutetat brut aux consommateurs Mais cette tendance est faible et ils
sont (foies œufs) plus utiliseacutes par les industries de conserverie et de saurisserie
(ANDRIEUX 2004)
On peut distinguer quatre (4) categories de produits deacuteriveacutes en fonction de leur
destination
lrsquoutilisation en nutrition humaine ou en alimentation animale
lrsquoutilisation en dieacuteteacutetique ou nutraceutique
32
lrsquoutilisation en cosmeacutetique
utilisation plus restreinte et speacutecifique drsquoun seul type de produit deacuteriveacute
Il existe plusieurs applications possibles des co-produits (figure5) parmi
lesquelles on peut citer
les farines et huiles de poisson
Cette valorisation est actuellement la plus importante car tous les co-produits
peuvent ecirctre utiliseacutes sans distinction Aucun tri nrsquoest neacutecessaire seule la
distinction co- produits issus de poissons sauvages ou drsquoeacutelevage doit ecirctre faite
les hachis
Les co-produits sont broyeacutes et filtreacutes puis le hachi obtenu est congeleacute en bloc
Les co-produits viscegraveres sont exclus de cette valorisation Les hachis sont
destineacutes agrave la fabrication drsquoaliments pour animaux domestiques essentiellement
les chats Ils sont souvent commercialiseacutes sous forme congeleacutee et sont une
bonne source de proteacuteines
les hydrolysats (cf 33)
la production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee (protides lipides)
La production de farine et drsquohuile de poisson repreacutesente toujours en tonnage la
voie de valorisation la plus importante des co-produits de la pecircche (figure 5)
Mais la faible valeur ajouteacutee obtenue avec ces produits incite les industriels agrave
rechercher des deacuteboucheacutes plus rentables productions de sauces de poisson
drsquoaromes de proteacuteines musculaires (surimi) sont autant de valorisation
alternative vers lrsquoindustrie agro-alimentaire (CHING 1999)
33
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
33 Les hydrolysats de poisson
331 Deacutefinition
Les hydrolysats sont des fractions agrave teneur proteacuteique eacuteleveacutee (73 agrave 85) obtenus
par autolyse (uniquement sous lrsquoaction drsquoenzymes endogegravenes) ou heacuteteacuterolyses
(ajout drsquoenzymes exogegravenes) Cependant la proportion en eacuteleacutements mineacuteraux est
assez faible car les arecirctes osseuses non hydrolysables ont eacuteteacute retireacutees Les
hydrolysats ont donc lrsquoavantage drsquoecirctre digeste et drsquoavoir une haute qualiteacute
nutritive
332 Les avantages
Les hydrolysats preacutesentent les mecircmes avantages que les matiegraveres premiegraveres
drsquoorigine animale pour lrsquoaquaculture sans en avoir les nombreux inconveacutenients
(LARBIER et LECLERCQ 1992 ANDERSON et coll 1993) En effet ce
sont des proteacuteines hydrolyseacutees les acides amineacutes essentiels libeacutereacutes sont donc
plus facilement disponibles et assimilables pour les animaux De plus ils
constituent un produit tregraves appeacutetant et parfaitement accepteacute gracircce agrave lrsquoarocircme de
34
poisson et preacutesente une granulomeacutetrie fine facilitant la fabrication drsquoaliments
suivant des proceacutedeacutes tels que la microparticulation (JONES 1995) Enfin les
hydrolysats comportent en geacuteneacuteral peu de mineacuteraux et ne risquent donc pas de
polluer les eaux des eacutelevages aquacoles leur bonne qualiteacute microbiologique
eacutetant assureacutee par la steacuterilisation au cours de la fabrication
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson
3331 En alimentation animale
Les hydrolysats de poisson sont utiliseacutes comme substitut du lait pour les bovins
et les ovins En comparaison avec la caseacuteine les animaux nourris avec les
hydrolysats de poisson gras apregraves un deacutebut de croissance plus lent arrivent au
mecircme poids au bout de quelques semaines (OslashRSKOV et Coll 1982
RITCHIE et MACKIE 1982) De plus une eacutetude eacuteconomique a montreacute les
inteacuterecircts des peptides de poisson en tant que substituts du lait (MERRITT
1982) Pour le beacutetail adulte lrsquoensilage obtenu agrave partir drsquoherbe peut ecirctre
eacutegalement remplaceacute par des hydrolysats de poisson (OUELLET et Coll 1997)
Mais crsquoest dans le domaine de lrsquoaquaculture que ces hydrolysats sont les plus
valoriseacutes En effet en aquaculture la charge reacutecurrente la plus importante est la
source proteacuteique apporteacutee aux animaux Les proteacuteines de poisson hydrolyseacutees
en plus de leur faible coucirct sont drsquoune grande digestibiliteacute De plus de
nombreuses eacutetudes ont montreacute que certains hydrolysats de poisson possegravedent des
proprieacuteteacutes nutraceutiques Ainsi le remplacement des farines de poisson par des
hydrolysats de poisson augmenterait la croissance des crevettes et des larves de
poisson (CORDOVA-MUREATA et GARCIA-CARRENO 2002)
35
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
9 Coacuterdova-Murueta JH et Garciacutea-Carreno FL 2002 Nutritive value of squid and hydrolyzed protein supplement in shrimp feed Aquaculture 210 371-84
75
10 Cuvellier GF 1999 Enzymologie et biocatalyse Dans Biotechnologie Paris Tec et Doc Lavoisier Paris 319-42 11 Dumay J 2006 Extraction de lipides en voie aqueuse par bioreacteur enzymatique combineacute agrave lrsquoultracentrifugation application agrave la valorisation de co-produits de poisson (Sardina pilchardus) Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute bioproceacutedeacutes et biotechnologies marines Lieu de soutenance Ecole Polytechnique de lrsquoUniversiteacute de Nantes 12 Dong YL Sheng G Y Fu J M et Wen K W 2005 Chemical characterization and antianaemia activity of fish protein hydrolysate from Saurida elongata J Sci Food Agric 85 2033-39 13 FAO 1998 The state of world fisheries and aquaculture Rome Italy 14 Fitzgerald AJ Rai P S Marchbank T Taylor G W Ghosh S Ritz B W et Playford R J 2005 Reparative properties of a commercial fish protein hydrolysate preparation Gut 54775-81 15 Gauthier D 2006 Introduction aux techniques utiliseacutees en biochimie le dosage des proteacuteines lten lignegt [accegraves internet] wwwchimiebiochimieumonctoncabchdgsiitubprodosage 16 Gildberg A 1993 Enzymic processing of marine raw materials Process Biochem 28 1-15 17 Gildberg A Brgwald J Johansen A et Stenberg E 1996 Isolation of acid peptide fractions from a fish protein hydrolysate with strong stimulatory effect on atlantic salmon (Salmo salar) head kidney leucocytes Comp Biochem Physiol 114 B 97-101 18 Gildberg A Arnesen J A et Carlehoumlg M 2002 Utilisation of cod backbone by biochemical fractionation Process Biochem 38 475-80
76
19 Gueacuterard F Dufosseacute L De La Broise D et Binet A 2001 Enzymatic hydrolysis of protein from yellowfin tuna (Thunnus albacares) wastes using alcalase J Mol Catalysis B Enzymatic 11 1051-9 20 Gueacuterard F Batista I Pires C Thorkelson G et Le Gal Y 2004 Repport on sources and selection criteria for raw material Rapport eacutetabli pour le programme SEAFOODplus- 57 21 Gornall Bardawill et David 1949 J Biol Chem 177 751 [Mise au point dune meacutethode quantitative pour doser les proteacuteines avec le biuret] 22 Hoyle NT et Merrit J H 1994 Quality of fish protein hydrolysates from herring (Clupea harengus) J Food Sci 59 76-9 23 Direction des Pecircches Maritimes (DPM) Centre de Recherche Oceacuteanographiques de Dakar-Thiaroye(CRODT) Rapport final Etude de lrsquoeacutevaluation et de la gestion des ressources halieutiques en Reacutepublique de Seacuteneacutegal Dakar direction des pecircches maritimes 24 Institut Franccedilais pour la Nutrition 1997 Les proteacuteines ndash Tome 2 Caracteacuteristiques des diffeacuterentes sources de proteacuteines alimentaires Paris IFN- Dossier speacutecifique Ndeg9 bis 25 Jones DA 1995 Frippak ndash the facts A response to the article by PR Muir and DC Sutton J Word Aquacult Soc 26(2)220-222 26 Jun SY Park P J Jung W K et Kim S K 2004 Purification and characterization of an antioxydative peptide from enzymatic hydrolysate of yellowfin sole (Limanda aspera) frame protein Eur Food Res Technol 219 pp 20-6 27 Kim SK et Mendis E 2006 Bioactive compounds from marine processing by-products - A review Food Res Int 39383-93 28 Kristinsson HG et Rasco B A 2000 Fish protein hydrolysates Production biochemical and functional properties Critical Reviews in Food Sci and Nutr 40 43-81
77
29 Lalasidis G Bostroumlm S et Sjoumlberg L B 1978 Low molecular weight enzymatic fish protein hydrolysates chemical composition and nutritive values J Agric Food Cehm 28 751-6 30 Liaset B Julsham K et Espe M 2003 Chemical composition and theoretical nutritional evaluation of the produced fractions from enzymic hydrolysis of salmon frames with Protamex Process Biochem 38 1747-59 32 Liaset B Lied E et Espe M 2000 Enzymatic hydrolysis of by-products from the fishfilleting industry chemical characterization and nutritional evaluation J Sci Food Agric 80 881 33 Larbier M et Leclercq B 1992 Les matiegraveres premiegraveres utiliseacutees en aviculture (225 ndash 301) in nutrition et alimentation des volailles Paris INRA 34 Lowry O H Rosebrough NJ Farr AL et Randall R J 1951 Protein measurement with Folin phenol reagent J Biol Chem 193 256 ndash 275 35 Lynch et coll (1998) Lynch JM Barbano DMet Fleming JR ndash Indirect and direct determination of the casein content of milk by Kjeldhal nitrogen analysis collaborative study J AOAC Int 36 Mackie IM 1982 General review of fish protein hydrolysates Animal Feed Sci And Technol 7 113-24 37 Martin AM et Chintalapati S P 1989 Fish offal-peat compost extracts as fermentation substrate Biological wastes 27 281-8 38 Martone et al (2005) Martone CB Peacuterez Borla O et Saacuten chez J J 2005 Fishery by-product as a nutrient source for bacteria and aracha growth media Bioresource Technol 96 383-87 39 Merritt JH 1982 Assessment of the production costs of fish protein hydrolysates Anim Feed Sci Technol 1 147-51
78
40 Ndoye F Moiumlty-maiumlzi P et Broutin c 2002 Le poisson fumeacute sur la petite cocircte Senegalaise 41Oslashrskov ER Soliman H S et Clark C F S 1982 Use of fish protein hydrolysate in milk replacers Anim Feed Sci Tech 7 135 42 Ouellet DR Seoane J R Veira D M et Proulx J G 1997 Effects of supplementation with fish meal or fish protein hydrolysate on growth nutrient digestibility and rumen fermentation of growing cattle fed grass silage Anim Feed Sci Tech 68 307-26 43 Picot L Bordenave S Didelot S Fruitier-Arnaudin I Sannier F Thorkelsson G Bergeacute J P Gueacuterard F Chabeaud A et Piot J M 2006 Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines Process Biochem 41 1217-22 44 Quaglia GB et Orban E 1987 Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysates from sardine (Sardina pilchardus) J Sci Food Agric 38 271-6 45 Rajapakse N Jung W K Mendis E Moon S H et Kim S K 2005 A novel anticoagulant purified from fish protein hydrolysate inhibits factor XIIa and platelet aggregation Life Sciences 76 2607-19 46 Ravallec-Pleacute R 2000 Valorisation dhydrolysats dorigine marine optimisation de la concentration en peptides apparenteacutes aux facteurs de croissance et aux agents seacutecreacutetagogues Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Bretagne Occidentale 47 Ravallec-Pleacute R et Van Wormhoudt A 2003 Secretagogue activities in cod (Gadus morhua) and shrimp (Penaeus aztecus) extracts and alcalase hydrolysates determined in AR4-2J pancreatic tumour cells Comp Biochem Physiol B 134 669-79 48 Rousseau M Batista I Le Gal Y et Fouchereau-Peacuteron M 2001 Purification of a functional competitive antagonist for calcitonin gene related peptide action from sardine hydrolysate EJB 4 25-32 49 Shahidi F Han X et Synowiecki J 1995 Production and characteristics of protein hydrolystaes from capelin (Mallotus villosus) Food Chem 53 285-93
79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
DEDICACES Je deacutedie ce travail
A Dieu tout puissant le creacuteateur et le pourvoyeur de toutes choses et de toutes
œuvres humaines
A mes parents PENDA Apollinaire et SAMI Marie qui mrsquoont donneacute la vie lrsquoamour et la joie de vivre Trouvez ici toute mon affection et mon respect pour lrsquoeacuteducation que vous mrsquoavez donneacute Lrsquoamour du travaille le sacrifice de soi et la perseverance quelque soit les epreuves et les embuches Que ce travail soit une fierteacute pour vous
A mes fregraveres Penda Herveacute Penda Elyseacute Penda apolinaireII et mon beacutebeacute
Penda Reneacute et mes sœurs Essomba Daniel Tchamba Martial et Penda
Christine qui mrsquoont encourageacutes et soutenus
A mon neveu mon petit hamed
A mes feu grands parents Yonkeu Charles et Nkou Christine je sais que de lagrave
haut vous veillez sur moi Reposez en paix Que DIEU ait pitieacute de vos acircmes
A mes grands parents LITOUKE Leacuteon et Ngo Penda Rose Merci pour vos
conseils et votre amour
A mes oncles mes tantes mes cousins et mes cousines
A la famille BILLONG EDIMA vous mrsquoavez prise comme votre fille Je
nrsquooublierais jamais votre gratitude et votre affection Que la paix et la prospeacuteriteacute
habitent toujours dans votre maison
A la famille NGOTTE je beacuteni DIEU de vous avoir connu je ne saurais vous
remercier a travers les mots
A mon Beau fregravere Hubert Toudic merci pour les sacrifices faits pour moi
A Siriel Gaelle Eva Elisabeth Fabien Junior Natou Wawa Denis Nous
avons passeacute de tregraves bon moment agrave Dakar merci pour votre amitieacute
A Mrsquosik Dounia et Andela Abessolo votre amitieacute et votre soutien pendant ces 6
derniegraveres anneacutees resteront agrave jamais dans ma meacutemoire Merci pour votre
affection
xv
A Naomie Kenmogne malgreacute les eacutepreuves notre amitieacute est resteacute intacte a
travers se travail je te teacutemoigne toute mon affection
A Moundjoa Christian
A Stella Abessolo Sandrine Tene Rachel Bend Christelle Bobda Doris
Sadi Mme Ichakou Hermine Kwin Nathalie Laeticia Sabine Bouba
A mes camarades
Salifou Arouna Hellow Jean-Marc Serge Mpouam Ndam kamanzi
Shyaka Walbadet Yapi Doumbou Mosus zombou Tcheuffo Moctar
Natacha Carine Viviane
A mes proches relations et amis de Dakar et drsquoailleurs et agrave tous ceux que je ne
saurais citer car la liste est exhaustive mais que je porte dans mon cœur
A la CAVESTAS et agrave lrsquoAEVD
A la promotion SAMBA SIDIBE (34e promotion)
Au Cameroun ma chegravere patrie
Au Seacuteneacutegal mon pays hocircte
xvi
REMERCIEMENTS
Nous tenons agrave exprimer notre immense gratitude agrave lrsquoendroit de tout
ceux qui ont œuvreacutes de pregraves ou de loin agrave lrsquoaccomplissement de ce
travail
Professeurs Malang Seydi
Docteurs KSB Sylla Bellancille Musabemarya Alain kamga Waladjo Serge
Bakou Babacar Sene
Tout le personnel du service drsquoHIDAOA
Tout le personnel de lrsquoEISMV de Dakar
Madame DIOUF de la bibliothegraveque de lrsquoEISMV de Dakar
Tout le personnel du mini resto
A Clara Gregoire Dr Gilles Hakou Dr Ngono Patrick Samuel Zoumbou Kasseacute
Ndongo Dr Ekoga Mve Daniel Chancellin Dr wounkou Christian Tcheuffo
Ma tregraves chegravere patrie le Cameroun et le Seacuteneacutegal mon pays drsquoaccueil
Tous ceux que nous nrsquoavons pas citeacutes et qui de pregraves ou de loin ont rendu ce
travail possible
A tous veuillez recevoir lexpression de notre profonde gratitude
HOMMAGES A NOS MAITRES ET JUGES
xvii
A notre preacutesident de jury Monsieur Niama Diop SALL Professeur agrave la
Faculteacute de Meacutedecine de pharmacie et drsquoOdonto-Stomatologie de
Dakar Vous nous faites lrsquoinsigne honneur malgreacute vos multiples occupations de
preacutesider ce jury Votre abord facile et la spontaneacuteiteacute avec laquelle vous avez
reacutepondu agrave notre sollicitation nous ont beaucoup marqueacute Veuillez trouver ici
lrsquoexpression de notre profonde et sincegravere gratitude
A notre Directeur et Rapporteur de Thegravese Monsieur Malang SEYDI
Professeur agrave lrsquoEISMV de Dakar Vous avez accepteacute drsquoencadrer et de diriger
ce travail avec rigueur scientifique et pragmatisme Nous avons eacuteteacute fascineacute par
votre abord facile et votre simpliciteacute Vos qualiteacutes scientifiques et humaines
nous ont profondeacutement marqueacute Trouver ici lrsquoassurance de notre profonde
gratitude
A notre Maicirctre et Juge Monsieur Germain Jeacuterocircme SAWADOGO
Professeur agrave lrsquoEISMV de Dakar Nous sommes tregraves sensible agrave lrsquohonneur
que vous faites en acceptant de juger ce travail malgreacute vos multiples
occupations Vous nous avez apporteacute une preuve suppleacutementaire de ce que nous
pensons de vous Vos qualiteacutes intelectuelles et humaines forcent respect et
admiration Trouvez ici lrsquoassurance de notre profonde gratitude
A notre Maicirctre et Juge Monsieur Serge Niangoran BAKOU Maicirctre de confeacuterences agreacutegeacute agrave lrsquoEISMV de Dakar vous nous faites un grand
honneur de juger ce modeste travail Vos qualiteacutes scientifiques votre grand
dynamisme et votre abneacutegation devant le travail suscite chaque jour lrsquoadmiration
des eacutetudiants et le respect de vos paires Veuillez recevoir maicirctre nos sincegraveres
remerciements et profondes consideacuterations Vous ecirctes un model pour nous
xviii
xix
A mes Co-Directeurs de Thegravese monsieur Khalifa Babacar Seacuterigne SYLLA
et Madame Beacutellancille MUSABEYEMARIYA Assistants agrave lrsquoEISMV de
Dakar Ce travail est aussi le vocirctre Trouvez ainsi les assurances de notre sincegravere
reconnaissance
LISTE DES TABLEAUX
Tableau I Nomenclature de la sole tropicale
Tableau II classification systeacutematique de la sole tropicale
Tableau III Les 20 acides amineacutes
Tableau IV Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Tableau V Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Tableau VI Classification des proteacuteases
20
LISTE DES FIGURES Figure 1 carte des villages cocirctiers de pecircche de la reacutepublique du Seacuteneacutegal
(source direction des pecircche maritimes 2003) Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de lrsquohydrolyse
enzymatique
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Figure 8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
21
LISTE DES ABREVIATIONS DPM Direction des Pecircches Maritimes AA Acides Amineacutes AAI Acide Amineacutes Indispensables IFN Institut Franccedilais de Normalisation EC Enzyme Classification ATP Adeacutenosine Triphosphate pH Potentiel Hydrogegravene degC Degreacute Celsius FAO Food Agricultural Organisation EISMV Ecole Inter-Etat des Sciences et Meacutedecine Veacuteteacuterinaires HIDAOA Hygiegravene des Industries des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine
Animale IFREMER Institut Franccedilais de Recherche et drsquoExploitation de la Mer INRA Institut Nationale de Recherche Agricole
22
LISTES DES PHOTOS
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation de lrsquoenzyme Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
Photo 7 hydrolysat dans les tubes Falcon
TABLE DES MATIERES INTRODUCTION 1 PREMIERE PARTIE SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 4 CHAPITRE 1 Geacuteneacuteraliteacutes sur la pecircche au Seacuteneacutegal 5 11 Environnement naturel 5
12 Historique de la pecircche au Seacuteneacutegal 5
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees 8
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche 8
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis 9
21 Nomenclature 9
22 Classification systeacutematique 9
23 Caracteacuteristiques morphologiques 9
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae 9
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis 10
24 Reacutepartition geacuteographique 10
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson valorisation et utilisation 12
31 Deacutefinition et composition 12
32 Valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes 12
33 Les hydrolysats de poisson 15
331 Deacutefinition 15
332 Les avantages 15
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson 16
3331 En alimentation animale 16
3332 Inteacuterecircts fonctionnels 17
34 Production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee Les peptides 17
16
341 Geacuteneacuteraliteacutes sur les proteacuteines 17
3411 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des proteacuteines 19
3412 Les proteacuteines de poisson 20
34121 La fraction myogegravene soluble 21
34122 La fraction myofibrillaire 21
342 Les peptides 21
3421 Les Sources azoteacutees 21
3422 Inteacuterecircts nutritionnelles des peptides 23
3423 Activiteacutes biologiques des peptides 24
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE 25
41 Les enzymes 25
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes 25
412 Nomenclature et classification 26
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle 26
4122 Nomenclature et classification officielle 26
413 Les principales classes drsquoenzymes 28
42 Lrsquohydrolyse enzymatique 29
421 Deacutefinition et principe 29
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse 30
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique 30
42 31 Influence de la tempeacuterature 31
4232 Influence du pH 32
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices 33
Conclusion partielle 34
17
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE ndash DISCUSSION ET
RECOMMANDATION
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES 36
11 Mateacuteriel 36
111 Mateacuteriel biologique 36
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale 36
1112 Constitution des lots 37
112 Mateacuteriel enzymatique 37
113 Mateacuteriel technique 38
1131 Materiel de preacutelegravevement 38
1132 Mateacuteriel de laboratoire 38
12 Meacutethodes 39
121 Hydrolyse enzymatique 39
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses 40
1212 Hydrolyse courte dureacutee 41
122 Filtration 41
123 Centrifugation 41
124 La matiegravere segraveche 42
13 Analyses biochimiques 42
131 Deacutetermination de la teneur en eau 42
132 Dosage des proteacuteines totales 43
1321 Principe 43
1322 Mode opeacuteratoire 43
1323 Expression des reacutesultats 44
CHAPITRE 2 RESULTATS 45
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse 45
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes 45
18
19
2 3 Poids du culot et du surnageant 46
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant 47
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot 48
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS 49
31 Discussion 49
311 Discussion des reacutesultats 49
3111 La matiegravere segraveche 49
3113 Les proteacuteines 49
312 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes 50
3121 Lrsquohydrolyse enzymatique 50
3122 La matiegravere segraveche 51
3123 Le dosage des proteacuteines 51
32 Recommandations 54
CONCLUSION GENERALE 56
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 58
INTRODUCTION
Les oceacuteans constituent une richesse alimentaire tregraves diversifieacutee (poissons
algues crustaceacutes coquillages mollusques) Selon la FAO plus de 130 millions
de tonnes de poissons sont actuellement pecirccheacutes ou eacuteleveacutes chaque anneacutee dans le
monde
Les produits de la mer peuvent ecirctre consommeacutes frais congeleacutes seacutecheacutes ou encore
transformeacutes La politique environnementale actuelle incite de plus en plus les
industriels agrave prendre en comptes les deacutechets geacuteneacutereacutes par tous proceacutedeacutes de
transformation des poissons Crsquoest pourquoi apregraves lrsquoexploitation des parties
nobles des poissons des chercheurs se sont inteacuteresseacute aux co-produits Les co-
produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterables lors des
opeacuterations traditionnelles de production
Comme le montre le diagramme 1 la production de filet de la sole tropicale est
agrave lrsquoorigine de plusieurs sources de co-produits solides tecirctes viscegraveres carcasse
et peaux En effet des eacutetudes ont reacuteveacuteleacute que les co-produits de poissons sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecircts notamment les proteacuteines Un des
outils pour la reacutecupeacuteration efficace des proteacuteines des co-produits est lrsquohydrolyse
enzymatique elle est appliqueacutee pour ameacuteliorer les proprieacuteteacutes fonctionnelles et
alimentaires des proteacuteines Le but principal de lhydrolyse des co-produits de
poissons est dobtenir le reacutetablissement possible et maximum de tous les
composants valables tout en maintenant leurs qualiteacutes Ainsi le potentiel du
proceacutedeacute drsquohydrolyse enzymatique controcircleacutee sur les co-produits (tecirctes viscegraveres)
de la sole tropicale issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale en
filet de poisson va ecirctre eacutetudieacute durant ce travail
20
DEBARQUEMENT
RECEPTION LAVAGETRIAGE
PESEE
STOCKAGE EN CHAMBRE FROIDE (sous glace fondante)
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
PELAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration peaux
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
FILETAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration carcasse+ viscegraveres
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu jets dans des paniers)
TREMPAGE (eau glaceacutee et chloreacutee 2degC 1 agrave 2mn concentration 2ppm)
PARAGECONDITIONNEMENT (en films plastiques)
EMBALLAGE (caisses de polystyregravene)
PESEE
GLACcedilAGE (glace isoleacutee du produit)
SCELLAGE
ETIQUETAGE
ENTREPOSAGE REFRIGERE (0 - +4degC)
EXPEDITION
Diagramme 1 Principales eacutetapes de transformation de la sole tropicale en filet
21
Le but de ce travail est la libeacuteration et le dosage des proteacuteines des co-produits
de la sole tropicale De cet objectif geacuteneacuteral deacutecoule les objectifs speacutecifiques
suivants
Hydrolyser les co-produits (tecirctes viscegraveres) agrave lrsquoaide drsquoune proteacutease
Seacuteparer la phase soluble (surnageant) de la phase insoluble (culot) par
centrifugation
Obtenir la matiegravere segraveche de ces deux phases
Doser les proteacuteines totales agrave partir des matiegraveres segraveches obtenues
Pour reacutepondre agrave ces objectifs ce travail se deacuteclinera en deux parties ougrave des
eacuteleacutements de reacuteponses apparaicirctront Une premiegravere partie portant sur lrsquoeacutetude
bibliographique puis une deuxiegraveme partie preacutesentant les analyses effectueacutees et
les reacutesultats obtenus Faisant suite aux conclusions des perspectives seront
eacutemises pour la conduite de futurs travaux
22
PREMIERE PARTIE SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
23
CHAPITRE 1 Geacuteneacuteraliteacutes sur la pecircche au Seacuteneacutegal
11 Environnement naturel
Au large des cocirctes Seacuteneacutegalaises situeacutees agrave lrsquoextreacutemiteacute ouest du continent africain
se heurte le courant marin des canaries venu du Nord et des courants deacuteriveacutes du
courant du Golfe de Guineacutee Des upwellings(remonteacutee drsquoeau froides riches en
sels nutritifs le long de la pente du plateau continental) remontent eacutegalement de
la couche drsquoeau profonde le long de la pente du plateau continental La
tempeacuterature de lrsquoeau de mer en surface ne descend jamais en dessous de 15degC au
cours de lrsquoanneacutee Les fleuves Seacuteneacutegal Gambie et Casamance se jettent dans
lrsquooceacutean atlantique et apportent des sels mineacuteraux pendant lrsquohivernage De plus
du sable riche en sels inorganiques est apporteacute du deacutesert du Sahara par les vents
Le riche environnement naturel preacuteciteacute augmente la productiviteacute de la mer et
creacutee les pecirccheries classeacutees parmi les plus riches drsquoAfrique Des vents violents
qui soufflent au passage de lrsquohivernage agrave la saison segraveche et au passage de la
saison segraveche agrave lrsquohivernage rendent souvent la mer agiteacutee mais en geacuteneacuteral la
zone maritime est calme ce qui permet agrave la population de profiter en toute
seacutecuriteacute des bienfaits de la mer (DPM CRODT 2006)
12 Historique de la pecircche au Seacuteneacutegal
La pecircche a pendant longtemps eacuteteacute une activiteacute monopoliseacutee par certaines
ethnies
les Guet Ndariens de Saint-Louis situeacute agrave lrsquoembouchure du fleuve Seacuteneacutegal
les Lebous aux environs de Dakar
les Nyominka vivant principalement au Saloum
Ces ethnies ont utiliseacute des pecirccheries cocirctiegraveres sur une longueur drsquoenviron 2000
km allant des cocirctes de la Mauritanie au Nord agrave la cocircte de la Sierra Leone au
Sud en suivant le deacuteplacement saisonnier des bancs de poissons La pecircche
artisanale srsquoeffectuait sur des pirogues avec pagaies ou de petites embarcations agrave
24
voile Les captures eacutetaient fournies aux habitants de lrsquointeacuterieur du pays sous
formes de produits fumeacutes ou seacutecheacutes (DPM CRODT 2006)
Lrsquoancecirctre de la pirogue seacuteneacutegalaise remonterait au XVIe siegravecle Elle eacutetait
constitueacutee au deacutepart drsquoun simple tronc eacutevideacute propulseacute agrave la pagaie Vers le deacutebut
du XVIIe siegravecle on assiste agrave lrsquoapparition de la voile Les eacuteperons faisant office
de brise-lames et les bordes sont rajouteacutes au cours du siegravecle suivant Enfin le
moteur hors-bord apparaicirct vers 1950
On distingue deux saisons de production une saison de faible capture de juin
agrave octobre ougrave les volumes des produits diminuent et une saison de forte
production allant de novembre agrave juin Les captures de la pecircche artisanale sont
principalement des espegraveces peacutelagiques alors que les produits de la pecircche
industrielle sont des espegraveces benthiques
Selon la direction des pecircches maritimes (DPM 1996) du ministegravere de
lrsquoeacuteconomie maritime en 1996 lrsquoeffectif de la flottille seacuteneacutegalaise eacutetait le
suivant 11 600 pirogues dont 9 300 motoriseacutees (80) 212 chalutiers dont 60
chalutiers eacutetrangers (28) 6 sardiniers dont 2 sardiniers eacutetrangers (33) 62
thoniers eacutetrangers (97) Les principales prises sont les petits peacutelagiques
(sardinelles chinchards maquereaux) qui repreacutesentent 72 des prises Le reste
correspond agrave des espegraveces benthiques (crevettes ceacutephalopodes rougets dorades
soleshellip)
25
Figure1 Carte des villages cocirctiers de pecircche de la Reacutepublique du Seacuteneacutegal
(source Direction des pecircches maritimes 2003)
26
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees
Depuis trois deacutecennies le secteur de la pecircche a connu une forte croissance au
Seacuteneacutegal Les captures ont eacuteteacute multiplieacutees par huit en 32 ans Les deacutebarquements
des flottilles seacuteneacutegalaises et eacutetrangegraveres ont atteint en 1996 plus de 415 000
tonnes En 1997 le volume deacutebarqueacute est passeacute agrave 421 000 tonnes et en 1998 agrave
425 000 tonnes Cette eacutevolution eacutetant principalement lieacutee agrave lrsquoaugmentation des
petits peacutelagiques mis agrave terre par la pecircche artisanale
(DPM 2003)
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche
Au Seacuteneacutegal la pecircche maritime constitue un eacuteleacutement cleacute de lrsquoeacuteconomie avec une
production en valeur de 150 milliards de FCFA environ soit 2 du PIB national
et 16 du PIB du secteur primaire en 2003 Par ailleurs la population active
dans ce secteur est drsquoenviron 600 000 personnes en comptant lrsquoemploi direct et
indirect repreacutesentant environ 17 de la population active totale Les
exportations de produits halieutiques du pays eacutetaient drsquoenviron 2 milliards pour
130 000 tonnes en 2000 et mecircme ulteacuterieurement celles-ci continuaient de
constituer la plus importante source drsquoacquisition de devises du pays Ces
exportations permettent actuellement de payer pregraves de la moitieacute de la facture
peacutetroliegravere
(Ministegravere de lrsquoeacuteconomie et des finances direction de la deacutemographie et des
statistiques 2005)
Gracircce agrave leur disponibiliteacute les produits de la mer peuvent donc apparaicirctre comme
un apport nutritionnel tregraves important drsquoun point de vue alimentaire les produits
halieutiques contribuent pour 60 agrave lrsquoapport en proteacuteine animales des
populations Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de
proteacuteines couvrant 75 de leurs besoins En 1997 la consommation moyenne
annuelle de poisson au Seacuteneacutegal eacutetait de 26kg par habitant pour une
consommation mondiale de 135 kg par habitant (NDOYE ET COLL 2002)
27
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis
21 Nomenclature
Tableau I Nomenclature de la sole tropicale
Nom scientifique
Nom franccedilais En vernaculaire (en wolof)
Nom FAO Nom anglais
Cynoglossus senegalensis
Sole tropicale Tapaleacute Sole-langue Seacuteneacutegalaise
tongue sole
(SERET 1981)
22 Classification systeacutematique
Cynoglossus senegalensis est classeacute comme indiqueacute dans le tableau ci-dessous
Tableau II classification systeacutematique de la sole tropicale
Classe Osteacuteichtyens
Ordre Pleuronectiformes
Famille Cynoglossidae
Genre Cynoglossus
Espegravece senegalensis
(SERET 1981)
23 Caracteacuteristiques morphologiques
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae
Ce sont des poissons marins agrave corps plat diminuant progressivement de largeur
vers lrsquoarriegravere Les deux yeux assez petits sont situeacutes sur le cocircteacute gauche Le
museau est arrondi La bouche est petite infegravere plus au moins arqueacutee Le bord
du pregrave-opercule nrsquoest pas libre et est recouvert par la peau et des eacutecailles Il nrsquoy
a pas de rayons eacutepineux agrave la dorsale et agrave lrsquoanale La dorsale deacutebute en avant de
lrsquoœil dorsal Les rayons de la dorsale et de lrsquoanale sont confluents avec ceux de
28
la caudale qui se termine en pointe Les nageoires pectorales sont absentes ou
rudimentaires Seule la pelvienne de la face oculeacutee est preacutesente elle est situeacutee
sur la ligne meacutediane Le corps est recouvert par des eacutecailles cteacutenoiumldes ou
cycloiumldes (SERET 1981)
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis
Le corps est plat et allongeacute les nageoires dorsale et anale rejoignent la caudale
qui se termine en pointe Les yeux situeacutes sur le cocircteacute gauche du corps ont un
espace assez large entre eux Le museau est largement arrondi le crochet rostral
plutocirct court srsquoeacutetend jusqursquoau niveau de la narine anteacuterieure La bouche srsquoeacutetend
au-delagrave de lrsquoœil ventral La nageoire dorsale compte 119-125 rayons lrsquoanale 93-
99 rayons et la caudale 12 rayons On compte 124-138 eacutecailles tubuleacutees le long
de la ligne margino-dorsale Une ligne lateacuterale meacutediane est visible sur la face
aveugle
Sur la face oculeacutee le corps est plus ou moins uniformeacutement brun plus ou moins
fonceacute avec des reflets verdacirctres visibles sur le vivant la reacutegion de lrsquoopercule
est souvent noiracirctre La face aveugle est blanchacirctre
(SERET 1981)
Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
29
24 Reacutepartition geacuteographique
Cynoglossus senegalensis est une espegravece tregraves cocirctiegravere par rapport aux autres
espegraveces de la famille des cynoglossidae Elle freacutequente les zones sablo vaseuses
cocirctiegraveres entre 10 et 110 megravetres mais les prises maximales sont reacutealiseacutees entre 5
et 15 megravetres de profondeur Elle est connue de la Mauritanie agrave lrsquoAngola Les
reacutepartitions bathymeacutetriques de cette espegravece observeacutees au Seacuteneacutegal Togo-Benin
au Congo et au Cameroun sont similaires
(SERET 1981)
30
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson deacutefinition valorisation et
utilisation
31 Deacutefinition et composition
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
des opeacuterations traditionnelles de production
Les principaux co-produits de poisson rencontreacutes sont la tecircte la peau les
chutes de filetage les arecirctes centrales les viscegraveres le foie et selon les peacuteriodes
de pecircche les eacuteleacutements reproducteurs tels que les œufs ou la laitance (figure3)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
En vue drsquoune valorisation les co-produits sont traiteacutes selon le mecircme protocole
de conservation que les parties destineacutees agrave la production alimentaire
garantissant ainsi leur absence drsquoalteacuteration
32 les voies de valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes
Le produit deacuteriveacute est le produit commercial obtenu agrave partir drsquoun co-produit Un
co-produit pourra donner plusieurs produits deacuteriveacutes (figure4) Ainsi
la tecircte de poisson pourra ecirctre valoriseacutee en tant que farine de poisson huile
ou destineacutee agrave la nutrition
la chair sur les arecirctes en farine de poisson la chair hacheacutee et huile
31
la peau en farine de poisson collagegravene geacutelatine cuir
les viscegraveres en farine de poisson huile vitamines
la carcasse en farine de poisson collagegravene geacutelatine mineacuteraux
(GUERARD et Coll 2004)
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Ces produits sont qualifieacutes de produits deacuteriveacutes et non de produits finis car ils
sont geacuteneacuteralement commercialiseacutes sous forme drsquoingreacutedients crsquoest-agrave-dire sous
forme de produits intermeacutediaires pour la nutrition humaine animale pour la
dieacuteteacutetique la cosmeacutetique Neacuteanmoins certains co-produits (foies œufs) peuvent
ecirctre vendus agrave lrsquoeacutetat brut aux consommateurs Mais cette tendance est faible et ils
sont (foies œufs) plus utiliseacutes par les industries de conserverie et de saurisserie
(ANDRIEUX 2004)
On peut distinguer quatre (4) categories de produits deacuteriveacutes en fonction de leur
destination
lrsquoutilisation en nutrition humaine ou en alimentation animale
lrsquoutilisation en dieacuteteacutetique ou nutraceutique
32
lrsquoutilisation en cosmeacutetique
utilisation plus restreinte et speacutecifique drsquoun seul type de produit deacuteriveacute
Il existe plusieurs applications possibles des co-produits (figure5) parmi
lesquelles on peut citer
les farines et huiles de poisson
Cette valorisation est actuellement la plus importante car tous les co-produits
peuvent ecirctre utiliseacutes sans distinction Aucun tri nrsquoest neacutecessaire seule la
distinction co- produits issus de poissons sauvages ou drsquoeacutelevage doit ecirctre faite
les hachis
Les co-produits sont broyeacutes et filtreacutes puis le hachi obtenu est congeleacute en bloc
Les co-produits viscegraveres sont exclus de cette valorisation Les hachis sont
destineacutes agrave la fabrication drsquoaliments pour animaux domestiques essentiellement
les chats Ils sont souvent commercialiseacutes sous forme congeleacutee et sont une
bonne source de proteacuteines
les hydrolysats (cf 33)
la production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee (protides lipides)
La production de farine et drsquohuile de poisson repreacutesente toujours en tonnage la
voie de valorisation la plus importante des co-produits de la pecircche (figure 5)
Mais la faible valeur ajouteacutee obtenue avec ces produits incite les industriels agrave
rechercher des deacuteboucheacutes plus rentables productions de sauces de poisson
drsquoaromes de proteacuteines musculaires (surimi) sont autant de valorisation
alternative vers lrsquoindustrie agro-alimentaire (CHING 1999)
33
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
33 Les hydrolysats de poisson
331 Deacutefinition
Les hydrolysats sont des fractions agrave teneur proteacuteique eacuteleveacutee (73 agrave 85) obtenus
par autolyse (uniquement sous lrsquoaction drsquoenzymes endogegravenes) ou heacuteteacuterolyses
(ajout drsquoenzymes exogegravenes) Cependant la proportion en eacuteleacutements mineacuteraux est
assez faible car les arecirctes osseuses non hydrolysables ont eacuteteacute retireacutees Les
hydrolysats ont donc lrsquoavantage drsquoecirctre digeste et drsquoavoir une haute qualiteacute
nutritive
332 Les avantages
Les hydrolysats preacutesentent les mecircmes avantages que les matiegraveres premiegraveres
drsquoorigine animale pour lrsquoaquaculture sans en avoir les nombreux inconveacutenients
(LARBIER et LECLERCQ 1992 ANDERSON et coll 1993) En effet ce
sont des proteacuteines hydrolyseacutees les acides amineacutes essentiels libeacutereacutes sont donc
plus facilement disponibles et assimilables pour les animaux De plus ils
constituent un produit tregraves appeacutetant et parfaitement accepteacute gracircce agrave lrsquoarocircme de
34
poisson et preacutesente une granulomeacutetrie fine facilitant la fabrication drsquoaliments
suivant des proceacutedeacutes tels que la microparticulation (JONES 1995) Enfin les
hydrolysats comportent en geacuteneacuteral peu de mineacuteraux et ne risquent donc pas de
polluer les eaux des eacutelevages aquacoles leur bonne qualiteacute microbiologique
eacutetant assureacutee par la steacuterilisation au cours de la fabrication
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson
3331 En alimentation animale
Les hydrolysats de poisson sont utiliseacutes comme substitut du lait pour les bovins
et les ovins En comparaison avec la caseacuteine les animaux nourris avec les
hydrolysats de poisson gras apregraves un deacutebut de croissance plus lent arrivent au
mecircme poids au bout de quelques semaines (OslashRSKOV et Coll 1982
RITCHIE et MACKIE 1982) De plus une eacutetude eacuteconomique a montreacute les
inteacuterecircts des peptides de poisson en tant que substituts du lait (MERRITT
1982) Pour le beacutetail adulte lrsquoensilage obtenu agrave partir drsquoherbe peut ecirctre
eacutegalement remplaceacute par des hydrolysats de poisson (OUELLET et Coll 1997)
Mais crsquoest dans le domaine de lrsquoaquaculture que ces hydrolysats sont les plus
valoriseacutes En effet en aquaculture la charge reacutecurrente la plus importante est la
source proteacuteique apporteacutee aux animaux Les proteacuteines de poisson hydrolyseacutees
en plus de leur faible coucirct sont drsquoune grande digestibiliteacute De plus de
nombreuses eacutetudes ont montreacute que certains hydrolysats de poisson possegravedent des
proprieacuteteacutes nutraceutiques Ainsi le remplacement des farines de poisson par des
hydrolysats de poisson augmenterait la croissance des crevettes et des larves de
poisson (CORDOVA-MUREATA et GARCIA-CARRENO 2002)
35
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
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SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
A Naomie Kenmogne malgreacute les eacutepreuves notre amitieacute est resteacute intacte a
travers se travail je te teacutemoigne toute mon affection
A Moundjoa Christian
A Stella Abessolo Sandrine Tene Rachel Bend Christelle Bobda Doris
Sadi Mme Ichakou Hermine Kwin Nathalie Laeticia Sabine Bouba
A mes camarades
Salifou Arouna Hellow Jean-Marc Serge Mpouam Ndam kamanzi
Shyaka Walbadet Yapi Doumbou Mosus zombou Tcheuffo Moctar
Natacha Carine Viviane
A mes proches relations et amis de Dakar et drsquoailleurs et agrave tous ceux que je ne
saurais citer car la liste est exhaustive mais que je porte dans mon cœur
A la CAVESTAS et agrave lrsquoAEVD
A la promotion SAMBA SIDIBE (34e promotion)
Au Cameroun ma chegravere patrie
Au Seacuteneacutegal mon pays hocircte
xvi
REMERCIEMENTS
Nous tenons agrave exprimer notre immense gratitude agrave lrsquoendroit de tout
ceux qui ont œuvreacutes de pregraves ou de loin agrave lrsquoaccomplissement de ce
travail
Professeurs Malang Seydi
Docteurs KSB Sylla Bellancille Musabemarya Alain kamga Waladjo Serge
Bakou Babacar Sene
Tout le personnel du service drsquoHIDAOA
Tout le personnel de lrsquoEISMV de Dakar
Madame DIOUF de la bibliothegraveque de lrsquoEISMV de Dakar
Tout le personnel du mini resto
A Clara Gregoire Dr Gilles Hakou Dr Ngono Patrick Samuel Zoumbou Kasseacute
Ndongo Dr Ekoga Mve Daniel Chancellin Dr wounkou Christian Tcheuffo
Ma tregraves chegravere patrie le Cameroun et le Seacuteneacutegal mon pays drsquoaccueil
Tous ceux que nous nrsquoavons pas citeacutes et qui de pregraves ou de loin ont rendu ce
travail possible
A tous veuillez recevoir lexpression de notre profonde gratitude
HOMMAGES A NOS MAITRES ET JUGES
xvii
A notre preacutesident de jury Monsieur Niama Diop SALL Professeur agrave la
Faculteacute de Meacutedecine de pharmacie et drsquoOdonto-Stomatologie de
Dakar Vous nous faites lrsquoinsigne honneur malgreacute vos multiples occupations de
preacutesider ce jury Votre abord facile et la spontaneacuteiteacute avec laquelle vous avez
reacutepondu agrave notre sollicitation nous ont beaucoup marqueacute Veuillez trouver ici
lrsquoexpression de notre profonde et sincegravere gratitude
A notre Directeur et Rapporteur de Thegravese Monsieur Malang SEYDI
Professeur agrave lrsquoEISMV de Dakar Vous avez accepteacute drsquoencadrer et de diriger
ce travail avec rigueur scientifique et pragmatisme Nous avons eacuteteacute fascineacute par
votre abord facile et votre simpliciteacute Vos qualiteacutes scientifiques et humaines
nous ont profondeacutement marqueacute Trouver ici lrsquoassurance de notre profonde
gratitude
A notre Maicirctre et Juge Monsieur Germain Jeacuterocircme SAWADOGO
Professeur agrave lrsquoEISMV de Dakar Nous sommes tregraves sensible agrave lrsquohonneur
que vous faites en acceptant de juger ce travail malgreacute vos multiples
occupations Vous nous avez apporteacute une preuve suppleacutementaire de ce que nous
pensons de vous Vos qualiteacutes intelectuelles et humaines forcent respect et
admiration Trouvez ici lrsquoassurance de notre profonde gratitude
A notre Maicirctre et Juge Monsieur Serge Niangoran BAKOU Maicirctre de confeacuterences agreacutegeacute agrave lrsquoEISMV de Dakar vous nous faites un grand
honneur de juger ce modeste travail Vos qualiteacutes scientifiques votre grand
dynamisme et votre abneacutegation devant le travail suscite chaque jour lrsquoadmiration
des eacutetudiants et le respect de vos paires Veuillez recevoir maicirctre nos sincegraveres
remerciements et profondes consideacuterations Vous ecirctes un model pour nous
xviii
xix
A mes Co-Directeurs de Thegravese monsieur Khalifa Babacar Seacuterigne SYLLA
et Madame Beacutellancille MUSABEYEMARIYA Assistants agrave lrsquoEISMV de
Dakar Ce travail est aussi le vocirctre Trouvez ainsi les assurances de notre sincegravere
reconnaissance
LISTE DES TABLEAUX
Tableau I Nomenclature de la sole tropicale
Tableau II classification systeacutematique de la sole tropicale
Tableau III Les 20 acides amineacutes
Tableau IV Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Tableau V Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Tableau VI Classification des proteacuteases
20
LISTE DES FIGURES Figure 1 carte des villages cocirctiers de pecircche de la reacutepublique du Seacuteneacutegal
(source direction des pecircche maritimes 2003) Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de lrsquohydrolyse
enzymatique
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Figure 8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
21
LISTE DES ABREVIATIONS DPM Direction des Pecircches Maritimes AA Acides Amineacutes AAI Acide Amineacutes Indispensables IFN Institut Franccedilais de Normalisation EC Enzyme Classification ATP Adeacutenosine Triphosphate pH Potentiel Hydrogegravene degC Degreacute Celsius FAO Food Agricultural Organisation EISMV Ecole Inter-Etat des Sciences et Meacutedecine Veacuteteacuterinaires HIDAOA Hygiegravene des Industries des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine
Animale IFREMER Institut Franccedilais de Recherche et drsquoExploitation de la Mer INRA Institut Nationale de Recherche Agricole
22
LISTES DES PHOTOS
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation de lrsquoenzyme Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
Photo 7 hydrolysat dans les tubes Falcon
TABLE DES MATIERES INTRODUCTION 1 PREMIERE PARTIE SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 4 CHAPITRE 1 Geacuteneacuteraliteacutes sur la pecircche au Seacuteneacutegal 5 11 Environnement naturel 5
12 Historique de la pecircche au Seacuteneacutegal 5
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees 8
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche 8
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis 9
21 Nomenclature 9
22 Classification systeacutematique 9
23 Caracteacuteristiques morphologiques 9
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae 9
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis 10
24 Reacutepartition geacuteographique 10
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson valorisation et utilisation 12
31 Deacutefinition et composition 12
32 Valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes 12
33 Les hydrolysats de poisson 15
331 Deacutefinition 15
332 Les avantages 15
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson 16
3331 En alimentation animale 16
3332 Inteacuterecircts fonctionnels 17
34 Production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee Les peptides 17
16
341 Geacuteneacuteraliteacutes sur les proteacuteines 17
3411 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des proteacuteines 19
3412 Les proteacuteines de poisson 20
34121 La fraction myogegravene soluble 21
34122 La fraction myofibrillaire 21
342 Les peptides 21
3421 Les Sources azoteacutees 21
3422 Inteacuterecircts nutritionnelles des peptides 23
3423 Activiteacutes biologiques des peptides 24
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE 25
41 Les enzymes 25
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes 25
412 Nomenclature et classification 26
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle 26
4122 Nomenclature et classification officielle 26
413 Les principales classes drsquoenzymes 28
42 Lrsquohydrolyse enzymatique 29
421 Deacutefinition et principe 29
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse 30
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique 30
42 31 Influence de la tempeacuterature 31
4232 Influence du pH 32
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices 33
Conclusion partielle 34
17
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE ndash DISCUSSION ET
RECOMMANDATION
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES 36
11 Mateacuteriel 36
111 Mateacuteriel biologique 36
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale 36
1112 Constitution des lots 37
112 Mateacuteriel enzymatique 37
113 Mateacuteriel technique 38
1131 Materiel de preacutelegravevement 38
1132 Mateacuteriel de laboratoire 38
12 Meacutethodes 39
121 Hydrolyse enzymatique 39
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses 40
1212 Hydrolyse courte dureacutee 41
122 Filtration 41
123 Centrifugation 41
124 La matiegravere segraveche 42
13 Analyses biochimiques 42
131 Deacutetermination de la teneur en eau 42
132 Dosage des proteacuteines totales 43
1321 Principe 43
1322 Mode opeacuteratoire 43
1323 Expression des reacutesultats 44
CHAPITRE 2 RESULTATS 45
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse 45
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes 45
18
19
2 3 Poids du culot et du surnageant 46
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant 47
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot 48
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS 49
31 Discussion 49
311 Discussion des reacutesultats 49
3111 La matiegravere segraveche 49
3113 Les proteacuteines 49
312 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes 50
3121 Lrsquohydrolyse enzymatique 50
3122 La matiegravere segraveche 51
3123 Le dosage des proteacuteines 51
32 Recommandations 54
CONCLUSION GENERALE 56
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 58
INTRODUCTION
Les oceacuteans constituent une richesse alimentaire tregraves diversifieacutee (poissons
algues crustaceacutes coquillages mollusques) Selon la FAO plus de 130 millions
de tonnes de poissons sont actuellement pecirccheacutes ou eacuteleveacutes chaque anneacutee dans le
monde
Les produits de la mer peuvent ecirctre consommeacutes frais congeleacutes seacutecheacutes ou encore
transformeacutes La politique environnementale actuelle incite de plus en plus les
industriels agrave prendre en comptes les deacutechets geacuteneacutereacutes par tous proceacutedeacutes de
transformation des poissons Crsquoest pourquoi apregraves lrsquoexploitation des parties
nobles des poissons des chercheurs se sont inteacuteresseacute aux co-produits Les co-
produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterables lors des
opeacuterations traditionnelles de production
Comme le montre le diagramme 1 la production de filet de la sole tropicale est
agrave lrsquoorigine de plusieurs sources de co-produits solides tecirctes viscegraveres carcasse
et peaux En effet des eacutetudes ont reacuteveacuteleacute que les co-produits de poissons sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecircts notamment les proteacuteines Un des
outils pour la reacutecupeacuteration efficace des proteacuteines des co-produits est lrsquohydrolyse
enzymatique elle est appliqueacutee pour ameacuteliorer les proprieacuteteacutes fonctionnelles et
alimentaires des proteacuteines Le but principal de lhydrolyse des co-produits de
poissons est dobtenir le reacutetablissement possible et maximum de tous les
composants valables tout en maintenant leurs qualiteacutes Ainsi le potentiel du
proceacutedeacute drsquohydrolyse enzymatique controcircleacutee sur les co-produits (tecirctes viscegraveres)
de la sole tropicale issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale en
filet de poisson va ecirctre eacutetudieacute durant ce travail
20
DEBARQUEMENT
RECEPTION LAVAGETRIAGE
PESEE
STOCKAGE EN CHAMBRE FROIDE (sous glace fondante)
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
PELAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration peaux
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
FILETAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration carcasse+ viscegraveres
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu jets dans des paniers)
TREMPAGE (eau glaceacutee et chloreacutee 2degC 1 agrave 2mn concentration 2ppm)
PARAGECONDITIONNEMENT (en films plastiques)
EMBALLAGE (caisses de polystyregravene)
PESEE
GLACcedilAGE (glace isoleacutee du produit)
SCELLAGE
ETIQUETAGE
ENTREPOSAGE REFRIGERE (0 - +4degC)
EXPEDITION
Diagramme 1 Principales eacutetapes de transformation de la sole tropicale en filet
21
Le but de ce travail est la libeacuteration et le dosage des proteacuteines des co-produits
de la sole tropicale De cet objectif geacuteneacuteral deacutecoule les objectifs speacutecifiques
suivants
Hydrolyser les co-produits (tecirctes viscegraveres) agrave lrsquoaide drsquoune proteacutease
Seacuteparer la phase soluble (surnageant) de la phase insoluble (culot) par
centrifugation
Obtenir la matiegravere segraveche de ces deux phases
Doser les proteacuteines totales agrave partir des matiegraveres segraveches obtenues
Pour reacutepondre agrave ces objectifs ce travail se deacuteclinera en deux parties ougrave des
eacuteleacutements de reacuteponses apparaicirctront Une premiegravere partie portant sur lrsquoeacutetude
bibliographique puis une deuxiegraveme partie preacutesentant les analyses effectueacutees et
les reacutesultats obtenus Faisant suite aux conclusions des perspectives seront
eacutemises pour la conduite de futurs travaux
22
PREMIERE PARTIE SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
23
CHAPITRE 1 Geacuteneacuteraliteacutes sur la pecircche au Seacuteneacutegal
11 Environnement naturel
Au large des cocirctes Seacuteneacutegalaises situeacutees agrave lrsquoextreacutemiteacute ouest du continent africain
se heurte le courant marin des canaries venu du Nord et des courants deacuteriveacutes du
courant du Golfe de Guineacutee Des upwellings(remonteacutee drsquoeau froides riches en
sels nutritifs le long de la pente du plateau continental) remontent eacutegalement de
la couche drsquoeau profonde le long de la pente du plateau continental La
tempeacuterature de lrsquoeau de mer en surface ne descend jamais en dessous de 15degC au
cours de lrsquoanneacutee Les fleuves Seacuteneacutegal Gambie et Casamance se jettent dans
lrsquooceacutean atlantique et apportent des sels mineacuteraux pendant lrsquohivernage De plus
du sable riche en sels inorganiques est apporteacute du deacutesert du Sahara par les vents
Le riche environnement naturel preacuteciteacute augmente la productiviteacute de la mer et
creacutee les pecirccheries classeacutees parmi les plus riches drsquoAfrique Des vents violents
qui soufflent au passage de lrsquohivernage agrave la saison segraveche et au passage de la
saison segraveche agrave lrsquohivernage rendent souvent la mer agiteacutee mais en geacuteneacuteral la
zone maritime est calme ce qui permet agrave la population de profiter en toute
seacutecuriteacute des bienfaits de la mer (DPM CRODT 2006)
12 Historique de la pecircche au Seacuteneacutegal
La pecircche a pendant longtemps eacuteteacute une activiteacute monopoliseacutee par certaines
ethnies
les Guet Ndariens de Saint-Louis situeacute agrave lrsquoembouchure du fleuve Seacuteneacutegal
les Lebous aux environs de Dakar
les Nyominka vivant principalement au Saloum
Ces ethnies ont utiliseacute des pecirccheries cocirctiegraveres sur une longueur drsquoenviron 2000
km allant des cocirctes de la Mauritanie au Nord agrave la cocircte de la Sierra Leone au
Sud en suivant le deacuteplacement saisonnier des bancs de poissons La pecircche
artisanale srsquoeffectuait sur des pirogues avec pagaies ou de petites embarcations agrave
24
voile Les captures eacutetaient fournies aux habitants de lrsquointeacuterieur du pays sous
formes de produits fumeacutes ou seacutecheacutes (DPM CRODT 2006)
Lrsquoancecirctre de la pirogue seacuteneacutegalaise remonterait au XVIe siegravecle Elle eacutetait
constitueacutee au deacutepart drsquoun simple tronc eacutevideacute propulseacute agrave la pagaie Vers le deacutebut
du XVIIe siegravecle on assiste agrave lrsquoapparition de la voile Les eacuteperons faisant office
de brise-lames et les bordes sont rajouteacutes au cours du siegravecle suivant Enfin le
moteur hors-bord apparaicirct vers 1950
On distingue deux saisons de production une saison de faible capture de juin
agrave octobre ougrave les volumes des produits diminuent et une saison de forte
production allant de novembre agrave juin Les captures de la pecircche artisanale sont
principalement des espegraveces peacutelagiques alors que les produits de la pecircche
industrielle sont des espegraveces benthiques
Selon la direction des pecircches maritimes (DPM 1996) du ministegravere de
lrsquoeacuteconomie maritime en 1996 lrsquoeffectif de la flottille seacuteneacutegalaise eacutetait le
suivant 11 600 pirogues dont 9 300 motoriseacutees (80) 212 chalutiers dont 60
chalutiers eacutetrangers (28) 6 sardiniers dont 2 sardiniers eacutetrangers (33) 62
thoniers eacutetrangers (97) Les principales prises sont les petits peacutelagiques
(sardinelles chinchards maquereaux) qui repreacutesentent 72 des prises Le reste
correspond agrave des espegraveces benthiques (crevettes ceacutephalopodes rougets dorades
soleshellip)
25
Figure1 Carte des villages cocirctiers de pecircche de la Reacutepublique du Seacuteneacutegal
(source Direction des pecircches maritimes 2003)
26
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees
Depuis trois deacutecennies le secteur de la pecircche a connu une forte croissance au
Seacuteneacutegal Les captures ont eacuteteacute multiplieacutees par huit en 32 ans Les deacutebarquements
des flottilles seacuteneacutegalaises et eacutetrangegraveres ont atteint en 1996 plus de 415 000
tonnes En 1997 le volume deacutebarqueacute est passeacute agrave 421 000 tonnes et en 1998 agrave
425 000 tonnes Cette eacutevolution eacutetant principalement lieacutee agrave lrsquoaugmentation des
petits peacutelagiques mis agrave terre par la pecircche artisanale
(DPM 2003)
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche
Au Seacuteneacutegal la pecircche maritime constitue un eacuteleacutement cleacute de lrsquoeacuteconomie avec une
production en valeur de 150 milliards de FCFA environ soit 2 du PIB national
et 16 du PIB du secteur primaire en 2003 Par ailleurs la population active
dans ce secteur est drsquoenviron 600 000 personnes en comptant lrsquoemploi direct et
indirect repreacutesentant environ 17 de la population active totale Les
exportations de produits halieutiques du pays eacutetaient drsquoenviron 2 milliards pour
130 000 tonnes en 2000 et mecircme ulteacuterieurement celles-ci continuaient de
constituer la plus importante source drsquoacquisition de devises du pays Ces
exportations permettent actuellement de payer pregraves de la moitieacute de la facture
peacutetroliegravere
(Ministegravere de lrsquoeacuteconomie et des finances direction de la deacutemographie et des
statistiques 2005)
Gracircce agrave leur disponibiliteacute les produits de la mer peuvent donc apparaicirctre comme
un apport nutritionnel tregraves important drsquoun point de vue alimentaire les produits
halieutiques contribuent pour 60 agrave lrsquoapport en proteacuteine animales des
populations Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de
proteacuteines couvrant 75 de leurs besoins En 1997 la consommation moyenne
annuelle de poisson au Seacuteneacutegal eacutetait de 26kg par habitant pour une
consommation mondiale de 135 kg par habitant (NDOYE ET COLL 2002)
27
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis
21 Nomenclature
Tableau I Nomenclature de la sole tropicale
Nom scientifique
Nom franccedilais En vernaculaire (en wolof)
Nom FAO Nom anglais
Cynoglossus senegalensis
Sole tropicale Tapaleacute Sole-langue Seacuteneacutegalaise
tongue sole
(SERET 1981)
22 Classification systeacutematique
Cynoglossus senegalensis est classeacute comme indiqueacute dans le tableau ci-dessous
Tableau II classification systeacutematique de la sole tropicale
Classe Osteacuteichtyens
Ordre Pleuronectiformes
Famille Cynoglossidae
Genre Cynoglossus
Espegravece senegalensis
(SERET 1981)
23 Caracteacuteristiques morphologiques
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae
Ce sont des poissons marins agrave corps plat diminuant progressivement de largeur
vers lrsquoarriegravere Les deux yeux assez petits sont situeacutes sur le cocircteacute gauche Le
museau est arrondi La bouche est petite infegravere plus au moins arqueacutee Le bord
du pregrave-opercule nrsquoest pas libre et est recouvert par la peau et des eacutecailles Il nrsquoy
a pas de rayons eacutepineux agrave la dorsale et agrave lrsquoanale La dorsale deacutebute en avant de
lrsquoœil dorsal Les rayons de la dorsale et de lrsquoanale sont confluents avec ceux de
28
la caudale qui se termine en pointe Les nageoires pectorales sont absentes ou
rudimentaires Seule la pelvienne de la face oculeacutee est preacutesente elle est situeacutee
sur la ligne meacutediane Le corps est recouvert par des eacutecailles cteacutenoiumldes ou
cycloiumldes (SERET 1981)
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis
Le corps est plat et allongeacute les nageoires dorsale et anale rejoignent la caudale
qui se termine en pointe Les yeux situeacutes sur le cocircteacute gauche du corps ont un
espace assez large entre eux Le museau est largement arrondi le crochet rostral
plutocirct court srsquoeacutetend jusqursquoau niveau de la narine anteacuterieure La bouche srsquoeacutetend
au-delagrave de lrsquoœil ventral La nageoire dorsale compte 119-125 rayons lrsquoanale 93-
99 rayons et la caudale 12 rayons On compte 124-138 eacutecailles tubuleacutees le long
de la ligne margino-dorsale Une ligne lateacuterale meacutediane est visible sur la face
aveugle
Sur la face oculeacutee le corps est plus ou moins uniformeacutement brun plus ou moins
fonceacute avec des reflets verdacirctres visibles sur le vivant la reacutegion de lrsquoopercule
est souvent noiracirctre La face aveugle est blanchacirctre
(SERET 1981)
Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
29
24 Reacutepartition geacuteographique
Cynoglossus senegalensis est une espegravece tregraves cocirctiegravere par rapport aux autres
espegraveces de la famille des cynoglossidae Elle freacutequente les zones sablo vaseuses
cocirctiegraveres entre 10 et 110 megravetres mais les prises maximales sont reacutealiseacutees entre 5
et 15 megravetres de profondeur Elle est connue de la Mauritanie agrave lrsquoAngola Les
reacutepartitions bathymeacutetriques de cette espegravece observeacutees au Seacuteneacutegal Togo-Benin
au Congo et au Cameroun sont similaires
(SERET 1981)
30
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson deacutefinition valorisation et
utilisation
31 Deacutefinition et composition
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
des opeacuterations traditionnelles de production
Les principaux co-produits de poisson rencontreacutes sont la tecircte la peau les
chutes de filetage les arecirctes centrales les viscegraveres le foie et selon les peacuteriodes
de pecircche les eacuteleacutements reproducteurs tels que les œufs ou la laitance (figure3)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
En vue drsquoune valorisation les co-produits sont traiteacutes selon le mecircme protocole
de conservation que les parties destineacutees agrave la production alimentaire
garantissant ainsi leur absence drsquoalteacuteration
32 les voies de valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes
Le produit deacuteriveacute est le produit commercial obtenu agrave partir drsquoun co-produit Un
co-produit pourra donner plusieurs produits deacuteriveacutes (figure4) Ainsi
la tecircte de poisson pourra ecirctre valoriseacutee en tant que farine de poisson huile
ou destineacutee agrave la nutrition
la chair sur les arecirctes en farine de poisson la chair hacheacutee et huile
31
la peau en farine de poisson collagegravene geacutelatine cuir
les viscegraveres en farine de poisson huile vitamines
la carcasse en farine de poisson collagegravene geacutelatine mineacuteraux
(GUERARD et Coll 2004)
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Ces produits sont qualifieacutes de produits deacuteriveacutes et non de produits finis car ils
sont geacuteneacuteralement commercialiseacutes sous forme drsquoingreacutedients crsquoest-agrave-dire sous
forme de produits intermeacutediaires pour la nutrition humaine animale pour la
dieacuteteacutetique la cosmeacutetique Neacuteanmoins certains co-produits (foies œufs) peuvent
ecirctre vendus agrave lrsquoeacutetat brut aux consommateurs Mais cette tendance est faible et ils
sont (foies œufs) plus utiliseacutes par les industries de conserverie et de saurisserie
(ANDRIEUX 2004)
On peut distinguer quatre (4) categories de produits deacuteriveacutes en fonction de leur
destination
lrsquoutilisation en nutrition humaine ou en alimentation animale
lrsquoutilisation en dieacuteteacutetique ou nutraceutique
32
lrsquoutilisation en cosmeacutetique
utilisation plus restreinte et speacutecifique drsquoun seul type de produit deacuteriveacute
Il existe plusieurs applications possibles des co-produits (figure5) parmi
lesquelles on peut citer
les farines et huiles de poisson
Cette valorisation est actuellement la plus importante car tous les co-produits
peuvent ecirctre utiliseacutes sans distinction Aucun tri nrsquoest neacutecessaire seule la
distinction co- produits issus de poissons sauvages ou drsquoeacutelevage doit ecirctre faite
les hachis
Les co-produits sont broyeacutes et filtreacutes puis le hachi obtenu est congeleacute en bloc
Les co-produits viscegraveres sont exclus de cette valorisation Les hachis sont
destineacutes agrave la fabrication drsquoaliments pour animaux domestiques essentiellement
les chats Ils sont souvent commercialiseacutes sous forme congeleacutee et sont une
bonne source de proteacuteines
les hydrolysats (cf 33)
la production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee (protides lipides)
La production de farine et drsquohuile de poisson repreacutesente toujours en tonnage la
voie de valorisation la plus importante des co-produits de la pecircche (figure 5)
Mais la faible valeur ajouteacutee obtenue avec ces produits incite les industriels agrave
rechercher des deacuteboucheacutes plus rentables productions de sauces de poisson
drsquoaromes de proteacuteines musculaires (surimi) sont autant de valorisation
alternative vers lrsquoindustrie agro-alimentaire (CHING 1999)
33
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
33 Les hydrolysats de poisson
331 Deacutefinition
Les hydrolysats sont des fractions agrave teneur proteacuteique eacuteleveacutee (73 agrave 85) obtenus
par autolyse (uniquement sous lrsquoaction drsquoenzymes endogegravenes) ou heacuteteacuterolyses
(ajout drsquoenzymes exogegravenes) Cependant la proportion en eacuteleacutements mineacuteraux est
assez faible car les arecirctes osseuses non hydrolysables ont eacuteteacute retireacutees Les
hydrolysats ont donc lrsquoavantage drsquoecirctre digeste et drsquoavoir une haute qualiteacute
nutritive
332 Les avantages
Les hydrolysats preacutesentent les mecircmes avantages que les matiegraveres premiegraveres
drsquoorigine animale pour lrsquoaquaculture sans en avoir les nombreux inconveacutenients
(LARBIER et LECLERCQ 1992 ANDERSON et coll 1993) En effet ce
sont des proteacuteines hydrolyseacutees les acides amineacutes essentiels libeacutereacutes sont donc
plus facilement disponibles et assimilables pour les animaux De plus ils
constituent un produit tregraves appeacutetant et parfaitement accepteacute gracircce agrave lrsquoarocircme de
34
poisson et preacutesente une granulomeacutetrie fine facilitant la fabrication drsquoaliments
suivant des proceacutedeacutes tels que la microparticulation (JONES 1995) Enfin les
hydrolysats comportent en geacuteneacuteral peu de mineacuteraux et ne risquent donc pas de
polluer les eaux des eacutelevages aquacoles leur bonne qualiteacute microbiologique
eacutetant assureacutee par la steacuterilisation au cours de la fabrication
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson
3331 En alimentation animale
Les hydrolysats de poisson sont utiliseacutes comme substitut du lait pour les bovins
et les ovins En comparaison avec la caseacuteine les animaux nourris avec les
hydrolysats de poisson gras apregraves un deacutebut de croissance plus lent arrivent au
mecircme poids au bout de quelques semaines (OslashRSKOV et Coll 1982
RITCHIE et MACKIE 1982) De plus une eacutetude eacuteconomique a montreacute les
inteacuterecircts des peptides de poisson en tant que substituts du lait (MERRITT
1982) Pour le beacutetail adulte lrsquoensilage obtenu agrave partir drsquoherbe peut ecirctre
eacutegalement remplaceacute par des hydrolysats de poisson (OUELLET et Coll 1997)
Mais crsquoest dans le domaine de lrsquoaquaculture que ces hydrolysats sont les plus
valoriseacutes En effet en aquaculture la charge reacutecurrente la plus importante est la
source proteacuteique apporteacutee aux animaux Les proteacuteines de poisson hydrolyseacutees
en plus de leur faible coucirct sont drsquoune grande digestibiliteacute De plus de
nombreuses eacutetudes ont montreacute que certains hydrolysats de poisson possegravedent des
proprieacuteteacutes nutraceutiques Ainsi le remplacement des farines de poisson par des
hydrolysats de poisson augmenterait la croissance des crevettes et des larves de
poisson (CORDOVA-MUREATA et GARCIA-CARRENO 2002)
35
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
9 Coacuterdova-Murueta JH et Garciacutea-Carreno FL 2002 Nutritive value of squid and hydrolyzed protein supplement in shrimp feed Aquaculture 210 371-84
75
10 Cuvellier GF 1999 Enzymologie et biocatalyse Dans Biotechnologie Paris Tec et Doc Lavoisier Paris 319-42 11 Dumay J 2006 Extraction de lipides en voie aqueuse par bioreacteur enzymatique combineacute agrave lrsquoultracentrifugation application agrave la valorisation de co-produits de poisson (Sardina pilchardus) Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute bioproceacutedeacutes et biotechnologies marines Lieu de soutenance Ecole Polytechnique de lrsquoUniversiteacute de Nantes 12 Dong YL Sheng G Y Fu J M et Wen K W 2005 Chemical characterization and antianaemia activity of fish protein hydrolysate from Saurida elongata J Sci Food Agric 85 2033-39 13 FAO 1998 The state of world fisheries and aquaculture Rome Italy 14 Fitzgerald AJ Rai P S Marchbank T Taylor G W Ghosh S Ritz B W et Playford R J 2005 Reparative properties of a commercial fish protein hydrolysate preparation Gut 54775-81 15 Gauthier D 2006 Introduction aux techniques utiliseacutees en biochimie le dosage des proteacuteines lten lignegt [accegraves internet] wwwchimiebiochimieumonctoncabchdgsiitubprodosage 16 Gildberg A 1993 Enzymic processing of marine raw materials Process Biochem 28 1-15 17 Gildberg A Brgwald J Johansen A et Stenberg E 1996 Isolation of acid peptide fractions from a fish protein hydrolysate with strong stimulatory effect on atlantic salmon (Salmo salar) head kidney leucocytes Comp Biochem Physiol 114 B 97-101 18 Gildberg A Arnesen J A et Carlehoumlg M 2002 Utilisation of cod backbone by biochemical fractionation Process Biochem 38 475-80
76
19 Gueacuterard F Dufosseacute L De La Broise D et Binet A 2001 Enzymatic hydrolysis of protein from yellowfin tuna (Thunnus albacares) wastes using alcalase J Mol Catalysis B Enzymatic 11 1051-9 20 Gueacuterard F Batista I Pires C Thorkelson G et Le Gal Y 2004 Repport on sources and selection criteria for raw material Rapport eacutetabli pour le programme SEAFOODplus- 57 21 Gornall Bardawill et David 1949 J Biol Chem 177 751 [Mise au point dune meacutethode quantitative pour doser les proteacuteines avec le biuret] 22 Hoyle NT et Merrit J H 1994 Quality of fish protein hydrolysates from herring (Clupea harengus) J Food Sci 59 76-9 23 Direction des Pecircches Maritimes (DPM) Centre de Recherche Oceacuteanographiques de Dakar-Thiaroye(CRODT) Rapport final Etude de lrsquoeacutevaluation et de la gestion des ressources halieutiques en Reacutepublique de Seacuteneacutegal Dakar direction des pecircches maritimes 24 Institut Franccedilais pour la Nutrition 1997 Les proteacuteines ndash Tome 2 Caracteacuteristiques des diffeacuterentes sources de proteacuteines alimentaires Paris IFN- Dossier speacutecifique Ndeg9 bis 25 Jones DA 1995 Frippak ndash the facts A response to the article by PR Muir and DC Sutton J Word Aquacult Soc 26(2)220-222 26 Jun SY Park P J Jung W K et Kim S K 2004 Purification and characterization of an antioxydative peptide from enzymatic hydrolysate of yellowfin sole (Limanda aspera) frame protein Eur Food Res Technol 219 pp 20-6 27 Kim SK et Mendis E 2006 Bioactive compounds from marine processing by-products - A review Food Res Int 39383-93 28 Kristinsson HG et Rasco B A 2000 Fish protein hydrolysates Production biochemical and functional properties Critical Reviews in Food Sci and Nutr 40 43-81
77
29 Lalasidis G Bostroumlm S et Sjoumlberg L B 1978 Low molecular weight enzymatic fish protein hydrolysates chemical composition and nutritive values J Agric Food Cehm 28 751-6 30 Liaset B Julsham K et Espe M 2003 Chemical composition and theoretical nutritional evaluation of the produced fractions from enzymic hydrolysis of salmon frames with Protamex Process Biochem 38 1747-59 32 Liaset B Lied E et Espe M 2000 Enzymatic hydrolysis of by-products from the fishfilleting industry chemical characterization and nutritional evaluation J Sci Food Agric 80 881 33 Larbier M et Leclercq B 1992 Les matiegraveres premiegraveres utiliseacutees en aviculture (225 ndash 301) in nutrition et alimentation des volailles Paris INRA 34 Lowry O H Rosebrough NJ Farr AL et Randall R J 1951 Protein measurement with Folin phenol reagent J Biol Chem 193 256 ndash 275 35 Lynch et coll (1998) Lynch JM Barbano DMet Fleming JR ndash Indirect and direct determination of the casein content of milk by Kjeldhal nitrogen analysis collaborative study J AOAC Int 36 Mackie IM 1982 General review of fish protein hydrolysates Animal Feed Sci And Technol 7 113-24 37 Martin AM et Chintalapati S P 1989 Fish offal-peat compost extracts as fermentation substrate Biological wastes 27 281-8 38 Martone et al (2005) Martone CB Peacuterez Borla O et Saacuten chez J J 2005 Fishery by-product as a nutrient source for bacteria and aracha growth media Bioresource Technol 96 383-87 39 Merritt JH 1982 Assessment of the production costs of fish protein hydrolysates Anim Feed Sci Technol 1 147-51
78
40 Ndoye F Moiumlty-maiumlzi P et Broutin c 2002 Le poisson fumeacute sur la petite cocircte Senegalaise 41Oslashrskov ER Soliman H S et Clark C F S 1982 Use of fish protein hydrolysate in milk replacers Anim Feed Sci Tech 7 135 42 Ouellet DR Seoane J R Veira D M et Proulx J G 1997 Effects of supplementation with fish meal or fish protein hydrolysate on growth nutrient digestibility and rumen fermentation of growing cattle fed grass silage Anim Feed Sci Tech 68 307-26 43 Picot L Bordenave S Didelot S Fruitier-Arnaudin I Sannier F Thorkelsson G Bergeacute J P Gueacuterard F Chabeaud A et Piot J M 2006 Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines Process Biochem 41 1217-22 44 Quaglia GB et Orban E 1987 Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysates from sardine (Sardina pilchardus) J Sci Food Agric 38 271-6 45 Rajapakse N Jung W K Mendis E Moon S H et Kim S K 2005 A novel anticoagulant purified from fish protein hydrolysate inhibits factor XIIa and platelet aggregation Life Sciences 76 2607-19 46 Ravallec-Pleacute R 2000 Valorisation dhydrolysats dorigine marine optimisation de la concentration en peptides apparenteacutes aux facteurs de croissance et aux agents seacutecreacutetagogues Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Bretagne Occidentale 47 Ravallec-Pleacute R et Van Wormhoudt A 2003 Secretagogue activities in cod (Gadus morhua) and shrimp (Penaeus aztecus) extracts and alcalase hydrolysates determined in AR4-2J pancreatic tumour cells Comp Biochem Physiol B 134 669-79 48 Rousseau M Batista I Le Gal Y et Fouchereau-Peacuteron M 2001 Purification of a functional competitive antagonist for calcitonin gene related peptide action from sardine hydrolysate EJB 4 25-32 49 Shahidi F Han X et Synowiecki J 1995 Production and characteristics of protein hydrolystaes from capelin (Mallotus villosus) Food Chem 53 285-93
79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
REMERCIEMENTS
Nous tenons agrave exprimer notre immense gratitude agrave lrsquoendroit de tout
ceux qui ont œuvreacutes de pregraves ou de loin agrave lrsquoaccomplissement de ce
travail
Professeurs Malang Seydi
Docteurs KSB Sylla Bellancille Musabemarya Alain kamga Waladjo Serge
Bakou Babacar Sene
Tout le personnel du service drsquoHIDAOA
Tout le personnel de lrsquoEISMV de Dakar
Madame DIOUF de la bibliothegraveque de lrsquoEISMV de Dakar
Tout le personnel du mini resto
A Clara Gregoire Dr Gilles Hakou Dr Ngono Patrick Samuel Zoumbou Kasseacute
Ndongo Dr Ekoga Mve Daniel Chancellin Dr wounkou Christian Tcheuffo
Ma tregraves chegravere patrie le Cameroun et le Seacuteneacutegal mon pays drsquoaccueil
Tous ceux que nous nrsquoavons pas citeacutes et qui de pregraves ou de loin ont rendu ce
travail possible
A tous veuillez recevoir lexpression de notre profonde gratitude
HOMMAGES A NOS MAITRES ET JUGES
xvii
A notre preacutesident de jury Monsieur Niama Diop SALL Professeur agrave la
Faculteacute de Meacutedecine de pharmacie et drsquoOdonto-Stomatologie de
Dakar Vous nous faites lrsquoinsigne honneur malgreacute vos multiples occupations de
preacutesider ce jury Votre abord facile et la spontaneacuteiteacute avec laquelle vous avez
reacutepondu agrave notre sollicitation nous ont beaucoup marqueacute Veuillez trouver ici
lrsquoexpression de notre profonde et sincegravere gratitude
A notre Directeur et Rapporteur de Thegravese Monsieur Malang SEYDI
Professeur agrave lrsquoEISMV de Dakar Vous avez accepteacute drsquoencadrer et de diriger
ce travail avec rigueur scientifique et pragmatisme Nous avons eacuteteacute fascineacute par
votre abord facile et votre simpliciteacute Vos qualiteacutes scientifiques et humaines
nous ont profondeacutement marqueacute Trouver ici lrsquoassurance de notre profonde
gratitude
A notre Maicirctre et Juge Monsieur Germain Jeacuterocircme SAWADOGO
Professeur agrave lrsquoEISMV de Dakar Nous sommes tregraves sensible agrave lrsquohonneur
que vous faites en acceptant de juger ce travail malgreacute vos multiples
occupations Vous nous avez apporteacute une preuve suppleacutementaire de ce que nous
pensons de vous Vos qualiteacutes intelectuelles et humaines forcent respect et
admiration Trouvez ici lrsquoassurance de notre profonde gratitude
A notre Maicirctre et Juge Monsieur Serge Niangoran BAKOU Maicirctre de confeacuterences agreacutegeacute agrave lrsquoEISMV de Dakar vous nous faites un grand
honneur de juger ce modeste travail Vos qualiteacutes scientifiques votre grand
dynamisme et votre abneacutegation devant le travail suscite chaque jour lrsquoadmiration
des eacutetudiants et le respect de vos paires Veuillez recevoir maicirctre nos sincegraveres
remerciements et profondes consideacuterations Vous ecirctes un model pour nous
xviii
xix
A mes Co-Directeurs de Thegravese monsieur Khalifa Babacar Seacuterigne SYLLA
et Madame Beacutellancille MUSABEYEMARIYA Assistants agrave lrsquoEISMV de
Dakar Ce travail est aussi le vocirctre Trouvez ainsi les assurances de notre sincegravere
reconnaissance
LISTE DES TABLEAUX
Tableau I Nomenclature de la sole tropicale
Tableau II classification systeacutematique de la sole tropicale
Tableau III Les 20 acides amineacutes
Tableau IV Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Tableau V Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Tableau VI Classification des proteacuteases
20
LISTE DES FIGURES Figure 1 carte des villages cocirctiers de pecircche de la reacutepublique du Seacuteneacutegal
(source direction des pecircche maritimes 2003) Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de lrsquohydrolyse
enzymatique
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Figure 8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
21
LISTE DES ABREVIATIONS DPM Direction des Pecircches Maritimes AA Acides Amineacutes AAI Acide Amineacutes Indispensables IFN Institut Franccedilais de Normalisation EC Enzyme Classification ATP Adeacutenosine Triphosphate pH Potentiel Hydrogegravene degC Degreacute Celsius FAO Food Agricultural Organisation EISMV Ecole Inter-Etat des Sciences et Meacutedecine Veacuteteacuterinaires HIDAOA Hygiegravene des Industries des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine
Animale IFREMER Institut Franccedilais de Recherche et drsquoExploitation de la Mer INRA Institut Nationale de Recherche Agricole
22
LISTES DES PHOTOS
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation de lrsquoenzyme Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
Photo 7 hydrolysat dans les tubes Falcon
TABLE DES MATIERES INTRODUCTION 1 PREMIERE PARTIE SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 4 CHAPITRE 1 Geacuteneacuteraliteacutes sur la pecircche au Seacuteneacutegal 5 11 Environnement naturel 5
12 Historique de la pecircche au Seacuteneacutegal 5
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees 8
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche 8
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis 9
21 Nomenclature 9
22 Classification systeacutematique 9
23 Caracteacuteristiques morphologiques 9
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae 9
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis 10
24 Reacutepartition geacuteographique 10
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson valorisation et utilisation 12
31 Deacutefinition et composition 12
32 Valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes 12
33 Les hydrolysats de poisson 15
331 Deacutefinition 15
332 Les avantages 15
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson 16
3331 En alimentation animale 16
3332 Inteacuterecircts fonctionnels 17
34 Production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee Les peptides 17
16
341 Geacuteneacuteraliteacutes sur les proteacuteines 17
3411 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des proteacuteines 19
3412 Les proteacuteines de poisson 20
34121 La fraction myogegravene soluble 21
34122 La fraction myofibrillaire 21
342 Les peptides 21
3421 Les Sources azoteacutees 21
3422 Inteacuterecircts nutritionnelles des peptides 23
3423 Activiteacutes biologiques des peptides 24
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE 25
41 Les enzymes 25
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes 25
412 Nomenclature et classification 26
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle 26
4122 Nomenclature et classification officielle 26
413 Les principales classes drsquoenzymes 28
42 Lrsquohydrolyse enzymatique 29
421 Deacutefinition et principe 29
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse 30
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique 30
42 31 Influence de la tempeacuterature 31
4232 Influence du pH 32
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices 33
Conclusion partielle 34
17
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE ndash DISCUSSION ET
RECOMMANDATION
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES 36
11 Mateacuteriel 36
111 Mateacuteriel biologique 36
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale 36
1112 Constitution des lots 37
112 Mateacuteriel enzymatique 37
113 Mateacuteriel technique 38
1131 Materiel de preacutelegravevement 38
1132 Mateacuteriel de laboratoire 38
12 Meacutethodes 39
121 Hydrolyse enzymatique 39
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses 40
1212 Hydrolyse courte dureacutee 41
122 Filtration 41
123 Centrifugation 41
124 La matiegravere segraveche 42
13 Analyses biochimiques 42
131 Deacutetermination de la teneur en eau 42
132 Dosage des proteacuteines totales 43
1321 Principe 43
1322 Mode opeacuteratoire 43
1323 Expression des reacutesultats 44
CHAPITRE 2 RESULTATS 45
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse 45
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes 45
18
19
2 3 Poids du culot et du surnageant 46
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant 47
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot 48
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS 49
31 Discussion 49
311 Discussion des reacutesultats 49
3111 La matiegravere segraveche 49
3113 Les proteacuteines 49
312 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes 50
3121 Lrsquohydrolyse enzymatique 50
3122 La matiegravere segraveche 51
3123 Le dosage des proteacuteines 51
32 Recommandations 54
CONCLUSION GENERALE 56
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 58
INTRODUCTION
Les oceacuteans constituent une richesse alimentaire tregraves diversifieacutee (poissons
algues crustaceacutes coquillages mollusques) Selon la FAO plus de 130 millions
de tonnes de poissons sont actuellement pecirccheacutes ou eacuteleveacutes chaque anneacutee dans le
monde
Les produits de la mer peuvent ecirctre consommeacutes frais congeleacutes seacutecheacutes ou encore
transformeacutes La politique environnementale actuelle incite de plus en plus les
industriels agrave prendre en comptes les deacutechets geacuteneacutereacutes par tous proceacutedeacutes de
transformation des poissons Crsquoest pourquoi apregraves lrsquoexploitation des parties
nobles des poissons des chercheurs se sont inteacuteresseacute aux co-produits Les co-
produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterables lors des
opeacuterations traditionnelles de production
Comme le montre le diagramme 1 la production de filet de la sole tropicale est
agrave lrsquoorigine de plusieurs sources de co-produits solides tecirctes viscegraveres carcasse
et peaux En effet des eacutetudes ont reacuteveacuteleacute que les co-produits de poissons sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecircts notamment les proteacuteines Un des
outils pour la reacutecupeacuteration efficace des proteacuteines des co-produits est lrsquohydrolyse
enzymatique elle est appliqueacutee pour ameacuteliorer les proprieacuteteacutes fonctionnelles et
alimentaires des proteacuteines Le but principal de lhydrolyse des co-produits de
poissons est dobtenir le reacutetablissement possible et maximum de tous les
composants valables tout en maintenant leurs qualiteacutes Ainsi le potentiel du
proceacutedeacute drsquohydrolyse enzymatique controcircleacutee sur les co-produits (tecirctes viscegraveres)
de la sole tropicale issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale en
filet de poisson va ecirctre eacutetudieacute durant ce travail
20
DEBARQUEMENT
RECEPTION LAVAGETRIAGE
PESEE
STOCKAGE EN CHAMBRE FROIDE (sous glace fondante)
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
PELAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration peaux
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
FILETAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration carcasse+ viscegraveres
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu jets dans des paniers)
TREMPAGE (eau glaceacutee et chloreacutee 2degC 1 agrave 2mn concentration 2ppm)
PARAGECONDITIONNEMENT (en films plastiques)
EMBALLAGE (caisses de polystyregravene)
PESEE
GLACcedilAGE (glace isoleacutee du produit)
SCELLAGE
ETIQUETAGE
ENTREPOSAGE REFRIGERE (0 - +4degC)
EXPEDITION
Diagramme 1 Principales eacutetapes de transformation de la sole tropicale en filet
21
Le but de ce travail est la libeacuteration et le dosage des proteacuteines des co-produits
de la sole tropicale De cet objectif geacuteneacuteral deacutecoule les objectifs speacutecifiques
suivants
Hydrolyser les co-produits (tecirctes viscegraveres) agrave lrsquoaide drsquoune proteacutease
Seacuteparer la phase soluble (surnageant) de la phase insoluble (culot) par
centrifugation
Obtenir la matiegravere segraveche de ces deux phases
Doser les proteacuteines totales agrave partir des matiegraveres segraveches obtenues
Pour reacutepondre agrave ces objectifs ce travail se deacuteclinera en deux parties ougrave des
eacuteleacutements de reacuteponses apparaicirctront Une premiegravere partie portant sur lrsquoeacutetude
bibliographique puis une deuxiegraveme partie preacutesentant les analyses effectueacutees et
les reacutesultats obtenus Faisant suite aux conclusions des perspectives seront
eacutemises pour la conduite de futurs travaux
22
PREMIERE PARTIE SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
23
CHAPITRE 1 Geacuteneacuteraliteacutes sur la pecircche au Seacuteneacutegal
11 Environnement naturel
Au large des cocirctes Seacuteneacutegalaises situeacutees agrave lrsquoextreacutemiteacute ouest du continent africain
se heurte le courant marin des canaries venu du Nord et des courants deacuteriveacutes du
courant du Golfe de Guineacutee Des upwellings(remonteacutee drsquoeau froides riches en
sels nutritifs le long de la pente du plateau continental) remontent eacutegalement de
la couche drsquoeau profonde le long de la pente du plateau continental La
tempeacuterature de lrsquoeau de mer en surface ne descend jamais en dessous de 15degC au
cours de lrsquoanneacutee Les fleuves Seacuteneacutegal Gambie et Casamance se jettent dans
lrsquooceacutean atlantique et apportent des sels mineacuteraux pendant lrsquohivernage De plus
du sable riche en sels inorganiques est apporteacute du deacutesert du Sahara par les vents
Le riche environnement naturel preacuteciteacute augmente la productiviteacute de la mer et
creacutee les pecirccheries classeacutees parmi les plus riches drsquoAfrique Des vents violents
qui soufflent au passage de lrsquohivernage agrave la saison segraveche et au passage de la
saison segraveche agrave lrsquohivernage rendent souvent la mer agiteacutee mais en geacuteneacuteral la
zone maritime est calme ce qui permet agrave la population de profiter en toute
seacutecuriteacute des bienfaits de la mer (DPM CRODT 2006)
12 Historique de la pecircche au Seacuteneacutegal
La pecircche a pendant longtemps eacuteteacute une activiteacute monopoliseacutee par certaines
ethnies
les Guet Ndariens de Saint-Louis situeacute agrave lrsquoembouchure du fleuve Seacuteneacutegal
les Lebous aux environs de Dakar
les Nyominka vivant principalement au Saloum
Ces ethnies ont utiliseacute des pecirccheries cocirctiegraveres sur une longueur drsquoenviron 2000
km allant des cocirctes de la Mauritanie au Nord agrave la cocircte de la Sierra Leone au
Sud en suivant le deacuteplacement saisonnier des bancs de poissons La pecircche
artisanale srsquoeffectuait sur des pirogues avec pagaies ou de petites embarcations agrave
24
voile Les captures eacutetaient fournies aux habitants de lrsquointeacuterieur du pays sous
formes de produits fumeacutes ou seacutecheacutes (DPM CRODT 2006)
Lrsquoancecirctre de la pirogue seacuteneacutegalaise remonterait au XVIe siegravecle Elle eacutetait
constitueacutee au deacutepart drsquoun simple tronc eacutevideacute propulseacute agrave la pagaie Vers le deacutebut
du XVIIe siegravecle on assiste agrave lrsquoapparition de la voile Les eacuteperons faisant office
de brise-lames et les bordes sont rajouteacutes au cours du siegravecle suivant Enfin le
moteur hors-bord apparaicirct vers 1950
On distingue deux saisons de production une saison de faible capture de juin
agrave octobre ougrave les volumes des produits diminuent et une saison de forte
production allant de novembre agrave juin Les captures de la pecircche artisanale sont
principalement des espegraveces peacutelagiques alors que les produits de la pecircche
industrielle sont des espegraveces benthiques
Selon la direction des pecircches maritimes (DPM 1996) du ministegravere de
lrsquoeacuteconomie maritime en 1996 lrsquoeffectif de la flottille seacuteneacutegalaise eacutetait le
suivant 11 600 pirogues dont 9 300 motoriseacutees (80) 212 chalutiers dont 60
chalutiers eacutetrangers (28) 6 sardiniers dont 2 sardiniers eacutetrangers (33) 62
thoniers eacutetrangers (97) Les principales prises sont les petits peacutelagiques
(sardinelles chinchards maquereaux) qui repreacutesentent 72 des prises Le reste
correspond agrave des espegraveces benthiques (crevettes ceacutephalopodes rougets dorades
soleshellip)
25
Figure1 Carte des villages cocirctiers de pecircche de la Reacutepublique du Seacuteneacutegal
(source Direction des pecircches maritimes 2003)
26
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees
Depuis trois deacutecennies le secteur de la pecircche a connu une forte croissance au
Seacuteneacutegal Les captures ont eacuteteacute multiplieacutees par huit en 32 ans Les deacutebarquements
des flottilles seacuteneacutegalaises et eacutetrangegraveres ont atteint en 1996 plus de 415 000
tonnes En 1997 le volume deacutebarqueacute est passeacute agrave 421 000 tonnes et en 1998 agrave
425 000 tonnes Cette eacutevolution eacutetant principalement lieacutee agrave lrsquoaugmentation des
petits peacutelagiques mis agrave terre par la pecircche artisanale
(DPM 2003)
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche
Au Seacuteneacutegal la pecircche maritime constitue un eacuteleacutement cleacute de lrsquoeacuteconomie avec une
production en valeur de 150 milliards de FCFA environ soit 2 du PIB national
et 16 du PIB du secteur primaire en 2003 Par ailleurs la population active
dans ce secteur est drsquoenviron 600 000 personnes en comptant lrsquoemploi direct et
indirect repreacutesentant environ 17 de la population active totale Les
exportations de produits halieutiques du pays eacutetaient drsquoenviron 2 milliards pour
130 000 tonnes en 2000 et mecircme ulteacuterieurement celles-ci continuaient de
constituer la plus importante source drsquoacquisition de devises du pays Ces
exportations permettent actuellement de payer pregraves de la moitieacute de la facture
peacutetroliegravere
(Ministegravere de lrsquoeacuteconomie et des finances direction de la deacutemographie et des
statistiques 2005)
Gracircce agrave leur disponibiliteacute les produits de la mer peuvent donc apparaicirctre comme
un apport nutritionnel tregraves important drsquoun point de vue alimentaire les produits
halieutiques contribuent pour 60 agrave lrsquoapport en proteacuteine animales des
populations Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de
proteacuteines couvrant 75 de leurs besoins En 1997 la consommation moyenne
annuelle de poisson au Seacuteneacutegal eacutetait de 26kg par habitant pour une
consommation mondiale de 135 kg par habitant (NDOYE ET COLL 2002)
27
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis
21 Nomenclature
Tableau I Nomenclature de la sole tropicale
Nom scientifique
Nom franccedilais En vernaculaire (en wolof)
Nom FAO Nom anglais
Cynoglossus senegalensis
Sole tropicale Tapaleacute Sole-langue Seacuteneacutegalaise
tongue sole
(SERET 1981)
22 Classification systeacutematique
Cynoglossus senegalensis est classeacute comme indiqueacute dans le tableau ci-dessous
Tableau II classification systeacutematique de la sole tropicale
Classe Osteacuteichtyens
Ordre Pleuronectiformes
Famille Cynoglossidae
Genre Cynoglossus
Espegravece senegalensis
(SERET 1981)
23 Caracteacuteristiques morphologiques
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae
Ce sont des poissons marins agrave corps plat diminuant progressivement de largeur
vers lrsquoarriegravere Les deux yeux assez petits sont situeacutes sur le cocircteacute gauche Le
museau est arrondi La bouche est petite infegravere plus au moins arqueacutee Le bord
du pregrave-opercule nrsquoest pas libre et est recouvert par la peau et des eacutecailles Il nrsquoy
a pas de rayons eacutepineux agrave la dorsale et agrave lrsquoanale La dorsale deacutebute en avant de
lrsquoœil dorsal Les rayons de la dorsale et de lrsquoanale sont confluents avec ceux de
28
la caudale qui se termine en pointe Les nageoires pectorales sont absentes ou
rudimentaires Seule la pelvienne de la face oculeacutee est preacutesente elle est situeacutee
sur la ligne meacutediane Le corps est recouvert par des eacutecailles cteacutenoiumldes ou
cycloiumldes (SERET 1981)
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis
Le corps est plat et allongeacute les nageoires dorsale et anale rejoignent la caudale
qui se termine en pointe Les yeux situeacutes sur le cocircteacute gauche du corps ont un
espace assez large entre eux Le museau est largement arrondi le crochet rostral
plutocirct court srsquoeacutetend jusqursquoau niveau de la narine anteacuterieure La bouche srsquoeacutetend
au-delagrave de lrsquoœil ventral La nageoire dorsale compte 119-125 rayons lrsquoanale 93-
99 rayons et la caudale 12 rayons On compte 124-138 eacutecailles tubuleacutees le long
de la ligne margino-dorsale Une ligne lateacuterale meacutediane est visible sur la face
aveugle
Sur la face oculeacutee le corps est plus ou moins uniformeacutement brun plus ou moins
fonceacute avec des reflets verdacirctres visibles sur le vivant la reacutegion de lrsquoopercule
est souvent noiracirctre La face aveugle est blanchacirctre
(SERET 1981)
Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
29
24 Reacutepartition geacuteographique
Cynoglossus senegalensis est une espegravece tregraves cocirctiegravere par rapport aux autres
espegraveces de la famille des cynoglossidae Elle freacutequente les zones sablo vaseuses
cocirctiegraveres entre 10 et 110 megravetres mais les prises maximales sont reacutealiseacutees entre 5
et 15 megravetres de profondeur Elle est connue de la Mauritanie agrave lrsquoAngola Les
reacutepartitions bathymeacutetriques de cette espegravece observeacutees au Seacuteneacutegal Togo-Benin
au Congo et au Cameroun sont similaires
(SERET 1981)
30
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson deacutefinition valorisation et
utilisation
31 Deacutefinition et composition
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
des opeacuterations traditionnelles de production
Les principaux co-produits de poisson rencontreacutes sont la tecircte la peau les
chutes de filetage les arecirctes centrales les viscegraveres le foie et selon les peacuteriodes
de pecircche les eacuteleacutements reproducteurs tels que les œufs ou la laitance (figure3)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
En vue drsquoune valorisation les co-produits sont traiteacutes selon le mecircme protocole
de conservation que les parties destineacutees agrave la production alimentaire
garantissant ainsi leur absence drsquoalteacuteration
32 les voies de valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes
Le produit deacuteriveacute est le produit commercial obtenu agrave partir drsquoun co-produit Un
co-produit pourra donner plusieurs produits deacuteriveacutes (figure4) Ainsi
la tecircte de poisson pourra ecirctre valoriseacutee en tant que farine de poisson huile
ou destineacutee agrave la nutrition
la chair sur les arecirctes en farine de poisson la chair hacheacutee et huile
31
la peau en farine de poisson collagegravene geacutelatine cuir
les viscegraveres en farine de poisson huile vitamines
la carcasse en farine de poisson collagegravene geacutelatine mineacuteraux
(GUERARD et Coll 2004)
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Ces produits sont qualifieacutes de produits deacuteriveacutes et non de produits finis car ils
sont geacuteneacuteralement commercialiseacutes sous forme drsquoingreacutedients crsquoest-agrave-dire sous
forme de produits intermeacutediaires pour la nutrition humaine animale pour la
dieacuteteacutetique la cosmeacutetique Neacuteanmoins certains co-produits (foies œufs) peuvent
ecirctre vendus agrave lrsquoeacutetat brut aux consommateurs Mais cette tendance est faible et ils
sont (foies œufs) plus utiliseacutes par les industries de conserverie et de saurisserie
(ANDRIEUX 2004)
On peut distinguer quatre (4) categories de produits deacuteriveacutes en fonction de leur
destination
lrsquoutilisation en nutrition humaine ou en alimentation animale
lrsquoutilisation en dieacuteteacutetique ou nutraceutique
32
lrsquoutilisation en cosmeacutetique
utilisation plus restreinte et speacutecifique drsquoun seul type de produit deacuteriveacute
Il existe plusieurs applications possibles des co-produits (figure5) parmi
lesquelles on peut citer
les farines et huiles de poisson
Cette valorisation est actuellement la plus importante car tous les co-produits
peuvent ecirctre utiliseacutes sans distinction Aucun tri nrsquoest neacutecessaire seule la
distinction co- produits issus de poissons sauvages ou drsquoeacutelevage doit ecirctre faite
les hachis
Les co-produits sont broyeacutes et filtreacutes puis le hachi obtenu est congeleacute en bloc
Les co-produits viscegraveres sont exclus de cette valorisation Les hachis sont
destineacutes agrave la fabrication drsquoaliments pour animaux domestiques essentiellement
les chats Ils sont souvent commercialiseacutes sous forme congeleacutee et sont une
bonne source de proteacuteines
les hydrolysats (cf 33)
la production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee (protides lipides)
La production de farine et drsquohuile de poisson repreacutesente toujours en tonnage la
voie de valorisation la plus importante des co-produits de la pecircche (figure 5)
Mais la faible valeur ajouteacutee obtenue avec ces produits incite les industriels agrave
rechercher des deacuteboucheacutes plus rentables productions de sauces de poisson
drsquoaromes de proteacuteines musculaires (surimi) sont autant de valorisation
alternative vers lrsquoindustrie agro-alimentaire (CHING 1999)
33
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
33 Les hydrolysats de poisson
331 Deacutefinition
Les hydrolysats sont des fractions agrave teneur proteacuteique eacuteleveacutee (73 agrave 85) obtenus
par autolyse (uniquement sous lrsquoaction drsquoenzymes endogegravenes) ou heacuteteacuterolyses
(ajout drsquoenzymes exogegravenes) Cependant la proportion en eacuteleacutements mineacuteraux est
assez faible car les arecirctes osseuses non hydrolysables ont eacuteteacute retireacutees Les
hydrolysats ont donc lrsquoavantage drsquoecirctre digeste et drsquoavoir une haute qualiteacute
nutritive
332 Les avantages
Les hydrolysats preacutesentent les mecircmes avantages que les matiegraveres premiegraveres
drsquoorigine animale pour lrsquoaquaculture sans en avoir les nombreux inconveacutenients
(LARBIER et LECLERCQ 1992 ANDERSON et coll 1993) En effet ce
sont des proteacuteines hydrolyseacutees les acides amineacutes essentiels libeacutereacutes sont donc
plus facilement disponibles et assimilables pour les animaux De plus ils
constituent un produit tregraves appeacutetant et parfaitement accepteacute gracircce agrave lrsquoarocircme de
34
poisson et preacutesente une granulomeacutetrie fine facilitant la fabrication drsquoaliments
suivant des proceacutedeacutes tels que la microparticulation (JONES 1995) Enfin les
hydrolysats comportent en geacuteneacuteral peu de mineacuteraux et ne risquent donc pas de
polluer les eaux des eacutelevages aquacoles leur bonne qualiteacute microbiologique
eacutetant assureacutee par la steacuterilisation au cours de la fabrication
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson
3331 En alimentation animale
Les hydrolysats de poisson sont utiliseacutes comme substitut du lait pour les bovins
et les ovins En comparaison avec la caseacuteine les animaux nourris avec les
hydrolysats de poisson gras apregraves un deacutebut de croissance plus lent arrivent au
mecircme poids au bout de quelques semaines (OslashRSKOV et Coll 1982
RITCHIE et MACKIE 1982) De plus une eacutetude eacuteconomique a montreacute les
inteacuterecircts des peptides de poisson en tant que substituts du lait (MERRITT
1982) Pour le beacutetail adulte lrsquoensilage obtenu agrave partir drsquoherbe peut ecirctre
eacutegalement remplaceacute par des hydrolysats de poisson (OUELLET et Coll 1997)
Mais crsquoest dans le domaine de lrsquoaquaculture que ces hydrolysats sont les plus
valoriseacutes En effet en aquaculture la charge reacutecurrente la plus importante est la
source proteacuteique apporteacutee aux animaux Les proteacuteines de poisson hydrolyseacutees
en plus de leur faible coucirct sont drsquoune grande digestibiliteacute De plus de
nombreuses eacutetudes ont montreacute que certains hydrolysats de poisson possegravedent des
proprieacuteteacutes nutraceutiques Ainsi le remplacement des farines de poisson par des
hydrolysats de poisson augmenterait la croissance des crevettes et des larves de
poisson (CORDOVA-MUREATA et GARCIA-CARRENO 2002)
35
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
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SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
A notre preacutesident de jury Monsieur Niama Diop SALL Professeur agrave la
Faculteacute de Meacutedecine de pharmacie et drsquoOdonto-Stomatologie de
Dakar Vous nous faites lrsquoinsigne honneur malgreacute vos multiples occupations de
preacutesider ce jury Votre abord facile et la spontaneacuteiteacute avec laquelle vous avez
reacutepondu agrave notre sollicitation nous ont beaucoup marqueacute Veuillez trouver ici
lrsquoexpression de notre profonde et sincegravere gratitude
A notre Directeur et Rapporteur de Thegravese Monsieur Malang SEYDI
Professeur agrave lrsquoEISMV de Dakar Vous avez accepteacute drsquoencadrer et de diriger
ce travail avec rigueur scientifique et pragmatisme Nous avons eacuteteacute fascineacute par
votre abord facile et votre simpliciteacute Vos qualiteacutes scientifiques et humaines
nous ont profondeacutement marqueacute Trouver ici lrsquoassurance de notre profonde
gratitude
A notre Maicirctre et Juge Monsieur Germain Jeacuterocircme SAWADOGO
Professeur agrave lrsquoEISMV de Dakar Nous sommes tregraves sensible agrave lrsquohonneur
que vous faites en acceptant de juger ce travail malgreacute vos multiples
occupations Vous nous avez apporteacute une preuve suppleacutementaire de ce que nous
pensons de vous Vos qualiteacutes intelectuelles et humaines forcent respect et
admiration Trouvez ici lrsquoassurance de notre profonde gratitude
A notre Maicirctre et Juge Monsieur Serge Niangoran BAKOU Maicirctre de confeacuterences agreacutegeacute agrave lrsquoEISMV de Dakar vous nous faites un grand
honneur de juger ce modeste travail Vos qualiteacutes scientifiques votre grand
dynamisme et votre abneacutegation devant le travail suscite chaque jour lrsquoadmiration
des eacutetudiants et le respect de vos paires Veuillez recevoir maicirctre nos sincegraveres
remerciements et profondes consideacuterations Vous ecirctes un model pour nous
xviii
xix
A mes Co-Directeurs de Thegravese monsieur Khalifa Babacar Seacuterigne SYLLA
et Madame Beacutellancille MUSABEYEMARIYA Assistants agrave lrsquoEISMV de
Dakar Ce travail est aussi le vocirctre Trouvez ainsi les assurances de notre sincegravere
reconnaissance
LISTE DES TABLEAUX
Tableau I Nomenclature de la sole tropicale
Tableau II classification systeacutematique de la sole tropicale
Tableau III Les 20 acides amineacutes
Tableau IV Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Tableau V Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Tableau VI Classification des proteacuteases
20
LISTE DES FIGURES Figure 1 carte des villages cocirctiers de pecircche de la reacutepublique du Seacuteneacutegal
(source direction des pecircche maritimes 2003) Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de lrsquohydrolyse
enzymatique
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Figure 8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
21
LISTE DES ABREVIATIONS DPM Direction des Pecircches Maritimes AA Acides Amineacutes AAI Acide Amineacutes Indispensables IFN Institut Franccedilais de Normalisation EC Enzyme Classification ATP Adeacutenosine Triphosphate pH Potentiel Hydrogegravene degC Degreacute Celsius FAO Food Agricultural Organisation EISMV Ecole Inter-Etat des Sciences et Meacutedecine Veacuteteacuterinaires HIDAOA Hygiegravene des Industries des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine
Animale IFREMER Institut Franccedilais de Recherche et drsquoExploitation de la Mer INRA Institut Nationale de Recherche Agricole
22
LISTES DES PHOTOS
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation de lrsquoenzyme Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
Photo 7 hydrolysat dans les tubes Falcon
TABLE DES MATIERES INTRODUCTION 1 PREMIERE PARTIE SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 4 CHAPITRE 1 Geacuteneacuteraliteacutes sur la pecircche au Seacuteneacutegal 5 11 Environnement naturel 5
12 Historique de la pecircche au Seacuteneacutegal 5
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees 8
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche 8
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis 9
21 Nomenclature 9
22 Classification systeacutematique 9
23 Caracteacuteristiques morphologiques 9
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae 9
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis 10
24 Reacutepartition geacuteographique 10
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson valorisation et utilisation 12
31 Deacutefinition et composition 12
32 Valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes 12
33 Les hydrolysats de poisson 15
331 Deacutefinition 15
332 Les avantages 15
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson 16
3331 En alimentation animale 16
3332 Inteacuterecircts fonctionnels 17
34 Production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee Les peptides 17
16
341 Geacuteneacuteraliteacutes sur les proteacuteines 17
3411 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des proteacuteines 19
3412 Les proteacuteines de poisson 20
34121 La fraction myogegravene soluble 21
34122 La fraction myofibrillaire 21
342 Les peptides 21
3421 Les Sources azoteacutees 21
3422 Inteacuterecircts nutritionnelles des peptides 23
3423 Activiteacutes biologiques des peptides 24
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE 25
41 Les enzymes 25
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes 25
412 Nomenclature et classification 26
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle 26
4122 Nomenclature et classification officielle 26
413 Les principales classes drsquoenzymes 28
42 Lrsquohydrolyse enzymatique 29
421 Deacutefinition et principe 29
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse 30
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique 30
42 31 Influence de la tempeacuterature 31
4232 Influence du pH 32
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices 33
Conclusion partielle 34
17
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE ndash DISCUSSION ET
RECOMMANDATION
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES 36
11 Mateacuteriel 36
111 Mateacuteriel biologique 36
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale 36
1112 Constitution des lots 37
112 Mateacuteriel enzymatique 37
113 Mateacuteriel technique 38
1131 Materiel de preacutelegravevement 38
1132 Mateacuteriel de laboratoire 38
12 Meacutethodes 39
121 Hydrolyse enzymatique 39
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses 40
1212 Hydrolyse courte dureacutee 41
122 Filtration 41
123 Centrifugation 41
124 La matiegravere segraveche 42
13 Analyses biochimiques 42
131 Deacutetermination de la teneur en eau 42
132 Dosage des proteacuteines totales 43
1321 Principe 43
1322 Mode opeacuteratoire 43
1323 Expression des reacutesultats 44
CHAPITRE 2 RESULTATS 45
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse 45
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes 45
18
19
2 3 Poids du culot et du surnageant 46
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant 47
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot 48
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS 49
31 Discussion 49
311 Discussion des reacutesultats 49
3111 La matiegravere segraveche 49
3113 Les proteacuteines 49
312 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes 50
3121 Lrsquohydrolyse enzymatique 50
3122 La matiegravere segraveche 51
3123 Le dosage des proteacuteines 51
32 Recommandations 54
CONCLUSION GENERALE 56
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 58
INTRODUCTION
Les oceacuteans constituent une richesse alimentaire tregraves diversifieacutee (poissons
algues crustaceacutes coquillages mollusques) Selon la FAO plus de 130 millions
de tonnes de poissons sont actuellement pecirccheacutes ou eacuteleveacutes chaque anneacutee dans le
monde
Les produits de la mer peuvent ecirctre consommeacutes frais congeleacutes seacutecheacutes ou encore
transformeacutes La politique environnementale actuelle incite de plus en plus les
industriels agrave prendre en comptes les deacutechets geacuteneacutereacutes par tous proceacutedeacutes de
transformation des poissons Crsquoest pourquoi apregraves lrsquoexploitation des parties
nobles des poissons des chercheurs se sont inteacuteresseacute aux co-produits Les co-
produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterables lors des
opeacuterations traditionnelles de production
Comme le montre le diagramme 1 la production de filet de la sole tropicale est
agrave lrsquoorigine de plusieurs sources de co-produits solides tecirctes viscegraveres carcasse
et peaux En effet des eacutetudes ont reacuteveacuteleacute que les co-produits de poissons sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecircts notamment les proteacuteines Un des
outils pour la reacutecupeacuteration efficace des proteacuteines des co-produits est lrsquohydrolyse
enzymatique elle est appliqueacutee pour ameacuteliorer les proprieacuteteacutes fonctionnelles et
alimentaires des proteacuteines Le but principal de lhydrolyse des co-produits de
poissons est dobtenir le reacutetablissement possible et maximum de tous les
composants valables tout en maintenant leurs qualiteacutes Ainsi le potentiel du
proceacutedeacute drsquohydrolyse enzymatique controcircleacutee sur les co-produits (tecirctes viscegraveres)
de la sole tropicale issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale en
filet de poisson va ecirctre eacutetudieacute durant ce travail
20
DEBARQUEMENT
RECEPTION LAVAGETRIAGE
PESEE
STOCKAGE EN CHAMBRE FROIDE (sous glace fondante)
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
PELAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration peaux
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
FILETAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration carcasse+ viscegraveres
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu jets dans des paniers)
TREMPAGE (eau glaceacutee et chloreacutee 2degC 1 agrave 2mn concentration 2ppm)
PARAGECONDITIONNEMENT (en films plastiques)
EMBALLAGE (caisses de polystyregravene)
PESEE
GLACcedilAGE (glace isoleacutee du produit)
SCELLAGE
ETIQUETAGE
ENTREPOSAGE REFRIGERE (0 - +4degC)
EXPEDITION
Diagramme 1 Principales eacutetapes de transformation de la sole tropicale en filet
21
Le but de ce travail est la libeacuteration et le dosage des proteacuteines des co-produits
de la sole tropicale De cet objectif geacuteneacuteral deacutecoule les objectifs speacutecifiques
suivants
Hydrolyser les co-produits (tecirctes viscegraveres) agrave lrsquoaide drsquoune proteacutease
Seacuteparer la phase soluble (surnageant) de la phase insoluble (culot) par
centrifugation
Obtenir la matiegravere segraveche de ces deux phases
Doser les proteacuteines totales agrave partir des matiegraveres segraveches obtenues
Pour reacutepondre agrave ces objectifs ce travail se deacuteclinera en deux parties ougrave des
eacuteleacutements de reacuteponses apparaicirctront Une premiegravere partie portant sur lrsquoeacutetude
bibliographique puis une deuxiegraveme partie preacutesentant les analyses effectueacutees et
les reacutesultats obtenus Faisant suite aux conclusions des perspectives seront
eacutemises pour la conduite de futurs travaux
22
PREMIERE PARTIE SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
23
CHAPITRE 1 Geacuteneacuteraliteacutes sur la pecircche au Seacuteneacutegal
11 Environnement naturel
Au large des cocirctes Seacuteneacutegalaises situeacutees agrave lrsquoextreacutemiteacute ouest du continent africain
se heurte le courant marin des canaries venu du Nord et des courants deacuteriveacutes du
courant du Golfe de Guineacutee Des upwellings(remonteacutee drsquoeau froides riches en
sels nutritifs le long de la pente du plateau continental) remontent eacutegalement de
la couche drsquoeau profonde le long de la pente du plateau continental La
tempeacuterature de lrsquoeau de mer en surface ne descend jamais en dessous de 15degC au
cours de lrsquoanneacutee Les fleuves Seacuteneacutegal Gambie et Casamance se jettent dans
lrsquooceacutean atlantique et apportent des sels mineacuteraux pendant lrsquohivernage De plus
du sable riche en sels inorganiques est apporteacute du deacutesert du Sahara par les vents
Le riche environnement naturel preacuteciteacute augmente la productiviteacute de la mer et
creacutee les pecirccheries classeacutees parmi les plus riches drsquoAfrique Des vents violents
qui soufflent au passage de lrsquohivernage agrave la saison segraveche et au passage de la
saison segraveche agrave lrsquohivernage rendent souvent la mer agiteacutee mais en geacuteneacuteral la
zone maritime est calme ce qui permet agrave la population de profiter en toute
seacutecuriteacute des bienfaits de la mer (DPM CRODT 2006)
12 Historique de la pecircche au Seacuteneacutegal
La pecircche a pendant longtemps eacuteteacute une activiteacute monopoliseacutee par certaines
ethnies
les Guet Ndariens de Saint-Louis situeacute agrave lrsquoembouchure du fleuve Seacuteneacutegal
les Lebous aux environs de Dakar
les Nyominka vivant principalement au Saloum
Ces ethnies ont utiliseacute des pecirccheries cocirctiegraveres sur une longueur drsquoenviron 2000
km allant des cocirctes de la Mauritanie au Nord agrave la cocircte de la Sierra Leone au
Sud en suivant le deacuteplacement saisonnier des bancs de poissons La pecircche
artisanale srsquoeffectuait sur des pirogues avec pagaies ou de petites embarcations agrave
24
voile Les captures eacutetaient fournies aux habitants de lrsquointeacuterieur du pays sous
formes de produits fumeacutes ou seacutecheacutes (DPM CRODT 2006)
Lrsquoancecirctre de la pirogue seacuteneacutegalaise remonterait au XVIe siegravecle Elle eacutetait
constitueacutee au deacutepart drsquoun simple tronc eacutevideacute propulseacute agrave la pagaie Vers le deacutebut
du XVIIe siegravecle on assiste agrave lrsquoapparition de la voile Les eacuteperons faisant office
de brise-lames et les bordes sont rajouteacutes au cours du siegravecle suivant Enfin le
moteur hors-bord apparaicirct vers 1950
On distingue deux saisons de production une saison de faible capture de juin
agrave octobre ougrave les volumes des produits diminuent et une saison de forte
production allant de novembre agrave juin Les captures de la pecircche artisanale sont
principalement des espegraveces peacutelagiques alors que les produits de la pecircche
industrielle sont des espegraveces benthiques
Selon la direction des pecircches maritimes (DPM 1996) du ministegravere de
lrsquoeacuteconomie maritime en 1996 lrsquoeffectif de la flottille seacuteneacutegalaise eacutetait le
suivant 11 600 pirogues dont 9 300 motoriseacutees (80) 212 chalutiers dont 60
chalutiers eacutetrangers (28) 6 sardiniers dont 2 sardiniers eacutetrangers (33) 62
thoniers eacutetrangers (97) Les principales prises sont les petits peacutelagiques
(sardinelles chinchards maquereaux) qui repreacutesentent 72 des prises Le reste
correspond agrave des espegraveces benthiques (crevettes ceacutephalopodes rougets dorades
soleshellip)
25
Figure1 Carte des villages cocirctiers de pecircche de la Reacutepublique du Seacuteneacutegal
(source Direction des pecircches maritimes 2003)
26
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees
Depuis trois deacutecennies le secteur de la pecircche a connu une forte croissance au
Seacuteneacutegal Les captures ont eacuteteacute multiplieacutees par huit en 32 ans Les deacutebarquements
des flottilles seacuteneacutegalaises et eacutetrangegraveres ont atteint en 1996 plus de 415 000
tonnes En 1997 le volume deacutebarqueacute est passeacute agrave 421 000 tonnes et en 1998 agrave
425 000 tonnes Cette eacutevolution eacutetant principalement lieacutee agrave lrsquoaugmentation des
petits peacutelagiques mis agrave terre par la pecircche artisanale
(DPM 2003)
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche
Au Seacuteneacutegal la pecircche maritime constitue un eacuteleacutement cleacute de lrsquoeacuteconomie avec une
production en valeur de 150 milliards de FCFA environ soit 2 du PIB national
et 16 du PIB du secteur primaire en 2003 Par ailleurs la population active
dans ce secteur est drsquoenviron 600 000 personnes en comptant lrsquoemploi direct et
indirect repreacutesentant environ 17 de la population active totale Les
exportations de produits halieutiques du pays eacutetaient drsquoenviron 2 milliards pour
130 000 tonnes en 2000 et mecircme ulteacuterieurement celles-ci continuaient de
constituer la plus importante source drsquoacquisition de devises du pays Ces
exportations permettent actuellement de payer pregraves de la moitieacute de la facture
peacutetroliegravere
(Ministegravere de lrsquoeacuteconomie et des finances direction de la deacutemographie et des
statistiques 2005)
Gracircce agrave leur disponibiliteacute les produits de la mer peuvent donc apparaicirctre comme
un apport nutritionnel tregraves important drsquoun point de vue alimentaire les produits
halieutiques contribuent pour 60 agrave lrsquoapport en proteacuteine animales des
populations Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de
proteacuteines couvrant 75 de leurs besoins En 1997 la consommation moyenne
annuelle de poisson au Seacuteneacutegal eacutetait de 26kg par habitant pour une
consommation mondiale de 135 kg par habitant (NDOYE ET COLL 2002)
27
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis
21 Nomenclature
Tableau I Nomenclature de la sole tropicale
Nom scientifique
Nom franccedilais En vernaculaire (en wolof)
Nom FAO Nom anglais
Cynoglossus senegalensis
Sole tropicale Tapaleacute Sole-langue Seacuteneacutegalaise
tongue sole
(SERET 1981)
22 Classification systeacutematique
Cynoglossus senegalensis est classeacute comme indiqueacute dans le tableau ci-dessous
Tableau II classification systeacutematique de la sole tropicale
Classe Osteacuteichtyens
Ordre Pleuronectiformes
Famille Cynoglossidae
Genre Cynoglossus
Espegravece senegalensis
(SERET 1981)
23 Caracteacuteristiques morphologiques
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae
Ce sont des poissons marins agrave corps plat diminuant progressivement de largeur
vers lrsquoarriegravere Les deux yeux assez petits sont situeacutes sur le cocircteacute gauche Le
museau est arrondi La bouche est petite infegravere plus au moins arqueacutee Le bord
du pregrave-opercule nrsquoest pas libre et est recouvert par la peau et des eacutecailles Il nrsquoy
a pas de rayons eacutepineux agrave la dorsale et agrave lrsquoanale La dorsale deacutebute en avant de
lrsquoœil dorsal Les rayons de la dorsale et de lrsquoanale sont confluents avec ceux de
28
la caudale qui se termine en pointe Les nageoires pectorales sont absentes ou
rudimentaires Seule la pelvienne de la face oculeacutee est preacutesente elle est situeacutee
sur la ligne meacutediane Le corps est recouvert par des eacutecailles cteacutenoiumldes ou
cycloiumldes (SERET 1981)
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis
Le corps est plat et allongeacute les nageoires dorsale et anale rejoignent la caudale
qui se termine en pointe Les yeux situeacutes sur le cocircteacute gauche du corps ont un
espace assez large entre eux Le museau est largement arrondi le crochet rostral
plutocirct court srsquoeacutetend jusqursquoau niveau de la narine anteacuterieure La bouche srsquoeacutetend
au-delagrave de lrsquoœil ventral La nageoire dorsale compte 119-125 rayons lrsquoanale 93-
99 rayons et la caudale 12 rayons On compte 124-138 eacutecailles tubuleacutees le long
de la ligne margino-dorsale Une ligne lateacuterale meacutediane est visible sur la face
aveugle
Sur la face oculeacutee le corps est plus ou moins uniformeacutement brun plus ou moins
fonceacute avec des reflets verdacirctres visibles sur le vivant la reacutegion de lrsquoopercule
est souvent noiracirctre La face aveugle est blanchacirctre
(SERET 1981)
Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
29
24 Reacutepartition geacuteographique
Cynoglossus senegalensis est une espegravece tregraves cocirctiegravere par rapport aux autres
espegraveces de la famille des cynoglossidae Elle freacutequente les zones sablo vaseuses
cocirctiegraveres entre 10 et 110 megravetres mais les prises maximales sont reacutealiseacutees entre 5
et 15 megravetres de profondeur Elle est connue de la Mauritanie agrave lrsquoAngola Les
reacutepartitions bathymeacutetriques de cette espegravece observeacutees au Seacuteneacutegal Togo-Benin
au Congo et au Cameroun sont similaires
(SERET 1981)
30
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson deacutefinition valorisation et
utilisation
31 Deacutefinition et composition
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
des opeacuterations traditionnelles de production
Les principaux co-produits de poisson rencontreacutes sont la tecircte la peau les
chutes de filetage les arecirctes centrales les viscegraveres le foie et selon les peacuteriodes
de pecircche les eacuteleacutements reproducteurs tels que les œufs ou la laitance (figure3)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
En vue drsquoune valorisation les co-produits sont traiteacutes selon le mecircme protocole
de conservation que les parties destineacutees agrave la production alimentaire
garantissant ainsi leur absence drsquoalteacuteration
32 les voies de valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes
Le produit deacuteriveacute est le produit commercial obtenu agrave partir drsquoun co-produit Un
co-produit pourra donner plusieurs produits deacuteriveacutes (figure4) Ainsi
la tecircte de poisson pourra ecirctre valoriseacutee en tant que farine de poisson huile
ou destineacutee agrave la nutrition
la chair sur les arecirctes en farine de poisson la chair hacheacutee et huile
31
la peau en farine de poisson collagegravene geacutelatine cuir
les viscegraveres en farine de poisson huile vitamines
la carcasse en farine de poisson collagegravene geacutelatine mineacuteraux
(GUERARD et Coll 2004)
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Ces produits sont qualifieacutes de produits deacuteriveacutes et non de produits finis car ils
sont geacuteneacuteralement commercialiseacutes sous forme drsquoingreacutedients crsquoest-agrave-dire sous
forme de produits intermeacutediaires pour la nutrition humaine animale pour la
dieacuteteacutetique la cosmeacutetique Neacuteanmoins certains co-produits (foies œufs) peuvent
ecirctre vendus agrave lrsquoeacutetat brut aux consommateurs Mais cette tendance est faible et ils
sont (foies œufs) plus utiliseacutes par les industries de conserverie et de saurisserie
(ANDRIEUX 2004)
On peut distinguer quatre (4) categories de produits deacuteriveacutes en fonction de leur
destination
lrsquoutilisation en nutrition humaine ou en alimentation animale
lrsquoutilisation en dieacuteteacutetique ou nutraceutique
32
lrsquoutilisation en cosmeacutetique
utilisation plus restreinte et speacutecifique drsquoun seul type de produit deacuteriveacute
Il existe plusieurs applications possibles des co-produits (figure5) parmi
lesquelles on peut citer
les farines et huiles de poisson
Cette valorisation est actuellement la plus importante car tous les co-produits
peuvent ecirctre utiliseacutes sans distinction Aucun tri nrsquoest neacutecessaire seule la
distinction co- produits issus de poissons sauvages ou drsquoeacutelevage doit ecirctre faite
les hachis
Les co-produits sont broyeacutes et filtreacutes puis le hachi obtenu est congeleacute en bloc
Les co-produits viscegraveres sont exclus de cette valorisation Les hachis sont
destineacutes agrave la fabrication drsquoaliments pour animaux domestiques essentiellement
les chats Ils sont souvent commercialiseacutes sous forme congeleacutee et sont une
bonne source de proteacuteines
les hydrolysats (cf 33)
la production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee (protides lipides)
La production de farine et drsquohuile de poisson repreacutesente toujours en tonnage la
voie de valorisation la plus importante des co-produits de la pecircche (figure 5)
Mais la faible valeur ajouteacutee obtenue avec ces produits incite les industriels agrave
rechercher des deacuteboucheacutes plus rentables productions de sauces de poisson
drsquoaromes de proteacuteines musculaires (surimi) sont autant de valorisation
alternative vers lrsquoindustrie agro-alimentaire (CHING 1999)
33
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
33 Les hydrolysats de poisson
331 Deacutefinition
Les hydrolysats sont des fractions agrave teneur proteacuteique eacuteleveacutee (73 agrave 85) obtenus
par autolyse (uniquement sous lrsquoaction drsquoenzymes endogegravenes) ou heacuteteacuterolyses
(ajout drsquoenzymes exogegravenes) Cependant la proportion en eacuteleacutements mineacuteraux est
assez faible car les arecirctes osseuses non hydrolysables ont eacuteteacute retireacutees Les
hydrolysats ont donc lrsquoavantage drsquoecirctre digeste et drsquoavoir une haute qualiteacute
nutritive
332 Les avantages
Les hydrolysats preacutesentent les mecircmes avantages que les matiegraveres premiegraveres
drsquoorigine animale pour lrsquoaquaculture sans en avoir les nombreux inconveacutenients
(LARBIER et LECLERCQ 1992 ANDERSON et coll 1993) En effet ce
sont des proteacuteines hydrolyseacutees les acides amineacutes essentiels libeacutereacutes sont donc
plus facilement disponibles et assimilables pour les animaux De plus ils
constituent un produit tregraves appeacutetant et parfaitement accepteacute gracircce agrave lrsquoarocircme de
34
poisson et preacutesente une granulomeacutetrie fine facilitant la fabrication drsquoaliments
suivant des proceacutedeacutes tels que la microparticulation (JONES 1995) Enfin les
hydrolysats comportent en geacuteneacuteral peu de mineacuteraux et ne risquent donc pas de
polluer les eaux des eacutelevages aquacoles leur bonne qualiteacute microbiologique
eacutetant assureacutee par la steacuterilisation au cours de la fabrication
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson
3331 En alimentation animale
Les hydrolysats de poisson sont utiliseacutes comme substitut du lait pour les bovins
et les ovins En comparaison avec la caseacuteine les animaux nourris avec les
hydrolysats de poisson gras apregraves un deacutebut de croissance plus lent arrivent au
mecircme poids au bout de quelques semaines (OslashRSKOV et Coll 1982
RITCHIE et MACKIE 1982) De plus une eacutetude eacuteconomique a montreacute les
inteacuterecircts des peptides de poisson en tant que substituts du lait (MERRITT
1982) Pour le beacutetail adulte lrsquoensilage obtenu agrave partir drsquoherbe peut ecirctre
eacutegalement remplaceacute par des hydrolysats de poisson (OUELLET et Coll 1997)
Mais crsquoest dans le domaine de lrsquoaquaculture que ces hydrolysats sont les plus
valoriseacutes En effet en aquaculture la charge reacutecurrente la plus importante est la
source proteacuteique apporteacutee aux animaux Les proteacuteines de poisson hydrolyseacutees
en plus de leur faible coucirct sont drsquoune grande digestibiliteacute De plus de
nombreuses eacutetudes ont montreacute que certains hydrolysats de poisson possegravedent des
proprieacuteteacutes nutraceutiques Ainsi le remplacement des farines de poisson par des
hydrolysats de poisson augmenterait la croissance des crevettes et des larves de
poisson (CORDOVA-MUREATA et GARCIA-CARRENO 2002)
35
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
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CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
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1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
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113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
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Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
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Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
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la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
9 Coacuterdova-Murueta JH et Garciacutea-Carreno FL 2002 Nutritive value of squid and hydrolyzed protein supplement in shrimp feed Aquaculture 210 371-84
75
10 Cuvellier GF 1999 Enzymologie et biocatalyse Dans Biotechnologie Paris Tec et Doc Lavoisier Paris 319-42 11 Dumay J 2006 Extraction de lipides en voie aqueuse par bioreacteur enzymatique combineacute agrave lrsquoultracentrifugation application agrave la valorisation de co-produits de poisson (Sardina pilchardus) Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute bioproceacutedeacutes et biotechnologies marines Lieu de soutenance Ecole Polytechnique de lrsquoUniversiteacute de Nantes 12 Dong YL Sheng G Y Fu J M et Wen K W 2005 Chemical characterization and antianaemia activity of fish protein hydrolysate from Saurida elongata J Sci Food Agric 85 2033-39 13 FAO 1998 The state of world fisheries and aquaculture Rome Italy 14 Fitzgerald AJ Rai P S Marchbank T Taylor G W Ghosh S Ritz B W et Playford R J 2005 Reparative properties of a commercial fish protein hydrolysate preparation Gut 54775-81 15 Gauthier D 2006 Introduction aux techniques utiliseacutees en biochimie le dosage des proteacuteines lten lignegt [accegraves internet] wwwchimiebiochimieumonctoncabchdgsiitubprodosage 16 Gildberg A 1993 Enzymic processing of marine raw materials Process Biochem 28 1-15 17 Gildberg A Brgwald J Johansen A et Stenberg E 1996 Isolation of acid peptide fractions from a fish protein hydrolysate with strong stimulatory effect on atlantic salmon (Salmo salar) head kidney leucocytes Comp Biochem Physiol 114 B 97-101 18 Gildberg A Arnesen J A et Carlehoumlg M 2002 Utilisation of cod backbone by biochemical fractionation Process Biochem 38 475-80
76
19 Gueacuterard F Dufosseacute L De La Broise D et Binet A 2001 Enzymatic hydrolysis of protein from yellowfin tuna (Thunnus albacares) wastes using alcalase J Mol Catalysis B Enzymatic 11 1051-9 20 Gueacuterard F Batista I Pires C Thorkelson G et Le Gal Y 2004 Repport on sources and selection criteria for raw material Rapport eacutetabli pour le programme SEAFOODplus- 57 21 Gornall Bardawill et David 1949 J Biol Chem 177 751 [Mise au point dune meacutethode quantitative pour doser les proteacuteines avec le biuret] 22 Hoyle NT et Merrit J H 1994 Quality of fish protein hydrolysates from herring (Clupea harengus) J Food Sci 59 76-9 23 Direction des Pecircches Maritimes (DPM) Centre de Recherche Oceacuteanographiques de Dakar-Thiaroye(CRODT) Rapport final Etude de lrsquoeacutevaluation et de la gestion des ressources halieutiques en Reacutepublique de Seacuteneacutegal Dakar direction des pecircches maritimes 24 Institut Franccedilais pour la Nutrition 1997 Les proteacuteines ndash Tome 2 Caracteacuteristiques des diffeacuterentes sources de proteacuteines alimentaires Paris IFN- Dossier speacutecifique Ndeg9 bis 25 Jones DA 1995 Frippak ndash the facts A response to the article by PR Muir and DC Sutton J Word Aquacult Soc 26(2)220-222 26 Jun SY Park P J Jung W K et Kim S K 2004 Purification and characterization of an antioxydative peptide from enzymatic hydrolysate of yellowfin sole (Limanda aspera) frame protein Eur Food Res Technol 219 pp 20-6 27 Kim SK et Mendis E 2006 Bioactive compounds from marine processing by-products - A review Food Res Int 39383-93 28 Kristinsson HG et Rasco B A 2000 Fish protein hydrolysates Production biochemical and functional properties Critical Reviews in Food Sci and Nutr 40 43-81
77
29 Lalasidis G Bostroumlm S et Sjoumlberg L B 1978 Low molecular weight enzymatic fish protein hydrolysates chemical composition and nutritive values J Agric Food Cehm 28 751-6 30 Liaset B Julsham K et Espe M 2003 Chemical composition and theoretical nutritional evaluation of the produced fractions from enzymic hydrolysis of salmon frames with Protamex Process Biochem 38 1747-59 32 Liaset B Lied E et Espe M 2000 Enzymatic hydrolysis of by-products from the fishfilleting industry chemical characterization and nutritional evaluation J Sci Food Agric 80 881 33 Larbier M et Leclercq B 1992 Les matiegraveres premiegraveres utiliseacutees en aviculture (225 ndash 301) in nutrition et alimentation des volailles Paris INRA 34 Lowry O H Rosebrough NJ Farr AL et Randall R J 1951 Protein measurement with Folin phenol reagent J Biol Chem 193 256 ndash 275 35 Lynch et coll (1998) Lynch JM Barbano DMet Fleming JR ndash Indirect and direct determination of the casein content of milk by Kjeldhal nitrogen analysis collaborative study J AOAC Int 36 Mackie IM 1982 General review of fish protein hydrolysates Animal Feed Sci And Technol 7 113-24 37 Martin AM et Chintalapati S P 1989 Fish offal-peat compost extracts as fermentation substrate Biological wastes 27 281-8 38 Martone et al (2005) Martone CB Peacuterez Borla O et Saacuten chez J J 2005 Fishery by-product as a nutrient source for bacteria and aracha growth media Bioresource Technol 96 383-87 39 Merritt JH 1982 Assessment of the production costs of fish protein hydrolysates Anim Feed Sci Technol 1 147-51
78
40 Ndoye F Moiumlty-maiumlzi P et Broutin c 2002 Le poisson fumeacute sur la petite cocircte Senegalaise 41Oslashrskov ER Soliman H S et Clark C F S 1982 Use of fish protein hydrolysate in milk replacers Anim Feed Sci Tech 7 135 42 Ouellet DR Seoane J R Veira D M et Proulx J G 1997 Effects of supplementation with fish meal or fish protein hydrolysate on growth nutrient digestibility and rumen fermentation of growing cattle fed grass silage Anim Feed Sci Tech 68 307-26 43 Picot L Bordenave S Didelot S Fruitier-Arnaudin I Sannier F Thorkelsson G Bergeacute J P Gueacuterard F Chabeaud A et Piot J M 2006 Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines Process Biochem 41 1217-22 44 Quaglia GB et Orban E 1987 Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysates from sardine (Sardina pilchardus) J Sci Food Agric 38 271-6 45 Rajapakse N Jung W K Mendis E Moon S H et Kim S K 2005 A novel anticoagulant purified from fish protein hydrolysate inhibits factor XIIa and platelet aggregation Life Sciences 76 2607-19 46 Ravallec-Pleacute R 2000 Valorisation dhydrolysats dorigine marine optimisation de la concentration en peptides apparenteacutes aux facteurs de croissance et aux agents seacutecreacutetagogues Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Bretagne Occidentale 47 Ravallec-Pleacute R et Van Wormhoudt A 2003 Secretagogue activities in cod (Gadus morhua) and shrimp (Penaeus aztecus) extracts and alcalase hydrolysates determined in AR4-2J pancreatic tumour cells Comp Biochem Physiol B 134 669-79 48 Rousseau M Batista I Le Gal Y et Fouchereau-Peacuteron M 2001 Purification of a functional competitive antagonist for calcitonin gene related peptide action from sardine hydrolysate EJB 4 25-32 49 Shahidi F Han X et Synowiecki J 1995 Production and characteristics of protein hydrolystaes from capelin (Mallotus villosus) Food Chem 53 285-93
79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
xix
A mes Co-Directeurs de Thegravese monsieur Khalifa Babacar Seacuterigne SYLLA
et Madame Beacutellancille MUSABEYEMARIYA Assistants agrave lrsquoEISMV de
Dakar Ce travail est aussi le vocirctre Trouvez ainsi les assurances de notre sincegravere
reconnaissance
LISTE DES TABLEAUX
Tableau I Nomenclature de la sole tropicale
Tableau II classification systeacutematique de la sole tropicale
Tableau III Les 20 acides amineacutes
Tableau IV Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Tableau V Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Tableau VI Classification des proteacuteases
20
LISTE DES FIGURES Figure 1 carte des villages cocirctiers de pecircche de la reacutepublique du Seacuteneacutegal
(source direction des pecircche maritimes 2003) Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de lrsquohydrolyse
enzymatique
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Figure 8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
21
LISTE DES ABREVIATIONS DPM Direction des Pecircches Maritimes AA Acides Amineacutes AAI Acide Amineacutes Indispensables IFN Institut Franccedilais de Normalisation EC Enzyme Classification ATP Adeacutenosine Triphosphate pH Potentiel Hydrogegravene degC Degreacute Celsius FAO Food Agricultural Organisation EISMV Ecole Inter-Etat des Sciences et Meacutedecine Veacuteteacuterinaires HIDAOA Hygiegravene des Industries des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine
Animale IFREMER Institut Franccedilais de Recherche et drsquoExploitation de la Mer INRA Institut Nationale de Recherche Agricole
22
LISTES DES PHOTOS
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation de lrsquoenzyme Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
Photo 7 hydrolysat dans les tubes Falcon
TABLE DES MATIERES INTRODUCTION 1 PREMIERE PARTIE SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 4 CHAPITRE 1 Geacuteneacuteraliteacutes sur la pecircche au Seacuteneacutegal 5 11 Environnement naturel 5
12 Historique de la pecircche au Seacuteneacutegal 5
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees 8
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche 8
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis 9
21 Nomenclature 9
22 Classification systeacutematique 9
23 Caracteacuteristiques morphologiques 9
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae 9
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis 10
24 Reacutepartition geacuteographique 10
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson valorisation et utilisation 12
31 Deacutefinition et composition 12
32 Valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes 12
33 Les hydrolysats de poisson 15
331 Deacutefinition 15
332 Les avantages 15
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson 16
3331 En alimentation animale 16
3332 Inteacuterecircts fonctionnels 17
34 Production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee Les peptides 17
16
341 Geacuteneacuteraliteacutes sur les proteacuteines 17
3411 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des proteacuteines 19
3412 Les proteacuteines de poisson 20
34121 La fraction myogegravene soluble 21
34122 La fraction myofibrillaire 21
342 Les peptides 21
3421 Les Sources azoteacutees 21
3422 Inteacuterecircts nutritionnelles des peptides 23
3423 Activiteacutes biologiques des peptides 24
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE 25
41 Les enzymes 25
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes 25
412 Nomenclature et classification 26
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle 26
4122 Nomenclature et classification officielle 26
413 Les principales classes drsquoenzymes 28
42 Lrsquohydrolyse enzymatique 29
421 Deacutefinition et principe 29
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse 30
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique 30
42 31 Influence de la tempeacuterature 31
4232 Influence du pH 32
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices 33
Conclusion partielle 34
17
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE ndash DISCUSSION ET
RECOMMANDATION
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES 36
11 Mateacuteriel 36
111 Mateacuteriel biologique 36
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale 36
1112 Constitution des lots 37
112 Mateacuteriel enzymatique 37
113 Mateacuteriel technique 38
1131 Materiel de preacutelegravevement 38
1132 Mateacuteriel de laboratoire 38
12 Meacutethodes 39
121 Hydrolyse enzymatique 39
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses 40
1212 Hydrolyse courte dureacutee 41
122 Filtration 41
123 Centrifugation 41
124 La matiegravere segraveche 42
13 Analyses biochimiques 42
131 Deacutetermination de la teneur en eau 42
132 Dosage des proteacuteines totales 43
1321 Principe 43
1322 Mode opeacuteratoire 43
1323 Expression des reacutesultats 44
CHAPITRE 2 RESULTATS 45
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse 45
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes 45
18
19
2 3 Poids du culot et du surnageant 46
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant 47
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot 48
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS 49
31 Discussion 49
311 Discussion des reacutesultats 49
3111 La matiegravere segraveche 49
3113 Les proteacuteines 49
312 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes 50
3121 Lrsquohydrolyse enzymatique 50
3122 La matiegravere segraveche 51
3123 Le dosage des proteacuteines 51
32 Recommandations 54
CONCLUSION GENERALE 56
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 58
INTRODUCTION
Les oceacuteans constituent une richesse alimentaire tregraves diversifieacutee (poissons
algues crustaceacutes coquillages mollusques) Selon la FAO plus de 130 millions
de tonnes de poissons sont actuellement pecirccheacutes ou eacuteleveacutes chaque anneacutee dans le
monde
Les produits de la mer peuvent ecirctre consommeacutes frais congeleacutes seacutecheacutes ou encore
transformeacutes La politique environnementale actuelle incite de plus en plus les
industriels agrave prendre en comptes les deacutechets geacuteneacutereacutes par tous proceacutedeacutes de
transformation des poissons Crsquoest pourquoi apregraves lrsquoexploitation des parties
nobles des poissons des chercheurs se sont inteacuteresseacute aux co-produits Les co-
produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterables lors des
opeacuterations traditionnelles de production
Comme le montre le diagramme 1 la production de filet de la sole tropicale est
agrave lrsquoorigine de plusieurs sources de co-produits solides tecirctes viscegraveres carcasse
et peaux En effet des eacutetudes ont reacuteveacuteleacute que les co-produits de poissons sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecircts notamment les proteacuteines Un des
outils pour la reacutecupeacuteration efficace des proteacuteines des co-produits est lrsquohydrolyse
enzymatique elle est appliqueacutee pour ameacuteliorer les proprieacuteteacutes fonctionnelles et
alimentaires des proteacuteines Le but principal de lhydrolyse des co-produits de
poissons est dobtenir le reacutetablissement possible et maximum de tous les
composants valables tout en maintenant leurs qualiteacutes Ainsi le potentiel du
proceacutedeacute drsquohydrolyse enzymatique controcircleacutee sur les co-produits (tecirctes viscegraveres)
de la sole tropicale issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale en
filet de poisson va ecirctre eacutetudieacute durant ce travail
20
DEBARQUEMENT
RECEPTION LAVAGETRIAGE
PESEE
STOCKAGE EN CHAMBRE FROIDE (sous glace fondante)
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
PELAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration peaux
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
FILETAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration carcasse+ viscegraveres
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu jets dans des paniers)
TREMPAGE (eau glaceacutee et chloreacutee 2degC 1 agrave 2mn concentration 2ppm)
PARAGECONDITIONNEMENT (en films plastiques)
EMBALLAGE (caisses de polystyregravene)
PESEE
GLACcedilAGE (glace isoleacutee du produit)
SCELLAGE
ETIQUETAGE
ENTREPOSAGE REFRIGERE (0 - +4degC)
EXPEDITION
Diagramme 1 Principales eacutetapes de transformation de la sole tropicale en filet
21
Le but de ce travail est la libeacuteration et le dosage des proteacuteines des co-produits
de la sole tropicale De cet objectif geacuteneacuteral deacutecoule les objectifs speacutecifiques
suivants
Hydrolyser les co-produits (tecirctes viscegraveres) agrave lrsquoaide drsquoune proteacutease
Seacuteparer la phase soluble (surnageant) de la phase insoluble (culot) par
centrifugation
Obtenir la matiegravere segraveche de ces deux phases
Doser les proteacuteines totales agrave partir des matiegraveres segraveches obtenues
Pour reacutepondre agrave ces objectifs ce travail se deacuteclinera en deux parties ougrave des
eacuteleacutements de reacuteponses apparaicirctront Une premiegravere partie portant sur lrsquoeacutetude
bibliographique puis une deuxiegraveme partie preacutesentant les analyses effectueacutees et
les reacutesultats obtenus Faisant suite aux conclusions des perspectives seront
eacutemises pour la conduite de futurs travaux
22
PREMIERE PARTIE SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
23
CHAPITRE 1 Geacuteneacuteraliteacutes sur la pecircche au Seacuteneacutegal
11 Environnement naturel
Au large des cocirctes Seacuteneacutegalaises situeacutees agrave lrsquoextreacutemiteacute ouest du continent africain
se heurte le courant marin des canaries venu du Nord et des courants deacuteriveacutes du
courant du Golfe de Guineacutee Des upwellings(remonteacutee drsquoeau froides riches en
sels nutritifs le long de la pente du plateau continental) remontent eacutegalement de
la couche drsquoeau profonde le long de la pente du plateau continental La
tempeacuterature de lrsquoeau de mer en surface ne descend jamais en dessous de 15degC au
cours de lrsquoanneacutee Les fleuves Seacuteneacutegal Gambie et Casamance se jettent dans
lrsquooceacutean atlantique et apportent des sels mineacuteraux pendant lrsquohivernage De plus
du sable riche en sels inorganiques est apporteacute du deacutesert du Sahara par les vents
Le riche environnement naturel preacuteciteacute augmente la productiviteacute de la mer et
creacutee les pecirccheries classeacutees parmi les plus riches drsquoAfrique Des vents violents
qui soufflent au passage de lrsquohivernage agrave la saison segraveche et au passage de la
saison segraveche agrave lrsquohivernage rendent souvent la mer agiteacutee mais en geacuteneacuteral la
zone maritime est calme ce qui permet agrave la population de profiter en toute
seacutecuriteacute des bienfaits de la mer (DPM CRODT 2006)
12 Historique de la pecircche au Seacuteneacutegal
La pecircche a pendant longtemps eacuteteacute une activiteacute monopoliseacutee par certaines
ethnies
les Guet Ndariens de Saint-Louis situeacute agrave lrsquoembouchure du fleuve Seacuteneacutegal
les Lebous aux environs de Dakar
les Nyominka vivant principalement au Saloum
Ces ethnies ont utiliseacute des pecirccheries cocirctiegraveres sur une longueur drsquoenviron 2000
km allant des cocirctes de la Mauritanie au Nord agrave la cocircte de la Sierra Leone au
Sud en suivant le deacuteplacement saisonnier des bancs de poissons La pecircche
artisanale srsquoeffectuait sur des pirogues avec pagaies ou de petites embarcations agrave
24
voile Les captures eacutetaient fournies aux habitants de lrsquointeacuterieur du pays sous
formes de produits fumeacutes ou seacutecheacutes (DPM CRODT 2006)
Lrsquoancecirctre de la pirogue seacuteneacutegalaise remonterait au XVIe siegravecle Elle eacutetait
constitueacutee au deacutepart drsquoun simple tronc eacutevideacute propulseacute agrave la pagaie Vers le deacutebut
du XVIIe siegravecle on assiste agrave lrsquoapparition de la voile Les eacuteperons faisant office
de brise-lames et les bordes sont rajouteacutes au cours du siegravecle suivant Enfin le
moteur hors-bord apparaicirct vers 1950
On distingue deux saisons de production une saison de faible capture de juin
agrave octobre ougrave les volumes des produits diminuent et une saison de forte
production allant de novembre agrave juin Les captures de la pecircche artisanale sont
principalement des espegraveces peacutelagiques alors que les produits de la pecircche
industrielle sont des espegraveces benthiques
Selon la direction des pecircches maritimes (DPM 1996) du ministegravere de
lrsquoeacuteconomie maritime en 1996 lrsquoeffectif de la flottille seacuteneacutegalaise eacutetait le
suivant 11 600 pirogues dont 9 300 motoriseacutees (80) 212 chalutiers dont 60
chalutiers eacutetrangers (28) 6 sardiniers dont 2 sardiniers eacutetrangers (33) 62
thoniers eacutetrangers (97) Les principales prises sont les petits peacutelagiques
(sardinelles chinchards maquereaux) qui repreacutesentent 72 des prises Le reste
correspond agrave des espegraveces benthiques (crevettes ceacutephalopodes rougets dorades
soleshellip)
25
Figure1 Carte des villages cocirctiers de pecircche de la Reacutepublique du Seacuteneacutegal
(source Direction des pecircches maritimes 2003)
26
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees
Depuis trois deacutecennies le secteur de la pecircche a connu une forte croissance au
Seacuteneacutegal Les captures ont eacuteteacute multiplieacutees par huit en 32 ans Les deacutebarquements
des flottilles seacuteneacutegalaises et eacutetrangegraveres ont atteint en 1996 plus de 415 000
tonnes En 1997 le volume deacutebarqueacute est passeacute agrave 421 000 tonnes et en 1998 agrave
425 000 tonnes Cette eacutevolution eacutetant principalement lieacutee agrave lrsquoaugmentation des
petits peacutelagiques mis agrave terre par la pecircche artisanale
(DPM 2003)
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche
Au Seacuteneacutegal la pecircche maritime constitue un eacuteleacutement cleacute de lrsquoeacuteconomie avec une
production en valeur de 150 milliards de FCFA environ soit 2 du PIB national
et 16 du PIB du secteur primaire en 2003 Par ailleurs la population active
dans ce secteur est drsquoenviron 600 000 personnes en comptant lrsquoemploi direct et
indirect repreacutesentant environ 17 de la population active totale Les
exportations de produits halieutiques du pays eacutetaient drsquoenviron 2 milliards pour
130 000 tonnes en 2000 et mecircme ulteacuterieurement celles-ci continuaient de
constituer la plus importante source drsquoacquisition de devises du pays Ces
exportations permettent actuellement de payer pregraves de la moitieacute de la facture
peacutetroliegravere
(Ministegravere de lrsquoeacuteconomie et des finances direction de la deacutemographie et des
statistiques 2005)
Gracircce agrave leur disponibiliteacute les produits de la mer peuvent donc apparaicirctre comme
un apport nutritionnel tregraves important drsquoun point de vue alimentaire les produits
halieutiques contribuent pour 60 agrave lrsquoapport en proteacuteine animales des
populations Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de
proteacuteines couvrant 75 de leurs besoins En 1997 la consommation moyenne
annuelle de poisson au Seacuteneacutegal eacutetait de 26kg par habitant pour une
consommation mondiale de 135 kg par habitant (NDOYE ET COLL 2002)
27
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis
21 Nomenclature
Tableau I Nomenclature de la sole tropicale
Nom scientifique
Nom franccedilais En vernaculaire (en wolof)
Nom FAO Nom anglais
Cynoglossus senegalensis
Sole tropicale Tapaleacute Sole-langue Seacuteneacutegalaise
tongue sole
(SERET 1981)
22 Classification systeacutematique
Cynoglossus senegalensis est classeacute comme indiqueacute dans le tableau ci-dessous
Tableau II classification systeacutematique de la sole tropicale
Classe Osteacuteichtyens
Ordre Pleuronectiformes
Famille Cynoglossidae
Genre Cynoglossus
Espegravece senegalensis
(SERET 1981)
23 Caracteacuteristiques morphologiques
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae
Ce sont des poissons marins agrave corps plat diminuant progressivement de largeur
vers lrsquoarriegravere Les deux yeux assez petits sont situeacutes sur le cocircteacute gauche Le
museau est arrondi La bouche est petite infegravere plus au moins arqueacutee Le bord
du pregrave-opercule nrsquoest pas libre et est recouvert par la peau et des eacutecailles Il nrsquoy
a pas de rayons eacutepineux agrave la dorsale et agrave lrsquoanale La dorsale deacutebute en avant de
lrsquoœil dorsal Les rayons de la dorsale et de lrsquoanale sont confluents avec ceux de
28
la caudale qui se termine en pointe Les nageoires pectorales sont absentes ou
rudimentaires Seule la pelvienne de la face oculeacutee est preacutesente elle est situeacutee
sur la ligne meacutediane Le corps est recouvert par des eacutecailles cteacutenoiumldes ou
cycloiumldes (SERET 1981)
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis
Le corps est plat et allongeacute les nageoires dorsale et anale rejoignent la caudale
qui se termine en pointe Les yeux situeacutes sur le cocircteacute gauche du corps ont un
espace assez large entre eux Le museau est largement arrondi le crochet rostral
plutocirct court srsquoeacutetend jusqursquoau niveau de la narine anteacuterieure La bouche srsquoeacutetend
au-delagrave de lrsquoœil ventral La nageoire dorsale compte 119-125 rayons lrsquoanale 93-
99 rayons et la caudale 12 rayons On compte 124-138 eacutecailles tubuleacutees le long
de la ligne margino-dorsale Une ligne lateacuterale meacutediane est visible sur la face
aveugle
Sur la face oculeacutee le corps est plus ou moins uniformeacutement brun plus ou moins
fonceacute avec des reflets verdacirctres visibles sur le vivant la reacutegion de lrsquoopercule
est souvent noiracirctre La face aveugle est blanchacirctre
(SERET 1981)
Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
29
24 Reacutepartition geacuteographique
Cynoglossus senegalensis est une espegravece tregraves cocirctiegravere par rapport aux autres
espegraveces de la famille des cynoglossidae Elle freacutequente les zones sablo vaseuses
cocirctiegraveres entre 10 et 110 megravetres mais les prises maximales sont reacutealiseacutees entre 5
et 15 megravetres de profondeur Elle est connue de la Mauritanie agrave lrsquoAngola Les
reacutepartitions bathymeacutetriques de cette espegravece observeacutees au Seacuteneacutegal Togo-Benin
au Congo et au Cameroun sont similaires
(SERET 1981)
30
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson deacutefinition valorisation et
utilisation
31 Deacutefinition et composition
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
des opeacuterations traditionnelles de production
Les principaux co-produits de poisson rencontreacutes sont la tecircte la peau les
chutes de filetage les arecirctes centrales les viscegraveres le foie et selon les peacuteriodes
de pecircche les eacuteleacutements reproducteurs tels que les œufs ou la laitance (figure3)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
En vue drsquoune valorisation les co-produits sont traiteacutes selon le mecircme protocole
de conservation que les parties destineacutees agrave la production alimentaire
garantissant ainsi leur absence drsquoalteacuteration
32 les voies de valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes
Le produit deacuteriveacute est le produit commercial obtenu agrave partir drsquoun co-produit Un
co-produit pourra donner plusieurs produits deacuteriveacutes (figure4) Ainsi
la tecircte de poisson pourra ecirctre valoriseacutee en tant que farine de poisson huile
ou destineacutee agrave la nutrition
la chair sur les arecirctes en farine de poisson la chair hacheacutee et huile
31
la peau en farine de poisson collagegravene geacutelatine cuir
les viscegraveres en farine de poisson huile vitamines
la carcasse en farine de poisson collagegravene geacutelatine mineacuteraux
(GUERARD et Coll 2004)
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Ces produits sont qualifieacutes de produits deacuteriveacutes et non de produits finis car ils
sont geacuteneacuteralement commercialiseacutes sous forme drsquoingreacutedients crsquoest-agrave-dire sous
forme de produits intermeacutediaires pour la nutrition humaine animale pour la
dieacuteteacutetique la cosmeacutetique Neacuteanmoins certains co-produits (foies œufs) peuvent
ecirctre vendus agrave lrsquoeacutetat brut aux consommateurs Mais cette tendance est faible et ils
sont (foies œufs) plus utiliseacutes par les industries de conserverie et de saurisserie
(ANDRIEUX 2004)
On peut distinguer quatre (4) categories de produits deacuteriveacutes en fonction de leur
destination
lrsquoutilisation en nutrition humaine ou en alimentation animale
lrsquoutilisation en dieacuteteacutetique ou nutraceutique
32
lrsquoutilisation en cosmeacutetique
utilisation plus restreinte et speacutecifique drsquoun seul type de produit deacuteriveacute
Il existe plusieurs applications possibles des co-produits (figure5) parmi
lesquelles on peut citer
les farines et huiles de poisson
Cette valorisation est actuellement la plus importante car tous les co-produits
peuvent ecirctre utiliseacutes sans distinction Aucun tri nrsquoest neacutecessaire seule la
distinction co- produits issus de poissons sauvages ou drsquoeacutelevage doit ecirctre faite
les hachis
Les co-produits sont broyeacutes et filtreacutes puis le hachi obtenu est congeleacute en bloc
Les co-produits viscegraveres sont exclus de cette valorisation Les hachis sont
destineacutes agrave la fabrication drsquoaliments pour animaux domestiques essentiellement
les chats Ils sont souvent commercialiseacutes sous forme congeleacutee et sont une
bonne source de proteacuteines
les hydrolysats (cf 33)
la production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee (protides lipides)
La production de farine et drsquohuile de poisson repreacutesente toujours en tonnage la
voie de valorisation la plus importante des co-produits de la pecircche (figure 5)
Mais la faible valeur ajouteacutee obtenue avec ces produits incite les industriels agrave
rechercher des deacuteboucheacutes plus rentables productions de sauces de poisson
drsquoaromes de proteacuteines musculaires (surimi) sont autant de valorisation
alternative vers lrsquoindustrie agro-alimentaire (CHING 1999)
33
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
33 Les hydrolysats de poisson
331 Deacutefinition
Les hydrolysats sont des fractions agrave teneur proteacuteique eacuteleveacutee (73 agrave 85) obtenus
par autolyse (uniquement sous lrsquoaction drsquoenzymes endogegravenes) ou heacuteteacuterolyses
(ajout drsquoenzymes exogegravenes) Cependant la proportion en eacuteleacutements mineacuteraux est
assez faible car les arecirctes osseuses non hydrolysables ont eacuteteacute retireacutees Les
hydrolysats ont donc lrsquoavantage drsquoecirctre digeste et drsquoavoir une haute qualiteacute
nutritive
332 Les avantages
Les hydrolysats preacutesentent les mecircmes avantages que les matiegraveres premiegraveres
drsquoorigine animale pour lrsquoaquaculture sans en avoir les nombreux inconveacutenients
(LARBIER et LECLERCQ 1992 ANDERSON et coll 1993) En effet ce
sont des proteacuteines hydrolyseacutees les acides amineacutes essentiels libeacutereacutes sont donc
plus facilement disponibles et assimilables pour les animaux De plus ils
constituent un produit tregraves appeacutetant et parfaitement accepteacute gracircce agrave lrsquoarocircme de
34
poisson et preacutesente une granulomeacutetrie fine facilitant la fabrication drsquoaliments
suivant des proceacutedeacutes tels que la microparticulation (JONES 1995) Enfin les
hydrolysats comportent en geacuteneacuteral peu de mineacuteraux et ne risquent donc pas de
polluer les eaux des eacutelevages aquacoles leur bonne qualiteacute microbiologique
eacutetant assureacutee par la steacuterilisation au cours de la fabrication
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson
3331 En alimentation animale
Les hydrolysats de poisson sont utiliseacutes comme substitut du lait pour les bovins
et les ovins En comparaison avec la caseacuteine les animaux nourris avec les
hydrolysats de poisson gras apregraves un deacutebut de croissance plus lent arrivent au
mecircme poids au bout de quelques semaines (OslashRSKOV et Coll 1982
RITCHIE et MACKIE 1982) De plus une eacutetude eacuteconomique a montreacute les
inteacuterecircts des peptides de poisson en tant que substituts du lait (MERRITT
1982) Pour le beacutetail adulte lrsquoensilage obtenu agrave partir drsquoherbe peut ecirctre
eacutegalement remplaceacute par des hydrolysats de poisson (OUELLET et Coll 1997)
Mais crsquoest dans le domaine de lrsquoaquaculture que ces hydrolysats sont les plus
valoriseacutes En effet en aquaculture la charge reacutecurrente la plus importante est la
source proteacuteique apporteacutee aux animaux Les proteacuteines de poisson hydrolyseacutees
en plus de leur faible coucirct sont drsquoune grande digestibiliteacute De plus de
nombreuses eacutetudes ont montreacute que certains hydrolysats de poisson possegravedent des
proprieacuteteacutes nutraceutiques Ainsi le remplacement des farines de poisson par des
hydrolysats de poisson augmenterait la croissance des crevettes et des larves de
poisson (CORDOVA-MUREATA et GARCIA-CARRENO 2002)
35
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
9 Coacuterdova-Murueta JH et Garciacutea-Carreno FL 2002 Nutritive value of squid and hydrolyzed protein supplement in shrimp feed Aquaculture 210 371-84
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10 Cuvellier GF 1999 Enzymologie et biocatalyse Dans Biotechnologie Paris Tec et Doc Lavoisier Paris 319-42 11 Dumay J 2006 Extraction de lipides en voie aqueuse par bioreacteur enzymatique combineacute agrave lrsquoultracentrifugation application agrave la valorisation de co-produits de poisson (Sardina pilchardus) Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute bioproceacutedeacutes et biotechnologies marines Lieu de soutenance Ecole Polytechnique de lrsquoUniversiteacute de Nantes 12 Dong YL Sheng G Y Fu J M et Wen K W 2005 Chemical characterization and antianaemia activity of fish protein hydrolysate from Saurida elongata J Sci Food Agric 85 2033-39 13 FAO 1998 The state of world fisheries and aquaculture Rome Italy 14 Fitzgerald AJ Rai P S Marchbank T Taylor G W Ghosh S Ritz B W et Playford R J 2005 Reparative properties of a commercial fish protein hydrolysate preparation Gut 54775-81 15 Gauthier D 2006 Introduction aux techniques utiliseacutees en biochimie le dosage des proteacuteines lten lignegt [accegraves internet] wwwchimiebiochimieumonctoncabchdgsiitubprodosage 16 Gildberg A 1993 Enzymic processing of marine raw materials Process Biochem 28 1-15 17 Gildberg A Brgwald J Johansen A et Stenberg E 1996 Isolation of acid peptide fractions from a fish protein hydrolysate with strong stimulatory effect on atlantic salmon (Salmo salar) head kidney leucocytes Comp Biochem Physiol 114 B 97-101 18 Gildberg A Arnesen J A et Carlehoumlg M 2002 Utilisation of cod backbone by biochemical fractionation Process Biochem 38 475-80
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79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
LISTE DES TABLEAUX
Tableau I Nomenclature de la sole tropicale
Tableau II classification systeacutematique de la sole tropicale
Tableau III Les 20 acides amineacutes
Tableau IV Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Tableau V Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Tableau VI Classification des proteacuteases
20
LISTE DES FIGURES Figure 1 carte des villages cocirctiers de pecircche de la reacutepublique du Seacuteneacutegal
(source direction des pecircche maritimes 2003) Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de lrsquohydrolyse
enzymatique
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Figure 8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
21
LISTE DES ABREVIATIONS DPM Direction des Pecircches Maritimes AA Acides Amineacutes AAI Acide Amineacutes Indispensables IFN Institut Franccedilais de Normalisation EC Enzyme Classification ATP Adeacutenosine Triphosphate pH Potentiel Hydrogegravene degC Degreacute Celsius FAO Food Agricultural Organisation EISMV Ecole Inter-Etat des Sciences et Meacutedecine Veacuteteacuterinaires HIDAOA Hygiegravene des Industries des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine
Animale IFREMER Institut Franccedilais de Recherche et drsquoExploitation de la Mer INRA Institut Nationale de Recherche Agricole
22
LISTES DES PHOTOS
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation de lrsquoenzyme Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
Photo 7 hydrolysat dans les tubes Falcon
TABLE DES MATIERES INTRODUCTION 1 PREMIERE PARTIE SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 4 CHAPITRE 1 Geacuteneacuteraliteacutes sur la pecircche au Seacuteneacutegal 5 11 Environnement naturel 5
12 Historique de la pecircche au Seacuteneacutegal 5
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees 8
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche 8
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis 9
21 Nomenclature 9
22 Classification systeacutematique 9
23 Caracteacuteristiques morphologiques 9
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae 9
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis 10
24 Reacutepartition geacuteographique 10
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson valorisation et utilisation 12
31 Deacutefinition et composition 12
32 Valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes 12
33 Les hydrolysats de poisson 15
331 Deacutefinition 15
332 Les avantages 15
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson 16
3331 En alimentation animale 16
3332 Inteacuterecircts fonctionnels 17
34 Production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee Les peptides 17
16
341 Geacuteneacuteraliteacutes sur les proteacuteines 17
3411 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des proteacuteines 19
3412 Les proteacuteines de poisson 20
34121 La fraction myogegravene soluble 21
34122 La fraction myofibrillaire 21
342 Les peptides 21
3421 Les Sources azoteacutees 21
3422 Inteacuterecircts nutritionnelles des peptides 23
3423 Activiteacutes biologiques des peptides 24
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE 25
41 Les enzymes 25
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes 25
412 Nomenclature et classification 26
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle 26
4122 Nomenclature et classification officielle 26
413 Les principales classes drsquoenzymes 28
42 Lrsquohydrolyse enzymatique 29
421 Deacutefinition et principe 29
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse 30
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique 30
42 31 Influence de la tempeacuterature 31
4232 Influence du pH 32
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices 33
Conclusion partielle 34
17
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE ndash DISCUSSION ET
RECOMMANDATION
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES 36
11 Mateacuteriel 36
111 Mateacuteriel biologique 36
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale 36
1112 Constitution des lots 37
112 Mateacuteriel enzymatique 37
113 Mateacuteriel technique 38
1131 Materiel de preacutelegravevement 38
1132 Mateacuteriel de laboratoire 38
12 Meacutethodes 39
121 Hydrolyse enzymatique 39
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses 40
1212 Hydrolyse courte dureacutee 41
122 Filtration 41
123 Centrifugation 41
124 La matiegravere segraveche 42
13 Analyses biochimiques 42
131 Deacutetermination de la teneur en eau 42
132 Dosage des proteacuteines totales 43
1321 Principe 43
1322 Mode opeacuteratoire 43
1323 Expression des reacutesultats 44
CHAPITRE 2 RESULTATS 45
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse 45
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes 45
18
19
2 3 Poids du culot et du surnageant 46
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant 47
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot 48
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS 49
31 Discussion 49
311 Discussion des reacutesultats 49
3111 La matiegravere segraveche 49
3113 Les proteacuteines 49
312 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes 50
3121 Lrsquohydrolyse enzymatique 50
3122 La matiegravere segraveche 51
3123 Le dosage des proteacuteines 51
32 Recommandations 54
CONCLUSION GENERALE 56
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 58
INTRODUCTION
Les oceacuteans constituent une richesse alimentaire tregraves diversifieacutee (poissons
algues crustaceacutes coquillages mollusques) Selon la FAO plus de 130 millions
de tonnes de poissons sont actuellement pecirccheacutes ou eacuteleveacutes chaque anneacutee dans le
monde
Les produits de la mer peuvent ecirctre consommeacutes frais congeleacutes seacutecheacutes ou encore
transformeacutes La politique environnementale actuelle incite de plus en plus les
industriels agrave prendre en comptes les deacutechets geacuteneacutereacutes par tous proceacutedeacutes de
transformation des poissons Crsquoest pourquoi apregraves lrsquoexploitation des parties
nobles des poissons des chercheurs se sont inteacuteresseacute aux co-produits Les co-
produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterables lors des
opeacuterations traditionnelles de production
Comme le montre le diagramme 1 la production de filet de la sole tropicale est
agrave lrsquoorigine de plusieurs sources de co-produits solides tecirctes viscegraveres carcasse
et peaux En effet des eacutetudes ont reacuteveacuteleacute que les co-produits de poissons sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecircts notamment les proteacuteines Un des
outils pour la reacutecupeacuteration efficace des proteacuteines des co-produits est lrsquohydrolyse
enzymatique elle est appliqueacutee pour ameacuteliorer les proprieacuteteacutes fonctionnelles et
alimentaires des proteacuteines Le but principal de lhydrolyse des co-produits de
poissons est dobtenir le reacutetablissement possible et maximum de tous les
composants valables tout en maintenant leurs qualiteacutes Ainsi le potentiel du
proceacutedeacute drsquohydrolyse enzymatique controcircleacutee sur les co-produits (tecirctes viscegraveres)
de la sole tropicale issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale en
filet de poisson va ecirctre eacutetudieacute durant ce travail
20
DEBARQUEMENT
RECEPTION LAVAGETRIAGE
PESEE
STOCKAGE EN CHAMBRE FROIDE (sous glace fondante)
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
PELAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration peaux
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
FILETAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration carcasse+ viscegraveres
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu jets dans des paniers)
TREMPAGE (eau glaceacutee et chloreacutee 2degC 1 agrave 2mn concentration 2ppm)
PARAGECONDITIONNEMENT (en films plastiques)
EMBALLAGE (caisses de polystyregravene)
PESEE
GLACcedilAGE (glace isoleacutee du produit)
SCELLAGE
ETIQUETAGE
ENTREPOSAGE REFRIGERE (0 - +4degC)
EXPEDITION
Diagramme 1 Principales eacutetapes de transformation de la sole tropicale en filet
21
Le but de ce travail est la libeacuteration et le dosage des proteacuteines des co-produits
de la sole tropicale De cet objectif geacuteneacuteral deacutecoule les objectifs speacutecifiques
suivants
Hydrolyser les co-produits (tecirctes viscegraveres) agrave lrsquoaide drsquoune proteacutease
Seacuteparer la phase soluble (surnageant) de la phase insoluble (culot) par
centrifugation
Obtenir la matiegravere segraveche de ces deux phases
Doser les proteacuteines totales agrave partir des matiegraveres segraveches obtenues
Pour reacutepondre agrave ces objectifs ce travail se deacuteclinera en deux parties ougrave des
eacuteleacutements de reacuteponses apparaicirctront Une premiegravere partie portant sur lrsquoeacutetude
bibliographique puis une deuxiegraveme partie preacutesentant les analyses effectueacutees et
les reacutesultats obtenus Faisant suite aux conclusions des perspectives seront
eacutemises pour la conduite de futurs travaux
22
PREMIERE PARTIE SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
23
CHAPITRE 1 Geacuteneacuteraliteacutes sur la pecircche au Seacuteneacutegal
11 Environnement naturel
Au large des cocirctes Seacuteneacutegalaises situeacutees agrave lrsquoextreacutemiteacute ouest du continent africain
se heurte le courant marin des canaries venu du Nord et des courants deacuteriveacutes du
courant du Golfe de Guineacutee Des upwellings(remonteacutee drsquoeau froides riches en
sels nutritifs le long de la pente du plateau continental) remontent eacutegalement de
la couche drsquoeau profonde le long de la pente du plateau continental La
tempeacuterature de lrsquoeau de mer en surface ne descend jamais en dessous de 15degC au
cours de lrsquoanneacutee Les fleuves Seacuteneacutegal Gambie et Casamance se jettent dans
lrsquooceacutean atlantique et apportent des sels mineacuteraux pendant lrsquohivernage De plus
du sable riche en sels inorganiques est apporteacute du deacutesert du Sahara par les vents
Le riche environnement naturel preacuteciteacute augmente la productiviteacute de la mer et
creacutee les pecirccheries classeacutees parmi les plus riches drsquoAfrique Des vents violents
qui soufflent au passage de lrsquohivernage agrave la saison segraveche et au passage de la
saison segraveche agrave lrsquohivernage rendent souvent la mer agiteacutee mais en geacuteneacuteral la
zone maritime est calme ce qui permet agrave la population de profiter en toute
seacutecuriteacute des bienfaits de la mer (DPM CRODT 2006)
12 Historique de la pecircche au Seacuteneacutegal
La pecircche a pendant longtemps eacuteteacute une activiteacute monopoliseacutee par certaines
ethnies
les Guet Ndariens de Saint-Louis situeacute agrave lrsquoembouchure du fleuve Seacuteneacutegal
les Lebous aux environs de Dakar
les Nyominka vivant principalement au Saloum
Ces ethnies ont utiliseacute des pecirccheries cocirctiegraveres sur une longueur drsquoenviron 2000
km allant des cocirctes de la Mauritanie au Nord agrave la cocircte de la Sierra Leone au
Sud en suivant le deacuteplacement saisonnier des bancs de poissons La pecircche
artisanale srsquoeffectuait sur des pirogues avec pagaies ou de petites embarcations agrave
24
voile Les captures eacutetaient fournies aux habitants de lrsquointeacuterieur du pays sous
formes de produits fumeacutes ou seacutecheacutes (DPM CRODT 2006)
Lrsquoancecirctre de la pirogue seacuteneacutegalaise remonterait au XVIe siegravecle Elle eacutetait
constitueacutee au deacutepart drsquoun simple tronc eacutevideacute propulseacute agrave la pagaie Vers le deacutebut
du XVIIe siegravecle on assiste agrave lrsquoapparition de la voile Les eacuteperons faisant office
de brise-lames et les bordes sont rajouteacutes au cours du siegravecle suivant Enfin le
moteur hors-bord apparaicirct vers 1950
On distingue deux saisons de production une saison de faible capture de juin
agrave octobre ougrave les volumes des produits diminuent et une saison de forte
production allant de novembre agrave juin Les captures de la pecircche artisanale sont
principalement des espegraveces peacutelagiques alors que les produits de la pecircche
industrielle sont des espegraveces benthiques
Selon la direction des pecircches maritimes (DPM 1996) du ministegravere de
lrsquoeacuteconomie maritime en 1996 lrsquoeffectif de la flottille seacuteneacutegalaise eacutetait le
suivant 11 600 pirogues dont 9 300 motoriseacutees (80) 212 chalutiers dont 60
chalutiers eacutetrangers (28) 6 sardiniers dont 2 sardiniers eacutetrangers (33) 62
thoniers eacutetrangers (97) Les principales prises sont les petits peacutelagiques
(sardinelles chinchards maquereaux) qui repreacutesentent 72 des prises Le reste
correspond agrave des espegraveces benthiques (crevettes ceacutephalopodes rougets dorades
soleshellip)
25
Figure1 Carte des villages cocirctiers de pecircche de la Reacutepublique du Seacuteneacutegal
(source Direction des pecircches maritimes 2003)
26
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees
Depuis trois deacutecennies le secteur de la pecircche a connu une forte croissance au
Seacuteneacutegal Les captures ont eacuteteacute multiplieacutees par huit en 32 ans Les deacutebarquements
des flottilles seacuteneacutegalaises et eacutetrangegraveres ont atteint en 1996 plus de 415 000
tonnes En 1997 le volume deacutebarqueacute est passeacute agrave 421 000 tonnes et en 1998 agrave
425 000 tonnes Cette eacutevolution eacutetant principalement lieacutee agrave lrsquoaugmentation des
petits peacutelagiques mis agrave terre par la pecircche artisanale
(DPM 2003)
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche
Au Seacuteneacutegal la pecircche maritime constitue un eacuteleacutement cleacute de lrsquoeacuteconomie avec une
production en valeur de 150 milliards de FCFA environ soit 2 du PIB national
et 16 du PIB du secteur primaire en 2003 Par ailleurs la population active
dans ce secteur est drsquoenviron 600 000 personnes en comptant lrsquoemploi direct et
indirect repreacutesentant environ 17 de la population active totale Les
exportations de produits halieutiques du pays eacutetaient drsquoenviron 2 milliards pour
130 000 tonnes en 2000 et mecircme ulteacuterieurement celles-ci continuaient de
constituer la plus importante source drsquoacquisition de devises du pays Ces
exportations permettent actuellement de payer pregraves de la moitieacute de la facture
peacutetroliegravere
(Ministegravere de lrsquoeacuteconomie et des finances direction de la deacutemographie et des
statistiques 2005)
Gracircce agrave leur disponibiliteacute les produits de la mer peuvent donc apparaicirctre comme
un apport nutritionnel tregraves important drsquoun point de vue alimentaire les produits
halieutiques contribuent pour 60 agrave lrsquoapport en proteacuteine animales des
populations Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de
proteacuteines couvrant 75 de leurs besoins En 1997 la consommation moyenne
annuelle de poisson au Seacuteneacutegal eacutetait de 26kg par habitant pour une
consommation mondiale de 135 kg par habitant (NDOYE ET COLL 2002)
27
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis
21 Nomenclature
Tableau I Nomenclature de la sole tropicale
Nom scientifique
Nom franccedilais En vernaculaire (en wolof)
Nom FAO Nom anglais
Cynoglossus senegalensis
Sole tropicale Tapaleacute Sole-langue Seacuteneacutegalaise
tongue sole
(SERET 1981)
22 Classification systeacutematique
Cynoglossus senegalensis est classeacute comme indiqueacute dans le tableau ci-dessous
Tableau II classification systeacutematique de la sole tropicale
Classe Osteacuteichtyens
Ordre Pleuronectiformes
Famille Cynoglossidae
Genre Cynoglossus
Espegravece senegalensis
(SERET 1981)
23 Caracteacuteristiques morphologiques
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae
Ce sont des poissons marins agrave corps plat diminuant progressivement de largeur
vers lrsquoarriegravere Les deux yeux assez petits sont situeacutes sur le cocircteacute gauche Le
museau est arrondi La bouche est petite infegravere plus au moins arqueacutee Le bord
du pregrave-opercule nrsquoest pas libre et est recouvert par la peau et des eacutecailles Il nrsquoy
a pas de rayons eacutepineux agrave la dorsale et agrave lrsquoanale La dorsale deacutebute en avant de
lrsquoœil dorsal Les rayons de la dorsale et de lrsquoanale sont confluents avec ceux de
28
la caudale qui se termine en pointe Les nageoires pectorales sont absentes ou
rudimentaires Seule la pelvienne de la face oculeacutee est preacutesente elle est situeacutee
sur la ligne meacutediane Le corps est recouvert par des eacutecailles cteacutenoiumldes ou
cycloiumldes (SERET 1981)
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis
Le corps est plat et allongeacute les nageoires dorsale et anale rejoignent la caudale
qui se termine en pointe Les yeux situeacutes sur le cocircteacute gauche du corps ont un
espace assez large entre eux Le museau est largement arrondi le crochet rostral
plutocirct court srsquoeacutetend jusqursquoau niveau de la narine anteacuterieure La bouche srsquoeacutetend
au-delagrave de lrsquoœil ventral La nageoire dorsale compte 119-125 rayons lrsquoanale 93-
99 rayons et la caudale 12 rayons On compte 124-138 eacutecailles tubuleacutees le long
de la ligne margino-dorsale Une ligne lateacuterale meacutediane est visible sur la face
aveugle
Sur la face oculeacutee le corps est plus ou moins uniformeacutement brun plus ou moins
fonceacute avec des reflets verdacirctres visibles sur le vivant la reacutegion de lrsquoopercule
est souvent noiracirctre La face aveugle est blanchacirctre
(SERET 1981)
Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
29
24 Reacutepartition geacuteographique
Cynoglossus senegalensis est une espegravece tregraves cocirctiegravere par rapport aux autres
espegraveces de la famille des cynoglossidae Elle freacutequente les zones sablo vaseuses
cocirctiegraveres entre 10 et 110 megravetres mais les prises maximales sont reacutealiseacutees entre 5
et 15 megravetres de profondeur Elle est connue de la Mauritanie agrave lrsquoAngola Les
reacutepartitions bathymeacutetriques de cette espegravece observeacutees au Seacuteneacutegal Togo-Benin
au Congo et au Cameroun sont similaires
(SERET 1981)
30
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson deacutefinition valorisation et
utilisation
31 Deacutefinition et composition
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
des opeacuterations traditionnelles de production
Les principaux co-produits de poisson rencontreacutes sont la tecircte la peau les
chutes de filetage les arecirctes centrales les viscegraveres le foie et selon les peacuteriodes
de pecircche les eacuteleacutements reproducteurs tels que les œufs ou la laitance (figure3)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
En vue drsquoune valorisation les co-produits sont traiteacutes selon le mecircme protocole
de conservation que les parties destineacutees agrave la production alimentaire
garantissant ainsi leur absence drsquoalteacuteration
32 les voies de valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes
Le produit deacuteriveacute est le produit commercial obtenu agrave partir drsquoun co-produit Un
co-produit pourra donner plusieurs produits deacuteriveacutes (figure4) Ainsi
la tecircte de poisson pourra ecirctre valoriseacutee en tant que farine de poisson huile
ou destineacutee agrave la nutrition
la chair sur les arecirctes en farine de poisson la chair hacheacutee et huile
31
la peau en farine de poisson collagegravene geacutelatine cuir
les viscegraveres en farine de poisson huile vitamines
la carcasse en farine de poisson collagegravene geacutelatine mineacuteraux
(GUERARD et Coll 2004)
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Ces produits sont qualifieacutes de produits deacuteriveacutes et non de produits finis car ils
sont geacuteneacuteralement commercialiseacutes sous forme drsquoingreacutedients crsquoest-agrave-dire sous
forme de produits intermeacutediaires pour la nutrition humaine animale pour la
dieacuteteacutetique la cosmeacutetique Neacuteanmoins certains co-produits (foies œufs) peuvent
ecirctre vendus agrave lrsquoeacutetat brut aux consommateurs Mais cette tendance est faible et ils
sont (foies œufs) plus utiliseacutes par les industries de conserverie et de saurisserie
(ANDRIEUX 2004)
On peut distinguer quatre (4) categories de produits deacuteriveacutes en fonction de leur
destination
lrsquoutilisation en nutrition humaine ou en alimentation animale
lrsquoutilisation en dieacuteteacutetique ou nutraceutique
32
lrsquoutilisation en cosmeacutetique
utilisation plus restreinte et speacutecifique drsquoun seul type de produit deacuteriveacute
Il existe plusieurs applications possibles des co-produits (figure5) parmi
lesquelles on peut citer
les farines et huiles de poisson
Cette valorisation est actuellement la plus importante car tous les co-produits
peuvent ecirctre utiliseacutes sans distinction Aucun tri nrsquoest neacutecessaire seule la
distinction co- produits issus de poissons sauvages ou drsquoeacutelevage doit ecirctre faite
les hachis
Les co-produits sont broyeacutes et filtreacutes puis le hachi obtenu est congeleacute en bloc
Les co-produits viscegraveres sont exclus de cette valorisation Les hachis sont
destineacutes agrave la fabrication drsquoaliments pour animaux domestiques essentiellement
les chats Ils sont souvent commercialiseacutes sous forme congeleacutee et sont une
bonne source de proteacuteines
les hydrolysats (cf 33)
la production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee (protides lipides)
La production de farine et drsquohuile de poisson repreacutesente toujours en tonnage la
voie de valorisation la plus importante des co-produits de la pecircche (figure 5)
Mais la faible valeur ajouteacutee obtenue avec ces produits incite les industriels agrave
rechercher des deacuteboucheacutes plus rentables productions de sauces de poisson
drsquoaromes de proteacuteines musculaires (surimi) sont autant de valorisation
alternative vers lrsquoindustrie agro-alimentaire (CHING 1999)
33
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
33 Les hydrolysats de poisson
331 Deacutefinition
Les hydrolysats sont des fractions agrave teneur proteacuteique eacuteleveacutee (73 agrave 85) obtenus
par autolyse (uniquement sous lrsquoaction drsquoenzymes endogegravenes) ou heacuteteacuterolyses
(ajout drsquoenzymes exogegravenes) Cependant la proportion en eacuteleacutements mineacuteraux est
assez faible car les arecirctes osseuses non hydrolysables ont eacuteteacute retireacutees Les
hydrolysats ont donc lrsquoavantage drsquoecirctre digeste et drsquoavoir une haute qualiteacute
nutritive
332 Les avantages
Les hydrolysats preacutesentent les mecircmes avantages que les matiegraveres premiegraveres
drsquoorigine animale pour lrsquoaquaculture sans en avoir les nombreux inconveacutenients
(LARBIER et LECLERCQ 1992 ANDERSON et coll 1993) En effet ce
sont des proteacuteines hydrolyseacutees les acides amineacutes essentiels libeacutereacutes sont donc
plus facilement disponibles et assimilables pour les animaux De plus ils
constituent un produit tregraves appeacutetant et parfaitement accepteacute gracircce agrave lrsquoarocircme de
34
poisson et preacutesente une granulomeacutetrie fine facilitant la fabrication drsquoaliments
suivant des proceacutedeacutes tels que la microparticulation (JONES 1995) Enfin les
hydrolysats comportent en geacuteneacuteral peu de mineacuteraux et ne risquent donc pas de
polluer les eaux des eacutelevages aquacoles leur bonne qualiteacute microbiologique
eacutetant assureacutee par la steacuterilisation au cours de la fabrication
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson
3331 En alimentation animale
Les hydrolysats de poisson sont utiliseacutes comme substitut du lait pour les bovins
et les ovins En comparaison avec la caseacuteine les animaux nourris avec les
hydrolysats de poisson gras apregraves un deacutebut de croissance plus lent arrivent au
mecircme poids au bout de quelques semaines (OslashRSKOV et Coll 1982
RITCHIE et MACKIE 1982) De plus une eacutetude eacuteconomique a montreacute les
inteacuterecircts des peptides de poisson en tant que substituts du lait (MERRITT
1982) Pour le beacutetail adulte lrsquoensilage obtenu agrave partir drsquoherbe peut ecirctre
eacutegalement remplaceacute par des hydrolysats de poisson (OUELLET et Coll 1997)
Mais crsquoest dans le domaine de lrsquoaquaculture que ces hydrolysats sont les plus
valoriseacutes En effet en aquaculture la charge reacutecurrente la plus importante est la
source proteacuteique apporteacutee aux animaux Les proteacuteines de poisson hydrolyseacutees
en plus de leur faible coucirct sont drsquoune grande digestibiliteacute De plus de
nombreuses eacutetudes ont montreacute que certains hydrolysats de poisson possegravedent des
proprieacuteteacutes nutraceutiques Ainsi le remplacement des farines de poisson par des
hydrolysats de poisson augmenterait la croissance des crevettes et des larves de
poisson (CORDOVA-MUREATA et GARCIA-CARRENO 2002)
35
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
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29 Lalasidis G Bostroumlm S et Sjoumlberg L B 1978 Low molecular weight enzymatic fish protein hydrolysates chemical composition and nutritive values J Agric Food Cehm 28 751-6 30 Liaset B Julsham K et Espe M 2003 Chemical composition and theoretical nutritional evaluation of the produced fractions from enzymic hydrolysis of salmon frames with Protamex Process Biochem 38 1747-59 32 Liaset B Lied E et Espe M 2000 Enzymatic hydrolysis of by-products from the fishfilleting industry chemical characterization and nutritional evaluation J Sci Food Agric 80 881 33 Larbier M et Leclercq B 1992 Les matiegraveres premiegraveres utiliseacutees en aviculture (225 ndash 301) in nutrition et alimentation des volailles Paris INRA 34 Lowry O H Rosebrough NJ Farr AL et Randall R J 1951 Protein measurement with Folin phenol reagent J Biol Chem 193 256 ndash 275 35 Lynch et coll (1998) Lynch JM Barbano DMet Fleming JR ndash Indirect and direct determination of the casein content of milk by Kjeldhal nitrogen analysis collaborative study J AOAC Int 36 Mackie IM 1982 General review of fish protein hydrolysates Animal Feed Sci And Technol 7 113-24 37 Martin AM et Chintalapati S P 1989 Fish offal-peat compost extracts as fermentation substrate Biological wastes 27 281-8 38 Martone et al (2005) Martone CB Peacuterez Borla O et Saacuten chez J J 2005 Fishery by-product as a nutrient source for bacteria and aracha growth media Bioresource Technol 96 383-87 39 Merritt JH 1982 Assessment of the production costs of fish protein hydrolysates Anim Feed Sci Technol 1 147-51
78
40 Ndoye F Moiumlty-maiumlzi P et Broutin c 2002 Le poisson fumeacute sur la petite cocircte Senegalaise 41Oslashrskov ER Soliman H S et Clark C F S 1982 Use of fish protein hydrolysate in milk replacers Anim Feed Sci Tech 7 135 42 Ouellet DR Seoane J R Veira D M et Proulx J G 1997 Effects of supplementation with fish meal or fish protein hydrolysate on growth nutrient digestibility and rumen fermentation of growing cattle fed grass silage Anim Feed Sci Tech 68 307-26 43 Picot L Bordenave S Didelot S Fruitier-Arnaudin I Sannier F Thorkelsson G Bergeacute J P Gueacuterard F Chabeaud A et Piot J M 2006 Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines Process Biochem 41 1217-22 44 Quaglia GB et Orban E 1987 Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysates from sardine (Sardina pilchardus) J Sci Food Agric 38 271-6 45 Rajapakse N Jung W K Mendis E Moon S H et Kim S K 2005 A novel anticoagulant purified from fish protein hydrolysate inhibits factor XIIa and platelet aggregation Life Sciences 76 2607-19 46 Ravallec-Pleacute R 2000 Valorisation dhydrolysats dorigine marine optimisation de la concentration en peptides apparenteacutes aux facteurs de croissance et aux agents seacutecreacutetagogues Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Bretagne Occidentale 47 Ravallec-Pleacute R et Van Wormhoudt A 2003 Secretagogue activities in cod (Gadus morhua) and shrimp (Penaeus aztecus) extracts and alcalase hydrolysates determined in AR4-2J pancreatic tumour cells Comp Biochem Physiol B 134 669-79 48 Rousseau M Batista I Le Gal Y et Fouchereau-Peacuteron M 2001 Purification of a functional competitive antagonist for calcitonin gene related peptide action from sardine hydrolysate EJB 4 25-32 49 Shahidi F Han X et Synowiecki J 1995 Production and characteristics of protein hydrolystaes from capelin (Mallotus villosus) Food Chem 53 285-93
79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
LISTE DES FIGURES Figure 1 carte des villages cocirctiers de pecircche de la reacutepublique du Seacuteneacutegal
(source direction des pecircche maritimes 2003) Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de lrsquohydrolyse
enzymatique
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Figure 8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
21
LISTE DES ABREVIATIONS DPM Direction des Pecircches Maritimes AA Acides Amineacutes AAI Acide Amineacutes Indispensables IFN Institut Franccedilais de Normalisation EC Enzyme Classification ATP Adeacutenosine Triphosphate pH Potentiel Hydrogegravene degC Degreacute Celsius FAO Food Agricultural Organisation EISMV Ecole Inter-Etat des Sciences et Meacutedecine Veacuteteacuterinaires HIDAOA Hygiegravene des Industries des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine
Animale IFREMER Institut Franccedilais de Recherche et drsquoExploitation de la Mer INRA Institut Nationale de Recherche Agricole
22
LISTES DES PHOTOS
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation de lrsquoenzyme Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
Photo 7 hydrolysat dans les tubes Falcon
TABLE DES MATIERES INTRODUCTION 1 PREMIERE PARTIE SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 4 CHAPITRE 1 Geacuteneacuteraliteacutes sur la pecircche au Seacuteneacutegal 5 11 Environnement naturel 5
12 Historique de la pecircche au Seacuteneacutegal 5
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees 8
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche 8
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis 9
21 Nomenclature 9
22 Classification systeacutematique 9
23 Caracteacuteristiques morphologiques 9
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae 9
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis 10
24 Reacutepartition geacuteographique 10
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson valorisation et utilisation 12
31 Deacutefinition et composition 12
32 Valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes 12
33 Les hydrolysats de poisson 15
331 Deacutefinition 15
332 Les avantages 15
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson 16
3331 En alimentation animale 16
3332 Inteacuterecircts fonctionnels 17
34 Production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee Les peptides 17
16
341 Geacuteneacuteraliteacutes sur les proteacuteines 17
3411 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des proteacuteines 19
3412 Les proteacuteines de poisson 20
34121 La fraction myogegravene soluble 21
34122 La fraction myofibrillaire 21
342 Les peptides 21
3421 Les Sources azoteacutees 21
3422 Inteacuterecircts nutritionnelles des peptides 23
3423 Activiteacutes biologiques des peptides 24
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE 25
41 Les enzymes 25
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes 25
412 Nomenclature et classification 26
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle 26
4122 Nomenclature et classification officielle 26
413 Les principales classes drsquoenzymes 28
42 Lrsquohydrolyse enzymatique 29
421 Deacutefinition et principe 29
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse 30
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique 30
42 31 Influence de la tempeacuterature 31
4232 Influence du pH 32
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices 33
Conclusion partielle 34
17
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE ndash DISCUSSION ET
RECOMMANDATION
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES 36
11 Mateacuteriel 36
111 Mateacuteriel biologique 36
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale 36
1112 Constitution des lots 37
112 Mateacuteriel enzymatique 37
113 Mateacuteriel technique 38
1131 Materiel de preacutelegravevement 38
1132 Mateacuteriel de laboratoire 38
12 Meacutethodes 39
121 Hydrolyse enzymatique 39
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses 40
1212 Hydrolyse courte dureacutee 41
122 Filtration 41
123 Centrifugation 41
124 La matiegravere segraveche 42
13 Analyses biochimiques 42
131 Deacutetermination de la teneur en eau 42
132 Dosage des proteacuteines totales 43
1321 Principe 43
1322 Mode opeacuteratoire 43
1323 Expression des reacutesultats 44
CHAPITRE 2 RESULTATS 45
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse 45
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes 45
18
19
2 3 Poids du culot et du surnageant 46
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant 47
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot 48
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS 49
31 Discussion 49
311 Discussion des reacutesultats 49
3111 La matiegravere segraveche 49
3113 Les proteacuteines 49
312 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes 50
3121 Lrsquohydrolyse enzymatique 50
3122 La matiegravere segraveche 51
3123 Le dosage des proteacuteines 51
32 Recommandations 54
CONCLUSION GENERALE 56
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 58
INTRODUCTION
Les oceacuteans constituent une richesse alimentaire tregraves diversifieacutee (poissons
algues crustaceacutes coquillages mollusques) Selon la FAO plus de 130 millions
de tonnes de poissons sont actuellement pecirccheacutes ou eacuteleveacutes chaque anneacutee dans le
monde
Les produits de la mer peuvent ecirctre consommeacutes frais congeleacutes seacutecheacutes ou encore
transformeacutes La politique environnementale actuelle incite de plus en plus les
industriels agrave prendre en comptes les deacutechets geacuteneacutereacutes par tous proceacutedeacutes de
transformation des poissons Crsquoest pourquoi apregraves lrsquoexploitation des parties
nobles des poissons des chercheurs se sont inteacuteresseacute aux co-produits Les co-
produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterables lors des
opeacuterations traditionnelles de production
Comme le montre le diagramme 1 la production de filet de la sole tropicale est
agrave lrsquoorigine de plusieurs sources de co-produits solides tecirctes viscegraveres carcasse
et peaux En effet des eacutetudes ont reacuteveacuteleacute que les co-produits de poissons sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecircts notamment les proteacuteines Un des
outils pour la reacutecupeacuteration efficace des proteacuteines des co-produits est lrsquohydrolyse
enzymatique elle est appliqueacutee pour ameacuteliorer les proprieacuteteacutes fonctionnelles et
alimentaires des proteacuteines Le but principal de lhydrolyse des co-produits de
poissons est dobtenir le reacutetablissement possible et maximum de tous les
composants valables tout en maintenant leurs qualiteacutes Ainsi le potentiel du
proceacutedeacute drsquohydrolyse enzymatique controcircleacutee sur les co-produits (tecirctes viscegraveres)
de la sole tropicale issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale en
filet de poisson va ecirctre eacutetudieacute durant ce travail
20
DEBARQUEMENT
RECEPTION LAVAGETRIAGE
PESEE
STOCKAGE EN CHAMBRE FROIDE (sous glace fondante)
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
PELAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration peaux
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
FILETAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration carcasse+ viscegraveres
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu jets dans des paniers)
TREMPAGE (eau glaceacutee et chloreacutee 2degC 1 agrave 2mn concentration 2ppm)
PARAGECONDITIONNEMENT (en films plastiques)
EMBALLAGE (caisses de polystyregravene)
PESEE
GLACcedilAGE (glace isoleacutee du produit)
SCELLAGE
ETIQUETAGE
ENTREPOSAGE REFRIGERE (0 - +4degC)
EXPEDITION
Diagramme 1 Principales eacutetapes de transformation de la sole tropicale en filet
21
Le but de ce travail est la libeacuteration et le dosage des proteacuteines des co-produits
de la sole tropicale De cet objectif geacuteneacuteral deacutecoule les objectifs speacutecifiques
suivants
Hydrolyser les co-produits (tecirctes viscegraveres) agrave lrsquoaide drsquoune proteacutease
Seacuteparer la phase soluble (surnageant) de la phase insoluble (culot) par
centrifugation
Obtenir la matiegravere segraveche de ces deux phases
Doser les proteacuteines totales agrave partir des matiegraveres segraveches obtenues
Pour reacutepondre agrave ces objectifs ce travail se deacuteclinera en deux parties ougrave des
eacuteleacutements de reacuteponses apparaicirctront Une premiegravere partie portant sur lrsquoeacutetude
bibliographique puis une deuxiegraveme partie preacutesentant les analyses effectueacutees et
les reacutesultats obtenus Faisant suite aux conclusions des perspectives seront
eacutemises pour la conduite de futurs travaux
22
PREMIERE PARTIE SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
23
CHAPITRE 1 Geacuteneacuteraliteacutes sur la pecircche au Seacuteneacutegal
11 Environnement naturel
Au large des cocirctes Seacuteneacutegalaises situeacutees agrave lrsquoextreacutemiteacute ouest du continent africain
se heurte le courant marin des canaries venu du Nord et des courants deacuteriveacutes du
courant du Golfe de Guineacutee Des upwellings(remonteacutee drsquoeau froides riches en
sels nutritifs le long de la pente du plateau continental) remontent eacutegalement de
la couche drsquoeau profonde le long de la pente du plateau continental La
tempeacuterature de lrsquoeau de mer en surface ne descend jamais en dessous de 15degC au
cours de lrsquoanneacutee Les fleuves Seacuteneacutegal Gambie et Casamance se jettent dans
lrsquooceacutean atlantique et apportent des sels mineacuteraux pendant lrsquohivernage De plus
du sable riche en sels inorganiques est apporteacute du deacutesert du Sahara par les vents
Le riche environnement naturel preacuteciteacute augmente la productiviteacute de la mer et
creacutee les pecirccheries classeacutees parmi les plus riches drsquoAfrique Des vents violents
qui soufflent au passage de lrsquohivernage agrave la saison segraveche et au passage de la
saison segraveche agrave lrsquohivernage rendent souvent la mer agiteacutee mais en geacuteneacuteral la
zone maritime est calme ce qui permet agrave la population de profiter en toute
seacutecuriteacute des bienfaits de la mer (DPM CRODT 2006)
12 Historique de la pecircche au Seacuteneacutegal
La pecircche a pendant longtemps eacuteteacute une activiteacute monopoliseacutee par certaines
ethnies
les Guet Ndariens de Saint-Louis situeacute agrave lrsquoembouchure du fleuve Seacuteneacutegal
les Lebous aux environs de Dakar
les Nyominka vivant principalement au Saloum
Ces ethnies ont utiliseacute des pecirccheries cocirctiegraveres sur une longueur drsquoenviron 2000
km allant des cocirctes de la Mauritanie au Nord agrave la cocircte de la Sierra Leone au
Sud en suivant le deacuteplacement saisonnier des bancs de poissons La pecircche
artisanale srsquoeffectuait sur des pirogues avec pagaies ou de petites embarcations agrave
24
voile Les captures eacutetaient fournies aux habitants de lrsquointeacuterieur du pays sous
formes de produits fumeacutes ou seacutecheacutes (DPM CRODT 2006)
Lrsquoancecirctre de la pirogue seacuteneacutegalaise remonterait au XVIe siegravecle Elle eacutetait
constitueacutee au deacutepart drsquoun simple tronc eacutevideacute propulseacute agrave la pagaie Vers le deacutebut
du XVIIe siegravecle on assiste agrave lrsquoapparition de la voile Les eacuteperons faisant office
de brise-lames et les bordes sont rajouteacutes au cours du siegravecle suivant Enfin le
moteur hors-bord apparaicirct vers 1950
On distingue deux saisons de production une saison de faible capture de juin
agrave octobre ougrave les volumes des produits diminuent et une saison de forte
production allant de novembre agrave juin Les captures de la pecircche artisanale sont
principalement des espegraveces peacutelagiques alors que les produits de la pecircche
industrielle sont des espegraveces benthiques
Selon la direction des pecircches maritimes (DPM 1996) du ministegravere de
lrsquoeacuteconomie maritime en 1996 lrsquoeffectif de la flottille seacuteneacutegalaise eacutetait le
suivant 11 600 pirogues dont 9 300 motoriseacutees (80) 212 chalutiers dont 60
chalutiers eacutetrangers (28) 6 sardiniers dont 2 sardiniers eacutetrangers (33) 62
thoniers eacutetrangers (97) Les principales prises sont les petits peacutelagiques
(sardinelles chinchards maquereaux) qui repreacutesentent 72 des prises Le reste
correspond agrave des espegraveces benthiques (crevettes ceacutephalopodes rougets dorades
soleshellip)
25
Figure1 Carte des villages cocirctiers de pecircche de la Reacutepublique du Seacuteneacutegal
(source Direction des pecircches maritimes 2003)
26
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees
Depuis trois deacutecennies le secteur de la pecircche a connu une forte croissance au
Seacuteneacutegal Les captures ont eacuteteacute multiplieacutees par huit en 32 ans Les deacutebarquements
des flottilles seacuteneacutegalaises et eacutetrangegraveres ont atteint en 1996 plus de 415 000
tonnes En 1997 le volume deacutebarqueacute est passeacute agrave 421 000 tonnes et en 1998 agrave
425 000 tonnes Cette eacutevolution eacutetant principalement lieacutee agrave lrsquoaugmentation des
petits peacutelagiques mis agrave terre par la pecircche artisanale
(DPM 2003)
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche
Au Seacuteneacutegal la pecircche maritime constitue un eacuteleacutement cleacute de lrsquoeacuteconomie avec une
production en valeur de 150 milliards de FCFA environ soit 2 du PIB national
et 16 du PIB du secteur primaire en 2003 Par ailleurs la population active
dans ce secteur est drsquoenviron 600 000 personnes en comptant lrsquoemploi direct et
indirect repreacutesentant environ 17 de la population active totale Les
exportations de produits halieutiques du pays eacutetaient drsquoenviron 2 milliards pour
130 000 tonnes en 2000 et mecircme ulteacuterieurement celles-ci continuaient de
constituer la plus importante source drsquoacquisition de devises du pays Ces
exportations permettent actuellement de payer pregraves de la moitieacute de la facture
peacutetroliegravere
(Ministegravere de lrsquoeacuteconomie et des finances direction de la deacutemographie et des
statistiques 2005)
Gracircce agrave leur disponibiliteacute les produits de la mer peuvent donc apparaicirctre comme
un apport nutritionnel tregraves important drsquoun point de vue alimentaire les produits
halieutiques contribuent pour 60 agrave lrsquoapport en proteacuteine animales des
populations Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de
proteacuteines couvrant 75 de leurs besoins En 1997 la consommation moyenne
annuelle de poisson au Seacuteneacutegal eacutetait de 26kg par habitant pour une
consommation mondiale de 135 kg par habitant (NDOYE ET COLL 2002)
27
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis
21 Nomenclature
Tableau I Nomenclature de la sole tropicale
Nom scientifique
Nom franccedilais En vernaculaire (en wolof)
Nom FAO Nom anglais
Cynoglossus senegalensis
Sole tropicale Tapaleacute Sole-langue Seacuteneacutegalaise
tongue sole
(SERET 1981)
22 Classification systeacutematique
Cynoglossus senegalensis est classeacute comme indiqueacute dans le tableau ci-dessous
Tableau II classification systeacutematique de la sole tropicale
Classe Osteacuteichtyens
Ordre Pleuronectiformes
Famille Cynoglossidae
Genre Cynoglossus
Espegravece senegalensis
(SERET 1981)
23 Caracteacuteristiques morphologiques
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae
Ce sont des poissons marins agrave corps plat diminuant progressivement de largeur
vers lrsquoarriegravere Les deux yeux assez petits sont situeacutes sur le cocircteacute gauche Le
museau est arrondi La bouche est petite infegravere plus au moins arqueacutee Le bord
du pregrave-opercule nrsquoest pas libre et est recouvert par la peau et des eacutecailles Il nrsquoy
a pas de rayons eacutepineux agrave la dorsale et agrave lrsquoanale La dorsale deacutebute en avant de
lrsquoœil dorsal Les rayons de la dorsale et de lrsquoanale sont confluents avec ceux de
28
la caudale qui se termine en pointe Les nageoires pectorales sont absentes ou
rudimentaires Seule la pelvienne de la face oculeacutee est preacutesente elle est situeacutee
sur la ligne meacutediane Le corps est recouvert par des eacutecailles cteacutenoiumldes ou
cycloiumldes (SERET 1981)
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis
Le corps est plat et allongeacute les nageoires dorsale et anale rejoignent la caudale
qui se termine en pointe Les yeux situeacutes sur le cocircteacute gauche du corps ont un
espace assez large entre eux Le museau est largement arrondi le crochet rostral
plutocirct court srsquoeacutetend jusqursquoau niveau de la narine anteacuterieure La bouche srsquoeacutetend
au-delagrave de lrsquoœil ventral La nageoire dorsale compte 119-125 rayons lrsquoanale 93-
99 rayons et la caudale 12 rayons On compte 124-138 eacutecailles tubuleacutees le long
de la ligne margino-dorsale Une ligne lateacuterale meacutediane est visible sur la face
aveugle
Sur la face oculeacutee le corps est plus ou moins uniformeacutement brun plus ou moins
fonceacute avec des reflets verdacirctres visibles sur le vivant la reacutegion de lrsquoopercule
est souvent noiracirctre La face aveugle est blanchacirctre
(SERET 1981)
Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
29
24 Reacutepartition geacuteographique
Cynoglossus senegalensis est une espegravece tregraves cocirctiegravere par rapport aux autres
espegraveces de la famille des cynoglossidae Elle freacutequente les zones sablo vaseuses
cocirctiegraveres entre 10 et 110 megravetres mais les prises maximales sont reacutealiseacutees entre 5
et 15 megravetres de profondeur Elle est connue de la Mauritanie agrave lrsquoAngola Les
reacutepartitions bathymeacutetriques de cette espegravece observeacutees au Seacuteneacutegal Togo-Benin
au Congo et au Cameroun sont similaires
(SERET 1981)
30
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson deacutefinition valorisation et
utilisation
31 Deacutefinition et composition
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
des opeacuterations traditionnelles de production
Les principaux co-produits de poisson rencontreacutes sont la tecircte la peau les
chutes de filetage les arecirctes centrales les viscegraveres le foie et selon les peacuteriodes
de pecircche les eacuteleacutements reproducteurs tels que les œufs ou la laitance (figure3)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
En vue drsquoune valorisation les co-produits sont traiteacutes selon le mecircme protocole
de conservation que les parties destineacutees agrave la production alimentaire
garantissant ainsi leur absence drsquoalteacuteration
32 les voies de valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes
Le produit deacuteriveacute est le produit commercial obtenu agrave partir drsquoun co-produit Un
co-produit pourra donner plusieurs produits deacuteriveacutes (figure4) Ainsi
la tecircte de poisson pourra ecirctre valoriseacutee en tant que farine de poisson huile
ou destineacutee agrave la nutrition
la chair sur les arecirctes en farine de poisson la chair hacheacutee et huile
31
la peau en farine de poisson collagegravene geacutelatine cuir
les viscegraveres en farine de poisson huile vitamines
la carcasse en farine de poisson collagegravene geacutelatine mineacuteraux
(GUERARD et Coll 2004)
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Ces produits sont qualifieacutes de produits deacuteriveacutes et non de produits finis car ils
sont geacuteneacuteralement commercialiseacutes sous forme drsquoingreacutedients crsquoest-agrave-dire sous
forme de produits intermeacutediaires pour la nutrition humaine animale pour la
dieacuteteacutetique la cosmeacutetique Neacuteanmoins certains co-produits (foies œufs) peuvent
ecirctre vendus agrave lrsquoeacutetat brut aux consommateurs Mais cette tendance est faible et ils
sont (foies œufs) plus utiliseacutes par les industries de conserverie et de saurisserie
(ANDRIEUX 2004)
On peut distinguer quatre (4) categories de produits deacuteriveacutes en fonction de leur
destination
lrsquoutilisation en nutrition humaine ou en alimentation animale
lrsquoutilisation en dieacuteteacutetique ou nutraceutique
32
lrsquoutilisation en cosmeacutetique
utilisation plus restreinte et speacutecifique drsquoun seul type de produit deacuteriveacute
Il existe plusieurs applications possibles des co-produits (figure5) parmi
lesquelles on peut citer
les farines et huiles de poisson
Cette valorisation est actuellement la plus importante car tous les co-produits
peuvent ecirctre utiliseacutes sans distinction Aucun tri nrsquoest neacutecessaire seule la
distinction co- produits issus de poissons sauvages ou drsquoeacutelevage doit ecirctre faite
les hachis
Les co-produits sont broyeacutes et filtreacutes puis le hachi obtenu est congeleacute en bloc
Les co-produits viscegraveres sont exclus de cette valorisation Les hachis sont
destineacutes agrave la fabrication drsquoaliments pour animaux domestiques essentiellement
les chats Ils sont souvent commercialiseacutes sous forme congeleacutee et sont une
bonne source de proteacuteines
les hydrolysats (cf 33)
la production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee (protides lipides)
La production de farine et drsquohuile de poisson repreacutesente toujours en tonnage la
voie de valorisation la plus importante des co-produits de la pecircche (figure 5)
Mais la faible valeur ajouteacutee obtenue avec ces produits incite les industriels agrave
rechercher des deacuteboucheacutes plus rentables productions de sauces de poisson
drsquoaromes de proteacuteines musculaires (surimi) sont autant de valorisation
alternative vers lrsquoindustrie agro-alimentaire (CHING 1999)
33
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
33 Les hydrolysats de poisson
331 Deacutefinition
Les hydrolysats sont des fractions agrave teneur proteacuteique eacuteleveacutee (73 agrave 85) obtenus
par autolyse (uniquement sous lrsquoaction drsquoenzymes endogegravenes) ou heacuteteacuterolyses
(ajout drsquoenzymes exogegravenes) Cependant la proportion en eacuteleacutements mineacuteraux est
assez faible car les arecirctes osseuses non hydrolysables ont eacuteteacute retireacutees Les
hydrolysats ont donc lrsquoavantage drsquoecirctre digeste et drsquoavoir une haute qualiteacute
nutritive
332 Les avantages
Les hydrolysats preacutesentent les mecircmes avantages que les matiegraveres premiegraveres
drsquoorigine animale pour lrsquoaquaculture sans en avoir les nombreux inconveacutenients
(LARBIER et LECLERCQ 1992 ANDERSON et coll 1993) En effet ce
sont des proteacuteines hydrolyseacutees les acides amineacutes essentiels libeacutereacutes sont donc
plus facilement disponibles et assimilables pour les animaux De plus ils
constituent un produit tregraves appeacutetant et parfaitement accepteacute gracircce agrave lrsquoarocircme de
34
poisson et preacutesente une granulomeacutetrie fine facilitant la fabrication drsquoaliments
suivant des proceacutedeacutes tels que la microparticulation (JONES 1995) Enfin les
hydrolysats comportent en geacuteneacuteral peu de mineacuteraux et ne risquent donc pas de
polluer les eaux des eacutelevages aquacoles leur bonne qualiteacute microbiologique
eacutetant assureacutee par la steacuterilisation au cours de la fabrication
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson
3331 En alimentation animale
Les hydrolysats de poisson sont utiliseacutes comme substitut du lait pour les bovins
et les ovins En comparaison avec la caseacuteine les animaux nourris avec les
hydrolysats de poisson gras apregraves un deacutebut de croissance plus lent arrivent au
mecircme poids au bout de quelques semaines (OslashRSKOV et Coll 1982
RITCHIE et MACKIE 1982) De plus une eacutetude eacuteconomique a montreacute les
inteacuterecircts des peptides de poisson en tant que substituts du lait (MERRITT
1982) Pour le beacutetail adulte lrsquoensilage obtenu agrave partir drsquoherbe peut ecirctre
eacutegalement remplaceacute par des hydrolysats de poisson (OUELLET et Coll 1997)
Mais crsquoest dans le domaine de lrsquoaquaculture que ces hydrolysats sont les plus
valoriseacutes En effet en aquaculture la charge reacutecurrente la plus importante est la
source proteacuteique apporteacutee aux animaux Les proteacuteines de poisson hydrolyseacutees
en plus de leur faible coucirct sont drsquoune grande digestibiliteacute De plus de
nombreuses eacutetudes ont montreacute que certains hydrolysats de poisson possegravedent des
proprieacuteteacutes nutraceutiques Ainsi le remplacement des farines de poisson par des
hydrolysats de poisson augmenterait la croissance des crevettes et des larves de
poisson (CORDOVA-MUREATA et GARCIA-CARRENO 2002)
35
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
9 Coacuterdova-Murueta JH et Garciacutea-Carreno FL 2002 Nutritive value of squid and hydrolyzed protein supplement in shrimp feed Aquaculture 210 371-84
75
10 Cuvellier GF 1999 Enzymologie et biocatalyse Dans Biotechnologie Paris Tec et Doc Lavoisier Paris 319-42 11 Dumay J 2006 Extraction de lipides en voie aqueuse par bioreacteur enzymatique combineacute agrave lrsquoultracentrifugation application agrave la valorisation de co-produits de poisson (Sardina pilchardus) Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute bioproceacutedeacutes et biotechnologies marines Lieu de soutenance Ecole Polytechnique de lrsquoUniversiteacute de Nantes 12 Dong YL Sheng G Y Fu J M et Wen K W 2005 Chemical characterization and antianaemia activity of fish protein hydrolysate from Saurida elongata J Sci Food Agric 85 2033-39 13 FAO 1998 The state of world fisheries and aquaculture Rome Italy 14 Fitzgerald AJ Rai P S Marchbank T Taylor G W Ghosh S Ritz B W et Playford R J 2005 Reparative properties of a commercial fish protein hydrolysate preparation Gut 54775-81 15 Gauthier D 2006 Introduction aux techniques utiliseacutees en biochimie le dosage des proteacuteines lten lignegt [accegraves internet] wwwchimiebiochimieumonctoncabchdgsiitubprodosage 16 Gildberg A 1993 Enzymic processing of marine raw materials Process Biochem 28 1-15 17 Gildberg A Brgwald J Johansen A et Stenberg E 1996 Isolation of acid peptide fractions from a fish protein hydrolysate with strong stimulatory effect on atlantic salmon (Salmo salar) head kidney leucocytes Comp Biochem Physiol 114 B 97-101 18 Gildberg A Arnesen J A et Carlehoumlg M 2002 Utilisation of cod backbone by biochemical fractionation Process Biochem 38 475-80
76
19 Gueacuterard F Dufosseacute L De La Broise D et Binet A 2001 Enzymatic hydrolysis of protein from yellowfin tuna (Thunnus albacares) wastes using alcalase J Mol Catalysis B Enzymatic 11 1051-9 20 Gueacuterard F Batista I Pires C Thorkelson G et Le Gal Y 2004 Repport on sources and selection criteria for raw material Rapport eacutetabli pour le programme SEAFOODplus- 57 21 Gornall Bardawill et David 1949 J Biol Chem 177 751 [Mise au point dune meacutethode quantitative pour doser les proteacuteines avec le biuret] 22 Hoyle NT et Merrit J H 1994 Quality of fish protein hydrolysates from herring (Clupea harengus) J Food Sci 59 76-9 23 Direction des Pecircches Maritimes (DPM) Centre de Recherche Oceacuteanographiques de Dakar-Thiaroye(CRODT) Rapport final Etude de lrsquoeacutevaluation et de la gestion des ressources halieutiques en Reacutepublique de Seacuteneacutegal Dakar direction des pecircches maritimes 24 Institut Franccedilais pour la Nutrition 1997 Les proteacuteines ndash Tome 2 Caracteacuteristiques des diffeacuterentes sources de proteacuteines alimentaires Paris IFN- Dossier speacutecifique Ndeg9 bis 25 Jones DA 1995 Frippak ndash the facts A response to the article by PR Muir and DC Sutton J Word Aquacult Soc 26(2)220-222 26 Jun SY Park P J Jung W K et Kim S K 2004 Purification and characterization of an antioxydative peptide from enzymatic hydrolysate of yellowfin sole (Limanda aspera) frame protein Eur Food Res Technol 219 pp 20-6 27 Kim SK et Mendis E 2006 Bioactive compounds from marine processing by-products - A review Food Res Int 39383-93 28 Kristinsson HG et Rasco B A 2000 Fish protein hydrolysates Production biochemical and functional properties Critical Reviews in Food Sci and Nutr 40 43-81
77
29 Lalasidis G Bostroumlm S et Sjoumlberg L B 1978 Low molecular weight enzymatic fish protein hydrolysates chemical composition and nutritive values J Agric Food Cehm 28 751-6 30 Liaset B Julsham K et Espe M 2003 Chemical composition and theoretical nutritional evaluation of the produced fractions from enzymic hydrolysis of salmon frames with Protamex Process Biochem 38 1747-59 32 Liaset B Lied E et Espe M 2000 Enzymatic hydrolysis of by-products from the fishfilleting industry chemical characterization and nutritional evaluation J Sci Food Agric 80 881 33 Larbier M et Leclercq B 1992 Les matiegraveres premiegraveres utiliseacutees en aviculture (225 ndash 301) in nutrition et alimentation des volailles Paris INRA 34 Lowry O H Rosebrough NJ Farr AL et Randall R J 1951 Protein measurement with Folin phenol reagent J Biol Chem 193 256 ndash 275 35 Lynch et coll (1998) Lynch JM Barbano DMet Fleming JR ndash Indirect and direct determination of the casein content of milk by Kjeldhal nitrogen analysis collaborative study J AOAC Int 36 Mackie IM 1982 General review of fish protein hydrolysates Animal Feed Sci And Technol 7 113-24 37 Martin AM et Chintalapati S P 1989 Fish offal-peat compost extracts as fermentation substrate Biological wastes 27 281-8 38 Martone et al (2005) Martone CB Peacuterez Borla O et Saacuten chez J J 2005 Fishery by-product as a nutrient source for bacteria and aracha growth media Bioresource Technol 96 383-87 39 Merritt JH 1982 Assessment of the production costs of fish protein hydrolysates Anim Feed Sci Technol 1 147-51
78
40 Ndoye F Moiumlty-maiumlzi P et Broutin c 2002 Le poisson fumeacute sur la petite cocircte Senegalaise 41Oslashrskov ER Soliman H S et Clark C F S 1982 Use of fish protein hydrolysate in milk replacers Anim Feed Sci Tech 7 135 42 Ouellet DR Seoane J R Veira D M et Proulx J G 1997 Effects of supplementation with fish meal or fish protein hydrolysate on growth nutrient digestibility and rumen fermentation of growing cattle fed grass silage Anim Feed Sci Tech 68 307-26 43 Picot L Bordenave S Didelot S Fruitier-Arnaudin I Sannier F Thorkelsson G Bergeacute J P Gueacuterard F Chabeaud A et Piot J M 2006 Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines Process Biochem 41 1217-22 44 Quaglia GB et Orban E 1987 Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysates from sardine (Sardina pilchardus) J Sci Food Agric 38 271-6 45 Rajapakse N Jung W K Mendis E Moon S H et Kim S K 2005 A novel anticoagulant purified from fish protein hydrolysate inhibits factor XIIa and platelet aggregation Life Sciences 76 2607-19 46 Ravallec-Pleacute R 2000 Valorisation dhydrolysats dorigine marine optimisation de la concentration en peptides apparenteacutes aux facteurs de croissance et aux agents seacutecreacutetagogues Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Bretagne Occidentale 47 Ravallec-Pleacute R et Van Wormhoudt A 2003 Secretagogue activities in cod (Gadus morhua) and shrimp (Penaeus aztecus) extracts and alcalase hydrolysates determined in AR4-2J pancreatic tumour cells Comp Biochem Physiol B 134 669-79 48 Rousseau M Batista I Le Gal Y et Fouchereau-Peacuteron M 2001 Purification of a functional competitive antagonist for calcitonin gene related peptide action from sardine hydrolysate EJB 4 25-32 49 Shahidi F Han X et Synowiecki J 1995 Production and characteristics of protein hydrolystaes from capelin (Mallotus villosus) Food Chem 53 285-93
79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
LISTE DES ABREVIATIONS DPM Direction des Pecircches Maritimes AA Acides Amineacutes AAI Acide Amineacutes Indispensables IFN Institut Franccedilais de Normalisation EC Enzyme Classification ATP Adeacutenosine Triphosphate pH Potentiel Hydrogegravene degC Degreacute Celsius FAO Food Agricultural Organisation EISMV Ecole Inter-Etat des Sciences et Meacutedecine Veacuteteacuterinaires HIDAOA Hygiegravene des Industries des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine
Animale IFREMER Institut Franccedilais de Recherche et drsquoExploitation de la Mer INRA Institut Nationale de Recherche Agricole
22
LISTES DES PHOTOS
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation de lrsquoenzyme Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
Photo 7 hydrolysat dans les tubes Falcon
TABLE DES MATIERES INTRODUCTION 1 PREMIERE PARTIE SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 4 CHAPITRE 1 Geacuteneacuteraliteacutes sur la pecircche au Seacuteneacutegal 5 11 Environnement naturel 5
12 Historique de la pecircche au Seacuteneacutegal 5
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees 8
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche 8
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis 9
21 Nomenclature 9
22 Classification systeacutematique 9
23 Caracteacuteristiques morphologiques 9
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae 9
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis 10
24 Reacutepartition geacuteographique 10
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson valorisation et utilisation 12
31 Deacutefinition et composition 12
32 Valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes 12
33 Les hydrolysats de poisson 15
331 Deacutefinition 15
332 Les avantages 15
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson 16
3331 En alimentation animale 16
3332 Inteacuterecircts fonctionnels 17
34 Production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee Les peptides 17
16
341 Geacuteneacuteraliteacutes sur les proteacuteines 17
3411 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des proteacuteines 19
3412 Les proteacuteines de poisson 20
34121 La fraction myogegravene soluble 21
34122 La fraction myofibrillaire 21
342 Les peptides 21
3421 Les Sources azoteacutees 21
3422 Inteacuterecircts nutritionnelles des peptides 23
3423 Activiteacutes biologiques des peptides 24
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE 25
41 Les enzymes 25
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes 25
412 Nomenclature et classification 26
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle 26
4122 Nomenclature et classification officielle 26
413 Les principales classes drsquoenzymes 28
42 Lrsquohydrolyse enzymatique 29
421 Deacutefinition et principe 29
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse 30
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique 30
42 31 Influence de la tempeacuterature 31
4232 Influence du pH 32
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices 33
Conclusion partielle 34
17
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE ndash DISCUSSION ET
RECOMMANDATION
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES 36
11 Mateacuteriel 36
111 Mateacuteriel biologique 36
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale 36
1112 Constitution des lots 37
112 Mateacuteriel enzymatique 37
113 Mateacuteriel technique 38
1131 Materiel de preacutelegravevement 38
1132 Mateacuteriel de laboratoire 38
12 Meacutethodes 39
121 Hydrolyse enzymatique 39
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses 40
1212 Hydrolyse courte dureacutee 41
122 Filtration 41
123 Centrifugation 41
124 La matiegravere segraveche 42
13 Analyses biochimiques 42
131 Deacutetermination de la teneur en eau 42
132 Dosage des proteacuteines totales 43
1321 Principe 43
1322 Mode opeacuteratoire 43
1323 Expression des reacutesultats 44
CHAPITRE 2 RESULTATS 45
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse 45
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes 45
18
19
2 3 Poids du culot et du surnageant 46
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant 47
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot 48
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS 49
31 Discussion 49
311 Discussion des reacutesultats 49
3111 La matiegravere segraveche 49
3113 Les proteacuteines 49
312 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes 50
3121 Lrsquohydrolyse enzymatique 50
3122 La matiegravere segraveche 51
3123 Le dosage des proteacuteines 51
32 Recommandations 54
CONCLUSION GENERALE 56
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 58
INTRODUCTION
Les oceacuteans constituent une richesse alimentaire tregraves diversifieacutee (poissons
algues crustaceacutes coquillages mollusques) Selon la FAO plus de 130 millions
de tonnes de poissons sont actuellement pecirccheacutes ou eacuteleveacutes chaque anneacutee dans le
monde
Les produits de la mer peuvent ecirctre consommeacutes frais congeleacutes seacutecheacutes ou encore
transformeacutes La politique environnementale actuelle incite de plus en plus les
industriels agrave prendre en comptes les deacutechets geacuteneacutereacutes par tous proceacutedeacutes de
transformation des poissons Crsquoest pourquoi apregraves lrsquoexploitation des parties
nobles des poissons des chercheurs se sont inteacuteresseacute aux co-produits Les co-
produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterables lors des
opeacuterations traditionnelles de production
Comme le montre le diagramme 1 la production de filet de la sole tropicale est
agrave lrsquoorigine de plusieurs sources de co-produits solides tecirctes viscegraveres carcasse
et peaux En effet des eacutetudes ont reacuteveacuteleacute que les co-produits de poissons sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecircts notamment les proteacuteines Un des
outils pour la reacutecupeacuteration efficace des proteacuteines des co-produits est lrsquohydrolyse
enzymatique elle est appliqueacutee pour ameacuteliorer les proprieacuteteacutes fonctionnelles et
alimentaires des proteacuteines Le but principal de lhydrolyse des co-produits de
poissons est dobtenir le reacutetablissement possible et maximum de tous les
composants valables tout en maintenant leurs qualiteacutes Ainsi le potentiel du
proceacutedeacute drsquohydrolyse enzymatique controcircleacutee sur les co-produits (tecirctes viscegraveres)
de la sole tropicale issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale en
filet de poisson va ecirctre eacutetudieacute durant ce travail
20
DEBARQUEMENT
RECEPTION LAVAGETRIAGE
PESEE
STOCKAGE EN CHAMBRE FROIDE (sous glace fondante)
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
PELAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration peaux
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
FILETAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration carcasse+ viscegraveres
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu jets dans des paniers)
TREMPAGE (eau glaceacutee et chloreacutee 2degC 1 agrave 2mn concentration 2ppm)
PARAGECONDITIONNEMENT (en films plastiques)
EMBALLAGE (caisses de polystyregravene)
PESEE
GLACcedilAGE (glace isoleacutee du produit)
SCELLAGE
ETIQUETAGE
ENTREPOSAGE REFRIGERE (0 - +4degC)
EXPEDITION
Diagramme 1 Principales eacutetapes de transformation de la sole tropicale en filet
21
Le but de ce travail est la libeacuteration et le dosage des proteacuteines des co-produits
de la sole tropicale De cet objectif geacuteneacuteral deacutecoule les objectifs speacutecifiques
suivants
Hydrolyser les co-produits (tecirctes viscegraveres) agrave lrsquoaide drsquoune proteacutease
Seacuteparer la phase soluble (surnageant) de la phase insoluble (culot) par
centrifugation
Obtenir la matiegravere segraveche de ces deux phases
Doser les proteacuteines totales agrave partir des matiegraveres segraveches obtenues
Pour reacutepondre agrave ces objectifs ce travail se deacuteclinera en deux parties ougrave des
eacuteleacutements de reacuteponses apparaicirctront Une premiegravere partie portant sur lrsquoeacutetude
bibliographique puis une deuxiegraveme partie preacutesentant les analyses effectueacutees et
les reacutesultats obtenus Faisant suite aux conclusions des perspectives seront
eacutemises pour la conduite de futurs travaux
22
PREMIERE PARTIE SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
23
CHAPITRE 1 Geacuteneacuteraliteacutes sur la pecircche au Seacuteneacutegal
11 Environnement naturel
Au large des cocirctes Seacuteneacutegalaises situeacutees agrave lrsquoextreacutemiteacute ouest du continent africain
se heurte le courant marin des canaries venu du Nord et des courants deacuteriveacutes du
courant du Golfe de Guineacutee Des upwellings(remonteacutee drsquoeau froides riches en
sels nutritifs le long de la pente du plateau continental) remontent eacutegalement de
la couche drsquoeau profonde le long de la pente du plateau continental La
tempeacuterature de lrsquoeau de mer en surface ne descend jamais en dessous de 15degC au
cours de lrsquoanneacutee Les fleuves Seacuteneacutegal Gambie et Casamance se jettent dans
lrsquooceacutean atlantique et apportent des sels mineacuteraux pendant lrsquohivernage De plus
du sable riche en sels inorganiques est apporteacute du deacutesert du Sahara par les vents
Le riche environnement naturel preacuteciteacute augmente la productiviteacute de la mer et
creacutee les pecirccheries classeacutees parmi les plus riches drsquoAfrique Des vents violents
qui soufflent au passage de lrsquohivernage agrave la saison segraveche et au passage de la
saison segraveche agrave lrsquohivernage rendent souvent la mer agiteacutee mais en geacuteneacuteral la
zone maritime est calme ce qui permet agrave la population de profiter en toute
seacutecuriteacute des bienfaits de la mer (DPM CRODT 2006)
12 Historique de la pecircche au Seacuteneacutegal
La pecircche a pendant longtemps eacuteteacute une activiteacute monopoliseacutee par certaines
ethnies
les Guet Ndariens de Saint-Louis situeacute agrave lrsquoembouchure du fleuve Seacuteneacutegal
les Lebous aux environs de Dakar
les Nyominka vivant principalement au Saloum
Ces ethnies ont utiliseacute des pecirccheries cocirctiegraveres sur une longueur drsquoenviron 2000
km allant des cocirctes de la Mauritanie au Nord agrave la cocircte de la Sierra Leone au
Sud en suivant le deacuteplacement saisonnier des bancs de poissons La pecircche
artisanale srsquoeffectuait sur des pirogues avec pagaies ou de petites embarcations agrave
24
voile Les captures eacutetaient fournies aux habitants de lrsquointeacuterieur du pays sous
formes de produits fumeacutes ou seacutecheacutes (DPM CRODT 2006)
Lrsquoancecirctre de la pirogue seacuteneacutegalaise remonterait au XVIe siegravecle Elle eacutetait
constitueacutee au deacutepart drsquoun simple tronc eacutevideacute propulseacute agrave la pagaie Vers le deacutebut
du XVIIe siegravecle on assiste agrave lrsquoapparition de la voile Les eacuteperons faisant office
de brise-lames et les bordes sont rajouteacutes au cours du siegravecle suivant Enfin le
moteur hors-bord apparaicirct vers 1950
On distingue deux saisons de production une saison de faible capture de juin
agrave octobre ougrave les volumes des produits diminuent et une saison de forte
production allant de novembre agrave juin Les captures de la pecircche artisanale sont
principalement des espegraveces peacutelagiques alors que les produits de la pecircche
industrielle sont des espegraveces benthiques
Selon la direction des pecircches maritimes (DPM 1996) du ministegravere de
lrsquoeacuteconomie maritime en 1996 lrsquoeffectif de la flottille seacuteneacutegalaise eacutetait le
suivant 11 600 pirogues dont 9 300 motoriseacutees (80) 212 chalutiers dont 60
chalutiers eacutetrangers (28) 6 sardiniers dont 2 sardiniers eacutetrangers (33) 62
thoniers eacutetrangers (97) Les principales prises sont les petits peacutelagiques
(sardinelles chinchards maquereaux) qui repreacutesentent 72 des prises Le reste
correspond agrave des espegraveces benthiques (crevettes ceacutephalopodes rougets dorades
soleshellip)
25
Figure1 Carte des villages cocirctiers de pecircche de la Reacutepublique du Seacuteneacutegal
(source Direction des pecircches maritimes 2003)
26
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees
Depuis trois deacutecennies le secteur de la pecircche a connu une forte croissance au
Seacuteneacutegal Les captures ont eacuteteacute multiplieacutees par huit en 32 ans Les deacutebarquements
des flottilles seacuteneacutegalaises et eacutetrangegraveres ont atteint en 1996 plus de 415 000
tonnes En 1997 le volume deacutebarqueacute est passeacute agrave 421 000 tonnes et en 1998 agrave
425 000 tonnes Cette eacutevolution eacutetant principalement lieacutee agrave lrsquoaugmentation des
petits peacutelagiques mis agrave terre par la pecircche artisanale
(DPM 2003)
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche
Au Seacuteneacutegal la pecircche maritime constitue un eacuteleacutement cleacute de lrsquoeacuteconomie avec une
production en valeur de 150 milliards de FCFA environ soit 2 du PIB national
et 16 du PIB du secteur primaire en 2003 Par ailleurs la population active
dans ce secteur est drsquoenviron 600 000 personnes en comptant lrsquoemploi direct et
indirect repreacutesentant environ 17 de la population active totale Les
exportations de produits halieutiques du pays eacutetaient drsquoenviron 2 milliards pour
130 000 tonnes en 2000 et mecircme ulteacuterieurement celles-ci continuaient de
constituer la plus importante source drsquoacquisition de devises du pays Ces
exportations permettent actuellement de payer pregraves de la moitieacute de la facture
peacutetroliegravere
(Ministegravere de lrsquoeacuteconomie et des finances direction de la deacutemographie et des
statistiques 2005)
Gracircce agrave leur disponibiliteacute les produits de la mer peuvent donc apparaicirctre comme
un apport nutritionnel tregraves important drsquoun point de vue alimentaire les produits
halieutiques contribuent pour 60 agrave lrsquoapport en proteacuteine animales des
populations Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de
proteacuteines couvrant 75 de leurs besoins En 1997 la consommation moyenne
annuelle de poisson au Seacuteneacutegal eacutetait de 26kg par habitant pour une
consommation mondiale de 135 kg par habitant (NDOYE ET COLL 2002)
27
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis
21 Nomenclature
Tableau I Nomenclature de la sole tropicale
Nom scientifique
Nom franccedilais En vernaculaire (en wolof)
Nom FAO Nom anglais
Cynoglossus senegalensis
Sole tropicale Tapaleacute Sole-langue Seacuteneacutegalaise
tongue sole
(SERET 1981)
22 Classification systeacutematique
Cynoglossus senegalensis est classeacute comme indiqueacute dans le tableau ci-dessous
Tableau II classification systeacutematique de la sole tropicale
Classe Osteacuteichtyens
Ordre Pleuronectiformes
Famille Cynoglossidae
Genre Cynoglossus
Espegravece senegalensis
(SERET 1981)
23 Caracteacuteristiques morphologiques
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae
Ce sont des poissons marins agrave corps plat diminuant progressivement de largeur
vers lrsquoarriegravere Les deux yeux assez petits sont situeacutes sur le cocircteacute gauche Le
museau est arrondi La bouche est petite infegravere plus au moins arqueacutee Le bord
du pregrave-opercule nrsquoest pas libre et est recouvert par la peau et des eacutecailles Il nrsquoy
a pas de rayons eacutepineux agrave la dorsale et agrave lrsquoanale La dorsale deacutebute en avant de
lrsquoœil dorsal Les rayons de la dorsale et de lrsquoanale sont confluents avec ceux de
28
la caudale qui se termine en pointe Les nageoires pectorales sont absentes ou
rudimentaires Seule la pelvienne de la face oculeacutee est preacutesente elle est situeacutee
sur la ligne meacutediane Le corps est recouvert par des eacutecailles cteacutenoiumldes ou
cycloiumldes (SERET 1981)
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis
Le corps est plat et allongeacute les nageoires dorsale et anale rejoignent la caudale
qui se termine en pointe Les yeux situeacutes sur le cocircteacute gauche du corps ont un
espace assez large entre eux Le museau est largement arrondi le crochet rostral
plutocirct court srsquoeacutetend jusqursquoau niveau de la narine anteacuterieure La bouche srsquoeacutetend
au-delagrave de lrsquoœil ventral La nageoire dorsale compte 119-125 rayons lrsquoanale 93-
99 rayons et la caudale 12 rayons On compte 124-138 eacutecailles tubuleacutees le long
de la ligne margino-dorsale Une ligne lateacuterale meacutediane est visible sur la face
aveugle
Sur la face oculeacutee le corps est plus ou moins uniformeacutement brun plus ou moins
fonceacute avec des reflets verdacirctres visibles sur le vivant la reacutegion de lrsquoopercule
est souvent noiracirctre La face aveugle est blanchacirctre
(SERET 1981)
Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
29
24 Reacutepartition geacuteographique
Cynoglossus senegalensis est une espegravece tregraves cocirctiegravere par rapport aux autres
espegraveces de la famille des cynoglossidae Elle freacutequente les zones sablo vaseuses
cocirctiegraveres entre 10 et 110 megravetres mais les prises maximales sont reacutealiseacutees entre 5
et 15 megravetres de profondeur Elle est connue de la Mauritanie agrave lrsquoAngola Les
reacutepartitions bathymeacutetriques de cette espegravece observeacutees au Seacuteneacutegal Togo-Benin
au Congo et au Cameroun sont similaires
(SERET 1981)
30
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson deacutefinition valorisation et
utilisation
31 Deacutefinition et composition
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
des opeacuterations traditionnelles de production
Les principaux co-produits de poisson rencontreacutes sont la tecircte la peau les
chutes de filetage les arecirctes centrales les viscegraveres le foie et selon les peacuteriodes
de pecircche les eacuteleacutements reproducteurs tels que les œufs ou la laitance (figure3)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
En vue drsquoune valorisation les co-produits sont traiteacutes selon le mecircme protocole
de conservation que les parties destineacutees agrave la production alimentaire
garantissant ainsi leur absence drsquoalteacuteration
32 les voies de valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes
Le produit deacuteriveacute est le produit commercial obtenu agrave partir drsquoun co-produit Un
co-produit pourra donner plusieurs produits deacuteriveacutes (figure4) Ainsi
la tecircte de poisson pourra ecirctre valoriseacutee en tant que farine de poisson huile
ou destineacutee agrave la nutrition
la chair sur les arecirctes en farine de poisson la chair hacheacutee et huile
31
la peau en farine de poisson collagegravene geacutelatine cuir
les viscegraveres en farine de poisson huile vitamines
la carcasse en farine de poisson collagegravene geacutelatine mineacuteraux
(GUERARD et Coll 2004)
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Ces produits sont qualifieacutes de produits deacuteriveacutes et non de produits finis car ils
sont geacuteneacuteralement commercialiseacutes sous forme drsquoingreacutedients crsquoest-agrave-dire sous
forme de produits intermeacutediaires pour la nutrition humaine animale pour la
dieacuteteacutetique la cosmeacutetique Neacuteanmoins certains co-produits (foies œufs) peuvent
ecirctre vendus agrave lrsquoeacutetat brut aux consommateurs Mais cette tendance est faible et ils
sont (foies œufs) plus utiliseacutes par les industries de conserverie et de saurisserie
(ANDRIEUX 2004)
On peut distinguer quatre (4) categories de produits deacuteriveacutes en fonction de leur
destination
lrsquoutilisation en nutrition humaine ou en alimentation animale
lrsquoutilisation en dieacuteteacutetique ou nutraceutique
32
lrsquoutilisation en cosmeacutetique
utilisation plus restreinte et speacutecifique drsquoun seul type de produit deacuteriveacute
Il existe plusieurs applications possibles des co-produits (figure5) parmi
lesquelles on peut citer
les farines et huiles de poisson
Cette valorisation est actuellement la plus importante car tous les co-produits
peuvent ecirctre utiliseacutes sans distinction Aucun tri nrsquoest neacutecessaire seule la
distinction co- produits issus de poissons sauvages ou drsquoeacutelevage doit ecirctre faite
les hachis
Les co-produits sont broyeacutes et filtreacutes puis le hachi obtenu est congeleacute en bloc
Les co-produits viscegraveres sont exclus de cette valorisation Les hachis sont
destineacutes agrave la fabrication drsquoaliments pour animaux domestiques essentiellement
les chats Ils sont souvent commercialiseacutes sous forme congeleacutee et sont une
bonne source de proteacuteines
les hydrolysats (cf 33)
la production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee (protides lipides)
La production de farine et drsquohuile de poisson repreacutesente toujours en tonnage la
voie de valorisation la plus importante des co-produits de la pecircche (figure 5)
Mais la faible valeur ajouteacutee obtenue avec ces produits incite les industriels agrave
rechercher des deacuteboucheacutes plus rentables productions de sauces de poisson
drsquoaromes de proteacuteines musculaires (surimi) sont autant de valorisation
alternative vers lrsquoindustrie agro-alimentaire (CHING 1999)
33
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
33 Les hydrolysats de poisson
331 Deacutefinition
Les hydrolysats sont des fractions agrave teneur proteacuteique eacuteleveacutee (73 agrave 85) obtenus
par autolyse (uniquement sous lrsquoaction drsquoenzymes endogegravenes) ou heacuteteacuterolyses
(ajout drsquoenzymes exogegravenes) Cependant la proportion en eacuteleacutements mineacuteraux est
assez faible car les arecirctes osseuses non hydrolysables ont eacuteteacute retireacutees Les
hydrolysats ont donc lrsquoavantage drsquoecirctre digeste et drsquoavoir une haute qualiteacute
nutritive
332 Les avantages
Les hydrolysats preacutesentent les mecircmes avantages que les matiegraveres premiegraveres
drsquoorigine animale pour lrsquoaquaculture sans en avoir les nombreux inconveacutenients
(LARBIER et LECLERCQ 1992 ANDERSON et coll 1993) En effet ce
sont des proteacuteines hydrolyseacutees les acides amineacutes essentiels libeacutereacutes sont donc
plus facilement disponibles et assimilables pour les animaux De plus ils
constituent un produit tregraves appeacutetant et parfaitement accepteacute gracircce agrave lrsquoarocircme de
34
poisson et preacutesente une granulomeacutetrie fine facilitant la fabrication drsquoaliments
suivant des proceacutedeacutes tels que la microparticulation (JONES 1995) Enfin les
hydrolysats comportent en geacuteneacuteral peu de mineacuteraux et ne risquent donc pas de
polluer les eaux des eacutelevages aquacoles leur bonne qualiteacute microbiologique
eacutetant assureacutee par la steacuterilisation au cours de la fabrication
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson
3331 En alimentation animale
Les hydrolysats de poisson sont utiliseacutes comme substitut du lait pour les bovins
et les ovins En comparaison avec la caseacuteine les animaux nourris avec les
hydrolysats de poisson gras apregraves un deacutebut de croissance plus lent arrivent au
mecircme poids au bout de quelques semaines (OslashRSKOV et Coll 1982
RITCHIE et MACKIE 1982) De plus une eacutetude eacuteconomique a montreacute les
inteacuterecircts des peptides de poisson en tant que substituts du lait (MERRITT
1982) Pour le beacutetail adulte lrsquoensilage obtenu agrave partir drsquoherbe peut ecirctre
eacutegalement remplaceacute par des hydrolysats de poisson (OUELLET et Coll 1997)
Mais crsquoest dans le domaine de lrsquoaquaculture que ces hydrolysats sont les plus
valoriseacutes En effet en aquaculture la charge reacutecurrente la plus importante est la
source proteacuteique apporteacutee aux animaux Les proteacuteines de poisson hydrolyseacutees
en plus de leur faible coucirct sont drsquoune grande digestibiliteacute De plus de
nombreuses eacutetudes ont montreacute que certains hydrolysats de poisson possegravedent des
proprieacuteteacutes nutraceutiques Ainsi le remplacement des farines de poisson par des
hydrolysats de poisson augmenterait la croissance des crevettes et des larves de
poisson (CORDOVA-MUREATA et GARCIA-CARRENO 2002)
35
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
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50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
LISTES DES PHOTOS
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation de lrsquoenzyme Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
Photo 7 hydrolysat dans les tubes Falcon
TABLE DES MATIERES INTRODUCTION 1 PREMIERE PARTIE SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 4 CHAPITRE 1 Geacuteneacuteraliteacutes sur la pecircche au Seacuteneacutegal 5 11 Environnement naturel 5
12 Historique de la pecircche au Seacuteneacutegal 5
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees 8
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche 8
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis 9
21 Nomenclature 9
22 Classification systeacutematique 9
23 Caracteacuteristiques morphologiques 9
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae 9
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis 10
24 Reacutepartition geacuteographique 10
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson valorisation et utilisation 12
31 Deacutefinition et composition 12
32 Valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes 12
33 Les hydrolysats de poisson 15
331 Deacutefinition 15
332 Les avantages 15
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson 16
3331 En alimentation animale 16
3332 Inteacuterecircts fonctionnels 17
34 Production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee Les peptides 17
16
341 Geacuteneacuteraliteacutes sur les proteacuteines 17
3411 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des proteacuteines 19
3412 Les proteacuteines de poisson 20
34121 La fraction myogegravene soluble 21
34122 La fraction myofibrillaire 21
342 Les peptides 21
3421 Les Sources azoteacutees 21
3422 Inteacuterecircts nutritionnelles des peptides 23
3423 Activiteacutes biologiques des peptides 24
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE 25
41 Les enzymes 25
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes 25
412 Nomenclature et classification 26
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle 26
4122 Nomenclature et classification officielle 26
413 Les principales classes drsquoenzymes 28
42 Lrsquohydrolyse enzymatique 29
421 Deacutefinition et principe 29
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse 30
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique 30
42 31 Influence de la tempeacuterature 31
4232 Influence du pH 32
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices 33
Conclusion partielle 34
17
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE ndash DISCUSSION ET
RECOMMANDATION
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES 36
11 Mateacuteriel 36
111 Mateacuteriel biologique 36
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale 36
1112 Constitution des lots 37
112 Mateacuteriel enzymatique 37
113 Mateacuteriel technique 38
1131 Materiel de preacutelegravevement 38
1132 Mateacuteriel de laboratoire 38
12 Meacutethodes 39
121 Hydrolyse enzymatique 39
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses 40
1212 Hydrolyse courte dureacutee 41
122 Filtration 41
123 Centrifugation 41
124 La matiegravere segraveche 42
13 Analyses biochimiques 42
131 Deacutetermination de la teneur en eau 42
132 Dosage des proteacuteines totales 43
1321 Principe 43
1322 Mode opeacuteratoire 43
1323 Expression des reacutesultats 44
CHAPITRE 2 RESULTATS 45
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse 45
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes 45
18
19
2 3 Poids du culot et du surnageant 46
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant 47
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot 48
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS 49
31 Discussion 49
311 Discussion des reacutesultats 49
3111 La matiegravere segraveche 49
3113 Les proteacuteines 49
312 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes 50
3121 Lrsquohydrolyse enzymatique 50
3122 La matiegravere segraveche 51
3123 Le dosage des proteacuteines 51
32 Recommandations 54
CONCLUSION GENERALE 56
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 58
INTRODUCTION
Les oceacuteans constituent une richesse alimentaire tregraves diversifieacutee (poissons
algues crustaceacutes coquillages mollusques) Selon la FAO plus de 130 millions
de tonnes de poissons sont actuellement pecirccheacutes ou eacuteleveacutes chaque anneacutee dans le
monde
Les produits de la mer peuvent ecirctre consommeacutes frais congeleacutes seacutecheacutes ou encore
transformeacutes La politique environnementale actuelle incite de plus en plus les
industriels agrave prendre en comptes les deacutechets geacuteneacutereacutes par tous proceacutedeacutes de
transformation des poissons Crsquoest pourquoi apregraves lrsquoexploitation des parties
nobles des poissons des chercheurs se sont inteacuteresseacute aux co-produits Les co-
produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterables lors des
opeacuterations traditionnelles de production
Comme le montre le diagramme 1 la production de filet de la sole tropicale est
agrave lrsquoorigine de plusieurs sources de co-produits solides tecirctes viscegraveres carcasse
et peaux En effet des eacutetudes ont reacuteveacuteleacute que les co-produits de poissons sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecircts notamment les proteacuteines Un des
outils pour la reacutecupeacuteration efficace des proteacuteines des co-produits est lrsquohydrolyse
enzymatique elle est appliqueacutee pour ameacuteliorer les proprieacuteteacutes fonctionnelles et
alimentaires des proteacuteines Le but principal de lhydrolyse des co-produits de
poissons est dobtenir le reacutetablissement possible et maximum de tous les
composants valables tout en maintenant leurs qualiteacutes Ainsi le potentiel du
proceacutedeacute drsquohydrolyse enzymatique controcircleacutee sur les co-produits (tecirctes viscegraveres)
de la sole tropicale issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale en
filet de poisson va ecirctre eacutetudieacute durant ce travail
20
DEBARQUEMENT
RECEPTION LAVAGETRIAGE
PESEE
STOCKAGE EN CHAMBRE FROIDE (sous glace fondante)
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
PELAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration peaux
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
FILETAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration carcasse+ viscegraveres
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu jets dans des paniers)
TREMPAGE (eau glaceacutee et chloreacutee 2degC 1 agrave 2mn concentration 2ppm)
PARAGECONDITIONNEMENT (en films plastiques)
EMBALLAGE (caisses de polystyregravene)
PESEE
GLACcedilAGE (glace isoleacutee du produit)
SCELLAGE
ETIQUETAGE
ENTREPOSAGE REFRIGERE (0 - +4degC)
EXPEDITION
Diagramme 1 Principales eacutetapes de transformation de la sole tropicale en filet
21
Le but de ce travail est la libeacuteration et le dosage des proteacuteines des co-produits
de la sole tropicale De cet objectif geacuteneacuteral deacutecoule les objectifs speacutecifiques
suivants
Hydrolyser les co-produits (tecirctes viscegraveres) agrave lrsquoaide drsquoune proteacutease
Seacuteparer la phase soluble (surnageant) de la phase insoluble (culot) par
centrifugation
Obtenir la matiegravere segraveche de ces deux phases
Doser les proteacuteines totales agrave partir des matiegraveres segraveches obtenues
Pour reacutepondre agrave ces objectifs ce travail se deacuteclinera en deux parties ougrave des
eacuteleacutements de reacuteponses apparaicirctront Une premiegravere partie portant sur lrsquoeacutetude
bibliographique puis une deuxiegraveme partie preacutesentant les analyses effectueacutees et
les reacutesultats obtenus Faisant suite aux conclusions des perspectives seront
eacutemises pour la conduite de futurs travaux
22
PREMIERE PARTIE SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
23
CHAPITRE 1 Geacuteneacuteraliteacutes sur la pecircche au Seacuteneacutegal
11 Environnement naturel
Au large des cocirctes Seacuteneacutegalaises situeacutees agrave lrsquoextreacutemiteacute ouest du continent africain
se heurte le courant marin des canaries venu du Nord et des courants deacuteriveacutes du
courant du Golfe de Guineacutee Des upwellings(remonteacutee drsquoeau froides riches en
sels nutritifs le long de la pente du plateau continental) remontent eacutegalement de
la couche drsquoeau profonde le long de la pente du plateau continental La
tempeacuterature de lrsquoeau de mer en surface ne descend jamais en dessous de 15degC au
cours de lrsquoanneacutee Les fleuves Seacuteneacutegal Gambie et Casamance se jettent dans
lrsquooceacutean atlantique et apportent des sels mineacuteraux pendant lrsquohivernage De plus
du sable riche en sels inorganiques est apporteacute du deacutesert du Sahara par les vents
Le riche environnement naturel preacuteciteacute augmente la productiviteacute de la mer et
creacutee les pecirccheries classeacutees parmi les plus riches drsquoAfrique Des vents violents
qui soufflent au passage de lrsquohivernage agrave la saison segraveche et au passage de la
saison segraveche agrave lrsquohivernage rendent souvent la mer agiteacutee mais en geacuteneacuteral la
zone maritime est calme ce qui permet agrave la population de profiter en toute
seacutecuriteacute des bienfaits de la mer (DPM CRODT 2006)
12 Historique de la pecircche au Seacuteneacutegal
La pecircche a pendant longtemps eacuteteacute une activiteacute monopoliseacutee par certaines
ethnies
les Guet Ndariens de Saint-Louis situeacute agrave lrsquoembouchure du fleuve Seacuteneacutegal
les Lebous aux environs de Dakar
les Nyominka vivant principalement au Saloum
Ces ethnies ont utiliseacute des pecirccheries cocirctiegraveres sur une longueur drsquoenviron 2000
km allant des cocirctes de la Mauritanie au Nord agrave la cocircte de la Sierra Leone au
Sud en suivant le deacuteplacement saisonnier des bancs de poissons La pecircche
artisanale srsquoeffectuait sur des pirogues avec pagaies ou de petites embarcations agrave
24
voile Les captures eacutetaient fournies aux habitants de lrsquointeacuterieur du pays sous
formes de produits fumeacutes ou seacutecheacutes (DPM CRODT 2006)
Lrsquoancecirctre de la pirogue seacuteneacutegalaise remonterait au XVIe siegravecle Elle eacutetait
constitueacutee au deacutepart drsquoun simple tronc eacutevideacute propulseacute agrave la pagaie Vers le deacutebut
du XVIIe siegravecle on assiste agrave lrsquoapparition de la voile Les eacuteperons faisant office
de brise-lames et les bordes sont rajouteacutes au cours du siegravecle suivant Enfin le
moteur hors-bord apparaicirct vers 1950
On distingue deux saisons de production une saison de faible capture de juin
agrave octobre ougrave les volumes des produits diminuent et une saison de forte
production allant de novembre agrave juin Les captures de la pecircche artisanale sont
principalement des espegraveces peacutelagiques alors que les produits de la pecircche
industrielle sont des espegraveces benthiques
Selon la direction des pecircches maritimes (DPM 1996) du ministegravere de
lrsquoeacuteconomie maritime en 1996 lrsquoeffectif de la flottille seacuteneacutegalaise eacutetait le
suivant 11 600 pirogues dont 9 300 motoriseacutees (80) 212 chalutiers dont 60
chalutiers eacutetrangers (28) 6 sardiniers dont 2 sardiniers eacutetrangers (33) 62
thoniers eacutetrangers (97) Les principales prises sont les petits peacutelagiques
(sardinelles chinchards maquereaux) qui repreacutesentent 72 des prises Le reste
correspond agrave des espegraveces benthiques (crevettes ceacutephalopodes rougets dorades
soleshellip)
25
Figure1 Carte des villages cocirctiers de pecircche de la Reacutepublique du Seacuteneacutegal
(source Direction des pecircches maritimes 2003)
26
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees
Depuis trois deacutecennies le secteur de la pecircche a connu une forte croissance au
Seacuteneacutegal Les captures ont eacuteteacute multiplieacutees par huit en 32 ans Les deacutebarquements
des flottilles seacuteneacutegalaises et eacutetrangegraveres ont atteint en 1996 plus de 415 000
tonnes En 1997 le volume deacutebarqueacute est passeacute agrave 421 000 tonnes et en 1998 agrave
425 000 tonnes Cette eacutevolution eacutetant principalement lieacutee agrave lrsquoaugmentation des
petits peacutelagiques mis agrave terre par la pecircche artisanale
(DPM 2003)
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche
Au Seacuteneacutegal la pecircche maritime constitue un eacuteleacutement cleacute de lrsquoeacuteconomie avec une
production en valeur de 150 milliards de FCFA environ soit 2 du PIB national
et 16 du PIB du secteur primaire en 2003 Par ailleurs la population active
dans ce secteur est drsquoenviron 600 000 personnes en comptant lrsquoemploi direct et
indirect repreacutesentant environ 17 de la population active totale Les
exportations de produits halieutiques du pays eacutetaient drsquoenviron 2 milliards pour
130 000 tonnes en 2000 et mecircme ulteacuterieurement celles-ci continuaient de
constituer la plus importante source drsquoacquisition de devises du pays Ces
exportations permettent actuellement de payer pregraves de la moitieacute de la facture
peacutetroliegravere
(Ministegravere de lrsquoeacuteconomie et des finances direction de la deacutemographie et des
statistiques 2005)
Gracircce agrave leur disponibiliteacute les produits de la mer peuvent donc apparaicirctre comme
un apport nutritionnel tregraves important drsquoun point de vue alimentaire les produits
halieutiques contribuent pour 60 agrave lrsquoapport en proteacuteine animales des
populations Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de
proteacuteines couvrant 75 de leurs besoins En 1997 la consommation moyenne
annuelle de poisson au Seacuteneacutegal eacutetait de 26kg par habitant pour une
consommation mondiale de 135 kg par habitant (NDOYE ET COLL 2002)
27
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis
21 Nomenclature
Tableau I Nomenclature de la sole tropicale
Nom scientifique
Nom franccedilais En vernaculaire (en wolof)
Nom FAO Nom anglais
Cynoglossus senegalensis
Sole tropicale Tapaleacute Sole-langue Seacuteneacutegalaise
tongue sole
(SERET 1981)
22 Classification systeacutematique
Cynoglossus senegalensis est classeacute comme indiqueacute dans le tableau ci-dessous
Tableau II classification systeacutematique de la sole tropicale
Classe Osteacuteichtyens
Ordre Pleuronectiformes
Famille Cynoglossidae
Genre Cynoglossus
Espegravece senegalensis
(SERET 1981)
23 Caracteacuteristiques morphologiques
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae
Ce sont des poissons marins agrave corps plat diminuant progressivement de largeur
vers lrsquoarriegravere Les deux yeux assez petits sont situeacutes sur le cocircteacute gauche Le
museau est arrondi La bouche est petite infegravere plus au moins arqueacutee Le bord
du pregrave-opercule nrsquoest pas libre et est recouvert par la peau et des eacutecailles Il nrsquoy
a pas de rayons eacutepineux agrave la dorsale et agrave lrsquoanale La dorsale deacutebute en avant de
lrsquoœil dorsal Les rayons de la dorsale et de lrsquoanale sont confluents avec ceux de
28
la caudale qui se termine en pointe Les nageoires pectorales sont absentes ou
rudimentaires Seule la pelvienne de la face oculeacutee est preacutesente elle est situeacutee
sur la ligne meacutediane Le corps est recouvert par des eacutecailles cteacutenoiumldes ou
cycloiumldes (SERET 1981)
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis
Le corps est plat et allongeacute les nageoires dorsale et anale rejoignent la caudale
qui se termine en pointe Les yeux situeacutes sur le cocircteacute gauche du corps ont un
espace assez large entre eux Le museau est largement arrondi le crochet rostral
plutocirct court srsquoeacutetend jusqursquoau niveau de la narine anteacuterieure La bouche srsquoeacutetend
au-delagrave de lrsquoœil ventral La nageoire dorsale compte 119-125 rayons lrsquoanale 93-
99 rayons et la caudale 12 rayons On compte 124-138 eacutecailles tubuleacutees le long
de la ligne margino-dorsale Une ligne lateacuterale meacutediane est visible sur la face
aveugle
Sur la face oculeacutee le corps est plus ou moins uniformeacutement brun plus ou moins
fonceacute avec des reflets verdacirctres visibles sur le vivant la reacutegion de lrsquoopercule
est souvent noiracirctre La face aveugle est blanchacirctre
(SERET 1981)
Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
29
24 Reacutepartition geacuteographique
Cynoglossus senegalensis est une espegravece tregraves cocirctiegravere par rapport aux autres
espegraveces de la famille des cynoglossidae Elle freacutequente les zones sablo vaseuses
cocirctiegraveres entre 10 et 110 megravetres mais les prises maximales sont reacutealiseacutees entre 5
et 15 megravetres de profondeur Elle est connue de la Mauritanie agrave lrsquoAngola Les
reacutepartitions bathymeacutetriques de cette espegravece observeacutees au Seacuteneacutegal Togo-Benin
au Congo et au Cameroun sont similaires
(SERET 1981)
30
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson deacutefinition valorisation et
utilisation
31 Deacutefinition et composition
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
des opeacuterations traditionnelles de production
Les principaux co-produits de poisson rencontreacutes sont la tecircte la peau les
chutes de filetage les arecirctes centrales les viscegraveres le foie et selon les peacuteriodes
de pecircche les eacuteleacutements reproducteurs tels que les œufs ou la laitance (figure3)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
En vue drsquoune valorisation les co-produits sont traiteacutes selon le mecircme protocole
de conservation que les parties destineacutees agrave la production alimentaire
garantissant ainsi leur absence drsquoalteacuteration
32 les voies de valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes
Le produit deacuteriveacute est le produit commercial obtenu agrave partir drsquoun co-produit Un
co-produit pourra donner plusieurs produits deacuteriveacutes (figure4) Ainsi
la tecircte de poisson pourra ecirctre valoriseacutee en tant que farine de poisson huile
ou destineacutee agrave la nutrition
la chair sur les arecirctes en farine de poisson la chair hacheacutee et huile
31
la peau en farine de poisson collagegravene geacutelatine cuir
les viscegraveres en farine de poisson huile vitamines
la carcasse en farine de poisson collagegravene geacutelatine mineacuteraux
(GUERARD et Coll 2004)
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Ces produits sont qualifieacutes de produits deacuteriveacutes et non de produits finis car ils
sont geacuteneacuteralement commercialiseacutes sous forme drsquoingreacutedients crsquoest-agrave-dire sous
forme de produits intermeacutediaires pour la nutrition humaine animale pour la
dieacuteteacutetique la cosmeacutetique Neacuteanmoins certains co-produits (foies œufs) peuvent
ecirctre vendus agrave lrsquoeacutetat brut aux consommateurs Mais cette tendance est faible et ils
sont (foies œufs) plus utiliseacutes par les industries de conserverie et de saurisserie
(ANDRIEUX 2004)
On peut distinguer quatre (4) categories de produits deacuteriveacutes en fonction de leur
destination
lrsquoutilisation en nutrition humaine ou en alimentation animale
lrsquoutilisation en dieacuteteacutetique ou nutraceutique
32
lrsquoutilisation en cosmeacutetique
utilisation plus restreinte et speacutecifique drsquoun seul type de produit deacuteriveacute
Il existe plusieurs applications possibles des co-produits (figure5) parmi
lesquelles on peut citer
les farines et huiles de poisson
Cette valorisation est actuellement la plus importante car tous les co-produits
peuvent ecirctre utiliseacutes sans distinction Aucun tri nrsquoest neacutecessaire seule la
distinction co- produits issus de poissons sauvages ou drsquoeacutelevage doit ecirctre faite
les hachis
Les co-produits sont broyeacutes et filtreacutes puis le hachi obtenu est congeleacute en bloc
Les co-produits viscegraveres sont exclus de cette valorisation Les hachis sont
destineacutes agrave la fabrication drsquoaliments pour animaux domestiques essentiellement
les chats Ils sont souvent commercialiseacutes sous forme congeleacutee et sont une
bonne source de proteacuteines
les hydrolysats (cf 33)
la production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee (protides lipides)
La production de farine et drsquohuile de poisson repreacutesente toujours en tonnage la
voie de valorisation la plus importante des co-produits de la pecircche (figure 5)
Mais la faible valeur ajouteacutee obtenue avec ces produits incite les industriels agrave
rechercher des deacuteboucheacutes plus rentables productions de sauces de poisson
drsquoaromes de proteacuteines musculaires (surimi) sont autant de valorisation
alternative vers lrsquoindustrie agro-alimentaire (CHING 1999)
33
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
33 Les hydrolysats de poisson
331 Deacutefinition
Les hydrolysats sont des fractions agrave teneur proteacuteique eacuteleveacutee (73 agrave 85) obtenus
par autolyse (uniquement sous lrsquoaction drsquoenzymes endogegravenes) ou heacuteteacuterolyses
(ajout drsquoenzymes exogegravenes) Cependant la proportion en eacuteleacutements mineacuteraux est
assez faible car les arecirctes osseuses non hydrolysables ont eacuteteacute retireacutees Les
hydrolysats ont donc lrsquoavantage drsquoecirctre digeste et drsquoavoir une haute qualiteacute
nutritive
332 Les avantages
Les hydrolysats preacutesentent les mecircmes avantages que les matiegraveres premiegraveres
drsquoorigine animale pour lrsquoaquaculture sans en avoir les nombreux inconveacutenients
(LARBIER et LECLERCQ 1992 ANDERSON et coll 1993) En effet ce
sont des proteacuteines hydrolyseacutees les acides amineacutes essentiels libeacutereacutes sont donc
plus facilement disponibles et assimilables pour les animaux De plus ils
constituent un produit tregraves appeacutetant et parfaitement accepteacute gracircce agrave lrsquoarocircme de
34
poisson et preacutesente une granulomeacutetrie fine facilitant la fabrication drsquoaliments
suivant des proceacutedeacutes tels que la microparticulation (JONES 1995) Enfin les
hydrolysats comportent en geacuteneacuteral peu de mineacuteraux et ne risquent donc pas de
polluer les eaux des eacutelevages aquacoles leur bonne qualiteacute microbiologique
eacutetant assureacutee par la steacuterilisation au cours de la fabrication
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson
3331 En alimentation animale
Les hydrolysats de poisson sont utiliseacutes comme substitut du lait pour les bovins
et les ovins En comparaison avec la caseacuteine les animaux nourris avec les
hydrolysats de poisson gras apregraves un deacutebut de croissance plus lent arrivent au
mecircme poids au bout de quelques semaines (OslashRSKOV et Coll 1982
RITCHIE et MACKIE 1982) De plus une eacutetude eacuteconomique a montreacute les
inteacuterecircts des peptides de poisson en tant que substituts du lait (MERRITT
1982) Pour le beacutetail adulte lrsquoensilage obtenu agrave partir drsquoherbe peut ecirctre
eacutegalement remplaceacute par des hydrolysats de poisson (OUELLET et Coll 1997)
Mais crsquoest dans le domaine de lrsquoaquaculture que ces hydrolysats sont les plus
valoriseacutes En effet en aquaculture la charge reacutecurrente la plus importante est la
source proteacuteique apporteacutee aux animaux Les proteacuteines de poisson hydrolyseacutees
en plus de leur faible coucirct sont drsquoune grande digestibiliteacute De plus de
nombreuses eacutetudes ont montreacute que certains hydrolysats de poisson possegravedent des
proprieacuteteacutes nutraceutiques Ainsi le remplacement des farines de poisson par des
hydrolysats de poisson augmenterait la croissance des crevettes et des larves de
poisson (CORDOVA-MUREATA et GARCIA-CARRENO 2002)
35
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
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79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
TABLE DES MATIERES INTRODUCTION 1 PREMIERE PARTIE SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 4 CHAPITRE 1 Geacuteneacuteraliteacutes sur la pecircche au Seacuteneacutegal 5 11 Environnement naturel 5
12 Historique de la pecircche au Seacuteneacutegal 5
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees 8
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche 8
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis 9
21 Nomenclature 9
22 Classification systeacutematique 9
23 Caracteacuteristiques morphologiques 9
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae 9
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis 10
24 Reacutepartition geacuteographique 10
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson valorisation et utilisation 12
31 Deacutefinition et composition 12
32 Valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes 12
33 Les hydrolysats de poisson 15
331 Deacutefinition 15
332 Les avantages 15
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson 16
3331 En alimentation animale 16
3332 Inteacuterecircts fonctionnels 17
34 Production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee Les peptides 17
16
341 Geacuteneacuteraliteacutes sur les proteacuteines 17
3411 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des proteacuteines 19
3412 Les proteacuteines de poisson 20
34121 La fraction myogegravene soluble 21
34122 La fraction myofibrillaire 21
342 Les peptides 21
3421 Les Sources azoteacutees 21
3422 Inteacuterecircts nutritionnelles des peptides 23
3423 Activiteacutes biologiques des peptides 24
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE 25
41 Les enzymes 25
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes 25
412 Nomenclature et classification 26
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle 26
4122 Nomenclature et classification officielle 26
413 Les principales classes drsquoenzymes 28
42 Lrsquohydrolyse enzymatique 29
421 Deacutefinition et principe 29
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse 30
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique 30
42 31 Influence de la tempeacuterature 31
4232 Influence du pH 32
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices 33
Conclusion partielle 34
17
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE ndash DISCUSSION ET
RECOMMANDATION
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES 36
11 Mateacuteriel 36
111 Mateacuteriel biologique 36
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale 36
1112 Constitution des lots 37
112 Mateacuteriel enzymatique 37
113 Mateacuteriel technique 38
1131 Materiel de preacutelegravevement 38
1132 Mateacuteriel de laboratoire 38
12 Meacutethodes 39
121 Hydrolyse enzymatique 39
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses 40
1212 Hydrolyse courte dureacutee 41
122 Filtration 41
123 Centrifugation 41
124 La matiegravere segraveche 42
13 Analyses biochimiques 42
131 Deacutetermination de la teneur en eau 42
132 Dosage des proteacuteines totales 43
1321 Principe 43
1322 Mode opeacuteratoire 43
1323 Expression des reacutesultats 44
CHAPITRE 2 RESULTATS 45
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse 45
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes 45
18
19
2 3 Poids du culot et du surnageant 46
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant 47
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot 48
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS 49
31 Discussion 49
311 Discussion des reacutesultats 49
3111 La matiegravere segraveche 49
3113 Les proteacuteines 49
312 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes 50
3121 Lrsquohydrolyse enzymatique 50
3122 La matiegravere segraveche 51
3123 Le dosage des proteacuteines 51
32 Recommandations 54
CONCLUSION GENERALE 56
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 58
INTRODUCTION
Les oceacuteans constituent une richesse alimentaire tregraves diversifieacutee (poissons
algues crustaceacutes coquillages mollusques) Selon la FAO plus de 130 millions
de tonnes de poissons sont actuellement pecirccheacutes ou eacuteleveacutes chaque anneacutee dans le
monde
Les produits de la mer peuvent ecirctre consommeacutes frais congeleacutes seacutecheacutes ou encore
transformeacutes La politique environnementale actuelle incite de plus en plus les
industriels agrave prendre en comptes les deacutechets geacuteneacutereacutes par tous proceacutedeacutes de
transformation des poissons Crsquoest pourquoi apregraves lrsquoexploitation des parties
nobles des poissons des chercheurs se sont inteacuteresseacute aux co-produits Les co-
produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterables lors des
opeacuterations traditionnelles de production
Comme le montre le diagramme 1 la production de filet de la sole tropicale est
agrave lrsquoorigine de plusieurs sources de co-produits solides tecirctes viscegraveres carcasse
et peaux En effet des eacutetudes ont reacuteveacuteleacute que les co-produits de poissons sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecircts notamment les proteacuteines Un des
outils pour la reacutecupeacuteration efficace des proteacuteines des co-produits est lrsquohydrolyse
enzymatique elle est appliqueacutee pour ameacuteliorer les proprieacuteteacutes fonctionnelles et
alimentaires des proteacuteines Le but principal de lhydrolyse des co-produits de
poissons est dobtenir le reacutetablissement possible et maximum de tous les
composants valables tout en maintenant leurs qualiteacutes Ainsi le potentiel du
proceacutedeacute drsquohydrolyse enzymatique controcircleacutee sur les co-produits (tecirctes viscegraveres)
de la sole tropicale issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale en
filet de poisson va ecirctre eacutetudieacute durant ce travail
20
DEBARQUEMENT
RECEPTION LAVAGETRIAGE
PESEE
STOCKAGE EN CHAMBRE FROIDE (sous glace fondante)
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
PELAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration peaux
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
FILETAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration carcasse+ viscegraveres
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu jets dans des paniers)
TREMPAGE (eau glaceacutee et chloreacutee 2degC 1 agrave 2mn concentration 2ppm)
PARAGECONDITIONNEMENT (en films plastiques)
EMBALLAGE (caisses de polystyregravene)
PESEE
GLACcedilAGE (glace isoleacutee du produit)
SCELLAGE
ETIQUETAGE
ENTREPOSAGE REFRIGERE (0 - +4degC)
EXPEDITION
Diagramme 1 Principales eacutetapes de transformation de la sole tropicale en filet
21
Le but de ce travail est la libeacuteration et le dosage des proteacuteines des co-produits
de la sole tropicale De cet objectif geacuteneacuteral deacutecoule les objectifs speacutecifiques
suivants
Hydrolyser les co-produits (tecirctes viscegraveres) agrave lrsquoaide drsquoune proteacutease
Seacuteparer la phase soluble (surnageant) de la phase insoluble (culot) par
centrifugation
Obtenir la matiegravere segraveche de ces deux phases
Doser les proteacuteines totales agrave partir des matiegraveres segraveches obtenues
Pour reacutepondre agrave ces objectifs ce travail se deacuteclinera en deux parties ougrave des
eacuteleacutements de reacuteponses apparaicirctront Une premiegravere partie portant sur lrsquoeacutetude
bibliographique puis une deuxiegraveme partie preacutesentant les analyses effectueacutees et
les reacutesultats obtenus Faisant suite aux conclusions des perspectives seront
eacutemises pour la conduite de futurs travaux
22
PREMIERE PARTIE SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
23
CHAPITRE 1 Geacuteneacuteraliteacutes sur la pecircche au Seacuteneacutegal
11 Environnement naturel
Au large des cocirctes Seacuteneacutegalaises situeacutees agrave lrsquoextreacutemiteacute ouest du continent africain
se heurte le courant marin des canaries venu du Nord et des courants deacuteriveacutes du
courant du Golfe de Guineacutee Des upwellings(remonteacutee drsquoeau froides riches en
sels nutritifs le long de la pente du plateau continental) remontent eacutegalement de
la couche drsquoeau profonde le long de la pente du plateau continental La
tempeacuterature de lrsquoeau de mer en surface ne descend jamais en dessous de 15degC au
cours de lrsquoanneacutee Les fleuves Seacuteneacutegal Gambie et Casamance se jettent dans
lrsquooceacutean atlantique et apportent des sels mineacuteraux pendant lrsquohivernage De plus
du sable riche en sels inorganiques est apporteacute du deacutesert du Sahara par les vents
Le riche environnement naturel preacuteciteacute augmente la productiviteacute de la mer et
creacutee les pecirccheries classeacutees parmi les plus riches drsquoAfrique Des vents violents
qui soufflent au passage de lrsquohivernage agrave la saison segraveche et au passage de la
saison segraveche agrave lrsquohivernage rendent souvent la mer agiteacutee mais en geacuteneacuteral la
zone maritime est calme ce qui permet agrave la population de profiter en toute
seacutecuriteacute des bienfaits de la mer (DPM CRODT 2006)
12 Historique de la pecircche au Seacuteneacutegal
La pecircche a pendant longtemps eacuteteacute une activiteacute monopoliseacutee par certaines
ethnies
les Guet Ndariens de Saint-Louis situeacute agrave lrsquoembouchure du fleuve Seacuteneacutegal
les Lebous aux environs de Dakar
les Nyominka vivant principalement au Saloum
Ces ethnies ont utiliseacute des pecirccheries cocirctiegraveres sur une longueur drsquoenviron 2000
km allant des cocirctes de la Mauritanie au Nord agrave la cocircte de la Sierra Leone au
Sud en suivant le deacuteplacement saisonnier des bancs de poissons La pecircche
artisanale srsquoeffectuait sur des pirogues avec pagaies ou de petites embarcations agrave
24
voile Les captures eacutetaient fournies aux habitants de lrsquointeacuterieur du pays sous
formes de produits fumeacutes ou seacutecheacutes (DPM CRODT 2006)
Lrsquoancecirctre de la pirogue seacuteneacutegalaise remonterait au XVIe siegravecle Elle eacutetait
constitueacutee au deacutepart drsquoun simple tronc eacutevideacute propulseacute agrave la pagaie Vers le deacutebut
du XVIIe siegravecle on assiste agrave lrsquoapparition de la voile Les eacuteperons faisant office
de brise-lames et les bordes sont rajouteacutes au cours du siegravecle suivant Enfin le
moteur hors-bord apparaicirct vers 1950
On distingue deux saisons de production une saison de faible capture de juin
agrave octobre ougrave les volumes des produits diminuent et une saison de forte
production allant de novembre agrave juin Les captures de la pecircche artisanale sont
principalement des espegraveces peacutelagiques alors que les produits de la pecircche
industrielle sont des espegraveces benthiques
Selon la direction des pecircches maritimes (DPM 1996) du ministegravere de
lrsquoeacuteconomie maritime en 1996 lrsquoeffectif de la flottille seacuteneacutegalaise eacutetait le
suivant 11 600 pirogues dont 9 300 motoriseacutees (80) 212 chalutiers dont 60
chalutiers eacutetrangers (28) 6 sardiniers dont 2 sardiniers eacutetrangers (33) 62
thoniers eacutetrangers (97) Les principales prises sont les petits peacutelagiques
(sardinelles chinchards maquereaux) qui repreacutesentent 72 des prises Le reste
correspond agrave des espegraveces benthiques (crevettes ceacutephalopodes rougets dorades
soleshellip)
25
Figure1 Carte des villages cocirctiers de pecircche de la Reacutepublique du Seacuteneacutegal
(source Direction des pecircches maritimes 2003)
26
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees
Depuis trois deacutecennies le secteur de la pecircche a connu une forte croissance au
Seacuteneacutegal Les captures ont eacuteteacute multiplieacutees par huit en 32 ans Les deacutebarquements
des flottilles seacuteneacutegalaises et eacutetrangegraveres ont atteint en 1996 plus de 415 000
tonnes En 1997 le volume deacutebarqueacute est passeacute agrave 421 000 tonnes et en 1998 agrave
425 000 tonnes Cette eacutevolution eacutetant principalement lieacutee agrave lrsquoaugmentation des
petits peacutelagiques mis agrave terre par la pecircche artisanale
(DPM 2003)
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche
Au Seacuteneacutegal la pecircche maritime constitue un eacuteleacutement cleacute de lrsquoeacuteconomie avec une
production en valeur de 150 milliards de FCFA environ soit 2 du PIB national
et 16 du PIB du secteur primaire en 2003 Par ailleurs la population active
dans ce secteur est drsquoenviron 600 000 personnes en comptant lrsquoemploi direct et
indirect repreacutesentant environ 17 de la population active totale Les
exportations de produits halieutiques du pays eacutetaient drsquoenviron 2 milliards pour
130 000 tonnes en 2000 et mecircme ulteacuterieurement celles-ci continuaient de
constituer la plus importante source drsquoacquisition de devises du pays Ces
exportations permettent actuellement de payer pregraves de la moitieacute de la facture
peacutetroliegravere
(Ministegravere de lrsquoeacuteconomie et des finances direction de la deacutemographie et des
statistiques 2005)
Gracircce agrave leur disponibiliteacute les produits de la mer peuvent donc apparaicirctre comme
un apport nutritionnel tregraves important drsquoun point de vue alimentaire les produits
halieutiques contribuent pour 60 agrave lrsquoapport en proteacuteine animales des
populations Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de
proteacuteines couvrant 75 de leurs besoins En 1997 la consommation moyenne
annuelle de poisson au Seacuteneacutegal eacutetait de 26kg par habitant pour une
consommation mondiale de 135 kg par habitant (NDOYE ET COLL 2002)
27
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis
21 Nomenclature
Tableau I Nomenclature de la sole tropicale
Nom scientifique
Nom franccedilais En vernaculaire (en wolof)
Nom FAO Nom anglais
Cynoglossus senegalensis
Sole tropicale Tapaleacute Sole-langue Seacuteneacutegalaise
tongue sole
(SERET 1981)
22 Classification systeacutematique
Cynoglossus senegalensis est classeacute comme indiqueacute dans le tableau ci-dessous
Tableau II classification systeacutematique de la sole tropicale
Classe Osteacuteichtyens
Ordre Pleuronectiformes
Famille Cynoglossidae
Genre Cynoglossus
Espegravece senegalensis
(SERET 1981)
23 Caracteacuteristiques morphologiques
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae
Ce sont des poissons marins agrave corps plat diminuant progressivement de largeur
vers lrsquoarriegravere Les deux yeux assez petits sont situeacutes sur le cocircteacute gauche Le
museau est arrondi La bouche est petite infegravere plus au moins arqueacutee Le bord
du pregrave-opercule nrsquoest pas libre et est recouvert par la peau et des eacutecailles Il nrsquoy
a pas de rayons eacutepineux agrave la dorsale et agrave lrsquoanale La dorsale deacutebute en avant de
lrsquoœil dorsal Les rayons de la dorsale et de lrsquoanale sont confluents avec ceux de
28
la caudale qui se termine en pointe Les nageoires pectorales sont absentes ou
rudimentaires Seule la pelvienne de la face oculeacutee est preacutesente elle est situeacutee
sur la ligne meacutediane Le corps est recouvert par des eacutecailles cteacutenoiumldes ou
cycloiumldes (SERET 1981)
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis
Le corps est plat et allongeacute les nageoires dorsale et anale rejoignent la caudale
qui se termine en pointe Les yeux situeacutes sur le cocircteacute gauche du corps ont un
espace assez large entre eux Le museau est largement arrondi le crochet rostral
plutocirct court srsquoeacutetend jusqursquoau niveau de la narine anteacuterieure La bouche srsquoeacutetend
au-delagrave de lrsquoœil ventral La nageoire dorsale compte 119-125 rayons lrsquoanale 93-
99 rayons et la caudale 12 rayons On compte 124-138 eacutecailles tubuleacutees le long
de la ligne margino-dorsale Une ligne lateacuterale meacutediane est visible sur la face
aveugle
Sur la face oculeacutee le corps est plus ou moins uniformeacutement brun plus ou moins
fonceacute avec des reflets verdacirctres visibles sur le vivant la reacutegion de lrsquoopercule
est souvent noiracirctre La face aveugle est blanchacirctre
(SERET 1981)
Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
29
24 Reacutepartition geacuteographique
Cynoglossus senegalensis est une espegravece tregraves cocirctiegravere par rapport aux autres
espegraveces de la famille des cynoglossidae Elle freacutequente les zones sablo vaseuses
cocirctiegraveres entre 10 et 110 megravetres mais les prises maximales sont reacutealiseacutees entre 5
et 15 megravetres de profondeur Elle est connue de la Mauritanie agrave lrsquoAngola Les
reacutepartitions bathymeacutetriques de cette espegravece observeacutees au Seacuteneacutegal Togo-Benin
au Congo et au Cameroun sont similaires
(SERET 1981)
30
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson deacutefinition valorisation et
utilisation
31 Deacutefinition et composition
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
des opeacuterations traditionnelles de production
Les principaux co-produits de poisson rencontreacutes sont la tecircte la peau les
chutes de filetage les arecirctes centrales les viscegraveres le foie et selon les peacuteriodes
de pecircche les eacuteleacutements reproducteurs tels que les œufs ou la laitance (figure3)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
En vue drsquoune valorisation les co-produits sont traiteacutes selon le mecircme protocole
de conservation que les parties destineacutees agrave la production alimentaire
garantissant ainsi leur absence drsquoalteacuteration
32 les voies de valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes
Le produit deacuteriveacute est le produit commercial obtenu agrave partir drsquoun co-produit Un
co-produit pourra donner plusieurs produits deacuteriveacutes (figure4) Ainsi
la tecircte de poisson pourra ecirctre valoriseacutee en tant que farine de poisson huile
ou destineacutee agrave la nutrition
la chair sur les arecirctes en farine de poisson la chair hacheacutee et huile
31
la peau en farine de poisson collagegravene geacutelatine cuir
les viscegraveres en farine de poisson huile vitamines
la carcasse en farine de poisson collagegravene geacutelatine mineacuteraux
(GUERARD et Coll 2004)
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Ces produits sont qualifieacutes de produits deacuteriveacutes et non de produits finis car ils
sont geacuteneacuteralement commercialiseacutes sous forme drsquoingreacutedients crsquoest-agrave-dire sous
forme de produits intermeacutediaires pour la nutrition humaine animale pour la
dieacuteteacutetique la cosmeacutetique Neacuteanmoins certains co-produits (foies œufs) peuvent
ecirctre vendus agrave lrsquoeacutetat brut aux consommateurs Mais cette tendance est faible et ils
sont (foies œufs) plus utiliseacutes par les industries de conserverie et de saurisserie
(ANDRIEUX 2004)
On peut distinguer quatre (4) categories de produits deacuteriveacutes en fonction de leur
destination
lrsquoutilisation en nutrition humaine ou en alimentation animale
lrsquoutilisation en dieacuteteacutetique ou nutraceutique
32
lrsquoutilisation en cosmeacutetique
utilisation plus restreinte et speacutecifique drsquoun seul type de produit deacuteriveacute
Il existe plusieurs applications possibles des co-produits (figure5) parmi
lesquelles on peut citer
les farines et huiles de poisson
Cette valorisation est actuellement la plus importante car tous les co-produits
peuvent ecirctre utiliseacutes sans distinction Aucun tri nrsquoest neacutecessaire seule la
distinction co- produits issus de poissons sauvages ou drsquoeacutelevage doit ecirctre faite
les hachis
Les co-produits sont broyeacutes et filtreacutes puis le hachi obtenu est congeleacute en bloc
Les co-produits viscegraveres sont exclus de cette valorisation Les hachis sont
destineacutes agrave la fabrication drsquoaliments pour animaux domestiques essentiellement
les chats Ils sont souvent commercialiseacutes sous forme congeleacutee et sont une
bonne source de proteacuteines
les hydrolysats (cf 33)
la production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee (protides lipides)
La production de farine et drsquohuile de poisson repreacutesente toujours en tonnage la
voie de valorisation la plus importante des co-produits de la pecircche (figure 5)
Mais la faible valeur ajouteacutee obtenue avec ces produits incite les industriels agrave
rechercher des deacuteboucheacutes plus rentables productions de sauces de poisson
drsquoaromes de proteacuteines musculaires (surimi) sont autant de valorisation
alternative vers lrsquoindustrie agro-alimentaire (CHING 1999)
33
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
33 Les hydrolysats de poisson
331 Deacutefinition
Les hydrolysats sont des fractions agrave teneur proteacuteique eacuteleveacutee (73 agrave 85) obtenus
par autolyse (uniquement sous lrsquoaction drsquoenzymes endogegravenes) ou heacuteteacuterolyses
(ajout drsquoenzymes exogegravenes) Cependant la proportion en eacuteleacutements mineacuteraux est
assez faible car les arecirctes osseuses non hydrolysables ont eacuteteacute retireacutees Les
hydrolysats ont donc lrsquoavantage drsquoecirctre digeste et drsquoavoir une haute qualiteacute
nutritive
332 Les avantages
Les hydrolysats preacutesentent les mecircmes avantages que les matiegraveres premiegraveres
drsquoorigine animale pour lrsquoaquaculture sans en avoir les nombreux inconveacutenients
(LARBIER et LECLERCQ 1992 ANDERSON et coll 1993) En effet ce
sont des proteacuteines hydrolyseacutees les acides amineacutes essentiels libeacutereacutes sont donc
plus facilement disponibles et assimilables pour les animaux De plus ils
constituent un produit tregraves appeacutetant et parfaitement accepteacute gracircce agrave lrsquoarocircme de
34
poisson et preacutesente une granulomeacutetrie fine facilitant la fabrication drsquoaliments
suivant des proceacutedeacutes tels que la microparticulation (JONES 1995) Enfin les
hydrolysats comportent en geacuteneacuteral peu de mineacuteraux et ne risquent donc pas de
polluer les eaux des eacutelevages aquacoles leur bonne qualiteacute microbiologique
eacutetant assureacutee par la steacuterilisation au cours de la fabrication
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson
3331 En alimentation animale
Les hydrolysats de poisson sont utiliseacutes comme substitut du lait pour les bovins
et les ovins En comparaison avec la caseacuteine les animaux nourris avec les
hydrolysats de poisson gras apregraves un deacutebut de croissance plus lent arrivent au
mecircme poids au bout de quelques semaines (OslashRSKOV et Coll 1982
RITCHIE et MACKIE 1982) De plus une eacutetude eacuteconomique a montreacute les
inteacuterecircts des peptides de poisson en tant que substituts du lait (MERRITT
1982) Pour le beacutetail adulte lrsquoensilage obtenu agrave partir drsquoherbe peut ecirctre
eacutegalement remplaceacute par des hydrolysats de poisson (OUELLET et Coll 1997)
Mais crsquoest dans le domaine de lrsquoaquaculture que ces hydrolysats sont les plus
valoriseacutes En effet en aquaculture la charge reacutecurrente la plus importante est la
source proteacuteique apporteacutee aux animaux Les proteacuteines de poisson hydrolyseacutees
en plus de leur faible coucirct sont drsquoune grande digestibiliteacute De plus de
nombreuses eacutetudes ont montreacute que certains hydrolysats de poisson possegravedent des
proprieacuteteacutes nutraceutiques Ainsi le remplacement des farines de poisson par des
hydrolysats de poisson augmenterait la croissance des crevettes et des larves de
poisson (CORDOVA-MUREATA et GARCIA-CARRENO 2002)
35
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
9 Coacuterdova-Murueta JH et Garciacutea-Carreno FL 2002 Nutritive value of squid and hydrolyzed protein supplement in shrimp feed Aquaculture 210 371-84
75
10 Cuvellier GF 1999 Enzymologie et biocatalyse Dans Biotechnologie Paris Tec et Doc Lavoisier Paris 319-42 11 Dumay J 2006 Extraction de lipides en voie aqueuse par bioreacteur enzymatique combineacute agrave lrsquoultracentrifugation application agrave la valorisation de co-produits de poisson (Sardina pilchardus) Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute bioproceacutedeacutes et biotechnologies marines Lieu de soutenance Ecole Polytechnique de lrsquoUniversiteacute de Nantes 12 Dong YL Sheng G Y Fu J M et Wen K W 2005 Chemical characterization and antianaemia activity of fish protein hydrolysate from Saurida elongata J Sci Food Agric 85 2033-39 13 FAO 1998 The state of world fisheries and aquaculture Rome Italy 14 Fitzgerald AJ Rai P S Marchbank T Taylor G W Ghosh S Ritz B W et Playford R J 2005 Reparative properties of a commercial fish protein hydrolysate preparation Gut 54775-81 15 Gauthier D 2006 Introduction aux techniques utiliseacutees en biochimie le dosage des proteacuteines lten lignegt [accegraves internet] wwwchimiebiochimieumonctoncabchdgsiitubprodosage 16 Gildberg A 1993 Enzymic processing of marine raw materials Process Biochem 28 1-15 17 Gildberg A Brgwald J Johansen A et Stenberg E 1996 Isolation of acid peptide fractions from a fish protein hydrolysate with strong stimulatory effect on atlantic salmon (Salmo salar) head kidney leucocytes Comp Biochem Physiol 114 B 97-101 18 Gildberg A Arnesen J A et Carlehoumlg M 2002 Utilisation of cod backbone by biochemical fractionation Process Biochem 38 475-80
76
19 Gueacuterard F Dufosseacute L De La Broise D et Binet A 2001 Enzymatic hydrolysis of protein from yellowfin tuna (Thunnus albacares) wastes using alcalase J Mol Catalysis B Enzymatic 11 1051-9 20 Gueacuterard F Batista I Pires C Thorkelson G et Le Gal Y 2004 Repport on sources and selection criteria for raw material Rapport eacutetabli pour le programme SEAFOODplus- 57 21 Gornall Bardawill et David 1949 J Biol Chem 177 751 [Mise au point dune meacutethode quantitative pour doser les proteacuteines avec le biuret] 22 Hoyle NT et Merrit J H 1994 Quality of fish protein hydrolysates from herring (Clupea harengus) J Food Sci 59 76-9 23 Direction des Pecircches Maritimes (DPM) Centre de Recherche Oceacuteanographiques de Dakar-Thiaroye(CRODT) Rapport final Etude de lrsquoeacutevaluation et de la gestion des ressources halieutiques en Reacutepublique de Seacuteneacutegal Dakar direction des pecircches maritimes 24 Institut Franccedilais pour la Nutrition 1997 Les proteacuteines ndash Tome 2 Caracteacuteristiques des diffeacuterentes sources de proteacuteines alimentaires Paris IFN- Dossier speacutecifique Ndeg9 bis 25 Jones DA 1995 Frippak ndash the facts A response to the article by PR Muir and DC Sutton J Word Aquacult Soc 26(2)220-222 26 Jun SY Park P J Jung W K et Kim S K 2004 Purification and characterization of an antioxydative peptide from enzymatic hydrolysate of yellowfin sole (Limanda aspera) frame protein Eur Food Res Technol 219 pp 20-6 27 Kim SK et Mendis E 2006 Bioactive compounds from marine processing by-products - A review Food Res Int 39383-93 28 Kristinsson HG et Rasco B A 2000 Fish protein hydrolysates Production biochemical and functional properties Critical Reviews in Food Sci and Nutr 40 43-81
77
29 Lalasidis G Bostroumlm S et Sjoumlberg L B 1978 Low molecular weight enzymatic fish protein hydrolysates chemical composition and nutritive values J Agric Food Cehm 28 751-6 30 Liaset B Julsham K et Espe M 2003 Chemical composition and theoretical nutritional evaluation of the produced fractions from enzymic hydrolysis of salmon frames with Protamex Process Biochem 38 1747-59 32 Liaset B Lied E et Espe M 2000 Enzymatic hydrolysis of by-products from the fishfilleting industry chemical characterization and nutritional evaluation J Sci Food Agric 80 881 33 Larbier M et Leclercq B 1992 Les matiegraveres premiegraveres utiliseacutees en aviculture (225 ndash 301) in nutrition et alimentation des volailles Paris INRA 34 Lowry O H Rosebrough NJ Farr AL et Randall R J 1951 Protein measurement with Folin phenol reagent J Biol Chem 193 256 ndash 275 35 Lynch et coll (1998) Lynch JM Barbano DMet Fleming JR ndash Indirect and direct determination of the casein content of milk by Kjeldhal nitrogen analysis collaborative study J AOAC Int 36 Mackie IM 1982 General review of fish protein hydrolysates Animal Feed Sci And Technol 7 113-24 37 Martin AM et Chintalapati S P 1989 Fish offal-peat compost extracts as fermentation substrate Biological wastes 27 281-8 38 Martone et al (2005) Martone CB Peacuterez Borla O et Saacuten chez J J 2005 Fishery by-product as a nutrient source for bacteria and aracha growth media Bioresource Technol 96 383-87 39 Merritt JH 1982 Assessment of the production costs of fish protein hydrolysates Anim Feed Sci Technol 1 147-51
78
40 Ndoye F Moiumlty-maiumlzi P et Broutin c 2002 Le poisson fumeacute sur la petite cocircte Senegalaise 41Oslashrskov ER Soliman H S et Clark C F S 1982 Use of fish protein hydrolysate in milk replacers Anim Feed Sci Tech 7 135 42 Ouellet DR Seoane J R Veira D M et Proulx J G 1997 Effects of supplementation with fish meal or fish protein hydrolysate on growth nutrient digestibility and rumen fermentation of growing cattle fed grass silage Anim Feed Sci Tech 68 307-26 43 Picot L Bordenave S Didelot S Fruitier-Arnaudin I Sannier F Thorkelsson G Bergeacute J P Gueacuterard F Chabeaud A et Piot J M 2006 Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines Process Biochem 41 1217-22 44 Quaglia GB et Orban E 1987 Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysates from sardine (Sardina pilchardus) J Sci Food Agric 38 271-6 45 Rajapakse N Jung W K Mendis E Moon S H et Kim S K 2005 A novel anticoagulant purified from fish protein hydrolysate inhibits factor XIIa and platelet aggregation Life Sciences 76 2607-19 46 Ravallec-Pleacute R 2000 Valorisation dhydrolysats dorigine marine optimisation de la concentration en peptides apparenteacutes aux facteurs de croissance et aux agents seacutecreacutetagogues Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Bretagne Occidentale 47 Ravallec-Pleacute R et Van Wormhoudt A 2003 Secretagogue activities in cod (Gadus morhua) and shrimp (Penaeus aztecus) extracts and alcalase hydrolysates determined in AR4-2J pancreatic tumour cells Comp Biochem Physiol B 134 669-79 48 Rousseau M Batista I Le Gal Y et Fouchereau-Peacuteron M 2001 Purification of a functional competitive antagonist for calcitonin gene related peptide action from sardine hydrolysate EJB 4 25-32 49 Shahidi F Han X et Synowiecki J 1995 Production and characteristics of protein hydrolystaes from capelin (Mallotus villosus) Food Chem 53 285-93
79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
341 Geacuteneacuteraliteacutes sur les proteacuteines 17
3411 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des proteacuteines 19
3412 Les proteacuteines de poisson 20
34121 La fraction myogegravene soluble 21
34122 La fraction myofibrillaire 21
342 Les peptides 21
3421 Les Sources azoteacutees 21
3422 Inteacuterecircts nutritionnelles des peptides 23
3423 Activiteacutes biologiques des peptides 24
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE 25
41 Les enzymes 25
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes 25
412 Nomenclature et classification 26
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle 26
4122 Nomenclature et classification officielle 26
413 Les principales classes drsquoenzymes 28
42 Lrsquohydrolyse enzymatique 29
421 Deacutefinition et principe 29
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse 30
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique 30
42 31 Influence de la tempeacuterature 31
4232 Influence du pH 32
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices 33
Conclusion partielle 34
17
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE ndash DISCUSSION ET
RECOMMANDATION
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES 36
11 Mateacuteriel 36
111 Mateacuteriel biologique 36
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale 36
1112 Constitution des lots 37
112 Mateacuteriel enzymatique 37
113 Mateacuteriel technique 38
1131 Materiel de preacutelegravevement 38
1132 Mateacuteriel de laboratoire 38
12 Meacutethodes 39
121 Hydrolyse enzymatique 39
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses 40
1212 Hydrolyse courte dureacutee 41
122 Filtration 41
123 Centrifugation 41
124 La matiegravere segraveche 42
13 Analyses biochimiques 42
131 Deacutetermination de la teneur en eau 42
132 Dosage des proteacuteines totales 43
1321 Principe 43
1322 Mode opeacuteratoire 43
1323 Expression des reacutesultats 44
CHAPITRE 2 RESULTATS 45
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse 45
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes 45
18
19
2 3 Poids du culot et du surnageant 46
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant 47
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot 48
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS 49
31 Discussion 49
311 Discussion des reacutesultats 49
3111 La matiegravere segraveche 49
3113 Les proteacuteines 49
312 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes 50
3121 Lrsquohydrolyse enzymatique 50
3122 La matiegravere segraveche 51
3123 Le dosage des proteacuteines 51
32 Recommandations 54
CONCLUSION GENERALE 56
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 58
INTRODUCTION
Les oceacuteans constituent une richesse alimentaire tregraves diversifieacutee (poissons
algues crustaceacutes coquillages mollusques) Selon la FAO plus de 130 millions
de tonnes de poissons sont actuellement pecirccheacutes ou eacuteleveacutes chaque anneacutee dans le
monde
Les produits de la mer peuvent ecirctre consommeacutes frais congeleacutes seacutecheacutes ou encore
transformeacutes La politique environnementale actuelle incite de plus en plus les
industriels agrave prendre en comptes les deacutechets geacuteneacutereacutes par tous proceacutedeacutes de
transformation des poissons Crsquoest pourquoi apregraves lrsquoexploitation des parties
nobles des poissons des chercheurs se sont inteacuteresseacute aux co-produits Les co-
produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterables lors des
opeacuterations traditionnelles de production
Comme le montre le diagramme 1 la production de filet de la sole tropicale est
agrave lrsquoorigine de plusieurs sources de co-produits solides tecirctes viscegraveres carcasse
et peaux En effet des eacutetudes ont reacuteveacuteleacute que les co-produits de poissons sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecircts notamment les proteacuteines Un des
outils pour la reacutecupeacuteration efficace des proteacuteines des co-produits est lrsquohydrolyse
enzymatique elle est appliqueacutee pour ameacuteliorer les proprieacuteteacutes fonctionnelles et
alimentaires des proteacuteines Le but principal de lhydrolyse des co-produits de
poissons est dobtenir le reacutetablissement possible et maximum de tous les
composants valables tout en maintenant leurs qualiteacutes Ainsi le potentiel du
proceacutedeacute drsquohydrolyse enzymatique controcircleacutee sur les co-produits (tecirctes viscegraveres)
de la sole tropicale issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale en
filet de poisson va ecirctre eacutetudieacute durant ce travail
20
DEBARQUEMENT
RECEPTION LAVAGETRIAGE
PESEE
STOCKAGE EN CHAMBRE FROIDE (sous glace fondante)
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
PELAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration peaux
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
FILETAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration carcasse+ viscegraveres
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu jets dans des paniers)
TREMPAGE (eau glaceacutee et chloreacutee 2degC 1 agrave 2mn concentration 2ppm)
PARAGECONDITIONNEMENT (en films plastiques)
EMBALLAGE (caisses de polystyregravene)
PESEE
GLACcedilAGE (glace isoleacutee du produit)
SCELLAGE
ETIQUETAGE
ENTREPOSAGE REFRIGERE (0 - +4degC)
EXPEDITION
Diagramme 1 Principales eacutetapes de transformation de la sole tropicale en filet
21
Le but de ce travail est la libeacuteration et le dosage des proteacuteines des co-produits
de la sole tropicale De cet objectif geacuteneacuteral deacutecoule les objectifs speacutecifiques
suivants
Hydrolyser les co-produits (tecirctes viscegraveres) agrave lrsquoaide drsquoune proteacutease
Seacuteparer la phase soluble (surnageant) de la phase insoluble (culot) par
centrifugation
Obtenir la matiegravere segraveche de ces deux phases
Doser les proteacuteines totales agrave partir des matiegraveres segraveches obtenues
Pour reacutepondre agrave ces objectifs ce travail se deacuteclinera en deux parties ougrave des
eacuteleacutements de reacuteponses apparaicirctront Une premiegravere partie portant sur lrsquoeacutetude
bibliographique puis une deuxiegraveme partie preacutesentant les analyses effectueacutees et
les reacutesultats obtenus Faisant suite aux conclusions des perspectives seront
eacutemises pour la conduite de futurs travaux
22
PREMIERE PARTIE SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
23
CHAPITRE 1 Geacuteneacuteraliteacutes sur la pecircche au Seacuteneacutegal
11 Environnement naturel
Au large des cocirctes Seacuteneacutegalaises situeacutees agrave lrsquoextreacutemiteacute ouest du continent africain
se heurte le courant marin des canaries venu du Nord et des courants deacuteriveacutes du
courant du Golfe de Guineacutee Des upwellings(remonteacutee drsquoeau froides riches en
sels nutritifs le long de la pente du plateau continental) remontent eacutegalement de
la couche drsquoeau profonde le long de la pente du plateau continental La
tempeacuterature de lrsquoeau de mer en surface ne descend jamais en dessous de 15degC au
cours de lrsquoanneacutee Les fleuves Seacuteneacutegal Gambie et Casamance se jettent dans
lrsquooceacutean atlantique et apportent des sels mineacuteraux pendant lrsquohivernage De plus
du sable riche en sels inorganiques est apporteacute du deacutesert du Sahara par les vents
Le riche environnement naturel preacuteciteacute augmente la productiviteacute de la mer et
creacutee les pecirccheries classeacutees parmi les plus riches drsquoAfrique Des vents violents
qui soufflent au passage de lrsquohivernage agrave la saison segraveche et au passage de la
saison segraveche agrave lrsquohivernage rendent souvent la mer agiteacutee mais en geacuteneacuteral la
zone maritime est calme ce qui permet agrave la population de profiter en toute
seacutecuriteacute des bienfaits de la mer (DPM CRODT 2006)
12 Historique de la pecircche au Seacuteneacutegal
La pecircche a pendant longtemps eacuteteacute une activiteacute monopoliseacutee par certaines
ethnies
les Guet Ndariens de Saint-Louis situeacute agrave lrsquoembouchure du fleuve Seacuteneacutegal
les Lebous aux environs de Dakar
les Nyominka vivant principalement au Saloum
Ces ethnies ont utiliseacute des pecirccheries cocirctiegraveres sur une longueur drsquoenviron 2000
km allant des cocirctes de la Mauritanie au Nord agrave la cocircte de la Sierra Leone au
Sud en suivant le deacuteplacement saisonnier des bancs de poissons La pecircche
artisanale srsquoeffectuait sur des pirogues avec pagaies ou de petites embarcations agrave
24
voile Les captures eacutetaient fournies aux habitants de lrsquointeacuterieur du pays sous
formes de produits fumeacutes ou seacutecheacutes (DPM CRODT 2006)
Lrsquoancecirctre de la pirogue seacuteneacutegalaise remonterait au XVIe siegravecle Elle eacutetait
constitueacutee au deacutepart drsquoun simple tronc eacutevideacute propulseacute agrave la pagaie Vers le deacutebut
du XVIIe siegravecle on assiste agrave lrsquoapparition de la voile Les eacuteperons faisant office
de brise-lames et les bordes sont rajouteacutes au cours du siegravecle suivant Enfin le
moteur hors-bord apparaicirct vers 1950
On distingue deux saisons de production une saison de faible capture de juin
agrave octobre ougrave les volumes des produits diminuent et une saison de forte
production allant de novembre agrave juin Les captures de la pecircche artisanale sont
principalement des espegraveces peacutelagiques alors que les produits de la pecircche
industrielle sont des espegraveces benthiques
Selon la direction des pecircches maritimes (DPM 1996) du ministegravere de
lrsquoeacuteconomie maritime en 1996 lrsquoeffectif de la flottille seacuteneacutegalaise eacutetait le
suivant 11 600 pirogues dont 9 300 motoriseacutees (80) 212 chalutiers dont 60
chalutiers eacutetrangers (28) 6 sardiniers dont 2 sardiniers eacutetrangers (33) 62
thoniers eacutetrangers (97) Les principales prises sont les petits peacutelagiques
(sardinelles chinchards maquereaux) qui repreacutesentent 72 des prises Le reste
correspond agrave des espegraveces benthiques (crevettes ceacutephalopodes rougets dorades
soleshellip)
25
Figure1 Carte des villages cocirctiers de pecircche de la Reacutepublique du Seacuteneacutegal
(source Direction des pecircches maritimes 2003)
26
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees
Depuis trois deacutecennies le secteur de la pecircche a connu une forte croissance au
Seacuteneacutegal Les captures ont eacuteteacute multiplieacutees par huit en 32 ans Les deacutebarquements
des flottilles seacuteneacutegalaises et eacutetrangegraveres ont atteint en 1996 plus de 415 000
tonnes En 1997 le volume deacutebarqueacute est passeacute agrave 421 000 tonnes et en 1998 agrave
425 000 tonnes Cette eacutevolution eacutetant principalement lieacutee agrave lrsquoaugmentation des
petits peacutelagiques mis agrave terre par la pecircche artisanale
(DPM 2003)
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche
Au Seacuteneacutegal la pecircche maritime constitue un eacuteleacutement cleacute de lrsquoeacuteconomie avec une
production en valeur de 150 milliards de FCFA environ soit 2 du PIB national
et 16 du PIB du secteur primaire en 2003 Par ailleurs la population active
dans ce secteur est drsquoenviron 600 000 personnes en comptant lrsquoemploi direct et
indirect repreacutesentant environ 17 de la population active totale Les
exportations de produits halieutiques du pays eacutetaient drsquoenviron 2 milliards pour
130 000 tonnes en 2000 et mecircme ulteacuterieurement celles-ci continuaient de
constituer la plus importante source drsquoacquisition de devises du pays Ces
exportations permettent actuellement de payer pregraves de la moitieacute de la facture
peacutetroliegravere
(Ministegravere de lrsquoeacuteconomie et des finances direction de la deacutemographie et des
statistiques 2005)
Gracircce agrave leur disponibiliteacute les produits de la mer peuvent donc apparaicirctre comme
un apport nutritionnel tregraves important drsquoun point de vue alimentaire les produits
halieutiques contribuent pour 60 agrave lrsquoapport en proteacuteine animales des
populations Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de
proteacuteines couvrant 75 de leurs besoins En 1997 la consommation moyenne
annuelle de poisson au Seacuteneacutegal eacutetait de 26kg par habitant pour une
consommation mondiale de 135 kg par habitant (NDOYE ET COLL 2002)
27
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis
21 Nomenclature
Tableau I Nomenclature de la sole tropicale
Nom scientifique
Nom franccedilais En vernaculaire (en wolof)
Nom FAO Nom anglais
Cynoglossus senegalensis
Sole tropicale Tapaleacute Sole-langue Seacuteneacutegalaise
tongue sole
(SERET 1981)
22 Classification systeacutematique
Cynoglossus senegalensis est classeacute comme indiqueacute dans le tableau ci-dessous
Tableau II classification systeacutematique de la sole tropicale
Classe Osteacuteichtyens
Ordre Pleuronectiformes
Famille Cynoglossidae
Genre Cynoglossus
Espegravece senegalensis
(SERET 1981)
23 Caracteacuteristiques morphologiques
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae
Ce sont des poissons marins agrave corps plat diminuant progressivement de largeur
vers lrsquoarriegravere Les deux yeux assez petits sont situeacutes sur le cocircteacute gauche Le
museau est arrondi La bouche est petite infegravere plus au moins arqueacutee Le bord
du pregrave-opercule nrsquoest pas libre et est recouvert par la peau et des eacutecailles Il nrsquoy
a pas de rayons eacutepineux agrave la dorsale et agrave lrsquoanale La dorsale deacutebute en avant de
lrsquoœil dorsal Les rayons de la dorsale et de lrsquoanale sont confluents avec ceux de
28
la caudale qui se termine en pointe Les nageoires pectorales sont absentes ou
rudimentaires Seule la pelvienne de la face oculeacutee est preacutesente elle est situeacutee
sur la ligne meacutediane Le corps est recouvert par des eacutecailles cteacutenoiumldes ou
cycloiumldes (SERET 1981)
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis
Le corps est plat et allongeacute les nageoires dorsale et anale rejoignent la caudale
qui se termine en pointe Les yeux situeacutes sur le cocircteacute gauche du corps ont un
espace assez large entre eux Le museau est largement arrondi le crochet rostral
plutocirct court srsquoeacutetend jusqursquoau niveau de la narine anteacuterieure La bouche srsquoeacutetend
au-delagrave de lrsquoœil ventral La nageoire dorsale compte 119-125 rayons lrsquoanale 93-
99 rayons et la caudale 12 rayons On compte 124-138 eacutecailles tubuleacutees le long
de la ligne margino-dorsale Une ligne lateacuterale meacutediane est visible sur la face
aveugle
Sur la face oculeacutee le corps est plus ou moins uniformeacutement brun plus ou moins
fonceacute avec des reflets verdacirctres visibles sur le vivant la reacutegion de lrsquoopercule
est souvent noiracirctre La face aveugle est blanchacirctre
(SERET 1981)
Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
29
24 Reacutepartition geacuteographique
Cynoglossus senegalensis est une espegravece tregraves cocirctiegravere par rapport aux autres
espegraveces de la famille des cynoglossidae Elle freacutequente les zones sablo vaseuses
cocirctiegraveres entre 10 et 110 megravetres mais les prises maximales sont reacutealiseacutees entre 5
et 15 megravetres de profondeur Elle est connue de la Mauritanie agrave lrsquoAngola Les
reacutepartitions bathymeacutetriques de cette espegravece observeacutees au Seacuteneacutegal Togo-Benin
au Congo et au Cameroun sont similaires
(SERET 1981)
30
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson deacutefinition valorisation et
utilisation
31 Deacutefinition et composition
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
des opeacuterations traditionnelles de production
Les principaux co-produits de poisson rencontreacutes sont la tecircte la peau les
chutes de filetage les arecirctes centrales les viscegraveres le foie et selon les peacuteriodes
de pecircche les eacuteleacutements reproducteurs tels que les œufs ou la laitance (figure3)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
En vue drsquoune valorisation les co-produits sont traiteacutes selon le mecircme protocole
de conservation que les parties destineacutees agrave la production alimentaire
garantissant ainsi leur absence drsquoalteacuteration
32 les voies de valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes
Le produit deacuteriveacute est le produit commercial obtenu agrave partir drsquoun co-produit Un
co-produit pourra donner plusieurs produits deacuteriveacutes (figure4) Ainsi
la tecircte de poisson pourra ecirctre valoriseacutee en tant que farine de poisson huile
ou destineacutee agrave la nutrition
la chair sur les arecirctes en farine de poisson la chair hacheacutee et huile
31
la peau en farine de poisson collagegravene geacutelatine cuir
les viscegraveres en farine de poisson huile vitamines
la carcasse en farine de poisson collagegravene geacutelatine mineacuteraux
(GUERARD et Coll 2004)
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Ces produits sont qualifieacutes de produits deacuteriveacutes et non de produits finis car ils
sont geacuteneacuteralement commercialiseacutes sous forme drsquoingreacutedients crsquoest-agrave-dire sous
forme de produits intermeacutediaires pour la nutrition humaine animale pour la
dieacuteteacutetique la cosmeacutetique Neacuteanmoins certains co-produits (foies œufs) peuvent
ecirctre vendus agrave lrsquoeacutetat brut aux consommateurs Mais cette tendance est faible et ils
sont (foies œufs) plus utiliseacutes par les industries de conserverie et de saurisserie
(ANDRIEUX 2004)
On peut distinguer quatre (4) categories de produits deacuteriveacutes en fonction de leur
destination
lrsquoutilisation en nutrition humaine ou en alimentation animale
lrsquoutilisation en dieacuteteacutetique ou nutraceutique
32
lrsquoutilisation en cosmeacutetique
utilisation plus restreinte et speacutecifique drsquoun seul type de produit deacuteriveacute
Il existe plusieurs applications possibles des co-produits (figure5) parmi
lesquelles on peut citer
les farines et huiles de poisson
Cette valorisation est actuellement la plus importante car tous les co-produits
peuvent ecirctre utiliseacutes sans distinction Aucun tri nrsquoest neacutecessaire seule la
distinction co- produits issus de poissons sauvages ou drsquoeacutelevage doit ecirctre faite
les hachis
Les co-produits sont broyeacutes et filtreacutes puis le hachi obtenu est congeleacute en bloc
Les co-produits viscegraveres sont exclus de cette valorisation Les hachis sont
destineacutes agrave la fabrication drsquoaliments pour animaux domestiques essentiellement
les chats Ils sont souvent commercialiseacutes sous forme congeleacutee et sont une
bonne source de proteacuteines
les hydrolysats (cf 33)
la production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee (protides lipides)
La production de farine et drsquohuile de poisson repreacutesente toujours en tonnage la
voie de valorisation la plus importante des co-produits de la pecircche (figure 5)
Mais la faible valeur ajouteacutee obtenue avec ces produits incite les industriels agrave
rechercher des deacuteboucheacutes plus rentables productions de sauces de poisson
drsquoaromes de proteacuteines musculaires (surimi) sont autant de valorisation
alternative vers lrsquoindustrie agro-alimentaire (CHING 1999)
33
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
33 Les hydrolysats de poisson
331 Deacutefinition
Les hydrolysats sont des fractions agrave teneur proteacuteique eacuteleveacutee (73 agrave 85) obtenus
par autolyse (uniquement sous lrsquoaction drsquoenzymes endogegravenes) ou heacuteteacuterolyses
(ajout drsquoenzymes exogegravenes) Cependant la proportion en eacuteleacutements mineacuteraux est
assez faible car les arecirctes osseuses non hydrolysables ont eacuteteacute retireacutees Les
hydrolysats ont donc lrsquoavantage drsquoecirctre digeste et drsquoavoir une haute qualiteacute
nutritive
332 Les avantages
Les hydrolysats preacutesentent les mecircmes avantages que les matiegraveres premiegraveres
drsquoorigine animale pour lrsquoaquaculture sans en avoir les nombreux inconveacutenients
(LARBIER et LECLERCQ 1992 ANDERSON et coll 1993) En effet ce
sont des proteacuteines hydrolyseacutees les acides amineacutes essentiels libeacutereacutes sont donc
plus facilement disponibles et assimilables pour les animaux De plus ils
constituent un produit tregraves appeacutetant et parfaitement accepteacute gracircce agrave lrsquoarocircme de
34
poisson et preacutesente une granulomeacutetrie fine facilitant la fabrication drsquoaliments
suivant des proceacutedeacutes tels que la microparticulation (JONES 1995) Enfin les
hydrolysats comportent en geacuteneacuteral peu de mineacuteraux et ne risquent donc pas de
polluer les eaux des eacutelevages aquacoles leur bonne qualiteacute microbiologique
eacutetant assureacutee par la steacuterilisation au cours de la fabrication
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson
3331 En alimentation animale
Les hydrolysats de poisson sont utiliseacutes comme substitut du lait pour les bovins
et les ovins En comparaison avec la caseacuteine les animaux nourris avec les
hydrolysats de poisson gras apregraves un deacutebut de croissance plus lent arrivent au
mecircme poids au bout de quelques semaines (OslashRSKOV et Coll 1982
RITCHIE et MACKIE 1982) De plus une eacutetude eacuteconomique a montreacute les
inteacuterecircts des peptides de poisson en tant que substituts du lait (MERRITT
1982) Pour le beacutetail adulte lrsquoensilage obtenu agrave partir drsquoherbe peut ecirctre
eacutegalement remplaceacute par des hydrolysats de poisson (OUELLET et Coll 1997)
Mais crsquoest dans le domaine de lrsquoaquaculture que ces hydrolysats sont les plus
valoriseacutes En effet en aquaculture la charge reacutecurrente la plus importante est la
source proteacuteique apporteacutee aux animaux Les proteacuteines de poisson hydrolyseacutees
en plus de leur faible coucirct sont drsquoune grande digestibiliteacute De plus de
nombreuses eacutetudes ont montreacute que certains hydrolysats de poisson possegravedent des
proprieacuteteacutes nutraceutiques Ainsi le remplacement des farines de poisson par des
hydrolysats de poisson augmenterait la croissance des crevettes et des larves de
poisson (CORDOVA-MUREATA et GARCIA-CARRENO 2002)
35
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
9 Coacuterdova-Murueta JH et Garciacutea-Carreno FL 2002 Nutritive value of squid and hydrolyzed protein supplement in shrimp feed Aquaculture 210 371-84
75
10 Cuvellier GF 1999 Enzymologie et biocatalyse Dans Biotechnologie Paris Tec et Doc Lavoisier Paris 319-42 11 Dumay J 2006 Extraction de lipides en voie aqueuse par bioreacteur enzymatique combineacute agrave lrsquoultracentrifugation application agrave la valorisation de co-produits de poisson (Sardina pilchardus) Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute bioproceacutedeacutes et biotechnologies marines Lieu de soutenance Ecole Polytechnique de lrsquoUniversiteacute de Nantes 12 Dong YL Sheng G Y Fu J M et Wen K W 2005 Chemical characterization and antianaemia activity of fish protein hydrolysate from Saurida elongata J Sci Food Agric 85 2033-39 13 FAO 1998 The state of world fisheries and aquaculture Rome Italy 14 Fitzgerald AJ Rai P S Marchbank T Taylor G W Ghosh S Ritz B W et Playford R J 2005 Reparative properties of a commercial fish protein hydrolysate preparation Gut 54775-81 15 Gauthier D 2006 Introduction aux techniques utiliseacutees en biochimie le dosage des proteacuteines lten lignegt [accegraves internet] wwwchimiebiochimieumonctoncabchdgsiitubprodosage 16 Gildberg A 1993 Enzymic processing of marine raw materials Process Biochem 28 1-15 17 Gildberg A Brgwald J Johansen A et Stenberg E 1996 Isolation of acid peptide fractions from a fish protein hydrolysate with strong stimulatory effect on atlantic salmon (Salmo salar) head kidney leucocytes Comp Biochem Physiol 114 B 97-101 18 Gildberg A Arnesen J A et Carlehoumlg M 2002 Utilisation of cod backbone by biochemical fractionation Process Biochem 38 475-80
76
19 Gueacuterard F Dufosseacute L De La Broise D et Binet A 2001 Enzymatic hydrolysis of protein from yellowfin tuna (Thunnus albacares) wastes using alcalase J Mol Catalysis B Enzymatic 11 1051-9 20 Gueacuterard F Batista I Pires C Thorkelson G et Le Gal Y 2004 Repport on sources and selection criteria for raw material Rapport eacutetabli pour le programme SEAFOODplus- 57 21 Gornall Bardawill et David 1949 J Biol Chem 177 751 [Mise au point dune meacutethode quantitative pour doser les proteacuteines avec le biuret] 22 Hoyle NT et Merrit J H 1994 Quality of fish protein hydrolysates from herring (Clupea harengus) J Food Sci 59 76-9 23 Direction des Pecircches Maritimes (DPM) Centre de Recherche Oceacuteanographiques de Dakar-Thiaroye(CRODT) Rapport final Etude de lrsquoeacutevaluation et de la gestion des ressources halieutiques en Reacutepublique de Seacuteneacutegal Dakar direction des pecircches maritimes 24 Institut Franccedilais pour la Nutrition 1997 Les proteacuteines ndash Tome 2 Caracteacuteristiques des diffeacuterentes sources de proteacuteines alimentaires Paris IFN- Dossier speacutecifique Ndeg9 bis 25 Jones DA 1995 Frippak ndash the facts A response to the article by PR Muir and DC Sutton J Word Aquacult Soc 26(2)220-222 26 Jun SY Park P J Jung W K et Kim S K 2004 Purification and characterization of an antioxydative peptide from enzymatic hydrolysate of yellowfin sole (Limanda aspera) frame protein Eur Food Res Technol 219 pp 20-6 27 Kim SK et Mendis E 2006 Bioactive compounds from marine processing by-products - A review Food Res Int 39383-93 28 Kristinsson HG et Rasco B A 2000 Fish protein hydrolysates Production biochemical and functional properties Critical Reviews in Food Sci and Nutr 40 43-81
77
29 Lalasidis G Bostroumlm S et Sjoumlberg L B 1978 Low molecular weight enzymatic fish protein hydrolysates chemical composition and nutritive values J Agric Food Cehm 28 751-6 30 Liaset B Julsham K et Espe M 2003 Chemical composition and theoretical nutritional evaluation of the produced fractions from enzymic hydrolysis of salmon frames with Protamex Process Biochem 38 1747-59 32 Liaset B Lied E et Espe M 2000 Enzymatic hydrolysis of by-products from the fishfilleting industry chemical characterization and nutritional evaluation J Sci Food Agric 80 881 33 Larbier M et Leclercq B 1992 Les matiegraveres premiegraveres utiliseacutees en aviculture (225 ndash 301) in nutrition et alimentation des volailles Paris INRA 34 Lowry O H Rosebrough NJ Farr AL et Randall R J 1951 Protein measurement with Folin phenol reagent J Biol Chem 193 256 ndash 275 35 Lynch et coll (1998) Lynch JM Barbano DMet Fleming JR ndash Indirect and direct determination of the casein content of milk by Kjeldhal nitrogen analysis collaborative study J AOAC Int 36 Mackie IM 1982 General review of fish protein hydrolysates Animal Feed Sci And Technol 7 113-24 37 Martin AM et Chintalapati S P 1989 Fish offal-peat compost extracts as fermentation substrate Biological wastes 27 281-8 38 Martone et al (2005) Martone CB Peacuterez Borla O et Saacuten chez J J 2005 Fishery by-product as a nutrient source for bacteria and aracha growth media Bioresource Technol 96 383-87 39 Merritt JH 1982 Assessment of the production costs of fish protein hydrolysates Anim Feed Sci Technol 1 147-51
78
40 Ndoye F Moiumlty-maiumlzi P et Broutin c 2002 Le poisson fumeacute sur la petite cocircte Senegalaise 41Oslashrskov ER Soliman H S et Clark C F S 1982 Use of fish protein hydrolysate in milk replacers Anim Feed Sci Tech 7 135 42 Ouellet DR Seoane J R Veira D M et Proulx J G 1997 Effects of supplementation with fish meal or fish protein hydrolysate on growth nutrient digestibility and rumen fermentation of growing cattle fed grass silage Anim Feed Sci Tech 68 307-26 43 Picot L Bordenave S Didelot S Fruitier-Arnaudin I Sannier F Thorkelsson G Bergeacute J P Gueacuterard F Chabeaud A et Piot J M 2006 Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines Process Biochem 41 1217-22 44 Quaglia GB et Orban E 1987 Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysates from sardine (Sardina pilchardus) J Sci Food Agric 38 271-6 45 Rajapakse N Jung W K Mendis E Moon S H et Kim S K 2005 A novel anticoagulant purified from fish protein hydrolysate inhibits factor XIIa and platelet aggregation Life Sciences 76 2607-19 46 Ravallec-Pleacute R 2000 Valorisation dhydrolysats dorigine marine optimisation de la concentration en peptides apparenteacutes aux facteurs de croissance et aux agents seacutecreacutetagogues Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Bretagne Occidentale 47 Ravallec-Pleacute R et Van Wormhoudt A 2003 Secretagogue activities in cod (Gadus morhua) and shrimp (Penaeus aztecus) extracts and alcalase hydrolysates determined in AR4-2J pancreatic tumour cells Comp Biochem Physiol B 134 669-79 48 Rousseau M Batista I Le Gal Y et Fouchereau-Peacuteron M 2001 Purification of a functional competitive antagonist for calcitonin gene related peptide action from sardine hydrolysate EJB 4 25-32 49 Shahidi F Han X et Synowiecki J 1995 Production and characteristics of protein hydrolystaes from capelin (Mallotus villosus) Food Chem 53 285-93
79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE ndash DISCUSSION ET
RECOMMANDATION
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES 36
11 Mateacuteriel 36
111 Mateacuteriel biologique 36
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale 36
1112 Constitution des lots 37
112 Mateacuteriel enzymatique 37
113 Mateacuteriel technique 38
1131 Materiel de preacutelegravevement 38
1132 Mateacuteriel de laboratoire 38
12 Meacutethodes 39
121 Hydrolyse enzymatique 39
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses 40
1212 Hydrolyse courte dureacutee 41
122 Filtration 41
123 Centrifugation 41
124 La matiegravere segraveche 42
13 Analyses biochimiques 42
131 Deacutetermination de la teneur en eau 42
132 Dosage des proteacuteines totales 43
1321 Principe 43
1322 Mode opeacuteratoire 43
1323 Expression des reacutesultats 44
CHAPITRE 2 RESULTATS 45
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse 45
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes 45
18
19
2 3 Poids du culot et du surnageant 46
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant 47
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot 48
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS 49
31 Discussion 49
311 Discussion des reacutesultats 49
3111 La matiegravere segraveche 49
3113 Les proteacuteines 49
312 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes 50
3121 Lrsquohydrolyse enzymatique 50
3122 La matiegravere segraveche 51
3123 Le dosage des proteacuteines 51
32 Recommandations 54
CONCLUSION GENERALE 56
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 58
INTRODUCTION
Les oceacuteans constituent une richesse alimentaire tregraves diversifieacutee (poissons
algues crustaceacutes coquillages mollusques) Selon la FAO plus de 130 millions
de tonnes de poissons sont actuellement pecirccheacutes ou eacuteleveacutes chaque anneacutee dans le
monde
Les produits de la mer peuvent ecirctre consommeacutes frais congeleacutes seacutecheacutes ou encore
transformeacutes La politique environnementale actuelle incite de plus en plus les
industriels agrave prendre en comptes les deacutechets geacuteneacutereacutes par tous proceacutedeacutes de
transformation des poissons Crsquoest pourquoi apregraves lrsquoexploitation des parties
nobles des poissons des chercheurs se sont inteacuteresseacute aux co-produits Les co-
produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterables lors des
opeacuterations traditionnelles de production
Comme le montre le diagramme 1 la production de filet de la sole tropicale est
agrave lrsquoorigine de plusieurs sources de co-produits solides tecirctes viscegraveres carcasse
et peaux En effet des eacutetudes ont reacuteveacuteleacute que les co-produits de poissons sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecircts notamment les proteacuteines Un des
outils pour la reacutecupeacuteration efficace des proteacuteines des co-produits est lrsquohydrolyse
enzymatique elle est appliqueacutee pour ameacuteliorer les proprieacuteteacutes fonctionnelles et
alimentaires des proteacuteines Le but principal de lhydrolyse des co-produits de
poissons est dobtenir le reacutetablissement possible et maximum de tous les
composants valables tout en maintenant leurs qualiteacutes Ainsi le potentiel du
proceacutedeacute drsquohydrolyse enzymatique controcircleacutee sur les co-produits (tecirctes viscegraveres)
de la sole tropicale issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale en
filet de poisson va ecirctre eacutetudieacute durant ce travail
20
DEBARQUEMENT
RECEPTION LAVAGETRIAGE
PESEE
STOCKAGE EN CHAMBRE FROIDE (sous glace fondante)
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
PELAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration peaux
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
FILETAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration carcasse+ viscegraveres
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu jets dans des paniers)
TREMPAGE (eau glaceacutee et chloreacutee 2degC 1 agrave 2mn concentration 2ppm)
PARAGECONDITIONNEMENT (en films plastiques)
EMBALLAGE (caisses de polystyregravene)
PESEE
GLACcedilAGE (glace isoleacutee du produit)
SCELLAGE
ETIQUETAGE
ENTREPOSAGE REFRIGERE (0 - +4degC)
EXPEDITION
Diagramme 1 Principales eacutetapes de transformation de la sole tropicale en filet
21
Le but de ce travail est la libeacuteration et le dosage des proteacuteines des co-produits
de la sole tropicale De cet objectif geacuteneacuteral deacutecoule les objectifs speacutecifiques
suivants
Hydrolyser les co-produits (tecirctes viscegraveres) agrave lrsquoaide drsquoune proteacutease
Seacuteparer la phase soluble (surnageant) de la phase insoluble (culot) par
centrifugation
Obtenir la matiegravere segraveche de ces deux phases
Doser les proteacuteines totales agrave partir des matiegraveres segraveches obtenues
Pour reacutepondre agrave ces objectifs ce travail se deacuteclinera en deux parties ougrave des
eacuteleacutements de reacuteponses apparaicirctront Une premiegravere partie portant sur lrsquoeacutetude
bibliographique puis une deuxiegraveme partie preacutesentant les analyses effectueacutees et
les reacutesultats obtenus Faisant suite aux conclusions des perspectives seront
eacutemises pour la conduite de futurs travaux
22
PREMIERE PARTIE SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
23
CHAPITRE 1 Geacuteneacuteraliteacutes sur la pecircche au Seacuteneacutegal
11 Environnement naturel
Au large des cocirctes Seacuteneacutegalaises situeacutees agrave lrsquoextreacutemiteacute ouest du continent africain
se heurte le courant marin des canaries venu du Nord et des courants deacuteriveacutes du
courant du Golfe de Guineacutee Des upwellings(remonteacutee drsquoeau froides riches en
sels nutritifs le long de la pente du plateau continental) remontent eacutegalement de
la couche drsquoeau profonde le long de la pente du plateau continental La
tempeacuterature de lrsquoeau de mer en surface ne descend jamais en dessous de 15degC au
cours de lrsquoanneacutee Les fleuves Seacuteneacutegal Gambie et Casamance se jettent dans
lrsquooceacutean atlantique et apportent des sels mineacuteraux pendant lrsquohivernage De plus
du sable riche en sels inorganiques est apporteacute du deacutesert du Sahara par les vents
Le riche environnement naturel preacuteciteacute augmente la productiviteacute de la mer et
creacutee les pecirccheries classeacutees parmi les plus riches drsquoAfrique Des vents violents
qui soufflent au passage de lrsquohivernage agrave la saison segraveche et au passage de la
saison segraveche agrave lrsquohivernage rendent souvent la mer agiteacutee mais en geacuteneacuteral la
zone maritime est calme ce qui permet agrave la population de profiter en toute
seacutecuriteacute des bienfaits de la mer (DPM CRODT 2006)
12 Historique de la pecircche au Seacuteneacutegal
La pecircche a pendant longtemps eacuteteacute une activiteacute monopoliseacutee par certaines
ethnies
les Guet Ndariens de Saint-Louis situeacute agrave lrsquoembouchure du fleuve Seacuteneacutegal
les Lebous aux environs de Dakar
les Nyominka vivant principalement au Saloum
Ces ethnies ont utiliseacute des pecirccheries cocirctiegraveres sur une longueur drsquoenviron 2000
km allant des cocirctes de la Mauritanie au Nord agrave la cocircte de la Sierra Leone au
Sud en suivant le deacuteplacement saisonnier des bancs de poissons La pecircche
artisanale srsquoeffectuait sur des pirogues avec pagaies ou de petites embarcations agrave
24
voile Les captures eacutetaient fournies aux habitants de lrsquointeacuterieur du pays sous
formes de produits fumeacutes ou seacutecheacutes (DPM CRODT 2006)
Lrsquoancecirctre de la pirogue seacuteneacutegalaise remonterait au XVIe siegravecle Elle eacutetait
constitueacutee au deacutepart drsquoun simple tronc eacutevideacute propulseacute agrave la pagaie Vers le deacutebut
du XVIIe siegravecle on assiste agrave lrsquoapparition de la voile Les eacuteperons faisant office
de brise-lames et les bordes sont rajouteacutes au cours du siegravecle suivant Enfin le
moteur hors-bord apparaicirct vers 1950
On distingue deux saisons de production une saison de faible capture de juin
agrave octobre ougrave les volumes des produits diminuent et une saison de forte
production allant de novembre agrave juin Les captures de la pecircche artisanale sont
principalement des espegraveces peacutelagiques alors que les produits de la pecircche
industrielle sont des espegraveces benthiques
Selon la direction des pecircches maritimes (DPM 1996) du ministegravere de
lrsquoeacuteconomie maritime en 1996 lrsquoeffectif de la flottille seacuteneacutegalaise eacutetait le
suivant 11 600 pirogues dont 9 300 motoriseacutees (80) 212 chalutiers dont 60
chalutiers eacutetrangers (28) 6 sardiniers dont 2 sardiniers eacutetrangers (33) 62
thoniers eacutetrangers (97) Les principales prises sont les petits peacutelagiques
(sardinelles chinchards maquereaux) qui repreacutesentent 72 des prises Le reste
correspond agrave des espegraveces benthiques (crevettes ceacutephalopodes rougets dorades
soleshellip)
25
Figure1 Carte des villages cocirctiers de pecircche de la Reacutepublique du Seacuteneacutegal
(source Direction des pecircches maritimes 2003)
26
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees
Depuis trois deacutecennies le secteur de la pecircche a connu une forte croissance au
Seacuteneacutegal Les captures ont eacuteteacute multiplieacutees par huit en 32 ans Les deacutebarquements
des flottilles seacuteneacutegalaises et eacutetrangegraveres ont atteint en 1996 plus de 415 000
tonnes En 1997 le volume deacutebarqueacute est passeacute agrave 421 000 tonnes et en 1998 agrave
425 000 tonnes Cette eacutevolution eacutetant principalement lieacutee agrave lrsquoaugmentation des
petits peacutelagiques mis agrave terre par la pecircche artisanale
(DPM 2003)
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche
Au Seacuteneacutegal la pecircche maritime constitue un eacuteleacutement cleacute de lrsquoeacuteconomie avec une
production en valeur de 150 milliards de FCFA environ soit 2 du PIB national
et 16 du PIB du secteur primaire en 2003 Par ailleurs la population active
dans ce secteur est drsquoenviron 600 000 personnes en comptant lrsquoemploi direct et
indirect repreacutesentant environ 17 de la population active totale Les
exportations de produits halieutiques du pays eacutetaient drsquoenviron 2 milliards pour
130 000 tonnes en 2000 et mecircme ulteacuterieurement celles-ci continuaient de
constituer la plus importante source drsquoacquisition de devises du pays Ces
exportations permettent actuellement de payer pregraves de la moitieacute de la facture
peacutetroliegravere
(Ministegravere de lrsquoeacuteconomie et des finances direction de la deacutemographie et des
statistiques 2005)
Gracircce agrave leur disponibiliteacute les produits de la mer peuvent donc apparaicirctre comme
un apport nutritionnel tregraves important drsquoun point de vue alimentaire les produits
halieutiques contribuent pour 60 agrave lrsquoapport en proteacuteine animales des
populations Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de
proteacuteines couvrant 75 de leurs besoins En 1997 la consommation moyenne
annuelle de poisson au Seacuteneacutegal eacutetait de 26kg par habitant pour une
consommation mondiale de 135 kg par habitant (NDOYE ET COLL 2002)
27
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis
21 Nomenclature
Tableau I Nomenclature de la sole tropicale
Nom scientifique
Nom franccedilais En vernaculaire (en wolof)
Nom FAO Nom anglais
Cynoglossus senegalensis
Sole tropicale Tapaleacute Sole-langue Seacuteneacutegalaise
tongue sole
(SERET 1981)
22 Classification systeacutematique
Cynoglossus senegalensis est classeacute comme indiqueacute dans le tableau ci-dessous
Tableau II classification systeacutematique de la sole tropicale
Classe Osteacuteichtyens
Ordre Pleuronectiformes
Famille Cynoglossidae
Genre Cynoglossus
Espegravece senegalensis
(SERET 1981)
23 Caracteacuteristiques morphologiques
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae
Ce sont des poissons marins agrave corps plat diminuant progressivement de largeur
vers lrsquoarriegravere Les deux yeux assez petits sont situeacutes sur le cocircteacute gauche Le
museau est arrondi La bouche est petite infegravere plus au moins arqueacutee Le bord
du pregrave-opercule nrsquoest pas libre et est recouvert par la peau et des eacutecailles Il nrsquoy
a pas de rayons eacutepineux agrave la dorsale et agrave lrsquoanale La dorsale deacutebute en avant de
lrsquoœil dorsal Les rayons de la dorsale et de lrsquoanale sont confluents avec ceux de
28
la caudale qui se termine en pointe Les nageoires pectorales sont absentes ou
rudimentaires Seule la pelvienne de la face oculeacutee est preacutesente elle est situeacutee
sur la ligne meacutediane Le corps est recouvert par des eacutecailles cteacutenoiumldes ou
cycloiumldes (SERET 1981)
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis
Le corps est plat et allongeacute les nageoires dorsale et anale rejoignent la caudale
qui se termine en pointe Les yeux situeacutes sur le cocircteacute gauche du corps ont un
espace assez large entre eux Le museau est largement arrondi le crochet rostral
plutocirct court srsquoeacutetend jusqursquoau niveau de la narine anteacuterieure La bouche srsquoeacutetend
au-delagrave de lrsquoœil ventral La nageoire dorsale compte 119-125 rayons lrsquoanale 93-
99 rayons et la caudale 12 rayons On compte 124-138 eacutecailles tubuleacutees le long
de la ligne margino-dorsale Une ligne lateacuterale meacutediane est visible sur la face
aveugle
Sur la face oculeacutee le corps est plus ou moins uniformeacutement brun plus ou moins
fonceacute avec des reflets verdacirctres visibles sur le vivant la reacutegion de lrsquoopercule
est souvent noiracirctre La face aveugle est blanchacirctre
(SERET 1981)
Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
29
24 Reacutepartition geacuteographique
Cynoglossus senegalensis est une espegravece tregraves cocirctiegravere par rapport aux autres
espegraveces de la famille des cynoglossidae Elle freacutequente les zones sablo vaseuses
cocirctiegraveres entre 10 et 110 megravetres mais les prises maximales sont reacutealiseacutees entre 5
et 15 megravetres de profondeur Elle est connue de la Mauritanie agrave lrsquoAngola Les
reacutepartitions bathymeacutetriques de cette espegravece observeacutees au Seacuteneacutegal Togo-Benin
au Congo et au Cameroun sont similaires
(SERET 1981)
30
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson deacutefinition valorisation et
utilisation
31 Deacutefinition et composition
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
des opeacuterations traditionnelles de production
Les principaux co-produits de poisson rencontreacutes sont la tecircte la peau les
chutes de filetage les arecirctes centrales les viscegraveres le foie et selon les peacuteriodes
de pecircche les eacuteleacutements reproducteurs tels que les œufs ou la laitance (figure3)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
En vue drsquoune valorisation les co-produits sont traiteacutes selon le mecircme protocole
de conservation que les parties destineacutees agrave la production alimentaire
garantissant ainsi leur absence drsquoalteacuteration
32 les voies de valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes
Le produit deacuteriveacute est le produit commercial obtenu agrave partir drsquoun co-produit Un
co-produit pourra donner plusieurs produits deacuteriveacutes (figure4) Ainsi
la tecircte de poisson pourra ecirctre valoriseacutee en tant que farine de poisson huile
ou destineacutee agrave la nutrition
la chair sur les arecirctes en farine de poisson la chair hacheacutee et huile
31
la peau en farine de poisson collagegravene geacutelatine cuir
les viscegraveres en farine de poisson huile vitamines
la carcasse en farine de poisson collagegravene geacutelatine mineacuteraux
(GUERARD et Coll 2004)
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Ces produits sont qualifieacutes de produits deacuteriveacutes et non de produits finis car ils
sont geacuteneacuteralement commercialiseacutes sous forme drsquoingreacutedients crsquoest-agrave-dire sous
forme de produits intermeacutediaires pour la nutrition humaine animale pour la
dieacuteteacutetique la cosmeacutetique Neacuteanmoins certains co-produits (foies œufs) peuvent
ecirctre vendus agrave lrsquoeacutetat brut aux consommateurs Mais cette tendance est faible et ils
sont (foies œufs) plus utiliseacutes par les industries de conserverie et de saurisserie
(ANDRIEUX 2004)
On peut distinguer quatre (4) categories de produits deacuteriveacutes en fonction de leur
destination
lrsquoutilisation en nutrition humaine ou en alimentation animale
lrsquoutilisation en dieacuteteacutetique ou nutraceutique
32
lrsquoutilisation en cosmeacutetique
utilisation plus restreinte et speacutecifique drsquoun seul type de produit deacuteriveacute
Il existe plusieurs applications possibles des co-produits (figure5) parmi
lesquelles on peut citer
les farines et huiles de poisson
Cette valorisation est actuellement la plus importante car tous les co-produits
peuvent ecirctre utiliseacutes sans distinction Aucun tri nrsquoest neacutecessaire seule la
distinction co- produits issus de poissons sauvages ou drsquoeacutelevage doit ecirctre faite
les hachis
Les co-produits sont broyeacutes et filtreacutes puis le hachi obtenu est congeleacute en bloc
Les co-produits viscegraveres sont exclus de cette valorisation Les hachis sont
destineacutes agrave la fabrication drsquoaliments pour animaux domestiques essentiellement
les chats Ils sont souvent commercialiseacutes sous forme congeleacutee et sont une
bonne source de proteacuteines
les hydrolysats (cf 33)
la production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee (protides lipides)
La production de farine et drsquohuile de poisson repreacutesente toujours en tonnage la
voie de valorisation la plus importante des co-produits de la pecircche (figure 5)
Mais la faible valeur ajouteacutee obtenue avec ces produits incite les industriels agrave
rechercher des deacuteboucheacutes plus rentables productions de sauces de poisson
drsquoaromes de proteacuteines musculaires (surimi) sont autant de valorisation
alternative vers lrsquoindustrie agro-alimentaire (CHING 1999)
33
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
33 Les hydrolysats de poisson
331 Deacutefinition
Les hydrolysats sont des fractions agrave teneur proteacuteique eacuteleveacutee (73 agrave 85) obtenus
par autolyse (uniquement sous lrsquoaction drsquoenzymes endogegravenes) ou heacuteteacuterolyses
(ajout drsquoenzymes exogegravenes) Cependant la proportion en eacuteleacutements mineacuteraux est
assez faible car les arecirctes osseuses non hydrolysables ont eacuteteacute retireacutees Les
hydrolysats ont donc lrsquoavantage drsquoecirctre digeste et drsquoavoir une haute qualiteacute
nutritive
332 Les avantages
Les hydrolysats preacutesentent les mecircmes avantages que les matiegraveres premiegraveres
drsquoorigine animale pour lrsquoaquaculture sans en avoir les nombreux inconveacutenients
(LARBIER et LECLERCQ 1992 ANDERSON et coll 1993) En effet ce
sont des proteacuteines hydrolyseacutees les acides amineacutes essentiels libeacutereacutes sont donc
plus facilement disponibles et assimilables pour les animaux De plus ils
constituent un produit tregraves appeacutetant et parfaitement accepteacute gracircce agrave lrsquoarocircme de
34
poisson et preacutesente une granulomeacutetrie fine facilitant la fabrication drsquoaliments
suivant des proceacutedeacutes tels que la microparticulation (JONES 1995) Enfin les
hydrolysats comportent en geacuteneacuteral peu de mineacuteraux et ne risquent donc pas de
polluer les eaux des eacutelevages aquacoles leur bonne qualiteacute microbiologique
eacutetant assureacutee par la steacuterilisation au cours de la fabrication
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson
3331 En alimentation animale
Les hydrolysats de poisson sont utiliseacutes comme substitut du lait pour les bovins
et les ovins En comparaison avec la caseacuteine les animaux nourris avec les
hydrolysats de poisson gras apregraves un deacutebut de croissance plus lent arrivent au
mecircme poids au bout de quelques semaines (OslashRSKOV et Coll 1982
RITCHIE et MACKIE 1982) De plus une eacutetude eacuteconomique a montreacute les
inteacuterecircts des peptides de poisson en tant que substituts du lait (MERRITT
1982) Pour le beacutetail adulte lrsquoensilage obtenu agrave partir drsquoherbe peut ecirctre
eacutegalement remplaceacute par des hydrolysats de poisson (OUELLET et Coll 1997)
Mais crsquoest dans le domaine de lrsquoaquaculture que ces hydrolysats sont les plus
valoriseacutes En effet en aquaculture la charge reacutecurrente la plus importante est la
source proteacuteique apporteacutee aux animaux Les proteacuteines de poisson hydrolyseacutees
en plus de leur faible coucirct sont drsquoune grande digestibiliteacute De plus de
nombreuses eacutetudes ont montreacute que certains hydrolysats de poisson possegravedent des
proprieacuteteacutes nutraceutiques Ainsi le remplacement des farines de poisson par des
hydrolysats de poisson augmenterait la croissance des crevettes et des larves de
poisson (CORDOVA-MUREATA et GARCIA-CARRENO 2002)
35
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
9 Coacuterdova-Murueta JH et Garciacutea-Carreno FL 2002 Nutritive value of squid and hydrolyzed protein supplement in shrimp feed Aquaculture 210 371-84
75
10 Cuvellier GF 1999 Enzymologie et biocatalyse Dans Biotechnologie Paris Tec et Doc Lavoisier Paris 319-42 11 Dumay J 2006 Extraction de lipides en voie aqueuse par bioreacteur enzymatique combineacute agrave lrsquoultracentrifugation application agrave la valorisation de co-produits de poisson (Sardina pilchardus) Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute bioproceacutedeacutes et biotechnologies marines Lieu de soutenance Ecole Polytechnique de lrsquoUniversiteacute de Nantes 12 Dong YL Sheng G Y Fu J M et Wen K W 2005 Chemical characterization and antianaemia activity of fish protein hydrolysate from Saurida elongata J Sci Food Agric 85 2033-39 13 FAO 1998 The state of world fisheries and aquaculture Rome Italy 14 Fitzgerald AJ Rai P S Marchbank T Taylor G W Ghosh S Ritz B W et Playford R J 2005 Reparative properties of a commercial fish protein hydrolysate preparation Gut 54775-81 15 Gauthier D 2006 Introduction aux techniques utiliseacutees en biochimie le dosage des proteacuteines lten lignegt [accegraves internet] wwwchimiebiochimieumonctoncabchdgsiitubprodosage 16 Gildberg A 1993 Enzymic processing of marine raw materials Process Biochem 28 1-15 17 Gildberg A Brgwald J Johansen A et Stenberg E 1996 Isolation of acid peptide fractions from a fish protein hydrolysate with strong stimulatory effect on atlantic salmon (Salmo salar) head kidney leucocytes Comp Biochem Physiol 114 B 97-101 18 Gildberg A Arnesen J A et Carlehoumlg M 2002 Utilisation of cod backbone by biochemical fractionation Process Biochem 38 475-80
76
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79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
19
2 3 Poids du culot et du surnageant 46
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant 47
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot 48
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS 49
31 Discussion 49
311 Discussion des reacutesultats 49
3111 La matiegravere segraveche 49
3113 Les proteacuteines 49
312 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes 50
3121 Lrsquohydrolyse enzymatique 50
3122 La matiegravere segraveche 51
3123 Le dosage des proteacuteines 51
32 Recommandations 54
CONCLUSION GENERALE 56
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 58
INTRODUCTION
Les oceacuteans constituent une richesse alimentaire tregraves diversifieacutee (poissons
algues crustaceacutes coquillages mollusques) Selon la FAO plus de 130 millions
de tonnes de poissons sont actuellement pecirccheacutes ou eacuteleveacutes chaque anneacutee dans le
monde
Les produits de la mer peuvent ecirctre consommeacutes frais congeleacutes seacutecheacutes ou encore
transformeacutes La politique environnementale actuelle incite de plus en plus les
industriels agrave prendre en comptes les deacutechets geacuteneacutereacutes par tous proceacutedeacutes de
transformation des poissons Crsquoest pourquoi apregraves lrsquoexploitation des parties
nobles des poissons des chercheurs se sont inteacuteresseacute aux co-produits Les co-
produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterables lors des
opeacuterations traditionnelles de production
Comme le montre le diagramme 1 la production de filet de la sole tropicale est
agrave lrsquoorigine de plusieurs sources de co-produits solides tecirctes viscegraveres carcasse
et peaux En effet des eacutetudes ont reacuteveacuteleacute que les co-produits de poissons sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecircts notamment les proteacuteines Un des
outils pour la reacutecupeacuteration efficace des proteacuteines des co-produits est lrsquohydrolyse
enzymatique elle est appliqueacutee pour ameacuteliorer les proprieacuteteacutes fonctionnelles et
alimentaires des proteacuteines Le but principal de lhydrolyse des co-produits de
poissons est dobtenir le reacutetablissement possible et maximum de tous les
composants valables tout en maintenant leurs qualiteacutes Ainsi le potentiel du
proceacutedeacute drsquohydrolyse enzymatique controcircleacutee sur les co-produits (tecirctes viscegraveres)
de la sole tropicale issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale en
filet de poisson va ecirctre eacutetudieacute durant ce travail
20
DEBARQUEMENT
RECEPTION LAVAGETRIAGE
PESEE
STOCKAGE EN CHAMBRE FROIDE (sous glace fondante)
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
PELAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration peaux
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
FILETAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration carcasse+ viscegraveres
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu jets dans des paniers)
TREMPAGE (eau glaceacutee et chloreacutee 2degC 1 agrave 2mn concentration 2ppm)
PARAGECONDITIONNEMENT (en films plastiques)
EMBALLAGE (caisses de polystyregravene)
PESEE
GLACcedilAGE (glace isoleacutee du produit)
SCELLAGE
ETIQUETAGE
ENTREPOSAGE REFRIGERE (0 - +4degC)
EXPEDITION
Diagramme 1 Principales eacutetapes de transformation de la sole tropicale en filet
21
Le but de ce travail est la libeacuteration et le dosage des proteacuteines des co-produits
de la sole tropicale De cet objectif geacuteneacuteral deacutecoule les objectifs speacutecifiques
suivants
Hydrolyser les co-produits (tecirctes viscegraveres) agrave lrsquoaide drsquoune proteacutease
Seacuteparer la phase soluble (surnageant) de la phase insoluble (culot) par
centrifugation
Obtenir la matiegravere segraveche de ces deux phases
Doser les proteacuteines totales agrave partir des matiegraveres segraveches obtenues
Pour reacutepondre agrave ces objectifs ce travail se deacuteclinera en deux parties ougrave des
eacuteleacutements de reacuteponses apparaicirctront Une premiegravere partie portant sur lrsquoeacutetude
bibliographique puis une deuxiegraveme partie preacutesentant les analyses effectueacutees et
les reacutesultats obtenus Faisant suite aux conclusions des perspectives seront
eacutemises pour la conduite de futurs travaux
22
PREMIERE PARTIE SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
23
CHAPITRE 1 Geacuteneacuteraliteacutes sur la pecircche au Seacuteneacutegal
11 Environnement naturel
Au large des cocirctes Seacuteneacutegalaises situeacutees agrave lrsquoextreacutemiteacute ouest du continent africain
se heurte le courant marin des canaries venu du Nord et des courants deacuteriveacutes du
courant du Golfe de Guineacutee Des upwellings(remonteacutee drsquoeau froides riches en
sels nutritifs le long de la pente du plateau continental) remontent eacutegalement de
la couche drsquoeau profonde le long de la pente du plateau continental La
tempeacuterature de lrsquoeau de mer en surface ne descend jamais en dessous de 15degC au
cours de lrsquoanneacutee Les fleuves Seacuteneacutegal Gambie et Casamance se jettent dans
lrsquooceacutean atlantique et apportent des sels mineacuteraux pendant lrsquohivernage De plus
du sable riche en sels inorganiques est apporteacute du deacutesert du Sahara par les vents
Le riche environnement naturel preacuteciteacute augmente la productiviteacute de la mer et
creacutee les pecirccheries classeacutees parmi les plus riches drsquoAfrique Des vents violents
qui soufflent au passage de lrsquohivernage agrave la saison segraveche et au passage de la
saison segraveche agrave lrsquohivernage rendent souvent la mer agiteacutee mais en geacuteneacuteral la
zone maritime est calme ce qui permet agrave la population de profiter en toute
seacutecuriteacute des bienfaits de la mer (DPM CRODT 2006)
12 Historique de la pecircche au Seacuteneacutegal
La pecircche a pendant longtemps eacuteteacute une activiteacute monopoliseacutee par certaines
ethnies
les Guet Ndariens de Saint-Louis situeacute agrave lrsquoembouchure du fleuve Seacuteneacutegal
les Lebous aux environs de Dakar
les Nyominka vivant principalement au Saloum
Ces ethnies ont utiliseacute des pecirccheries cocirctiegraveres sur une longueur drsquoenviron 2000
km allant des cocirctes de la Mauritanie au Nord agrave la cocircte de la Sierra Leone au
Sud en suivant le deacuteplacement saisonnier des bancs de poissons La pecircche
artisanale srsquoeffectuait sur des pirogues avec pagaies ou de petites embarcations agrave
24
voile Les captures eacutetaient fournies aux habitants de lrsquointeacuterieur du pays sous
formes de produits fumeacutes ou seacutecheacutes (DPM CRODT 2006)
Lrsquoancecirctre de la pirogue seacuteneacutegalaise remonterait au XVIe siegravecle Elle eacutetait
constitueacutee au deacutepart drsquoun simple tronc eacutevideacute propulseacute agrave la pagaie Vers le deacutebut
du XVIIe siegravecle on assiste agrave lrsquoapparition de la voile Les eacuteperons faisant office
de brise-lames et les bordes sont rajouteacutes au cours du siegravecle suivant Enfin le
moteur hors-bord apparaicirct vers 1950
On distingue deux saisons de production une saison de faible capture de juin
agrave octobre ougrave les volumes des produits diminuent et une saison de forte
production allant de novembre agrave juin Les captures de la pecircche artisanale sont
principalement des espegraveces peacutelagiques alors que les produits de la pecircche
industrielle sont des espegraveces benthiques
Selon la direction des pecircches maritimes (DPM 1996) du ministegravere de
lrsquoeacuteconomie maritime en 1996 lrsquoeffectif de la flottille seacuteneacutegalaise eacutetait le
suivant 11 600 pirogues dont 9 300 motoriseacutees (80) 212 chalutiers dont 60
chalutiers eacutetrangers (28) 6 sardiniers dont 2 sardiniers eacutetrangers (33) 62
thoniers eacutetrangers (97) Les principales prises sont les petits peacutelagiques
(sardinelles chinchards maquereaux) qui repreacutesentent 72 des prises Le reste
correspond agrave des espegraveces benthiques (crevettes ceacutephalopodes rougets dorades
soleshellip)
25
Figure1 Carte des villages cocirctiers de pecircche de la Reacutepublique du Seacuteneacutegal
(source Direction des pecircches maritimes 2003)
26
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees
Depuis trois deacutecennies le secteur de la pecircche a connu une forte croissance au
Seacuteneacutegal Les captures ont eacuteteacute multiplieacutees par huit en 32 ans Les deacutebarquements
des flottilles seacuteneacutegalaises et eacutetrangegraveres ont atteint en 1996 plus de 415 000
tonnes En 1997 le volume deacutebarqueacute est passeacute agrave 421 000 tonnes et en 1998 agrave
425 000 tonnes Cette eacutevolution eacutetant principalement lieacutee agrave lrsquoaugmentation des
petits peacutelagiques mis agrave terre par la pecircche artisanale
(DPM 2003)
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche
Au Seacuteneacutegal la pecircche maritime constitue un eacuteleacutement cleacute de lrsquoeacuteconomie avec une
production en valeur de 150 milliards de FCFA environ soit 2 du PIB national
et 16 du PIB du secteur primaire en 2003 Par ailleurs la population active
dans ce secteur est drsquoenviron 600 000 personnes en comptant lrsquoemploi direct et
indirect repreacutesentant environ 17 de la population active totale Les
exportations de produits halieutiques du pays eacutetaient drsquoenviron 2 milliards pour
130 000 tonnes en 2000 et mecircme ulteacuterieurement celles-ci continuaient de
constituer la plus importante source drsquoacquisition de devises du pays Ces
exportations permettent actuellement de payer pregraves de la moitieacute de la facture
peacutetroliegravere
(Ministegravere de lrsquoeacuteconomie et des finances direction de la deacutemographie et des
statistiques 2005)
Gracircce agrave leur disponibiliteacute les produits de la mer peuvent donc apparaicirctre comme
un apport nutritionnel tregraves important drsquoun point de vue alimentaire les produits
halieutiques contribuent pour 60 agrave lrsquoapport en proteacuteine animales des
populations Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de
proteacuteines couvrant 75 de leurs besoins En 1997 la consommation moyenne
annuelle de poisson au Seacuteneacutegal eacutetait de 26kg par habitant pour une
consommation mondiale de 135 kg par habitant (NDOYE ET COLL 2002)
27
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis
21 Nomenclature
Tableau I Nomenclature de la sole tropicale
Nom scientifique
Nom franccedilais En vernaculaire (en wolof)
Nom FAO Nom anglais
Cynoglossus senegalensis
Sole tropicale Tapaleacute Sole-langue Seacuteneacutegalaise
tongue sole
(SERET 1981)
22 Classification systeacutematique
Cynoglossus senegalensis est classeacute comme indiqueacute dans le tableau ci-dessous
Tableau II classification systeacutematique de la sole tropicale
Classe Osteacuteichtyens
Ordre Pleuronectiformes
Famille Cynoglossidae
Genre Cynoglossus
Espegravece senegalensis
(SERET 1981)
23 Caracteacuteristiques morphologiques
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae
Ce sont des poissons marins agrave corps plat diminuant progressivement de largeur
vers lrsquoarriegravere Les deux yeux assez petits sont situeacutes sur le cocircteacute gauche Le
museau est arrondi La bouche est petite infegravere plus au moins arqueacutee Le bord
du pregrave-opercule nrsquoest pas libre et est recouvert par la peau et des eacutecailles Il nrsquoy
a pas de rayons eacutepineux agrave la dorsale et agrave lrsquoanale La dorsale deacutebute en avant de
lrsquoœil dorsal Les rayons de la dorsale et de lrsquoanale sont confluents avec ceux de
28
la caudale qui se termine en pointe Les nageoires pectorales sont absentes ou
rudimentaires Seule la pelvienne de la face oculeacutee est preacutesente elle est situeacutee
sur la ligne meacutediane Le corps est recouvert par des eacutecailles cteacutenoiumldes ou
cycloiumldes (SERET 1981)
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis
Le corps est plat et allongeacute les nageoires dorsale et anale rejoignent la caudale
qui se termine en pointe Les yeux situeacutes sur le cocircteacute gauche du corps ont un
espace assez large entre eux Le museau est largement arrondi le crochet rostral
plutocirct court srsquoeacutetend jusqursquoau niveau de la narine anteacuterieure La bouche srsquoeacutetend
au-delagrave de lrsquoœil ventral La nageoire dorsale compte 119-125 rayons lrsquoanale 93-
99 rayons et la caudale 12 rayons On compte 124-138 eacutecailles tubuleacutees le long
de la ligne margino-dorsale Une ligne lateacuterale meacutediane est visible sur la face
aveugle
Sur la face oculeacutee le corps est plus ou moins uniformeacutement brun plus ou moins
fonceacute avec des reflets verdacirctres visibles sur le vivant la reacutegion de lrsquoopercule
est souvent noiracirctre La face aveugle est blanchacirctre
(SERET 1981)
Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
29
24 Reacutepartition geacuteographique
Cynoglossus senegalensis est une espegravece tregraves cocirctiegravere par rapport aux autres
espegraveces de la famille des cynoglossidae Elle freacutequente les zones sablo vaseuses
cocirctiegraveres entre 10 et 110 megravetres mais les prises maximales sont reacutealiseacutees entre 5
et 15 megravetres de profondeur Elle est connue de la Mauritanie agrave lrsquoAngola Les
reacutepartitions bathymeacutetriques de cette espegravece observeacutees au Seacuteneacutegal Togo-Benin
au Congo et au Cameroun sont similaires
(SERET 1981)
30
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson deacutefinition valorisation et
utilisation
31 Deacutefinition et composition
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
des opeacuterations traditionnelles de production
Les principaux co-produits de poisson rencontreacutes sont la tecircte la peau les
chutes de filetage les arecirctes centrales les viscegraveres le foie et selon les peacuteriodes
de pecircche les eacuteleacutements reproducteurs tels que les œufs ou la laitance (figure3)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
En vue drsquoune valorisation les co-produits sont traiteacutes selon le mecircme protocole
de conservation que les parties destineacutees agrave la production alimentaire
garantissant ainsi leur absence drsquoalteacuteration
32 les voies de valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes
Le produit deacuteriveacute est le produit commercial obtenu agrave partir drsquoun co-produit Un
co-produit pourra donner plusieurs produits deacuteriveacutes (figure4) Ainsi
la tecircte de poisson pourra ecirctre valoriseacutee en tant que farine de poisson huile
ou destineacutee agrave la nutrition
la chair sur les arecirctes en farine de poisson la chair hacheacutee et huile
31
la peau en farine de poisson collagegravene geacutelatine cuir
les viscegraveres en farine de poisson huile vitamines
la carcasse en farine de poisson collagegravene geacutelatine mineacuteraux
(GUERARD et Coll 2004)
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Ces produits sont qualifieacutes de produits deacuteriveacutes et non de produits finis car ils
sont geacuteneacuteralement commercialiseacutes sous forme drsquoingreacutedients crsquoest-agrave-dire sous
forme de produits intermeacutediaires pour la nutrition humaine animale pour la
dieacuteteacutetique la cosmeacutetique Neacuteanmoins certains co-produits (foies œufs) peuvent
ecirctre vendus agrave lrsquoeacutetat brut aux consommateurs Mais cette tendance est faible et ils
sont (foies œufs) plus utiliseacutes par les industries de conserverie et de saurisserie
(ANDRIEUX 2004)
On peut distinguer quatre (4) categories de produits deacuteriveacutes en fonction de leur
destination
lrsquoutilisation en nutrition humaine ou en alimentation animale
lrsquoutilisation en dieacuteteacutetique ou nutraceutique
32
lrsquoutilisation en cosmeacutetique
utilisation plus restreinte et speacutecifique drsquoun seul type de produit deacuteriveacute
Il existe plusieurs applications possibles des co-produits (figure5) parmi
lesquelles on peut citer
les farines et huiles de poisson
Cette valorisation est actuellement la plus importante car tous les co-produits
peuvent ecirctre utiliseacutes sans distinction Aucun tri nrsquoest neacutecessaire seule la
distinction co- produits issus de poissons sauvages ou drsquoeacutelevage doit ecirctre faite
les hachis
Les co-produits sont broyeacutes et filtreacutes puis le hachi obtenu est congeleacute en bloc
Les co-produits viscegraveres sont exclus de cette valorisation Les hachis sont
destineacutes agrave la fabrication drsquoaliments pour animaux domestiques essentiellement
les chats Ils sont souvent commercialiseacutes sous forme congeleacutee et sont une
bonne source de proteacuteines
les hydrolysats (cf 33)
la production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee (protides lipides)
La production de farine et drsquohuile de poisson repreacutesente toujours en tonnage la
voie de valorisation la plus importante des co-produits de la pecircche (figure 5)
Mais la faible valeur ajouteacutee obtenue avec ces produits incite les industriels agrave
rechercher des deacuteboucheacutes plus rentables productions de sauces de poisson
drsquoaromes de proteacuteines musculaires (surimi) sont autant de valorisation
alternative vers lrsquoindustrie agro-alimentaire (CHING 1999)
33
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
33 Les hydrolysats de poisson
331 Deacutefinition
Les hydrolysats sont des fractions agrave teneur proteacuteique eacuteleveacutee (73 agrave 85) obtenus
par autolyse (uniquement sous lrsquoaction drsquoenzymes endogegravenes) ou heacuteteacuterolyses
(ajout drsquoenzymes exogegravenes) Cependant la proportion en eacuteleacutements mineacuteraux est
assez faible car les arecirctes osseuses non hydrolysables ont eacuteteacute retireacutees Les
hydrolysats ont donc lrsquoavantage drsquoecirctre digeste et drsquoavoir une haute qualiteacute
nutritive
332 Les avantages
Les hydrolysats preacutesentent les mecircmes avantages que les matiegraveres premiegraveres
drsquoorigine animale pour lrsquoaquaculture sans en avoir les nombreux inconveacutenients
(LARBIER et LECLERCQ 1992 ANDERSON et coll 1993) En effet ce
sont des proteacuteines hydrolyseacutees les acides amineacutes essentiels libeacutereacutes sont donc
plus facilement disponibles et assimilables pour les animaux De plus ils
constituent un produit tregraves appeacutetant et parfaitement accepteacute gracircce agrave lrsquoarocircme de
34
poisson et preacutesente une granulomeacutetrie fine facilitant la fabrication drsquoaliments
suivant des proceacutedeacutes tels que la microparticulation (JONES 1995) Enfin les
hydrolysats comportent en geacuteneacuteral peu de mineacuteraux et ne risquent donc pas de
polluer les eaux des eacutelevages aquacoles leur bonne qualiteacute microbiologique
eacutetant assureacutee par la steacuterilisation au cours de la fabrication
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson
3331 En alimentation animale
Les hydrolysats de poisson sont utiliseacutes comme substitut du lait pour les bovins
et les ovins En comparaison avec la caseacuteine les animaux nourris avec les
hydrolysats de poisson gras apregraves un deacutebut de croissance plus lent arrivent au
mecircme poids au bout de quelques semaines (OslashRSKOV et Coll 1982
RITCHIE et MACKIE 1982) De plus une eacutetude eacuteconomique a montreacute les
inteacuterecircts des peptides de poisson en tant que substituts du lait (MERRITT
1982) Pour le beacutetail adulte lrsquoensilage obtenu agrave partir drsquoherbe peut ecirctre
eacutegalement remplaceacute par des hydrolysats de poisson (OUELLET et Coll 1997)
Mais crsquoest dans le domaine de lrsquoaquaculture que ces hydrolysats sont les plus
valoriseacutes En effet en aquaculture la charge reacutecurrente la plus importante est la
source proteacuteique apporteacutee aux animaux Les proteacuteines de poisson hydrolyseacutees
en plus de leur faible coucirct sont drsquoune grande digestibiliteacute De plus de
nombreuses eacutetudes ont montreacute que certains hydrolysats de poisson possegravedent des
proprieacuteteacutes nutraceutiques Ainsi le remplacement des farines de poisson par des
hydrolysats de poisson augmenterait la croissance des crevettes et des larves de
poisson (CORDOVA-MUREATA et GARCIA-CARRENO 2002)
35
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
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80
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SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
INTRODUCTION
Les oceacuteans constituent une richesse alimentaire tregraves diversifieacutee (poissons
algues crustaceacutes coquillages mollusques) Selon la FAO plus de 130 millions
de tonnes de poissons sont actuellement pecirccheacutes ou eacuteleveacutes chaque anneacutee dans le
monde
Les produits de la mer peuvent ecirctre consommeacutes frais congeleacutes seacutecheacutes ou encore
transformeacutes La politique environnementale actuelle incite de plus en plus les
industriels agrave prendre en comptes les deacutechets geacuteneacutereacutes par tous proceacutedeacutes de
transformation des poissons Crsquoest pourquoi apregraves lrsquoexploitation des parties
nobles des poissons des chercheurs se sont inteacuteresseacute aux co-produits Les co-
produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterables lors des
opeacuterations traditionnelles de production
Comme le montre le diagramme 1 la production de filet de la sole tropicale est
agrave lrsquoorigine de plusieurs sources de co-produits solides tecirctes viscegraveres carcasse
et peaux En effet des eacutetudes ont reacuteveacuteleacute que les co-produits de poissons sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecircts notamment les proteacuteines Un des
outils pour la reacutecupeacuteration efficace des proteacuteines des co-produits est lrsquohydrolyse
enzymatique elle est appliqueacutee pour ameacuteliorer les proprieacuteteacutes fonctionnelles et
alimentaires des proteacuteines Le but principal de lhydrolyse des co-produits de
poissons est dobtenir le reacutetablissement possible et maximum de tous les
composants valables tout en maintenant leurs qualiteacutes Ainsi le potentiel du
proceacutedeacute drsquohydrolyse enzymatique controcircleacutee sur les co-produits (tecirctes viscegraveres)
de la sole tropicale issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale en
filet de poisson va ecirctre eacutetudieacute durant ce travail
20
DEBARQUEMENT
RECEPTION LAVAGETRIAGE
PESEE
STOCKAGE EN CHAMBRE FROIDE (sous glace fondante)
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
PELAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration peaux
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
FILETAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration carcasse+ viscegraveres
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu jets dans des paniers)
TREMPAGE (eau glaceacutee et chloreacutee 2degC 1 agrave 2mn concentration 2ppm)
PARAGECONDITIONNEMENT (en films plastiques)
EMBALLAGE (caisses de polystyregravene)
PESEE
GLACcedilAGE (glace isoleacutee du produit)
SCELLAGE
ETIQUETAGE
ENTREPOSAGE REFRIGERE (0 - +4degC)
EXPEDITION
Diagramme 1 Principales eacutetapes de transformation de la sole tropicale en filet
21
Le but de ce travail est la libeacuteration et le dosage des proteacuteines des co-produits
de la sole tropicale De cet objectif geacuteneacuteral deacutecoule les objectifs speacutecifiques
suivants
Hydrolyser les co-produits (tecirctes viscegraveres) agrave lrsquoaide drsquoune proteacutease
Seacuteparer la phase soluble (surnageant) de la phase insoluble (culot) par
centrifugation
Obtenir la matiegravere segraveche de ces deux phases
Doser les proteacuteines totales agrave partir des matiegraveres segraveches obtenues
Pour reacutepondre agrave ces objectifs ce travail se deacuteclinera en deux parties ougrave des
eacuteleacutements de reacuteponses apparaicirctront Une premiegravere partie portant sur lrsquoeacutetude
bibliographique puis une deuxiegraveme partie preacutesentant les analyses effectueacutees et
les reacutesultats obtenus Faisant suite aux conclusions des perspectives seront
eacutemises pour la conduite de futurs travaux
22
PREMIERE PARTIE SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
23
CHAPITRE 1 Geacuteneacuteraliteacutes sur la pecircche au Seacuteneacutegal
11 Environnement naturel
Au large des cocirctes Seacuteneacutegalaises situeacutees agrave lrsquoextreacutemiteacute ouest du continent africain
se heurte le courant marin des canaries venu du Nord et des courants deacuteriveacutes du
courant du Golfe de Guineacutee Des upwellings(remonteacutee drsquoeau froides riches en
sels nutritifs le long de la pente du plateau continental) remontent eacutegalement de
la couche drsquoeau profonde le long de la pente du plateau continental La
tempeacuterature de lrsquoeau de mer en surface ne descend jamais en dessous de 15degC au
cours de lrsquoanneacutee Les fleuves Seacuteneacutegal Gambie et Casamance se jettent dans
lrsquooceacutean atlantique et apportent des sels mineacuteraux pendant lrsquohivernage De plus
du sable riche en sels inorganiques est apporteacute du deacutesert du Sahara par les vents
Le riche environnement naturel preacuteciteacute augmente la productiviteacute de la mer et
creacutee les pecirccheries classeacutees parmi les plus riches drsquoAfrique Des vents violents
qui soufflent au passage de lrsquohivernage agrave la saison segraveche et au passage de la
saison segraveche agrave lrsquohivernage rendent souvent la mer agiteacutee mais en geacuteneacuteral la
zone maritime est calme ce qui permet agrave la population de profiter en toute
seacutecuriteacute des bienfaits de la mer (DPM CRODT 2006)
12 Historique de la pecircche au Seacuteneacutegal
La pecircche a pendant longtemps eacuteteacute une activiteacute monopoliseacutee par certaines
ethnies
les Guet Ndariens de Saint-Louis situeacute agrave lrsquoembouchure du fleuve Seacuteneacutegal
les Lebous aux environs de Dakar
les Nyominka vivant principalement au Saloum
Ces ethnies ont utiliseacute des pecirccheries cocirctiegraveres sur une longueur drsquoenviron 2000
km allant des cocirctes de la Mauritanie au Nord agrave la cocircte de la Sierra Leone au
Sud en suivant le deacuteplacement saisonnier des bancs de poissons La pecircche
artisanale srsquoeffectuait sur des pirogues avec pagaies ou de petites embarcations agrave
24
voile Les captures eacutetaient fournies aux habitants de lrsquointeacuterieur du pays sous
formes de produits fumeacutes ou seacutecheacutes (DPM CRODT 2006)
Lrsquoancecirctre de la pirogue seacuteneacutegalaise remonterait au XVIe siegravecle Elle eacutetait
constitueacutee au deacutepart drsquoun simple tronc eacutevideacute propulseacute agrave la pagaie Vers le deacutebut
du XVIIe siegravecle on assiste agrave lrsquoapparition de la voile Les eacuteperons faisant office
de brise-lames et les bordes sont rajouteacutes au cours du siegravecle suivant Enfin le
moteur hors-bord apparaicirct vers 1950
On distingue deux saisons de production une saison de faible capture de juin
agrave octobre ougrave les volumes des produits diminuent et une saison de forte
production allant de novembre agrave juin Les captures de la pecircche artisanale sont
principalement des espegraveces peacutelagiques alors que les produits de la pecircche
industrielle sont des espegraveces benthiques
Selon la direction des pecircches maritimes (DPM 1996) du ministegravere de
lrsquoeacuteconomie maritime en 1996 lrsquoeffectif de la flottille seacuteneacutegalaise eacutetait le
suivant 11 600 pirogues dont 9 300 motoriseacutees (80) 212 chalutiers dont 60
chalutiers eacutetrangers (28) 6 sardiniers dont 2 sardiniers eacutetrangers (33) 62
thoniers eacutetrangers (97) Les principales prises sont les petits peacutelagiques
(sardinelles chinchards maquereaux) qui repreacutesentent 72 des prises Le reste
correspond agrave des espegraveces benthiques (crevettes ceacutephalopodes rougets dorades
soleshellip)
25
Figure1 Carte des villages cocirctiers de pecircche de la Reacutepublique du Seacuteneacutegal
(source Direction des pecircches maritimes 2003)
26
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees
Depuis trois deacutecennies le secteur de la pecircche a connu une forte croissance au
Seacuteneacutegal Les captures ont eacuteteacute multiplieacutees par huit en 32 ans Les deacutebarquements
des flottilles seacuteneacutegalaises et eacutetrangegraveres ont atteint en 1996 plus de 415 000
tonnes En 1997 le volume deacutebarqueacute est passeacute agrave 421 000 tonnes et en 1998 agrave
425 000 tonnes Cette eacutevolution eacutetant principalement lieacutee agrave lrsquoaugmentation des
petits peacutelagiques mis agrave terre par la pecircche artisanale
(DPM 2003)
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche
Au Seacuteneacutegal la pecircche maritime constitue un eacuteleacutement cleacute de lrsquoeacuteconomie avec une
production en valeur de 150 milliards de FCFA environ soit 2 du PIB national
et 16 du PIB du secteur primaire en 2003 Par ailleurs la population active
dans ce secteur est drsquoenviron 600 000 personnes en comptant lrsquoemploi direct et
indirect repreacutesentant environ 17 de la population active totale Les
exportations de produits halieutiques du pays eacutetaient drsquoenviron 2 milliards pour
130 000 tonnes en 2000 et mecircme ulteacuterieurement celles-ci continuaient de
constituer la plus importante source drsquoacquisition de devises du pays Ces
exportations permettent actuellement de payer pregraves de la moitieacute de la facture
peacutetroliegravere
(Ministegravere de lrsquoeacuteconomie et des finances direction de la deacutemographie et des
statistiques 2005)
Gracircce agrave leur disponibiliteacute les produits de la mer peuvent donc apparaicirctre comme
un apport nutritionnel tregraves important drsquoun point de vue alimentaire les produits
halieutiques contribuent pour 60 agrave lrsquoapport en proteacuteine animales des
populations Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de
proteacuteines couvrant 75 de leurs besoins En 1997 la consommation moyenne
annuelle de poisson au Seacuteneacutegal eacutetait de 26kg par habitant pour une
consommation mondiale de 135 kg par habitant (NDOYE ET COLL 2002)
27
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis
21 Nomenclature
Tableau I Nomenclature de la sole tropicale
Nom scientifique
Nom franccedilais En vernaculaire (en wolof)
Nom FAO Nom anglais
Cynoglossus senegalensis
Sole tropicale Tapaleacute Sole-langue Seacuteneacutegalaise
tongue sole
(SERET 1981)
22 Classification systeacutematique
Cynoglossus senegalensis est classeacute comme indiqueacute dans le tableau ci-dessous
Tableau II classification systeacutematique de la sole tropicale
Classe Osteacuteichtyens
Ordre Pleuronectiformes
Famille Cynoglossidae
Genre Cynoglossus
Espegravece senegalensis
(SERET 1981)
23 Caracteacuteristiques morphologiques
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae
Ce sont des poissons marins agrave corps plat diminuant progressivement de largeur
vers lrsquoarriegravere Les deux yeux assez petits sont situeacutes sur le cocircteacute gauche Le
museau est arrondi La bouche est petite infegravere plus au moins arqueacutee Le bord
du pregrave-opercule nrsquoest pas libre et est recouvert par la peau et des eacutecailles Il nrsquoy
a pas de rayons eacutepineux agrave la dorsale et agrave lrsquoanale La dorsale deacutebute en avant de
lrsquoœil dorsal Les rayons de la dorsale et de lrsquoanale sont confluents avec ceux de
28
la caudale qui se termine en pointe Les nageoires pectorales sont absentes ou
rudimentaires Seule la pelvienne de la face oculeacutee est preacutesente elle est situeacutee
sur la ligne meacutediane Le corps est recouvert par des eacutecailles cteacutenoiumldes ou
cycloiumldes (SERET 1981)
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis
Le corps est plat et allongeacute les nageoires dorsale et anale rejoignent la caudale
qui se termine en pointe Les yeux situeacutes sur le cocircteacute gauche du corps ont un
espace assez large entre eux Le museau est largement arrondi le crochet rostral
plutocirct court srsquoeacutetend jusqursquoau niveau de la narine anteacuterieure La bouche srsquoeacutetend
au-delagrave de lrsquoœil ventral La nageoire dorsale compte 119-125 rayons lrsquoanale 93-
99 rayons et la caudale 12 rayons On compte 124-138 eacutecailles tubuleacutees le long
de la ligne margino-dorsale Une ligne lateacuterale meacutediane est visible sur la face
aveugle
Sur la face oculeacutee le corps est plus ou moins uniformeacutement brun plus ou moins
fonceacute avec des reflets verdacirctres visibles sur le vivant la reacutegion de lrsquoopercule
est souvent noiracirctre La face aveugle est blanchacirctre
(SERET 1981)
Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
29
24 Reacutepartition geacuteographique
Cynoglossus senegalensis est une espegravece tregraves cocirctiegravere par rapport aux autres
espegraveces de la famille des cynoglossidae Elle freacutequente les zones sablo vaseuses
cocirctiegraveres entre 10 et 110 megravetres mais les prises maximales sont reacutealiseacutees entre 5
et 15 megravetres de profondeur Elle est connue de la Mauritanie agrave lrsquoAngola Les
reacutepartitions bathymeacutetriques de cette espegravece observeacutees au Seacuteneacutegal Togo-Benin
au Congo et au Cameroun sont similaires
(SERET 1981)
30
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson deacutefinition valorisation et
utilisation
31 Deacutefinition et composition
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
des opeacuterations traditionnelles de production
Les principaux co-produits de poisson rencontreacutes sont la tecircte la peau les
chutes de filetage les arecirctes centrales les viscegraveres le foie et selon les peacuteriodes
de pecircche les eacuteleacutements reproducteurs tels que les œufs ou la laitance (figure3)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
En vue drsquoune valorisation les co-produits sont traiteacutes selon le mecircme protocole
de conservation que les parties destineacutees agrave la production alimentaire
garantissant ainsi leur absence drsquoalteacuteration
32 les voies de valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes
Le produit deacuteriveacute est le produit commercial obtenu agrave partir drsquoun co-produit Un
co-produit pourra donner plusieurs produits deacuteriveacutes (figure4) Ainsi
la tecircte de poisson pourra ecirctre valoriseacutee en tant que farine de poisson huile
ou destineacutee agrave la nutrition
la chair sur les arecirctes en farine de poisson la chair hacheacutee et huile
31
la peau en farine de poisson collagegravene geacutelatine cuir
les viscegraveres en farine de poisson huile vitamines
la carcasse en farine de poisson collagegravene geacutelatine mineacuteraux
(GUERARD et Coll 2004)
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Ces produits sont qualifieacutes de produits deacuteriveacutes et non de produits finis car ils
sont geacuteneacuteralement commercialiseacutes sous forme drsquoingreacutedients crsquoest-agrave-dire sous
forme de produits intermeacutediaires pour la nutrition humaine animale pour la
dieacuteteacutetique la cosmeacutetique Neacuteanmoins certains co-produits (foies œufs) peuvent
ecirctre vendus agrave lrsquoeacutetat brut aux consommateurs Mais cette tendance est faible et ils
sont (foies œufs) plus utiliseacutes par les industries de conserverie et de saurisserie
(ANDRIEUX 2004)
On peut distinguer quatre (4) categories de produits deacuteriveacutes en fonction de leur
destination
lrsquoutilisation en nutrition humaine ou en alimentation animale
lrsquoutilisation en dieacuteteacutetique ou nutraceutique
32
lrsquoutilisation en cosmeacutetique
utilisation plus restreinte et speacutecifique drsquoun seul type de produit deacuteriveacute
Il existe plusieurs applications possibles des co-produits (figure5) parmi
lesquelles on peut citer
les farines et huiles de poisson
Cette valorisation est actuellement la plus importante car tous les co-produits
peuvent ecirctre utiliseacutes sans distinction Aucun tri nrsquoest neacutecessaire seule la
distinction co- produits issus de poissons sauvages ou drsquoeacutelevage doit ecirctre faite
les hachis
Les co-produits sont broyeacutes et filtreacutes puis le hachi obtenu est congeleacute en bloc
Les co-produits viscegraveres sont exclus de cette valorisation Les hachis sont
destineacutes agrave la fabrication drsquoaliments pour animaux domestiques essentiellement
les chats Ils sont souvent commercialiseacutes sous forme congeleacutee et sont une
bonne source de proteacuteines
les hydrolysats (cf 33)
la production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee (protides lipides)
La production de farine et drsquohuile de poisson repreacutesente toujours en tonnage la
voie de valorisation la plus importante des co-produits de la pecircche (figure 5)
Mais la faible valeur ajouteacutee obtenue avec ces produits incite les industriels agrave
rechercher des deacuteboucheacutes plus rentables productions de sauces de poisson
drsquoaromes de proteacuteines musculaires (surimi) sont autant de valorisation
alternative vers lrsquoindustrie agro-alimentaire (CHING 1999)
33
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
33 Les hydrolysats de poisson
331 Deacutefinition
Les hydrolysats sont des fractions agrave teneur proteacuteique eacuteleveacutee (73 agrave 85) obtenus
par autolyse (uniquement sous lrsquoaction drsquoenzymes endogegravenes) ou heacuteteacuterolyses
(ajout drsquoenzymes exogegravenes) Cependant la proportion en eacuteleacutements mineacuteraux est
assez faible car les arecirctes osseuses non hydrolysables ont eacuteteacute retireacutees Les
hydrolysats ont donc lrsquoavantage drsquoecirctre digeste et drsquoavoir une haute qualiteacute
nutritive
332 Les avantages
Les hydrolysats preacutesentent les mecircmes avantages que les matiegraveres premiegraveres
drsquoorigine animale pour lrsquoaquaculture sans en avoir les nombreux inconveacutenients
(LARBIER et LECLERCQ 1992 ANDERSON et coll 1993) En effet ce
sont des proteacuteines hydrolyseacutees les acides amineacutes essentiels libeacutereacutes sont donc
plus facilement disponibles et assimilables pour les animaux De plus ils
constituent un produit tregraves appeacutetant et parfaitement accepteacute gracircce agrave lrsquoarocircme de
34
poisson et preacutesente une granulomeacutetrie fine facilitant la fabrication drsquoaliments
suivant des proceacutedeacutes tels que la microparticulation (JONES 1995) Enfin les
hydrolysats comportent en geacuteneacuteral peu de mineacuteraux et ne risquent donc pas de
polluer les eaux des eacutelevages aquacoles leur bonne qualiteacute microbiologique
eacutetant assureacutee par la steacuterilisation au cours de la fabrication
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson
3331 En alimentation animale
Les hydrolysats de poisson sont utiliseacutes comme substitut du lait pour les bovins
et les ovins En comparaison avec la caseacuteine les animaux nourris avec les
hydrolysats de poisson gras apregraves un deacutebut de croissance plus lent arrivent au
mecircme poids au bout de quelques semaines (OslashRSKOV et Coll 1982
RITCHIE et MACKIE 1982) De plus une eacutetude eacuteconomique a montreacute les
inteacuterecircts des peptides de poisson en tant que substituts du lait (MERRITT
1982) Pour le beacutetail adulte lrsquoensilage obtenu agrave partir drsquoherbe peut ecirctre
eacutegalement remplaceacute par des hydrolysats de poisson (OUELLET et Coll 1997)
Mais crsquoest dans le domaine de lrsquoaquaculture que ces hydrolysats sont les plus
valoriseacutes En effet en aquaculture la charge reacutecurrente la plus importante est la
source proteacuteique apporteacutee aux animaux Les proteacuteines de poisson hydrolyseacutees
en plus de leur faible coucirct sont drsquoune grande digestibiliteacute De plus de
nombreuses eacutetudes ont montreacute que certains hydrolysats de poisson possegravedent des
proprieacuteteacutes nutraceutiques Ainsi le remplacement des farines de poisson par des
hydrolysats de poisson augmenterait la croissance des crevettes et des larves de
poisson (CORDOVA-MUREATA et GARCIA-CARRENO 2002)
35
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
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SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
DEBARQUEMENT
RECEPTION LAVAGETRIAGE
PESEE
STOCKAGE EN CHAMBRE FROIDE (sous glace fondante)
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
PELAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration peaux
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu)
FILETAGE (manuel ou meacutecanique) reacutecupeacuteration carcasse+ viscegraveres
LAVAGE (eau chloreacutee sous eacutecoulement continu jets dans des paniers)
TREMPAGE (eau glaceacutee et chloreacutee 2degC 1 agrave 2mn concentration 2ppm)
PARAGECONDITIONNEMENT (en films plastiques)
EMBALLAGE (caisses de polystyregravene)
PESEE
GLACcedilAGE (glace isoleacutee du produit)
SCELLAGE
ETIQUETAGE
ENTREPOSAGE REFRIGERE (0 - +4degC)
EXPEDITION
Diagramme 1 Principales eacutetapes de transformation de la sole tropicale en filet
21
Le but de ce travail est la libeacuteration et le dosage des proteacuteines des co-produits
de la sole tropicale De cet objectif geacuteneacuteral deacutecoule les objectifs speacutecifiques
suivants
Hydrolyser les co-produits (tecirctes viscegraveres) agrave lrsquoaide drsquoune proteacutease
Seacuteparer la phase soluble (surnageant) de la phase insoluble (culot) par
centrifugation
Obtenir la matiegravere segraveche de ces deux phases
Doser les proteacuteines totales agrave partir des matiegraveres segraveches obtenues
Pour reacutepondre agrave ces objectifs ce travail se deacuteclinera en deux parties ougrave des
eacuteleacutements de reacuteponses apparaicirctront Une premiegravere partie portant sur lrsquoeacutetude
bibliographique puis une deuxiegraveme partie preacutesentant les analyses effectueacutees et
les reacutesultats obtenus Faisant suite aux conclusions des perspectives seront
eacutemises pour la conduite de futurs travaux
22
PREMIERE PARTIE SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
23
CHAPITRE 1 Geacuteneacuteraliteacutes sur la pecircche au Seacuteneacutegal
11 Environnement naturel
Au large des cocirctes Seacuteneacutegalaises situeacutees agrave lrsquoextreacutemiteacute ouest du continent africain
se heurte le courant marin des canaries venu du Nord et des courants deacuteriveacutes du
courant du Golfe de Guineacutee Des upwellings(remonteacutee drsquoeau froides riches en
sels nutritifs le long de la pente du plateau continental) remontent eacutegalement de
la couche drsquoeau profonde le long de la pente du plateau continental La
tempeacuterature de lrsquoeau de mer en surface ne descend jamais en dessous de 15degC au
cours de lrsquoanneacutee Les fleuves Seacuteneacutegal Gambie et Casamance se jettent dans
lrsquooceacutean atlantique et apportent des sels mineacuteraux pendant lrsquohivernage De plus
du sable riche en sels inorganiques est apporteacute du deacutesert du Sahara par les vents
Le riche environnement naturel preacuteciteacute augmente la productiviteacute de la mer et
creacutee les pecirccheries classeacutees parmi les plus riches drsquoAfrique Des vents violents
qui soufflent au passage de lrsquohivernage agrave la saison segraveche et au passage de la
saison segraveche agrave lrsquohivernage rendent souvent la mer agiteacutee mais en geacuteneacuteral la
zone maritime est calme ce qui permet agrave la population de profiter en toute
seacutecuriteacute des bienfaits de la mer (DPM CRODT 2006)
12 Historique de la pecircche au Seacuteneacutegal
La pecircche a pendant longtemps eacuteteacute une activiteacute monopoliseacutee par certaines
ethnies
les Guet Ndariens de Saint-Louis situeacute agrave lrsquoembouchure du fleuve Seacuteneacutegal
les Lebous aux environs de Dakar
les Nyominka vivant principalement au Saloum
Ces ethnies ont utiliseacute des pecirccheries cocirctiegraveres sur une longueur drsquoenviron 2000
km allant des cocirctes de la Mauritanie au Nord agrave la cocircte de la Sierra Leone au
Sud en suivant le deacuteplacement saisonnier des bancs de poissons La pecircche
artisanale srsquoeffectuait sur des pirogues avec pagaies ou de petites embarcations agrave
24
voile Les captures eacutetaient fournies aux habitants de lrsquointeacuterieur du pays sous
formes de produits fumeacutes ou seacutecheacutes (DPM CRODT 2006)
Lrsquoancecirctre de la pirogue seacuteneacutegalaise remonterait au XVIe siegravecle Elle eacutetait
constitueacutee au deacutepart drsquoun simple tronc eacutevideacute propulseacute agrave la pagaie Vers le deacutebut
du XVIIe siegravecle on assiste agrave lrsquoapparition de la voile Les eacuteperons faisant office
de brise-lames et les bordes sont rajouteacutes au cours du siegravecle suivant Enfin le
moteur hors-bord apparaicirct vers 1950
On distingue deux saisons de production une saison de faible capture de juin
agrave octobre ougrave les volumes des produits diminuent et une saison de forte
production allant de novembre agrave juin Les captures de la pecircche artisanale sont
principalement des espegraveces peacutelagiques alors que les produits de la pecircche
industrielle sont des espegraveces benthiques
Selon la direction des pecircches maritimes (DPM 1996) du ministegravere de
lrsquoeacuteconomie maritime en 1996 lrsquoeffectif de la flottille seacuteneacutegalaise eacutetait le
suivant 11 600 pirogues dont 9 300 motoriseacutees (80) 212 chalutiers dont 60
chalutiers eacutetrangers (28) 6 sardiniers dont 2 sardiniers eacutetrangers (33) 62
thoniers eacutetrangers (97) Les principales prises sont les petits peacutelagiques
(sardinelles chinchards maquereaux) qui repreacutesentent 72 des prises Le reste
correspond agrave des espegraveces benthiques (crevettes ceacutephalopodes rougets dorades
soleshellip)
25
Figure1 Carte des villages cocirctiers de pecircche de la Reacutepublique du Seacuteneacutegal
(source Direction des pecircches maritimes 2003)
26
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees
Depuis trois deacutecennies le secteur de la pecircche a connu une forte croissance au
Seacuteneacutegal Les captures ont eacuteteacute multiplieacutees par huit en 32 ans Les deacutebarquements
des flottilles seacuteneacutegalaises et eacutetrangegraveres ont atteint en 1996 plus de 415 000
tonnes En 1997 le volume deacutebarqueacute est passeacute agrave 421 000 tonnes et en 1998 agrave
425 000 tonnes Cette eacutevolution eacutetant principalement lieacutee agrave lrsquoaugmentation des
petits peacutelagiques mis agrave terre par la pecircche artisanale
(DPM 2003)
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche
Au Seacuteneacutegal la pecircche maritime constitue un eacuteleacutement cleacute de lrsquoeacuteconomie avec une
production en valeur de 150 milliards de FCFA environ soit 2 du PIB national
et 16 du PIB du secteur primaire en 2003 Par ailleurs la population active
dans ce secteur est drsquoenviron 600 000 personnes en comptant lrsquoemploi direct et
indirect repreacutesentant environ 17 de la population active totale Les
exportations de produits halieutiques du pays eacutetaient drsquoenviron 2 milliards pour
130 000 tonnes en 2000 et mecircme ulteacuterieurement celles-ci continuaient de
constituer la plus importante source drsquoacquisition de devises du pays Ces
exportations permettent actuellement de payer pregraves de la moitieacute de la facture
peacutetroliegravere
(Ministegravere de lrsquoeacuteconomie et des finances direction de la deacutemographie et des
statistiques 2005)
Gracircce agrave leur disponibiliteacute les produits de la mer peuvent donc apparaicirctre comme
un apport nutritionnel tregraves important drsquoun point de vue alimentaire les produits
halieutiques contribuent pour 60 agrave lrsquoapport en proteacuteine animales des
populations Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de
proteacuteines couvrant 75 de leurs besoins En 1997 la consommation moyenne
annuelle de poisson au Seacuteneacutegal eacutetait de 26kg par habitant pour une
consommation mondiale de 135 kg par habitant (NDOYE ET COLL 2002)
27
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis
21 Nomenclature
Tableau I Nomenclature de la sole tropicale
Nom scientifique
Nom franccedilais En vernaculaire (en wolof)
Nom FAO Nom anglais
Cynoglossus senegalensis
Sole tropicale Tapaleacute Sole-langue Seacuteneacutegalaise
tongue sole
(SERET 1981)
22 Classification systeacutematique
Cynoglossus senegalensis est classeacute comme indiqueacute dans le tableau ci-dessous
Tableau II classification systeacutematique de la sole tropicale
Classe Osteacuteichtyens
Ordre Pleuronectiformes
Famille Cynoglossidae
Genre Cynoglossus
Espegravece senegalensis
(SERET 1981)
23 Caracteacuteristiques morphologiques
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae
Ce sont des poissons marins agrave corps plat diminuant progressivement de largeur
vers lrsquoarriegravere Les deux yeux assez petits sont situeacutes sur le cocircteacute gauche Le
museau est arrondi La bouche est petite infegravere plus au moins arqueacutee Le bord
du pregrave-opercule nrsquoest pas libre et est recouvert par la peau et des eacutecailles Il nrsquoy
a pas de rayons eacutepineux agrave la dorsale et agrave lrsquoanale La dorsale deacutebute en avant de
lrsquoœil dorsal Les rayons de la dorsale et de lrsquoanale sont confluents avec ceux de
28
la caudale qui se termine en pointe Les nageoires pectorales sont absentes ou
rudimentaires Seule la pelvienne de la face oculeacutee est preacutesente elle est situeacutee
sur la ligne meacutediane Le corps est recouvert par des eacutecailles cteacutenoiumldes ou
cycloiumldes (SERET 1981)
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis
Le corps est plat et allongeacute les nageoires dorsale et anale rejoignent la caudale
qui se termine en pointe Les yeux situeacutes sur le cocircteacute gauche du corps ont un
espace assez large entre eux Le museau est largement arrondi le crochet rostral
plutocirct court srsquoeacutetend jusqursquoau niveau de la narine anteacuterieure La bouche srsquoeacutetend
au-delagrave de lrsquoœil ventral La nageoire dorsale compte 119-125 rayons lrsquoanale 93-
99 rayons et la caudale 12 rayons On compte 124-138 eacutecailles tubuleacutees le long
de la ligne margino-dorsale Une ligne lateacuterale meacutediane est visible sur la face
aveugle
Sur la face oculeacutee le corps est plus ou moins uniformeacutement brun plus ou moins
fonceacute avec des reflets verdacirctres visibles sur le vivant la reacutegion de lrsquoopercule
est souvent noiracirctre La face aveugle est blanchacirctre
(SERET 1981)
Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
29
24 Reacutepartition geacuteographique
Cynoglossus senegalensis est une espegravece tregraves cocirctiegravere par rapport aux autres
espegraveces de la famille des cynoglossidae Elle freacutequente les zones sablo vaseuses
cocirctiegraveres entre 10 et 110 megravetres mais les prises maximales sont reacutealiseacutees entre 5
et 15 megravetres de profondeur Elle est connue de la Mauritanie agrave lrsquoAngola Les
reacutepartitions bathymeacutetriques de cette espegravece observeacutees au Seacuteneacutegal Togo-Benin
au Congo et au Cameroun sont similaires
(SERET 1981)
30
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson deacutefinition valorisation et
utilisation
31 Deacutefinition et composition
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
des opeacuterations traditionnelles de production
Les principaux co-produits de poisson rencontreacutes sont la tecircte la peau les
chutes de filetage les arecirctes centrales les viscegraveres le foie et selon les peacuteriodes
de pecircche les eacuteleacutements reproducteurs tels que les œufs ou la laitance (figure3)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
En vue drsquoune valorisation les co-produits sont traiteacutes selon le mecircme protocole
de conservation que les parties destineacutees agrave la production alimentaire
garantissant ainsi leur absence drsquoalteacuteration
32 les voies de valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes
Le produit deacuteriveacute est le produit commercial obtenu agrave partir drsquoun co-produit Un
co-produit pourra donner plusieurs produits deacuteriveacutes (figure4) Ainsi
la tecircte de poisson pourra ecirctre valoriseacutee en tant que farine de poisson huile
ou destineacutee agrave la nutrition
la chair sur les arecirctes en farine de poisson la chair hacheacutee et huile
31
la peau en farine de poisson collagegravene geacutelatine cuir
les viscegraveres en farine de poisson huile vitamines
la carcasse en farine de poisson collagegravene geacutelatine mineacuteraux
(GUERARD et Coll 2004)
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Ces produits sont qualifieacutes de produits deacuteriveacutes et non de produits finis car ils
sont geacuteneacuteralement commercialiseacutes sous forme drsquoingreacutedients crsquoest-agrave-dire sous
forme de produits intermeacutediaires pour la nutrition humaine animale pour la
dieacuteteacutetique la cosmeacutetique Neacuteanmoins certains co-produits (foies œufs) peuvent
ecirctre vendus agrave lrsquoeacutetat brut aux consommateurs Mais cette tendance est faible et ils
sont (foies œufs) plus utiliseacutes par les industries de conserverie et de saurisserie
(ANDRIEUX 2004)
On peut distinguer quatre (4) categories de produits deacuteriveacutes en fonction de leur
destination
lrsquoutilisation en nutrition humaine ou en alimentation animale
lrsquoutilisation en dieacuteteacutetique ou nutraceutique
32
lrsquoutilisation en cosmeacutetique
utilisation plus restreinte et speacutecifique drsquoun seul type de produit deacuteriveacute
Il existe plusieurs applications possibles des co-produits (figure5) parmi
lesquelles on peut citer
les farines et huiles de poisson
Cette valorisation est actuellement la plus importante car tous les co-produits
peuvent ecirctre utiliseacutes sans distinction Aucun tri nrsquoest neacutecessaire seule la
distinction co- produits issus de poissons sauvages ou drsquoeacutelevage doit ecirctre faite
les hachis
Les co-produits sont broyeacutes et filtreacutes puis le hachi obtenu est congeleacute en bloc
Les co-produits viscegraveres sont exclus de cette valorisation Les hachis sont
destineacutes agrave la fabrication drsquoaliments pour animaux domestiques essentiellement
les chats Ils sont souvent commercialiseacutes sous forme congeleacutee et sont une
bonne source de proteacuteines
les hydrolysats (cf 33)
la production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee (protides lipides)
La production de farine et drsquohuile de poisson repreacutesente toujours en tonnage la
voie de valorisation la plus importante des co-produits de la pecircche (figure 5)
Mais la faible valeur ajouteacutee obtenue avec ces produits incite les industriels agrave
rechercher des deacuteboucheacutes plus rentables productions de sauces de poisson
drsquoaromes de proteacuteines musculaires (surimi) sont autant de valorisation
alternative vers lrsquoindustrie agro-alimentaire (CHING 1999)
33
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
33 Les hydrolysats de poisson
331 Deacutefinition
Les hydrolysats sont des fractions agrave teneur proteacuteique eacuteleveacutee (73 agrave 85) obtenus
par autolyse (uniquement sous lrsquoaction drsquoenzymes endogegravenes) ou heacuteteacuterolyses
(ajout drsquoenzymes exogegravenes) Cependant la proportion en eacuteleacutements mineacuteraux est
assez faible car les arecirctes osseuses non hydrolysables ont eacuteteacute retireacutees Les
hydrolysats ont donc lrsquoavantage drsquoecirctre digeste et drsquoavoir une haute qualiteacute
nutritive
332 Les avantages
Les hydrolysats preacutesentent les mecircmes avantages que les matiegraveres premiegraveres
drsquoorigine animale pour lrsquoaquaculture sans en avoir les nombreux inconveacutenients
(LARBIER et LECLERCQ 1992 ANDERSON et coll 1993) En effet ce
sont des proteacuteines hydrolyseacutees les acides amineacutes essentiels libeacutereacutes sont donc
plus facilement disponibles et assimilables pour les animaux De plus ils
constituent un produit tregraves appeacutetant et parfaitement accepteacute gracircce agrave lrsquoarocircme de
34
poisson et preacutesente une granulomeacutetrie fine facilitant la fabrication drsquoaliments
suivant des proceacutedeacutes tels que la microparticulation (JONES 1995) Enfin les
hydrolysats comportent en geacuteneacuteral peu de mineacuteraux et ne risquent donc pas de
polluer les eaux des eacutelevages aquacoles leur bonne qualiteacute microbiologique
eacutetant assureacutee par la steacuterilisation au cours de la fabrication
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson
3331 En alimentation animale
Les hydrolysats de poisson sont utiliseacutes comme substitut du lait pour les bovins
et les ovins En comparaison avec la caseacuteine les animaux nourris avec les
hydrolysats de poisson gras apregraves un deacutebut de croissance plus lent arrivent au
mecircme poids au bout de quelques semaines (OslashRSKOV et Coll 1982
RITCHIE et MACKIE 1982) De plus une eacutetude eacuteconomique a montreacute les
inteacuterecircts des peptides de poisson en tant que substituts du lait (MERRITT
1982) Pour le beacutetail adulte lrsquoensilage obtenu agrave partir drsquoherbe peut ecirctre
eacutegalement remplaceacute par des hydrolysats de poisson (OUELLET et Coll 1997)
Mais crsquoest dans le domaine de lrsquoaquaculture que ces hydrolysats sont les plus
valoriseacutes En effet en aquaculture la charge reacutecurrente la plus importante est la
source proteacuteique apporteacutee aux animaux Les proteacuteines de poisson hydrolyseacutees
en plus de leur faible coucirct sont drsquoune grande digestibiliteacute De plus de
nombreuses eacutetudes ont montreacute que certains hydrolysats de poisson possegravedent des
proprieacuteteacutes nutraceutiques Ainsi le remplacement des farines de poisson par des
hydrolysats de poisson augmenterait la croissance des crevettes et des larves de
poisson (CORDOVA-MUREATA et GARCIA-CARRENO 2002)
35
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
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SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
Le but de ce travail est la libeacuteration et le dosage des proteacuteines des co-produits
de la sole tropicale De cet objectif geacuteneacuteral deacutecoule les objectifs speacutecifiques
suivants
Hydrolyser les co-produits (tecirctes viscegraveres) agrave lrsquoaide drsquoune proteacutease
Seacuteparer la phase soluble (surnageant) de la phase insoluble (culot) par
centrifugation
Obtenir la matiegravere segraveche de ces deux phases
Doser les proteacuteines totales agrave partir des matiegraveres segraveches obtenues
Pour reacutepondre agrave ces objectifs ce travail se deacuteclinera en deux parties ougrave des
eacuteleacutements de reacuteponses apparaicirctront Une premiegravere partie portant sur lrsquoeacutetude
bibliographique puis une deuxiegraveme partie preacutesentant les analyses effectueacutees et
les reacutesultats obtenus Faisant suite aux conclusions des perspectives seront
eacutemises pour la conduite de futurs travaux
22
PREMIERE PARTIE SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
23
CHAPITRE 1 Geacuteneacuteraliteacutes sur la pecircche au Seacuteneacutegal
11 Environnement naturel
Au large des cocirctes Seacuteneacutegalaises situeacutees agrave lrsquoextreacutemiteacute ouest du continent africain
se heurte le courant marin des canaries venu du Nord et des courants deacuteriveacutes du
courant du Golfe de Guineacutee Des upwellings(remonteacutee drsquoeau froides riches en
sels nutritifs le long de la pente du plateau continental) remontent eacutegalement de
la couche drsquoeau profonde le long de la pente du plateau continental La
tempeacuterature de lrsquoeau de mer en surface ne descend jamais en dessous de 15degC au
cours de lrsquoanneacutee Les fleuves Seacuteneacutegal Gambie et Casamance se jettent dans
lrsquooceacutean atlantique et apportent des sels mineacuteraux pendant lrsquohivernage De plus
du sable riche en sels inorganiques est apporteacute du deacutesert du Sahara par les vents
Le riche environnement naturel preacuteciteacute augmente la productiviteacute de la mer et
creacutee les pecirccheries classeacutees parmi les plus riches drsquoAfrique Des vents violents
qui soufflent au passage de lrsquohivernage agrave la saison segraveche et au passage de la
saison segraveche agrave lrsquohivernage rendent souvent la mer agiteacutee mais en geacuteneacuteral la
zone maritime est calme ce qui permet agrave la population de profiter en toute
seacutecuriteacute des bienfaits de la mer (DPM CRODT 2006)
12 Historique de la pecircche au Seacuteneacutegal
La pecircche a pendant longtemps eacuteteacute une activiteacute monopoliseacutee par certaines
ethnies
les Guet Ndariens de Saint-Louis situeacute agrave lrsquoembouchure du fleuve Seacuteneacutegal
les Lebous aux environs de Dakar
les Nyominka vivant principalement au Saloum
Ces ethnies ont utiliseacute des pecirccheries cocirctiegraveres sur une longueur drsquoenviron 2000
km allant des cocirctes de la Mauritanie au Nord agrave la cocircte de la Sierra Leone au
Sud en suivant le deacuteplacement saisonnier des bancs de poissons La pecircche
artisanale srsquoeffectuait sur des pirogues avec pagaies ou de petites embarcations agrave
24
voile Les captures eacutetaient fournies aux habitants de lrsquointeacuterieur du pays sous
formes de produits fumeacutes ou seacutecheacutes (DPM CRODT 2006)
Lrsquoancecirctre de la pirogue seacuteneacutegalaise remonterait au XVIe siegravecle Elle eacutetait
constitueacutee au deacutepart drsquoun simple tronc eacutevideacute propulseacute agrave la pagaie Vers le deacutebut
du XVIIe siegravecle on assiste agrave lrsquoapparition de la voile Les eacuteperons faisant office
de brise-lames et les bordes sont rajouteacutes au cours du siegravecle suivant Enfin le
moteur hors-bord apparaicirct vers 1950
On distingue deux saisons de production une saison de faible capture de juin
agrave octobre ougrave les volumes des produits diminuent et une saison de forte
production allant de novembre agrave juin Les captures de la pecircche artisanale sont
principalement des espegraveces peacutelagiques alors que les produits de la pecircche
industrielle sont des espegraveces benthiques
Selon la direction des pecircches maritimes (DPM 1996) du ministegravere de
lrsquoeacuteconomie maritime en 1996 lrsquoeffectif de la flottille seacuteneacutegalaise eacutetait le
suivant 11 600 pirogues dont 9 300 motoriseacutees (80) 212 chalutiers dont 60
chalutiers eacutetrangers (28) 6 sardiniers dont 2 sardiniers eacutetrangers (33) 62
thoniers eacutetrangers (97) Les principales prises sont les petits peacutelagiques
(sardinelles chinchards maquereaux) qui repreacutesentent 72 des prises Le reste
correspond agrave des espegraveces benthiques (crevettes ceacutephalopodes rougets dorades
soleshellip)
25
Figure1 Carte des villages cocirctiers de pecircche de la Reacutepublique du Seacuteneacutegal
(source Direction des pecircches maritimes 2003)
26
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees
Depuis trois deacutecennies le secteur de la pecircche a connu une forte croissance au
Seacuteneacutegal Les captures ont eacuteteacute multiplieacutees par huit en 32 ans Les deacutebarquements
des flottilles seacuteneacutegalaises et eacutetrangegraveres ont atteint en 1996 plus de 415 000
tonnes En 1997 le volume deacutebarqueacute est passeacute agrave 421 000 tonnes et en 1998 agrave
425 000 tonnes Cette eacutevolution eacutetant principalement lieacutee agrave lrsquoaugmentation des
petits peacutelagiques mis agrave terre par la pecircche artisanale
(DPM 2003)
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche
Au Seacuteneacutegal la pecircche maritime constitue un eacuteleacutement cleacute de lrsquoeacuteconomie avec une
production en valeur de 150 milliards de FCFA environ soit 2 du PIB national
et 16 du PIB du secteur primaire en 2003 Par ailleurs la population active
dans ce secteur est drsquoenviron 600 000 personnes en comptant lrsquoemploi direct et
indirect repreacutesentant environ 17 de la population active totale Les
exportations de produits halieutiques du pays eacutetaient drsquoenviron 2 milliards pour
130 000 tonnes en 2000 et mecircme ulteacuterieurement celles-ci continuaient de
constituer la plus importante source drsquoacquisition de devises du pays Ces
exportations permettent actuellement de payer pregraves de la moitieacute de la facture
peacutetroliegravere
(Ministegravere de lrsquoeacuteconomie et des finances direction de la deacutemographie et des
statistiques 2005)
Gracircce agrave leur disponibiliteacute les produits de la mer peuvent donc apparaicirctre comme
un apport nutritionnel tregraves important drsquoun point de vue alimentaire les produits
halieutiques contribuent pour 60 agrave lrsquoapport en proteacuteine animales des
populations Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de
proteacuteines couvrant 75 de leurs besoins En 1997 la consommation moyenne
annuelle de poisson au Seacuteneacutegal eacutetait de 26kg par habitant pour une
consommation mondiale de 135 kg par habitant (NDOYE ET COLL 2002)
27
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis
21 Nomenclature
Tableau I Nomenclature de la sole tropicale
Nom scientifique
Nom franccedilais En vernaculaire (en wolof)
Nom FAO Nom anglais
Cynoglossus senegalensis
Sole tropicale Tapaleacute Sole-langue Seacuteneacutegalaise
tongue sole
(SERET 1981)
22 Classification systeacutematique
Cynoglossus senegalensis est classeacute comme indiqueacute dans le tableau ci-dessous
Tableau II classification systeacutematique de la sole tropicale
Classe Osteacuteichtyens
Ordre Pleuronectiformes
Famille Cynoglossidae
Genre Cynoglossus
Espegravece senegalensis
(SERET 1981)
23 Caracteacuteristiques morphologiques
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae
Ce sont des poissons marins agrave corps plat diminuant progressivement de largeur
vers lrsquoarriegravere Les deux yeux assez petits sont situeacutes sur le cocircteacute gauche Le
museau est arrondi La bouche est petite infegravere plus au moins arqueacutee Le bord
du pregrave-opercule nrsquoest pas libre et est recouvert par la peau et des eacutecailles Il nrsquoy
a pas de rayons eacutepineux agrave la dorsale et agrave lrsquoanale La dorsale deacutebute en avant de
lrsquoœil dorsal Les rayons de la dorsale et de lrsquoanale sont confluents avec ceux de
28
la caudale qui se termine en pointe Les nageoires pectorales sont absentes ou
rudimentaires Seule la pelvienne de la face oculeacutee est preacutesente elle est situeacutee
sur la ligne meacutediane Le corps est recouvert par des eacutecailles cteacutenoiumldes ou
cycloiumldes (SERET 1981)
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis
Le corps est plat et allongeacute les nageoires dorsale et anale rejoignent la caudale
qui se termine en pointe Les yeux situeacutes sur le cocircteacute gauche du corps ont un
espace assez large entre eux Le museau est largement arrondi le crochet rostral
plutocirct court srsquoeacutetend jusqursquoau niveau de la narine anteacuterieure La bouche srsquoeacutetend
au-delagrave de lrsquoœil ventral La nageoire dorsale compte 119-125 rayons lrsquoanale 93-
99 rayons et la caudale 12 rayons On compte 124-138 eacutecailles tubuleacutees le long
de la ligne margino-dorsale Une ligne lateacuterale meacutediane est visible sur la face
aveugle
Sur la face oculeacutee le corps est plus ou moins uniformeacutement brun plus ou moins
fonceacute avec des reflets verdacirctres visibles sur le vivant la reacutegion de lrsquoopercule
est souvent noiracirctre La face aveugle est blanchacirctre
(SERET 1981)
Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
29
24 Reacutepartition geacuteographique
Cynoglossus senegalensis est une espegravece tregraves cocirctiegravere par rapport aux autres
espegraveces de la famille des cynoglossidae Elle freacutequente les zones sablo vaseuses
cocirctiegraveres entre 10 et 110 megravetres mais les prises maximales sont reacutealiseacutees entre 5
et 15 megravetres de profondeur Elle est connue de la Mauritanie agrave lrsquoAngola Les
reacutepartitions bathymeacutetriques de cette espegravece observeacutees au Seacuteneacutegal Togo-Benin
au Congo et au Cameroun sont similaires
(SERET 1981)
30
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson deacutefinition valorisation et
utilisation
31 Deacutefinition et composition
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
des opeacuterations traditionnelles de production
Les principaux co-produits de poisson rencontreacutes sont la tecircte la peau les
chutes de filetage les arecirctes centrales les viscegraveres le foie et selon les peacuteriodes
de pecircche les eacuteleacutements reproducteurs tels que les œufs ou la laitance (figure3)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
En vue drsquoune valorisation les co-produits sont traiteacutes selon le mecircme protocole
de conservation que les parties destineacutees agrave la production alimentaire
garantissant ainsi leur absence drsquoalteacuteration
32 les voies de valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes
Le produit deacuteriveacute est le produit commercial obtenu agrave partir drsquoun co-produit Un
co-produit pourra donner plusieurs produits deacuteriveacutes (figure4) Ainsi
la tecircte de poisson pourra ecirctre valoriseacutee en tant que farine de poisson huile
ou destineacutee agrave la nutrition
la chair sur les arecirctes en farine de poisson la chair hacheacutee et huile
31
la peau en farine de poisson collagegravene geacutelatine cuir
les viscegraveres en farine de poisson huile vitamines
la carcasse en farine de poisson collagegravene geacutelatine mineacuteraux
(GUERARD et Coll 2004)
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Ces produits sont qualifieacutes de produits deacuteriveacutes et non de produits finis car ils
sont geacuteneacuteralement commercialiseacutes sous forme drsquoingreacutedients crsquoest-agrave-dire sous
forme de produits intermeacutediaires pour la nutrition humaine animale pour la
dieacuteteacutetique la cosmeacutetique Neacuteanmoins certains co-produits (foies œufs) peuvent
ecirctre vendus agrave lrsquoeacutetat brut aux consommateurs Mais cette tendance est faible et ils
sont (foies œufs) plus utiliseacutes par les industries de conserverie et de saurisserie
(ANDRIEUX 2004)
On peut distinguer quatre (4) categories de produits deacuteriveacutes en fonction de leur
destination
lrsquoutilisation en nutrition humaine ou en alimentation animale
lrsquoutilisation en dieacuteteacutetique ou nutraceutique
32
lrsquoutilisation en cosmeacutetique
utilisation plus restreinte et speacutecifique drsquoun seul type de produit deacuteriveacute
Il existe plusieurs applications possibles des co-produits (figure5) parmi
lesquelles on peut citer
les farines et huiles de poisson
Cette valorisation est actuellement la plus importante car tous les co-produits
peuvent ecirctre utiliseacutes sans distinction Aucun tri nrsquoest neacutecessaire seule la
distinction co- produits issus de poissons sauvages ou drsquoeacutelevage doit ecirctre faite
les hachis
Les co-produits sont broyeacutes et filtreacutes puis le hachi obtenu est congeleacute en bloc
Les co-produits viscegraveres sont exclus de cette valorisation Les hachis sont
destineacutes agrave la fabrication drsquoaliments pour animaux domestiques essentiellement
les chats Ils sont souvent commercialiseacutes sous forme congeleacutee et sont une
bonne source de proteacuteines
les hydrolysats (cf 33)
la production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee (protides lipides)
La production de farine et drsquohuile de poisson repreacutesente toujours en tonnage la
voie de valorisation la plus importante des co-produits de la pecircche (figure 5)
Mais la faible valeur ajouteacutee obtenue avec ces produits incite les industriels agrave
rechercher des deacuteboucheacutes plus rentables productions de sauces de poisson
drsquoaromes de proteacuteines musculaires (surimi) sont autant de valorisation
alternative vers lrsquoindustrie agro-alimentaire (CHING 1999)
33
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
33 Les hydrolysats de poisson
331 Deacutefinition
Les hydrolysats sont des fractions agrave teneur proteacuteique eacuteleveacutee (73 agrave 85) obtenus
par autolyse (uniquement sous lrsquoaction drsquoenzymes endogegravenes) ou heacuteteacuterolyses
(ajout drsquoenzymes exogegravenes) Cependant la proportion en eacuteleacutements mineacuteraux est
assez faible car les arecirctes osseuses non hydrolysables ont eacuteteacute retireacutees Les
hydrolysats ont donc lrsquoavantage drsquoecirctre digeste et drsquoavoir une haute qualiteacute
nutritive
332 Les avantages
Les hydrolysats preacutesentent les mecircmes avantages que les matiegraveres premiegraveres
drsquoorigine animale pour lrsquoaquaculture sans en avoir les nombreux inconveacutenients
(LARBIER et LECLERCQ 1992 ANDERSON et coll 1993) En effet ce
sont des proteacuteines hydrolyseacutees les acides amineacutes essentiels libeacutereacutes sont donc
plus facilement disponibles et assimilables pour les animaux De plus ils
constituent un produit tregraves appeacutetant et parfaitement accepteacute gracircce agrave lrsquoarocircme de
34
poisson et preacutesente une granulomeacutetrie fine facilitant la fabrication drsquoaliments
suivant des proceacutedeacutes tels que la microparticulation (JONES 1995) Enfin les
hydrolysats comportent en geacuteneacuteral peu de mineacuteraux et ne risquent donc pas de
polluer les eaux des eacutelevages aquacoles leur bonne qualiteacute microbiologique
eacutetant assureacutee par la steacuterilisation au cours de la fabrication
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson
3331 En alimentation animale
Les hydrolysats de poisson sont utiliseacutes comme substitut du lait pour les bovins
et les ovins En comparaison avec la caseacuteine les animaux nourris avec les
hydrolysats de poisson gras apregraves un deacutebut de croissance plus lent arrivent au
mecircme poids au bout de quelques semaines (OslashRSKOV et Coll 1982
RITCHIE et MACKIE 1982) De plus une eacutetude eacuteconomique a montreacute les
inteacuterecircts des peptides de poisson en tant que substituts du lait (MERRITT
1982) Pour le beacutetail adulte lrsquoensilage obtenu agrave partir drsquoherbe peut ecirctre
eacutegalement remplaceacute par des hydrolysats de poisson (OUELLET et Coll 1997)
Mais crsquoest dans le domaine de lrsquoaquaculture que ces hydrolysats sont les plus
valoriseacutes En effet en aquaculture la charge reacutecurrente la plus importante est la
source proteacuteique apporteacutee aux animaux Les proteacuteines de poisson hydrolyseacutees
en plus de leur faible coucirct sont drsquoune grande digestibiliteacute De plus de
nombreuses eacutetudes ont montreacute que certains hydrolysats de poisson possegravedent des
proprieacuteteacutes nutraceutiques Ainsi le remplacement des farines de poisson par des
hydrolysats de poisson augmenterait la croissance des crevettes et des larves de
poisson (CORDOVA-MUREATA et GARCIA-CARRENO 2002)
35
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
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SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
PREMIERE PARTIE SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
23
CHAPITRE 1 Geacuteneacuteraliteacutes sur la pecircche au Seacuteneacutegal
11 Environnement naturel
Au large des cocirctes Seacuteneacutegalaises situeacutees agrave lrsquoextreacutemiteacute ouest du continent africain
se heurte le courant marin des canaries venu du Nord et des courants deacuteriveacutes du
courant du Golfe de Guineacutee Des upwellings(remonteacutee drsquoeau froides riches en
sels nutritifs le long de la pente du plateau continental) remontent eacutegalement de
la couche drsquoeau profonde le long de la pente du plateau continental La
tempeacuterature de lrsquoeau de mer en surface ne descend jamais en dessous de 15degC au
cours de lrsquoanneacutee Les fleuves Seacuteneacutegal Gambie et Casamance se jettent dans
lrsquooceacutean atlantique et apportent des sels mineacuteraux pendant lrsquohivernage De plus
du sable riche en sels inorganiques est apporteacute du deacutesert du Sahara par les vents
Le riche environnement naturel preacuteciteacute augmente la productiviteacute de la mer et
creacutee les pecirccheries classeacutees parmi les plus riches drsquoAfrique Des vents violents
qui soufflent au passage de lrsquohivernage agrave la saison segraveche et au passage de la
saison segraveche agrave lrsquohivernage rendent souvent la mer agiteacutee mais en geacuteneacuteral la
zone maritime est calme ce qui permet agrave la population de profiter en toute
seacutecuriteacute des bienfaits de la mer (DPM CRODT 2006)
12 Historique de la pecircche au Seacuteneacutegal
La pecircche a pendant longtemps eacuteteacute une activiteacute monopoliseacutee par certaines
ethnies
les Guet Ndariens de Saint-Louis situeacute agrave lrsquoembouchure du fleuve Seacuteneacutegal
les Lebous aux environs de Dakar
les Nyominka vivant principalement au Saloum
Ces ethnies ont utiliseacute des pecirccheries cocirctiegraveres sur une longueur drsquoenviron 2000
km allant des cocirctes de la Mauritanie au Nord agrave la cocircte de la Sierra Leone au
Sud en suivant le deacuteplacement saisonnier des bancs de poissons La pecircche
artisanale srsquoeffectuait sur des pirogues avec pagaies ou de petites embarcations agrave
24
voile Les captures eacutetaient fournies aux habitants de lrsquointeacuterieur du pays sous
formes de produits fumeacutes ou seacutecheacutes (DPM CRODT 2006)
Lrsquoancecirctre de la pirogue seacuteneacutegalaise remonterait au XVIe siegravecle Elle eacutetait
constitueacutee au deacutepart drsquoun simple tronc eacutevideacute propulseacute agrave la pagaie Vers le deacutebut
du XVIIe siegravecle on assiste agrave lrsquoapparition de la voile Les eacuteperons faisant office
de brise-lames et les bordes sont rajouteacutes au cours du siegravecle suivant Enfin le
moteur hors-bord apparaicirct vers 1950
On distingue deux saisons de production une saison de faible capture de juin
agrave octobre ougrave les volumes des produits diminuent et une saison de forte
production allant de novembre agrave juin Les captures de la pecircche artisanale sont
principalement des espegraveces peacutelagiques alors que les produits de la pecircche
industrielle sont des espegraveces benthiques
Selon la direction des pecircches maritimes (DPM 1996) du ministegravere de
lrsquoeacuteconomie maritime en 1996 lrsquoeffectif de la flottille seacuteneacutegalaise eacutetait le
suivant 11 600 pirogues dont 9 300 motoriseacutees (80) 212 chalutiers dont 60
chalutiers eacutetrangers (28) 6 sardiniers dont 2 sardiniers eacutetrangers (33) 62
thoniers eacutetrangers (97) Les principales prises sont les petits peacutelagiques
(sardinelles chinchards maquereaux) qui repreacutesentent 72 des prises Le reste
correspond agrave des espegraveces benthiques (crevettes ceacutephalopodes rougets dorades
soleshellip)
25
Figure1 Carte des villages cocirctiers de pecircche de la Reacutepublique du Seacuteneacutegal
(source Direction des pecircches maritimes 2003)
26
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees
Depuis trois deacutecennies le secteur de la pecircche a connu une forte croissance au
Seacuteneacutegal Les captures ont eacuteteacute multiplieacutees par huit en 32 ans Les deacutebarquements
des flottilles seacuteneacutegalaises et eacutetrangegraveres ont atteint en 1996 plus de 415 000
tonnes En 1997 le volume deacutebarqueacute est passeacute agrave 421 000 tonnes et en 1998 agrave
425 000 tonnes Cette eacutevolution eacutetant principalement lieacutee agrave lrsquoaugmentation des
petits peacutelagiques mis agrave terre par la pecircche artisanale
(DPM 2003)
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche
Au Seacuteneacutegal la pecircche maritime constitue un eacuteleacutement cleacute de lrsquoeacuteconomie avec une
production en valeur de 150 milliards de FCFA environ soit 2 du PIB national
et 16 du PIB du secteur primaire en 2003 Par ailleurs la population active
dans ce secteur est drsquoenviron 600 000 personnes en comptant lrsquoemploi direct et
indirect repreacutesentant environ 17 de la population active totale Les
exportations de produits halieutiques du pays eacutetaient drsquoenviron 2 milliards pour
130 000 tonnes en 2000 et mecircme ulteacuterieurement celles-ci continuaient de
constituer la plus importante source drsquoacquisition de devises du pays Ces
exportations permettent actuellement de payer pregraves de la moitieacute de la facture
peacutetroliegravere
(Ministegravere de lrsquoeacuteconomie et des finances direction de la deacutemographie et des
statistiques 2005)
Gracircce agrave leur disponibiliteacute les produits de la mer peuvent donc apparaicirctre comme
un apport nutritionnel tregraves important drsquoun point de vue alimentaire les produits
halieutiques contribuent pour 60 agrave lrsquoapport en proteacuteine animales des
populations Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de
proteacuteines couvrant 75 de leurs besoins En 1997 la consommation moyenne
annuelle de poisson au Seacuteneacutegal eacutetait de 26kg par habitant pour une
consommation mondiale de 135 kg par habitant (NDOYE ET COLL 2002)
27
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis
21 Nomenclature
Tableau I Nomenclature de la sole tropicale
Nom scientifique
Nom franccedilais En vernaculaire (en wolof)
Nom FAO Nom anglais
Cynoglossus senegalensis
Sole tropicale Tapaleacute Sole-langue Seacuteneacutegalaise
tongue sole
(SERET 1981)
22 Classification systeacutematique
Cynoglossus senegalensis est classeacute comme indiqueacute dans le tableau ci-dessous
Tableau II classification systeacutematique de la sole tropicale
Classe Osteacuteichtyens
Ordre Pleuronectiformes
Famille Cynoglossidae
Genre Cynoglossus
Espegravece senegalensis
(SERET 1981)
23 Caracteacuteristiques morphologiques
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae
Ce sont des poissons marins agrave corps plat diminuant progressivement de largeur
vers lrsquoarriegravere Les deux yeux assez petits sont situeacutes sur le cocircteacute gauche Le
museau est arrondi La bouche est petite infegravere plus au moins arqueacutee Le bord
du pregrave-opercule nrsquoest pas libre et est recouvert par la peau et des eacutecailles Il nrsquoy
a pas de rayons eacutepineux agrave la dorsale et agrave lrsquoanale La dorsale deacutebute en avant de
lrsquoœil dorsal Les rayons de la dorsale et de lrsquoanale sont confluents avec ceux de
28
la caudale qui se termine en pointe Les nageoires pectorales sont absentes ou
rudimentaires Seule la pelvienne de la face oculeacutee est preacutesente elle est situeacutee
sur la ligne meacutediane Le corps est recouvert par des eacutecailles cteacutenoiumldes ou
cycloiumldes (SERET 1981)
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis
Le corps est plat et allongeacute les nageoires dorsale et anale rejoignent la caudale
qui se termine en pointe Les yeux situeacutes sur le cocircteacute gauche du corps ont un
espace assez large entre eux Le museau est largement arrondi le crochet rostral
plutocirct court srsquoeacutetend jusqursquoau niveau de la narine anteacuterieure La bouche srsquoeacutetend
au-delagrave de lrsquoœil ventral La nageoire dorsale compte 119-125 rayons lrsquoanale 93-
99 rayons et la caudale 12 rayons On compte 124-138 eacutecailles tubuleacutees le long
de la ligne margino-dorsale Une ligne lateacuterale meacutediane est visible sur la face
aveugle
Sur la face oculeacutee le corps est plus ou moins uniformeacutement brun plus ou moins
fonceacute avec des reflets verdacirctres visibles sur le vivant la reacutegion de lrsquoopercule
est souvent noiracirctre La face aveugle est blanchacirctre
(SERET 1981)
Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
29
24 Reacutepartition geacuteographique
Cynoglossus senegalensis est une espegravece tregraves cocirctiegravere par rapport aux autres
espegraveces de la famille des cynoglossidae Elle freacutequente les zones sablo vaseuses
cocirctiegraveres entre 10 et 110 megravetres mais les prises maximales sont reacutealiseacutees entre 5
et 15 megravetres de profondeur Elle est connue de la Mauritanie agrave lrsquoAngola Les
reacutepartitions bathymeacutetriques de cette espegravece observeacutees au Seacuteneacutegal Togo-Benin
au Congo et au Cameroun sont similaires
(SERET 1981)
30
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson deacutefinition valorisation et
utilisation
31 Deacutefinition et composition
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
des opeacuterations traditionnelles de production
Les principaux co-produits de poisson rencontreacutes sont la tecircte la peau les
chutes de filetage les arecirctes centrales les viscegraveres le foie et selon les peacuteriodes
de pecircche les eacuteleacutements reproducteurs tels que les œufs ou la laitance (figure3)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
En vue drsquoune valorisation les co-produits sont traiteacutes selon le mecircme protocole
de conservation que les parties destineacutees agrave la production alimentaire
garantissant ainsi leur absence drsquoalteacuteration
32 les voies de valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes
Le produit deacuteriveacute est le produit commercial obtenu agrave partir drsquoun co-produit Un
co-produit pourra donner plusieurs produits deacuteriveacutes (figure4) Ainsi
la tecircte de poisson pourra ecirctre valoriseacutee en tant que farine de poisson huile
ou destineacutee agrave la nutrition
la chair sur les arecirctes en farine de poisson la chair hacheacutee et huile
31
la peau en farine de poisson collagegravene geacutelatine cuir
les viscegraveres en farine de poisson huile vitamines
la carcasse en farine de poisson collagegravene geacutelatine mineacuteraux
(GUERARD et Coll 2004)
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Ces produits sont qualifieacutes de produits deacuteriveacutes et non de produits finis car ils
sont geacuteneacuteralement commercialiseacutes sous forme drsquoingreacutedients crsquoest-agrave-dire sous
forme de produits intermeacutediaires pour la nutrition humaine animale pour la
dieacuteteacutetique la cosmeacutetique Neacuteanmoins certains co-produits (foies œufs) peuvent
ecirctre vendus agrave lrsquoeacutetat brut aux consommateurs Mais cette tendance est faible et ils
sont (foies œufs) plus utiliseacutes par les industries de conserverie et de saurisserie
(ANDRIEUX 2004)
On peut distinguer quatre (4) categories de produits deacuteriveacutes en fonction de leur
destination
lrsquoutilisation en nutrition humaine ou en alimentation animale
lrsquoutilisation en dieacuteteacutetique ou nutraceutique
32
lrsquoutilisation en cosmeacutetique
utilisation plus restreinte et speacutecifique drsquoun seul type de produit deacuteriveacute
Il existe plusieurs applications possibles des co-produits (figure5) parmi
lesquelles on peut citer
les farines et huiles de poisson
Cette valorisation est actuellement la plus importante car tous les co-produits
peuvent ecirctre utiliseacutes sans distinction Aucun tri nrsquoest neacutecessaire seule la
distinction co- produits issus de poissons sauvages ou drsquoeacutelevage doit ecirctre faite
les hachis
Les co-produits sont broyeacutes et filtreacutes puis le hachi obtenu est congeleacute en bloc
Les co-produits viscegraveres sont exclus de cette valorisation Les hachis sont
destineacutes agrave la fabrication drsquoaliments pour animaux domestiques essentiellement
les chats Ils sont souvent commercialiseacutes sous forme congeleacutee et sont une
bonne source de proteacuteines
les hydrolysats (cf 33)
la production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee (protides lipides)
La production de farine et drsquohuile de poisson repreacutesente toujours en tonnage la
voie de valorisation la plus importante des co-produits de la pecircche (figure 5)
Mais la faible valeur ajouteacutee obtenue avec ces produits incite les industriels agrave
rechercher des deacuteboucheacutes plus rentables productions de sauces de poisson
drsquoaromes de proteacuteines musculaires (surimi) sont autant de valorisation
alternative vers lrsquoindustrie agro-alimentaire (CHING 1999)
33
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
33 Les hydrolysats de poisson
331 Deacutefinition
Les hydrolysats sont des fractions agrave teneur proteacuteique eacuteleveacutee (73 agrave 85) obtenus
par autolyse (uniquement sous lrsquoaction drsquoenzymes endogegravenes) ou heacuteteacuterolyses
(ajout drsquoenzymes exogegravenes) Cependant la proportion en eacuteleacutements mineacuteraux est
assez faible car les arecirctes osseuses non hydrolysables ont eacuteteacute retireacutees Les
hydrolysats ont donc lrsquoavantage drsquoecirctre digeste et drsquoavoir une haute qualiteacute
nutritive
332 Les avantages
Les hydrolysats preacutesentent les mecircmes avantages que les matiegraveres premiegraveres
drsquoorigine animale pour lrsquoaquaculture sans en avoir les nombreux inconveacutenients
(LARBIER et LECLERCQ 1992 ANDERSON et coll 1993) En effet ce
sont des proteacuteines hydrolyseacutees les acides amineacutes essentiels libeacutereacutes sont donc
plus facilement disponibles et assimilables pour les animaux De plus ils
constituent un produit tregraves appeacutetant et parfaitement accepteacute gracircce agrave lrsquoarocircme de
34
poisson et preacutesente une granulomeacutetrie fine facilitant la fabrication drsquoaliments
suivant des proceacutedeacutes tels que la microparticulation (JONES 1995) Enfin les
hydrolysats comportent en geacuteneacuteral peu de mineacuteraux et ne risquent donc pas de
polluer les eaux des eacutelevages aquacoles leur bonne qualiteacute microbiologique
eacutetant assureacutee par la steacuterilisation au cours de la fabrication
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson
3331 En alimentation animale
Les hydrolysats de poisson sont utiliseacutes comme substitut du lait pour les bovins
et les ovins En comparaison avec la caseacuteine les animaux nourris avec les
hydrolysats de poisson gras apregraves un deacutebut de croissance plus lent arrivent au
mecircme poids au bout de quelques semaines (OslashRSKOV et Coll 1982
RITCHIE et MACKIE 1982) De plus une eacutetude eacuteconomique a montreacute les
inteacuterecircts des peptides de poisson en tant que substituts du lait (MERRITT
1982) Pour le beacutetail adulte lrsquoensilage obtenu agrave partir drsquoherbe peut ecirctre
eacutegalement remplaceacute par des hydrolysats de poisson (OUELLET et Coll 1997)
Mais crsquoest dans le domaine de lrsquoaquaculture que ces hydrolysats sont les plus
valoriseacutes En effet en aquaculture la charge reacutecurrente la plus importante est la
source proteacuteique apporteacutee aux animaux Les proteacuteines de poisson hydrolyseacutees
en plus de leur faible coucirct sont drsquoune grande digestibiliteacute De plus de
nombreuses eacutetudes ont montreacute que certains hydrolysats de poisson possegravedent des
proprieacuteteacutes nutraceutiques Ainsi le remplacement des farines de poisson par des
hydrolysats de poisson augmenterait la croissance des crevettes et des larves de
poisson (CORDOVA-MUREATA et GARCIA-CARRENO 2002)
35
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
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80
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SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
CHAPITRE 1 Geacuteneacuteraliteacutes sur la pecircche au Seacuteneacutegal
11 Environnement naturel
Au large des cocirctes Seacuteneacutegalaises situeacutees agrave lrsquoextreacutemiteacute ouest du continent africain
se heurte le courant marin des canaries venu du Nord et des courants deacuteriveacutes du
courant du Golfe de Guineacutee Des upwellings(remonteacutee drsquoeau froides riches en
sels nutritifs le long de la pente du plateau continental) remontent eacutegalement de
la couche drsquoeau profonde le long de la pente du plateau continental La
tempeacuterature de lrsquoeau de mer en surface ne descend jamais en dessous de 15degC au
cours de lrsquoanneacutee Les fleuves Seacuteneacutegal Gambie et Casamance se jettent dans
lrsquooceacutean atlantique et apportent des sels mineacuteraux pendant lrsquohivernage De plus
du sable riche en sels inorganiques est apporteacute du deacutesert du Sahara par les vents
Le riche environnement naturel preacuteciteacute augmente la productiviteacute de la mer et
creacutee les pecirccheries classeacutees parmi les plus riches drsquoAfrique Des vents violents
qui soufflent au passage de lrsquohivernage agrave la saison segraveche et au passage de la
saison segraveche agrave lrsquohivernage rendent souvent la mer agiteacutee mais en geacuteneacuteral la
zone maritime est calme ce qui permet agrave la population de profiter en toute
seacutecuriteacute des bienfaits de la mer (DPM CRODT 2006)
12 Historique de la pecircche au Seacuteneacutegal
La pecircche a pendant longtemps eacuteteacute une activiteacute monopoliseacutee par certaines
ethnies
les Guet Ndariens de Saint-Louis situeacute agrave lrsquoembouchure du fleuve Seacuteneacutegal
les Lebous aux environs de Dakar
les Nyominka vivant principalement au Saloum
Ces ethnies ont utiliseacute des pecirccheries cocirctiegraveres sur une longueur drsquoenviron 2000
km allant des cocirctes de la Mauritanie au Nord agrave la cocircte de la Sierra Leone au
Sud en suivant le deacuteplacement saisonnier des bancs de poissons La pecircche
artisanale srsquoeffectuait sur des pirogues avec pagaies ou de petites embarcations agrave
24
voile Les captures eacutetaient fournies aux habitants de lrsquointeacuterieur du pays sous
formes de produits fumeacutes ou seacutecheacutes (DPM CRODT 2006)
Lrsquoancecirctre de la pirogue seacuteneacutegalaise remonterait au XVIe siegravecle Elle eacutetait
constitueacutee au deacutepart drsquoun simple tronc eacutevideacute propulseacute agrave la pagaie Vers le deacutebut
du XVIIe siegravecle on assiste agrave lrsquoapparition de la voile Les eacuteperons faisant office
de brise-lames et les bordes sont rajouteacutes au cours du siegravecle suivant Enfin le
moteur hors-bord apparaicirct vers 1950
On distingue deux saisons de production une saison de faible capture de juin
agrave octobre ougrave les volumes des produits diminuent et une saison de forte
production allant de novembre agrave juin Les captures de la pecircche artisanale sont
principalement des espegraveces peacutelagiques alors que les produits de la pecircche
industrielle sont des espegraveces benthiques
Selon la direction des pecircches maritimes (DPM 1996) du ministegravere de
lrsquoeacuteconomie maritime en 1996 lrsquoeffectif de la flottille seacuteneacutegalaise eacutetait le
suivant 11 600 pirogues dont 9 300 motoriseacutees (80) 212 chalutiers dont 60
chalutiers eacutetrangers (28) 6 sardiniers dont 2 sardiniers eacutetrangers (33) 62
thoniers eacutetrangers (97) Les principales prises sont les petits peacutelagiques
(sardinelles chinchards maquereaux) qui repreacutesentent 72 des prises Le reste
correspond agrave des espegraveces benthiques (crevettes ceacutephalopodes rougets dorades
soleshellip)
25
Figure1 Carte des villages cocirctiers de pecircche de la Reacutepublique du Seacuteneacutegal
(source Direction des pecircches maritimes 2003)
26
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees
Depuis trois deacutecennies le secteur de la pecircche a connu une forte croissance au
Seacuteneacutegal Les captures ont eacuteteacute multiplieacutees par huit en 32 ans Les deacutebarquements
des flottilles seacuteneacutegalaises et eacutetrangegraveres ont atteint en 1996 plus de 415 000
tonnes En 1997 le volume deacutebarqueacute est passeacute agrave 421 000 tonnes et en 1998 agrave
425 000 tonnes Cette eacutevolution eacutetant principalement lieacutee agrave lrsquoaugmentation des
petits peacutelagiques mis agrave terre par la pecircche artisanale
(DPM 2003)
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche
Au Seacuteneacutegal la pecircche maritime constitue un eacuteleacutement cleacute de lrsquoeacuteconomie avec une
production en valeur de 150 milliards de FCFA environ soit 2 du PIB national
et 16 du PIB du secteur primaire en 2003 Par ailleurs la population active
dans ce secteur est drsquoenviron 600 000 personnes en comptant lrsquoemploi direct et
indirect repreacutesentant environ 17 de la population active totale Les
exportations de produits halieutiques du pays eacutetaient drsquoenviron 2 milliards pour
130 000 tonnes en 2000 et mecircme ulteacuterieurement celles-ci continuaient de
constituer la plus importante source drsquoacquisition de devises du pays Ces
exportations permettent actuellement de payer pregraves de la moitieacute de la facture
peacutetroliegravere
(Ministegravere de lrsquoeacuteconomie et des finances direction de la deacutemographie et des
statistiques 2005)
Gracircce agrave leur disponibiliteacute les produits de la mer peuvent donc apparaicirctre comme
un apport nutritionnel tregraves important drsquoun point de vue alimentaire les produits
halieutiques contribuent pour 60 agrave lrsquoapport en proteacuteine animales des
populations Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de
proteacuteines couvrant 75 de leurs besoins En 1997 la consommation moyenne
annuelle de poisson au Seacuteneacutegal eacutetait de 26kg par habitant pour une
consommation mondiale de 135 kg par habitant (NDOYE ET COLL 2002)
27
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis
21 Nomenclature
Tableau I Nomenclature de la sole tropicale
Nom scientifique
Nom franccedilais En vernaculaire (en wolof)
Nom FAO Nom anglais
Cynoglossus senegalensis
Sole tropicale Tapaleacute Sole-langue Seacuteneacutegalaise
tongue sole
(SERET 1981)
22 Classification systeacutematique
Cynoglossus senegalensis est classeacute comme indiqueacute dans le tableau ci-dessous
Tableau II classification systeacutematique de la sole tropicale
Classe Osteacuteichtyens
Ordre Pleuronectiformes
Famille Cynoglossidae
Genre Cynoglossus
Espegravece senegalensis
(SERET 1981)
23 Caracteacuteristiques morphologiques
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae
Ce sont des poissons marins agrave corps plat diminuant progressivement de largeur
vers lrsquoarriegravere Les deux yeux assez petits sont situeacutes sur le cocircteacute gauche Le
museau est arrondi La bouche est petite infegravere plus au moins arqueacutee Le bord
du pregrave-opercule nrsquoest pas libre et est recouvert par la peau et des eacutecailles Il nrsquoy
a pas de rayons eacutepineux agrave la dorsale et agrave lrsquoanale La dorsale deacutebute en avant de
lrsquoœil dorsal Les rayons de la dorsale et de lrsquoanale sont confluents avec ceux de
28
la caudale qui se termine en pointe Les nageoires pectorales sont absentes ou
rudimentaires Seule la pelvienne de la face oculeacutee est preacutesente elle est situeacutee
sur la ligne meacutediane Le corps est recouvert par des eacutecailles cteacutenoiumldes ou
cycloiumldes (SERET 1981)
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis
Le corps est plat et allongeacute les nageoires dorsale et anale rejoignent la caudale
qui se termine en pointe Les yeux situeacutes sur le cocircteacute gauche du corps ont un
espace assez large entre eux Le museau est largement arrondi le crochet rostral
plutocirct court srsquoeacutetend jusqursquoau niveau de la narine anteacuterieure La bouche srsquoeacutetend
au-delagrave de lrsquoœil ventral La nageoire dorsale compte 119-125 rayons lrsquoanale 93-
99 rayons et la caudale 12 rayons On compte 124-138 eacutecailles tubuleacutees le long
de la ligne margino-dorsale Une ligne lateacuterale meacutediane est visible sur la face
aveugle
Sur la face oculeacutee le corps est plus ou moins uniformeacutement brun plus ou moins
fonceacute avec des reflets verdacirctres visibles sur le vivant la reacutegion de lrsquoopercule
est souvent noiracirctre La face aveugle est blanchacirctre
(SERET 1981)
Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
29
24 Reacutepartition geacuteographique
Cynoglossus senegalensis est une espegravece tregraves cocirctiegravere par rapport aux autres
espegraveces de la famille des cynoglossidae Elle freacutequente les zones sablo vaseuses
cocirctiegraveres entre 10 et 110 megravetres mais les prises maximales sont reacutealiseacutees entre 5
et 15 megravetres de profondeur Elle est connue de la Mauritanie agrave lrsquoAngola Les
reacutepartitions bathymeacutetriques de cette espegravece observeacutees au Seacuteneacutegal Togo-Benin
au Congo et au Cameroun sont similaires
(SERET 1981)
30
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson deacutefinition valorisation et
utilisation
31 Deacutefinition et composition
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
des opeacuterations traditionnelles de production
Les principaux co-produits de poisson rencontreacutes sont la tecircte la peau les
chutes de filetage les arecirctes centrales les viscegraveres le foie et selon les peacuteriodes
de pecircche les eacuteleacutements reproducteurs tels que les œufs ou la laitance (figure3)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
En vue drsquoune valorisation les co-produits sont traiteacutes selon le mecircme protocole
de conservation que les parties destineacutees agrave la production alimentaire
garantissant ainsi leur absence drsquoalteacuteration
32 les voies de valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes
Le produit deacuteriveacute est le produit commercial obtenu agrave partir drsquoun co-produit Un
co-produit pourra donner plusieurs produits deacuteriveacutes (figure4) Ainsi
la tecircte de poisson pourra ecirctre valoriseacutee en tant que farine de poisson huile
ou destineacutee agrave la nutrition
la chair sur les arecirctes en farine de poisson la chair hacheacutee et huile
31
la peau en farine de poisson collagegravene geacutelatine cuir
les viscegraveres en farine de poisson huile vitamines
la carcasse en farine de poisson collagegravene geacutelatine mineacuteraux
(GUERARD et Coll 2004)
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Ces produits sont qualifieacutes de produits deacuteriveacutes et non de produits finis car ils
sont geacuteneacuteralement commercialiseacutes sous forme drsquoingreacutedients crsquoest-agrave-dire sous
forme de produits intermeacutediaires pour la nutrition humaine animale pour la
dieacuteteacutetique la cosmeacutetique Neacuteanmoins certains co-produits (foies œufs) peuvent
ecirctre vendus agrave lrsquoeacutetat brut aux consommateurs Mais cette tendance est faible et ils
sont (foies œufs) plus utiliseacutes par les industries de conserverie et de saurisserie
(ANDRIEUX 2004)
On peut distinguer quatre (4) categories de produits deacuteriveacutes en fonction de leur
destination
lrsquoutilisation en nutrition humaine ou en alimentation animale
lrsquoutilisation en dieacuteteacutetique ou nutraceutique
32
lrsquoutilisation en cosmeacutetique
utilisation plus restreinte et speacutecifique drsquoun seul type de produit deacuteriveacute
Il existe plusieurs applications possibles des co-produits (figure5) parmi
lesquelles on peut citer
les farines et huiles de poisson
Cette valorisation est actuellement la plus importante car tous les co-produits
peuvent ecirctre utiliseacutes sans distinction Aucun tri nrsquoest neacutecessaire seule la
distinction co- produits issus de poissons sauvages ou drsquoeacutelevage doit ecirctre faite
les hachis
Les co-produits sont broyeacutes et filtreacutes puis le hachi obtenu est congeleacute en bloc
Les co-produits viscegraveres sont exclus de cette valorisation Les hachis sont
destineacutes agrave la fabrication drsquoaliments pour animaux domestiques essentiellement
les chats Ils sont souvent commercialiseacutes sous forme congeleacutee et sont une
bonne source de proteacuteines
les hydrolysats (cf 33)
la production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee (protides lipides)
La production de farine et drsquohuile de poisson repreacutesente toujours en tonnage la
voie de valorisation la plus importante des co-produits de la pecircche (figure 5)
Mais la faible valeur ajouteacutee obtenue avec ces produits incite les industriels agrave
rechercher des deacuteboucheacutes plus rentables productions de sauces de poisson
drsquoaromes de proteacuteines musculaires (surimi) sont autant de valorisation
alternative vers lrsquoindustrie agro-alimentaire (CHING 1999)
33
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
33 Les hydrolysats de poisson
331 Deacutefinition
Les hydrolysats sont des fractions agrave teneur proteacuteique eacuteleveacutee (73 agrave 85) obtenus
par autolyse (uniquement sous lrsquoaction drsquoenzymes endogegravenes) ou heacuteteacuterolyses
(ajout drsquoenzymes exogegravenes) Cependant la proportion en eacuteleacutements mineacuteraux est
assez faible car les arecirctes osseuses non hydrolysables ont eacuteteacute retireacutees Les
hydrolysats ont donc lrsquoavantage drsquoecirctre digeste et drsquoavoir une haute qualiteacute
nutritive
332 Les avantages
Les hydrolysats preacutesentent les mecircmes avantages que les matiegraveres premiegraveres
drsquoorigine animale pour lrsquoaquaculture sans en avoir les nombreux inconveacutenients
(LARBIER et LECLERCQ 1992 ANDERSON et coll 1993) En effet ce
sont des proteacuteines hydrolyseacutees les acides amineacutes essentiels libeacutereacutes sont donc
plus facilement disponibles et assimilables pour les animaux De plus ils
constituent un produit tregraves appeacutetant et parfaitement accepteacute gracircce agrave lrsquoarocircme de
34
poisson et preacutesente une granulomeacutetrie fine facilitant la fabrication drsquoaliments
suivant des proceacutedeacutes tels que la microparticulation (JONES 1995) Enfin les
hydrolysats comportent en geacuteneacuteral peu de mineacuteraux et ne risquent donc pas de
polluer les eaux des eacutelevages aquacoles leur bonne qualiteacute microbiologique
eacutetant assureacutee par la steacuterilisation au cours de la fabrication
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson
3331 En alimentation animale
Les hydrolysats de poisson sont utiliseacutes comme substitut du lait pour les bovins
et les ovins En comparaison avec la caseacuteine les animaux nourris avec les
hydrolysats de poisson gras apregraves un deacutebut de croissance plus lent arrivent au
mecircme poids au bout de quelques semaines (OslashRSKOV et Coll 1982
RITCHIE et MACKIE 1982) De plus une eacutetude eacuteconomique a montreacute les
inteacuterecircts des peptides de poisson en tant que substituts du lait (MERRITT
1982) Pour le beacutetail adulte lrsquoensilage obtenu agrave partir drsquoherbe peut ecirctre
eacutegalement remplaceacute par des hydrolysats de poisson (OUELLET et Coll 1997)
Mais crsquoest dans le domaine de lrsquoaquaculture que ces hydrolysats sont les plus
valoriseacutes En effet en aquaculture la charge reacutecurrente la plus importante est la
source proteacuteique apporteacutee aux animaux Les proteacuteines de poisson hydrolyseacutees
en plus de leur faible coucirct sont drsquoune grande digestibiliteacute De plus de
nombreuses eacutetudes ont montreacute que certains hydrolysats de poisson possegravedent des
proprieacuteteacutes nutraceutiques Ainsi le remplacement des farines de poisson par des
hydrolysats de poisson augmenterait la croissance des crevettes et des larves de
poisson (CORDOVA-MUREATA et GARCIA-CARRENO 2002)
35
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
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10 Cuvellier GF 1999 Enzymologie et biocatalyse Dans Biotechnologie Paris Tec et Doc Lavoisier Paris 319-42 11 Dumay J 2006 Extraction de lipides en voie aqueuse par bioreacteur enzymatique combineacute agrave lrsquoultracentrifugation application agrave la valorisation de co-produits de poisson (Sardina pilchardus) Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute bioproceacutedeacutes et biotechnologies marines Lieu de soutenance Ecole Polytechnique de lrsquoUniversiteacute de Nantes 12 Dong YL Sheng G Y Fu J M et Wen K W 2005 Chemical characterization and antianaemia activity of fish protein hydrolysate from Saurida elongata J Sci Food Agric 85 2033-39 13 FAO 1998 The state of world fisheries and aquaculture Rome Italy 14 Fitzgerald AJ Rai P S Marchbank T Taylor G W Ghosh S Ritz B W et Playford R J 2005 Reparative properties of a commercial fish protein hydrolysate preparation Gut 54775-81 15 Gauthier D 2006 Introduction aux techniques utiliseacutees en biochimie le dosage des proteacuteines lten lignegt [accegraves internet] wwwchimiebiochimieumonctoncabchdgsiitubprodosage 16 Gildberg A 1993 Enzymic processing of marine raw materials Process Biochem 28 1-15 17 Gildberg A Brgwald J Johansen A et Stenberg E 1996 Isolation of acid peptide fractions from a fish protein hydrolysate with strong stimulatory effect on atlantic salmon (Salmo salar) head kidney leucocytes Comp Biochem Physiol 114 B 97-101 18 Gildberg A Arnesen J A et Carlehoumlg M 2002 Utilisation of cod backbone by biochemical fractionation Process Biochem 38 475-80
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79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
voile Les captures eacutetaient fournies aux habitants de lrsquointeacuterieur du pays sous
formes de produits fumeacutes ou seacutecheacutes (DPM CRODT 2006)
Lrsquoancecirctre de la pirogue seacuteneacutegalaise remonterait au XVIe siegravecle Elle eacutetait
constitueacutee au deacutepart drsquoun simple tronc eacutevideacute propulseacute agrave la pagaie Vers le deacutebut
du XVIIe siegravecle on assiste agrave lrsquoapparition de la voile Les eacuteperons faisant office
de brise-lames et les bordes sont rajouteacutes au cours du siegravecle suivant Enfin le
moteur hors-bord apparaicirct vers 1950
On distingue deux saisons de production une saison de faible capture de juin
agrave octobre ougrave les volumes des produits diminuent et une saison de forte
production allant de novembre agrave juin Les captures de la pecircche artisanale sont
principalement des espegraveces peacutelagiques alors que les produits de la pecircche
industrielle sont des espegraveces benthiques
Selon la direction des pecircches maritimes (DPM 1996) du ministegravere de
lrsquoeacuteconomie maritime en 1996 lrsquoeffectif de la flottille seacuteneacutegalaise eacutetait le
suivant 11 600 pirogues dont 9 300 motoriseacutees (80) 212 chalutiers dont 60
chalutiers eacutetrangers (28) 6 sardiniers dont 2 sardiniers eacutetrangers (33) 62
thoniers eacutetrangers (97) Les principales prises sont les petits peacutelagiques
(sardinelles chinchards maquereaux) qui repreacutesentent 72 des prises Le reste
correspond agrave des espegraveces benthiques (crevettes ceacutephalopodes rougets dorades
soleshellip)
25
Figure1 Carte des villages cocirctiers de pecircche de la Reacutepublique du Seacuteneacutegal
(source Direction des pecircches maritimes 2003)
26
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees
Depuis trois deacutecennies le secteur de la pecircche a connu une forte croissance au
Seacuteneacutegal Les captures ont eacuteteacute multiplieacutees par huit en 32 ans Les deacutebarquements
des flottilles seacuteneacutegalaises et eacutetrangegraveres ont atteint en 1996 plus de 415 000
tonnes En 1997 le volume deacutebarqueacute est passeacute agrave 421 000 tonnes et en 1998 agrave
425 000 tonnes Cette eacutevolution eacutetant principalement lieacutee agrave lrsquoaugmentation des
petits peacutelagiques mis agrave terre par la pecircche artisanale
(DPM 2003)
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche
Au Seacuteneacutegal la pecircche maritime constitue un eacuteleacutement cleacute de lrsquoeacuteconomie avec une
production en valeur de 150 milliards de FCFA environ soit 2 du PIB national
et 16 du PIB du secteur primaire en 2003 Par ailleurs la population active
dans ce secteur est drsquoenviron 600 000 personnes en comptant lrsquoemploi direct et
indirect repreacutesentant environ 17 de la population active totale Les
exportations de produits halieutiques du pays eacutetaient drsquoenviron 2 milliards pour
130 000 tonnes en 2000 et mecircme ulteacuterieurement celles-ci continuaient de
constituer la plus importante source drsquoacquisition de devises du pays Ces
exportations permettent actuellement de payer pregraves de la moitieacute de la facture
peacutetroliegravere
(Ministegravere de lrsquoeacuteconomie et des finances direction de la deacutemographie et des
statistiques 2005)
Gracircce agrave leur disponibiliteacute les produits de la mer peuvent donc apparaicirctre comme
un apport nutritionnel tregraves important drsquoun point de vue alimentaire les produits
halieutiques contribuent pour 60 agrave lrsquoapport en proteacuteine animales des
populations Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de
proteacuteines couvrant 75 de leurs besoins En 1997 la consommation moyenne
annuelle de poisson au Seacuteneacutegal eacutetait de 26kg par habitant pour une
consommation mondiale de 135 kg par habitant (NDOYE ET COLL 2002)
27
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis
21 Nomenclature
Tableau I Nomenclature de la sole tropicale
Nom scientifique
Nom franccedilais En vernaculaire (en wolof)
Nom FAO Nom anglais
Cynoglossus senegalensis
Sole tropicale Tapaleacute Sole-langue Seacuteneacutegalaise
tongue sole
(SERET 1981)
22 Classification systeacutematique
Cynoglossus senegalensis est classeacute comme indiqueacute dans le tableau ci-dessous
Tableau II classification systeacutematique de la sole tropicale
Classe Osteacuteichtyens
Ordre Pleuronectiformes
Famille Cynoglossidae
Genre Cynoglossus
Espegravece senegalensis
(SERET 1981)
23 Caracteacuteristiques morphologiques
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae
Ce sont des poissons marins agrave corps plat diminuant progressivement de largeur
vers lrsquoarriegravere Les deux yeux assez petits sont situeacutes sur le cocircteacute gauche Le
museau est arrondi La bouche est petite infegravere plus au moins arqueacutee Le bord
du pregrave-opercule nrsquoest pas libre et est recouvert par la peau et des eacutecailles Il nrsquoy
a pas de rayons eacutepineux agrave la dorsale et agrave lrsquoanale La dorsale deacutebute en avant de
lrsquoœil dorsal Les rayons de la dorsale et de lrsquoanale sont confluents avec ceux de
28
la caudale qui se termine en pointe Les nageoires pectorales sont absentes ou
rudimentaires Seule la pelvienne de la face oculeacutee est preacutesente elle est situeacutee
sur la ligne meacutediane Le corps est recouvert par des eacutecailles cteacutenoiumldes ou
cycloiumldes (SERET 1981)
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis
Le corps est plat et allongeacute les nageoires dorsale et anale rejoignent la caudale
qui se termine en pointe Les yeux situeacutes sur le cocircteacute gauche du corps ont un
espace assez large entre eux Le museau est largement arrondi le crochet rostral
plutocirct court srsquoeacutetend jusqursquoau niveau de la narine anteacuterieure La bouche srsquoeacutetend
au-delagrave de lrsquoœil ventral La nageoire dorsale compte 119-125 rayons lrsquoanale 93-
99 rayons et la caudale 12 rayons On compte 124-138 eacutecailles tubuleacutees le long
de la ligne margino-dorsale Une ligne lateacuterale meacutediane est visible sur la face
aveugle
Sur la face oculeacutee le corps est plus ou moins uniformeacutement brun plus ou moins
fonceacute avec des reflets verdacirctres visibles sur le vivant la reacutegion de lrsquoopercule
est souvent noiracirctre La face aveugle est blanchacirctre
(SERET 1981)
Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
29
24 Reacutepartition geacuteographique
Cynoglossus senegalensis est une espegravece tregraves cocirctiegravere par rapport aux autres
espegraveces de la famille des cynoglossidae Elle freacutequente les zones sablo vaseuses
cocirctiegraveres entre 10 et 110 megravetres mais les prises maximales sont reacutealiseacutees entre 5
et 15 megravetres de profondeur Elle est connue de la Mauritanie agrave lrsquoAngola Les
reacutepartitions bathymeacutetriques de cette espegravece observeacutees au Seacuteneacutegal Togo-Benin
au Congo et au Cameroun sont similaires
(SERET 1981)
30
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson deacutefinition valorisation et
utilisation
31 Deacutefinition et composition
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
des opeacuterations traditionnelles de production
Les principaux co-produits de poisson rencontreacutes sont la tecircte la peau les
chutes de filetage les arecirctes centrales les viscegraveres le foie et selon les peacuteriodes
de pecircche les eacuteleacutements reproducteurs tels que les œufs ou la laitance (figure3)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
En vue drsquoune valorisation les co-produits sont traiteacutes selon le mecircme protocole
de conservation que les parties destineacutees agrave la production alimentaire
garantissant ainsi leur absence drsquoalteacuteration
32 les voies de valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes
Le produit deacuteriveacute est le produit commercial obtenu agrave partir drsquoun co-produit Un
co-produit pourra donner plusieurs produits deacuteriveacutes (figure4) Ainsi
la tecircte de poisson pourra ecirctre valoriseacutee en tant que farine de poisson huile
ou destineacutee agrave la nutrition
la chair sur les arecirctes en farine de poisson la chair hacheacutee et huile
31
la peau en farine de poisson collagegravene geacutelatine cuir
les viscegraveres en farine de poisson huile vitamines
la carcasse en farine de poisson collagegravene geacutelatine mineacuteraux
(GUERARD et Coll 2004)
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Ces produits sont qualifieacutes de produits deacuteriveacutes et non de produits finis car ils
sont geacuteneacuteralement commercialiseacutes sous forme drsquoingreacutedients crsquoest-agrave-dire sous
forme de produits intermeacutediaires pour la nutrition humaine animale pour la
dieacuteteacutetique la cosmeacutetique Neacuteanmoins certains co-produits (foies œufs) peuvent
ecirctre vendus agrave lrsquoeacutetat brut aux consommateurs Mais cette tendance est faible et ils
sont (foies œufs) plus utiliseacutes par les industries de conserverie et de saurisserie
(ANDRIEUX 2004)
On peut distinguer quatre (4) categories de produits deacuteriveacutes en fonction de leur
destination
lrsquoutilisation en nutrition humaine ou en alimentation animale
lrsquoutilisation en dieacuteteacutetique ou nutraceutique
32
lrsquoutilisation en cosmeacutetique
utilisation plus restreinte et speacutecifique drsquoun seul type de produit deacuteriveacute
Il existe plusieurs applications possibles des co-produits (figure5) parmi
lesquelles on peut citer
les farines et huiles de poisson
Cette valorisation est actuellement la plus importante car tous les co-produits
peuvent ecirctre utiliseacutes sans distinction Aucun tri nrsquoest neacutecessaire seule la
distinction co- produits issus de poissons sauvages ou drsquoeacutelevage doit ecirctre faite
les hachis
Les co-produits sont broyeacutes et filtreacutes puis le hachi obtenu est congeleacute en bloc
Les co-produits viscegraveres sont exclus de cette valorisation Les hachis sont
destineacutes agrave la fabrication drsquoaliments pour animaux domestiques essentiellement
les chats Ils sont souvent commercialiseacutes sous forme congeleacutee et sont une
bonne source de proteacuteines
les hydrolysats (cf 33)
la production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee (protides lipides)
La production de farine et drsquohuile de poisson repreacutesente toujours en tonnage la
voie de valorisation la plus importante des co-produits de la pecircche (figure 5)
Mais la faible valeur ajouteacutee obtenue avec ces produits incite les industriels agrave
rechercher des deacuteboucheacutes plus rentables productions de sauces de poisson
drsquoaromes de proteacuteines musculaires (surimi) sont autant de valorisation
alternative vers lrsquoindustrie agro-alimentaire (CHING 1999)
33
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
33 Les hydrolysats de poisson
331 Deacutefinition
Les hydrolysats sont des fractions agrave teneur proteacuteique eacuteleveacutee (73 agrave 85) obtenus
par autolyse (uniquement sous lrsquoaction drsquoenzymes endogegravenes) ou heacuteteacuterolyses
(ajout drsquoenzymes exogegravenes) Cependant la proportion en eacuteleacutements mineacuteraux est
assez faible car les arecirctes osseuses non hydrolysables ont eacuteteacute retireacutees Les
hydrolysats ont donc lrsquoavantage drsquoecirctre digeste et drsquoavoir une haute qualiteacute
nutritive
332 Les avantages
Les hydrolysats preacutesentent les mecircmes avantages que les matiegraveres premiegraveres
drsquoorigine animale pour lrsquoaquaculture sans en avoir les nombreux inconveacutenients
(LARBIER et LECLERCQ 1992 ANDERSON et coll 1993) En effet ce
sont des proteacuteines hydrolyseacutees les acides amineacutes essentiels libeacutereacutes sont donc
plus facilement disponibles et assimilables pour les animaux De plus ils
constituent un produit tregraves appeacutetant et parfaitement accepteacute gracircce agrave lrsquoarocircme de
34
poisson et preacutesente une granulomeacutetrie fine facilitant la fabrication drsquoaliments
suivant des proceacutedeacutes tels que la microparticulation (JONES 1995) Enfin les
hydrolysats comportent en geacuteneacuteral peu de mineacuteraux et ne risquent donc pas de
polluer les eaux des eacutelevages aquacoles leur bonne qualiteacute microbiologique
eacutetant assureacutee par la steacuterilisation au cours de la fabrication
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson
3331 En alimentation animale
Les hydrolysats de poisson sont utiliseacutes comme substitut du lait pour les bovins
et les ovins En comparaison avec la caseacuteine les animaux nourris avec les
hydrolysats de poisson gras apregraves un deacutebut de croissance plus lent arrivent au
mecircme poids au bout de quelques semaines (OslashRSKOV et Coll 1982
RITCHIE et MACKIE 1982) De plus une eacutetude eacuteconomique a montreacute les
inteacuterecircts des peptides de poisson en tant que substituts du lait (MERRITT
1982) Pour le beacutetail adulte lrsquoensilage obtenu agrave partir drsquoherbe peut ecirctre
eacutegalement remplaceacute par des hydrolysats de poisson (OUELLET et Coll 1997)
Mais crsquoest dans le domaine de lrsquoaquaculture que ces hydrolysats sont les plus
valoriseacutes En effet en aquaculture la charge reacutecurrente la plus importante est la
source proteacuteique apporteacutee aux animaux Les proteacuteines de poisson hydrolyseacutees
en plus de leur faible coucirct sont drsquoune grande digestibiliteacute De plus de
nombreuses eacutetudes ont montreacute que certains hydrolysats de poisson possegravedent des
proprieacuteteacutes nutraceutiques Ainsi le remplacement des farines de poisson par des
hydrolysats de poisson augmenterait la croissance des crevettes et des larves de
poisson (CORDOVA-MUREATA et GARCIA-CARRENO 2002)
35
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
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75
10 Cuvellier GF 1999 Enzymologie et biocatalyse Dans Biotechnologie Paris Tec et Doc Lavoisier Paris 319-42 11 Dumay J 2006 Extraction de lipides en voie aqueuse par bioreacteur enzymatique combineacute agrave lrsquoultracentrifugation application agrave la valorisation de co-produits de poisson (Sardina pilchardus) Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute bioproceacutedeacutes et biotechnologies marines Lieu de soutenance Ecole Polytechnique de lrsquoUniversiteacute de Nantes 12 Dong YL Sheng G Y Fu J M et Wen K W 2005 Chemical characterization and antianaemia activity of fish protein hydrolysate from Saurida elongata J Sci Food Agric 85 2033-39 13 FAO 1998 The state of world fisheries and aquaculture Rome Italy 14 Fitzgerald AJ Rai P S Marchbank T Taylor G W Ghosh S Ritz B W et Playford R J 2005 Reparative properties of a commercial fish protein hydrolysate preparation Gut 54775-81 15 Gauthier D 2006 Introduction aux techniques utiliseacutees en biochimie le dosage des proteacuteines lten lignegt [accegraves internet] wwwchimiebiochimieumonctoncabchdgsiitubprodosage 16 Gildberg A 1993 Enzymic processing of marine raw materials Process Biochem 28 1-15 17 Gildberg A Brgwald J Johansen A et Stenberg E 1996 Isolation of acid peptide fractions from a fish protein hydrolysate with strong stimulatory effect on atlantic salmon (Salmo salar) head kidney leucocytes Comp Biochem Physiol 114 B 97-101 18 Gildberg A Arnesen J A et Carlehoumlg M 2002 Utilisation of cod backbone by biochemical fractionation Process Biochem 38 475-80
76
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79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
Figure1 Carte des villages cocirctiers de pecircche de la Reacutepublique du Seacuteneacutegal
(source Direction des pecircches maritimes 2003)
26
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees
Depuis trois deacutecennies le secteur de la pecircche a connu une forte croissance au
Seacuteneacutegal Les captures ont eacuteteacute multiplieacutees par huit en 32 ans Les deacutebarquements
des flottilles seacuteneacutegalaises et eacutetrangegraveres ont atteint en 1996 plus de 415 000
tonnes En 1997 le volume deacutebarqueacute est passeacute agrave 421 000 tonnes et en 1998 agrave
425 000 tonnes Cette eacutevolution eacutetant principalement lieacutee agrave lrsquoaugmentation des
petits peacutelagiques mis agrave terre par la pecircche artisanale
(DPM 2003)
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche
Au Seacuteneacutegal la pecircche maritime constitue un eacuteleacutement cleacute de lrsquoeacuteconomie avec une
production en valeur de 150 milliards de FCFA environ soit 2 du PIB national
et 16 du PIB du secteur primaire en 2003 Par ailleurs la population active
dans ce secteur est drsquoenviron 600 000 personnes en comptant lrsquoemploi direct et
indirect repreacutesentant environ 17 de la population active totale Les
exportations de produits halieutiques du pays eacutetaient drsquoenviron 2 milliards pour
130 000 tonnes en 2000 et mecircme ulteacuterieurement celles-ci continuaient de
constituer la plus importante source drsquoacquisition de devises du pays Ces
exportations permettent actuellement de payer pregraves de la moitieacute de la facture
peacutetroliegravere
(Ministegravere de lrsquoeacuteconomie et des finances direction de la deacutemographie et des
statistiques 2005)
Gracircce agrave leur disponibiliteacute les produits de la mer peuvent donc apparaicirctre comme
un apport nutritionnel tregraves important drsquoun point de vue alimentaire les produits
halieutiques contribuent pour 60 agrave lrsquoapport en proteacuteine animales des
populations Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de
proteacuteines couvrant 75 de leurs besoins En 1997 la consommation moyenne
annuelle de poisson au Seacuteneacutegal eacutetait de 26kg par habitant pour une
consommation mondiale de 135 kg par habitant (NDOYE ET COLL 2002)
27
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis
21 Nomenclature
Tableau I Nomenclature de la sole tropicale
Nom scientifique
Nom franccedilais En vernaculaire (en wolof)
Nom FAO Nom anglais
Cynoglossus senegalensis
Sole tropicale Tapaleacute Sole-langue Seacuteneacutegalaise
tongue sole
(SERET 1981)
22 Classification systeacutematique
Cynoglossus senegalensis est classeacute comme indiqueacute dans le tableau ci-dessous
Tableau II classification systeacutematique de la sole tropicale
Classe Osteacuteichtyens
Ordre Pleuronectiformes
Famille Cynoglossidae
Genre Cynoglossus
Espegravece senegalensis
(SERET 1981)
23 Caracteacuteristiques morphologiques
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae
Ce sont des poissons marins agrave corps plat diminuant progressivement de largeur
vers lrsquoarriegravere Les deux yeux assez petits sont situeacutes sur le cocircteacute gauche Le
museau est arrondi La bouche est petite infegravere plus au moins arqueacutee Le bord
du pregrave-opercule nrsquoest pas libre et est recouvert par la peau et des eacutecailles Il nrsquoy
a pas de rayons eacutepineux agrave la dorsale et agrave lrsquoanale La dorsale deacutebute en avant de
lrsquoœil dorsal Les rayons de la dorsale et de lrsquoanale sont confluents avec ceux de
28
la caudale qui se termine en pointe Les nageoires pectorales sont absentes ou
rudimentaires Seule la pelvienne de la face oculeacutee est preacutesente elle est situeacutee
sur la ligne meacutediane Le corps est recouvert par des eacutecailles cteacutenoiumldes ou
cycloiumldes (SERET 1981)
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis
Le corps est plat et allongeacute les nageoires dorsale et anale rejoignent la caudale
qui se termine en pointe Les yeux situeacutes sur le cocircteacute gauche du corps ont un
espace assez large entre eux Le museau est largement arrondi le crochet rostral
plutocirct court srsquoeacutetend jusqursquoau niveau de la narine anteacuterieure La bouche srsquoeacutetend
au-delagrave de lrsquoœil ventral La nageoire dorsale compte 119-125 rayons lrsquoanale 93-
99 rayons et la caudale 12 rayons On compte 124-138 eacutecailles tubuleacutees le long
de la ligne margino-dorsale Une ligne lateacuterale meacutediane est visible sur la face
aveugle
Sur la face oculeacutee le corps est plus ou moins uniformeacutement brun plus ou moins
fonceacute avec des reflets verdacirctres visibles sur le vivant la reacutegion de lrsquoopercule
est souvent noiracirctre La face aveugle est blanchacirctre
(SERET 1981)
Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
29
24 Reacutepartition geacuteographique
Cynoglossus senegalensis est une espegravece tregraves cocirctiegravere par rapport aux autres
espegraveces de la famille des cynoglossidae Elle freacutequente les zones sablo vaseuses
cocirctiegraveres entre 10 et 110 megravetres mais les prises maximales sont reacutealiseacutees entre 5
et 15 megravetres de profondeur Elle est connue de la Mauritanie agrave lrsquoAngola Les
reacutepartitions bathymeacutetriques de cette espegravece observeacutees au Seacuteneacutegal Togo-Benin
au Congo et au Cameroun sont similaires
(SERET 1981)
30
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson deacutefinition valorisation et
utilisation
31 Deacutefinition et composition
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
des opeacuterations traditionnelles de production
Les principaux co-produits de poisson rencontreacutes sont la tecircte la peau les
chutes de filetage les arecirctes centrales les viscegraveres le foie et selon les peacuteriodes
de pecircche les eacuteleacutements reproducteurs tels que les œufs ou la laitance (figure3)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
En vue drsquoune valorisation les co-produits sont traiteacutes selon le mecircme protocole
de conservation que les parties destineacutees agrave la production alimentaire
garantissant ainsi leur absence drsquoalteacuteration
32 les voies de valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes
Le produit deacuteriveacute est le produit commercial obtenu agrave partir drsquoun co-produit Un
co-produit pourra donner plusieurs produits deacuteriveacutes (figure4) Ainsi
la tecircte de poisson pourra ecirctre valoriseacutee en tant que farine de poisson huile
ou destineacutee agrave la nutrition
la chair sur les arecirctes en farine de poisson la chair hacheacutee et huile
31
la peau en farine de poisson collagegravene geacutelatine cuir
les viscegraveres en farine de poisson huile vitamines
la carcasse en farine de poisson collagegravene geacutelatine mineacuteraux
(GUERARD et Coll 2004)
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Ces produits sont qualifieacutes de produits deacuteriveacutes et non de produits finis car ils
sont geacuteneacuteralement commercialiseacutes sous forme drsquoingreacutedients crsquoest-agrave-dire sous
forme de produits intermeacutediaires pour la nutrition humaine animale pour la
dieacuteteacutetique la cosmeacutetique Neacuteanmoins certains co-produits (foies œufs) peuvent
ecirctre vendus agrave lrsquoeacutetat brut aux consommateurs Mais cette tendance est faible et ils
sont (foies œufs) plus utiliseacutes par les industries de conserverie et de saurisserie
(ANDRIEUX 2004)
On peut distinguer quatre (4) categories de produits deacuteriveacutes en fonction de leur
destination
lrsquoutilisation en nutrition humaine ou en alimentation animale
lrsquoutilisation en dieacuteteacutetique ou nutraceutique
32
lrsquoutilisation en cosmeacutetique
utilisation plus restreinte et speacutecifique drsquoun seul type de produit deacuteriveacute
Il existe plusieurs applications possibles des co-produits (figure5) parmi
lesquelles on peut citer
les farines et huiles de poisson
Cette valorisation est actuellement la plus importante car tous les co-produits
peuvent ecirctre utiliseacutes sans distinction Aucun tri nrsquoest neacutecessaire seule la
distinction co- produits issus de poissons sauvages ou drsquoeacutelevage doit ecirctre faite
les hachis
Les co-produits sont broyeacutes et filtreacutes puis le hachi obtenu est congeleacute en bloc
Les co-produits viscegraveres sont exclus de cette valorisation Les hachis sont
destineacutes agrave la fabrication drsquoaliments pour animaux domestiques essentiellement
les chats Ils sont souvent commercialiseacutes sous forme congeleacutee et sont une
bonne source de proteacuteines
les hydrolysats (cf 33)
la production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee (protides lipides)
La production de farine et drsquohuile de poisson repreacutesente toujours en tonnage la
voie de valorisation la plus importante des co-produits de la pecircche (figure 5)
Mais la faible valeur ajouteacutee obtenue avec ces produits incite les industriels agrave
rechercher des deacuteboucheacutes plus rentables productions de sauces de poisson
drsquoaromes de proteacuteines musculaires (surimi) sont autant de valorisation
alternative vers lrsquoindustrie agro-alimentaire (CHING 1999)
33
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
33 Les hydrolysats de poisson
331 Deacutefinition
Les hydrolysats sont des fractions agrave teneur proteacuteique eacuteleveacutee (73 agrave 85) obtenus
par autolyse (uniquement sous lrsquoaction drsquoenzymes endogegravenes) ou heacuteteacuterolyses
(ajout drsquoenzymes exogegravenes) Cependant la proportion en eacuteleacutements mineacuteraux est
assez faible car les arecirctes osseuses non hydrolysables ont eacuteteacute retireacutees Les
hydrolysats ont donc lrsquoavantage drsquoecirctre digeste et drsquoavoir une haute qualiteacute
nutritive
332 Les avantages
Les hydrolysats preacutesentent les mecircmes avantages que les matiegraveres premiegraveres
drsquoorigine animale pour lrsquoaquaculture sans en avoir les nombreux inconveacutenients
(LARBIER et LECLERCQ 1992 ANDERSON et coll 1993) En effet ce
sont des proteacuteines hydrolyseacutees les acides amineacutes essentiels libeacutereacutes sont donc
plus facilement disponibles et assimilables pour les animaux De plus ils
constituent un produit tregraves appeacutetant et parfaitement accepteacute gracircce agrave lrsquoarocircme de
34
poisson et preacutesente une granulomeacutetrie fine facilitant la fabrication drsquoaliments
suivant des proceacutedeacutes tels que la microparticulation (JONES 1995) Enfin les
hydrolysats comportent en geacuteneacuteral peu de mineacuteraux et ne risquent donc pas de
polluer les eaux des eacutelevages aquacoles leur bonne qualiteacute microbiologique
eacutetant assureacutee par la steacuterilisation au cours de la fabrication
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson
3331 En alimentation animale
Les hydrolysats de poisson sont utiliseacutes comme substitut du lait pour les bovins
et les ovins En comparaison avec la caseacuteine les animaux nourris avec les
hydrolysats de poisson gras apregraves un deacutebut de croissance plus lent arrivent au
mecircme poids au bout de quelques semaines (OslashRSKOV et Coll 1982
RITCHIE et MACKIE 1982) De plus une eacutetude eacuteconomique a montreacute les
inteacuterecircts des peptides de poisson en tant que substituts du lait (MERRITT
1982) Pour le beacutetail adulte lrsquoensilage obtenu agrave partir drsquoherbe peut ecirctre
eacutegalement remplaceacute par des hydrolysats de poisson (OUELLET et Coll 1997)
Mais crsquoest dans le domaine de lrsquoaquaculture que ces hydrolysats sont les plus
valoriseacutes En effet en aquaculture la charge reacutecurrente la plus importante est la
source proteacuteique apporteacutee aux animaux Les proteacuteines de poisson hydrolyseacutees
en plus de leur faible coucirct sont drsquoune grande digestibiliteacute De plus de
nombreuses eacutetudes ont montreacute que certains hydrolysats de poisson possegravedent des
proprieacuteteacutes nutraceutiques Ainsi le remplacement des farines de poisson par des
hydrolysats de poisson augmenterait la croissance des crevettes et des larves de
poisson (CORDOVA-MUREATA et GARCIA-CARRENO 2002)
35
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
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79
80
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SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
13 La production et les quantiteacutes deacutebarqueacutees
Depuis trois deacutecennies le secteur de la pecircche a connu une forte croissance au
Seacuteneacutegal Les captures ont eacuteteacute multiplieacutees par huit en 32 ans Les deacutebarquements
des flottilles seacuteneacutegalaises et eacutetrangegraveres ont atteint en 1996 plus de 415 000
tonnes En 1997 le volume deacutebarqueacute est passeacute agrave 421 000 tonnes et en 1998 agrave
425 000 tonnes Cette eacutevolution eacutetant principalement lieacutee agrave lrsquoaugmentation des
petits peacutelagiques mis agrave terre par la pecircche artisanale
(DPM 2003)
14 Contribution eacuteconomique de la pecircche
Au Seacuteneacutegal la pecircche maritime constitue un eacuteleacutement cleacute de lrsquoeacuteconomie avec une
production en valeur de 150 milliards de FCFA environ soit 2 du PIB national
et 16 du PIB du secteur primaire en 2003 Par ailleurs la population active
dans ce secteur est drsquoenviron 600 000 personnes en comptant lrsquoemploi direct et
indirect repreacutesentant environ 17 de la population active totale Les
exportations de produits halieutiques du pays eacutetaient drsquoenviron 2 milliards pour
130 000 tonnes en 2000 et mecircme ulteacuterieurement celles-ci continuaient de
constituer la plus importante source drsquoacquisition de devises du pays Ces
exportations permettent actuellement de payer pregraves de la moitieacute de la facture
peacutetroliegravere
(Ministegravere de lrsquoeacuteconomie et des finances direction de la deacutemographie et des
statistiques 2005)
Gracircce agrave leur disponibiliteacute les produits de la mer peuvent donc apparaicirctre comme
un apport nutritionnel tregraves important drsquoun point de vue alimentaire les produits
halieutiques contribuent pour 60 agrave lrsquoapport en proteacuteine animales des
populations Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de
proteacuteines couvrant 75 de leurs besoins En 1997 la consommation moyenne
annuelle de poisson au Seacuteneacutegal eacutetait de 26kg par habitant pour une
consommation mondiale de 135 kg par habitant (NDOYE ET COLL 2002)
27
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis
21 Nomenclature
Tableau I Nomenclature de la sole tropicale
Nom scientifique
Nom franccedilais En vernaculaire (en wolof)
Nom FAO Nom anglais
Cynoglossus senegalensis
Sole tropicale Tapaleacute Sole-langue Seacuteneacutegalaise
tongue sole
(SERET 1981)
22 Classification systeacutematique
Cynoglossus senegalensis est classeacute comme indiqueacute dans le tableau ci-dessous
Tableau II classification systeacutematique de la sole tropicale
Classe Osteacuteichtyens
Ordre Pleuronectiformes
Famille Cynoglossidae
Genre Cynoglossus
Espegravece senegalensis
(SERET 1981)
23 Caracteacuteristiques morphologiques
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae
Ce sont des poissons marins agrave corps plat diminuant progressivement de largeur
vers lrsquoarriegravere Les deux yeux assez petits sont situeacutes sur le cocircteacute gauche Le
museau est arrondi La bouche est petite infegravere plus au moins arqueacutee Le bord
du pregrave-opercule nrsquoest pas libre et est recouvert par la peau et des eacutecailles Il nrsquoy
a pas de rayons eacutepineux agrave la dorsale et agrave lrsquoanale La dorsale deacutebute en avant de
lrsquoœil dorsal Les rayons de la dorsale et de lrsquoanale sont confluents avec ceux de
28
la caudale qui se termine en pointe Les nageoires pectorales sont absentes ou
rudimentaires Seule la pelvienne de la face oculeacutee est preacutesente elle est situeacutee
sur la ligne meacutediane Le corps est recouvert par des eacutecailles cteacutenoiumldes ou
cycloiumldes (SERET 1981)
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis
Le corps est plat et allongeacute les nageoires dorsale et anale rejoignent la caudale
qui se termine en pointe Les yeux situeacutes sur le cocircteacute gauche du corps ont un
espace assez large entre eux Le museau est largement arrondi le crochet rostral
plutocirct court srsquoeacutetend jusqursquoau niveau de la narine anteacuterieure La bouche srsquoeacutetend
au-delagrave de lrsquoœil ventral La nageoire dorsale compte 119-125 rayons lrsquoanale 93-
99 rayons et la caudale 12 rayons On compte 124-138 eacutecailles tubuleacutees le long
de la ligne margino-dorsale Une ligne lateacuterale meacutediane est visible sur la face
aveugle
Sur la face oculeacutee le corps est plus ou moins uniformeacutement brun plus ou moins
fonceacute avec des reflets verdacirctres visibles sur le vivant la reacutegion de lrsquoopercule
est souvent noiracirctre La face aveugle est blanchacirctre
(SERET 1981)
Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
29
24 Reacutepartition geacuteographique
Cynoglossus senegalensis est une espegravece tregraves cocirctiegravere par rapport aux autres
espegraveces de la famille des cynoglossidae Elle freacutequente les zones sablo vaseuses
cocirctiegraveres entre 10 et 110 megravetres mais les prises maximales sont reacutealiseacutees entre 5
et 15 megravetres de profondeur Elle est connue de la Mauritanie agrave lrsquoAngola Les
reacutepartitions bathymeacutetriques de cette espegravece observeacutees au Seacuteneacutegal Togo-Benin
au Congo et au Cameroun sont similaires
(SERET 1981)
30
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson deacutefinition valorisation et
utilisation
31 Deacutefinition et composition
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
des opeacuterations traditionnelles de production
Les principaux co-produits de poisson rencontreacutes sont la tecircte la peau les
chutes de filetage les arecirctes centrales les viscegraveres le foie et selon les peacuteriodes
de pecircche les eacuteleacutements reproducteurs tels que les œufs ou la laitance (figure3)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
En vue drsquoune valorisation les co-produits sont traiteacutes selon le mecircme protocole
de conservation que les parties destineacutees agrave la production alimentaire
garantissant ainsi leur absence drsquoalteacuteration
32 les voies de valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes
Le produit deacuteriveacute est le produit commercial obtenu agrave partir drsquoun co-produit Un
co-produit pourra donner plusieurs produits deacuteriveacutes (figure4) Ainsi
la tecircte de poisson pourra ecirctre valoriseacutee en tant que farine de poisson huile
ou destineacutee agrave la nutrition
la chair sur les arecirctes en farine de poisson la chair hacheacutee et huile
31
la peau en farine de poisson collagegravene geacutelatine cuir
les viscegraveres en farine de poisson huile vitamines
la carcasse en farine de poisson collagegravene geacutelatine mineacuteraux
(GUERARD et Coll 2004)
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Ces produits sont qualifieacutes de produits deacuteriveacutes et non de produits finis car ils
sont geacuteneacuteralement commercialiseacutes sous forme drsquoingreacutedients crsquoest-agrave-dire sous
forme de produits intermeacutediaires pour la nutrition humaine animale pour la
dieacuteteacutetique la cosmeacutetique Neacuteanmoins certains co-produits (foies œufs) peuvent
ecirctre vendus agrave lrsquoeacutetat brut aux consommateurs Mais cette tendance est faible et ils
sont (foies œufs) plus utiliseacutes par les industries de conserverie et de saurisserie
(ANDRIEUX 2004)
On peut distinguer quatre (4) categories de produits deacuteriveacutes en fonction de leur
destination
lrsquoutilisation en nutrition humaine ou en alimentation animale
lrsquoutilisation en dieacuteteacutetique ou nutraceutique
32
lrsquoutilisation en cosmeacutetique
utilisation plus restreinte et speacutecifique drsquoun seul type de produit deacuteriveacute
Il existe plusieurs applications possibles des co-produits (figure5) parmi
lesquelles on peut citer
les farines et huiles de poisson
Cette valorisation est actuellement la plus importante car tous les co-produits
peuvent ecirctre utiliseacutes sans distinction Aucun tri nrsquoest neacutecessaire seule la
distinction co- produits issus de poissons sauvages ou drsquoeacutelevage doit ecirctre faite
les hachis
Les co-produits sont broyeacutes et filtreacutes puis le hachi obtenu est congeleacute en bloc
Les co-produits viscegraveres sont exclus de cette valorisation Les hachis sont
destineacutes agrave la fabrication drsquoaliments pour animaux domestiques essentiellement
les chats Ils sont souvent commercialiseacutes sous forme congeleacutee et sont une
bonne source de proteacuteines
les hydrolysats (cf 33)
la production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee (protides lipides)
La production de farine et drsquohuile de poisson repreacutesente toujours en tonnage la
voie de valorisation la plus importante des co-produits de la pecircche (figure 5)
Mais la faible valeur ajouteacutee obtenue avec ces produits incite les industriels agrave
rechercher des deacuteboucheacutes plus rentables productions de sauces de poisson
drsquoaromes de proteacuteines musculaires (surimi) sont autant de valorisation
alternative vers lrsquoindustrie agro-alimentaire (CHING 1999)
33
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
33 Les hydrolysats de poisson
331 Deacutefinition
Les hydrolysats sont des fractions agrave teneur proteacuteique eacuteleveacutee (73 agrave 85) obtenus
par autolyse (uniquement sous lrsquoaction drsquoenzymes endogegravenes) ou heacuteteacuterolyses
(ajout drsquoenzymes exogegravenes) Cependant la proportion en eacuteleacutements mineacuteraux est
assez faible car les arecirctes osseuses non hydrolysables ont eacuteteacute retireacutees Les
hydrolysats ont donc lrsquoavantage drsquoecirctre digeste et drsquoavoir une haute qualiteacute
nutritive
332 Les avantages
Les hydrolysats preacutesentent les mecircmes avantages que les matiegraveres premiegraveres
drsquoorigine animale pour lrsquoaquaculture sans en avoir les nombreux inconveacutenients
(LARBIER et LECLERCQ 1992 ANDERSON et coll 1993) En effet ce
sont des proteacuteines hydrolyseacutees les acides amineacutes essentiels libeacutereacutes sont donc
plus facilement disponibles et assimilables pour les animaux De plus ils
constituent un produit tregraves appeacutetant et parfaitement accepteacute gracircce agrave lrsquoarocircme de
34
poisson et preacutesente une granulomeacutetrie fine facilitant la fabrication drsquoaliments
suivant des proceacutedeacutes tels que la microparticulation (JONES 1995) Enfin les
hydrolysats comportent en geacuteneacuteral peu de mineacuteraux et ne risquent donc pas de
polluer les eaux des eacutelevages aquacoles leur bonne qualiteacute microbiologique
eacutetant assureacutee par la steacuterilisation au cours de la fabrication
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson
3331 En alimentation animale
Les hydrolysats de poisson sont utiliseacutes comme substitut du lait pour les bovins
et les ovins En comparaison avec la caseacuteine les animaux nourris avec les
hydrolysats de poisson gras apregraves un deacutebut de croissance plus lent arrivent au
mecircme poids au bout de quelques semaines (OslashRSKOV et Coll 1982
RITCHIE et MACKIE 1982) De plus une eacutetude eacuteconomique a montreacute les
inteacuterecircts des peptides de poisson en tant que substituts du lait (MERRITT
1982) Pour le beacutetail adulte lrsquoensilage obtenu agrave partir drsquoherbe peut ecirctre
eacutegalement remplaceacute par des hydrolysats de poisson (OUELLET et Coll 1997)
Mais crsquoest dans le domaine de lrsquoaquaculture que ces hydrolysats sont les plus
valoriseacutes En effet en aquaculture la charge reacutecurrente la plus importante est la
source proteacuteique apporteacutee aux animaux Les proteacuteines de poisson hydrolyseacutees
en plus de leur faible coucirct sont drsquoune grande digestibiliteacute De plus de
nombreuses eacutetudes ont montreacute que certains hydrolysats de poisson possegravedent des
proprieacuteteacutes nutraceutiques Ainsi le remplacement des farines de poisson par des
hydrolysats de poisson augmenterait la croissance des crevettes et des larves de
poisson (CORDOVA-MUREATA et GARCIA-CARRENO 2002)
35
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
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10 Cuvellier GF 1999 Enzymologie et biocatalyse Dans Biotechnologie Paris Tec et Doc Lavoisier Paris 319-42 11 Dumay J 2006 Extraction de lipides en voie aqueuse par bioreacteur enzymatique combineacute agrave lrsquoultracentrifugation application agrave la valorisation de co-produits de poisson (Sardina pilchardus) Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute bioproceacutedeacutes et biotechnologies marines Lieu de soutenance Ecole Polytechnique de lrsquoUniversiteacute de Nantes 12 Dong YL Sheng G Y Fu J M et Wen K W 2005 Chemical characterization and antianaemia activity of fish protein hydrolysate from Saurida elongata J Sci Food Agric 85 2033-39 13 FAO 1998 The state of world fisheries and aquaculture Rome Italy 14 Fitzgerald AJ Rai P S Marchbank T Taylor G W Ghosh S Ritz B W et Playford R J 2005 Reparative properties of a commercial fish protein hydrolysate preparation Gut 54775-81 15 Gauthier D 2006 Introduction aux techniques utiliseacutees en biochimie le dosage des proteacuteines lten lignegt [accegraves internet] wwwchimiebiochimieumonctoncabchdgsiitubprodosage 16 Gildberg A 1993 Enzymic processing of marine raw materials Process Biochem 28 1-15 17 Gildberg A Brgwald J Johansen A et Stenberg E 1996 Isolation of acid peptide fractions from a fish protein hydrolysate with strong stimulatory effect on atlantic salmon (Salmo salar) head kidney leucocytes Comp Biochem Physiol 114 B 97-101 18 Gildberg A Arnesen J A et Carlehoumlg M 2002 Utilisation of cod backbone by biochemical fractionation Process Biochem 38 475-80
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19 Gueacuterard F Dufosseacute L De La Broise D et Binet A 2001 Enzymatic hydrolysis of protein from yellowfin tuna (Thunnus albacares) wastes using alcalase J Mol Catalysis B Enzymatic 11 1051-9 20 Gueacuterard F Batista I Pires C Thorkelson G et Le Gal Y 2004 Repport on sources and selection criteria for raw material Rapport eacutetabli pour le programme SEAFOODplus- 57 21 Gornall Bardawill et David 1949 J Biol Chem 177 751 [Mise au point dune meacutethode quantitative pour doser les proteacuteines avec le biuret] 22 Hoyle NT et Merrit J H 1994 Quality of fish protein hydrolysates from herring (Clupea harengus) J Food Sci 59 76-9 23 Direction des Pecircches Maritimes (DPM) Centre de Recherche Oceacuteanographiques de Dakar-Thiaroye(CRODT) Rapport final Etude de lrsquoeacutevaluation et de la gestion des ressources halieutiques en Reacutepublique de Seacuteneacutegal Dakar direction des pecircches maritimes 24 Institut Franccedilais pour la Nutrition 1997 Les proteacuteines ndash Tome 2 Caracteacuteristiques des diffeacuterentes sources de proteacuteines alimentaires Paris IFN- Dossier speacutecifique Ndeg9 bis 25 Jones DA 1995 Frippak ndash the facts A response to the article by PR Muir and DC Sutton J Word Aquacult Soc 26(2)220-222 26 Jun SY Park P J Jung W K et Kim S K 2004 Purification and characterization of an antioxydative peptide from enzymatic hydrolysate of yellowfin sole (Limanda aspera) frame protein Eur Food Res Technol 219 pp 20-6 27 Kim SK et Mendis E 2006 Bioactive compounds from marine processing by-products - A review Food Res Int 39383-93 28 Kristinsson HG et Rasco B A 2000 Fish protein hydrolysates Production biochemical and functional properties Critical Reviews in Food Sci and Nutr 40 43-81
77
29 Lalasidis G Bostroumlm S et Sjoumlberg L B 1978 Low molecular weight enzymatic fish protein hydrolysates chemical composition and nutritive values J Agric Food Cehm 28 751-6 30 Liaset B Julsham K et Espe M 2003 Chemical composition and theoretical nutritional evaluation of the produced fractions from enzymic hydrolysis of salmon frames with Protamex Process Biochem 38 1747-59 32 Liaset B Lied E et Espe M 2000 Enzymatic hydrolysis of by-products from the fishfilleting industry chemical characterization and nutritional evaluation J Sci Food Agric 80 881 33 Larbier M et Leclercq B 1992 Les matiegraveres premiegraveres utiliseacutees en aviculture (225 ndash 301) in nutrition et alimentation des volailles Paris INRA 34 Lowry O H Rosebrough NJ Farr AL et Randall R J 1951 Protein measurement with Folin phenol reagent J Biol Chem 193 256 ndash 275 35 Lynch et coll (1998) Lynch JM Barbano DMet Fleming JR ndash Indirect and direct determination of the casein content of milk by Kjeldhal nitrogen analysis collaborative study J AOAC Int 36 Mackie IM 1982 General review of fish protein hydrolysates Animal Feed Sci And Technol 7 113-24 37 Martin AM et Chintalapati S P 1989 Fish offal-peat compost extracts as fermentation substrate Biological wastes 27 281-8 38 Martone et al (2005) Martone CB Peacuterez Borla O et Saacuten chez J J 2005 Fishery by-product as a nutrient source for bacteria and aracha growth media Bioresource Technol 96 383-87 39 Merritt JH 1982 Assessment of the production costs of fish protein hydrolysates Anim Feed Sci Technol 1 147-51
78
40 Ndoye F Moiumlty-maiumlzi P et Broutin c 2002 Le poisson fumeacute sur la petite cocircte Senegalaise 41Oslashrskov ER Soliman H S et Clark C F S 1982 Use of fish protein hydrolysate in milk replacers Anim Feed Sci Tech 7 135 42 Ouellet DR Seoane J R Veira D M et Proulx J G 1997 Effects of supplementation with fish meal or fish protein hydrolysate on growth nutrient digestibility and rumen fermentation of growing cattle fed grass silage Anim Feed Sci Tech 68 307-26 43 Picot L Bordenave S Didelot S Fruitier-Arnaudin I Sannier F Thorkelsson G Bergeacute J P Gueacuterard F Chabeaud A et Piot J M 2006 Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines Process Biochem 41 1217-22 44 Quaglia GB et Orban E 1987 Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysates from sardine (Sardina pilchardus) J Sci Food Agric 38 271-6 45 Rajapakse N Jung W K Mendis E Moon S H et Kim S K 2005 A novel anticoagulant purified from fish protein hydrolysate inhibits factor XIIa and platelet aggregation Life Sciences 76 2607-19 46 Ravallec-Pleacute R 2000 Valorisation dhydrolysats dorigine marine optimisation de la concentration en peptides apparenteacutes aux facteurs de croissance et aux agents seacutecreacutetagogues Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Bretagne Occidentale 47 Ravallec-Pleacute R et Van Wormhoudt A 2003 Secretagogue activities in cod (Gadus morhua) and shrimp (Penaeus aztecus) extracts and alcalase hydrolysates determined in AR4-2J pancreatic tumour cells Comp Biochem Physiol B 134 669-79 48 Rousseau M Batista I Le Gal Y et Fouchereau-Peacuteron M 2001 Purification of a functional competitive antagonist for calcitonin gene related peptide action from sardine hydrolysate EJB 4 25-32 49 Shahidi F Han X et Synowiecki J 1995 Production and characteristics of protein hydrolystaes from capelin (Mallotus villosus) Food Chem 53 285-93
79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
CHAPITRE 2 Etude de la sole tropicale Cynoglossus senegalensis
21 Nomenclature
Tableau I Nomenclature de la sole tropicale
Nom scientifique
Nom franccedilais En vernaculaire (en wolof)
Nom FAO Nom anglais
Cynoglossus senegalensis
Sole tropicale Tapaleacute Sole-langue Seacuteneacutegalaise
tongue sole
(SERET 1981)
22 Classification systeacutematique
Cynoglossus senegalensis est classeacute comme indiqueacute dans le tableau ci-dessous
Tableau II classification systeacutematique de la sole tropicale
Classe Osteacuteichtyens
Ordre Pleuronectiformes
Famille Cynoglossidae
Genre Cynoglossus
Espegravece senegalensis
(SERET 1981)
23 Caracteacuteristiques morphologiques
231 Caracteacuteristiques geacuteneacuterales des cynoglossidae
Ce sont des poissons marins agrave corps plat diminuant progressivement de largeur
vers lrsquoarriegravere Les deux yeux assez petits sont situeacutes sur le cocircteacute gauche Le
museau est arrondi La bouche est petite infegravere plus au moins arqueacutee Le bord
du pregrave-opercule nrsquoest pas libre et est recouvert par la peau et des eacutecailles Il nrsquoy
a pas de rayons eacutepineux agrave la dorsale et agrave lrsquoanale La dorsale deacutebute en avant de
lrsquoœil dorsal Les rayons de la dorsale et de lrsquoanale sont confluents avec ceux de
28
la caudale qui se termine en pointe Les nageoires pectorales sont absentes ou
rudimentaires Seule la pelvienne de la face oculeacutee est preacutesente elle est situeacutee
sur la ligne meacutediane Le corps est recouvert par des eacutecailles cteacutenoiumldes ou
cycloiumldes (SERET 1981)
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis
Le corps est plat et allongeacute les nageoires dorsale et anale rejoignent la caudale
qui se termine en pointe Les yeux situeacutes sur le cocircteacute gauche du corps ont un
espace assez large entre eux Le museau est largement arrondi le crochet rostral
plutocirct court srsquoeacutetend jusqursquoau niveau de la narine anteacuterieure La bouche srsquoeacutetend
au-delagrave de lrsquoœil ventral La nageoire dorsale compte 119-125 rayons lrsquoanale 93-
99 rayons et la caudale 12 rayons On compte 124-138 eacutecailles tubuleacutees le long
de la ligne margino-dorsale Une ligne lateacuterale meacutediane est visible sur la face
aveugle
Sur la face oculeacutee le corps est plus ou moins uniformeacutement brun plus ou moins
fonceacute avec des reflets verdacirctres visibles sur le vivant la reacutegion de lrsquoopercule
est souvent noiracirctre La face aveugle est blanchacirctre
(SERET 1981)
Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
29
24 Reacutepartition geacuteographique
Cynoglossus senegalensis est une espegravece tregraves cocirctiegravere par rapport aux autres
espegraveces de la famille des cynoglossidae Elle freacutequente les zones sablo vaseuses
cocirctiegraveres entre 10 et 110 megravetres mais les prises maximales sont reacutealiseacutees entre 5
et 15 megravetres de profondeur Elle est connue de la Mauritanie agrave lrsquoAngola Les
reacutepartitions bathymeacutetriques de cette espegravece observeacutees au Seacuteneacutegal Togo-Benin
au Congo et au Cameroun sont similaires
(SERET 1981)
30
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson deacutefinition valorisation et
utilisation
31 Deacutefinition et composition
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
des opeacuterations traditionnelles de production
Les principaux co-produits de poisson rencontreacutes sont la tecircte la peau les
chutes de filetage les arecirctes centrales les viscegraveres le foie et selon les peacuteriodes
de pecircche les eacuteleacutements reproducteurs tels que les œufs ou la laitance (figure3)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
En vue drsquoune valorisation les co-produits sont traiteacutes selon le mecircme protocole
de conservation que les parties destineacutees agrave la production alimentaire
garantissant ainsi leur absence drsquoalteacuteration
32 les voies de valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes
Le produit deacuteriveacute est le produit commercial obtenu agrave partir drsquoun co-produit Un
co-produit pourra donner plusieurs produits deacuteriveacutes (figure4) Ainsi
la tecircte de poisson pourra ecirctre valoriseacutee en tant que farine de poisson huile
ou destineacutee agrave la nutrition
la chair sur les arecirctes en farine de poisson la chair hacheacutee et huile
31
la peau en farine de poisson collagegravene geacutelatine cuir
les viscegraveres en farine de poisson huile vitamines
la carcasse en farine de poisson collagegravene geacutelatine mineacuteraux
(GUERARD et Coll 2004)
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Ces produits sont qualifieacutes de produits deacuteriveacutes et non de produits finis car ils
sont geacuteneacuteralement commercialiseacutes sous forme drsquoingreacutedients crsquoest-agrave-dire sous
forme de produits intermeacutediaires pour la nutrition humaine animale pour la
dieacuteteacutetique la cosmeacutetique Neacuteanmoins certains co-produits (foies œufs) peuvent
ecirctre vendus agrave lrsquoeacutetat brut aux consommateurs Mais cette tendance est faible et ils
sont (foies œufs) plus utiliseacutes par les industries de conserverie et de saurisserie
(ANDRIEUX 2004)
On peut distinguer quatre (4) categories de produits deacuteriveacutes en fonction de leur
destination
lrsquoutilisation en nutrition humaine ou en alimentation animale
lrsquoutilisation en dieacuteteacutetique ou nutraceutique
32
lrsquoutilisation en cosmeacutetique
utilisation plus restreinte et speacutecifique drsquoun seul type de produit deacuteriveacute
Il existe plusieurs applications possibles des co-produits (figure5) parmi
lesquelles on peut citer
les farines et huiles de poisson
Cette valorisation est actuellement la plus importante car tous les co-produits
peuvent ecirctre utiliseacutes sans distinction Aucun tri nrsquoest neacutecessaire seule la
distinction co- produits issus de poissons sauvages ou drsquoeacutelevage doit ecirctre faite
les hachis
Les co-produits sont broyeacutes et filtreacutes puis le hachi obtenu est congeleacute en bloc
Les co-produits viscegraveres sont exclus de cette valorisation Les hachis sont
destineacutes agrave la fabrication drsquoaliments pour animaux domestiques essentiellement
les chats Ils sont souvent commercialiseacutes sous forme congeleacutee et sont une
bonne source de proteacuteines
les hydrolysats (cf 33)
la production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee (protides lipides)
La production de farine et drsquohuile de poisson repreacutesente toujours en tonnage la
voie de valorisation la plus importante des co-produits de la pecircche (figure 5)
Mais la faible valeur ajouteacutee obtenue avec ces produits incite les industriels agrave
rechercher des deacuteboucheacutes plus rentables productions de sauces de poisson
drsquoaromes de proteacuteines musculaires (surimi) sont autant de valorisation
alternative vers lrsquoindustrie agro-alimentaire (CHING 1999)
33
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
33 Les hydrolysats de poisson
331 Deacutefinition
Les hydrolysats sont des fractions agrave teneur proteacuteique eacuteleveacutee (73 agrave 85) obtenus
par autolyse (uniquement sous lrsquoaction drsquoenzymes endogegravenes) ou heacuteteacuterolyses
(ajout drsquoenzymes exogegravenes) Cependant la proportion en eacuteleacutements mineacuteraux est
assez faible car les arecirctes osseuses non hydrolysables ont eacuteteacute retireacutees Les
hydrolysats ont donc lrsquoavantage drsquoecirctre digeste et drsquoavoir une haute qualiteacute
nutritive
332 Les avantages
Les hydrolysats preacutesentent les mecircmes avantages que les matiegraveres premiegraveres
drsquoorigine animale pour lrsquoaquaculture sans en avoir les nombreux inconveacutenients
(LARBIER et LECLERCQ 1992 ANDERSON et coll 1993) En effet ce
sont des proteacuteines hydrolyseacutees les acides amineacutes essentiels libeacutereacutes sont donc
plus facilement disponibles et assimilables pour les animaux De plus ils
constituent un produit tregraves appeacutetant et parfaitement accepteacute gracircce agrave lrsquoarocircme de
34
poisson et preacutesente une granulomeacutetrie fine facilitant la fabrication drsquoaliments
suivant des proceacutedeacutes tels que la microparticulation (JONES 1995) Enfin les
hydrolysats comportent en geacuteneacuteral peu de mineacuteraux et ne risquent donc pas de
polluer les eaux des eacutelevages aquacoles leur bonne qualiteacute microbiologique
eacutetant assureacutee par la steacuterilisation au cours de la fabrication
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson
3331 En alimentation animale
Les hydrolysats de poisson sont utiliseacutes comme substitut du lait pour les bovins
et les ovins En comparaison avec la caseacuteine les animaux nourris avec les
hydrolysats de poisson gras apregraves un deacutebut de croissance plus lent arrivent au
mecircme poids au bout de quelques semaines (OslashRSKOV et Coll 1982
RITCHIE et MACKIE 1982) De plus une eacutetude eacuteconomique a montreacute les
inteacuterecircts des peptides de poisson en tant que substituts du lait (MERRITT
1982) Pour le beacutetail adulte lrsquoensilage obtenu agrave partir drsquoherbe peut ecirctre
eacutegalement remplaceacute par des hydrolysats de poisson (OUELLET et Coll 1997)
Mais crsquoest dans le domaine de lrsquoaquaculture que ces hydrolysats sont les plus
valoriseacutes En effet en aquaculture la charge reacutecurrente la plus importante est la
source proteacuteique apporteacutee aux animaux Les proteacuteines de poisson hydrolyseacutees
en plus de leur faible coucirct sont drsquoune grande digestibiliteacute De plus de
nombreuses eacutetudes ont montreacute que certains hydrolysats de poisson possegravedent des
proprieacuteteacutes nutraceutiques Ainsi le remplacement des farines de poisson par des
hydrolysats de poisson augmenterait la croissance des crevettes et des larves de
poisson (CORDOVA-MUREATA et GARCIA-CARRENO 2002)
35
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
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SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
la caudale qui se termine en pointe Les nageoires pectorales sont absentes ou
rudimentaires Seule la pelvienne de la face oculeacutee est preacutesente elle est situeacutee
sur la ligne meacutediane Le corps est recouvert par des eacutecailles cteacutenoiumldes ou
cycloiumldes (SERET 1981)
232 Caracteacuteristiques de Cynoglossus senegalensis
Le corps est plat et allongeacute les nageoires dorsale et anale rejoignent la caudale
qui se termine en pointe Les yeux situeacutes sur le cocircteacute gauche du corps ont un
espace assez large entre eux Le museau est largement arrondi le crochet rostral
plutocirct court srsquoeacutetend jusqursquoau niveau de la narine anteacuterieure La bouche srsquoeacutetend
au-delagrave de lrsquoœil ventral La nageoire dorsale compte 119-125 rayons lrsquoanale 93-
99 rayons et la caudale 12 rayons On compte 124-138 eacutecailles tubuleacutees le long
de la ligne margino-dorsale Une ligne lateacuterale meacutediane est visible sur la face
aveugle
Sur la face oculeacutee le corps est plus ou moins uniformeacutement brun plus ou moins
fonceacute avec des reflets verdacirctres visibles sur le vivant la reacutegion de lrsquoopercule
est souvent noiracirctre La face aveugle est blanchacirctre
(SERET 1981)
Figure 2 Cynoglossus senegalensis (drsquoapregraves SERET et OPIC 1986)
29
24 Reacutepartition geacuteographique
Cynoglossus senegalensis est une espegravece tregraves cocirctiegravere par rapport aux autres
espegraveces de la famille des cynoglossidae Elle freacutequente les zones sablo vaseuses
cocirctiegraveres entre 10 et 110 megravetres mais les prises maximales sont reacutealiseacutees entre 5
et 15 megravetres de profondeur Elle est connue de la Mauritanie agrave lrsquoAngola Les
reacutepartitions bathymeacutetriques de cette espegravece observeacutees au Seacuteneacutegal Togo-Benin
au Congo et au Cameroun sont similaires
(SERET 1981)
30
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson deacutefinition valorisation et
utilisation
31 Deacutefinition et composition
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
des opeacuterations traditionnelles de production
Les principaux co-produits de poisson rencontreacutes sont la tecircte la peau les
chutes de filetage les arecirctes centrales les viscegraveres le foie et selon les peacuteriodes
de pecircche les eacuteleacutements reproducteurs tels que les œufs ou la laitance (figure3)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
En vue drsquoune valorisation les co-produits sont traiteacutes selon le mecircme protocole
de conservation que les parties destineacutees agrave la production alimentaire
garantissant ainsi leur absence drsquoalteacuteration
32 les voies de valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes
Le produit deacuteriveacute est le produit commercial obtenu agrave partir drsquoun co-produit Un
co-produit pourra donner plusieurs produits deacuteriveacutes (figure4) Ainsi
la tecircte de poisson pourra ecirctre valoriseacutee en tant que farine de poisson huile
ou destineacutee agrave la nutrition
la chair sur les arecirctes en farine de poisson la chair hacheacutee et huile
31
la peau en farine de poisson collagegravene geacutelatine cuir
les viscegraveres en farine de poisson huile vitamines
la carcasse en farine de poisson collagegravene geacutelatine mineacuteraux
(GUERARD et Coll 2004)
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Ces produits sont qualifieacutes de produits deacuteriveacutes et non de produits finis car ils
sont geacuteneacuteralement commercialiseacutes sous forme drsquoingreacutedients crsquoest-agrave-dire sous
forme de produits intermeacutediaires pour la nutrition humaine animale pour la
dieacuteteacutetique la cosmeacutetique Neacuteanmoins certains co-produits (foies œufs) peuvent
ecirctre vendus agrave lrsquoeacutetat brut aux consommateurs Mais cette tendance est faible et ils
sont (foies œufs) plus utiliseacutes par les industries de conserverie et de saurisserie
(ANDRIEUX 2004)
On peut distinguer quatre (4) categories de produits deacuteriveacutes en fonction de leur
destination
lrsquoutilisation en nutrition humaine ou en alimentation animale
lrsquoutilisation en dieacuteteacutetique ou nutraceutique
32
lrsquoutilisation en cosmeacutetique
utilisation plus restreinte et speacutecifique drsquoun seul type de produit deacuteriveacute
Il existe plusieurs applications possibles des co-produits (figure5) parmi
lesquelles on peut citer
les farines et huiles de poisson
Cette valorisation est actuellement la plus importante car tous les co-produits
peuvent ecirctre utiliseacutes sans distinction Aucun tri nrsquoest neacutecessaire seule la
distinction co- produits issus de poissons sauvages ou drsquoeacutelevage doit ecirctre faite
les hachis
Les co-produits sont broyeacutes et filtreacutes puis le hachi obtenu est congeleacute en bloc
Les co-produits viscegraveres sont exclus de cette valorisation Les hachis sont
destineacutes agrave la fabrication drsquoaliments pour animaux domestiques essentiellement
les chats Ils sont souvent commercialiseacutes sous forme congeleacutee et sont une
bonne source de proteacuteines
les hydrolysats (cf 33)
la production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee (protides lipides)
La production de farine et drsquohuile de poisson repreacutesente toujours en tonnage la
voie de valorisation la plus importante des co-produits de la pecircche (figure 5)
Mais la faible valeur ajouteacutee obtenue avec ces produits incite les industriels agrave
rechercher des deacuteboucheacutes plus rentables productions de sauces de poisson
drsquoaromes de proteacuteines musculaires (surimi) sont autant de valorisation
alternative vers lrsquoindustrie agro-alimentaire (CHING 1999)
33
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
33 Les hydrolysats de poisson
331 Deacutefinition
Les hydrolysats sont des fractions agrave teneur proteacuteique eacuteleveacutee (73 agrave 85) obtenus
par autolyse (uniquement sous lrsquoaction drsquoenzymes endogegravenes) ou heacuteteacuterolyses
(ajout drsquoenzymes exogegravenes) Cependant la proportion en eacuteleacutements mineacuteraux est
assez faible car les arecirctes osseuses non hydrolysables ont eacuteteacute retireacutees Les
hydrolysats ont donc lrsquoavantage drsquoecirctre digeste et drsquoavoir une haute qualiteacute
nutritive
332 Les avantages
Les hydrolysats preacutesentent les mecircmes avantages que les matiegraveres premiegraveres
drsquoorigine animale pour lrsquoaquaculture sans en avoir les nombreux inconveacutenients
(LARBIER et LECLERCQ 1992 ANDERSON et coll 1993) En effet ce
sont des proteacuteines hydrolyseacutees les acides amineacutes essentiels libeacutereacutes sont donc
plus facilement disponibles et assimilables pour les animaux De plus ils
constituent un produit tregraves appeacutetant et parfaitement accepteacute gracircce agrave lrsquoarocircme de
34
poisson et preacutesente une granulomeacutetrie fine facilitant la fabrication drsquoaliments
suivant des proceacutedeacutes tels que la microparticulation (JONES 1995) Enfin les
hydrolysats comportent en geacuteneacuteral peu de mineacuteraux et ne risquent donc pas de
polluer les eaux des eacutelevages aquacoles leur bonne qualiteacute microbiologique
eacutetant assureacutee par la steacuterilisation au cours de la fabrication
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson
3331 En alimentation animale
Les hydrolysats de poisson sont utiliseacutes comme substitut du lait pour les bovins
et les ovins En comparaison avec la caseacuteine les animaux nourris avec les
hydrolysats de poisson gras apregraves un deacutebut de croissance plus lent arrivent au
mecircme poids au bout de quelques semaines (OslashRSKOV et Coll 1982
RITCHIE et MACKIE 1982) De plus une eacutetude eacuteconomique a montreacute les
inteacuterecircts des peptides de poisson en tant que substituts du lait (MERRITT
1982) Pour le beacutetail adulte lrsquoensilage obtenu agrave partir drsquoherbe peut ecirctre
eacutegalement remplaceacute par des hydrolysats de poisson (OUELLET et Coll 1997)
Mais crsquoest dans le domaine de lrsquoaquaculture que ces hydrolysats sont les plus
valoriseacutes En effet en aquaculture la charge reacutecurrente la plus importante est la
source proteacuteique apporteacutee aux animaux Les proteacuteines de poisson hydrolyseacutees
en plus de leur faible coucirct sont drsquoune grande digestibiliteacute De plus de
nombreuses eacutetudes ont montreacute que certains hydrolysats de poisson possegravedent des
proprieacuteteacutes nutraceutiques Ainsi le remplacement des farines de poisson par des
hydrolysats de poisson augmenterait la croissance des crevettes et des larves de
poisson (CORDOVA-MUREATA et GARCIA-CARRENO 2002)
35
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
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79
80
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SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
24 Reacutepartition geacuteographique
Cynoglossus senegalensis est une espegravece tregraves cocirctiegravere par rapport aux autres
espegraveces de la famille des cynoglossidae Elle freacutequente les zones sablo vaseuses
cocirctiegraveres entre 10 et 110 megravetres mais les prises maximales sont reacutealiseacutees entre 5
et 15 megravetres de profondeur Elle est connue de la Mauritanie agrave lrsquoAngola Les
reacutepartitions bathymeacutetriques de cette espegravece observeacutees au Seacuteneacutegal Togo-Benin
au Congo et au Cameroun sont similaires
(SERET 1981)
30
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson deacutefinition valorisation et
utilisation
31 Deacutefinition et composition
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
des opeacuterations traditionnelles de production
Les principaux co-produits de poisson rencontreacutes sont la tecircte la peau les
chutes de filetage les arecirctes centrales les viscegraveres le foie et selon les peacuteriodes
de pecircche les eacuteleacutements reproducteurs tels que les œufs ou la laitance (figure3)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
En vue drsquoune valorisation les co-produits sont traiteacutes selon le mecircme protocole
de conservation que les parties destineacutees agrave la production alimentaire
garantissant ainsi leur absence drsquoalteacuteration
32 les voies de valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes
Le produit deacuteriveacute est le produit commercial obtenu agrave partir drsquoun co-produit Un
co-produit pourra donner plusieurs produits deacuteriveacutes (figure4) Ainsi
la tecircte de poisson pourra ecirctre valoriseacutee en tant que farine de poisson huile
ou destineacutee agrave la nutrition
la chair sur les arecirctes en farine de poisson la chair hacheacutee et huile
31
la peau en farine de poisson collagegravene geacutelatine cuir
les viscegraveres en farine de poisson huile vitamines
la carcasse en farine de poisson collagegravene geacutelatine mineacuteraux
(GUERARD et Coll 2004)
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Ces produits sont qualifieacutes de produits deacuteriveacutes et non de produits finis car ils
sont geacuteneacuteralement commercialiseacutes sous forme drsquoingreacutedients crsquoest-agrave-dire sous
forme de produits intermeacutediaires pour la nutrition humaine animale pour la
dieacuteteacutetique la cosmeacutetique Neacuteanmoins certains co-produits (foies œufs) peuvent
ecirctre vendus agrave lrsquoeacutetat brut aux consommateurs Mais cette tendance est faible et ils
sont (foies œufs) plus utiliseacutes par les industries de conserverie et de saurisserie
(ANDRIEUX 2004)
On peut distinguer quatre (4) categories de produits deacuteriveacutes en fonction de leur
destination
lrsquoutilisation en nutrition humaine ou en alimentation animale
lrsquoutilisation en dieacuteteacutetique ou nutraceutique
32
lrsquoutilisation en cosmeacutetique
utilisation plus restreinte et speacutecifique drsquoun seul type de produit deacuteriveacute
Il existe plusieurs applications possibles des co-produits (figure5) parmi
lesquelles on peut citer
les farines et huiles de poisson
Cette valorisation est actuellement la plus importante car tous les co-produits
peuvent ecirctre utiliseacutes sans distinction Aucun tri nrsquoest neacutecessaire seule la
distinction co- produits issus de poissons sauvages ou drsquoeacutelevage doit ecirctre faite
les hachis
Les co-produits sont broyeacutes et filtreacutes puis le hachi obtenu est congeleacute en bloc
Les co-produits viscegraveres sont exclus de cette valorisation Les hachis sont
destineacutes agrave la fabrication drsquoaliments pour animaux domestiques essentiellement
les chats Ils sont souvent commercialiseacutes sous forme congeleacutee et sont une
bonne source de proteacuteines
les hydrolysats (cf 33)
la production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee (protides lipides)
La production de farine et drsquohuile de poisson repreacutesente toujours en tonnage la
voie de valorisation la plus importante des co-produits de la pecircche (figure 5)
Mais la faible valeur ajouteacutee obtenue avec ces produits incite les industriels agrave
rechercher des deacuteboucheacutes plus rentables productions de sauces de poisson
drsquoaromes de proteacuteines musculaires (surimi) sont autant de valorisation
alternative vers lrsquoindustrie agro-alimentaire (CHING 1999)
33
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
33 Les hydrolysats de poisson
331 Deacutefinition
Les hydrolysats sont des fractions agrave teneur proteacuteique eacuteleveacutee (73 agrave 85) obtenus
par autolyse (uniquement sous lrsquoaction drsquoenzymes endogegravenes) ou heacuteteacuterolyses
(ajout drsquoenzymes exogegravenes) Cependant la proportion en eacuteleacutements mineacuteraux est
assez faible car les arecirctes osseuses non hydrolysables ont eacuteteacute retireacutees Les
hydrolysats ont donc lrsquoavantage drsquoecirctre digeste et drsquoavoir une haute qualiteacute
nutritive
332 Les avantages
Les hydrolysats preacutesentent les mecircmes avantages que les matiegraveres premiegraveres
drsquoorigine animale pour lrsquoaquaculture sans en avoir les nombreux inconveacutenients
(LARBIER et LECLERCQ 1992 ANDERSON et coll 1993) En effet ce
sont des proteacuteines hydrolyseacutees les acides amineacutes essentiels libeacutereacutes sont donc
plus facilement disponibles et assimilables pour les animaux De plus ils
constituent un produit tregraves appeacutetant et parfaitement accepteacute gracircce agrave lrsquoarocircme de
34
poisson et preacutesente une granulomeacutetrie fine facilitant la fabrication drsquoaliments
suivant des proceacutedeacutes tels que la microparticulation (JONES 1995) Enfin les
hydrolysats comportent en geacuteneacuteral peu de mineacuteraux et ne risquent donc pas de
polluer les eaux des eacutelevages aquacoles leur bonne qualiteacute microbiologique
eacutetant assureacutee par la steacuterilisation au cours de la fabrication
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson
3331 En alimentation animale
Les hydrolysats de poisson sont utiliseacutes comme substitut du lait pour les bovins
et les ovins En comparaison avec la caseacuteine les animaux nourris avec les
hydrolysats de poisson gras apregraves un deacutebut de croissance plus lent arrivent au
mecircme poids au bout de quelques semaines (OslashRSKOV et Coll 1982
RITCHIE et MACKIE 1982) De plus une eacutetude eacuteconomique a montreacute les
inteacuterecircts des peptides de poisson en tant que substituts du lait (MERRITT
1982) Pour le beacutetail adulte lrsquoensilage obtenu agrave partir drsquoherbe peut ecirctre
eacutegalement remplaceacute par des hydrolysats de poisson (OUELLET et Coll 1997)
Mais crsquoest dans le domaine de lrsquoaquaculture que ces hydrolysats sont les plus
valoriseacutes En effet en aquaculture la charge reacutecurrente la plus importante est la
source proteacuteique apporteacutee aux animaux Les proteacuteines de poisson hydrolyseacutees
en plus de leur faible coucirct sont drsquoune grande digestibiliteacute De plus de
nombreuses eacutetudes ont montreacute que certains hydrolysats de poisson possegravedent des
proprieacuteteacutes nutraceutiques Ainsi le remplacement des farines de poisson par des
hydrolysats de poisson augmenterait la croissance des crevettes et des larves de
poisson (CORDOVA-MUREATA et GARCIA-CARRENO 2002)
35
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
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79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
CHAPITRE 3 Les Co-produits de poisson deacutefinition valorisation et
utilisation
31 Deacutefinition et composition
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
des opeacuterations traditionnelles de production
Les principaux co-produits de poisson rencontreacutes sont la tecircte la peau les
chutes de filetage les arecirctes centrales les viscegraveres le foie et selon les peacuteriodes
de pecircche les eacuteleacutements reproducteurs tels que les œufs ou la laitance (figure3)
Figure 3 Les principaux co-produits de Cynoglossus senegalensis
En vue drsquoune valorisation les co-produits sont traiteacutes selon le mecircme protocole
de conservation que les parties destineacutees agrave la production alimentaire
garantissant ainsi leur absence drsquoalteacuteration
32 les voies de valorisation des co-produits les produits deacuteriveacutes
Le produit deacuteriveacute est le produit commercial obtenu agrave partir drsquoun co-produit Un
co-produit pourra donner plusieurs produits deacuteriveacutes (figure4) Ainsi
la tecircte de poisson pourra ecirctre valoriseacutee en tant que farine de poisson huile
ou destineacutee agrave la nutrition
la chair sur les arecirctes en farine de poisson la chair hacheacutee et huile
31
la peau en farine de poisson collagegravene geacutelatine cuir
les viscegraveres en farine de poisson huile vitamines
la carcasse en farine de poisson collagegravene geacutelatine mineacuteraux
(GUERARD et Coll 2004)
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Ces produits sont qualifieacutes de produits deacuteriveacutes et non de produits finis car ils
sont geacuteneacuteralement commercialiseacutes sous forme drsquoingreacutedients crsquoest-agrave-dire sous
forme de produits intermeacutediaires pour la nutrition humaine animale pour la
dieacuteteacutetique la cosmeacutetique Neacuteanmoins certains co-produits (foies œufs) peuvent
ecirctre vendus agrave lrsquoeacutetat brut aux consommateurs Mais cette tendance est faible et ils
sont (foies œufs) plus utiliseacutes par les industries de conserverie et de saurisserie
(ANDRIEUX 2004)
On peut distinguer quatre (4) categories de produits deacuteriveacutes en fonction de leur
destination
lrsquoutilisation en nutrition humaine ou en alimentation animale
lrsquoutilisation en dieacuteteacutetique ou nutraceutique
32
lrsquoutilisation en cosmeacutetique
utilisation plus restreinte et speacutecifique drsquoun seul type de produit deacuteriveacute
Il existe plusieurs applications possibles des co-produits (figure5) parmi
lesquelles on peut citer
les farines et huiles de poisson
Cette valorisation est actuellement la plus importante car tous les co-produits
peuvent ecirctre utiliseacutes sans distinction Aucun tri nrsquoest neacutecessaire seule la
distinction co- produits issus de poissons sauvages ou drsquoeacutelevage doit ecirctre faite
les hachis
Les co-produits sont broyeacutes et filtreacutes puis le hachi obtenu est congeleacute en bloc
Les co-produits viscegraveres sont exclus de cette valorisation Les hachis sont
destineacutes agrave la fabrication drsquoaliments pour animaux domestiques essentiellement
les chats Ils sont souvent commercialiseacutes sous forme congeleacutee et sont une
bonne source de proteacuteines
les hydrolysats (cf 33)
la production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee (protides lipides)
La production de farine et drsquohuile de poisson repreacutesente toujours en tonnage la
voie de valorisation la plus importante des co-produits de la pecircche (figure 5)
Mais la faible valeur ajouteacutee obtenue avec ces produits incite les industriels agrave
rechercher des deacuteboucheacutes plus rentables productions de sauces de poisson
drsquoaromes de proteacuteines musculaires (surimi) sont autant de valorisation
alternative vers lrsquoindustrie agro-alimentaire (CHING 1999)
33
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
33 Les hydrolysats de poisson
331 Deacutefinition
Les hydrolysats sont des fractions agrave teneur proteacuteique eacuteleveacutee (73 agrave 85) obtenus
par autolyse (uniquement sous lrsquoaction drsquoenzymes endogegravenes) ou heacuteteacuterolyses
(ajout drsquoenzymes exogegravenes) Cependant la proportion en eacuteleacutements mineacuteraux est
assez faible car les arecirctes osseuses non hydrolysables ont eacuteteacute retireacutees Les
hydrolysats ont donc lrsquoavantage drsquoecirctre digeste et drsquoavoir une haute qualiteacute
nutritive
332 Les avantages
Les hydrolysats preacutesentent les mecircmes avantages que les matiegraveres premiegraveres
drsquoorigine animale pour lrsquoaquaculture sans en avoir les nombreux inconveacutenients
(LARBIER et LECLERCQ 1992 ANDERSON et coll 1993) En effet ce
sont des proteacuteines hydrolyseacutees les acides amineacutes essentiels libeacutereacutes sont donc
plus facilement disponibles et assimilables pour les animaux De plus ils
constituent un produit tregraves appeacutetant et parfaitement accepteacute gracircce agrave lrsquoarocircme de
34
poisson et preacutesente une granulomeacutetrie fine facilitant la fabrication drsquoaliments
suivant des proceacutedeacutes tels que la microparticulation (JONES 1995) Enfin les
hydrolysats comportent en geacuteneacuteral peu de mineacuteraux et ne risquent donc pas de
polluer les eaux des eacutelevages aquacoles leur bonne qualiteacute microbiologique
eacutetant assureacutee par la steacuterilisation au cours de la fabrication
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson
3331 En alimentation animale
Les hydrolysats de poisson sont utiliseacutes comme substitut du lait pour les bovins
et les ovins En comparaison avec la caseacuteine les animaux nourris avec les
hydrolysats de poisson gras apregraves un deacutebut de croissance plus lent arrivent au
mecircme poids au bout de quelques semaines (OslashRSKOV et Coll 1982
RITCHIE et MACKIE 1982) De plus une eacutetude eacuteconomique a montreacute les
inteacuterecircts des peptides de poisson en tant que substituts du lait (MERRITT
1982) Pour le beacutetail adulte lrsquoensilage obtenu agrave partir drsquoherbe peut ecirctre
eacutegalement remplaceacute par des hydrolysats de poisson (OUELLET et Coll 1997)
Mais crsquoest dans le domaine de lrsquoaquaculture que ces hydrolysats sont les plus
valoriseacutes En effet en aquaculture la charge reacutecurrente la plus importante est la
source proteacuteique apporteacutee aux animaux Les proteacuteines de poisson hydrolyseacutees
en plus de leur faible coucirct sont drsquoune grande digestibiliteacute De plus de
nombreuses eacutetudes ont montreacute que certains hydrolysats de poisson possegravedent des
proprieacuteteacutes nutraceutiques Ainsi le remplacement des farines de poisson par des
hydrolysats de poisson augmenterait la croissance des crevettes et des larves de
poisson (CORDOVA-MUREATA et GARCIA-CARRENO 2002)
35
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
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SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
la peau en farine de poisson collagegravene geacutelatine cuir
les viscegraveres en farine de poisson huile vitamines
la carcasse en farine de poisson collagegravene geacutelatine mineacuteraux
(GUERARD et Coll 2004)
Figure 4 les produits deacuteriveacutes des co-produits de la sole tropicale
Ces produits sont qualifieacutes de produits deacuteriveacutes et non de produits finis car ils
sont geacuteneacuteralement commercialiseacutes sous forme drsquoingreacutedients crsquoest-agrave-dire sous
forme de produits intermeacutediaires pour la nutrition humaine animale pour la
dieacuteteacutetique la cosmeacutetique Neacuteanmoins certains co-produits (foies œufs) peuvent
ecirctre vendus agrave lrsquoeacutetat brut aux consommateurs Mais cette tendance est faible et ils
sont (foies œufs) plus utiliseacutes par les industries de conserverie et de saurisserie
(ANDRIEUX 2004)
On peut distinguer quatre (4) categories de produits deacuteriveacutes en fonction de leur
destination
lrsquoutilisation en nutrition humaine ou en alimentation animale
lrsquoutilisation en dieacuteteacutetique ou nutraceutique
32
lrsquoutilisation en cosmeacutetique
utilisation plus restreinte et speacutecifique drsquoun seul type de produit deacuteriveacute
Il existe plusieurs applications possibles des co-produits (figure5) parmi
lesquelles on peut citer
les farines et huiles de poisson
Cette valorisation est actuellement la plus importante car tous les co-produits
peuvent ecirctre utiliseacutes sans distinction Aucun tri nrsquoest neacutecessaire seule la
distinction co- produits issus de poissons sauvages ou drsquoeacutelevage doit ecirctre faite
les hachis
Les co-produits sont broyeacutes et filtreacutes puis le hachi obtenu est congeleacute en bloc
Les co-produits viscegraveres sont exclus de cette valorisation Les hachis sont
destineacutes agrave la fabrication drsquoaliments pour animaux domestiques essentiellement
les chats Ils sont souvent commercialiseacutes sous forme congeleacutee et sont une
bonne source de proteacuteines
les hydrolysats (cf 33)
la production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee (protides lipides)
La production de farine et drsquohuile de poisson repreacutesente toujours en tonnage la
voie de valorisation la plus importante des co-produits de la pecircche (figure 5)
Mais la faible valeur ajouteacutee obtenue avec ces produits incite les industriels agrave
rechercher des deacuteboucheacutes plus rentables productions de sauces de poisson
drsquoaromes de proteacuteines musculaires (surimi) sont autant de valorisation
alternative vers lrsquoindustrie agro-alimentaire (CHING 1999)
33
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
33 Les hydrolysats de poisson
331 Deacutefinition
Les hydrolysats sont des fractions agrave teneur proteacuteique eacuteleveacutee (73 agrave 85) obtenus
par autolyse (uniquement sous lrsquoaction drsquoenzymes endogegravenes) ou heacuteteacuterolyses
(ajout drsquoenzymes exogegravenes) Cependant la proportion en eacuteleacutements mineacuteraux est
assez faible car les arecirctes osseuses non hydrolysables ont eacuteteacute retireacutees Les
hydrolysats ont donc lrsquoavantage drsquoecirctre digeste et drsquoavoir une haute qualiteacute
nutritive
332 Les avantages
Les hydrolysats preacutesentent les mecircmes avantages que les matiegraveres premiegraveres
drsquoorigine animale pour lrsquoaquaculture sans en avoir les nombreux inconveacutenients
(LARBIER et LECLERCQ 1992 ANDERSON et coll 1993) En effet ce
sont des proteacuteines hydrolyseacutees les acides amineacutes essentiels libeacutereacutes sont donc
plus facilement disponibles et assimilables pour les animaux De plus ils
constituent un produit tregraves appeacutetant et parfaitement accepteacute gracircce agrave lrsquoarocircme de
34
poisson et preacutesente une granulomeacutetrie fine facilitant la fabrication drsquoaliments
suivant des proceacutedeacutes tels que la microparticulation (JONES 1995) Enfin les
hydrolysats comportent en geacuteneacuteral peu de mineacuteraux et ne risquent donc pas de
polluer les eaux des eacutelevages aquacoles leur bonne qualiteacute microbiologique
eacutetant assureacutee par la steacuterilisation au cours de la fabrication
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson
3331 En alimentation animale
Les hydrolysats de poisson sont utiliseacutes comme substitut du lait pour les bovins
et les ovins En comparaison avec la caseacuteine les animaux nourris avec les
hydrolysats de poisson gras apregraves un deacutebut de croissance plus lent arrivent au
mecircme poids au bout de quelques semaines (OslashRSKOV et Coll 1982
RITCHIE et MACKIE 1982) De plus une eacutetude eacuteconomique a montreacute les
inteacuterecircts des peptides de poisson en tant que substituts du lait (MERRITT
1982) Pour le beacutetail adulte lrsquoensilage obtenu agrave partir drsquoherbe peut ecirctre
eacutegalement remplaceacute par des hydrolysats de poisson (OUELLET et Coll 1997)
Mais crsquoest dans le domaine de lrsquoaquaculture que ces hydrolysats sont les plus
valoriseacutes En effet en aquaculture la charge reacutecurrente la plus importante est la
source proteacuteique apporteacutee aux animaux Les proteacuteines de poisson hydrolyseacutees
en plus de leur faible coucirct sont drsquoune grande digestibiliteacute De plus de
nombreuses eacutetudes ont montreacute que certains hydrolysats de poisson possegravedent des
proprieacuteteacutes nutraceutiques Ainsi le remplacement des farines de poisson par des
hydrolysats de poisson augmenterait la croissance des crevettes et des larves de
poisson (CORDOVA-MUREATA et GARCIA-CARRENO 2002)
35
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
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80
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SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
lrsquoutilisation en cosmeacutetique
utilisation plus restreinte et speacutecifique drsquoun seul type de produit deacuteriveacute
Il existe plusieurs applications possibles des co-produits (figure5) parmi
lesquelles on peut citer
les farines et huiles de poisson
Cette valorisation est actuellement la plus importante car tous les co-produits
peuvent ecirctre utiliseacutes sans distinction Aucun tri nrsquoest neacutecessaire seule la
distinction co- produits issus de poissons sauvages ou drsquoeacutelevage doit ecirctre faite
les hachis
Les co-produits sont broyeacutes et filtreacutes puis le hachi obtenu est congeleacute en bloc
Les co-produits viscegraveres sont exclus de cette valorisation Les hachis sont
destineacutes agrave la fabrication drsquoaliments pour animaux domestiques essentiellement
les chats Ils sont souvent commercialiseacutes sous forme congeleacutee et sont une
bonne source de proteacuteines
les hydrolysats (cf 33)
la production de composeacutes de haute valeur ajouteacutee (protides lipides)
La production de farine et drsquohuile de poisson repreacutesente toujours en tonnage la
voie de valorisation la plus importante des co-produits de la pecircche (figure 5)
Mais la faible valeur ajouteacutee obtenue avec ces produits incite les industriels agrave
rechercher des deacuteboucheacutes plus rentables productions de sauces de poisson
drsquoaromes de proteacuteines musculaires (surimi) sont autant de valorisation
alternative vers lrsquoindustrie agro-alimentaire (CHING 1999)
33
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
33 Les hydrolysats de poisson
331 Deacutefinition
Les hydrolysats sont des fractions agrave teneur proteacuteique eacuteleveacutee (73 agrave 85) obtenus
par autolyse (uniquement sous lrsquoaction drsquoenzymes endogegravenes) ou heacuteteacuterolyses
(ajout drsquoenzymes exogegravenes) Cependant la proportion en eacuteleacutements mineacuteraux est
assez faible car les arecirctes osseuses non hydrolysables ont eacuteteacute retireacutees Les
hydrolysats ont donc lrsquoavantage drsquoecirctre digeste et drsquoavoir une haute qualiteacute
nutritive
332 Les avantages
Les hydrolysats preacutesentent les mecircmes avantages que les matiegraveres premiegraveres
drsquoorigine animale pour lrsquoaquaculture sans en avoir les nombreux inconveacutenients
(LARBIER et LECLERCQ 1992 ANDERSON et coll 1993) En effet ce
sont des proteacuteines hydrolyseacutees les acides amineacutes essentiels libeacutereacutes sont donc
plus facilement disponibles et assimilables pour les animaux De plus ils
constituent un produit tregraves appeacutetant et parfaitement accepteacute gracircce agrave lrsquoarocircme de
34
poisson et preacutesente une granulomeacutetrie fine facilitant la fabrication drsquoaliments
suivant des proceacutedeacutes tels que la microparticulation (JONES 1995) Enfin les
hydrolysats comportent en geacuteneacuteral peu de mineacuteraux et ne risquent donc pas de
polluer les eaux des eacutelevages aquacoles leur bonne qualiteacute microbiologique
eacutetant assureacutee par la steacuterilisation au cours de la fabrication
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson
3331 En alimentation animale
Les hydrolysats de poisson sont utiliseacutes comme substitut du lait pour les bovins
et les ovins En comparaison avec la caseacuteine les animaux nourris avec les
hydrolysats de poisson gras apregraves un deacutebut de croissance plus lent arrivent au
mecircme poids au bout de quelques semaines (OslashRSKOV et Coll 1982
RITCHIE et MACKIE 1982) De plus une eacutetude eacuteconomique a montreacute les
inteacuterecircts des peptides de poisson en tant que substituts du lait (MERRITT
1982) Pour le beacutetail adulte lrsquoensilage obtenu agrave partir drsquoherbe peut ecirctre
eacutegalement remplaceacute par des hydrolysats de poisson (OUELLET et Coll 1997)
Mais crsquoest dans le domaine de lrsquoaquaculture que ces hydrolysats sont les plus
valoriseacutes En effet en aquaculture la charge reacutecurrente la plus importante est la
source proteacuteique apporteacutee aux animaux Les proteacuteines de poisson hydrolyseacutees
en plus de leur faible coucirct sont drsquoune grande digestibiliteacute De plus de
nombreuses eacutetudes ont montreacute que certains hydrolysats de poisson possegravedent des
proprieacuteteacutes nutraceutiques Ainsi le remplacement des farines de poisson par des
hydrolysats de poisson augmenterait la croissance des crevettes et des larves de
poisson (CORDOVA-MUREATA et GARCIA-CARRENO 2002)
35
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
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78
40 Ndoye F Moiumlty-maiumlzi P et Broutin c 2002 Le poisson fumeacute sur la petite cocircte Senegalaise 41Oslashrskov ER Soliman H S et Clark C F S 1982 Use of fish protein hydrolysate in milk replacers Anim Feed Sci Tech 7 135 42 Ouellet DR Seoane J R Veira D M et Proulx J G 1997 Effects of supplementation with fish meal or fish protein hydrolysate on growth nutrient digestibility and rumen fermentation of growing cattle fed grass silage Anim Feed Sci Tech 68 307-26 43 Picot L Bordenave S Didelot S Fruitier-Arnaudin I Sannier F Thorkelsson G Bergeacute J P Gueacuterard F Chabeaud A et Piot J M 2006 Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines Process Biochem 41 1217-22 44 Quaglia GB et Orban E 1987 Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysates from sardine (Sardina pilchardus) J Sci Food Agric 38 271-6 45 Rajapakse N Jung W K Mendis E Moon S H et Kim S K 2005 A novel anticoagulant purified from fish protein hydrolysate inhibits factor XIIa and platelet aggregation Life Sciences 76 2607-19 46 Ravallec-Pleacute R 2000 Valorisation dhydrolysats dorigine marine optimisation de la concentration en peptides apparenteacutes aux facteurs de croissance et aux agents seacutecreacutetagogues Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Bretagne Occidentale 47 Ravallec-Pleacute R et Van Wormhoudt A 2003 Secretagogue activities in cod (Gadus morhua) and shrimp (Penaeus aztecus) extracts and alcalase hydrolysates determined in AR4-2J pancreatic tumour cells Comp Biochem Physiol B 134 669-79 48 Rousseau M Batista I Le Gal Y et Fouchereau-Peacuteron M 2001 Purification of a functional competitive antagonist for calcitonin gene related peptide action from sardine hydrolysate EJB 4 25-32 49 Shahidi F Han X et Synowiecki J 1995 Production and characteristics of protein hydrolystaes from capelin (Mallotus villosus) Food Chem 53 285-93
79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
Figure 5 Proportions des diffeacuterentes voies de valorisation des co-produits
drsquoorigine marine (ANDRIEUX 2004)
33 Les hydrolysats de poisson
331 Deacutefinition
Les hydrolysats sont des fractions agrave teneur proteacuteique eacuteleveacutee (73 agrave 85) obtenus
par autolyse (uniquement sous lrsquoaction drsquoenzymes endogegravenes) ou heacuteteacuterolyses
(ajout drsquoenzymes exogegravenes) Cependant la proportion en eacuteleacutements mineacuteraux est
assez faible car les arecirctes osseuses non hydrolysables ont eacuteteacute retireacutees Les
hydrolysats ont donc lrsquoavantage drsquoecirctre digeste et drsquoavoir une haute qualiteacute
nutritive
332 Les avantages
Les hydrolysats preacutesentent les mecircmes avantages que les matiegraveres premiegraveres
drsquoorigine animale pour lrsquoaquaculture sans en avoir les nombreux inconveacutenients
(LARBIER et LECLERCQ 1992 ANDERSON et coll 1993) En effet ce
sont des proteacuteines hydrolyseacutees les acides amineacutes essentiels libeacutereacutes sont donc
plus facilement disponibles et assimilables pour les animaux De plus ils
constituent un produit tregraves appeacutetant et parfaitement accepteacute gracircce agrave lrsquoarocircme de
34
poisson et preacutesente une granulomeacutetrie fine facilitant la fabrication drsquoaliments
suivant des proceacutedeacutes tels que la microparticulation (JONES 1995) Enfin les
hydrolysats comportent en geacuteneacuteral peu de mineacuteraux et ne risquent donc pas de
polluer les eaux des eacutelevages aquacoles leur bonne qualiteacute microbiologique
eacutetant assureacutee par la steacuterilisation au cours de la fabrication
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson
3331 En alimentation animale
Les hydrolysats de poisson sont utiliseacutes comme substitut du lait pour les bovins
et les ovins En comparaison avec la caseacuteine les animaux nourris avec les
hydrolysats de poisson gras apregraves un deacutebut de croissance plus lent arrivent au
mecircme poids au bout de quelques semaines (OslashRSKOV et Coll 1982
RITCHIE et MACKIE 1982) De plus une eacutetude eacuteconomique a montreacute les
inteacuterecircts des peptides de poisson en tant que substituts du lait (MERRITT
1982) Pour le beacutetail adulte lrsquoensilage obtenu agrave partir drsquoherbe peut ecirctre
eacutegalement remplaceacute par des hydrolysats de poisson (OUELLET et Coll 1997)
Mais crsquoest dans le domaine de lrsquoaquaculture que ces hydrolysats sont les plus
valoriseacutes En effet en aquaculture la charge reacutecurrente la plus importante est la
source proteacuteique apporteacutee aux animaux Les proteacuteines de poisson hydrolyseacutees
en plus de leur faible coucirct sont drsquoune grande digestibiliteacute De plus de
nombreuses eacutetudes ont montreacute que certains hydrolysats de poisson possegravedent des
proprieacuteteacutes nutraceutiques Ainsi le remplacement des farines de poisson par des
hydrolysats de poisson augmenterait la croissance des crevettes et des larves de
poisson (CORDOVA-MUREATA et GARCIA-CARRENO 2002)
35
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
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80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
poisson et preacutesente une granulomeacutetrie fine facilitant la fabrication drsquoaliments
suivant des proceacutedeacutes tels que la microparticulation (JONES 1995) Enfin les
hydrolysats comportent en geacuteneacuteral peu de mineacuteraux et ne risquent donc pas de
polluer les eaux des eacutelevages aquacoles leur bonne qualiteacute microbiologique
eacutetant assureacutee par la steacuterilisation au cours de la fabrication
333 Quelques inteacuterecircts des hydrolysats de poisson
3331 En alimentation animale
Les hydrolysats de poisson sont utiliseacutes comme substitut du lait pour les bovins
et les ovins En comparaison avec la caseacuteine les animaux nourris avec les
hydrolysats de poisson gras apregraves un deacutebut de croissance plus lent arrivent au
mecircme poids au bout de quelques semaines (OslashRSKOV et Coll 1982
RITCHIE et MACKIE 1982) De plus une eacutetude eacuteconomique a montreacute les
inteacuterecircts des peptides de poisson en tant que substituts du lait (MERRITT
1982) Pour le beacutetail adulte lrsquoensilage obtenu agrave partir drsquoherbe peut ecirctre
eacutegalement remplaceacute par des hydrolysats de poisson (OUELLET et Coll 1997)
Mais crsquoest dans le domaine de lrsquoaquaculture que ces hydrolysats sont les plus
valoriseacutes En effet en aquaculture la charge reacutecurrente la plus importante est la
source proteacuteique apporteacutee aux animaux Les proteacuteines de poisson hydrolyseacutees
en plus de leur faible coucirct sont drsquoune grande digestibiliteacute De plus de
nombreuses eacutetudes ont montreacute que certains hydrolysats de poisson possegravedent des
proprieacuteteacutes nutraceutiques Ainsi le remplacement des farines de poisson par des
hydrolysats de poisson augmenterait la croissance des crevettes et des larves de
poisson (CORDOVA-MUREATA et GARCIA-CARRENO 2002)
35
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
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40 Ndoye F Moiumlty-maiumlzi P et Broutin c 2002 Le poisson fumeacute sur la petite cocircte Senegalaise 41Oslashrskov ER Soliman H S et Clark C F S 1982 Use of fish protein hydrolysate in milk replacers Anim Feed Sci Tech 7 135 42 Ouellet DR Seoane J R Veira D M et Proulx J G 1997 Effects of supplementation with fish meal or fish protein hydrolysate on growth nutrient digestibility and rumen fermentation of growing cattle fed grass silage Anim Feed Sci Tech 68 307-26 43 Picot L Bordenave S Didelot S Fruitier-Arnaudin I Sannier F Thorkelsson G Bergeacute J P Gueacuterard F Chabeaud A et Piot J M 2006 Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines Process Biochem 41 1217-22 44 Quaglia GB et Orban E 1987 Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysates from sardine (Sardina pilchardus) J Sci Food Agric 38 271-6 45 Rajapakse N Jung W K Mendis E Moon S H et Kim S K 2005 A novel anticoagulant purified from fish protein hydrolysate inhibits factor XIIa and platelet aggregation Life Sciences 76 2607-19 46 Ravallec-Pleacute R 2000 Valorisation dhydrolysats dorigine marine optimisation de la concentration en peptides apparenteacutes aux facteurs de croissance et aux agents seacutecreacutetagogues Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Bretagne Occidentale 47 Ravallec-Pleacute R et Van Wormhoudt A 2003 Secretagogue activities in cod (Gadus morhua) and shrimp (Penaeus aztecus) extracts and alcalase hydrolysates determined in AR4-2J pancreatic tumour cells Comp Biochem Physiol B 134 669-79 48 Rousseau M Batista I Le Gal Y et Fouchereau-Peacuteron M 2001 Purification of a functional competitive antagonist for calcitonin gene related peptide action from sardine hydrolysate EJB 4 25-32 49 Shahidi F Han X et Synowiecki J 1995 Production and characteristics of protein hydrolystaes from capelin (Mallotus villosus) Food Chem 53 285-93
79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
3332 Inteacuterecircts fonctionnels
En plus de leurs qualiteacutes nutritionnelles maintenant eacutetablies les proprieacuteteacutes
fonctionnelles des hydrolysats de poisson ont eacuteteacute eacutetudieacutees En effet pour
pouvoir entrer dans la composition des aliments les hydrolysats doivent avoir
des proprieacuteteacutes particuliegraveres concernant lrsquohydrophobiciteacute les faculteacutes drsquoeacutemulsion
(et leur stabiliteacute) ou de formation de mousse la capaciteacute agrave retenir lrsquoeau Drsquoune
maniegravere geacuteneacuterale les proprieacuteteacutes fonctionnelles des hydrolysats sont lieacutees aux
conditions drsquohydrolyse Ainsi en controcirclant ces conditions il est possible
drsquoobtenir les proprieacuteteacutes fonctionnelles voulues ce qui permettrait de trouver des
applications varieacutees dans les domaines alimentaires comme dans lrsquoeacutelaboration
de vinaigrettes ou de saucisses industrielles (SLIZYTE et Coll 2005)
34 Valorisation des proteacuteines drsquohydrolysat de poisson
341 Les diffeacuterentes sources alimentaires et quelques fonctions des
proteacuteines
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules polypeptidiques reacutesultant de
lrsquoassociation drsquoun nombre eacuteleveacute drsquoacides amineacutes lieacutes entre eux par des liaisons
peptidiques
Les proteacuteines se trouvent dans un grand nombre drsquoaliments mais en quantiteacute
tregraves variable Leur valeur nutritionnelle est diffeacuterente drsquoun aliment agrave lrsquoautre On
ne peut se passer drsquoaucune source alimentaire de proteacuteines (animales et
veacutegeacutetales) (Voir tableau III)
Les proteacuteines drsquoorigine animale sont tregraves proches de celles de lrsquoecirctre humain du
fait de leur bon eacutequilibre en acides amineacutes Au regard des besoins de lrsquohomme
elles sont de bonnes qualiteacutes biologiques Pour obtenir une alimentation en
proteacuteines de bonne qualiteacute agrave lrsquoaide de proteacuteines veacutegeacutetales il est neacutecessaire
dassocier diffeacuterentes sources alimentaires Chacune drsquoentre elles nrsquoeacutetant pas
parfaitement eacutequilibreacutee au regard des besoins de lrsquohomme la compleacutementation
va permettre daugmenter la valeur biologique des proteacuteines veacutegeacutetales
36
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
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79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
Tableau III Groupe drsquoaliments proteacuteiques (IFN 1997)
Groupes drsquoaliments
I II III IV V VI
Produits Viande Poissons Œufs
Lait Produits laitiers
Concentreacutes et isolats obtenus agrave partir du groupe IV
Graines de leacutegumineuses
Graines de ceacutereacuteales
Leacutegumes frais Tubercules fruits
Proteacuteines 13 agrave 22 35 agrave 26 65 agrave 98 16 agrave 30 6 agrave 13 05 agrave 5
Les proteacuteines constituent lrsquoune des trois (3) grandes familles de nutriments
eacutenergeacutetiques avec les glucides et les lipides Elles assurent de nombreuses
fonctions dans le corps humain
elles jouent un rocircle structural et participent au renouvellement des tissus
musculaires des phanegraveres (cheveux ongles poils) de la matrice osseuse
de la peau
elles assurent de nombreuses fonctions physiologiques par exemple sous
la forme denzymes digestives drsquoheacutemoglobine drsquohormones de reacutecepteurs
et drsquoimmunoglobulines Par ailleurs elles constituent lrsquounique source
drsquoazote de lrsquoorganisme
342 Les proteacuteines de poisson
Le poisson est une source de proteacuteines aussi importante que la viande Les
proteacuteines du poisson peuvent ecirctre classeacutees en deux groupes
Les proteacuteines extracellulaires appeleacutees eacutegalement proteacuteines du stroma
sont insolubles dans les solutions salines Ce sont le collagegravene lrsquoeacutelastine
la keacuteratine la reacuteticuline et la connectine Elles semblent plus fragiles chez
les poissons que chez les mammifegraveres
Les proteacuteines intracellulaires se subdivisent en deux fractions
bull La fraction myogegravene hydrosoluble deacutesigneacutee plus simplement sous le nom
de myogegravene Elle est obtenue par pression de la chair ou par extraction en
solution faiblement ionique Cette fraction comprend les proteacuteines
37
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
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SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
sarcoplasmiques (myoglobine albumines globulines) et les proteacuteines des
granules obtenues par centrifugation
bull La fraction myofibrillaire peu soluble comprend les proteacuteines dites de
structure qui constituent la majeure partie des proteacuteines intracellulaires
Ce sont la myosine lrsquoactine lrsquoactomyosine (complexe des deux) et les
proteacuteines reacutegulatrices la tropomyosine les troponines les actines les
proteacuteines de la strie M et les proteacuteines C
3421 La fraction myogegravene soluble
Lrsquoessentiel de cette fraction proteacuteique est constitueacute de proteacuteines
sarcoplasmiques Ces proteacuteines sarcoplasmiques ont de nombreuses proprieacuteteacutes
communes ce sont des proteacuteines globulaires de faible viscositeacute et de poids
moleacuteculaire relativement bas Elles sont solubles dans les solutions faiblement
ioniques Geacuteneacuteralement mecircleacutees aux proteacuteines de la fraction myofibrillaire dans
le sarcoplasme elles repreacutesentent de 15 agrave 22 des proteacuteines totales Plus
diversifieacutees chez les poissons que les mammifegraveres les proteacuteines
sarcoplasmiques semblent caracteacuteristiques des espegraveces La myoglobine nrsquoexiste
pas dans les muscles blancs
3422 La fraction myofibrillaire
La myosine repreacutesente 55 agrave 60 des proteacuteines myofibrillaires du muscle Il yrsquoa
analogie dans les compositions en aminoacides de la myosine a des teneurs
particuliegraverement eacuteleveacutees en acide aspartique acide glutamique lysine et
leucine Lrsquoactine est la deuxiegraveme proteacuteine importante du muscle
343 Les peptides
Lorsqursquoelles subissent une hydrolyse enzymatique avec des proteacuteases Les
proteacuteines sont alors cliveacutees en peptides Lrsquoaction des enzymes sur la formation
des peptides est preacutepondeacuterante puisqursquoelle va jouer sur la taille et la fonction des
38
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
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40 Ndoye F Moiumlty-maiumlzi P et Broutin c 2002 Le poisson fumeacute sur la petite cocircte Senegalaise 41Oslashrskov ER Soliman H S et Clark C F S 1982 Use of fish protein hydrolysate in milk replacers Anim Feed Sci Tech 7 135 42 Ouellet DR Seoane J R Veira D M et Proulx J G 1997 Effects of supplementation with fish meal or fish protein hydrolysate on growth nutrient digestibility and rumen fermentation of growing cattle fed grass silage Anim Feed Sci Tech 68 307-26 43 Picot L Bordenave S Didelot S Fruitier-Arnaudin I Sannier F Thorkelsson G Bergeacute J P Gueacuterard F Chabeaud A et Piot J M 2006 Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines Process Biochem 41 1217-22 44 Quaglia GB et Orban E 1987 Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysates from sardine (Sardina pilchardus) J Sci Food Agric 38 271-6 45 Rajapakse N Jung W K Mendis E Moon S H et Kim S K 2005 A novel anticoagulant purified from fish protein hydrolysate inhibits factor XIIa and platelet aggregation Life Sciences 76 2607-19 46 Ravallec-Pleacute R 2000 Valorisation dhydrolysats dorigine marine optimisation de la concentration en peptides apparenteacutes aux facteurs de croissance et aux agents seacutecreacutetagogues Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Bretagne Occidentale 47 Ravallec-Pleacute R et Van Wormhoudt A 2003 Secretagogue activities in cod (Gadus morhua) and shrimp (Penaeus aztecus) extracts and alcalase hydrolysates determined in AR4-2J pancreatic tumour cells Comp Biochem Physiol B 134 669-79 48 Rousseau M Batista I Le Gal Y et Fouchereau-Peacuteron M 2001 Purification of a functional competitive antagonist for calcitonin gene related peptide action from sardine hydrolysate EJB 4 25-32 49 Shahidi F Han X et Synowiecki J 1995 Production and characteristics of protein hydrolystaes from capelin (Mallotus villosus) Food Chem 53 285-93
79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse De nombreuses voies de valorisation des
peptides issus des hydrolyses de co-produits marins sont citeacutees dans la
litteacuterature
3431 Les Sources azoteacutees
Les sources azoteacutees peuvent ecirctre deacutefinies comme eacutetant des composeacutes non
proteacuteiques de faible poids solubles dans lrsquoeau et contenant de lrsquoazote Cette
fraction repreacutesente 9 agrave 18 de lrsquoazote total des teacuteleacuteosteacuteens
Les muscles du poisson sont parmi ceux des verteacutebreacutes les plus riches en
substances azoteacutees extractives Les fractions les plus importantes de lrsquoazote
extractif dans les muscles du poisson sont constitueacutees par lrsquoazote basique Les
constituants majeurs de cette fraction sont les bases volatiles telles que
lrsquoammoniac lrsquooxyde de trimeacutethylamine la creacuteatine les acides amineacutes libres les
nucleacuteotides et les bases puriques (FAO 1998)
Dans la culture drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries champignons levures) la
source de nutriments repreacutesente le plus gros investissement (MARTONE et
Coll 2005)
Lrsquoutilisation drsquohydrolysats de poisson comme source de nutriments pour ces
organismes constitue une bonne voie de valorisation Cette utilisation
permettrait conjointement drsquoaugmenter la valeur des hydrolysats et de reacuteduire le
coucirct de production de la culture cellulaire Une eacutetude meneacutee en 1989 indique
que des hydrolysats de compost de poisson ameacutelioraient la seconde partie de la
croissance drsquoun champignon acide Scytalidium acidophilum valorisant ainsi le
compost de poisson jusque lagrave difficilement utilisable du fait de la forte odeur
deacutegageacutee (MARTIN et CHINTLAPATI 1989) Plus reacutecemment des travaux
ont valideacute le remplacement drsquoun milieu de croissance commercial par des
hydrolysats provenant de viscegraveres de morue ou de thon pour la croissance de
bacteacuteries de levures et de champignons (GUERARD et Coll 2001 ASPMO
et Coll 2005) De faccedilon similaire une eacutetude meneacutee sur 3 bacteacuteries diffeacuterentes
39
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
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10 Cuvellier GF 1999 Enzymologie et biocatalyse Dans Biotechnologie Paris Tec et Doc Lavoisier Paris 319-42 11 Dumay J 2006 Extraction de lipides en voie aqueuse par bioreacteur enzymatique combineacute agrave lrsquoultracentrifugation application agrave la valorisation de co-produits de poisson (Sardina pilchardus) Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute bioproceacutedeacutes et biotechnologies marines Lieu de soutenance Ecole Polytechnique de lrsquoUniversiteacute de Nantes 12 Dong YL Sheng G Y Fu J M et Wen K W 2005 Chemical characterization and antianaemia activity of fish protein hydrolysate from Saurida elongata J Sci Food Agric 85 2033-39 13 FAO 1998 The state of world fisheries and aquaculture Rome Italy 14 Fitzgerald AJ Rai P S Marchbank T Taylor G W Ghosh S Ritz B W et Playford R J 2005 Reparative properties of a commercial fish protein hydrolysate preparation Gut 54775-81 15 Gauthier D 2006 Introduction aux techniques utiliseacutees en biochimie le dosage des proteacuteines lten lignegt [accegraves internet] wwwchimiebiochimieumonctoncabchdgsiitubprodosage 16 Gildberg A 1993 Enzymic processing of marine raw materials Process Biochem 28 1-15 17 Gildberg A Brgwald J Johansen A et Stenberg E 1996 Isolation of acid peptide fractions from a fish protein hydrolysate with strong stimulatory effect on atlantic salmon (Salmo salar) head kidney leucocytes Comp Biochem Physiol 114 B 97-101 18 Gildberg A Arnesen J A et Carlehoumlg M 2002 Utilisation of cod backbone by biochemical fractionation Process Biochem 38 475-80
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79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
et sur une archeacuteobacteacuterie (Bacillus subtilis Staphylococcus epidermis
Escherichia coli et Halobacterium salinarum) montre qursquoun hydrolysat de
hareng contenant 80 de protides et peu drsquoacides amineacutes libres permet une
culture identique agrave celle obtenue avec un milieu de reacutefeacuterence agrave condition que la
saliniteacute et le pH de lrsquohydrolysat soient identiques (MARTONE et Coll 2005)
Les peptides contenus dans ces hydrolysats permettent ainsi la croissance non
seacutelective drsquoorganismes microbiens (bacteacuteries gram+ gramndash ou archeacuteobacteacuteries
poussent avec le mecircme hydrolysat) (DUMAY 2006)
3432 Inteacuterecircts nutritionnels des peptides
La digestibiliteacute des proteacuteines de poisson hydrolyseacutees preacutesente un avantage pour
la nutrition de personnes dont le systegraveme digestif est en dysfonctionnement En
effet des reacutegimes adeacutequats en fonction des pathologies peuvent ecirctre eacutelaboreacutes par
synthegravese mais ces productions sont tregraves coucircteuses Depuis les anneacutees 70 les
recherches se sont tourneacutees vers les hydrolysats de poisson montrant que les
inteacuterecircts nutritionnels et la composition de ces produits pouvait ecirctre incorporeacutes en
alimentation humaine dans des reacutegimes speacutecifiques En effet le taux de protides
solubles est important et la composition en acides amineacutes eacutequilibreacutee
Les hydrolysats de morue (LALASIDIS et Coll 1978) de tilapia (ABDULL-
HMID et Coll 2002) de saumon (LIASET et Coll 2003) ont montreacute leurs
grandes valeurs nutritionnelles parfois supeacuterieures agrave celles des reacutegimes
syntheacutetiques Un hydrolysat provenant drsquoun poisson de mer de faible valeur
Saurida elongata a eacutegalement montreacute des proprieacuteteacutes anti-aneacutemiantes (DONG et
Coll 2005) En plus de leur inteacuterecirct nutritionnel les hydrolysats de poisson
peuvent confeacuterer aux produits auxquels ils sont associeacutes une augmentation du
rendement de la cuisson (en diminuant les pertes en eau et en proteacuteines
occasionneacutees) et des proprieacuteteacutes anti-oxydantes (SHAHIDI et Coll 1995)
Lrsquoamertume des peptides geacuteneacutereacutes lors de lrsquohydrolyse est un frein pour
lrsquoutilisation des hydrolysats en alimentation humaine (KRISTINSSON et
40
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
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79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
RASCO 2000) Cette apparition est due agrave la libeacuteration des acides amineacutes
hydrophobes qui sont nativement compris agrave lrsquointeacuterieur des chaicircnes peptidiques
(MACKIE 1982 LIASET et Coll 2000) Certaines proteacuteases sont
particuliegraverement utiliseacutees pour la reacuteduction de lrsquoamertume Ces enzymes peuvent
ecirctre utiliseacutees degraves le deacutebut de lrsquohydrolyse comme Protamex (NOVOZYMES
2001) et Alcalase (HOYLE et MERRIT 1994) ou agrave la suite drsquoune hydrolyse
comme Flavourzyme (NOVOZYMES 2001) et la pancreacuteatinine (LALASIDIS
et Coll 1978)
3433 Activiteacutes biologiques des peptides
De nombreux articles portent sur les activiteacutes biologiques des peptides issus
drsquohydrolyses proteacuteolytiques Les peptides marins ne font pas exception Une
revue reacutecente sur les composeacutes marins bio-actifs liste les diffeacuterentes activiteacutes des
peptides Ainsi ces derniers peuvent avoir des effets anti-hypertenseurs anti-
thrombotiques immuno-modulateurs antioxydants anti-coagulantshellip (KIM et
MENDIS 2006) Les peptides marins interviennent dans le traitement de
lrsquoosteacuteoporose de lrsquoarthrite des maladies cardiovasculaires du diabegravete de
lrsquoobeacutesiteacute ou encore du cancer (GILDBERG et Coll 2002 KIM et MENDIS
2006)
Le tableau ci-dessous preacutecise quelques exemples de ces activiteacutes
41
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
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79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
42
Tableau IV Principales activiteacutes biologiques des proteacuteines de poisson
Espegraveces Activiteacutes Reacutefeacuterences Merlu reacuteparation du tissu
eacutepitheacutelial Fitzgerald et coll 2005
Sole anti oxydante Rajapakse et coll 2005 Sole Hypotensive Jun et coll 2004 Morue secretagogue
immunomodulatrice anti proliferative
Ravallec-Pleacute et VanWormhoudt 2003 Gildberg et colll 1996 Picot et coll 2006
Maquereau Oxydante Picot et coll 2006
Merlan anti proliferative Picot et coll 2006
Saumon anti proliferative Picot et coll 2006
Sardine comportement hormonal Picot et coll 2006 Rousseau et coll 2001
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
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SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
CHAPITRE 4 ENZYMES ET HYDROLYSE ENZYMATIQUE
41 Les enzymes
411 Deacutefinition et proprieacuteteacutes
Les enzymes sont des proteacuteines ou complexes de proteacuteines permettant
dacceacuteleacuterer jusquagrave des millions de fois les reacuteactions chimiques du meacutetabolisme
se deacuteroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire Les enzymes agissent agrave
faible concentration et elles se retrouvent intactes en fin de reacuteaction ce sont des
catalyseurs biologiques Comme tout catalyseur elle nrsquointervient pas dans le
processus reacuteactionnel et est retrouveacutee intacte agrave la fin de la reacuteaction Une enzyme
est speacutecifique drsquoune reacuteaction cest-agrave-dire qursquoelle catalyse toujours la mecircme
transformation sur les mecircmes corps chimiques
Les proprieacuteteacutes des enzymes
ce sont des proteacuteines de masse moleacuteculaire eacuteleveacutee thermolabiles
biocatalyseurs des reacuteactions meacutetaboliques
elles agissent agrave des concentrations tregraves faibles (par exemple pour
lanhydrase carbonique CO2+ H2O lt=gt H2CO3 une moleacutecule denzyme
peut hydrater 100 000 moleacutecules de CO2 =gt10-5mols)
elles possegravedent deux types de speacutecificiteacute
bull speacutecificiteacute eacutetroite ou lacircche avec le substrat Exemple la
phosphatase alcaline est capable dhydrolyser des esters
phosphoriques en milieu alcalin
bull Speacutecificiteacute dun type de reacuteaction
elles augmentent la vitesse des reacuteactions (jusquagravex1011) en respectant les
lois de la thermodynamique (sans modifier leur eacutetat deacutequilibre) elles
diminuent leacutenergie dactivation
elles doivent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave la fin de la reacuteaction ou de la seacutequence des
reacuteactions Lenzyme ne creacutee pas de reacuteaction
elles peuvent convertir un type deacutenergie en un autre
43
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
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79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
412 Nomenclature et classification
4121 Nomenclature et classification fonctionnelle
Elle est tregraves utiliseacutee Elle prend en compte le nom du substrat de lrsquoenzyme et le
type de reacuteaction catalyseacutee Pour designer une enzyme on indique
drsquoabord le nom du substrat
puis le type de reacuteaction catalyseacutee
on ajoute enfin le suffixe ase
Par exemple
bull Glucose- 6- phosphatase isomerase
bull Isocitrate lyase
Lorsque lrsquoenzyme utilise 2 substrats on les designent tous les deux en indiquant
Le substrat donneur de radicaux
Puis le substrat accepteur du radical libeacutereacute
Le radical eacutechangeacute
Le type de reaction on ajoute enfin ase
Par exemple
bull Aspartate aminotransferase
bull UDP glucose ndash fructose glucosyltransferase
4122 Nomenclature et classification officielle
Depuis 1961 lUnion Internationale de Biochimie a codifieacute la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle Toutes les
enzymes actuellement connues sont reacutepertorieacutees sous un numeacutero portant 4
chiffres seacutepareacutes par des points et preacuteceacutedeacutes de EC (Enzyme Classification) soit
(EC x1x2x3x4) La signification des chiffres est la suivante
X1 Le premier chiffre pouvant varier de 1 agrave 6 indique le type de
reacuteactions
44
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
9 Coacuterdova-Murueta JH et Garciacutea-Carreno FL 2002 Nutritive value of squid and hydrolyzed protein supplement in shrimp feed Aquaculture 210 371-84
75
10 Cuvellier GF 1999 Enzymologie et biocatalyse Dans Biotechnologie Paris Tec et Doc Lavoisier Paris 319-42 11 Dumay J 2006 Extraction de lipides en voie aqueuse par bioreacteur enzymatique combineacute agrave lrsquoultracentrifugation application agrave la valorisation de co-produits de poisson (Sardina pilchardus) Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute bioproceacutedeacutes et biotechnologies marines Lieu de soutenance Ecole Polytechnique de lrsquoUniversiteacute de Nantes 12 Dong YL Sheng G Y Fu J M et Wen K W 2005 Chemical characterization and antianaemia activity of fish protein hydrolysate from Saurida elongata J Sci Food Agric 85 2033-39 13 FAO 1998 The state of world fisheries and aquaculture Rome Italy 14 Fitzgerald AJ Rai P S Marchbank T Taylor G W Ghosh S Ritz B W et Playford R J 2005 Reparative properties of a commercial fish protein hydrolysate preparation Gut 54775-81 15 Gauthier D 2006 Introduction aux techniques utiliseacutees en biochimie le dosage des proteacuteines lten lignegt [accegraves internet] wwwchimiebiochimieumonctoncabchdgsiitubprodosage 16 Gildberg A 1993 Enzymic processing of marine raw materials Process Biochem 28 1-15 17 Gildberg A Brgwald J Johansen A et Stenberg E 1996 Isolation of acid peptide fractions from a fish protein hydrolysate with strong stimulatory effect on atlantic salmon (Salmo salar) head kidney leucocytes Comp Biochem Physiol 114 B 97-101 18 Gildberg A Arnesen J A et Carlehoumlg M 2002 Utilisation of cod backbone by biochemical fractionation Process Biochem 38 475-80
76
19 Gueacuterard F Dufosseacute L De La Broise D et Binet A 2001 Enzymatic hydrolysis of protein from yellowfin tuna (Thunnus albacares) wastes using alcalase J Mol Catalysis B Enzymatic 11 1051-9 20 Gueacuterard F Batista I Pires C Thorkelson G et Le Gal Y 2004 Repport on sources and selection criteria for raw material Rapport eacutetabli pour le programme SEAFOODplus- 57 21 Gornall Bardawill et David 1949 J Biol Chem 177 751 [Mise au point dune meacutethode quantitative pour doser les proteacuteines avec le biuret] 22 Hoyle NT et Merrit J H 1994 Quality of fish protein hydrolysates from herring (Clupea harengus) J Food Sci 59 76-9 23 Direction des Pecircches Maritimes (DPM) Centre de Recherche Oceacuteanographiques de Dakar-Thiaroye(CRODT) Rapport final Etude de lrsquoeacutevaluation et de la gestion des ressources halieutiques en Reacutepublique de Seacuteneacutegal Dakar direction des pecircches maritimes 24 Institut Franccedilais pour la Nutrition 1997 Les proteacuteines ndash Tome 2 Caracteacuteristiques des diffeacuterentes sources de proteacuteines alimentaires Paris IFN- Dossier speacutecifique Ndeg9 bis 25 Jones DA 1995 Frippak ndash the facts A response to the article by PR Muir and DC Sutton J Word Aquacult Soc 26(2)220-222 26 Jun SY Park P J Jung W K et Kim S K 2004 Purification and characterization of an antioxydative peptide from enzymatic hydrolysate of yellowfin sole (Limanda aspera) frame protein Eur Food Res Technol 219 pp 20-6 27 Kim SK et Mendis E 2006 Bioactive compounds from marine processing by-products - A review Food Res Int 39383-93 28 Kristinsson HG et Rasco B A 2000 Fish protein hydrolysates Production biochemical and functional properties Critical Reviews in Food Sci and Nutr 40 43-81
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29 Lalasidis G Bostroumlm S et Sjoumlberg L B 1978 Low molecular weight enzymatic fish protein hydrolysates chemical composition and nutritive values J Agric Food Cehm 28 751-6 30 Liaset B Julsham K et Espe M 2003 Chemical composition and theoretical nutritional evaluation of the produced fractions from enzymic hydrolysis of salmon frames with Protamex Process Biochem 38 1747-59 32 Liaset B Lied E et Espe M 2000 Enzymatic hydrolysis of by-products from the fishfilleting industry chemical characterization and nutritional evaluation J Sci Food Agric 80 881 33 Larbier M et Leclercq B 1992 Les matiegraveres premiegraveres utiliseacutees en aviculture (225 ndash 301) in nutrition et alimentation des volailles Paris INRA 34 Lowry O H Rosebrough NJ Farr AL et Randall R J 1951 Protein measurement with Folin phenol reagent J Biol Chem 193 256 ndash 275 35 Lynch et coll (1998) Lynch JM Barbano DMet Fleming JR ndash Indirect and direct determination of the casein content of milk by Kjeldhal nitrogen analysis collaborative study J AOAC Int 36 Mackie IM 1982 General review of fish protein hydrolysates Animal Feed Sci And Technol 7 113-24 37 Martin AM et Chintalapati S P 1989 Fish offal-peat compost extracts as fermentation substrate Biological wastes 27 281-8 38 Martone et al (2005) Martone CB Peacuterez Borla O et Saacuten chez J J 2005 Fishery by-product as a nutrient source for bacteria and aracha growth media Bioresource Technol 96 383-87 39 Merritt JH 1982 Assessment of the production costs of fish protein hydrolysates Anim Feed Sci Technol 1 147-51
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40 Ndoye F Moiumlty-maiumlzi P et Broutin c 2002 Le poisson fumeacute sur la petite cocircte Senegalaise 41Oslashrskov ER Soliman H S et Clark C F S 1982 Use of fish protein hydrolysate in milk replacers Anim Feed Sci Tech 7 135 42 Ouellet DR Seoane J R Veira D M et Proulx J G 1997 Effects of supplementation with fish meal or fish protein hydrolysate on growth nutrient digestibility and rumen fermentation of growing cattle fed grass silage Anim Feed Sci Tech 68 307-26 43 Picot L Bordenave S Didelot S Fruitier-Arnaudin I Sannier F Thorkelsson G Bergeacute J P Gueacuterard F Chabeaud A et Piot J M 2006 Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines Process Biochem 41 1217-22 44 Quaglia GB et Orban E 1987 Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysates from sardine (Sardina pilchardus) J Sci Food Agric 38 271-6 45 Rajapakse N Jung W K Mendis E Moon S H et Kim S K 2005 A novel anticoagulant purified from fish protein hydrolysate inhibits factor XIIa and platelet aggregation Life Sciences 76 2607-19 46 Ravallec-Pleacute R 2000 Valorisation dhydrolysats dorigine marine optimisation de la concentration en peptides apparenteacutes aux facteurs de croissance et aux agents seacutecreacutetagogues Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Bretagne Occidentale 47 Ravallec-Pleacute R et Van Wormhoudt A 2003 Secretagogue activities in cod (Gadus morhua) and shrimp (Penaeus aztecus) extracts and alcalase hydrolysates determined in AR4-2J pancreatic tumour cells Comp Biochem Physiol B 134 669-79 48 Rousseau M Batista I Le Gal Y et Fouchereau-Peacuteron M 2001 Purification of a functional competitive antagonist for calcitonin gene related peptide action from sardine hydrolysate EJB 4 25-32 49 Shahidi F Han X et Synowiecki J 1995 Production and characteristics of protein hydrolystaes from capelin (Mallotus villosus) Food Chem 53 285-93
79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
bull Oxydoreacuteductases (transfert deacutelectrons datomes dhydrogegravene ou fixation
doxygegravene)
bull Transfeacuterases (transfert datomes ou de groupes datomes autres que de 1)
bull Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH
issus de leau)
bull Lyases (Coupure des liaisons par dautres modes autres que lhydrolyse)
bull Isomeacuterases (reacuteaction conservant la formule brute du composeacute)
bull Ligases (formation des liaisons entre C et un autre meacutetalloiumlde en
utilisant leacutenergie de lATP)
X2 Le deuxiegraveme deacutesigne la sous-classe de lenzyme qui est deacutefinie
suivant son meacutecanisme daction Dans le cas des oxydoreacuteductases on
distingue les deacuteshydrogeacutenases les monooxygeacutenases et les dioxygeacutenases
X3 Le troisiegraveme chiffre deacutesigne la nature de la moleacutecule qui sert
daccepteur lorsquil sagit dun transfert deacutelectrons
X4 Le quatriegraveme chiffre est un numeacutero dordre dans le groupe et dans le
sous-groupe Lorsquune enzyme se termine par 99 cela signifie quelle
est incomplegravetement caracteacuteriseacutee
Cette classification officielle preacutecise et complegravete la nomenclature fonctionnelle
Dans un rapport ou une publication le nom fonctionnel continue agrave ecirctre utiliseacute
mais ce dernier est toujours suivi entre parenthegraveses par son numeacutero dans la
nomenclature officielle
413 Les principales classes drsquoenzymes
Contrairement aux autres composeacutes biochimiques la classification des enzymes
est baseacutee sur la reacuteaction catalyseacutee et non sur la composition de lrsquoenzyme
Les enzymes sont reacuteparties en six groupes
les oxydoreacuteductases (EC 1)
les transfeacuterases (EC 2)
les hydrolases (EC 3)
45
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
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29 Lalasidis G Bostroumlm S et Sjoumlberg L B 1978 Low molecular weight enzymatic fish protein hydrolysates chemical composition and nutritive values J Agric Food Cehm 28 751-6 30 Liaset B Julsham K et Espe M 2003 Chemical composition and theoretical nutritional evaluation of the produced fractions from enzymic hydrolysis of salmon frames with Protamex Process Biochem 38 1747-59 32 Liaset B Lied E et Espe M 2000 Enzymatic hydrolysis of by-products from the fishfilleting industry chemical characterization and nutritional evaluation J Sci Food Agric 80 881 33 Larbier M et Leclercq B 1992 Les matiegraveres premiegraveres utiliseacutees en aviculture (225 ndash 301) in nutrition et alimentation des volailles Paris INRA 34 Lowry O H Rosebrough NJ Farr AL et Randall R J 1951 Protein measurement with Folin phenol reagent J Biol Chem 193 256 ndash 275 35 Lynch et coll (1998) Lynch JM Barbano DMet Fleming JR ndash Indirect and direct determination of the casein content of milk by Kjeldhal nitrogen analysis collaborative study J AOAC Int 36 Mackie IM 1982 General review of fish protein hydrolysates Animal Feed Sci And Technol 7 113-24 37 Martin AM et Chintalapati S P 1989 Fish offal-peat compost extracts as fermentation substrate Biological wastes 27 281-8 38 Martone et al (2005) Martone CB Peacuterez Borla O et Saacuten chez J J 2005 Fishery by-product as a nutrient source for bacteria and aracha growth media Bioresource Technol 96 383-87 39 Merritt JH 1982 Assessment of the production costs of fish protein hydrolysates Anim Feed Sci Technol 1 147-51
78
40 Ndoye F Moiumlty-maiumlzi P et Broutin c 2002 Le poisson fumeacute sur la petite cocircte Senegalaise 41Oslashrskov ER Soliman H S et Clark C F S 1982 Use of fish protein hydrolysate in milk replacers Anim Feed Sci Tech 7 135 42 Ouellet DR Seoane J R Veira D M et Proulx J G 1997 Effects of supplementation with fish meal or fish protein hydrolysate on growth nutrient digestibility and rumen fermentation of growing cattle fed grass silage Anim Feed Sci Tech 68 307-26 43 Picot L Bordenave S Didelot S Fruitier-Arnaudin I Sannier F Thorkelsson G Bergeacute J P Gueacuterard F Chabeaud A et Piot J M 2006 Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines Process Biochem 41 1217-22 44 Quaglia GB et Orban E 1987 Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysates from sardine (Sardina pilchardus) J Sci Food Agric 38 271-6 45 Rajapakse N Jung W K Mendis E Moon S H et Kim S K 2005 A novel anticoagulant purified from fish protein hydrolysate inhibits factor XIIa and platelet aggregation Life Sciences 76 2607-19 46 Ravallec-Pleacute R 2000 Valorisation dhydrolysats dorigine marine optimisation de la concentration en peptides apparenteacutes aux facteurs de croissance et aux agents seacutecreacutetagogues Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Bretagne Occidentale 47 Ravallec-Pleacute R et Van Wormhoudt A 2003 Secretagogue activities in cod (Gadus morhua) and shrimp (Penaeus aztecus) extracts and alcalase hydrolysates determined in AR4-2J pancreatic tumour cells Comp Biochem Physiol B 134 669-79 48 Rousseau M Batista I Le Gal Y et Fouchereau-Peacuteron M 2001 Purification of a functional competitive antagonist for calcitonin gene related peptide action from sardine hydrolysate EJB 4 25-32 49 Shahidi F Han X et Synowiecki J 1995 Production and characteristics of protein hydrolystaes from capelin (Mallotus villosus) Food Chem 53 285-93
79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
les lyases (EC 4)
les isomeacuterases (EC 5)
les ligases (EC 6)
Dans notre eacutetude lrsquoenzyme utiliseacutee est une hydrolase (EC 3) et elle appartient
plus speacutecifiquement au groupe des proteacuteases (EC 34) en srsquoattaquant aux liaisons
peptidiques
42 Lrsquohydrolyse enzymatique
421 Deacutefinition et principe
Lrsquohydrolyse enzymatique est une reacuteaction chimique catalyseacutee par des enzymes
du type hydrolase au cours de laquelle intervient obligatoirement une moleacutecule
deau et qui aboutit agrave la scission dun composeacute
Lrsquohydrolyse enzymatique permet de couper les proteacuteines en peptides Les
proteacuteines hydrolyseacutees ont une mauvaise reacuteputation due agrave leur amertume
Cependant elles sont utiliseacutees pour confeacuterer agrave des aliments des proprieacuteteacutes
nutritionnelles ou fonctionnelles particuliegraveres
Lors drsquoune hydrolyse enzymatique les proteacuteases vont cliver les liaisons
peptidiques entre deux acides amineacutes adjacents dans la seacutequence primaire drsquoune
proteacuteine geacuteneacuterant ainsi au moins deux peptides Lrsquohydrolyse des liaisons
peptidiques va donc geacuteneacuterer la libeacuteration des protons H+ (Figure 6) Cette
libeacuteration de protons H+ va induire une acidification du milieu Ce principe est
valable pour les hydrolyses se deacuteroulant agrave pH supeacuterieur agrave 65 pour que le degreacute
de dissociation des ions R-N+H3 soit suffisant (RAVALLEC 2000) Lorsque le
pH est infeacuterieur la reacuteaction srsquoinverse et ce seront des ions HO- qui seront
libeacutereacutes
46
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
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SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
Figure 6 Scheacutema reacuteactionnel de la libeacuteration de protons H+ lors de
lrsquohydrolyse enzymatique
422 Pourquoi suivre lrsquoeacutevolution de lrsquohydrolyse
Le suivi de lrsquohydrolyse est une preacuteoccupation majeure lors de la mise en place
de proceacutedeacutes enzymatiques En effet lrsquoactiviteacute des enzymes ne srsquoarrecircte que
lorsque le substrat est totalement hydrolyseacute ou que les conditions du milieu ne
sont plus adeacutequates pour lrsquoenzyme
Il est donc important de suivre lrsquohydrolyse en fonction des produits deacutesireacutes
lrsquohydrolyse totale ne conduisant pas dans la majeure partie des cas aux produits
les plus inteacuteressants De nombreux protocoles ont eacuteteacute mis en place pour le suivi
de cette hydrolyse Un des proceacutedeacutes les plus simples est de mesurer les
modifications de pH induites par lrsquohydrolyse Cette mesure peut ecirctre effectueacutee
directement agrave lrsquoaide drsquoun ph-megravetre plongeacute dans le milieu reacuteactionnel mais pas
ce biais lrsquohydrolyse ne peut ecirctre pousseacutee tregraves loin lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme eacutetant
tregraves sensible aux variations de pH La mesure peut eacutegalement ecirctre lue de maniegravere
indirecte Pour permettre une action plus longue de lrsquoenzyme le milieu peut ecirctre
neutraliseacute par ajout de soude (lors de libeacuteration de H+) ou drsquoacide (libeacuteration
HO-) Le volume verseacute est directement proportionnel agrave la quantiteacute de liaisons
peptidiques coupeacutees Cette meacutethode est la meacutethode dite du pHstat (en reacutefeacuterence
agrave lrsquoappareil utiliseacute) (ADLER et NISSEN 1986)
423 Les paramegravetres influenccedilant lrsquohydrolyse enzymatique
Diffeacuterents facteurs peuvent affecter lrsquoefficaciteacute de lrsquohydrolyse enzymatique des
proteacuteines la tempeacuterature le pH la concentration du substrat et de lrsquoenzyme la
47
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
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80
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SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
force ionique la preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitricesactivatrices la
quantiteacute drsquoeau ajouteacutee
Nous traiterons ici uniquement des principaux facteurs agrave savoir la tempeacuterature
le pH et briegravevement de lrsquoeffet des substances inhibitrices ou activatrices
42 31 Influence de la tempeacuterature
Lrsquoeacutetude de la vitesse initiale en fonction de la tempeacuterature fait apparaicirctre deux
phases bien distinctes (Figure 7) La tempeacuterature acceacutelegravere drsquoune part les vitesses
des reacuteactions en fournissant lrsquoeacutenergie neacutecessaire au franchissement de la barriegravere
drsquoeacutenergie drsquoactivation mais au-delagrave drsquoune certaine tempeacuterature une
modification de la structure tridimensionnelle de lrsquoenzyme se produit entraicircnant
progressivement sa deacutenaturation et sa deacutesactivation La reacutesultante de ces deux
effets se traduit par une courbe geacuteneacuteralement dissymeacutetrique passant par une
valeur maximale pour une tempeacuterature optimale Certaines enzymes avec une
masse faible et une structure simple ou stabiliseacutee (agrave lrsquoaide de ponts disulfures
par exemple) se reacutevegravelent particuliegraverement stables agrave la chaleur Une mutation
peut confeacuterer agrave une enzyme une thermo sensibiliteacute diffeacuterente de celle de
lrsquoenzyme native tregraves utile pour confeacuterer une meilleure stabiliteacute agrave des enzymes
utiliseacutees agrave haute tempeacuterature
48
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
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79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
Figure7 Influence de la tempeacuterature sur la reacuteaction enzymatique
(CUVELLIER 1999)
Quoi qursquoil en soit la tempeacuterature est speacutecifique pour chaque enzyme (souvent
indiqueacutee par le fournisseur) et il est important de travailler dans la plage de
tempeacuterature indiqueacutee En biotechnologie lrsquoinactivation de lrsquoenzyme est tregraves
souvent reacutealiseacutee par traitement thermique souvent moins deacutenaturant pour la
reacutecupeacuteration des produits obtenus qursquoune variation de pH
4232 Influence du pH
La variation du pH peut avoir des conseacutequences sur lrsquoenzyme en provoquant des
modifications de lrsquoeacutetat drsquoionisation de certains acides amineacutes situeacutes sur le site
actif ou sur la zone permettant le maintien de la conformation tridimensionnelle
native de la proteacuteine Le substrat peut aussi subir une modification de son degreacute
drsquoionisation pouvant permettre ou empecirccher la formation du complexe enzyme
substrat Le pH optimum sera deacutefini en fonction de la transformation
enzymatique drsquoun substrat dans un milieu de composition donneacutee
Comme le montre la Figure8 la vitesse drsquoune reacuteaction deacutecroicirct geacuteneacuteralement
rapidement lorsque lrsquoon srsquoeacuteloigne du pH optimum jusqursquoagrave devenir neacutegligeable (agrave
49
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
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SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
plusmn 2 uniteacutes de pH) Ce pH optimum varie beaucoup selon les enzymes Certaines
proteacuteases ont des pH optimaux variant de 2 (pepsine) agrave 10 (alcalase)
Figure8 Variation de la vitesse de reacuteaction enzymatique en fonction du pH
(CUVELLIER 1999)
4233 Effets des substances activatrices ou inhibitrices
La vitesse drsquoune reacuteaction et lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme peuvent ecirctre modifieacutees par la
preacutesence de composeacutes autres que le substrat ce sont des effecteurs qui jouent
un rocircle important dans les pheacutenomegravenes de reacutegulation Ces effecteurs peuvent
avoir un effet inhibiteur ou activateur
Les inhibiteurs peuvent ecirctre compeacutetitifs cest-agrave-dire qursquoils possegravedent une
analogie de structure avec le substrat et qui peuvent aller se loger sur le site actif
de lrsquoenzyme agrave la place du substrat A lrsquoinverse certains inhibiteurs peuvent ecirctre
non compeacutetitifs Ces composeacutes ne vont pas se fixer sur le site actif speacutecifique du
substrat mais sur un autre site de lrsquoenzyme modifiant ainsi sa structure
tridimensionnelle et son activiteacute Cette deuxiegraveme sorte drsquoinhibition est tout de
50
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
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75
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76
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79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
mecircme assez rare Les co-produits marins comme toute matrice vivante
possegravedent un grand nombre de ces substances (GILDBERG 1993)
Conclusion partielle Les eaux Seacuteneacutegalaises sont les plus poissonneuses de lrsquoAfrique de lrsquoouest La
pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement eacuteconomique et sociale
du Seacuteneacutegal elle contribue ainsi de maniegravere non neacutegligeable agrave la croissance de
lrsquoeacuteconomie nationale
Les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines des seacuteneacutegalais
couvrant ainsi 75 de leurs besoins
Parmi les produits halieutiques des eaux Seacuteneacutegalaises on a la sole tropicale
(Cynoglossus senegalensis) qui est un poisson plat de la famille des
Cynoglossidae Lors de sa transformation en filets de poisson on obtient des co-
produits (tecircte peau viscegraveres arecircte centrale) qui selon des chercheurs sont
particuliegraverement riches en moleacutecules drsquointeacuterecirct notamment les proteacuteines
Parmi ces co-produits nous allons nous inteacuteresseacutes agrave la tecircte et aux viscegraveres pour
notre eacutetude ceci en proceacutedant agrave une hydrolyse enzymatique agrave lrsquoaide drsquoune
proteacutease dans le but de les valoriser
51
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
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40 Ndoye F Moiumlty-maiumlzi P et Broutin c 2002 Le poisson fumeacute sur la petite cocircte Senegalaise 41Oslashrskov ER Soliman H S et Clark C F S 1982 Use of fish protein hydrolysate in milk replacers Anim Feed Sci Tech 7 135 42 Ouellet DR Seoane J R Veira D M et Proulx J G 1997 Effects of supplementation with fish meal or fish protein hydrolysate on growth nutrient digestibility and rumen fermentation of growing cattle fed grass silage Anim Feed Sci Tech 68 307-26 43 Picot L Bordenave S Didelot S Fruitier-Arnaudin I Sannier F Thorkelsson G Bergeacute J P Gueacuterard F Chabeaud A et Piot J M 2006 Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines Process Biochem 41 1217-22 44 Quaglia GB et Orban E 1987 Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysates from sardine (Sardina pilchardus) J Sci Food Agric 38 271-6 45 Rajapakse N Jung W K Mendis E Moon S H et Kim S K 2005 A novel anticoagulant purified from fish protein hydrolysate inhibits factor XIIa and platelet aggregation Life Sciences 76 2607-19 46 Ravallec-Pleacute R 2000 Valorisation dhydrolysats dorigine marine optimisation de la concentration en peptides apparenteacutes aux facteurs de croissance et aux agents seacutecreacutetagogues Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Bretagne Occidentale 47 Ravallec-Pleacute R et Van Wormhoudt A 2003 Secretagogue activities in cod (Gadus morhua) and shrimp (Penaeus aztecus) extracts and alcalase hydrolysates determined in AR4-2J pancreatic tumour cells Comp Biochem Physiol B 134 669-79 48 Rousseau M Batista I Le Gal Y et Fouchereau-Peacuteron M 2001 Purification of a functional competitive antagonist for calcitonin gene related peptide action from sardine hydrolysate EJB 4 25-32 49 Shahidi F Han X et Synowiecki J 1995 Production and characteristics of protein hydrolystaes from capelin (Mallotus villosus) Food Chem 53 285-93
79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE
52
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
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79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
CHAPITRE 1 MATERIEL ET METHODES
Lrsquoeacutetude expeacuterimentale agrave savoir lrsquohydrolyse enzymatique et le dosage des
proteacuteines totales srsquoest faite dans le laboratoire de chimie alimentaire du service
drsquoHygiegravene et Industrie des Denreacutees Alimentaires drsquoOrigine Animale (HIDAOA)
de lrsquoEISMV et dans le laboratoire de Bromatologie de lrsquoESP durant la
peacuteriode de Janvier agrave Mars 2007
11 Mateacuteriel
111 Mateacuteriel biologique
1111 Preacuteparation des co-produits de la sole tropicale
Les soles utiliseacutees pour notre eacutetude provenant de lrsquousine lsquoLa pirogue bleuersquo ont
eacuteteacute peacutecheacutees dans la zone FAO Ndeg 34 en Deacutecembre 2006
Les poissons sont fileteacutes agrave lrsquousine et les co-produits sont collecteacutes seacutepareacutement
puis congeleacutes et stockeacutes agrave -20deg C
Les co-produits sont deacutefinis comme les parties non utiliseacutees et reacutecupeacuterable lors
drsquoopeacuteration traditionnelles de production Ces co-produits ont eacuteteacute traiteacutes selon le
mecircme protocole de conservation que les parties destineacutees agrave la consommation
humaine afin drsquoeacuteviter leur alteacuteration Les co-produits de soles utiliseacutes dans cette
eacutetude sont la tecircte et les viscegraveres (photo1)
Photo1 tecircte et viscegraveres de la sole tropicale
53
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
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77
29 Lalasidis G Bostroumlm S et Sjoumlberg L B 1978 Low molecular weight enzymatic fish protein hydrolysates chemical composition and nutritive values J Agric Food Cehm 28 751-6 30 Liaset B Julsham K et Espe M 2003 Chemical composition and theoretical nutritional evaluation of the produced fractions from enzymic hydrolysis of salmon frames with Protamex Process Biochem 38 1747-59 32 Liaset B Lied E et Espe M 2000 Enzymatic hydrolysis of by-products from the fishfilleting industry chemical characterization and nutritional evaluation J Sci Food Agric 80 881 33 Larbier M et Leclercq B 1992 Les matiegraveres premiegraveres utiliseacutees en aviculture (225 ndash 301) in nutrition et alimentation des volailles Paris INRA 34 Lowry O H Rosebrough NJ Farr AL et Randall R J 1951 Protein measurement with Folin phenol reagent J Biol Chem 193 256 ndash 275 35 Lynch et coll (1998) Lynch JM Barbano DMet Fleming JR ndash Indirect and direct determination of the casein content of milk by Kjeldhal nitrogen analysis collaborative study J AOAC Int 36 Mackie IM 1982 General review of fish protein hydrolysates Animal Feed Sci And Technol 7 113-24 37 Martin AM et Chintalapati S P 1989 Fish offal-peat compost extracts as fermentation substrate Biological wastes 27 281-8 38 Martone et al (2005) Martone CB Peacuterez Borla O et Saacuten chez J J 2005 Fishery by-product as a nutrient source for bacteria and aracha growth media Bioresource Technol 96 383-87 39 Merritt JH 1982 Assessment of the production costs of fish protein hydrolysates Anim Feed Sci Technol 1 147-51
78
40 Ndoye F Moiumlty-maiumlzi P et Broutin c 2002 Le poisson fumeacute sur la petite cocircte Senegalaise 41Oslashrskov ER Soliman H S et Clark C F S 1982 Use of fish protein hydrolysate in milk replacers Anim Feed Sci Tech 7 135 42 Ouellet DR Seoane J R Veira D M et Proulx J G 1997 Effects of supplementation with fish meal or fish protein hydrolysate on growth nutrient digestibility and rumen fermentation of growing cattle fed grass silage Anim Feed Sci Tech 68 307-26 43 Picot L Bordenave S Didelot S Fruitier-Arnaudin I Sannier F Thorkelsson G Bergeacute J P Gueacuterard F Chabeaud A et Piot J M 2006 Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines Process Biochem 41 1217-22 44 Quaglia GB et Orban E 1987 Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysates from sardine (Sardina pilchardus) J Sci Food Agric 38 271-6 45 Rajapakse N Jung W K Mendis E Moon S H et Kim S K 2005 A novel anticoagulant purified from fish protein hydrolysate inhibits factor XIIa and platelet aggregation Life Sciences 76 2607-19 46 Ravallec-Pleacute R 2000 Valorisation dhydrolysats dorigine marine optimisation de la concentration en peptides apparenteacutes aux facteurs de croissance et aux agents seacutecreacutetagogues Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Bretagne Occidentale 47 Ravallec-Pleacute R et Van Wormhoudt A 2003 Secretagogue activities in cod (Gadus morhua) and shrimp (Penaeus aztecus) extracts and alcalase hydrolysates determined in AR4-2J pancreatic tumour cells Comp Biochem Physiol B 134 669-79 48 Rousseau M Batista I Le Gal Y et Fouchereau-Peacuteron M 2001 Purification of a functional competitive antagonist for calcitonin gene related peptide action from sardine hydrolysate EJB 4 25-32 49 Shahidi F Han X et Synowiecki J 1995 Production and characteristics of protein hydrolystaes from capelin (Mallotus villosus) Food Chem 53 285-93
79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
1112 Constitution des lots
Pour chaque hydrolyse des lots de 100g de carcasse sont acircpreteacutes puis conserveacutes
agrave -20degC jusqursquoagrave leur utilisation
112 Mateacuteriel enzymatique
Lrsquoenzyme utiliseacutee est le Protamex Crsquoest une enzyme industrielle produite par
geacutenie geacuteneacutetique par la socieacuteteacute lsquoNovozymes SArsquo Le Protamex est un complexe
peptidique de la classe des hydrolases deacuteveloppeacute par plusieurs espegraveces de
Bacillus pour lrsquohydrolyse des proteacuteines alimentaires Protamex possegravede les
numeacuteros de classification enzymatique suivants EC 342162 et EC 342428
Contrairement agrave drsquoautres endoproteacuteases protamex a eacuteteacute eacutelaboreacute de faccedilon agrave ne
pas geacuteneacuterer de peptides amers mecircme lorsque les degreacutes drsquohydrolyses sont
faibles Protamex est standardiseacutee drsquoapregraves le fournisseur en uniteacute Anson par g
(AUg) Les conditions optimales de travail sont atteintes pour un pH compris
entre 55 et 75 et une tempeacuterature comprise entre 35 et 60degC
Protamex peut ecirctre inactiveacute par chauffage agrave 85degC pendant 10min lorsque le pH
est de 8 (Voir annexe)
Photo 2 boicircte contenant lrsquoenzyme Protamex
54
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
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10 Cuvellier GF 1999 Enzymologie et biocatalyse Dans Biotechnologie Paris Tec et Doc Lavoisier Paris 319-42 11 Dumay J 2006 Extraction de lipides en voie aqueuse par bioreacteur enzymatique combineacute agrave lrsquoultracentrifugation application agrave la valorisation de co-produits de poisson (Sardina pilchardus) Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute bioproceacutedeacutes et biotechnologies marines Lieu de soutenance Ecole Polytechnique de lrsquoUniversiteacute de Nantes 12 Dong YL Sheng G Y Fu J M et Wen K W 2005 Chemical characterization and antianaemia activity of fish protein hydrolysate from Saurida elongata J Sci Food Agric 85 2033-39 13 FAO 1998 The state of world fisheries and aquaculture Rome Italy 14 Fitzgerald AJ Rai P S Marchbank T Taylor G W Ghosh S Ritz B W et Playford R J 2005 Reparative properties of a commercial fish protein hydrolysate preparation Gut 54775-81 15 Gauthier D 2006 Introduction aux techniques utiliseacutees en biochimie le dosage des proteacuteines lten lignegt [accegraves internet] wwwchimiebiochimieumonctoncabchdgsiitubprodosage 16 Gildberg A 1993 Enzymic processing of marine raw materials Process Biochem 28 1-15 17 Gildberg A Brgwald J Johansen A et Stenberg E 1996 Isolation of acid peptide fractions from a fish protein hydrolysate with strong stimulatory effect on atlantic salmon (Salmo salar) head kidney leucocytes Comp Biochem Physiol 114 B 97-101 18 Gildberg A Arnesen J A et Carlehoumlg M 2002 Utilisation of cod backbone by biochemical fractionation Process Biochem 38 475-80
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80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
113 Mateacuteriel technique
1131 Mateacuteriel de preacutelegravevement
bull Glaciegravere
bull Carboglace
1132 Mateacuteriel de laboratoire
bull Verreries et accessoires
bull Mateacuteriel utiliseacute pour les prises drsquoessais couteaux ciseaux balance
eacutelectronique
bull Mateacuteriel utiliseacute pour lrsquohydrolyse enzymatique plaque chauffante
agitateur magneacutetique papier aluminium entonnoir thermo- pH megravetre
portable (photo 3)
bull Centrifugeuse (photo 4) bain-marie (photo 5) tube Falcon eacutetuve
bull Mateacuteriel utiliseacute pour la mineacuteralisation hotte capteur de fumeacutee bloc de
mineacuteralisation
bull Une uniteacute de distillation pour le dosage des proteacuteines
Photo 3 Thermo-pH metre portable (HANNA instruments)
55
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
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40 Ndoye F Moiumlty-maiumlzi P et Broutin c 2002 Le poisson fumeacute sur la petite cocircte Senegalaise 41Oslashrskov ER Soliman H S et Clark C F S 1982 Use of fish protein hydrolysate in milk replacers Anim Feed Sci Tech 7 135 42 Ouellet DR Seoane J R Veira D M et Proulx J G 1997 Effects of supplementation with fish meal or fish protein hydrolysate on growth nutrient digestibility and rumen fermentation of growing cattle fed grass silage Anim Feed Sci Tech 68 307-26 43 Picot L Bordenave S Didelot S Fruitier-Arnaudin I Sannier F Thorkelsson G Bergeacute J P Gueacuterard F Chabeaud A et Piot J M 2006 Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines Process Biochem 41 1217-22 44 Quaglia GB et Orban E 1987 Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysates from sardine (Sardina pilchardus) J Sci Food Agric 38 271-6 45 Rajapakse N Jung W K Mendis E Moon S H et Kim S K 2005 A novel anticoagulant purified from fish protein hydrolysate inhibits factor XIIa and platelet aggregation Life Sciences 76 2607-19 46 Ravallec-Pleacute R 2000 Valorisation dhydrolysats dorigine marine optimisation de la concentration en peptides apparenteacutes aux facteurs de croissance et aux agents seacutecreacutetagogues Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Bretagne Occidentale 47 Ravallec-Pleacute R et Van Wormhoudt A 2003 Secretagogue activities in cod (Gadus morhua) and shrimp (Penaeus aztecus) extracts and alcalase hydrolysates determined in AR4-2J pancreatic tumour cells Comp Biochem Physiol B 134 669-79 48 Rousseau M Batista I Le Gal Y et Fouchereau-Peacuteron M 2001 Purification of a functional competitive antagonist for calcitonin gene related peptide action from sardine hydrolysate EJB 4 25-32 49 Shahidi F Han X et Synowiecki J 1995 Production and characteristics of protein hydrolystaes from capelin (Mallotus villosus) Food Chem 53 285-93
79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
Photo 4 centrifugeuse Photo 5 Bain marie pour lrsquoinactivation
de lrsquoenzyme
12 Meacutethodes
121 Hydrolyse enzymatique
Le but de cette eacutetude est de deacutestructurer les matiegraveres par le biais de proteacutease de
faccedilon agrave libeacuterer les proteacuteines en vue drsquoune valorisation Il est donc important de
travailler dans les conditions preacutecises et controcircleacutees de tempeacuterature et de pH
adapteacutes agrave lrsquoenzyme utiliseacutee
100g de carcasse (tecirctes et viscegraveres) deacutecoupeacutees en morceaux et 100ml drsquoeau
distilleacutee sont introduits dans un erlenmeyer Le chauffage se fait avec une plaque
eacutelectrique jusqursquoagrave obtention des conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme crsquoest-agrave-
dire un PH de 630 et une tempeacuterature de 50degC 01ml drsquoenzyme est alors
ajouteacute agrave la solution
Lrsquohydrolyse dure 1h de temps Pendant lrsquohydrolyse la stabiliteacute du pH et de la
tempeacuterature est controcircleacutee par le thermo-pHmegravetre portable
56
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
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79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
Photo 6 Dispositif drsquohydrolyse installeacute au laboratoire
1211 Suivie de la cineacutetique des hydrolyses
Plusieurs paramegravetres sont influents lors de la conduite de lrsquohydrolyse
enzymatique
bull La concentration du substrat et de lrsquoenzyme
bull Le pH
bull La tempeacuterature
bull La force ionique
bull La preacutesence ou lrsquoabsence de substances inhibitrices ou activatrices
Lors de notre eacutetude seuls la tempeacuterature et le pH seront optimiseacutees
Chaque hydrolyse est suivie agrave temps reacuteel Pendant lrsquohydrolyse la stabilisation
du pH et de la tempeacuterature est controcircleacutee Toutes les 5min le pH et la tempeacuterature
sont noteacutes agrave lrsquoaide du thermo-pH megravetre (photo 6)
57
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
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SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
1212 Hydrolyse courte dureacutee
Les hydrolyses ont eacuteteacute conduites pour chaque eacutechantillon durant 1h suivant les
conditions optimales deacutetermineacutees pour lrsquoenzyme utiliseacutee de faccedilon agrave observer le
comportement des matrices en contact avec lrsquoenzyme
122 Filtration
Au bout drsquoune heure lrsquohydrolyse est consideacutereacutee comme termineacutee Lrsquohydrolysat
obtenu est filtreacute afin de seacuteparer les arecirctes On arrecircte la reacuteaction enzymatique en
placcedilant le meacutelange dans un bain-marie agrave 85degC pendant 10mn pour inactiver
lrsquoenzyme
123 Centrifugation
Lrsquohydrolysat est reparti dans les tubes Falcon de 40ml puis centrifugeacute agrave
6000trmn pendant 20mn
Photo7 hydrolysat dans les tubes Falcon
Ainsi trois (3) phases sont reacutecupeacutereacutees (photo8)
la phase huileuse contenant majoritairement les lipides
NB Cette phase est neacutegligeable car Cynoglossus senegalensis est un poisson
maigre
58
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
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78
40 Ndoye F Moiumlty-maiumlzi P et Broutin c 2002 Le poisson fumeacute sur la petite cocircte Senegalaise 41Oslashrskov ER Soliman H S et Clark C F S 1982 Use of fish protein hydrolysate in milk replacers Anim Feed Sci Tech 7 135 42 Ouellet DR Seoane J R Veira D M et Proulx J G 1997 Effects of supplementation with fish meal or fish protein hydrolysate on growth nutrient digestibility and rumen fermentation of growing cattle fed grass silage Anim Feed Sci Tech 68 307-26 43 Picot L Bordenave S Didelot S Fruitier-Arnaudin I Sannier F Thorkelsson G Bergeacute J P Gueacuterard F Chabeaud A et Piot J M 2006 Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines Process Biochem 41 1217-22 44 Quaglia GB et Orban E 1987 Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysates from sardine (Sardina pilchardus) J Sci Food Agric 38 271-6 45 Rajapakse N Jung W K Mendis E Moon S H et Kim S K 2005 A novel anticoagulant purified from fish protein hydrolysate inhibits factor XIIa and platelet aggregation Life Sciences 76 2607-19 46 Ravallec-Pleacute R 2000 Valorisation dhydrolysats dorigine marine optimisation de la concentration en peptides apparenteacutes aux facteurs de croissance et aux agents seacutecreacutetagogues Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Bretagne Occidentale 47 Ravallec-Pleacute R et Van Wormhoudt A 2003 Secretagogue activities in cod (Gadus morhua) and shrimp (Penaeus aztecus) extracts and alcalase hydrolysates determined in AR4-2J pancreatic tumour cells Comp Biochem Physiol B 134 669-79 48 Rousseau M Batista I Le Gal Y et Fouchereau-Peacuteron M 2001 Purification of a functional competitive antagonist for calcitonin gene related peptide action from sardine hydrolysate EJB 4 25-32 49 Shahidi F Han X et Synowiecki J 1995 Production and characteristics of protein hydrolystaes from capelin (Mallotus villosus) Food Chem 53 285-93
79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
la phase soluble correspondant au surnageant comportant les proteacuteines
les peptides en solution et autres composeacutes solubles
la phase insoluble correspondant au culot contenant les proteacuteines et les
fractions non solubles
Photo8 hydrolysat apregraves centrifugation
124 La matiegravere segraveche
Apregraves centrifugation le culot et le surnageant sont mis dans lrsquoeacutetuve agrave 100degC
pendant 48h Puis la matiegravere segraveche est reacutecupeacutereacutee pour des analyses
biochimiques
13 Analyses biochimiques
131 Deacutetermination de la teneur en eau
La teneur en eau des 2 fractions (culot et surnageant) est deacutetermineacutee par peseacutee
apregraves 48h dans lrsquoeacutetuve Pour cela le culot et le surnageant sont placeacutes dans des
coupelles preacutealablement tareacutees qui seront ensuite disposeacutees dans lrsquoeacutetuve agrave
100degC Apregraves refroidissement agrave tempeacuterature ambiante les coupelles sont agrave
nouveau peseacutees
La deacutetermination de la teneur en eau a eacuteteacute reacutealiseacutee de faccedilon identique pour toutes
les 2 fractions
La teneur en matiegravere segraveche est donneacutee par la formule suivante
59
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
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79
80
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SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
Teneur en matiegravere segraveche = masse de la coupelle pleine ndash masse de la coupelle vide masse de lrsquoeacutechantillon
132 Dosage des proteacuteines totales
Les proteacuteines totales sont estimeacutees agrave partir du taux drsquoazote doseacute par
mineacuteralisation selon la meacutethode de Kjeldhal (Lynch et coll 1998)
1321 Principe
Lrsquoazote totale est doseacute par mineacuteralisation agrave lrsquoacide sulfurique lrsquoammoniac
obtenue est deacuteplaceacute par une solution concentreacute drsquohydroxyde de sodium
recueillie dans une solution tampon drsquoacide borique titreacute
1322 Mode opeacuteratoire
Mineacuteralisation
Environ 1g de matiegravere segraveche de lrsquoeacutechantillon peseacute est placeacute dans un tube agrave
mineacuteraliser ainsi qursquoune pastille de catalyseur et 20ml drsquoacide sulfurique
concentreacute
Sous la hotte et le capteur de fumeacutee mis en route le tube est introduit dans le
bloc de mineacuteralisation On chauffe agrave 450degC environ jusqursquoagrave obtention drsquoune
solution tregraves visqueuse de teinte blanchacirctre Le temps neacutecessaire varie de 2 agrave 4h
Apregraves refroidissement le capteur de fumeacutee est rinceacute avec environ 5ml drsquoeau que
lrsquoon recueille dans le tube Le culot et le surnageant sont alors remis en
suspension dans lrsquoeau en prenant les preacutecautions drsquousage (20ml en tout
suffisent)
Le dosage de lrsquoazote total se fait sur cette solution
Entraicircnement agrave la vapeur drsquoeau
Dans une fiole conique de 250ml 20ml drsquoacide borique avec indicateur coloreacute y
sont placeacutes
60
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
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79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
Cette fiole est ensuite adapteacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute du reacutefrigeacuterant de lrsquouniteacute de
distillation de telle sorte que lrsquoallonge plonge dans la solution drsquoacide borique
On branche le tube sur lrsquouniteacute de distillation et on neutralise par 80ml de soude
(4 fois le volume drsquoacide sulfurique utiliseacute)
Lrsquoentraicircnement agrave la vapeur drsquoeau se fait en 6min Cela correspond agrave un volume
de 150ml de distillat sur les 20ml drsquoacide borique On obtient une solution de
couleur verte
Titration
On titre directement dans la fiole conique par lrsquoacide chlorhydrique 1N jusqursquoagrave
lrsquoobtention drsquoun virage agrave la couleur rose
1323 Expression des reacutesultats
La teneur en azote total noteacute N en g pour 100g de lrsquoeacutechantillon est eacutegal agrave
N= 14 x V M
Avec V= Volume en ml de lrsquoacide chlorhydrique utiliseacute
M= Masse en g de la prise drsquoessai
La teneur en peptides noteacute P est obtenue gracircce agrave la formule suivante
P= N x 625
On parlera ainsi de peptides et non de proteacuteines
61
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
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80
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SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
CHAPITRE 2 RESULTATS
21 Suivi de la cineacutetique de lrsquohydrolyse
Les deacutelais de temps ont eacuteteacute respecteacutes pour toutes les hydrolyses agrave savoir 1h
Le pH se situe dans lrsquointervalle [620 agrave 631] avec une moyenne de 624 La
tempeacuterature preacutesente une fourchette de [55 degC agrave 567degC] avec une moyenne de
5565degC (Voir annexes)
Ces reacutesultats montrent que les conditions drsquoutilisation de lrsquoenzyme Protamex ont
eacuteteacute respecteacutees au cours de notre expeacuterimentation
22 Poids des hydrolysats et des arecirctes
La figure 9 ci-dessous montre qursquoapregraves hydrolyse on a un deacutepocirct drsquoarecirctes
repreacutesentant 3 du poids de deacutepart Cela se justifie par le fait que les arecirctes ne
sont pas digeacutereacutees par le Protamex
Le poids de lrsquohydrolysat peut aller jusquagrave 97 de la masse initiale (100g de
carcasse + 100 ml drsquoeau) Le poids de lrsquohydrolysat est largement supeacuterieur agrave
celui des arecirctes Lrsquohydrolyse de courte dureacutee (1h) a permis une bonne seacuteparation
des arecirctes qui ont eacuteteacute nettoyeacutees de toute matiegravere organique Ces reacutesultats
prouvent que lrsquoenzyme a bien faciliteacute la digestion de toute la chaire attacheacutee agrave la
tecircte Ces reacutesultats teacutemoignent donc drsquoune bonne activiteacute enzymatique du
Protamex
62
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
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50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
3
97
Poids des arecirctes
Poids delhydolysat
Figure 9 Poids des deux parties obtenues apregraves hydrolyse
2 3 Poids du culot et du surnageant
A travers la figure 10 on remarque qursquoapregraves centrifugation de lrsquohydrolysat la
phase soluble (surnageant) est la plus abondante Elle repreacutesente 91 de
lrsquohydrolysat contre 9 pour la partie insoluble (culot)
9
91
Poids du culot
Poids dusurnageant
Figure 10 Pourcentages de culot et de surnageant dans lrsquohydrolysat
Ceci est un indicateur de lrsquoimportance des proteacuteines solubles dans lrsquohydrolysat
obtenu
63
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
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SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
24 Poids matiegravere segraveche et poids en eau du culot et du surnageant
En comparant les reacutesultats des figures 11 et 12 on se rend compte que le
surnageant est constitueacute agrave majoriteacute drsquoeau jusqursquoagrave 93 par rapport au culot dont
la teneur en eau est 15 moins Ceci srsquoexplique par le fait que le surnageant
eacutetant la phase aqueuse elle est beaucoup plus riche en eau
Quant aux matiegraveres segraveches crsquoest le contraire qursquoon observe En effet il est
logique que la matiegravere segraveche soit plus abondante dans le culot car il contient agrave
majoriteacute les fractions insolubles de lrsquohydrolysat
22
78
Poids matiegravereseacuteche culotPoids en eau duculot
Figure 11 Distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le culot
7
93
Poids matiegraveresegraveche surnageantPoids en eausurnageant
Figure 12 distribution de lrsquoeau et de la matiegravere segraveche dans le surnageant
25 Les proteacuteines du surnageant et du culot
64
0
5
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15
20
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Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
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SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
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Echantillons
Proteacuteine du Surnageant Proteacuteine du Culot
Figure 13 courbes des proteacuteines du surnageant et du culot
La figure 13 montre que le taux de proteacuteines est plus eacuteleveacute dans le surnageant
avec une moyenne de 2765 contre une moyenne de 23 97 dans le culot
Crsquoest en effet dans le surnageant qursquoon retrouve un grand nombre de proteacuteines
en solution Toutefois nous notons un taux minimal de proteacuteines supeacuterieur agrave 20
dans les deux cas
Lrsquohydrolyse des co-produits de la sole notamment de la tecircte et des viscegraveres par
le Protamex donne drsquoassez bons reacutesultats pour ecirctre exploiteacute Le surnageant peut
avoir un potentiel en tant que composants bioactifs dans les aliments
fonctionnels ou les nutraceutiques Et le culot employeacute pour la production de
lrsquoalimentation animale et de lrsquoaquaculture
65
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
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SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
CHAPITRE 3 DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
31 DISCUSSION
311 Discussion sur le mateacuteriel et les meacutethodes
3111 Lrsquohydrolyse enzymatique
Pour une bonne hydrolyse il est important de travailler dans des conditions
preacutecises cest-agrave-dire le mateacuteriel et la meacutethode doivent ecirctre de bonne qualiteacute et
adapteacutes aux opeacuterations effectueacutees
Pour notre eacutetude un pH megravetre portable nous a permis de surveiller agrave temps
reacuteel toutes les 5 min pendant 1h le pH et la tempeacuterature En effet lrsquoutilisation
drsquoun appareil de type pH stat aurait donneacute des reacutesultats plus preacutecis et stables Le
principe de cet appareil (pH stat TIM 854 TITRATION MANAGER) est de
controcircler les hydrolyses assisteacute par le logiciel Titra Master 85 (Radiometer
analytical) permettant de suivre la tempeacuterature et de reacuteguler le pH agrave lrsquoaide drsquoune
solution de NaOH 2N A partir du volume de soude verseacute le Degreacute drsquoHydrolyse
(DH) peut ecirctre calculeacute
Une enzyme de type proteacutease produit par geacutenie geacuteneacutetique par la firme
Novozymes (Danemark) a eacuteteacute utiliseacutee pour notre eacutetude Il srsquoagit du Protamexreg
qui est une endopeptidase cest-agrave-dire une enzyme qui coupe les liaisons
peptidiques situeacutee agrave lrsquointeacuterieur des moleacutecules Par ailleurs Protamexreg est
lrsquoenzyme qui permet drsquoobtenir le plus haut degreacute drsquohydrolyse comme lrsquoont
montreacute les travaux de Quaglia et Orban en 1990 Ces deux auteurs ont eu agrave
comparer Protamexreg avec drsquoautres enzymes proteacuteolytiques telles que lrsquoalcalase
et le Flavourzyme De leurs reacutesultats il ressort que de hauts degreacutes drsquohydrolyse
drsquoenviron 20 ont eacuteteacute obtenus avec le Protamexreg Contrairement aux deux
autres enzymes qui ont un degreacute drsquohydrolyse de 12
Pour notre eacutetude nous avons utiliseacutes une plaque chauffante reacutegleacutee agrave 55degC pour
mener nos hydrolyses Cependant plusieurs auteurs qui ont eu agrave travailler sur
66
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
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SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
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RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
lrsquohydrolyses des co-produits ont utiliseacutes un systegraveme beaucoup plus moderne
composeacute drsquoun bio reacuteacteur coupleacute agrave un pH stat qui permet de reacuteguler le pH du
milieu En effet lrsquoutilisation drsquoun bio-reacuteacteur enzymatique est preacutefeacuterable pour
reacutealiser les hydrolyses les eacutechantillons sont placeacutes dans un reacuteacteur agrave double
enveloppe avec un volume drsquoeau distilleacutee Le systegraveme est mis en agitation (300
rpm pour les viscegraveres et 700 rpm pour les tecirctes) et est ameneacute agrave la tempeacuterature
voulue agrave lrsquoaide de la circulation drsquoeacutethylegravene glycol dans la double enveloppe du
reacuteacteur La tempeacuterature agrave lrsquointeacuterieur du systegraveme est mesureacutee agrave lrsquoaide de la sonde
de tempeacuterature du pH stat Le pH initial est mesureacute puis lrsquoajout manuel de soude
(1 ou 2M) est reacutealiseacute jusqursquoagrave lrsquoobtention du pH voulu pour reacutealiser lrsquohydrolyse
Lrsquoenzyme est ajouteacutee apregraves stabilisation du systegraveme et le pH est controcircleacute par
lrsquoeacutelectrode et reacuteguleacute par la pointe drsquoaddition
3112 La matiegravere segraveche
La matiegravere segraveche des eacutechantillons est obtenue apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve agrave 100degC
Mais nous avons rencontreacute des limites au niveau du surnageant qui en seacutechant
devient collant (comme du caramel) rendant ainsi difficile les manipulations Il
aurait eacuteteacute preacutefeacuterable de deacuteterminer la teneur en matiegravere segraveche des eacutechantillons
apregraves lyophilisation En effet Les matiegraveres segraveches obtenues se trouvent alors
sous forme de poudre
3113 Le dosage des proteacuteines
Les proteacuteines sont composeacutees dacides amineacutes Dans le cadre de leur dosage de
nombreuses meacutethodes spectrophotomeacutetries baseacutees sur diverses caracteacuteristiques
spectrales ou reacuteactionnelles des acides amineacutes ont eacuteteacute mises au point
Pour cette eacutetude le dosage des proteacuteines a eacuteteacute fait par la meacutethode de Kjeldahl
Cette meacutethode consiste agrave mesurer la quantiteacute dazote organique dun eacutechantillon
Il faut eacutevidemment savoir pour leacutechantillon analyseacute quelle est la relation entre
67
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
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74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
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76
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SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
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RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
la quantiteacute dazote et celle de proteacuteines Elle requiert un eacutequipement coucircteux et
complexe On ne lapplique quagrave des eacutechantillons difficiles agrave homogeacuteneacuteiser
Pour eacuteviter les inconveacutenients de la meacutethode de Kjeldahl drsquoautre meacutethode telle
que la meacutethode de Lowry et la meacutethode du biuret peuvent ecirctre utiliseacutees
La meacutethode de Lowry peut ecirctre utiliseacutee pour le dosage des proteacuteines afin de
suivre lrsquoeacutevolution de la quantiteacute de proteacuteines au cours de lrsquohydrolyse (Lowry et
coll 1951) Cette meacutethode a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Lowry et coll qui ont combineacute
une reacuteaction du biuret et une reacuteaction au reacuteactif de Folin-Ciocalteu Ce dernier agrave
base de phosphomolybdate et de phosphotungstate reacuteagit avec les AA
tyrosines et tryptophanes pour donner une coloration bleue qui sajoute agrave celle
du biuret La grande sensibiliteacute de la meacutethode de Lowry est sa principale qualiteacute
La Meacutethode du biuret a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par Gornall et al (1949) Cette
reacuteaction du biuret est la formation dun complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conseacutecutifs en preacutesence de cuivre en
milieu alcalin Le complexe de coordination reacutesultant absorbe fortement dans le
bleu Mecircme si cette meacutethode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement
rapide Sa principale qualiteacute est davoir une absorption eacutegale pour toutes les
proteacuteines Par contre son deacutefaut est sa sensibiliteacute agrave certains interfeacuterents comme
les peptides le saccharose le tris le glyceacuterol)
La meacutethode de Lowry a eacuteteacute tellement utiliseacutee que larticle original de Lowry est
un des articles scientifiques les plus citeacutes au monde Encore aujourdhui on
publie de nouvelles variantes de cette meacutethode
(Gauthier 2006)
Il aurait eacuteteacute aussi inteacuteressant de doser les proteacuteines solubles par la meacutethode de
Bradford (Bradford 1976) Ce dosage est baseacute sur lrsquoadsorption du colorant bleu
de Coomassie G250 Ce reacuteactif rougebrun agrave lrsquoeacutetat libre prend une teinte bleue
quand il est lieacute aux proteacuteines et par conseacutequent possegravede un coefficient
drsquoextinction molaire eacuteleveacute dans le visible (agrave 595 nm) qui permet un dosage
68
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
9 Coacuterdova-Murueta JH et Garciacutea-Carreno FL 2002 Nutritive value of squid and hydrolyzed protein supplement in shrimp feed Aquaculture 210 371-84
75
10 Cuvellier GF 1999 Enzymologie et biocatalyse Dans Biotechnologie Paris Tec et Doc Lavoisier Paris 319-42 11 Dumay J 2006 Extraction de lipides en voie aqueuse par bioreacteur enzymatique combineacute agrave lrsquoultracentrifugation application agrave la valorisation de co-produits de poisson (Sardina pilchardus) Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute bioproceacutedeacutes et biotechnologies marines Lieu de soutenance Ecole Polytechnique de lrsquoUniversiteacute de Nantes 12 Dong YL Sheng G Y Fu J M et Wen K W 2005 Chemical characterization and antianaemia activity of fish protein hydrolysate from Saurida elongata J Sci Food Agric 85 2033-39 13 FAO 1998 The state of world fisheries and aquaculture Rome Italy 14 Fitzgerald AJ Rai P S Marchbank T Taylor G W Ghosh S Ritz B W et Playford R J 2005 Reparative properties of a commercial fish protein hydrolysate preparation Gut 54775-81 15 Gauthier D 2006 Introduction aux techniques utiliseacutees en biochimie le dosage des proteacuteines lten lignegt [accegraves internet] wwwchimiebiochimieumonctoncabchdgsiitubprodosage 16 Gildberg A 1993 Enzymic processing of marine raw materials Process Biochem 28 1-15 17 Gildberg A Brgwald J Johansen A et Stenberg E 1996 Isolation of acid peptide fractions from a fish protein hydrolysate with strong stimulatory effect on atlantic salmon (Salmo salar) head kidney leucocytes Comp Biochem Physiol 114 B 97-101 18 Gildberg A Arnesen J A et Carlehoumlg M 2002 Utilisation of cod backbone by biochemical fractionation Process Biochem 38 475-80
76
19 Gueacuterard F Dufosseacute L De La Broise D et Binet A 2001 Enzymatic hydrolysis of protein from yellowfin tuna (Thunnus albacares) wastes using alcalase J Mol Catalysis B Enzymatic 11 1051-9 20 Gueacuterard F Batista I Pires C Thorkelson G et Le Gal Y 2004 Repport on sources and selection criteria for raw material Rapport eacutetabli pour le programme SEAFOODplus- 57 21 Gornall Bardawill et David 1949 J Biol Chem 177 751 [Mise au point dune meacutethode quantitative pour doser les proteacuteines avec le biuret] 22 Hoyle NT et Merrit J H 1994 Quality of fish protein hydrolysates from herring (Clupea harengus) J Food Sci 59 76-9 23 Direction des Pecircches Maritimes (DPM) Centre de Recherche Oceacuteanographiques de Dakar-Thiaroye(CRODT) Rapport final Etude de lrsquoeacutevaluation et de la gestion des ressources halieutiques en Reacutepublique de Seacuteneacutegal Dakar direction des pecircches maritimes 24 Institut Franccedilais pour la Nutrition 1997 Les proteacuteines ndash Tome 2 Caracteacuteristiques des diffeacuterentes sources de proteacuteines alimentaires Paris IFN- Dossier speacutecifique Ndeg9 bis 25 Jones DA 1995 Frippak ndash the facts A response to the article by PR Muir and DC Sutton J Word Aquacult Soc 26(2)220-222 26 Jun SY Park P J Jung W K et Kim S K 2004 Purification and characterization of an antioxydative peptide from enzymatic hydrolysate of yellowfin sole (Limanda aspera) frame protein Eur Food Res Technol 219 pp 20-6 27 Kim SK et Mendis E 2006 Bioactive compounds from marine processing by-products - A review Food Res Int 39383-93 28 Kristinsson HG et Rasco B A 2000 Fish protein hydrolysates Production biochemical and functional properties Critical Reviews in Food Sci and Nutr 40 43-81
77
29 Lalasidis G Bostroumlm S et Sjoumlberg L B 1978 Low molecular weight enzymatic fish protein hydrolysates chemical composition and nutritive values J Agric Food Cehm 28 751-6 30 Liaset B Julsham K et Espe M 2003 Chemical composition and theoretical nutritional evaluation of the produced fractions from enzymic hydrolysis of salmon frames with Protamex Process Biochem 38 1747-59 32 Liaset B Lied E et Espe M 2000 Enzymatic hydrolysis of by-products from the fishfilleting industry chemical characterization and nutritional evaluation J Sci Food Agric 80 881 33 Larbier M et Leclercq B 1992 Les matiegraveres premiegraveres utiliseacutees en aviculture (225 ndash 301) in nutrition et alimentation des volailles Paris INRA 34 Lowry O H Rosebrough NJ Farr AL et Randall R J 1951 Protein measurement with Folin phenol reagent J Biol Chem 193 256 ndash 275 35 Lynch et coll (1998) Lynch JM Barbano DMet Fleming JR ndash Indirect and direct determination of the casein content of milk by Kjeldhal nitrogen analysis collaborative study J AOAC Int 36 Mackie IM 1982 General review of fish protein hydrolysates Animal Feed Sci And Technol 7 113-24 37 Martin AM et Chintalapati S P 1989 Fish offal-peat compost extracts as fermentation substrate Biological wastes 27 281-8 38 Martone et al (2005) Martone CB Peacuterez Borla O et Saacuten chez J J 2005 Fishery by-product as a nutrient source for bacteria and aracha growth media Bioresource Technol 96 383-87 39 Merritt JH 1982 Assessment of the production costs of fish protein hydrolysates Anim Feed Sci Technol 1 147-51
78
40 Ndoye F Moiumlty-maiumlzi P et Broutin c 2002 Le poisson fumeacute sur la petite cocircte Senegalaise 41Oslashrskov ER Soliman H S et Clark C F S 1982 Use of fish protein hydrolysate in milk replacers Anim Feed Sci Tech 7 135 42 Ouellet DR Seoane J R Veira D M et Proulx J G 1997 Effects of supplementation with fish meal or fish protein hydrolysate on growth nutrient digestibility and rumen fermentation of growing cattle fed grass silage Anim Feed Sci Tech 68 307-26 43 Picot L Bordenave S Didelot S Fruitier-Arnaudin I Sannier F Thorkelsson G Bergeacute J P Gueacuterard F Chabeaud A et Piot J M 2006 Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines Process Biochem 41 1217-22 44 Quaglia GB et Orban E 1987 Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysates from sardine (Sardina pilchardus) J Sci Food Agric 38 271-6 45 Rajapakse N Jung W K Mendis E Moon S H et Kim S K 2005 A novel anticoagulant purified from fish protein hydrolysate inhibits factor XIIa and platelet aggregation Life Sciences 76 2607-19 46 Ravallec-Pleacute R 2000 Valorisation dhydrolysats dorigine marine optimisation de la concentration en peptides apparenteacutes aux facteurs de croissance et aux agents seacutecreacutetagogues Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Bretagne Occidentale 47 Ravallec-Pleacute R et Van Wormhoudt A 2003 Secretagogue activities in cod (Gadus morhua) and shrimp (Penaeus aztecus) extracts and alcalase hydrolysates determined in AR4-2J pancreatic tumour cells Comp Biochem Physiol B 134 669-79 48 Rousseau M Batista I Le Gal Y et Fouchereau-Peacuteron M 2001 Purification of a functional competitive antagonist for calcitonin gene related peptide action from sardine hydrolysate EJB 4 25-32 49 Shahidi F Han X et Synowiecki J 1995 Production and characteristics of protein hydrolystaes from capelin (Mallotus villosus) Food Chem 53 285-93
79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
proteacuteique tregraves sensible Crsquoest donc une meacutethode sensible et rapide Elle est aussi
assez reacutesistante agrave la plupart des interfeacuterents qui nuisent agrave la plupart des autres
meacutethodes de dosage des proteacuteines En effet des eacutetudes publieacutees par Hoyle et
Merrit (1994) Liaset et coll (2000) Gueacuterard et coll (2002) Wu et coll
(2003) et indiquent que plus les composeacutes issus de lrsquohydrolyse sont solubles plus
sera important la valeur ajouteacutee des moleacutecules obtenues
312 Discussion des reacutesultats
3121 La matiegravere segraveche
Nos reacutesultats ont reacuteveacuteleacute une diffeacuterence importante de matiegravere segraveche (MS) dans
le culot et le surnageant En effet nous avons trouveacute 7 de MS dans le
surnageant alors que le culot en contient 22
Ces reacutesultats pourraient ecirctre particulier agrave la sole tropicale car les travaux
drsquoAUBERTIN en 2003 sur la morue ont reacuteveacuteleacute des teneurs identique (7) de
MS dans le culot et le surnageant Ceux de DUMAY en 2006 sur la sardine ont
reacuteveacuteleacute une teneur de 9 de MS pour le culot et 80 pour le surnageant Les
diffeacuterences observeacutees entre nos reacutesultats et ceux des autres auteurs pourraient
ecirctre le fait soit de lrsquoespegravece de poisson utiliseacute soit des diffeacuterentes meacutethodes de
deacutetermination de la matiegravere segraveche utiliseacutees (lyophilisation eacutetuvage)
3122 Les proteacuteines
A notre connaissance aucune eacutetude anteacuterieure nrsquoa porteacute sur les analyses des
proteacuteines des co-produits de la sole tropicale au Seacuteneacutegal rendant ainsi difficile
toute comparaison de nos reacutesultats Neacuteanmoins si nous comparons nos reacutesultats
avec ceux du tableau Ndeg4 (cf eacutetude bibliographique) le taux de proteacuteines totales
obtenu lors de notre travail avec une moyenne de 2765 pour le surnageant et
23 97 pour le culot nous montre que la sole tropicale agrave un taux de proteacuteines
sensiblement eacutegal agrave ceux de la viande pour le culot et agrave ceux des produits laitiers
69
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
9 Coacuterdova-Murueta JH et Garciacutea-Carreno FL 2002 Nutritive value of squid and hydrolyzed protein supplement in shrimp feed Aquaculture 210 371-84
75
10 Cuvellier GF 1999 Enzymologie et biocatalyse Dans Biotechnologie Paris Tec et Doc Lavoisier Paris 319-42 11 Dumay J 2006 Extraction de lipides en voie aqueuse par bioreacteur enzymatique combineacute agrave lrsquoultracentrifugation application agrave la valorisation de co-produits de poisson (Sardina pilchardus) Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute bioproceacutedeacutes et biotechnologies marines Lieu de soutenance Ecole Polytechnique de lrsquoUniversiteacute de Nantes 12 Dong YL Sheng G Y Fu J M et Wen K W 2005 Chemical characterization and antianaemia activity of fish protein hydrolysate from Saurida elongata J Sci Food Agric 85 2033-39 13 FAO 1998 The state of world fisheries and aquaculture Rome Italy 14 Fitzgerald AJ Rai P S Marchbank T Taylor G W Ghosh S Ritz B W et Playford R J 2005 Reparative properties of a commercial fish protein hydrolysate preparation Gut 54775-81 15 Gauthier D 2006 Introduction aux techniques utiliseacutees en biochimie le dosage des proteacuteines lten lignegt [accegraves internet] wwwchimiebiochimieumonctoncabchdgsiitubprodosage 16 Gildberg A 1993 Enzymic processing of marine raw materials Process Biochem 28 1-15 17 Gildberg A Brgwald J Johansen A et Stenberg E 1996 Isolation of acid peptide fractions from a fish protein hydrolysate with strong stimulatory effect on atlantic salmon (Salmo salar) head kidney leucocytes Comp Biochem Physiol 114 B 97-101 18 Gildberg A Arnesen J A et Carlehoumlg M 2002 Utilisation of cod backbone by biochemical fractionation Process Biochem 38 475-80
76
19 Gueacuterard F Dufosseacute L De La Broise D et Binet A 2001 Enzymatic hydrolysis of protein from yellowfin tuna (Thunnus albacares) wastes using alcalase J Mol Catalysis B Enzymatic 11 1051-9 20 Gueacuterard F Batista I Pires C Thorkelson G et Le Gal Y 2004 Repport on sources and selection criteria for raw material Rapport eacutetabli pour le programme SEAFOODplus- 57 21 Gornall Bardawill et David 1949 J Biol Chem 177 751 [Mise au point dune meacutethode quantitative pour doser les proteacuteines avec le biuret] 22 Hoyle NT et Merrit J H 1994 Quality of fish protein hydrolysates from herring (Clupea harengus) J Food Sci 59 76-9 23 Direction des Pecircches Maritimes (DPM) Centre de Recherche Oceacuteanographiques de Dakar-Thiaroye(CRODT) Rapport final Etude de lrsquoeacutevaluation et de la gestion des ressources halieutiques en Reacutepublique de Seacuteneacutegal Dakar direction des pecircches maritimes 24 Institut Franccedilais pour la Nutrition 1997 Les proteacuteines ndash Tome 2 Caracteacuteristiques des diffeacuterentes sources de proteacuteines alimentaires Paris IFN- Dossier speacutecifique Ndeg9 bis 25 Jones DA 1995 Frippak ndash the facts A response to the article by PR Muir and DC Sutton J Word Aquacult Soc 26(2)220-222 26 Jun SY Park P J Jung W K et Kim S K 2004 Purification and characterization of an antioxydative peptide from enzymatic hydrolysate of yellowfin sole (Limanda aspera) frame protein Eur Food Res Technol 219 pp 20-6 27 Kim SK et Mendis E 2006 Bioactive compounds from marine processing by-products - A review Food Res Int 39383-93 28 Kristinsson HG et Rasco B A 2000 Fish protein hydrolysates Production biochemical and functional properties Critical Reviews in Food Sci and Nutr 40 43-81
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29 Lalasidis G Bostroumlm S et Sjoumlberg L B 1978 Low molecular weight enzymatic fish protein hydrolysates chemical composition and nutritive values J Agric Food Cehm 28 751-6 30 Liaset B Julsham K et Espe M 2003 Chemical composition and theoretical nutritional evaluation of the produced fractions from enzymic hydrolysis of salmon frames with Protamex Process Biochem 38 1747-59 32 Liaset B Lied E et Espe M 2000 Enzymatic hydrolysis of by-products from the fishfilleting industry chemical characterization and nutritional evaluation J Sci Food Agric 80 881 33 Larbier M et Leclercq B 1992 Les matiegraveres premiegraveres utiliseacutees en aviculture (225 ndash 301) in nutrition et alimentation des volailles Paris INRA 34 Lowry O H Rosebrough NJ Farr AL et Randall R J 1951 Protein measurement with Folin phenol reagent J Biol Chem 193 256 ndash 275 35 Lynch et coll (1998) Lynch JM Barbano DMet Fleming JR ndash Indirect and direct determination of the casein content of milk by Kjeldhal nitrogen analysis collaborative study J AOAC Int 36 Mackie IM 1982 General review of fish protein hydrolysates Animal Feed Sci And Technol 7 113-24 37 Martin AM et Chintalapati S P 1989 Fish offal-peat compost extracts as fermentation substrate Biological wastes 27 281-8 38 Martone et al (2005) Martone CB Peacuterez Borla O et Saacuten chez J J 2005 Fishery by-product as a nutrient source for bacteria and aracha growth media Bioresource Technol 96 383-87 39 Merritt JH 1982 Assessment of the production costs of fish protein hydrolysates Anim Feed Sci Technol 1 147-51
78
40 Ndoye F Moiumlty-maiumlzi P et Broutin c 2002 Le poisson fumeacute sur la petite cocircte Senegalaise 41Oslashrskov ER Soliman H S et Clark C F S 1982 Use of fish protein hydrolysate in milk replacers Anim Feed Sci Tech 7 135 42 Ouellet DR Seoane J R Veira D M et Proulx J G 1997 Effects of supplementation with fish meal or fish protein hydrolysate on growth nutrient digestibility and rumen fermentation of growing cattle fed grass silage Anim Feed Sci Tech 68 307-26 43 Picot L Bordenave S Didelot S Fruitier-Arnaudin I Sannier F Thorkelsson G Bergeacute J P Gueacuterard F Chabeaud A et Piot J M 2006 Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines Process Biochem 41 1217-22 44 Quaglia GB et Orban E 1987 Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysates from sardine (Sardina pilchardus) J Sci Food Agric 38 271-6 45 Rajapakse N Jung W K Mendis E Moon S H et Kim S K 2005 A novel anticoagulant purified from fish protein hydrolysate inhibits factor XIIa and platelet aggregation Life Sciences 76 2607-19 46 Ravallec-Pleacute R 2000 Valorisation dhydrolysats dorigine marine optimisation de la concentration en peptides apparenteacutes aux facteurs de croissance et aux agents seacutecreacutetagogues Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Bretagne Occidentale 47 Ravallec-Pleacute R et Van Wormhoudt A 2003 Secretagogue activities in cod (Gadus morhua) and shrimp (Penaeus aztecus) extracts and alcalase hydrolysates determined in AR4-2J pancreatic tumour cells Comp Biochem Physiol B 134 669-79 48 Rousseau M Batista I Le Gal Y et Fouchereau-Peacuteron M 2001 Purification of a functional competitive antagonist for calcitonin gene related peptide action from sardine hydrolysate EJB 4 25-32 49 Shahidi F Han X et Synowiecki J 1995 Production and characteristics of protein hydrolystaes from capelin (Mallotus villosus) Food Chem 53 285-93
79
80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
pour le surnageant Quant agrave celui des leacutegumes frais tubercules fruits et graines
de ceacutereacuteales le taux de proteacuteines du culot et du surnageant est largement
supeacuterieur
Les travaux de DUMAY J (2006) ont reacuteveacuteleacute des teneurs relativement eacuteleveacutees
lors de lrsquoeacutetude des diffeacuterentes fractions issues drsquoun proceacutedeacute de fabrication de
surimis (proteacuteines musculaires de poisson) agrave partir de sardines La teneur en
proteacuteines des diffeacuterentes fractions repreacutesente en moyenne 381 de la matiegravere
segraveche Nous pouvons donc dire que les co-produits des soles sont moins riches
en proteacuteines que les sardines
70
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
72
bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
9 Coacuterdova-Murueta JH et Garciacutea-Carreno FL 2002 Nutritive value of squid and hydrolyzed protein supplement in shrimp feed Aquaculture 210 371-84
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10 Cuvellier GF 1999 Enzymologie et biocatalyse Dans Biotechnologie Paris Tec et Doc Lavoisier Paris 319-42 11 Dumay J 2006 Extraction de lipides en voie aqueuse par bioreacteur enzymatique combineacute agrave lrsquoultracentrifugation application agrave la valorisation de co-produits de poisson (Sardina pilchardus) Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute bioproceacutedeacutes et biotechnologies marines Lieu de soutenance Ecole Polytechnique de lrsquoUniversiteacute de Nantes 12 Dong YL Sheng G Y Fu J M et Wen K W 2005 Chemical characterization and antianaemia activity of fish protein hydrolysate from Saurida elongata J Sci Food Agric 85 2033-39 13 FAO 1998 The state of world fisheries and aquaculture Rome Italy 14 Fitzgerald AJ Rai P S Marchbank T Taylor G W Ghosh S Ritz B W et Playford R J 2005 Reparative properties of a commercial fish protein hydrolysate preparation Gut 54775-81 15 Gauthier D 2006 Introduction aux techniques utiliseacutees en biochimie le dosage des proteacuteines lten lignegt [accegraves internet] wwwchimiebiochimieumonctoncabchdgsiitubprodosage 16 Gildberg A 1993 Enzymic processing of marine raw materials Process Biochem 28 1-15 17 Gildberg A Brgwald J Johansen A et Stenberg E 1996 Isolation of acid peptide fractions from a fish protein hydrolysate with strong stimulatory effect on atlantic salmon (Salmo salar) head kidney leucocytes Comp Biochem Physiol 114 B 97-101 18 Gildberg A Arnesen J A et Carlehoumlg M 2002 Utilisation of cod backbone by biochemical fractionation Process Biochem 38 475-80
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19 Gueacuterard F Dufosseacute L De La Broise D et Binet A 2001 Enzymatic hydrolysis of protein from yellowfin tuna (Thunnus albacares) wastes using alcalase J Mol Catalysis B Enzymatic 11 1051-9 20 Gueacuterard F Batista I Pires C Thorkelson G et Le Gal Y 2004 Repport on sources and selection criteria for raw material Rapport eacutetabli pour le programme SEAFOODplus- 57 21 Gornall Bardawill et David 1949 J Biol Chem 177 751 [Mise au point dune meacutethode quantitative pour doser les proteacuteines avec le biuret] 22 Hoyle NT et Merrit J H 1994 Quality of fish protein hydrolysates from herring (Clupea harengus) J Food Sci 59 76-9 23 Direction des Pecircches Maritimes (DPM) Centre de Recherche Oceacuteanographiques de Dakar-Thiaroye(CRODT) Rapport final Etude de lrsquoeacutevaluation et de la gestion des ressources halieutiques en Reacutepublique de Seacuteneacutegal Dakar direction des pecircches maritimes 24 Institut Franccedilais pour la Nutrition 1997 Les proteacuteines ndash Tome 2 Caracteacuteristiques des diffeacuterentes sources de proteacuteines alimentaires Paris IFN- Dossier speacutecifique Ndeg9 bis 25 Jones DA 1995 Frippak ndash the facts A response to the article by PR Muir and DC Sutton J Word Aquacult Soc 26(2)220-222 26 Jun SY Park P J Jung W K et Kim S K 2004 Purification and characterization of an antioxydative peptide from enzymatic hydrolysate of yellowfin sole (Limanda aspera) frame protein Eur Food Res Technol 219 pp 20-6 27 Kim SK et Mendis E 2006 Bioactive compounds from marine processing by-products - A review Food Res Int 39383-93 28 Kristinsson HG et Rasco B A 2000 Fish protein hydrolysates Production biochemical and functional properties Critical Reviews in Food Sci and Nutr 40 43-81
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29 Lalasidis G Bostroumlm S et Sjoumlberg L B 1978 Low molecular weight enzymatic fish protein hydrolysates chemical composition and nutritive values J Agric Food Cehm 28 751-6 30 Liaset B Julsham K et Espe M 2003 Chemical composition and theoretical nutritional evaluation of the produced fractions from enzymic hydrolysis of salmon frames with Protamex Process Biochem 38 1747-59 32 Liaset B Lied E et Espe M 2000 Enzymatic hydrolysis of by-products from the fishfilleting industry chemical characterization and nutritional evaluation J Sci Food Agric 80 881 33 Larbier M et Leclercq B 1992 Les matiegraveres premiegraveres utiliseacutees en aviculture (225 ndash 301) in nutrition et alimentation des volailles Paris INRA 34 Lowry O H Rosebrough NJ Farr AL et Randall R J 1951 Protein measurement with Folin phenol reagent J Biol Chem 193 256 ndash 275 35 Lynch et coll (1998) Lynch JM Barbano DMet Fleming JR ndash Indirect and direct determination of the casein content of milk by Kjeldhal nitrogen analysis collaborative study J AOAC Int 36 Mackie IM 1982 General review of fish protein hydrolysates Animal Feed Sci And Technol 7 113-24 37 Martin AM et Chintalapati S P 1989 Fish offal-peat compost extracts as fermentation substrate Biological wastes 27 281-8 38 Martone et al (2005) Martone CB Peacuterez Borla O et Saacuten chez J J 2005 Fishery by-product as a nutrient source for bacteria and aracha growth media Bioresource Technol 96 383-87 39 Merritt JH 1982 Assessment of the production costs of fish protein hydrolysates Anim Feed Sci Technol 1 147-51
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40 Ndoye F Moiumlty-maiumlzi P et Broutin c 2002 Le poisson fumeacute sur la petite cocircte Senegalaise 41Oslashrskov ER Soliman H S et Clark C F S 1982 Use of fish protein hydrolysate in milk replacers Anim Feed Sci Tech 7 135 42 Ouellet DR Seoane J R Veira D M et Proulx J G 1997 Effects of supplementation with fish meal or fish protein hydrolysate on growth nutrient digestibility and rumen fermentation of growing cattle fed grass silage Anim Feed Sci Tech 68 307-26 43 Picot L Bordenave S Didelot S Fruitier-Arnaudin I Sannier F Thorkelsson G Bergeacute J P Gueacuterard F Chabeaud A et Piot J M 2006 Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines Process Biochem 41 1217-22 44 Quaglia GB et Orban E 1987 Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysates from sardine (Sardina pilchardus) J Sci Food Agric 38 271-6 45 Rajapakse N Jung W K Mendis E Moon S H et Kim S K 2005 A novel anticoagulant purified from fish protein hydrolysate inhibits factor XIIa and platelet aggregation Life Sciences 76 2607-19 46 Ravallec-Pleacute R 2000 Valorisation dhydrolysats dorigine marine optimisation de la concentration en peptides apparenteacutes aux facteurs de croissance et aux agents seacutecreacutetagogues Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Bretagne Occidentale 47 Ravallec-Pleacute R et Van Wormhoudt A 2003 Secretagogue activities in cod (Gadus morhua) and shrimp (Penaeus aztecus) extracts and alcalase hydrolysates determined in AR4-2J pancreatic tumour cells Comp Biochem Physiol B 134 669-79 48 Rousseau M Batista I Le Gal Y et Fouchereau-Peacuteron M 2001 Purification of a functional competitive antagonist for calcitonin gene related peptide action from sardine hydrolysate EJB 4 25-32 49 Shahidi F Han X et Synowiecki J 1995 Production and characteristics of protein hydrolystaes from capelin (Mallotus villosus) Food Chem 53 285-93
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50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
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RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
32 Recommandations
La valorisation des co-produits de la sole tropicale par hydrolyse enzymatique
est une technique qui devrait ecirctre exploiteacutee et encourageacutee par plusieurs secteurs
A lrsquoEtat
LrsquoEtat doit initier et encourager cette deacutemarche car elle permet de reacuteduire les
pertes post captures et les deacutechets geacuteneacutereacutes par les industries Car Le potentiel de
la combinaison des traitements enzymatiques des co-produits de la sole tropicale
a eacuteteacute deacutemontreacute et ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de
ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de
deacuteveloppement durable et de gestion des bio-ressources
Aux industriels
Il faut inciter les industriels agrave se porter vers ce domaine car crsquoest une source de
deacuteboucheacutes rentables tels que la production de sauce de poissons drsquoaromes de
proteacuteines musculaires
Drsquoun point de vue eacuteconomique il est important de noter que le prix de vente du
Protamex se situe aux alentours de 20000frcs CFAkg Et avec un kg de
Protamex on hydrolyse environ une tonne (T) de co-produits Il serait donc
inteacuteressant de montrer aux industriels que lrsquohydrolyse enzymatique est une
source rentable
Aux chercheurs
Pour des travaux de recherches des analyses plus approfondies peuvent ecirctre
envisageacutees dans le cadre drsquoun travail ulteacuterieur
bull identifications des peptides preacutesentes dans les matrices car notre travail ne
srsquoest limiteacute qursquoau dosage des proteacuteines sans savoir exactement lesquels
sont preacutesents et dans quelles proportions pour chacune drsquoelle
bull hydrolyses des autres co-produits peau arecirctes et deacutechets reacutesiduels
71
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bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
9 Coacuterdova-Murueta JH et Garciacutea-Carreno FL 2002 Nutritive value of squid and hydrolyzed protein supplement in shrimp feed Aquaculture 210 371-84
75
10 Cuvellier GF 1999 Enzymologie et biocatalyse Dans Biotechnologie Paris Tec et Doc Lavoisier Paris 319-42 11 Dumay J 2006 Extraction de lipides en voie aqueuse par bioreacteur enzymatique combineacute agrave lrsquoultracentrifugation application agrave la valorisation de co-produits de poisson (Sardina pilchardus) Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute bioproceacutedeacutes et biotechnologies marines Lieu de soutenance Ecole Polytechnique de lrsquoUniversiteacute de Nantes 12 Dong YL Sheng G Y Fu J M et Wen K W 2005 Chemical characterization and antianaemia activity of fish protein hydrolysate from Saurida elongata J Sci Food Agric 85 2033-39 13 FAO 1998 The state of world fisheries and aquaculture Rome Italy 14 Fitzgerald AJ Rai P S Marchbank T Taylor G W Ghosh S Ritz B W et Playford R J 2005 Reparative properties of a commercial fish protein hydrolysate preparation Gut 54775-81 15 Gauthier D 2006 Introduction aux techniques utiliseacutees en biochimie le dosage des proteacuteines lten lignegt [accegraves internet] wwwchimiebiochimieumonctoncabchdgsiitubprodosage 16 Gildberg A 1993 Enzymic processing of marine raw materials Process Biochem 28 1-15 17 Gildberg A Brgwald J Johansen A et Stenberg E 1996 Isolation of acid peptide fractions from a fish protein hydrolysate with strong stimulatory effect on atlantic salmon (Salmo salar) head kidney leucocytes Comp Biochem Physiol 114 B 97-101 18 Gildberg A Arnesen J A et Carlehoumlg M 2002 Utilisation of cod backbone by biochemical fractionation Process Biochem 38 475-80
76
19 Gueacuterard F Dufosseacute L De La Broise D et Binet A 2001 Enzymatic hydrolysis of protein from yellowfin tuna (Thunnus albacares) wastes using alcalase J Mol Catalysis B Enzymatic 11 1051-9 20 Gueacuterard F Batista I Pires C Thorkelson G et Le Gal Y 2004 Repport on sources and selection criteria for raw material Rapport eacutetabli pour le programme SEAFOODplus- 57 21 Gornall Bardawill et David 1949 J Biol Chem 177 751 [Mise au point dune meacutethode quantitative pour doser les proteacuteines avec le biuret] 22 Hoyle NT et Merrit J H 1994 Quality of fish protein hydrolysates from herring (Clupea harengus) J Food Sci 59 76-9 23 Direction des Pecircches Maritimes (DPM) Centre de Recherche Oceacuteanographiques de Dakar-Thiaroye(CRODT) Rapport final Etude de lrsquoeacutevaluation et de la gestion des ressources halieutiques en Reacutepublique de Seacuteneacutegal Dakar direction des pecircches maritimes 24 Institut Franccedilais pour la Nutrition 1997 Les proteacuteines ndash Tome 2 Caracteacuteristiques des diffeacuterentes sources de proteacuteines alimentaires Paris IFN- Dossier speacutecifique Ndeg9 bis 25 Jones DA 1995 Frippak ndash the facts A response to the article by PR Muir and DC Sutton J Word Aquacult Soc 26(2)220-222 26 Jun SY Park P J Jung W K et Kim S K 2004 Purification and characterization of an antioxydative peptide from enzymatic hydrolysate of yellowfin sole (Limanda aspera) frame protein Eur Food Res Technol 219 pp 20-6 27 Kim SK et Mendis E 2006 Bioactive compounds from marine processing by-products - A review Food Res Int 39383-93 28 Kristinsson HG et Rasco B A 2000 Fish protein hydrolysates Production biochemical and functional properties Critical Reviews in Food Sci and Nutr 40 43-81
77
29 Lalasidis G Bostroumlm S et Sjoumlberg L B 1978 Low molecular weight enzymatic fish protein hydrolysates chemical composition and nutritive values J Agric Food Cehm 28 751-6 30 Liaset B Julsham K et Espe M 2003 Chemical composition and theoretical nutritional evaluation of the produced fractions from enzymic hydrolysis of salmon frames with Protamex Process Biochem 38 1747-59 32 Liaset B Lied E et Espe M 2000 Enzymatic hydrolysis of by-products from the fishfilleting industry chemical characterization and nutritional evaluation J Sci Food Agric 80 881 33 Larbier M et Leclercq B 1992 Les matiegraveres premiegraveres utiliseacutees en aviculture (225 ndash 301) in nutrition et alimentation des volailles Paris INRA 34 Lowry O H Rosebrough NJ Farr AL et Randall R J 1951 Protein measurement with Folin phenol reagent J Biol Chem 193 256 ndash 275 35 Lynch et coll (1998) Lynch JM Barbano DMet Fleming JR ndash Indirect and direct determination of the casein content of milk by Kjeldhal nitrogen analysis collaborative study J AOAC Int 36 Mackie IM 1982 General review of fish protein hydrolysates Animal Feed Sci And Technol 7 113-24 37 Martin AM et Chintalapati S P 1989 Fish offal-peat compost extracts as fermentation substrate Biological wastes 27 281-8 38 Martone et al (2005) Martone CB Peacuterez Borla O et Saacuten chez J J 2005 Fishery by-product as a nutrient source for bacteria and aracha growth media Bioresource Technol 96 383-87 39 Merritt JH 1982 Assessment of the production costs of fish protein hydrolysates Anim Feed Sci Technol 1 147-51
78
40 Ndoye F Moiumlty-maiumlzi P et Broutin c 2002 Le poisson fumeacute sur la petite cocircte Senegalaise 41Oslashrskov ER Soliman H S et Clark C F S 1982 Use of fish protein hydrolysate in milk replacers Anim Feed Sci Tech 7 135 42 Ouellet DR Seoane J R Veira D M et Proulx J G 1997 Effects of supplementation with fish meal or fish protein hydrolysate on growth nutrient digestibility and rumen fermentation of growing cattle fed grass silage Anim Feed Sci Tech 68 307-26 43 Picot L Bordenave S Didelot S Fruitier-Arnaudin I Sannier F Thorkelsson G Bergeacute J P Gueacuterard F Chabeaud A et Piot J M 2006 Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines Process Biochem 41 1217-22 44 Quaglia GB et Orban E 1987 Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysates from sardine (Sardina pilchardus) J Sci Food Agric 38 271-6 45 Rajapakse N Jung W K Mendis E Moon S H et Kim S K 2005 A novel anticoagulant purified from fish protein hydrolysate inhibits factor XIIa and platelet aggregation Life Sciences 76 2607-19 46 Ravallec-Pleacute R 2000 Valorisation dhydrolysats dorigine marine optimisation de la concentration en peptides apparenteacutes aux facteurs de croissance et aux agents seacutecreacutetagogues Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Bretagne Occidentale 47 Ravallec-Pleacute R et Van Wormhoudt A 2003 Secretagogue activities in cod (Gadus morhua) and shrimp (Penaeus aztecus) extracts and alcalase hydrolysates determined in AR4-2J pancreatic tumour cells Comp Biochem Physiol B 134 669-79 48 Rousseau M Batista I Le Gal Y et Fouchereau-Peacuteron M 2001 Purification of a functional competitive antagonist for calcitonin gene related peptide action from sardine hydrolysate EJB 4 25-32 49 Shahidi F Han X et Synowiecki J 1995 Production and characteristics of protein hydrolystaes from capelin (Mallotus villosus) Food Chem 53 285-93
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80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
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RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
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bull hydrolyses longue dureacutee (24h) pour les tecirctes laissant supposer une
hydrolyse des tissus durs contenus dans les tecirctes (os cartilage arecirctes)
Une eacutetude ulteacuterieure pourrait se focaliser sur lrsquohydrolyse de ces tissus durs
et de leur influence sur les autres composeacutes
bull dosage du calciumphosphore sur les arecirctes issues des hydrolyses Dans le
but drsquoune valorisation
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
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matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
9 Coacuterdova-Murueta JH et Garciacutea-Carreno FL 2002 Nutritive value of squid and hydrolyzed protein supplement in shrimp feed Aquaculture 210 371-84
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10 Cuvellier GF 1999 Enzymologie et biocatalyse Dans Biotechnologie Paris Tec et Doc Lavoisier Paris 319-42 11 Dumay J 2006 Extraction de lipides en voie aqueuse par bioreacteur enzymatique combineacute agrave lrsquoultracentrifugation application agrave la valorisation de co-produits de poisson (Sardina pilchardus) Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute bioproceacutedeacutes et biotechnologies marines Lieu de soutenance Ecole Polytechnique de lrsquoUniversiteacute de Nantes 12 Dong YL Sheng G Y Fu J M et Wen K W 2005 Chemical characterization and antianaemia activity of fish protein hydrolysate from Saurida elongata J Sci Food Agric 85 2033-39 13 FAO 1998 The state of world fisheries and aquaculture Rome Italy 14 Fitzgerald AJ Rai P S Marchbank T Taylor G W Ghosh S Ritz B W et Playford R J 2005 Reparative properties of a commercial fish protein hydrolysate preparation Gut 54775-81 15 Gauthier D 2006 Introduction aux techniques utiliseacutees en biochimie le dosage des proteacuteines lten lignegt [accegraves internet] wwwchimiebiochimieumonctoncabchdgsiitubprodosage 16 Gildberg A 1993 Enzymic processing of marine raw materials Process Biochem 28 1-15 17 Gildberg A Brgwald J Johansen A et Stenberg E 1996 Isolation of acid peptide fractions from a fish protein hydrolysate with strong stimulatory effect on atlantic salmon (Salmo salar) head kidney leucocytes Comp Biochem Physiol 114 B 97-101 18 Gildberg A Arnesen J A et Carlehoumlg M 2002 Utilisation of cod backbone by biochemical fractionation Process Biochem 38 475-80
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19 Gueacuterard F Dufosseacute L De La Broise D et Binet A 2001 Enzymatic hydrolysis of protein from yellowfin tuna (Thunnus albacares) wastes using alcalase J Mol Catalysis B Enzymatic 11 1051-9 20 Gueacuterard F Batista I Pires C Thorkelson G et Le Gal Y 2004 Repport on sources and selection criteria for raw material Rapport eacutetabli pour le programme SEAFOODplus- 57 21 Gornall Bardawill et David 1949 J Biol Chem 177 751 [Mise au point dune meacutethode quantitative pour doser les proteacuteines avec le biuret] 22 Hoyle NT et Merrit J H 1994 Quality of fish protein hydrolysates from herring (Clupea harengus) J Food Sci 59 76-9 23 Direction des Pecircches Maritimes (DPM) Centre de Recherche Oceacuteanographiques de Dakar-Thiaroye(CRODT) Rapport final Etude de lrsquoeacutevaluation et de la gestion des ressources halieutiques en Reacutepublique de Seacuteneacutegal Dakar direction des pecircches maritimes 24 Institut Franccedilais pour la Nutrition 1997 Les proteacuteines ndash Tome 2 Caracteacuteristiques des diffeacuterentes sources de proteacuteines alimentaires Paris IFN- Dossier speacutecifique Ndeg9 bis 25 Jones DA 1995 Frippak ndash the facts A response to the article by PR Muir and DC Sutton J Word Aquacult Soc 26(2)220-222 26 Jun SY Park P J Jung W K et Kim S K 2004 Purification and characterization of an antioxydative peptide from enzymatic hydrolysate of yellowfin sole (Limanda aspera) frame protein Eur Food Res Technol 219 pp 20-6 27 Kim SK et Mendis E 2006 Bioactive compounds from marine processing by-products - A review Food Res Int 39383-93 28 Kristinsson HG et Rasco B A 2000 Fish protein hydrolysates Production biochemical and functional properties Critical Reviews in Food Sci and Nutr 40 43-81
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29 Lalasidis G Bostroumlm S et Sjoumlberg L B 1978 Low molecular weight enzymatic fish protein hydrolysates chemical composition and nutritive values J Agric Food Cehm 28 751-6 30 Liaset B Julsham K et Espe M 2003 Chemical composition and theoretical nutritional evaluation of the produced fractions from enzymic hydrolysis of salmon frames with Protamex Process Biochem 38 1747-59 32 Liaset B Lied E et Espe M 2000 Enzymatic hydrolysis of by-products from the fishfilleting industry chemical characterization and nutritional evaluation J Sci Food Agric 80 881 33 Larbier M et Leclercq B 1992 Les matiegraveres premiegraveres utiliseacutees en aviculture (225 ndash 301) in nutrition et alimentation des volailles Paris INRA 34 Lowry O H Rosebrough NJ Farr AL et Randall R J 1951 Protein measurement with Folin phenol reagent J Biol Chem 193 256 ndash 275 35 Lynch et coll (1998) Lynch JM Barbano DMet Fleming JR ndash Indirect and direct determination of the casein content of milk by Kjeldhal nitrogen analysis collaborative study J AOAC Int 36 Mackie IM 1982 General review of fish protein hydrolysates Animal Feed Sci And Technol 7 113-24 37 Martin AM et Chintalapati S P 1989 Fish offal-peat compost extracts as fermentation substrate Biological wastes 27 281-8 38 Martone et al (2005) Martone CB Peacuterez Borla O et Saacuten chez J J 2005 Fishery by-product as a nutrient source for bacteria and aracha growth media Bioresource Technol 96 383-87 39 Merritt JH 1982 Assessment of the production costs of fish protein hydrolysates Anim Feed Sci Technol 1 147-51
78
40 Ndoye F Moiumlty-maiumlzi P et Broutin c 2002 Le poisson fumeacute sur la petite cocircte Senegalaise 41Oslashrskov ER Soliman H S et Clark C F S 1982 Use of fish protein hydrolysate in milk replacers Anim Feed Sci Tech 7 135 42 Ouellet DR Seoane J R Veira D M et Proulx J G 1997 Effects of supplementation with fish meal or fish protein hydrolysate on growth nutrient digestibility and rumen fermentation of growing cattle fed grass silage Anim Feed Sci Tech 68 307-26 43 Picot L Bordenave S Didelot S Fruitier-Arnaudin I Sannier F Thorkelsson G Bergeacute J P Gueacuterard F Chabeaud A et Piot J M 2006 Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines Process Biochem 41 1217-22 44 Quaglia GB et Orban E 1987 Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysates from sardine (Sardina pilchardus) J Sci Food Agric 38 271-6 45 Rajapakse N Jung W K Mendis E Moon S H et Kim S K 2005 A novel anticoagulant purified from fish protein hydrolysate inhibits factor XIIa and platelet aggregation Life Sciences 76 2607-19 46 Ravallec-Pleacute R 2000 Valorisation dhydrolysats dorigine marine optimisation de la concentration en peptides apparenteacutes aux facteurs de croissance et aux agents seacutecreacutetagogues Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Bretagne Occidentale 47 Ravallec-Pleacute R et Van Wormhoudt A 2003 Secretagogue activities in cod (Gadus morhua) and shrimp (Penaeus aztecus) extracts and alcalase hydrolysates determined in AR4-2J pancreatic tumour cells Comp Biochem Physiol B 134 669-79 48 Rousseau M Batista I Le Gal Y et Fouchereau-Peacuteron M 2001 Purification of a functional competitive antagonist for calcitonin gene related peptide action from sardine hydrolysate EJB 4 25-32 49 Shahidi F Han X et Synowiecki J 1995 Production and characteristics of protein hydrolystaes from capelin (Mallotus villosus) Food Chem 53 285-93
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80
50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
CONCLUSION GENERALE
Les eaux Seacuteneacutegalaises sont classeacutees parmi les plus poissonneuses drsquoAfrique de
lrsquoouest Ainsi la pecircche est une composante essentielle du deacuteveloppement
eacuteconomique et sociale du Seacuteneacutegal Elle contribue de maniegravere non neacutegligeable
aux objectifs de croissance de lrsquoeacuteconomie nationale notamment agrave la reacuteduction
du chocircmage (600000 emplois directs et indirects)
Au Seacuteneacutegal les produits de la pecircche sont la principale source de proteacuteines
couvrant ainsi 75 des besoins La consommation de produits halieutiques y est
tregraves priseacutee puisque ces derniers entrent dans la composition de nombreux plats et
particuliegraverement dans celle du plat national le ldquoceebu jenldquo (riz au poisson)
Ainsi pour une nation dont lrsquoeacuteconomie et la nutrition de la population sont
essentiellement baseacutees sur la pecircche il est important de trouver des voies et
moyens pour contribuer au deacuteveloppement de ce secteur
Lrsquoobjectif de ce travail est lrsquoeacutetude de proceacutedeacutes originaux de reacutecupeacuteration des
fractions peptidiques de biomasses marines habituellement non exploiteacutees (co-
produits) par techniques douces (hydrolyse enzymatique) visant agrave une
consommation eacutenergeacutetique et un investissement modeacutereacutes
Pour reacutealiser ce travail nous avons utiliseacute comme matiegravere premiegravere les co-
produits de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) provenant de lrsquousine lsquola
pirogue bleuersquo
Ainsi les tecirctes et les viscegraveres de sole ont eacuteteacute seacutelectionneacutes pour ecirctre eacutetudieacutes
De cette eacutetude il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave
567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui
a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere
initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9
de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de
73
74
matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
9 Coacuterdova-Murueta JH et Garciacutea-Carreno FL 2002 Nutritive value of squid and hydrolyzed protein supplement in shrimp feed Aquaculture 210 371-84
75
10 Cuvellier GF 1999 Enzymologie et biocatalyse Dans Biotechnologie Paris Tec et Doc Lavoisier Paris 319-42 11 Dumay J 2006 Extraction de lipides en voie aqueuse par bioreacteur enzymatique combineacute agrave lrsquoultracentrifugation application agrave la valorisation de co-produits de poisson (Sardina pilchardus) Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute bioproceacutedeacutes et biotechnologies marines Lieu de soutenance Ecole Polytechnique de lrsquoUniversiteacute de Nantes 12 Dong YL Sheng G Y Fu J M et Wen K W 2005 Chemical characterization and antianaemia activity of fish protein hydrolysate from Saurida elongata J Sci Food Agric 85 2033-39 13 FAO 1998 The state of world fisheries and aquaculture Rome Italy 14 Fitzgerald AJ Rai P S Marchbank T Taylor G W Ghosh S Ritz B W et Playford R J 2005 Reparative properties of a commercial fish protein hydrolysate preparation Gut 54775-81 15 Gauthier D 2006 Introduction aux techniques utiliseacutees en biochimie le dosage des proteacuteines lten lignegt [accegraves internet] wwwchimiebiochimieumonctoncabchdgsiitubprodosage 16 Gildberg A 1993 Enzymic processing of marine raw materials Process Biochem 28 1-15 17 Gildberg A Brgwald J Johansen A et Stenberg E 1996 Isolation of acid peptide fractions from a fish protein hydrolysate with strong stimulatory effect on atlantic salmon (Salmo salar) head kidney leucocytes Comp Biochem Physiol 114 B 97-101 18 Gildberg A Arnesen J A et Carlehoumlg M 2002 Utilisation of cod backbone by biochemical fractionation Process Biochem 38 475-80
76
19 Gueacuterard F Dufosseacute L De La Broise D et Binet A 2001 Enzymatic hydrolysis of protein from yellowfin tuna (Thunnus albacares) wastes using alcalase J Mol Catalysis B Enzymatic 11 1051-9 20 Gueacuterard F Batista I Pires C Thorkelson G et Le Gal Y 2004 Repport on sources and selection criteria for raw material Rapport eacutetabli pour le programme SEAFOODplus- 57 21 Gornall Bardawill et David 1949 J Biol Chem 177 751 [Mise au point dune meacutethode quantitative pour doser les proteacuteines avec le biuret] 22 Hoyle NT et Merrit J H 1994 Quality of fish protein hydrolysates from herring (Clupea harengus) J Food Sci 59 76-9 23 Direction des Pecircches Maritimes (DPM) Centre de Recherche Oceacuteanographiques de Dakar-Thiaroye(CRODT) Rapport final Etude de lrsquoeacutevaluation et de la gestion des ressources halieutiques en Reacutepublique de Seacuteneacutegal Dakar direction des pecircches maritimes 24 Institut Franccedilais pour la Nutrition 1997 Les proteacuteines ndash Tome 2 Caracteacuteristiques des diffeacuterentes sources de proteacuteines alimentaires Paris IFN- Dossier speacutecifique Ndeg9 bis 25 Jones DA 1995 Frippak ndash the facts A response to the article by PR Muir and DC Sutton J Word Aquacult Soc 26(2)220-222 26 Jun SY Park P J Jung W K et Kim S K 2004 Purification and characterization of an antioxydative peptide from enzymatic hydrolysate of yellowfin sole (Limanda aspera) frame protein Eur Food Res Technol 219 pp 20-6 27 Kim SK et Mendis E 2006 Bioactive compounds from marine processing by-products - A review Food Res Int 39383-93 28 Kristinsson HG et Rasco B A 2000 Fish protein hydrolysates Production biochemical and functional properties Critical Reviews in Food Sci and Nutr 40 43-81
77
29 Lalasidis G Bostroumlm S et Sjoumlberg L B 1978 Low molecular weight enzymatic fish protein hydrolysates chemical composition and nutritive values J Agric Food Cehm 28 751-6 30 Liaset B Julsham K et Espe M 2003 Chemical composition and theoretical nutritional evaluation of the produced fractions from enzymic hydrolysis of salmon frames with Protamex Process Biochem 38 1747-59 32 Liaset B Lied E et Espe M 2000 Enzymatic hydrolysis of by-products from the fishfilleting industry chemical characterization and nutritional evaluation J Sci Food Agric 80 881 33 Larbier M et Leclercq B 1992 Les matiegraveres premiegraveres utiliseacutees en aviculture (225 ndash 301) in nutrition et alimentation des volailles Paris INRA 34 Lowry O H Rosebrough NJ Farr AL et Randall R J 1951 Protein measurement with Folin phenol reagent J Biol Chem 193 256 ndash 275 35 Lynch et coll (1998) Lynch JM Barbano DMet Fleming JR ndash Indirect and direct determination of the casein content of milk by Kjeldhal nitrogen analysis collaborative study J AOAC Int 36 Mackie IM 1982 General review of fish protein hydrolysates Animal Feed Sci And Technol 7 113-24 37 Martin AM et Chintalapati S P 1989 Fish offal-peat compost extracts as fermentation substrate Biological wastes 27 281-8 38 Martone et al (2005) Martone CB Peacuterez Borla O et Saacuten chez J J 2005 Fishery by-product as a nutrient source for bacteria and aracha growth media Bioresource Technol 96 383-87 39 Merritt JH 1982 Assessment of the production costs of fish protein hydrolysates Anim Feed Sci Technol 1 147-51
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40 Ndoye F Moiumlty-maiumlzi P et Broutin c 2002 Le poisson fumeacute sur la petite cocircte Senegalaise 41Oslashrskov ER Soliman H S et Clark C F S 1982 Use of fish protein hydrolysate in milk replacers Anim Feed Sci Tech 7 135 42 Ouellet DR Seoane J R Veira D M et Proulx J G 1997 Effects of supplementation with fish meal or fish protein hydrolysate on growth nutrient digestibility and rumen fermentation of growing cattle fed grass silage Anim Feed Sci Tech 68 307-26 43 Picot L Bordenave S Didelot S Fruitier-Arnaudin I Sannier F Thorkelsson G Bergeacute J P Gueacuterard F Chabeaud A et Piot J M 2006 Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines Process Biochem 41 1217-22 44 Quaglia GB et Orban E 1987 Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysates from sardine (Sardina pilchardus) J Sci Food Agric 38 271-6 45 Rajapakse N Jung W K Mendis E Moon S H et Kim S K 2005 A novel anticoagulant purified from fish protein hydrolysate inhibits factor XIIa and platelet aggregation Life Sciences 76 2607-19 46 Ravallec-Pleacute R 2000 Valorisation dhydrolysats dorigine marine optimisation de la concentration en peptides apparenteacutes aux facteurs de croissance et aux agents seacutecreacutetagogues Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Bretagne Occidentale 47 Ravallec-Pleacute R et Van Wormhoudt A 2003 Secretagogue activities in cod (Gadus morhua) and shrimp (Penaeus aztecus) extracts and alcalase hydrolysates determined in AR4-2J pancreatic tumour cells Comp Biochem Physiol B 134 669-79 48 Rousseau M Batista I Le Gal Y et Fouchereau-Peacuteron M 2001 Purification of a functional competitive antagonist for calcitonin gene related peptide action from sardine hydrolysate EJB 4 25-32 49 Shahidi F Han X et Synowiecki J 1995 Production and characteristics of protein hydrolystaes from capelin (Mallotus villosus) Food Chem 53 285-93
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50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
81
82
RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
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matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497
pour le culot et 2765 pour le surnageant
Ces reacutesultats montrent que le culot et le surnageant contiennent une quantiteacute
suffisante de proteacuteines pouvant ecirctre valoriseacutes aussi bien dans lrsquoalimentation
humaine qursquoanimale
La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des
proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse
enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre
ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces
srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion
des bio-ressources
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
9 Coacuterdova-Murueta JH et Garciacutea-Carreno FL 2002 Nutritive value of squid and hydrolyzed protein supplement in shrimp feed Aquaculture 210 371-84
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10 Cuvellier GF 1999 Enzymologie et biocatalyse Dans Biotechnologie Paris Tec et Doc Lavoisier Paris 319-42 11 Dumay J 2006 Extraction de lipides en voie aqueuse par bioreacteur enzymatique combineacute agrave lrsquoultracentrifugation application agrave la valorisation de co-produits de poisson (Sardina pilchardus) Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute bioproceacutedeacutes et biotechnologies marines Lieu de soutenance Ecole Polytechnique de lrsquoUniversiteacute de Nantes 12 Dong YL Sheng G Y Fu J M et Wen K W 2005 Chemical characterization and antianaemia activity of fish protein hydrolysate from Saurida elongata J Sci Food Agric 85 2033-39 13 FAO 1998 The state of world fisheries and aquaculture Rome Italy 14 Fitzgerald AJ Rai P S Marchbank T Taylor G W Ghosh S Ritz B W et Playford R J 2005 Reparative properties of a commercial fish protein hydrolysate preparation Gut 54775-81 15 Gauthier D 2006 Introduction aux techniques utiliseacutees en biochimie le dosage des proteacuteines lten lignegt [accegraves internet] wwwchimiebiochimieumonctoncabchdgsiitubprodosage 16 Gildberg A 1993 Enzymic processing of marine raw materials Process Biochem 28 1-15 17 Gildberg A Brgwald J Johansen A et Stenberg E 1996 Isolation of acid peptide fractions from a fish protein hydrolysate with strong stimulatory effect on atlantic salmon (Salmo salar) head kidney leucocytes Comp Biochem Physiol 114 B 97-101 18 Gildberg A Arnesen J A et Carlehoumlg M 2002 Utilisation of cod backbone by biochemical fractionation Process Biochem 38 475-80
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19 Gueacuterard F Dufosseacute L De La Broise D et Binet A 2001 Enzymatic hydrolysis of protein from yellowfin tuna (Thunnus albacares) wastes using alcalase J Mol Catalysis B Enzymatic 11 1051-9 20 Gueacuterard F Batista I Pires C Thorkelson G et Le Gal Y 2004 Repport on sources and selection criteria for raw material Rapport eacutetabli pour le programme SEAFOODplus- 57 21 Gornall Bardawill et David 1949 J Biol Chem 177 751 [Mise au point dune meacutethode quantitative pour doser les proteacuteines avec le biuret] 22 Hoyle NT et Merrit J H 1994 Quality of fish protein hydrolysates from herring (Clupea harengus) J Food Sci 59 76-9 23 Direction des Pecircches Maritimes (DPM) Centre de Recherche Oceacuteanographiques de Dakar-Thiaroye(CRODT) Rapport final Etude de lrsquoeacutevaluation et de la gestion des ressources halieutiques en Reacutepublique de Seacuteneacutegal Dakar direction des pecircches maritimes 24 Institut Franccedilais pour la Nutrition 1997 Les proteacuteines ndash Tome 2 Caracteacuteristiques des diffeacuterentes sources de proteacuteines alimentaires Paris IFN- Dossier speacutecifique Ndeg9 bis 25 Jones DA 1995 Frippak ndash the facts A response to the article by PR Muir and DC Sutton J Word Aquacult Soc 26(2)220-222 26 Jun SY Park P J Jung W K et Kim S K 2004 Purification and characterization of an antioxydative peptide from enzymatic hydrolysate of yellowfin sole (Limanda aspera) frame protein Eur Food Res Technol 219 pp 20-6 27 Kim SK et Mendis E 2006 Bioactive compounds from marine processing by-products - A review Food Res Int 39383-93 28 Kristinsson HG et Rasco B A 2000 Fish protein hydrolysates Production biochemical and functional properties Critical Reviews in Food Sci and Nutr 40 43-81
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29 Lalasidis G Bostroumlm S et Sjoumlberg L B 1978 Low molecular weight enzymatic fish protein hydrolysates chemical composition and nutritive values J Agric Food Cehm 28 751-6 30 Liaset B Julsham K et Espe M 2003 Chemical composition and theoretical nutritional evaluation of the produced fractions from enzymic hydrolysis of salmon frames with Protamex Process Biochem 38 1747-59 32 Liaset B Lied E et Espe M 2000 Enzymatic hydrolysis of by-products from the fishfilleting industry chemical characterization and nutritional evaluation J Sci Food Agric 80 881 33 Larbier M et Leclercq B 1992 Les matiegraveres premiegraveres utiliseacutees en aviculture (225 ndash 301) in nutrition et alimentation des volailles Paris INRA 34 Lowry O H Rosebrough NJ Farr AL et Randall R J 1951 Protein measurement with Folin phenol reagent J Biol Chem 193 256 ndash 275 35 Lynch et coll (1998) Lynch JM Barbano DMet Fleming JR ndash Indirect and direct determination of the casein content of milk by Kjeldhal nitrogen analysis collaborative study J AOAC Int 36 Mackie IM 1982 General review of fish protein hydrolysates Animal Feed Sci And Technol 7 113-24 37 Martin AM et Chintalapati S P 1989 Fish offal-peat compost extracts as fermentation substrate Biological wastes 27 281-8 38 Martone et al (2005) Martone CB Peacuterez Borla O et Saacuten chez J J 2005 Fishery by-product as a nutrient source for bacteria and aracha growth media Bioresource Technol 96 383-87 39 Merritt JH 1982 Assessment of the production costs of fish protein hydrolysates Anim Feed Sci Technol 1 147-51
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40 Ndoye F Moiumlty-maiumlzi P et Broutin c 2002 Le poisson fumeacute sur la petite cocircte Senegalaise 41Oslashrskov ER Soliman H S et Clark C F S 1982 Use of fish protein hydrolysate in milk replacers Anim Feed Sci Tech 7 135 42 Ouellet DR Seoane J R Veira D M et Proulx J G 1997 Effects of supplementation with fish meal or fish protein hydrolysate on growth nutrient digestibility and rumen fermentation of growing cattle fed grass silage Anim Feed Sci Tech 68 307-26 43 Picot L Bordenave S Didelot S Fruitier-Arnaudin I Sannier F Thorkelsson G Bergeacute J P Gueacuterard F Chabeaud A et Piot J M 2006 Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines Process Biochem 41 1217-22 44 Quaglia GB et Orban E 1987 Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysates from sardine (Sardina pilchardus) J Sci Food Agric 38 271-6 45 Rajapakse N Jung W K Mendis E Moon S H et Kim S K 2005 A novel anticoagulant purified from fish protein hydrolysate inhibits factor XIIa and platelet aggregation Life Sciences 76 2607-19 46 Ravallec-Pleacute R 2000 Valorisation dhydrolysats dorigine marine optimisation de la concentration en peptides apparenteacutes aux facteurs de croissance et aux agents seacutecreacutetagogues Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Bretagne Occidentale 47 Ravallec-Pleacute R et Van Wormhoudt A 2003 Secretagogue activities in cod (Gadus morhua) and shrimp (Penaeus aztecus) extracts and alcalase hydrolysates determined in AR4-2J pancreatic tumour cells Comp Biochem Physiol B 134 669-79 48 Rousseau M Batista I Le Gal Y et Fouchereau-Peacuteron M 2001 Purification of a functional competitive antagonist for calcitonin gene related peptide action from sardine hydrolysate EJB 4 25-32 49 Shahidi F Han X et Synowiecki J 1995 Production and characteristics of protein hydrolystaes from capelin (Mallotus villosus) Food Chem 53 285-93
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50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
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RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
Reacutefeacuterences bibliographiques 1 Abdul-Hamid A Bakar J Bee et GH 2002 Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from black tilapia (Oreochromis mossambicus) Food Chem 78 69-74 2 Adler-Nissen J 1986 Enzymic hydrolysis of food proteins New York Elsevier Applied Science Publishers 110-69 3 Anderson JS Lall S P Anderson DM et McNiven MA 1993 Evalution of protein quality in fish meals by chemival and biological assays Aquaculture 115 305 ndash 325 4 Andrieux 2004 La filiegravere franccedilaise des co-produits de la pecircche et de laquaculture eacutetat des lieux et analyse Etudes de lOfimer 63 5 Aspmo SI Horn S J et Eijsink V G H - Hydrolysates from Atlantic cod (Gadusmorhua L) 2005 viscera as a component of microbial growth media Process Biochem 40 3714-22 6 Aubertin Severine 2004 Valorisation des proteacuteines de Merlan Bleu sous forme de poudre Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute UFR Sciences et Sciences de lrsquoingeacutenieur Lieu de soutenance Universiteacute de Bretagne - Sud 7 Bradford M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72248-54 [deacuteveloppement initial de la meacutethode au bleu de Coomassie] 8 Ching LH 1999 Les nouvelles de lrsquoIFREMER valorisation des co-produits Juin 99 Ndeg5 lten lignegt - [accegraves internet] wwwifremerfrbibliomer documentso 2005
9 Coacuterdova-Murueta JH et Garciacutea-Carreno FL 2002 Nutritive value of squid and hydrolyzed protein supplement in shrimp feed Aquaculture 210 371-84
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10 Cuvellier GF 1999 Enzymologie et biocatalyse Dans Biotechnologie Paris Tec et Doc Lavoisier Paris 319-42 11 Dumay J 2006 Extraction de lipides en voie aqueuse par bioreacteur enzymatique combineacute agrave lrsquoultracentrifugation application agrave la valorisation de co-produits de poisson (Sardina pilchardus) Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute bioproceacutedeacutes et biotechnologies marines Lieu de soutenance Ecole Polytechnique de lrsquoUniversiteacute de Nantes 12 Dong YL Sheng G Y Fu J M et Wen K W 2005 Chemical characterization and antianaemia activity of fish protein hydrolysate from Saurida elongata J Sci Food Agric 85 2033-39 13 FAO 1998 The state of world fisheries and aquaculture Rome Italy 14 Fitzgerald AJ Rai P S Marchbank T Taylor G W Ghosh S Ritz B W et Playford R J 2005 Reparative properties of a commercial fish protein hydrolysate preparation Gut 54775-81 15 Gauthier D 2006 Introduction aux techniques utiliseacutees en biochimie le dosage des proteacuteines lten lignegt [accegraves internet] wwwchimiebiochimieumonctoncabchdgsiitubprodosage 16 Gildberg A 1993 Enzymic processing of marine raw materials Process Biochem 28 1-15 17 Gildberg A Brgwald J Johansen A et Stenberg E 1996 Isolation of acid peptide fractions from a fish protein hydrolysate with strong stimulatory effect on atlantic salmon (Salmo salar) head kidney leucocytes Comp Biochem Physiol 114 B 97-101 18 Gildberg A Arnesen J A et Carlehoumlg M 2002 Utilisation of cod backbone by biochemical fractionation Process Biochem 38 475-80
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19 Gueacuterard F Dufosseacute L De La Broise D et Binet A 2001 Enzymatic hydrolysis of protein from yellowfin tuna (Thunnus albacares) wastes using alcalase J Mol Catalysis B Enzymatic 11 1051-9 20 Gueacuterard F Batista I Pires C Thorkelson G et Le Gal Y 2004 Repport on sources and selection criteria for raw material Rapport eacutetabli pour le programme SEAFOODplus- 57 21 Gornall Bardawill et David 1949 J Biol Chem 177 751 [Mise au point dune meacutethode quantitative pour doser les proteacuteines avec le biuret] 22 Hoyle NT et Merrit J H 1994 Quality of fish protein hydrolysates from herring (Clupea harengus) J Food Sci 59 76-9 23 Direction des Pecircches Maritimes (DPM) Centre de Recherche Oceacuteanographiques de Dakar-Thiaroye(CRODT) Rapport final Etude de lrsquoeacutevaluation et de la gestion des ressources halieutiques en Reacutepublique de Seacuteneacutegal Dakar direction des pecircches maritimes 24 Institut Franccedilais pour la Nutrition 1997 Les proteacuteines ndash Tome 2 Caracteacuteristiques des diffeacuterentes sources de proteacuteines alimentaires Paris IFN- Dossier speacutecifique Ndeg9 bis 25 Jones DA 1995 Frippak ndash the facts A response to the article by PR Muir and DC Sutton J Word Aquacult Soc 26(2)220-222 26 Jun SY Park P J Jung W K et Kim S K 2004 Purification and characterization of an antioxydative peptide from enzymatic hydrolysate of yellowfin sole (Limanda aspera) frame protein Eur Food Res Technol 219 pp 20-6 27 Kim SK et Mendis E 2006 Bioactive compounds from marine processing by-products - A review Food Res Int 39383-93 28 Kristinsson HG et Rasco B A 2000 Fish protein hydrolysates Production biochemical and functional properties Critical Reviews in Food Sci and Nutr 40 43-81
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29 Lalasidis G Bostroumlm S et Sjoumlberg L B 1978 Low molecular weight enzymatic fish protein hydrolysates chemical composition and nutritive values J Agric Food Cehm 28 751-6 30 Liaset B Julsham K et Espe M 2003 Chemical composition and theoretical nutritional evaluation of the produced fractions from enzymic hydrolysis of salmon frames with Protamex Process Biochem 38 1747-59 32 Liaset B Lied E et Espe M 2000 Enzymatic hydrolysis of by-products from the fishfilleting industry chemical characterization and nutritional evaluation J Sci Food Agric 80 881 33 Larbier M et Leclercq B 1992 Les matiegraveres premiegraveres utiliseacutees en aviculture (225 ndash 301) in nutrition et alimentation des volailles Paris INRA 34 Lowry O H Rosebrough NJ Farr AL et Randall R J 1951 Protein measurement with Folin phenol reagent J Biol Chem 193 256 ndash 275 35 Lynch et coll (1998) Lynch JM Barbano DMet Fleming JR ndash Indirect and direct determination of the casein content of milk by Kjeldhal nitrogen analysis collaborative study J AOAC Int 36 Mackie IM 1982 General review of fish protein hydrolysates Animal Feed Sci And Technol 7 113-24 37 Martin AM et Chintalapati S P 1989 Fish offal-peat compost extracts as fermentation substrate Biological wastes 27 281-8 38 Martone et al (2005) Martone CB Peacuterez Borla O et Saacuten chez J J 2005 Fishery by-product as a nutrient source for bacteria and aracha growth media Bioresource Technol 96 383-87 39 Merritt JH 1982 Assessment of the production costs of fish protein hydrolysates Anim Feed Sci Technol 1 147-51
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40 Ndoye F Moiumlty-maiumlzi P et Broutin c 2002 Le poisson fumeacute sur la petite cocircte Senegalaise 41Oslashrskov ER Soliman H S et Clark C F S 1982 Use of fish protein hydrolysate in milk replacers Anim Feed Sci Tech 7 135 42 Ouellet DR Seoane J R Veira D M et Proulx J G 1997 Effects of supplementation with fish meal or fish protein hydrolysate on growth nutrient digestibility and rumen fermentation of growing cattle fed grass silage Anim Feed Sci Tech 68 307-26 43 Picot L Bordenave S Didelot S Fruitier-Arnaudin I Sannier F Thorkelsson G Bergeacute J P Gueacuterard F Chabeaud A et Piot J M 2006 Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines Process Biochem 41 1217-22 44 Quaglia GB et Orban E 1987 Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysates from sardine (Sardina pilchardus) J Sci Food Agric 38 271-6 45 Rajapakse N Jung W K Mendis E Moon S H et Kim S K 2005 A novel anticoagulant purified from fish protein hydrolysate inhibits factor XIIa and platelet aggregation Life Sciences 76 2607-19 46 Ravallec-Pleacute R 2000 Valorisation dhydrolysats dorigine marine optimisation de la concentration en peptides apparenteacutes aux facteurs de croissance et aux agents seacutecreacutetagogues Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Bretagne Occidentale 47 Ravallec-Pleacute R et Van Wormhoudt A 2003 Secretagogue activities in cod (Gadus morhua) and shrimp (Penaeus aztecus) extracts and alcalase hydrolysates determined in AR4-2J pancreatic tumour cells Comp Biochem Physiol B 134 669-79 48 Rousseau M Batista I Le Gal Y et Fouchereau-Peacuteron M 2001 Purification of a functional competitive antagonist for calcitonin gene related peptide action from sardine hydrolysate EJB 4 25-32 49 Shahidi F Han X et Synowiecki J 1995 Production and characteristics of protein hydrolystaes from capelin (Mallotus villosus) Food Chem 53 285-93
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50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
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RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
10 Cuvellier GF 1999 Enzymologie et biocatalyse Dans Biotechnologie Paris Tec et Doc Lavoisier Paris 319-42 11 Dumay J 2006 Extraction de lipides en voie aqueuse par bioreacteur enzymatique combineacute agrave lrsquoultracentrifugation application agrave la valorisation de co-produits de poisson (Sardina pilchardus) Thegravese de doctorat Speacutecialiteacute bioproceacutedeacutes et biotechnologies marines Lieu de soutenance Ecole Polytechnique de lrsquoUniversiteacute de Nantes 12 Dong YL Sheng G Y Fu J M et Wen K W 2005 Chemical characterization and antianaemia activity of fish protein hydrolysate from Saurida elongata J Sci Food Agric 85 2033-39 13 FAO 1998 The state of world fisheries and aquaculture Rome Italy 14 Fitzgerald AJ Rai P S Marchbank T Taylor G W Ghosh S Ritz B W et Playford R J 2005 Reparative properties of a commercial fish protein hydrolysate preparation Gut 54775-81 15 Gauthier D 2006 Introduction aux techniques utiliseacutees en biochimie le dosage des proteacuteines lten lignegt [accegraves internet] wwwchimiebiochimieumonctoncabchdgsiitubprodosage 16 Gildberg A 1993 Enzymic processing of marine raw materials Process Biochem 28 1-15 17 Gildberg A Brgwald J Johansen A et Stenberg E 1996 Isolation of acid peptide fractions from a fish protein hydrolysate with strong stimulatory effect on atlantic salmon (Salmo salar) head kidney leucocytes Comp Biochem Physiol 114 B 97-101 18 Gildberg A Arnesen J A et Carlehoumlg M 2002 Utilisation of cod backbone by biochemical fractionation Process Biochem 38 475-80
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19 Gueacuterard F Dufosseacute L De La Broise D et Binet A 2001 Enzymatic hydrolysis of protein from yellowfin tuna (Thunnus albacares) wastes using alcalase J Mol Catalysis B Enzymatic 11 1051-9 20 Gueacuterard F Batista I Pires C Thorkelson G et Le Gal Y 2004 Repport on sources and selection criteria for raw material Rapport eacutetabli pour le programme SEAFOODplus- 57 21 Gornall Bardawill et David 1949 J Biol Chem 177 751 [Mise au point dune meacutethode quantitative pour doser les proteacuteines avec le biuret] 22 Hoyle NT et Merrit J H 1994 Quality of fish protein hydrolysates from herring (Clupea harengus) J Food Sci 59 76-9 23 Direction des Pecircches Maritimes (DPM) Centre de Recherche Oceacuteanographiques de Dakar-Thiaroye(CRODT) Rapport final Etude de lrsquoeacutevaluation et de la gestion des ressources halieutiques en Reacutepublique de Seacuteneacutegal Dakar direction des pecircches maritimes 24 Institut Franccedilais pour la Nutrition 1997 Les proteacuteines ndash Tome 2 Caracteacuteristiques des diffeacuterentes sources de proteacuteines alimentaires Paris IFN- Dossier speacutecifique Ndeg9 bis 25 Jones DA 1995 Frippak ndash the facts A response to the article by PR Muir and DC Sutton J Word Aquacult Soc 26(2)220-222 26 Jun SY Park P J Jung W K et Kim S K 2004 Purification and characterization of an antioxydative peptide from enzymatic hydrolysate of yellowfin sole (Limanda aspera) frame protein Eur Food Res Technol 219 pp 20-6 27 Kim SK et Mendis E 2006 Bioactive compounds from marine processing by-products - A review Food Res Int 39383-93 28 Kristinsson HG et Rasco B A 2000 Fish protein hydrolysates Production biochemical and functional properties Critical Reviews in Food Sci and Nutr 40 43-81
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29 Lalasidis G Bostroumlm S et Sjoumlberg L B 1978 Low molecular weight enzymatic fish protein hydrolysates chemical composition and nutritive values J Agric Food Cehm 28 751-6 30 Liaset B Julsham K et Espe M 2003 Chemical composition and theoretical nutritional evaluation of the produced fractions from enzymic hydrolysis of salmon frames with Protamex Process Biochem 38 1747-59 32 Liaset B Lied E et Espe M 2000 Enzymatic hydrolysis of by-products from the fishfilleting industry chemical characterization and nutritional evaluation J Sci Food Agric 80 881 33 Larbier M et Leclercq B 1992 Les matiegraveres premiegraveres utiliseacutees en aviculture (225 ndash 301) in nutrition et alimentation des volailles Paris INRA 34 Lowry O H Rosebrough NJ Farr AL et Randall R J 1951 Protein measurement with Folin phenol reagent J Biol Chem 193 256 ndash 275 35 Lynch et coll (1998) Lynch JM Barbano DMet Fleming JR ndash Indirect and direct determination of the casein content of milk by Kjeldhal nitrogen analysis collaborative study J AOAC Int 36 Mackie IM 1982 General review of fish protein hydrolysates Animal Feed Sci And Technol 7 113-24 37 Martin AM et Chintalapati S P 1989 Fish offal-peat compost extracts as fermentation substrate Biological wastes 27 281-8 38 Martone et al (2005) Martone CB Peacuterez Borla O et Saacuten chez J J 2005 Fishery by-product as a nutrient source for bacteria and aracha growth media Bioresource Technol 96 383-87 39 Merritt JH 1982 Assessment of the production costs of fish protein hydrolysates Anim Feed Sci Technol 1 147-51
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40 Ndoye F Moiumlty-maiumlzi P et Broutin c 2002 Le poisson fumeacute sur la petite cocircte Senegalaise 41Oslashrskov ER Soliman H S et Clark C F S 1982 Use of fish protein hydrolysate in milk replacers Anim Feed Sci Tech 7 135 42 Ouellet DR Seoane J R Veira D M et Proulx J G 1997 Effects of supplementation with fish meal or fish protein hydrolysate on growth nutrient digestibility and rumen fermentation of growing cattle fed grass silage Anim Feed Sci Tech 68 307-26 43 Picot L Bordenave S Didelot S Fruitier-Arnaudin I Sannier F Thorkelsson G Bergeacute J P Gueacuterard F Chabeaud A et Piot J M 2006 Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines Process Biochem 41 1217-22 44 Quaglia GB et Orban E 1987 Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysates from sardine (Sardina pilchardus) J Sci Food Agric 38 271-6 45 Rajapakse N Jung W K Mendis E Moon S H et Kim S K 2005 A novel anticoagulant purified from fish protein hydrolysate inhibits factor XIIa and platelet aggregation Life Sciences 76 2607-19 46 Ravallec-Pleacute R 2000 Valorisation dhydrolysats dorigine marine optimisation de la concentration en peptides apparenteacutes aux facteurs de croissance et aux agents seacutecreacutetagogues Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Bretagne Occidentale 47 Ravallec-Pleacute R et Van Wormhoudt A 2003 Secretagogue activities in cod (Gadus morhua) and shrimp (Penaeus aztecus) extracts and alcalase hydrolysates determined in AR4-2J pancreatic tumour cells Comp Biochem Physiol B 134 669-79 48 Rousseau M Batista I Le Gal Y et Fouchereau-Peacuteron M 2001 Purification of a functional competitive antagonist for calcitonin gene related peptide action from sardine hydrolysate EJB 4 25-32 49 Shahidi F Han X et Synowiecki J 1995 Production and characteristics of protein hydrolystaes from capelin (Mallotus villosus) Food Chem 53 285-93
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50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
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RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
19 Gueacuterard F Dufosseacute L De La Broise D et Binet A 2001 Enzymatic hydrolysis of protein from yellowfin tuna (Thunnus albacares) wastes using alcalase J Mol Catalysis B Enzymatic 11 1051-9 20 Gueacuterard F Batista I Pires C Thorkelson G et Le Gal Y 2004 Repport on sources and selection criteria for raw material Rapport eacutetabli pour le programme SEAFOODplus- 57 21 Gornall Bardawill et David 1949 J Biol Chem 177 751 [Mise au point dune meacutethode quantitative pour doser les proteacuteines avec le biuret] 22 Hoyle NT et Merrit J H 1994 Quality of fish protein hydrolysates from herring (Clupea harengus) J Food Sci 59 76-9 23 Direction des Pecircches Maritimes (DPM) Centre de Recherche Oceacuteanographiques de Dakar-Thiaroye(CRODT) Rapport final Etude de lrsquoeacutevaluation et de la gestion des ressources halieutiques en Reacutepublique de Seacuteneacutegal Dakar direction des pecircches maritimes 24 Institut Franccedilais pour la Nutrition 1997 Les proteacuteines ndash Tome 2 Caracteacuteristiques des diffeacuterentes sources de proteacuteines alimentaires Paris IFN- Dossier speacutecifique Ndeg9 bis 25 Jones DA 1995 Frippak ndash the facts A response to the article by PR Muir and DC Sutton J Word Aquacult Soc 26(2)220-222 26 Jun SY Park P J Jung W K et Kim S K 2004 Purification and characterization of an antioxydative peptide from enzymatic hydrolysate of yellowfin sole (Limanda aspera) frame protein Eur Food Res Technol 219 pp 20-6 27 Kim SK et Mendis E 2006 Bioactive compounds from marine processing by-products - A review Food Res Int 39383-93 28 Kristinsson HG et Rasco B A 2000 Fish protein hydrolysates Production biochemical and functional properties Critical Reviews in Food Sci and Nutr 40 43-81
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29 Lalasidis G Bostroumlm S et Sjoumlberg L B 1978 Low molecular weight enzymatic fish protein hydrolysates chemical composition and nutritive values J Agric Food Cehm 28 751-6 30 Liaset B Julsham K et Espe M 2003 Chemical composition and theoretical nutritional evaluation of the produced fractions from enzymic hydrolysis of salmon frames with Protamex Process Biochem 38 1747-59 32 Liaset B Lied E et Espe M 2000 Enzymatic hydrolysis of by-products from the fishfilleting industry chemical characterization and nutritional evaluation J Sci Food Agric 80 881 33 Larbier M et Leclercq B 1992 Les matiegraveres premiegraveres utiliseacutees en aviculture (225 ndash 301) in nutrition et alimentation des volailles Paris INRA 34 Lowry O H Rosebrough NJ Farr AL et Randall R J 1951 Protein measurement with Folin phenol reagent J Biol Chem 193 256 ndash 275 35 Lynch et coll (1998) Lynch JM Barbano DMet Fleming JR ndash Indirect and direct determination of the casein content of milk by Kjeldhal nitrogen analysis collaborative study J AOAC Int 36 Mackie IM 1982 General review of fish protein hydrolysates Animal Feed Sci And Technol 7 113-24 37 Martin AM et Chintalapati S P 1989 Fish offal-peat compost extracts as fermentation substrate Biological wastes 27 281-8 38 Martone et al (2005) Martone CB Peacuterez Borla O et Saacuten chez J J 2005 Fishery by-product as a nutrient source for bacteria and aracha growth media Bioresource Technol 96 383-87 39 Merritt JH 1982 Assessment of the production costs of fish protein hydrolysates Anim Feed Sci Technol 1 147-51
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40 Ndoye F Moiumlty-maiumlzi P et Broutin c 2002 Le poisson fumeacute sur la petite cocircte Senegalaise 41Oslashrskov ER Soliman H S et Clark C F S 1982 Use of fish protein hydrolysate in milk replacers Anim Feed Sci Tech 7 135 42 Ouellet DR Seoane J R Veira D M et Proulx J G 1997 Effects of supplementation with fish meal or fish protein hydrolysate on growth nutrient digestibility and rumen fermentation of growing cattle fed grass silage Anim Feed Sci Tech 68 307-26 43 Picot L Bordenave S Didelot S Fruitier-Arnaudin I Sannier F Thorkelsson G Bergeacute J P Gueacuterard F Chabeaud A et Piot J M 2006 Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines Process Biochem 41 1217-22 44 Quaglia GB et Orban E 1987 Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysates from sardine (Sardina pilchardus) J Sci Food Agric 38 271-6 45 Rajapakse N Jung W K Mendis E Moon S H et Kim S K 2005 A novel anticoagulant purified from fish protein hydrolysate inhibits factor XIIa and platelet aggregation Life Sciences 76 2607-19 46 Ravallec-Pleacute R 2000 Valorisation dhydrolysats dorigine marine optimisation de la concentration en peptides apparenteacutes aux facteurs de croissance et aux agents seacutecreacutetagogues Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Bretagne Occidentale 47 Ravallec-Pleacute R et Van Wormhoudt A 2003 Secretagogue activities in cod (Gadus morhua) and shrimp (Penaeus aztecus) extracts and alcalase hydrolysates determined in AR4-2J pancreatic tumour cells Comp Biochem Physiol B 134 669-79 48 Rousseau M Batista I Le Gal Y et Fouchereau-Peacuteron M 2001 Purification of a functional competitive antagonist for calcitonin gene related peptide action from sardine hydrolysate EJB 4 25-32 49 Shahidi F Han X et Synowiecki J 1995 Production and characteristics of protein hydrolystaes from capelin (Mallotus villosus) Food Chem 53 285-93
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50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
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RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
29 Lalasidis G Bostroumlm S et Sjoumlberg L B 1978 Low molecular weight enzymatic fish protein hydrolysates chemical composition and nutritive values J Agric Food Cehm 28 751-6 30 Liaset B Julsham K et Espe M 2003 Chemical composition and theoretical nutritional evaluation of the produced fractions from enzymic hydrolysis of salmon frames with Protamex Process Biochem 38 1747-59 32 Liaset B Lied E et Espe M 2000 Enzymatic hydrolysis of by-products from the fishfilleting industry chemical characterization and nutritional evaluation J Sci Food Agric 80 881 33 Larbier M et Leclercq B 1992 Les matiegraveres premiegraveres utiliseacutees en aviculture (225 ndash 301) in nutrition et alimentation des volailles Paris INRA 34 Lowry O H Rosebrough NJ Farr AL et Randall R J 1951 Protein measurement with Folin phenol reagent J Biol Chem 193 256 ndash 275 35 Lynch et coll (1998) Lynch JM Barbano DMet Fleming JR ndash Indirect and direct determination of the casein content of milk by Kjeldhal nitrogen analysis collaborative study J AOAC Int 36 Mackie IM 1982 General review of fish protein hydrolysates Animal Feed Sci And Technol 7 113-24 37 Martin AM et Chintalapati S P 1989 Fish offal-peat compost extracts as fermentation substrate Biological wastes 27 281-8 38 Martone et al (2005) Martone CB Peacuterez Borla O et Saacuten chez J J 2005 Fishery by-product as a nutrient source for bacteria and aracha growth media Bioresource Technol 96 383-87 39 Merritt JH 1982 Assessment of the production costs of fish protein hydrolysates Anim Feed Sci Technol 1 147-51
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40 Ndoye F Moiumlty-maiumlzi P et Broutin c 2002 Le poisson fumeacute sur la petite cocircte Senegalaise 41Oslashrskov ER Soliman H S et Clark C F S 1982 Use of fish protein hydrolysate in milk replacers Anim Feed Sci Tech 7 135 42 Ouellet DR Seoane J R Veira D M et Proulx J G 1997 Effects of supplementation with fish meal or fish protein hydrolysate on growth nutrient digestibility and rumen fermentation of growing cattle fed grass silage Anim Feed Sci Tech 68 307-26 43 Picot L Bordenave S Didelot S Fruitier-Arnaudin I Sannier F Thorkelsson G Bergeacute J P Gueacuterard F Chabeaud A et Piot J M 2006 Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines Process Biochem 41 1217-22 44 Quaglia GB et Orban E 1987 Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysates from sardine (Sardina pilchardus) J Sci Food Agric 38 271-6 45 Rajapakse N Jung W K Mendis E Moon S H et Kim S K 2005 A novel anticoagulant purified from fish protein hydrolysate inhibits factor XIIa and platelet aggregation Life Sciences 76 2607-19 46 Ravallec-Pleacute R 2000 Valorisation dhydrolysats dorigine marine optimisation de la concentration en peptides apparenteacutes aux facteurs de croissance et aux agents seacutecreacutetagogues Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Bretagne Occidentale 47 Ravallec-Pleacute R et Van Wormhoudt A 2003 Secretagogue activities in cod (Gadus morhua) and shrimp (Penaeus aztecus) extracts and alcalase hydrolysates determined in AR4-2J pancreatic tumour cells Comp Biochem Physiol B 134 669-79 48 Rousseau M Batista I Le Gal Y et Fouchereau-Peacuteron M 2001 Purification of a functional competitive antagonist for calcitonin gene related peptide action from sardine hydrolysate EJB 4 25-32 49 Shahidi F Han X et Synowiecki J 1995 Production and characteristics of protein hydrolystaes from capelin (Mallotus villosus) Food Chem 53 285-93
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BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
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geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
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RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
40 Ndoye F Moiumlty-maiumlzi P et Broutin c 2002 Le poisson fumeacute sur la petite cocircte Senegalaise 41Oslashrskov ER Soliman H S et Clark C F S 1982 Use of fish protein hydrolysate in milk replacers Anim Feed Sci Tech 7 135 42 Ouellet DR Seoane J R Veira D M et Proulx J G 1997 Effects of supplementation with fish meal or fish protein hydrolysate on growth nutrient digestibility and rumen fermentation of growing cattle fed grass silage Anim Feed Sci Tech 68 307-26 43 Picot L Bordenave S Didelot S Fruitier-Arnaudin I Sannier F Thorkelsson G Bergeacute J P Gueacuterard F Chabeaud A et Piot J M 2006 Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines Process Biochem 41 1217-22 44 Quaglia GB et Orban E 1987 Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysates from sardine (Sardina pilchardus) J Sci Food Agric 38 271-6 45 Rajapakse N Jung W K Mendis E Moon S H et Kim S K 2005 A novel anticoagulant purified from fish protein hydrolysate inhibits factor XIIa and platelet aggregation Life Sciences 76 2607-19 46 Ravallec-Pleacute R 2000 Valorisation dhydrolysats dorigine marine optimisation de la concentration en peptides apparenteacutes aux facteurs de croissance et aux agents seacutecreacutetagogues Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Bretagne Occidentale 47 Ravallec-Pleacute R et Van Wormhoudt A 2003 Secretagogue activities in cod (Gadus morhua) and shrimp (Penaeus aztecus) extracts and alcalase hydrolysates determined in AR4-2J pancreatic tumour cells Comp Biochem Physiol B 134 669-79 48 Rousseau M Batista I Le Gal Y et Fouchereau-Peacuteron M 2001 Purification of a functional competitive antagonist for calcitonin gene related peptide action from sardine hydrolysate EJB 4 25-32 49 Shahidi F Han X et Synowiecki J 1995 Production and characteristics of protein hydrolystaes from capelin (Mallotus villosus) Food Chem 53 285-93
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50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
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aicircneacutes
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digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
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mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
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geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
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RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
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50 Seret B 1981 Poisson de mer de lrsquoOuest Africain tropical (Initiation documentation technique Ndeg 49) Paris ORSTM Illustration Pierre OPIC 51 Šližyte R Daukšas E Falch E Storroslash I et Rustad T 2005 Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod (Gadus morhua) by-products Process Biochem 40 2021-33 52 Wu HC Chen H M et Shiau C Y 2003 Free amino acids and peptides as related to antioxydant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Res Int 36 949-57
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
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RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
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laquo Fidegravelement attacheacute aux directives de Claude
BOURGELAT fondateur de lrsquoenseignement veacuteteacuterinaire dans
le monde je promets et je jure devant mes maicirctres et mes
aicircneacutes
- drsquoavoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
digniteacute et de lrsquohonneur de la profession veacuteteacuterinaire
- drsquoobserver en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixeacutes par le code de deacuteontologie de
mon pays
- de prouver par ma conduite ma conviction que la fortune
consiste moins dans le bien que lrsquoon a que dans celui que
lrsquoon peut faire
- de ne point mettre agrave trop haut prix le savoir que je dois agrave la
geacuteneacuterositeacute de ma patrie et agrave la sollicitude de tous ceux qui
mrsquoont permis de reacutealiser ma vocation
Que toute confiance me soit retireacutee srsquoil advient que je me parjure raquo
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RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr
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RESUME Ce travail srsquoinscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus de la chaicircne de transformation de la sole tropicale (Cynoglossus senegalensis) en filet par la mise en oeuvre de techniques douces ( hydrolyse enzymatique) visant agrave un investissement et une deacutepense eacutenergeacutetique modeacutereacutes afin drsquoobtenir des composeacutes drsquointeacuterecirct Pour ce travail lrsquoeacutetude a eacuteteacute appliqueacutee aux co-produits (tecircte et viscegraveres) de la sole tropicale avec lrsquoenzyme protamex Lrsquoobjectif eacutetant de libeacuterer les proteacuteines totales et ensuite les doser par la meacutethode de Kjeldahl en reacutealisant au preacutealable une hydrolyse enzymatique des co-produits (tecirctes et viscegraveres) Lrsquohydrolysat obtenu est centrifugeacute et on obtient deux principales phases (la phase soluble ou surnageant et la phase insoluble ou culot) Apregraves passage agrave lrsquoeacutetuve de ces deux phases la reacutecupeacuteration des matiegraveres segraveches a permis le dosage des proteacuteines totales Des reacutesultats il ressort qursquoun pH de 62 agrave 631 et une tempeacuterature de 55 agrave 567degC ont eacuteteacute observeacutes au cours de la conduite de lrsquohydrolyse enzymatique qui a dureacutee une heure (1h) Le poids de lrsquohydrolysat repreacutesente 97 de la matiegravere initiale et celui des arecirctes 3 Lrsquohydrolysat contient 91 de surnageant et 9 de culot Le culot et le surnageant contiennent respectivement 22 et 7 de matiegravere segraveche Le dosage des proteacuteines totales donne une moyenne de 2497 pour le culot et 2765 pour le surnageant La preacutesente eacutetude a ainsi permis de proposer un proceacutedeacute drsquoextraction des proteacuteines totales agrave partir de co-produits de poisson en utilisant lrsquohydrolyse enzymatique Lrsquooriginaliteacute de ce travail de thegravese reacuteside dans le fait qursquoil ouvre ainsi des perspectives encourageantes agrave lrsquoutilisation de ces techniques douces srsquoinscrivant dans une politique actuelle de deacuteveloppement durable et de gestion des bio ressources Mots cleacutes soles co-produits hydrolyse enzymatique valorisation Adresse Rose Eliane PENDA BP 30432 Yaoundeacute (Cameroun) Teacutel + (237) 77 46 23 88 + (221) 66 83 33 E-mail eliopendyahoofr