ue1 biocell : cours 8 · les protéoglycanes sont des protéines contenant un corps protéique et...

UE1 Biologie Cellulaire Pr. Ea 18/12/17 de 13h30 à 15h30 Ronéotypeur : Guillaume HEMONET Ronéoficheur : Laure GAUDIN

UE1 Biocell : cours 8

Renouvellement des matrices extracellulaires et relation avec les cellules

Le cours n’a pas du tout changé par rapport à l’année dernière

Ronéo 13 - Cours 8 UE1 Biocell ! sur !1 14

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I/ La matrice extracellulaire A) Généralités

B) Composition 1) Collagène 2) Fibre élastique 3) Protéines adhésives 4) Lame basale

II/ Dégradation de la matrice : les protéases A) Généralités

B) Protéases importantes 1) Cathepsines 2) Métalloprotéases (MMP) 3) Famille des furines 4) Sérines protéases

III/ Protéases et métastases A) Approche rationnelle

B) Modèle in vivo

C) Applications humaines

D) Utilisations thérapeutiques des inhibiteurs des MMP


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I) La matrice extracellulaire A) Généralités

La matrice extracellulaire est une substance qui permet la cohésion et le maintien de tous les tissus de l’organisme (localisation ubiquitaire de la MEC). Cependant, certains tissus sont plus ou moins riche en MEC. Les plus riches étant les cartilages (95% de matrice et 2-3 % de cellules) et le tissu osseux.

Cette matrice est synthétisée par des cellules mésenchymateuses. Dans le cartilage, tissu non innervé et non vascularisé, ce rôle revient aux cellules mésenchymateuses chondrocytaires (chondrocytes), seules cellules présentes. Dans les autres tissus qui sont vascularisés, les cellules mésenchymateuses sont les fibroblastes. On peut également noter la présence de macrophages, les monocytes et les infiltrats lymphocytaires.

La MEC est composé de plusieurs types de protéine, notamment les protéoglycanes (abondantes dans la MEC) et le collagène (protéines de structure fibreuses qui peuvent former des microfibrilles). Il y a également présence de protéines de cohésion (protéines adhésives) qui assure la communication entre la cellule qui fabrique les différentes protéines et la structure de la MEC. Ces protéines contiennent le plus souvent une séquence RGD reconnue alors par les intégrines. La MEC, fabriquée par les fibroblastes, est en renouvellement constant. À l’état physiologique et homéostatique, il y a autant de production que de destruction matricielle. Cette homéostasie est régulée au niveau local par des cytokines (facteurs spécifiques) qui ont un rôle catabolique. Ils vont activer la dégradation de la matrice grâce à la production et la sécrétion d’enzymes protéolytiques (protéases). Au niveau systémique, les facteurs de croissance vont réguler et stimuler la synthèse et la réponse anabolique des cellules mésenchymateuses afin de reconstruire la MEC détruite. En effet, ces facteurs de croissance sont stockés dans la matrice. Lorsqu’elle est dégradée par les protéases, il y a alors une libération des facteurs de croissance qui vont permettre de donner une réponse afin de synthétiser la matrice abimée. Concernant le tissu osseux, lors de la dégradation par ostéoblaste de la matrice, il y a libération des facteurs de croissance qui vont stimuler les ostéoblastes.

Rôle : - Maintenir une cohésion tissulaire - Permettre la migration de certaines cellules (immunité innée) - Stocker les facteurs de croissance (réguler l’homéostasie des protéines de la MEC)

Beaucoup de maladies sont liées à des anomalies de la MEC. Il existe notamment des maladies génétiques qui affectent la synthèse des composants de la matrice. Un défaut de collagène I (le plus exprimé par l’organisme) va être responsable de la maladie des os de verre. Un défaut de collagène II (spécifique des tissus cartilagineux) va avoir des répercussion sur les articulations et le squelette. Il existe des maladies acquises avec synthèses accru des protéines de la MEC qui va alors donner des maladies fibrosantes. Il existe également des maladies où la MEC se retrouve en défaut qui est souvent dû à un excès de destruction. L’inflammation va en effet induire la production de cytokines qui vont stimuler les protéases responsables de la dégradation de la MEC (Arthrose, ostéoporose, arthrite)


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B) Composition 1) Collagène

Le collagène est le composant majoritaire de la MEC (notamment le collagène I)

Exemple du collagène I : Ce collagène est composé d’une hélice de trois chaines de collagène qui forment alors une hélice fibrillaire. Cette synthèse est extrêmement régulée. Les chaines sont soit sous forme d’hétérotrimère soit sous forme de monotrimère qui grâce à leurs séquence en AA va permettre la formation en triple hélice.

Il y a tout d’abord : - Transcription de l’ARNm et la traduction dans le RE - Hydroxylation sur les résidus de lysine et de proline - Glycosylation sur les résidus hydroxyline. - Formation d’une triple hélice en s’associant entre eux - Sécrétion à l’extérieur de la cellule où il va subir un clivage en N-term et

permettre ainsi au collagène de former des microfibrilles et des fibrilles.

Il existe plusieurs type de collagène : le collagène fibrillaire et non fibrillaire Le collagène fibrillaire peut être majeur (I, II, III) ou mineur (V et XI). Une mutation des collagènes fibrillaires majeurs peut entrainer des maladies très spécifiques. Le collagène non fibrillaire ne forme pas de fibrilles. Les collagène IX, X, XII s’associent aux collagènes fibrillaires pour stabiliser le réseau de collagène dans le tissu conjonctif. Les collagènes IV et VII forment des réseaux au niveau de la lame basal ou en périphérie de la cellule mésenchymateuse.

Dans le cartilage articulaire, il existe un gros réseau de collagène de type II (fibrillaire). Ce réseau va être stabilisé par des collagènes non fibrillaires (IX). Ce réseau est important pour structurer la MEC du cartilage et donner les propriétés biomécaniques de ce tissu.

Spécificité tissulaire des collagènes

Type de collagène Distribution tissulaire

I os, peau, tendon, ligament, cornée, organe interne

II cartilage, disques intervertébraux, notocorde, humeur vitrée de l’oeil

III peau, vaisseaux sanguins, organes internes

V idem que I

XI idem que II

IX cartilage

XII tendons, ligaments et quelques autres tissus

IV lame basale

VII sous les épithéliums squameux stratifiés


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Pathologie du collagène Il existe des mutations génétiques possibles dans les séquences codantes ou non codantes du collagène qui peuvent donner des maladies graves. Les différences de phénotypes s’expliquent par la spécificité des différents collagènes dans les tissus.

2) Fibre élastique

Les fibres élastiques (élastines) sont des protéines fibreuses riches en proline qui possèdent des propriétés élastiques (assez logique me dira-t-on). Il y a présence de liaison de pontage entre les différentes molécules ce qui va permettre au réseau d’avoir cette propriété et de ramener la protéine dans son état de décompression, après l’étirement.

Les fibres élastiques sont entourées d’un manchon protéique composé de microfibrilles (10 nm). Les microfibrilles sont formées de glycoprotéines (f ibr i l l ine) et peuvent exis ter dans la MEC indépendamment de l’élastine. La fibrilline joue un rôle important dans la maladie de Marfan grâce à l’intermédiaire de TGFß. En effet, la fibrilline relie le complexe de latence de TGFß. Une mutation de cette fibrilline va entrainer une moins bonne liaison avec le TGFß. TGFß et son complexe de latence ne vont plus être stockés dans la MEC et vont donc être activés de manière soutenue. En bref, il y aura une hyperactivation de TGFß par défaut de stockage dans la MEC

Maladie de Marfan Les personnes atteintes de cette maladie sont très grands tant vertical qu’horizontal. Ils possèdent des doigts très graciles avec une arachnodactylie. Il y aura présence d’une hyperlaxité cutanée, des anomalies du tissu conjonctif qui peuvent causer des anévrismes (même fonctionnement que maladie d’Ehlers-Danlos). Il y aura des anomalies du canal ural et du cristallin

Collagène I Collagène II Collagène III

Maladie de Lobstein (maladie des os de verre) Il y aura une mauvaise trimérisation de l’hélice de collagène ce qui va avoir pour conséquence la formation de collagènes fibrillaires de moins bonne qualité Il y aura donc des troubles de la minéralisation osseuse qui entrainent donc une fragilité osseuse importante avec fractures à répétition

Les signes sont essentiellement ostéo-articulaires avec présence d’anomalies des articulations, de croissance et d’anomalies oculaires - Arthrose précoce - Dysplasie touchant les

vertèbres et les os - Myopie précoce

Maladie de Ehlers-Danlos Il va y avoir atteinte de : - La peau (élasticité, hyperlaxité,

finesse, ecchymoses) - Les vaisseaux car fragilité du tissu

conjonctif qui soutient les parois vasculaires (fractures vasculaires, anévrismes aortiques)

- Les organes internes (colon, utérus)

Les premières manifestations qui mènent au diagnostic sont la rupture de vaisseaux et la rupture des organes internes. Le diagnostic est assez tardif avec une pénétrance plus ou moins importante


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3) Protéines adhésives (≠ protéines structurales que sont le collagène et les fibres élastiques) Les protéines adhésives ont pour but de médier la communication entre la cellule mésenchymateuse et sa matrice. Cela se fait grâce à des récepteurs spécifiques qui vont reconnaitre ces protéines exprimant la séquence RGD (Arginine, Glycine, Acide Aspartique). Ces protéines adhésives ne sont pas spécifiques d’un tissu. On peut noter l’existence de : - Fibronectine - Vitronectine - Thrombospondine - Ténascine - Laminine

Fibronectine (une des protéines les mieux caractérisées) La fibronectine est une homodimères Leurs structures sont actuellement bien décrites, il s’agit d’une structure protéique extracellulaire ayant des domaines de liaison à des protéine de la MEC (collagène, héparine) 2 formes : - Sécrétée circulante fabriquée par hépatocyte - Locale matricielle sécrétés par les cellules mésenchymateuse

Glycosaminoglycanes

Les GAG correspondent à une chaîne polysaccharidique faite d’unités disaccharidiques répétitives (Acide glucoronique et la N-acétylglucosamine). Ces chaines contiennent beaucoup de carbones qui sont chargés (-). Cela va permettre l’hydratation du tissu. En effet, le tissu étant neutre, les GAG vont ainsi retenir des cations pour conserver la neutralité du tissu. Cela va avoir comme conséquence, une augmentation de la pression osmotique dans le tissu ce qui va retenir l’eau. Lorsque les GAG sont détruits, le tissu se déshydrate (Arthrose).

Particularité : structure très étirée → volume considérable → résistance. Présents en grande abondance dans le cartilage

Une des chaines de GAG les plus longues est l’acide hyaluronique. Il s’agit d’une longue chaine de disaccharides (25000) qui va former des agrégats glycoprotéiques par embranchement avec les protéoglycanes. L’acide hyaluronique est présent dans le tissu cartilagineux, cutané et conjonctif.

Protéoglycanes

Les protéoglycanes sont des protéines contenant un corps protéique et des sucres (GAG) qui sont liés par des protéines de liaison (spécifique). Il en existe plusieurs types : chondroïtine sulfate, héparine sulfate, kératine sulfate

Il existe plusieurs familles de PG en fonction des différentes GAG présentes par exemple avec des tailles variables : petit (décorine) ou gros (aggrécan). Il existe égalmement des PG trans-membrannaires (syndécan)

Les PG sont de grands agrégats de charge (-) qui vont donc permettre l’hydratation du tissu. Le cartilage articulaire, non vascularisé, contient 70% d’eau dans la MEC Ce cartilage possèdent une partie non calcifié et calcifiée séparées par la tide mark. La zone non calcifiée possède 3 zones : superficielle, intermédiaire et profonde La composition de la MEC diffère en fonction de ces zones : - Au niveau superficiel, le collagène II est parallèle à la

surface pour résister aux forces de frottement - Au niveau profond, le collagène II est perpendiculaire

pour résister aux forces de compression


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Protéoglycanes membranaires

Les PG membranaires (syndécan, biglycan) peuvent servir de récepteur à certains facteurs de croissance dont le récepteur au FGF ou TGFß

Les PG possèdent des tailles et des quantités variables en fonction des tissus dans lesquels ils se trouvent. Ils peuvent être de l’ordre du micromètre (acide hyaluronique) ou nanomètre (glycorine) par exemple. 4) Lame basal

Il existe d’autres protéines matricielles, notamment les protéines de la lame basale qui sépare l’épithélium du tissu conjonctif sous-jacent. La lame basale est composée de collagène IV en réseau qui s’associe avec les laminines.

Il existe des maladies qui touchent ces protéines : - Mutations génétiques non fonctionnelles qui

peuvent toucher le collagène IV ou laminine (maladie tératologique avec dermatose bulleuse qui peut être objectivée sur les modèles animaux)

- Maladies acquises notamment les maladies auto-immunes dans lesquelles des auto-anticorps sont dirigés contre ces protéines (Dans le syndrome de Goodpasture, des anticorps anti-collagène IV sont produits. Il va alors y avoir des atteintes rénales et pulmonaires)

II) Dégradation de la matrice : les protéases

Les composants de la matrice extracellulaire sont synthétisés puis dégradés de façon constante. En situation homéostasique il y a un juste équilibre entre ces deux activités. La dégradation est assurée par ces enzymes protéolytiques que sont les protéases. (Ces enzymse protéolytiques sont une grande classe d’enzyme mais dans ce cours nous verront uniquement celles qui permettent la destruction des protéines de la mec).

A) Généralités

Les protéases sont sécrétées sous forme de pro-enzyme inactive et peuvent s'activer les unes les autres (cascade enzymatique) ou s’autoactiver.Les protéases sont finement régulées par des inhibiteurs et activateurs, système qui, physiologiquement, est à l’équilibre. Certaines sont actives à ph acide (dans les lysosomes) ou encore à ph neutre.

Protéases: rôle en physiologie • Renouvellement normal des matrices en détruisant les protéines anciennes pour permettre à la cellule

d’en synthétiser des nouvelles.

• Réparation des plaies : -«shedding» des molécules transmembranaires (clivage et relargage d’une forme soluble de la portion extracellulaire d’un récepteur membranaire. Cela régule l’activité de la cytokine lié au

Protéase Localisation Activité à ph : Inhibiteur

Cathepsine Lysosomes 3-6 a2m

Plasmine Extracellulaire 7 PAI

Metalloprotéases Extracellulaire 7 TIMP


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récepteur)-clive les facteurs de croissance associés des protéines matricielles. Une fois libres, les facteurs de croissances activent la réponse anabolique et permet la réparation tissulaire en stimulant les cellules mésenchymateuses. Les protéases peuvent aussi cliver spécifiquement les facteurs de croissance sécrétés sous forme de pro-peptides.

Protéases: rôle en pathologie (le passage de physiologie à pathologie dépend du seuil d’activation des protéases) -Migration des leucocytes (MEC détruite pour laisser migrer les leucocytes) -Clivage des composants de la matrice extracellulaire : des protéines de liaison (cellule-cellule/ cellule-matrice) intégrines, cadhérines pour permettre la diapédèse dans les cellules endothéliales. -Destruction du cartilage dans les maladies inflammatoires -Entraine l’angiogénèse par relarguage de VEGF par la MEC. -Important dans la survenue de métastases (même système de migration que pour les leucocytes)

B) Protéases importantes

1) Cathepsines Ce sont des protéases intracellulaires : à l’état physiologique elles ne sont pas ou peu sécrétées. Elles sont présentes dans le lysosome dont le ph acide clive le prodomaine de la protéase ce qui la rend active. Il existe des maladies lysosomiales = "maladies de surcharges" dues à une absence de dégradation des protéines intracellulaires dans le lysosome et certaines par un mauvais routage des cathepsines

2) Métalloprotéases (MMP) : protéase extracellulaire

Plusieurs métalloprotéases ont été identifiées, aujourd’hui on en compte 28 (mmp1 à mmp28) différentes capables de dégrader tous les composants des matrices extra cellulaires. Certaines sont liées à la membrane cellulaire : MT-MMP (métalloprotéases transmembranaires) On a une redondance des métalloprotéases, elles n’ont pas de spécificité : l’organisme met en œuvre cette redondance pour suppléer aux états de carence.

Les différentes actions des MMP :

- Clive adhésions cellule-cellule (cadhérine) et cellule-MEC (intégrines) - Active des pro-peptides, des facteurs de croissance et des cytokines - Joue un rôle dans la migration cellulaire.- Favorise l’angiogénèse et la croissance cellulaire

Noms Substrats usuels Autres substrats Molécules activées par MMP

MMP1 (collagénase 1) Collagène I,II, III,

VII,X

Agrégan, ténascine Perlecan IGF-BP Pro-MMP1,2

Pro-TNFa

FGF actif IGF actif MMP1, 2,TNFa

MMP3 (Stromélysine) Protéglycans

Collagène II,IV,V,IX laminines

Perlécan Décorines Plasminogène Pro-MMP1,3,7

TGFb FGF MMP1,3,7


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- Détruit les composants de la MEC

Activation des MMP :

Les MMP sont libérées sous forme inactives (pro-MMP), repliées, adaptant une conformation particulière qui bloque le site catalytique dépendant du Zinc. En effet il y a interaction entre le Zinc et avec une cystéine (SH) du prodomaine. Lorsque le prodomaine est clivé (par une autre mmp) l’interaction est possible avec le zinc : la mmp est activée.

Inhibiteurs des MMP: Il s’agit des TIMP (timp1 et 2). En se fixant sur la MMP, ils vont empêcher que le site catalytique soit accessible.Leur action est non spécifique : Une TIMP peut inhiber plusieurs métalloprotéases.

Métalloprotéases : activation en cascade Certaines vont avoir une action délétère, d’autres bénéfique en fonction du tissu dans lequel elles agissent. Il est très difficile de relier une action que l’on observe à l’une des mmp particulière car elles agissent en cascade (activées par d’autres protéases dans les matrices). De plus elles sont redondantes, et peuvent interagir entres elles.

-Activation en cascade par d’autres protéases : Exemple : dégradation des protéoglycannes du disque inter vertebral par macrophages activés : MMP7 produite par le macrophage permet le « shedding » du TNFa membranaire → augmente la production et activation de MMP3 des chondrocytes → dégradation protéoglycannes

-Activation par les MT-MMP (membranaires) à la surface des cellules active les autres MMP → L’action des ces MMP est donc très régulée que ce soit par d’autres protéases ou par les facteurs de croissance (inhibent) et cytokines (activent)

Pour résumer : Le système MMP est complexe, redondant (beaucoup de protéases ont le même substrat), non spécifique (une MMP peut avoir plusieurs substrats) et les MMP s’activent les unes les autres ce qui entrainent une difficulté d’interprétation dans les modèles souris KO.

➔ Exemple : Les souris Ko MMP14 Phénotype particulier : plus petite que la souris sauvage. Il y a chez ces souris une un dérèglement de la plaque de croissance donc un retard dansl’ossification endrochondrale

On observe chez la souris KO MMP14 l’inactivation d’une autre métalloprotéase, la MMP2 ainsi que des troubles de la vascularisation (normalement lorsqu’on stimule par le FGF on crée une néoangiogénèse mais dans la souris sans MMP14 il y a absence de vascularisation) Le retard de croissance de ces souris est donc le résultat de plusieurs mécanismes.

3) Famille des furines : Elles interviennent surtout dans l’activation d’autres protéases : ce sont des pro-convertasesCe sont des protéases transmembranaires et présentes dans le trans Gogli Elles clivent et indusent la maturation de récepteurs, hormones, facteurs de croissance, MMP au niveau d’une séquence consensus d’acides aminés.

4) Sérines protéases : les activateurs du plasminogène :

Les sérines protéases comme l’Urokinase (uPA) et le tissu plasminogène activateur (tPA) convertissent le (zymogène) plasminogène en plasmine.


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-La plasmine dégrade tous les composants de la matrice (excepté le collagène natif et l’élastine.) surtout au niveau vasculaire .En effet c’est une voie très importante dans la dégradation du caillot plaquettaire et donc dans la coagulation. Ce système est utilisé actuellement à la fois dans le traitement de l’infarctus du myocarde mais aussi dans les AVC ischémiques.

-Il existe un inhibiteur de l’activateur du plasminogène (PAI) qui empêche la conversion du plasminogène en plasmine. Cette inhibition est stabilisée dans la matrice par la vitronectine.

Il y a donc un équilibre entre ses deux activateurs et son inhibiteur. Les deux formes des activateurs de plasminogène sont :

• Tissue plasminogène activateur (tpa) -Cet activateur est circulant et synthétisé de façon spécifique par les cellules endothéliales. -Son activité déclenchée par la fibrine (formation de caillots de la coagulation) -Il va donc être impliqué dans la dégradation du caillot par stimulation de la plasmine (on comprend pourquoi c’est la cellule endothéliale qui va produire cet activateur) -Ainsi on va produire des activateurs du plasminogene recombinants pour le traitement des accidents vasculaires. (en perfusion intraveineuse)

• Urokinase (uPA) -Elle est sécrétée sous forme inactive (pro-uPA) par de nombreuses cellules. -uPA a un récepteur cellulaire spécifique uPAR -La liaison au récepteur entraîne l'activation de pro-uPA en uPA. -uPA est régulé par les facteurs de croissance et des oncogènes comme les autres protéases -uPAR interagit avec les intégrines et peut lier la vitronectine → augmente l’adhésion cellulaire à la mec

Pour résumer : La plasmine active, provenant du plasminogène via l’urokinase, peut être inhibée par l’inhibiteur des activateurs de plasminogène (PAI). La plasmine dégrade de nombreux composants de la MEC, notamment la fibrine des caillots vasculaires, mais elle peut aussi activer d’autre MMP qui vont-elles aussi activer la dégradation de la MEC.


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III) Protéases et métastases

A) Approche rationelle

Cascade métastatique : c’est l’enchainement des étapes qui aboutissent au développement d’un cancer métastatique, c'est-à-dire d’un cancer dans lequel il y a colonisation d’un autre organe par les cellules tumorales.

a) Croissance in situ des cellules cancéreuses sans dégradation de la lame basale

b) Invasion : dégradation de la lame basale par les MMP et passage dans le tissu conjonctif

c et d) Intravasation : entrée des cellules tumorales dans les vaisseaux sanguins ou lymphatiques et favorise leur dissémination

e) Arrêt et extravasation : les cellules cancéreuses s’arrêtent et pénètrent dans le tissu secondaire grâce au gradient de chémiokines produites par le tissu hôte

f et g) Prolifération des cellules cancéreuses dans l e n o u v e a u t i s s u e t f o r m a t i o n d e l a néoangiogénèse.

A chacune de ces étapes, les protéases ou la liaison avec la MEC sont impliquées :

•Dans la tumeur primitive : perte de la connexion des cellules tumorales entre elles et dégradation

de la matrice (stroma) de la tumeur, angiogenèse, puis rupture de la membrane basale • Migration vers les ganglions puis vers les vaisseaux sanguins (rupture de la basale des vaisseaux et passage entre les cellules endothéliales) •Extravasation du vaisseau, dégradation de la matrice du tissu hôte de la métastase, angiogenèse, pour que la cellule s’implante : adhésion et prolifération dans le tissu métastatique.

Certaines tumeurs métastasiques vont migrer de façon spécifique dans les organes. (tissu spécifique) Par exemple dans le cancer du sein et de la prostate les métastases vont migrer de façon préférentielle dans le tissu squelettique. C’est grâce à la synthèse par les tissus hôtes, de chemiokines spécifiques et présence d’antigènes reconnus par les récepteurs des métastases.

Matrice et métastases

On sait que la sécrétion de protéases par les cellules tumorales est augmenté +++ On peut le mettre en évidence par PCR ou Westernblot.Ces protéases vont permettre à la cellule tumorale : -la dégradation de la MEC autour de la tumeur (stroma tumoral)


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-la dégradation de la basale des vaisseaux -la dégradation de la MEC de la tumeur primitive et de l'organe dans lequel va se développer la métastase (mec secondaire) - une libération de la MEC des facteurs de croissance (VEGF, FGF) stimulant l’angiogenèse

Pour démontrer que les protéases jouent un rôle important dans le processus métastatique, on va avoir recours à plusieurs modèles expérimentaux :-Test in vitro : invasion des cellules à travers une matrice synthétique -Modèles in vivo chez le rongeur -Application humaine : les mêmes facteurs prédisposant sont ils retrouvés chez l’homme? → On cherche à savoir si la présence d’activateurs et d’inhibiteurs de protéases peut moduler l’action des métastases.

B) Modèles in vivo : (chez la souris)

Des cellules tumorales sont directement injectées dans le système vasculaire de la souris et on cherche la survenue de modifications en fonction de la présence d’inhibiteurs ou activateurs de protéases (mauvaise approximation du phénomène métastatique) ce qui nous permet de voir si en présence ou non d’un traitement on aura une modification du taux de métastases. On cherche des modifications au niveau - des cellules tumorales (taille de la lésion, nombre, site métastasique…) - de l’animal (fond génétique ou traitement pharmacologiques)

Résultats expérimentaux (Arguments expérimentaux in vivo )

On injecte dans la circulation des souris nude (souris dont le système immunitaire a été réprimé, elles sont très peu capable de se défendre) des cellules tumorales humaines : - soit avec un vecteur vide - soit transfectées avec des protéases (métalloprotéases ou urokinase) et on peut voir une augmentation du caractère invasif - soit transfectées avec des inhibiteurs des MMP (TIMP) ou d’uPA (PAI) et on observe alors une diminution de leurs capacités invasives. !Résultats : On observe sur ce graphe qu’avec des protéases augmentées on a une augmentation du caractère invasif. (↑taille des lésions métastasiques) Au contraire, avec des inhibiteurs des MMP on constate une diminution des capacités invasives.

C) Applications humaines :

Des études de cohorte ont permis d’évaluer l’expression tissulaire des tissus cancéreux, des protéases et des inhibiteurs de protéases et leur retentissement sur l’expression des cancers. Il s’agit d’études prospectives chez les patients : on évalue le niveau d’expression d’un gène ou d’une protéine dans la tumeur primitive (tumorothèque) puis on les suit prospectivement en analysant leur survie sans récidive. On détermine ainsi d’éventuels liens statistiques entre une protéine ou un gène exprimé par les cellules tumorales et le développement de métastases. → intérêt pronostique


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Exemples de liens trouvés entre protéases et développement de métastase : - Activateur du plasminogène (urokinase) et cancer du sein et de la prostate - Cathepsine D et cancer du sein - Expression des Collagénases de type IV (lames basales) dans les cancers du poumon.

Exemple : pronostic du cancer du sein et contenu en urokinase :

Mesure du pourcentage de survie des patients en fonction du taux initial d’urokinase dans les tumeurs du sein. Plus le taux initial est élevé, plus les patientes meurent rapidement. Cette étude chez l’homme confirme l’importance de l’expression des protéases dans le développement et dans l’agressivité des tumeurs.

D) Utilisation thérapeutiques des inhibiteurs de MMP

Il y a eu beaucoup d’espoir dans le traitement des tumeurs utilisant des inhibiteurs de protéases. Cependant les protéases ont des actions larges et très complexes. Les inhibiteurs actuels n’aboutissent pas à un résultat concret en thérapeutique car le rôle précis de chaque protéase n’est pas encore déterminé.En effet des expériences contredisent l’hypothèse que les protéases ont un effet délétère, favorisant l’apparition de métastases.

Exemple : invalidation de la MMP8 Si on suit le raisonnement vu un peu plus haut on pourrait penser que l’invalidation de la MMP8 est bénéfique. Or l’invalidation de MM8 augmente le développement des tumeurs. En effet chez la souris MMP8 KO on a une augmentation très importante de la taille des tumeurs. De plus on observe une diminution du nombre de neutrophiles.Si on transplante chez des souris KO irradiés, une moelle de souris normale ces souris ne développent plus ou très peu de tumeurs. (présence de polynucléaires neutrophiles) et ont une espérance de vie identique aux souris sauvages. ! L’effet délétère de l’inactivation de la MMP8 provient donc de l’altération de la fonction des neutrophiles. L’action de la MMP8 est donc bénéfique.

Faits vérifiés chez l’homme grâce aux tumorothèques : Les patients présentant un polymorphisme MMP8 muté, provoquant une activité accrue de MPP8 développent moins de métastase que les patients à activité MMP normale. L’augmentation de son activité est donc protectrice vis-à-vis des métastases.

Les résultats décevants des inhibiteurs de MMP

•Les MMP peuvent avoir des effets positifs ou négatifs sur l’invasivité des cancers en fonction –de leur cibles cellulaires différentes (cellules de l’immunité, cellules du stroma tumoral) –des produits de dégradation qu’ils génèrent •Dégradomique : évaluer in vivo tous les produits de dégradations d’une MMP •Les métalloprotéases sont elles encore des cibles thérapeutiques? !Aujourd’hui on s’oriente vers d’autres pistes : bloquer en amont par des inhibiteurs bien plus spécifiques de chaque protéase, ou en aval en agissant sur les voies de signalisations déclenchées par les protéases.


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Ma tête devant les sujets de partiel (Margot on t’aime quand même)

Pour les dédicaces, cf cours 6 de biocell (on a la flemme)


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Fiche de cours 8 Biocell ; Renouvellement des matrices extracellulaires et relation avec les cellules

I) La matrice extracellulaire A) Généralités

La MEC a pour rôle d’assurer la cohésion et le maintien de tous les tissus de l’organisme. Il permet également la migration de certaines cellules (immunité innée) et le stockage de facteurs de croissance. Les tissus les plus riches en MEC sont le cartilage et le tissu osseux.

Dans le cartilage, la MEC est synthétisée par les cellules mésenchymateuses chondrocytaires tandis que dans les autres tissus, la synthèse se fait par des fibroblastes. Cette MEC est en renouvellement constant. L’homéostasie est assurée par : - les cytokines qui vont permettre la production et la sécrétion de protéases (catabolisme) - les facteurs de croissance qui, libérés lorsque la matrice est abimée, va permettre de la reconstruire

(anabolisme)

B) Composition 1) Collagène

Le collagène se compose en une hélice fibrillaire de trois chaines (hétérotrimères ou monotrimères) qui va par la suite s’associer à d’autres hélices pour former des microfibrilles et des fibrilles.

Étape : - Transcription de l’ARNm et la traduction dans le RE - Hydroxylation sur les résidus de lysine et de proline - Glycosylation sur les résidus hydroxyline. - Formation d’une triple hélice en s’associant entre elles - Sécrétion à l’extérieur de la cellule où il va subir un clivage en N-term et permettre ainsi au collagène de

former des microfibrilles et des fibrilles.

Collagène fibrillaire : - Majeur = I, II, III - Mineur = V et XI

Collagène non fibrillaire : IX, X, XII et IV/VII (dans la lame basale) Ce collagène non fibrillaire stabilise le réseau de collagène fibrillaire.

Collagène I Collagène II Collagène III

Maladie de Lobstein (maladie des os de verre) Il y aura une mauvaise trimérisation de l’hélice de collagène ce qui va avoir pour conséquence la formation de collagènes fibrillaires de moins bonne qualité Il y aura donc des troubles de la minéralisation osseuse qui entrainent donc une fragilité osseuse importante avec fractures à répétition

Les signes sont essentiellement ostéo-articulaires avec présence d’anomalies des articulations, de croissance et d’anomalies oculaires - Arthrose précoce - Dysplasie touchant les

vertèbres et les os - Myopie précoce

Maladie de Ehlers-Danlos Il va y avoir atteinte de : - La peau (élasticité, hyperlaxité,

finesse, ecchymoses) - Les vaisseaux car fragilité du tissu

conjonctif qui soutient les parois vasculaires (fractures vasculaires, anévrismes aortiques)

- Les organes internes (colon, utérus)

Les premières manifestations qui mènent au diagnostic sont la rupture de vaisseaux et la rupture des organes internes. Le diagnostic est assez tardif avec une pénétrance plus ou moins importante

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2) Fibres élastiques Les fibres élastiques sont des protéines fibreuses riche en proline possédant des propriétés élastiques grâce aux liaisons de pontage entre les molécules qui permet de ramener la protéine dans son état de décompression, après l’étirement. Ces fibres sont entourées d’un manchon protéique composé de microfibrilles.

La fibrilline joue un rôle dans la maladie de Marfan. Celle-ci relie le complexe de latence de TGFß qui va alors être stocké dans la MEC. Une mutation de la fibrilline va fragiliser cette liaison entrainant un défaut de stockage de TGFß et donc une hyperactivation de celui-ci. Les personnes atteintes de cette maladie sont très grand verticalement et horizontalement. Elles possèdent des doigts graciles avec une arachnodactylie. Il y aura présence d’une hyperlaxité cutanée et des anomalies du tissu conjonctif qui peuvent causer des anévrismes.

3) Protéines adhésives Ces protéines ont un but de médiation entre la cellule mésenchymateuse et les protéines de la MEC. C’est possible grâce à des récepteurs spécifiques qui reconnaissent la séquence RGD des protéines.

La fibronectine Il s’agit d’un homodimère possédant des domaines de liaison à certaines protéines de la MEC (collagène, héparine)

Protéoglycanes Les PG sont des protéines contenant un corps protéique et des GAGs liés par des protéines de liaison. Ce sont de grands agrégats chargés (-) qui permet l’hydratation du tissu par augmentation de la pression osmotique. Il existe des PG membranaires (syndécan, biglycan) qui peuvent servir de récepteurs à certains facteurs de croissance (FGF, TGFß)

4) Lame basale Il existe d’autres protéines matricielles, notamment les protéines de la lame basale qui sépare l’épithélium du tissu conjonctif sous-jacent. La lame basale est composée de collagène IV en réseau qui s’associe avec les laminines.

Il existe des maladies qui touchent ces protéines : - Mutations génétiques non fonctionnelles qui peuvent toucher le collagène IV ou laminine (maladie

tératologique avec dermatose bulleuse qui peut être objectivée sur les modèles animaux) - Maladies acquises notamment les maladies auto-immunes dans lesquelles des auto-anticorps sont dirigés

contre ces protéines (Dans le syndrome de Goodpasture, des anticorps anti-collagène IV sont produits. Il va alors y avoir des atteintes rénales et pulmonaires)

II) Rôle des protéases impliquées dans le renouvellement matriciel

A) Généralités sur les protéases

- Les protéases sont des enzymes protéolytiques qui permettent la dégradation et donc le renouvellement de la MEC. -Synthétisées sous forme immature de pro-enzymes inactives - Leur synthèse et leur action sont étroitement régulées par des inhibiteurs spécifiques. -Elles peuvent activer d'autres protéases → réaction en cascade, ou s’autoactiver.

Spécificité tissulaire des collagènes-1

Type de collagène Distribution tissulaire

I os, peau, tendon, ligament, cornée, organe interne

II cartilage, disques intervertébraux, notocorde, humeur vitrée de l’oeil

III peau, vaisseaux sanguins, organes internes


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Rôles: -Renouvellement de la matrice (un tissu non renouvelé se fragilise avec le temps) -Réparation des plaies ("Shedding" soit clivage et activation des facteurs circulants ou stockés dans la MEC lors de la dégradation -Migration et diapédèse (des leucocytes, et métastases) -Angiogenèse (relargage des facteurs de croissance VEGF stockés dans la MEC) !Effets physiologiques et pathologiques : délétères (maladies tumorales : métastases/ inflammatoires/ dégénératives) et destruction du tissu concerné.

B) Protéases importantes

• Cathepsines -protéases lysosomiales qui fonctionnent à pH acide. Ce sont des enzymes de dégradation intracellulaire pas ou peu sécrétées à l'état physiologique (↑ lors d'inflammation) -Maladies lysosomiales = "maladies de surcharge" dues à une absence de dégradation des protéines intracellulaires et certaines par un mauvais routage des cathepsines.

• Métalloprotéases (extracellulaire, actives à ph neutre)

- grande famille de protéases (actuellement 28 membres). -Capables de dégrader tous les composants de la MEC. - La plupart sont sécrétées, certaines sont liées à la membrane cellulaire : MT-MMP - Redondance, pas de spécificité, →moins d'anomalies car l’organisme compense les états de carence. - Activation en cascade par d'autres MMPs dans la MEC ou par les MT-MMPs à la surface des cellules. -contrôlée (↑ ou ↓) par des facteurs de croissance (inhibition) ou des cytokines (activation) -Elles sont libérées sous forme inactives : le zinc sur le domaine catalytique inhibe leur action en se liant à une cystéine du prodomaine. -Elles ont des inhibiteurs spécifiques : TIMP 1 et 2 qui se lie au domaine catalytique (un TIMP peut inhiber plusieurs métalloprotéases) → Elles ont différentes actions : - Clive adhésions cellule-cellule (cadhérine) et cellule-MEC (intégrines) - Active des pro-peptides, des facteurs de croissance et des cytokines - Joue un rôle dans la migration cellulaire.-Favorise l’angiogénèse et la croissance cellulaire (libération des facteurs de croissance) - Détruit les composants de la MEC

MMP1 (collagénase 1) : clive surtout le collagène I, mais peut aussi en cliver d’autres) MMP3 (stromélysine) : clive surtout le collagène II (mais peut aussi en cliver d’autres)

→ Le système MMP est complexe, redondant (beaucoup de protéases ont le même substrat), non spécifique (une MMP peut avoir plusieurs substrats) et les MMP s’activent les unes les autres ce qui entrainent une difficulté d’interprétation dans les modèles souris KO.

• Les Furines

-Protéases transmembranaires appelées pro-convertases (activent d’autres protéases) Elles sont présentes dans le Trans-Golgi. - Elles clivent et induisent la maturation des récepteurs, hormones, facteurs de croissance et des MMPs

• Les Sérines-protéases (exctracellulaire actives à ph neutre)

-activateurs du plasminogène → Conversion du zymogène (plasminogène) en plasmine (protéase qui peut dégrader tous les composants de la matrice sauf l'élastine et le collagène natif) - Le PAI est l'inhibiteur des Sérines protéases, empêchant la conversion du plasminogène en plasmine


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III)Protéases et métastases A) Approche rationnelle

Cascade métastasique : 1-Croissance in situ, 2- Invasion, 3- Echappement lymphatique, 4- Entrée en circulation, 5- Arrêt et extravasion, 6-Micrométastases et cellules dormantes, 7- Métastases et angiogénèse

Protéases et métastases On sait que la sécrétion de protéases par les cellules tumorales est augmenté +++ On peut le mettre en évidence par PCR ou Westernblot.Ces protéases vont permettre à la cellule tumorale : -la dégradation de la MEC autour de la tumeur (stroma tumoral) -la dégradation de la basale des vaisseaux -la dégradation de la MEC de la tumeur primitive et de l'organe dans lequel va se développer la métastase (mec secondaire) - une libération de la MEC des facteurs de croissance (VEGF, FGF) stimulant l’angiogenèse → Les modèles utilisés sont les tests in vitro sur matrice synthétique et in vivo sur les espèces murines.

B) Modèles in vivo (chez les souris)

Des cellules tumorales sont directement injectées dans le système vasculaire de la souris et on cherche la survenue de modifications en fonction de la présence d’inhibiteurs ou activateurs de protéases On observe qu’avec des activateurs de protéases (uPA ou MMP) on a une augmentation du caractère invasif. (↑taille des lésions métastasiques) Au contraire, avec des inhibiteurs des MMP (TIMP ou PAI) on constate une diminution des capacités invasives.

C) Application humaine et thérapeutiques

- Etude de tumorothèques → on constate que la surexpression des protéases augmente l'agressivité des cancers (et diminution de survie) -Cependant les résultats thérapeutiques sont décevants pour l'instant : les inhibiteurs des protéases manquent de sélectivité, d'efficacité et ont quelques effets secondaires. -De plus, on a découvert que l'invalidation de la MMP8 augmente le développement des tumeurs, donc qu'elle a une action protectrice. → Les métalloprotéases sont-elles encore des cibles thérapeutiques ?

Activateur tissulaire tPA (Tissue Plasminogen activator)

Urokinase uPA

- Circulant - Produit uniquement par les cellules endothéliales - Activité déclenchée par la fibrine (importante pour la coagulation) - Impliqué dans la dégradation du caillot - Utilisation d’un activateur du plasminogène recombinant rtPA en IV comme traitement d’urgence en cas d’IMC ou AVC - Permet de limiter les lésions d’un accident vasculaire - Efficacité +++

- sécrétée sous forme inactive (pro-uPA) par de nombreuses cellules - Récepteur cellulaire spécifique uPAR - La liaison au récepteur entraine l'activation de pro- uPA en uPA. - Régulée par les facteurs de croissance et des oncogènes - Interagit avec les intégrines et peut lier les protéines de la MEC comme la vitronectine - Rôle dans l’adhésion cellulaire


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