MARYSE LESSARD

ÉTUDE DE L'EXPRESSION DES GÈNES ENCODANT· LES SOUS-UNITÉS D'INTÉGRINES a4 ET aS DANS LE CONTEXTE DES 'PROPRIÉTÉS TUMORIGÈNES

ET MÉTASTATIQUES DU MÉLANOME UVÉAL

Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval

dans le cadre du programme de maîtrise en biologie cellulaire et moléculaire pour l'obtention du grade de Maître ès sciences (M.Sc.)

© Maryse Lessard, 2009

FACULTÉ DE MÉDECINE UNIVERSITÉ LAVAL

QUÉBEC

2009

II

Résumé

Les intégrines, des récepteurs trans-membranaires exerçant une fonction importante

dans l'adhésion et la migration cellulaire, pourraient contribuer aux propriétés,

tumorigènes et métastatiques du mélanome uvéa!. Nous avons démontré que le patron

d'expression de certaines intégrines différait entre les lignées tumorales: la sous-unité

d'intégrine a4 est anormalement élevée dans la lignée métastatique H79 alors que

l'expression de la sous-unité a5 est presque entièrement abolie dans des lignées à plus

fort potentiel tumorigène mais non dans les lignées peu agressives. La transcription du

gène a4 étant sous l' influence régulatrice du facteur de transcription (FT) Pax-6, nous

avons démontré que celui-ci n 'est cependant pas l'élément déterminant dans l'expression

aberrante du gène a4. Sachant que le promoteur du gène a5 est sous l'influence des FTs

Spl/Sp3, AP-l et NFI, nous avons démontré que l'agressivité des lignées de mélanomes

pouvait être étroitement liée' à des changements dans l'expression ou les propriétés de ces

FTs.

III

Avant-propos

Les résultàts obtenus pendant mon programme de maîtrise sont divisés en deux

chapitres (chapitre 2 et chapitre ·3) rédigés sous forme traditionnelle. Le troisième

chapitre de ce mémoire fera l'objet d'un prochain article, toujours en préparation au

moment de l'écriture de ce mémoire. Le Dr Sylvain L. Guérin, chercheur au centre de

recherche du CHUL, a agi à titre de directeur de recherche. Steeve Leclerc, assistant de

recherche dans l'équipe du Dr Sylvain L. Guérin, a agi à titre d'assistant de recherche

lors de la réalisation des travaux présentés dans ce mémoire.

Le premier chapitre de ce mémoire contient une introduction ainsi que les objectifs des

travaux présentés dans les chapitres suivants. Le second chapitre s'intitule: « L'influence

de Pax -6 sur la transcription du promoteur a4 dans le mélanome uvéal » et présente les

résultats d'une première étude concernant plus particulièrement la sous-unité d'intégrine

a4 dans le contexte de la progression métastatique du mélanome uvéa!. J'ai réalisé la

majeure partie des expériences de cette étude et quelques-unes avec l'aide de Solange

Landreville, PhD, étudiante dans le laboratoire du Dr Christian Salesse (Unité de

recherche en Ophtalmologie du CHUL) et de Steeve Leclerc, assistant de recherche,

MSc, dans le laboratoire du Dr Guérin. Le troisième chapitre est intitulé: « Influence de

la sous-unité a5 dans les propriétés tumorigènes du inélanome uvéal» et présente les

résultats d'une seconde étude portant sur la sous-unité d'intégrine a5 au niveau du

potentiel tumorigène du mélanome uvéa!. J'ai réalisé toutes les expériences de cette étude

dont certaines avec l'aide de Solange Landreville, PhD, étudiante dans le laboratoire du

Dr Salesse, et de Manon Gaudreault, assistante de recherche, PhD, dans le laboratoire du

Dr Guérin. Finalement, le dernier chapitre remet en contexte les conclusions tirées des

chapitres précédents ainsi que les perspectives qui sont ressorties suite à ce projet.

IV

Remerciements

Dans un premIer temps, j'aimerais remerCIer mon directeur de recherche, le Dr

Sylvain Guérin, pour ses conseils, son aide précieuse, mais surtout, sa présence tout au

long de la réalisation de cette maîtrise. Sa motivation et son soutien m'ont non seulement

permis ~e me dépasser tout au long de ces années, mais de le faire avec grande

satisfaction et fierté.

Un gros merci pour l'équipe Guérin et tout particulièrement Steeve Leclerc pour son

aide technique et sa façon extraordinaire ' de répondre à nos milliards de questions.

J'aimerais aussi remercier Karine Zaniolo qui m'a prise sous son aile dès mon

commencement. Un gros merci à Manon Gaudreault et Marie-Ève Gingras, pour leur

support moral, leur aide tout au long de ces années et avec qui j'ai pu partager de

nombreuses confidences. Merci les filles d'avoir su me poser les bonnes questions au bon

moment!

Je tiens également à remerCIer le Dr Christian Saless'e et son équipe, Solange

Landreville, Jennifer Gagné et Marj orie Bergeron pour leur précieuse collaboration dans

la réalisation de ce projet.

Je tiens à remercier le réseau vision, la banque d'Yeux du CHUL, la fondation de la

recherche en santé du Québec (FRSQ) et la Fondation Georges Phénix pour leur soutien

financier.

Finalement, merci à mes amis et à ma famille qui ont cru en moi du début à la fin. Un

merci tout spécial à mes parents et mon frère qui ont toujours été là pour moi et qui m'ont

toujours supportée. Un dernier merci, mais non le moindre, à mon conjoint, Pierre-Michel

Vallée qui m'a soutenue pendant les moments les plus difficiles et qui a toujours su dire

les mots pour me rassurer et m'encourager.

À tous, merci énormément!

v

Table des matières

Résumé ............................................................................................................................. 11

Avant-propos ................................................................................................................ 111

Remerciements .................................................................... : ........................................ IV

Table des matières ....................................................................................................... V

Liste des figures et tableaux .................................. .................................................. IX

Liste des abréviations ............................................................................................... XI

Chapitre 1

1 Introduction ................................................................................................................. 1

1.1 Généralités sur le cancer

1.2 Le mélanome uvéal 1.2.1 Généralités 1.2.2 Anatomie générale de l' œil 1.2.3 Type de mélanomes du tractus uvéal

1.2.3.1 Mélanomes de l'iris 1.2.3.2 Mélanomes du corps ciliaire 1.2.3.3 Mélanomes choroïdiens 1.2.3.4 Type cellulaire

1.2.3.4.1 Profil fusiforme 1.2.3.4.2 Profil épithélioïde 1.2.3.4.3 Profil mixte

1.2.4 Causes 1.2.5 Diagnostic et traitement

1.2.5.1 Diagnostic de la tumeur primaire 1.2.5.2 Choix du traitement

1.2.5.2.1 Notion de taille 1.2.5.2.2 Autres traitements possibles

1.2.6 Facteurs pronostics 1.2.6.1 La taille de la tumeur 1.2.6.2 Le type cellulaire et l'agressivité

1.2.7 Métastases 1.2.7.1 Processus métastatique 1.2.7.2 Pronostic et cause

1

3 3 3 5 5 6 6 6 7 7 7 8 8 8 9 9

10 10 10 Il Il Il 12

VI

1.3 Les molécules d'adhésion 14 1.3.1 Les sélectines 14 1.3.2 La superfamille des immunoglobulines 16 1.3.3 Les cadhérines 16 1.3.4 Les intégrines 17

1.3.4.1 Structure des intégrines 17 1.3.4.1.1 Sous-unité a 19 1.3.4.1.2 Sous-unité B 20

1.3.4.2 Ligands des intégrines 21 1.3.4.2.1 Matrice extracellulaire 21

1.3.4.3 Rôles des intégrines 22 1.3.4.4 Signalisation par les intégrines 23

1.3.5 La progression tumorale 25 1.3.6 L'intégrine a4B1 26

1.3.6.1 Structure de l'intégrirte a4~1 27 1.3.6.2 Régions régulatrices du gène a4 27 1.3.6.3 Le facteur de transcription Pax-6 29

1.3.6.3.1 La famille des gènes PAX 29 1.3.6.3.2 Pax-6 29

1.3.7 L'intégrine a5B1 31 1.3.7.1 Régions régulatrices du gène a5 32

1.4 Objectifs des travaux de recherche 34 1.4.1 Influence de Pax-6 sur l'activité du promoteur de la sous-unité a4 36 1.4.2 Influence .de la sous-unité a5 dans les propriétés tumorigènes du 36

mélanome uvéal

Chapitre 2

2 Influence de Pax-6 sur la transcription du promoteur ............................. 37

04 dans le mélanome uvéal

2.1 Introduction

2.2 Matériel et méthodes 2.2.1 Culture cellulaire 2.2.2 Extraits nucléaires et immunobuvardage de type western 2.2.3 Retard sur gel (EMSA) 2.2.4 Transfections transitoires

2.3 Résultats 2.3.1 Expression du facteur de transcription Pax-6 dans le

mélanome uvéal 2.3.2 Le facteur de transcription Pax-6 peut lier la séquence

de la région promotrice a4.1

37

38 38 38 39 40

41 41

41

1

1·

VII

2.3.3 Pax-6 est un répresseur de l'activité du promoteur a4 43

2.4 Discussion 46

Chapitre 3

3 Influence de la sous-unité aS dans les propriétés ......................................... 50 tumorigènes du mélanome uvéa)

3.1 Introduction

3.2 Matériel et méthodes 3.2.1 Culture cellulaire 3.2.2 Culture cellulaire en agar mou 3.2.3 Transfections transitoires 3.2.4 Extraction d'ARN et analyse en RT-PCR 3.2.5 Extraits nucléaires et immunobuvardage de type western 3.2.6 Retard sur gel (EMSA)

50

52 52 52 53 53 55 55

3.3 Résultats 57 3.3.1 Potentiel tumorigène et capacité des cellules à générer 57

des colonies en agar mou 3.3.2 Activité transcriptionnelle du promoteur du gène a5 59 3.3.3 Niveau d'expression des transcrits encodant les facteurs de 60

transcription SPI, SP3, AP-1 et NFI dans les lignées de mélanomes 3.3.4 Niveau d'expression des facteurs de transcription SPI, SP3, 62

AP-1 et NFI dans les lignées T97, T98, T108 et Tl15 3.3.5 Capacité de liaison des facteurs de transcription SP 1, AP-1 64

et NFI dans les lignées T97, T98, T108 et Tl15 3.3.6 Influence des facteurs SPI, AP-1 et NFI dans les lignées T97 69

et T108

3.4 Discussion 73

Chapitre 4

4 Conclusion .................................................................................................................. 80

4.1 Résumé 4.1.1 Influence de Pax -6 sur le promoteur du gène a4

80 80

4.1.2 Influence de la sous-unité a5 dans les propriétés tumorigènes du mélanome uvéal

4.2 Perspectives de recherche

VIII

81

83

Références bibliographiques ................................................................................... 85

Liste des figures et tableaux

Chapitre 1

Figure 1.1 Figure 1.2 Figure 1.3 Figure 1.4 Figure 1.5 Figure 1.6 Figure 1.7 Figure 1.8 Figure 1.9 Figure 1.10 Figure 1.11 Figure 1.12 Figure 1.13 Figure 1.14 Figure 1.15 Figure 1.16

Chapitre 2

Figure 2.1

Figure 2.2 Figure 2.3 Figure 2.4

Chapitre 3

Tableau 3.1 Tableau 3.2

Figure 3.1 Figure 3.2 Figure 3.3 Figure 3.4

Progression tumorale La structure générale de l'œil humain Différents types de mélanomes Différentes morphologies des cellules de mélanome uvéal Processus métastatique Molécules d'adhésion Structure générale des intégrines La famille des intégrines Signalisation par les intégrines Région régulatrice du gène a4 humain Éléments régulateurs Famille des gènes Pax PAX6 et PAX6 (Sa) Région régulatrice du gène aS humain Analyse en cytométrie de flu'x Expression des gènes encodant les sous-unités d'intégrines a4, aS et a6

Niveau d'expression du facteur de transcription Pax-6 dans les lignées de mélanomes Capacité de liaison de Pax-6 à la séquence régulatrice a4.1 Activité transcriptionnelle du promoteur du gène a4 Influence de Pax-6 sur l'activité du promoteur du gène a4

Résumé des cas d'où proviennent les lignées cancéreuses Séquences des amorces utilisées pour le RT -PCR . semi-quantitatif Morphologie cellulaire Indépendance à l'àncrage sur substrat d'agar mou Activité transcriptionnelle du promoteur du gène aS Niveaux des transcrits endogènes encodant la sous-~nité aS et des facteurs de transcription SpI, Ap-l et NFI

IX

Page

1 4 6 7

12 15 17 18 23 28 28 29 30 33 35 35

41

42 43 45

50 54

57 58 60 61

Figure 3.5.

Figure 3.6

Figure 3.7

Figure 3.8

Figure 3.9 Figure 3.10

Niveau d'expression des facteurs de transcription SpI, NFI et AP-I dans les lignées de mélanomes Capacité de liaison des facteurs de transcription SpI et Sp3 dans les lignées de mélanomes Capacité de liaison du facteur de transcription AP-I dans les lignées de mélanomes Capacité de liaison du facteur de transcription NFI dans les lignées de mélanomes Influence des sites SpI proximal et distal sur le promoteur aS Influence des facteurs de transcription SpI, AP-l et NFI sur le promoteur basal aS

x

63

65

66

68

70

71

Liste des abréviations

A ADN

AP-l

ARN

Asp

ATP

Bp

C

CAT

Cd49d1CD29

CIEBP

CIITA

Crk

DMEM

EDTA

EGF

EMSA

EPR

FACS

FAK

Fra

FT

FRE

G

GAPD

GFP

Glu

Gly

GRB

hGH HMBS

iARN

ICAM

Adénine

Acide désoxyribonucléique

Activator protein (protéine activatrice)

Acide ribonucléique

Aspartate

Adénosine triphosphate

Binding protein (protéine de liaison)

Cytosine

Chloramphénicol acétyl-transférase

Intégrine a4B 1

CCAAT/Enhancer Binding Prote in (protéine qui lie la séquence CCAAT)

class II, major histocompatibility complex, transactivator (transactivateur du complexe majeur d'histocompatibilité classe II) cdc-2 related kinase (kinase s'apparentant à cdc-2)

Dulbecco's modified Eagle's medium

Acide éthylène-diamine-tétraacétique

Epidermal growth factor (facteur de croissance épidermique)

Electrophoretic mobility shift assays (Rétention en gel)

Épithélium pigmentaire rétinien

Fluorescence-activated cell-sorting (Cytométtie de flux)

Focal adhesion kinase (kinase d'adhésion focale)

Fos-related antigen (antigène qui s'apparente à Fos)

F acteur de transcription

Fibronectin responsive element (élément de réponse à la fibronectine)

Guanine G lycéraldéhyde-3 -phosphate déhydrogénase

Green fluorescent protein (protéine fluorescente verte)

Glutamine

Glycine

Growth factor receptor -bound protein (protéine de liaison des récepteurs de facteurs de croissance)

Human growth hormone (hormone de croissance humaine)

hydroxyméthylbilane synthase

ARN interférent

Intercellular adhesion molecule (molécule d'adhésion intercellulaire)

XI

Ile

ILK

lm

Kb

KDa

Leu LM-peR MAPK

MeN

MEC

NCAM

NFI

NK NS

Pax

PCR

PKB

PLC

PNK PSI

PST Ras

RGD

rpm

RT-PCR SDSPAGE Ser

Shc

shRNA

SOS

Sp

Src

SSC

T

TTT Val

Isoleucine

Integrin linked kinase (kinase liée aux intégrines)

Initiateur

Kilobase

Kilodalton

Leucine ligation mediated PCR (peR médié par ligation)

Mitogen-activated prote in kinase (protéine kinase activée par des agents mitogènes)

Mélanocytes choroïdiens normaux

Matrice extracellulaire

Neural cell adhesion molecule (molécule d'adhésion des cellules neurales)

Nuclear factor 1 (facteur nucléaire 1)

N atural killer (tueuse naturelle) Non-spécifique

Paired box

Polymerase chain reaction (Réaction en chaîne de la polymérase)

Protéine kinase B

Phospholipase C Polynucléotide kinase Plexine/Semaphorine/Integrine

Pro line/ sérine/tyrosine

Retrovirus-associated DNA sequence (rétrovirus associé à l'ADN)

Arginine/ glycine/acide aspartique

Révolution par minute Reverse-transcriptase PCR (PCR par transcriptase inverse) Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

Sérine

Src homology 2 domain-containing (domaine contenant une région d'homologie 2 avec Src)

Short hairpin RNA (ARN en épingle à cheveux)

Son of sevenless

Specificity protein (protéine spécifique)

Sarcoma Rous cancer (cancer du sarcome de Rous)

Super-complexe

Tyrosine

Thermothérapie à travers la pupille

Valine

XII

VCAM

VLA-4

Vascular cell adhesion molecule (molécule d'adhésion vasculaire)

Very-late antigen 4

XIII

1

1. INTRODUCTION

1.1 Généralités sur le cancer

À tout moment de notre vie, des mutations surviennent à l'intérieur du génome des

cellules constituant notre corps. Ce phénomène amène un dérèglement au niveau du cycle

cellulaire, de la croissance, de la différenciation en plus de la mort cellulaire programmée

appelée apoptose (Park, Bissell et al. 2000). Notre corps élimine généralement ces cellules

grâce à nos cellules immunitaires telles que les macrophages et les cellules NK (<< natural

killer »), mais il arrive parfois qu'elles deviennent résistantes, les rendant aptes à .se diviser

indéfiniment. Les principales caractéristiques des cellules cancéreuses sont d 'abord leur

caractère d'immortalité et leur pouvoir absolu de division cellulaire, mais aussi, leur

capacité à envahir d'autres tissus du corps humain (Mareel and Leroy 2003) (Figure 1.1).

Figure 1.1 - Progression tumorale. (a) Cellule acquérant une mutation; (b) Prolifération; (c) Cellule acquérant une seconde mutation; (d) Capacité invasive du cancer; (e) Infiltration d'une cellule dans un vaisseau sanguin; (f) Accumulation de cellules cancéreuses formant un petit embole dans le vaisseau sanguin (image tirée de Louvard et Thiery, 2003) . .

Les cellules cancéreuses possèdent également la capacité de modifier ' leur

environnement (Hanahan and Weinberg 2000), leur permettant ainsi de proliférer et de

progresser pour mener à la fonnation d'une tumeur maligne. Des cancers peuvent survenir

dans toutes les cellules du corps et leur degré d'agressivité peut varier selon le type

cellulaire atteint. Ils peuvent, par exemple, atteindre des endroits essentiels à la survie, tels

2

que le foie, le cerveau ou le pancréas. Il arrive tout de même parfois qu'ils atteignent des

endroits plus subtils et d'apparence moins dangereux. En effet, certains cancers peuvent

parfois mettre en péril la survie des patients en dépit du fait qu'ils semblent inoffensifs.

L'œil, cet organe des sens d'une incroyable complexité, en est un bon exemple, car bien

qu'il ne soit pas nécessaire à la survie, il revêt tout de même son importance notamment

dans la qualité de vie des patients.

Les cancers de l'oeil ne sont certainement pas parmi les cancers les plus fréquents dans

la population adulte. À titre indicatif, ces cancers représentent 0,01% de tous les cancers

répertoriés aux États-Unis et en Angleterre (Hakulinen, Teppo et al. 1978). Cependant,

l'étude des mécanismes sous-j acents à ses propriétés tumorigènes et métastatiques peut

aider à comprendre la progression d'autres formes de cancers et permettre d' en élucider

certaines particularités partagées.

3

1.2 Le mélanome uvéal

1.2.1 Généralités

Le mélanome uvéal correspond au type de tumeur intraoculaire le plus fréquent dans la

population adulte. Malgré sa rareté, environ 50% des patients atteints de ce type de cancer

trouveront la mort dans, au plus, les quinze années suivant le diagnostic initial de

mélanome uvéal (Kincaid 1998). Le mélanome uvéal n'est pas le cancer le plus commun,

son incidence annuelle n'étant que d'environ 7,3 nouveaux cas par million d'habitants

(Vidal, Bacin et al. 1995). Bien qu'une personne de tout âge et de toute race peut en être

atteinte, il semble y avoir une prépondérance pour le caucasien adulte âgé de 50 à 70 ans

(Hungerford 1995; Kincaid 1998). Ce cancer a déjà été diagnostiqué chez des patients de

moins de 30 ans, ces cas ne représentant cependant que 4% de l'ensemble des individus

atteints (McCartney 1995). De plus, ce type de cancer est très rare chez les noirs et les

asiatiques (McCartney 1995). En effet, il est retrouvé environ 150 fois plus fréquemment

chez .les individus blancs que chez les noirs (Hakulinen, Teppo et al. 1978; Singh and

Topham 2003). Finalement, il semble plus fréquent chez les personnes présentant un iris

pâle et des cheveux blonds que chez ceux ayant des yeux et des cheveux bruns ou plus

foncés (Shields, Annesley et al. 1977; Guenel, Laforest et al. 2001).

1.2.2 Anatomie générale de l'œil

L' œil est le seul organe des sens qui permet à l'animal de transformer la lumière en

images pour lui permettre de voir. Comme c'est le cas chez la plupart des mammifères,

l' œil humain comporte trois tuniques : la sclère, l'uvée et la rétine (Figure 1.2). La sclère,

ou sclérotique, est la partie blanche externe de l'œil qui est prolongée par la cornée et qui

protège l' œil des agressions mécaniques en plus de maintenir la pression intraoculaire.

L'uvée, ou tractus uvéal, est une tunique vasculaire pigmentée qui comprend l'iris~ le corps

ciliaire et la choroïde (Kincaid 1998). Finalement, la rétine comprend des cellules

ganglionnaires, des cellules bipolaires, des intemeurones (cellules amacrines et

horizontales), des photorécepteurs (cônes et bâtonnets), des . cellules de soutien (cellules

4

gliales de Müller) ainsi qu'un épithélium pigmentaire rétinien (EPR) pour permettre la

transformation de la lumière en images par notre cerveau (Young 1976).

Corps dliaire

Ugament

suspenseur

Cornée

Iris

Pupille

Humew­aqueuse

Cristallin

Humeur vitrée

Uvée

r sdère

J. Choroide

Fovéa

Poin~

aveugle

Figure 1.2 - La structure générale de l'œil humain. (adaptée de Addison, Wesley et Longman, 1999).

De la partie antérieure vers la partie postérieure, l' œil se compose premièrement de la

cornée, une lentille transparente qui le protège de l'environnement extérieur et est capable

de concentrer la lumière sur le cristallin. On retrouve ensuite l'humeur aqueuse, un liquide

à faible viscosité responsable en partie du maintien de la pression intraoculaire et de la

forme globulaire de l'œil. L'iris, partie intégrante de l'uvée, est une membrane contractile,

tel un diaphragme, qui permet de modifier la quantité de lumière . pénétrant l'œil en

modifiant la taille de son orifice central, la pupille (Kincaid 1998). Le cristallin est une

lentille biologique biconvexe qui permet la mise au point et la formation d'une image sur la

rétine. Le corps ciliaire et la choroïde sont des structures musculaires qui se regroupent

avec l'iris pour former le tractus uvéal (Kincaid 1998). Le corps ciliaire permet

5

l'attachement du cristallin à la choroïde et cette dernière, richement vascularisée, est le tissu

nourricier de l' œil apportant l'oxygène et les nutriments aux cellules (Kincaid 1998). Elle

se compose principalement de quatre couches : la lamina fusca (suprachoroïde), le stroma,

la choriocapillaris et la membrane de Bruch (Kincaid 1998). La première couche est

constituée d 'un tissu ,?onjonctif élastique, de vaisseaux sanguins ainsi que de cellules

pigmentées appelées mélanocytes. Ces cellules présentent une morphologie dendritique et

contiennent le mélanosome qui est responsable de la synthèse de la mélanine et qui donne

la couleur brunâtre caractéristique à la choroïde (Boissy 1988). Le stroma contient

également plusieurs vaisseaux sanguins, mais de plus petit diamètre. La troisième couche

(choriocapillaris) contient un réseau fin de capillaires qui assure l'alimentation de la couche

externe de la rétine. La quatrième et dernière couche est la membrane de Bruch qui

représente la couche interne de la choroïde directement accolée à la couche pigmentaire de

la rétine et qui forme le lien entre cette dernière et la choroïde. Finalement, le point aveugle

ou tache aveugle correspond à l'endroit sur la rétine où s'insère le nerf optique et qui

permet de transmettre l'information visuelle jusqu'au cortex visuel, nous permettant ainsi

de voir des images (Schraermeyer, Addicks et al. 1998).

1.2.3 Types de mélanomes du tractus uvéal

Le mélanome uvéal peut se développer près de l'iris, près du corps ciliaire ou sur la

choroïde (Hungerford 1995).

1.2.3.1 Mélanomes de l'iris

Les mélanomes situés près de l'iris (Figure 1.3 A) comptent pour environ 3% de tous les

mélanomes du tractus uvéal malins (Damato 2006). Ce type de mélanome peut adopter un

patron nodulaire ou étendu avec un pourtour circonscrit ou diffus (Hungerford 1995). Étant

donné sa localisation, ce type de mélanome est le plus évident à repérer et les traitements

qui y sont associés varient beaucoup en fonction de son patron cellulaire (Kersten, Tse et al.

1985).

6

1.2.3.2 Mélanomes du corps ciliaire

Les mélanomes situés près du corps ciliaire (Figure 1.3 B) représentent

approximativement 7% de tous les cas de mélanome uvéal (Damato 2006). Les tumeurs

localisées près du corps ciliaire peuvent également être nodulaires ou diffuses. Il s 'agit du

type le plus difficile à diagnostiquer et la tumeur est souvent découverte à un stade plus

avancé, c'est-à-dire lorsqu'elle cause des troubles visuels ou lorsqu'elle produit un

détachement de la rétine suite à l'envahissement de la choroïde (Hungerford 1995).

1.2.3.3 Mélanomes choroïdiens

Le mélanome choroïdien (Figure 1.3 C) est celui le plus fréquemment observé (Scotto,

Fraumeni et al. 1976), correspondant à près de 90% de tous les cas répertoriés (Damato

2006). La plupart de ces tumeurs adoptent un patron nodulaire et une forte corrélation

existe entre la taille de la tumeur et le faible taux de survie des patients.

Figure 1.3 - Différents types de mélanomes. (À) Mélanome situé au niveau de l'iris; (B) Mélanome situé près du corps ciliaire; (C) Mélanome situé dans la choroïde (images tirées de www.etrf.org; "looc.org.uk; www.kimme1cancercenter.org).

1.2.3.4 Type cellulaire

Il est également possible de diviser les différents types de mélanomes du tractus uvéal

selon le ou les types cellulaires qui les constituent. Il existe trois grands profils qui peuvent

caractériser l ' apparence d 'une tumeur, soient les profils épithélioïde, fusiforme et mixte.

7

1.2.3.4.1 Profil fusiforme

Les cellules dites fusiformes sont plus longues et présentent des noyaux rayés (Figure

1.4 A). Cette classe se subdivise en deux types distincts, soit le type fusiforme A et

fusiforme B (Kincaid 1998). Le premier type (A) est le plus près du type bénin et se

présente avec un noyau plus fin. Le second type possède un noyau à forme plus arrondie

(Kincaid 1998).

1.2.3.4.2 Profil épithélioïde

Le profil dit épithélioïde présente des cellules plus volumineuses, ayant une forme

d'apparence cubique avec un plus grand volume de cytoplasme ainsi qu'un plus grand

noyau (McCartney 1995) (Figure 1.4 B). Ce profil n'est toutefois pas associé à un très bon

pronostic (Kincaid 1998)· et signifie souvent une plus grande agressivité des cellules

cancéreuses.

1.2.3.4.3 ProfIl mixte

Le profil mixte contient à la fois des cellules fusiformes et des ~ellules épithélioïdes. On

peut même associer l'agressivité de la tumeur avec le rapport entre les deux types de

cellules, car il semblerait que plus la tumeur contient de cellules épithélioïdes, plus elle est

susceptible d'être agressive (McLean, F oster et al. 1977).

Figure 1.4 - Différentes morphologies des cellules de mélanome uvéal. (A) Cellules fusiformes; (B) Cellules épithélioïdes (images tirées de Kincaid, 1998).

8

1.2.4 Causes

Le cancer apparaît suite · à la transformation des mélanocytes, cellules pigmentaires

situées dans le tractus uvéal. Ces dernières sont reconnues pour sécréter deux types de

mélanine soit l'eumélanine, d'une coloration qui va du beige au noir, et la phéomélanine,

. plus pâle et davantage jaune et rougeâtre. (Boissy 1988). Contrairement à ce qu 'on pourrait

penser, les facteurs environnementaux ne semblent pas Jouer un rôle dans la formation de

ce cancer. Plus particulièrement, les rayons ultraviolets connus pour endommager et

augmenter les risques de cancer de la peau, ne semblent pas prédisposer au développement

de la tumeur uvéale (Dolin, Foss et al. 1994; Moan, Porojnicu et al. 2008) et ne semblent

pas y être associés directement (Lutz, Cree et al. 2005). Toutefois, le mélanome uvéal

semble fortement associé aux mélanocytoses oculaires, notamment le Naevus d 'Ota, une

prolifération mélanocytaire ocul~ire et dermique touchant la conjonctive et les paupières en

plus de la peau adjacente, des sclérotiques et des muscles oculaires (Gonder, Shields et al.

1982).

Malgré la présence de quelques cas familiaux de mélanome uvéal répertoriés

(Oosterhuis, Went et al. 1982), ce type de cancer ne semble pas nécessiter une

prédisposition génétique et apparaît comme étant une tumeur sporadique (Kincaid 1998).

De plus, aucune mutation aléatoire sur plusieu~s chromosomes n'a été répertoriée, mais une

monosomie du chromoso~e 3 et ~ne duplication du chromosome 8q semblent davantage

associées au mélanome uvéal du corps ciliaire (Sisley, Cottam et al. 1992).

1.2.5 Diagnostic et traitements

1.2.5.1 Diagnostic de la tumeur primaire

La plupart des tumeurs du tractus uvéal sont généralement asymptomatiques et peuvent

souvent être dépistées pendant un simple examen de routine chez l' optométriste ou

l'ophtalmologiste (Kincaid 1998). Bien que les patients atteints ne présentent

habituellement aucun symptôme, les mélanomes situés près de l'iris entraînent parfois un

glaucome secondaire tandis que ceux situés près du corps ciliaire causent également de

9

l'astigmatisme ou des cataractes (Damato 2006). Qui plus est, les patients ayant un

mélanome choroïdal souffrent parfois aussi d'une perte de l'acuité visuelle ou d'une vision

embrouillée due au bris de l' épithélium pigmentaire rétinien ou du décollement de la rétine

(Damato 2006).

1.2.5.2 Choix du traitement

Traditionnellement, les patients atteints d'un mélanome uvéal subissaient l' énucléation

complète de l'œil touché. Aujourd'hui, certains centres spécialisés pour ce type de cancer

privilégient des techniques moins radicales permettant de conserver l'œil si les conditions

sont favorables. Il arrive même que le patient réussisse à conserver une certaine capacité

visuelle de l'œil touché. Néanmoins, et en dépit des avancées technologiques, il arrive que

le moyen choisi soit encore l' énucléation, mais combinée à d 'autres avenues afin de

s'assurer d'éradiquer complètement la tumeur. Le choix parmi les divers traitements

possibles est fait en fonction de plusieurs critères précis pouvant influencer les diverses

alternatives qui s'offrent au patient. De ces critères, on note plus particulièrement la taille et

l'origine de la tumeur, le patron de croissance, l'état du second œil, l'âge ainsi que la santé

générale du patient (Hungerford 1995).

1.2.5.2.1 La notion de taille

La notion de taille est un critère très important et précis qui peut donner beaucoup

d'indices sur la conduite à prendre pour détruire la tumeur. Un mélanome uvéal est

considéré comme petit si son diamètre est inférieur à 10 mm et possède une épaisseur

maximale de 3 mm; moyen si son diamètre se situe entre 10 et 15 mm et son épaisseur

entre 3 et 5 mm et, finalement, il est considéré comme gros s'il excède 15 mm de diamètre

et 5 mm d'épaisseur (McCartney 1995). Si la tumeur est de petite taille (moins de 5 mm),

les médecins préféreront une période de surveillance à tout autre traitement afin de voir

l'évolution de la tumeur (McCartney 1995). Ce choix peut s'expliquer en partie par la

controverse existant sur le fait que l'énucléation pourrait favoriser la migration de cellules

canc~reuses à travers les vaisseaux sanguins et la formation de métastases au niveau d'un

site secondaire (Zimmerman, McLean et al. 1978).

10

1.2.5.2.2 Autres traitements possibles

Les diverses options qui ont évolué parallèlement à l'énucléation incluent la

radiothérapie par plaque, la radiothérapie avec l'aide de particules chargées, la

photocoagulation par laser, la thermothérapie à travers la pupille (TTT) , l'ablation locale

(Journee-de Korver and Keunen 2002), la chimiothérapie (Char 1989), la cryothérapie

(Fraunfelder, Boozman et al. 1977) et l ' immunothérapie (McLean, Berd et al. 1990). Ces

nouvelles techniques ont donc permis de restreindre l'énucléation aux plus grosses tuineurs,

à celles ne répondant pas aux traitements ou aux tumeurs récurrentes. Cette pratique,

autrefois employée dans 95% des cas, a vu son utilisation diminuer drastiquement jusqu'à

moins d'un cas sur cinq aujourd'hui (21 % des cas en 1991) (Shields, Shields et al. 1991 ;

Seregard 1996) afin de non seulement préserver la qualité de vie des patients, mais

également, de prévenir d'éventuelles complications qui pourraient survenir suite à

l'énucléation. Depuis la dernière décennie du 20e siècle, la combinaison de ces différentes

options demeure encor~ et toujours le meilleur traitement possible pour les patients atteints

d'un mélanome uvéal (De Potter, Shields et al. 1996; Kincaid 1998; Shields, Shields et al.

1998).

1.2.6 Facteurs pronostics

L'espérance de vie des patients atteints d'un mélanome uvéal varie beaucoup d'un

individu à l'autre. En effet, environ la moitié des persoruies atteintes trouveront la mort

dans les quinze années suivant le diagnostic (Kincaid 1998). L'évolution de la maladie et

l'avenir du patient dépendent beaucoup de la taille et de la localisation de la tumeur et si

cette dernière a été détectée de façon précoce.

1.2.6.1 La taille de la tumeur

La taille de la tumeur informe généralement sur l'espérance de vie du patient: une

masse plus importante indique habituellement un mauvais pronostic (Flocks, Gerende et al.

1955) et une tumeur ayant un diamètre inférieur à 7 mm est associée à une diminution dans

le risque de décès. Le taux de survie moyen après 10 ans est d'environ 85,1% pour les

petites tumeurs tandis qu'il diminue à 73% chez les patients ayant une tumeur moyenne

Il

(Seregard 1999). Le taux de mortalité moyen après 5 ans pour les patients avec une

moyenne tumeur est d'environ 6-10% et grimpe à 22-27% pour ceux qui ont des tumeurs

de plus grande surface (Journee-de Korver et Keunen 2002). Un mélanome uvéal situé sur

l'iris semble être associé à un taux de mortalité inférieur à ceux situés sur la choroïde ou sur

le corps ciliaire (Hungerford 1995). Toutefois, ceci pourrait être lié au fait qu'étant situé sur

l'iris, il serait plus facilement et plus précocement détectable. La taille imposante de la

tumeur au diagnostic est certainement associée à un mauvais pronostic, mais sa position

antérieure semble également jouer contre la survie (Shammas et Blodi 1977). De plus, une

tumeur ayant un volume inférieur à 1 cm3 situé près du corps ciliaire laisse présager

habituellement de bonnes chances de survie pour le patient alors qu'une tumeur de même

envergure située sur la choroïde annonce un mauvais pronostic (Sorensen, Gamel et al.

1993).

1.2.6.2 Le type cellulaire et l'agressivité

Le type cellulaire et l'agressivité sont également de bons indicatifs pour prédire les

chances de survie du patient (McCartney 1995). Une tumeur démontrant des cellules

épithélioïdes semble davantage agressive qu'une tumeur à cellules fusiformes (McLean,

Foster et al. 1977; Shammas et Blodi 1977). Qui plus est, comme les tumeurs épithélioïdes

sont souvent associées aux tumeurs de plùs grands gabarits, il ne fait aucun doute que ces

deux facteurs sont indicateurs d'un' mauvais pronostic pour le patient (Davidorf et Lang

1975).

1.2.7 Métastases

1.2.7.1 Processus métastatique

Les métastases résultent de la migration des cellules cancéreuses, qui se sont détachées

de la tumeur primaire, à travers la paroi des vaisseaux sanguins où elles peuvent alors

gagner accès à d'autres organes ou tissus de l'organisme (Figure 1.5). Le diagnostic de

métastases secondaires est souvent accompagné d'un mauvais pronostic de survie.

Grossièrement, la coopération temporelle et anatomique entre les . molécules d'adhésion

12

cellulaire, les protéases qui dégradent la matrice extracellulaire et certains peptides générant

la vascularisation tumorale est nécessaire pour permettre le développement de métastases

(Ahmad et Hart 1997).

A

Figure 1.5 - Processus métastatique. (A) Des cellules cancéreuses se détachent de la tumeur primaire et ga"gnent accès à la circulation sanguine; (B) Les cellules cancéreuses envahissent ensuite l'organe secondaire (image tirée de Sanofi-aventis, 2008).

De façon générale, le processus métastatique semble suivre un patron séquentiel qui

demeure sensiblement le même d'une tumeur à une autre. Celui-ci "débute par la croissance

de cellules néoplasiques et la néovascularisation de la tumeur. Par la suite, il. y a

détachement d'une cellule cancéreuse de la tumeur primaire, suivi de l'intravasation de

celle-ci dans un vaisseau sanguin (Figure 1.5 A). La cellule cancéreuse procède à

l'extravasation du vaisseau pour pénétrer à l'intérieur de l'organe secondaire et, finalement,

s 'y établir et y proliférer (Fidler 1991; Ahmad et Hart 1997) (Figure 1.5 B).

1.2.7.2 Pronostic et causes

Dans le cas du mélanome uvéal, un patient sur deux sera atteint de métastases

secondaires et dans 90% des cas, elles nidifieront au foie (Diener-West, Hawkins et al.

13

1992). Lorsque des métastases sont détectées, l'espérance de vie du patient se trouve

réduite à quelques mois et dépasse très rarement deux ans (Leyvraz, Spataro et al. 1997). Le

mélanome uvéal situé près de l' iris semble moins prédisposé à générer des métastases, mais

l~ résection de la tumeur pourrait permettre à certaines cellules cancéreuses de proliférer et

de traverser la barrière des vaisseaux sanguins pou~ ensuite envahir d'autres organes

(Bechrakis et Lee 1991). Toutefois, certaines évidences semblent démontrer que des

métastases invisibles à l'œil nu seraient présentes jusqu'à 5 ans avant le diagnostic de la

tumeur primaire (Eskelin, Pyrhonen et al. 2000). Ceci éliminerait donc la possibilité que

dans certains cas, les métastases ne surviennent qu'à la suite du traitement administré à la

tumeur primaire (Singh 200 l) ~ Le processus métastatique pourrait s'expliquer notamment

par la présence de molécules d'adhésion à la surface des cellules, comme les intégrines, qui

pourraient permettre à la cellule de migrer jusqu'à l'organe cible (Marshall, Rutherford et

al. 1995).

14

1.3 Les molécules d'adhésion

Les molécules d'adhésion sont responsables de la liaison entre les cellules et la matrice

extracellulaire (MEC) ainsi que des interactions cellules-cellules. La capacité des cellules à

interagir par le biais de leurs molécules d'adhésion joue un rôle clé dans plusieurs

processus biologiques impliquant l 'homéostasie, le développement, l 'embryogenèse,

l'inflammation et la réponse immunitaire (Frenette et Wagner 1996; Petruzzelli, Takami et

al. 1999). Considérant l'importance de ces derniers, il est raisonnable de croire qu 'un

dérèglement dans un de ces processus peut jouer un rôle dans la progression du cancer et

des métastases. En effet, plusieurs études indiquent que certaines familles de molécules

d'adhésion sont impliquées dans la tumorigenèse, dans la progression tumorale et dans le

processus métastatique (Ohene-Abuakwa et Pignatelli 2000). De ces familles, on compte

les cadhérines, les immunoglobulines, les sélectines et, finalement, les intégrines (Figure

1.6).

1.3.1 Les sélectines

La famille des sélectines se compose de glycoprotéines transmembranaires contenant un

domaine N-tenninal calcium-dépendant unique (Figure 1.6 A). Elles possèdent également

un domaine similaire au facteur de croissance EGF qui exerce une fonction importante dans

la régulation de son activation (Bock 1991).

Leur fonction principale se traduit par des interactions hétérotypiques entre cellules. En

effet, elles pennettent l'adhésion des cellules sanguines et des leucocytes avec les cellules

endothéliales des vaisseaux sanguins (Ohene-Abuakwa et Pignatelli 2000). Il existe

seulement trois membres dans cette famille qui sont la E-sélectine (endothéliale), la P­

sélectine (plaquette) ainsi que la L-sélectine (leucocyte).

Il a été démontré que l'inhibition des fonctions de la E-sélectine hépatique dans un

modèle de souris entraîne une diminution dans le nombre de métastases au foie résultant de

l'implantation d'un carcinome du côlon (Brodt, Fallavollita et al. 1997; Khatib, Fallavollita

et al. 2002). L'adhésion des cellules cancéreuses à la paroi des vaisseaux sanguins leur

15

permettraient donc de traverser la parOI endothéliale afin d'envahir un site potentiel

secondaire.

A Domaine

NH :1-T erm inal

R é~on similaire au facteur de

croissanc e EG F

Répétitions des séquences deSpfotéinesré~aUcices

du C om plém ent

Dom aine intra cellulaire

c

cadhérine~

spécifiques

Domaines transm em brana1res

Dom ainesintracellu1aireS~~iI.

C atérunes

B

Dom aines uansm em brana.ire s

D

Dom aine calf-l

Dom aine calf-2

Pont disulfure

Domaines « 1 m m uno glubuline-lik e »

~Dolmaines ~ Fibronectine III

Dom aine intracellulaire

Dom aine Hybride Dom aine PSI

Figure 1.6 - Molécules d'adhésion. Représentation schématique de la structure des principales molécules d'adhésion responsables de l'interaction cellule-cellule et cellule-matrice; (A) Sélectine; (B) Immunoglobuline de type N-CAM; (C) Cadhérine; (D) Intégrine (image adaptée de Juliana, 2002).

16

1.3.2 La superfamille des immunoglobulines

La grande famille des immunoglobulines s'appelle ainsi en raison de leur domaine

extracellulaire « immunoglobuline-like » (Figure 1.6 B). Ce domaine se compose de

multiples chaînes . en boucles reliées par des ponts disulfures (Joseph-Silverstein et

Silverstein 1-998). Certaines de ces molécules contiennent également un domaine contenant

des répétitions de la séquence de la fibronectine III qui est reconnu pour avoir un rôle à

jouer dans la reconnaissance et la liaison de la cellule (Ohene-Abuakwa et Pignatelli 2000).

Ces molécules transmembranaires sont responsables non seulement de l' adhésion, mais

également de la migration des cellules (Beckner, Krutzsch et al. 1995) et ce, par des

interactions cellule-cellule. Parmi les membres de cette superfamille, on compte notamment

ICAM~1 (intercellulaire), VCAM-l (vasculaire) et NCAM (neural).

Certains membres de la famille des immunoglobulines ont vu leur expression augmentée

de façon aberrante à la surface de cellules malignes chez différents types de cancers (Maio,

Pinto et al. 1990; Passlick, Izbicki et al. 1994; Wolff, Stephenson et al. 1995). D ' autres

études semblent également démontrer que la surexpression de ICAM -1, par exemple, serait

associée à la progression de mélanomes et augmenterait le risque de métastases (Johnson,

Stade et al. 1989).

1.3.3 Les cadhérines

Les cadhérines constituent des glycoprotéines transmembranaires (Figure 1.6 C) qui

participent à l'adhésion cellule-cellule par une interaction homotypique calcium­

dépendante (Yap, Niessen et al. 1998).

Ces récepteurs sont des déterminants fondamentaùx de l'organisation tissulaire des

organismes adultes ou en développement (Ohene-Abuakwa et Pignatelli 2000). Il existe

plusieurs membres dans la famille des cadhérines qui sont divisés en deux sous-groupes

soient les classiques ou celles associées aux desmosomes. On retrouve, entre autre, la E-

17

(épithéliale), la P- (placentaire) et la N- (neuronale) cadhérine qui font partie du type

classique (Moles et Watt '1997; Hatta, Takagi et al. 1987).

Les fonctions des cadhérines sont généralement régulées grâce à leur domaine

cytoplasmique via les caténines (a, ~ et y), des protéines intégrées au cytosquelette

(Gumbiner et McCrea 1993). Les cadhérines sont considérées comme des gènes

suppresseurs de tumeur et l ' inhibition de leurs fonctions ou de leur expression semble être

reliée à la progression tumorale (Ohene-Abuakwa et Pignatelli 2000).

1.3.4 Les intégrines

1.3.4.1 Structure des intégrines

Les intégrines sont des récepteurs transmembranaires localisés à la surface des cellules

(Figure 1.7). Ces dernières sont constituées d'une sous-unité a et d'une sous-unité ~ qui

s'hétérodimérisent de façon non-covalente afin d'acquérir leurs propriétés fonctionnelles

(Vigneault, Zaniolo et al. 2007).

Domaine H}imde

Domaine PSI

I-BGF (l a 4)

Domsiœ~

Figure 1.7 - Structure générale des intégrines. Représentation schématique de la structure de l'intégrine. On peut distinguer la sous-unité a et la sous-unité P ainsi que leurs principaux éléments structurants (image adaptée de Juliana, 2002).

18

Les sous-unités des intégrines sont des protéines transmembranaires de type l , c ' est-à­

dire que leur extrémité N-terminale est extracellulaire tandis que leur extrémité C-terminale

est intracellulaire (Kuphal, Bauer et al. 2005). De plus, les sous-unités sont formées

intégralement de trois domaines distincts : un domaine extracellulaire ou exodomaine, qui

contient entre 700 et 1100' résidus, un court domaine transmembranaire de 20 à 30 résidus

et finalement, un domaine intracellulaire contenant environ 30 à 50 résidus (exception faite

de la sous-unité ~4 qui possède plus de 1 000 résidus) aussi appelé domaine cytoplasmique

(Kuphal, Bauer et al. 2005) .

. À ce jour, 24 sous-unités a différentes ainsi que 9 sous-unités ~ ont été identifiées dans

le génome humain. Toutefois, seulement 18 sous-unités a et 8 sous-unités ~ sont

actuellement répertoriées, celles-ci pouvant s'associer pour former 24 intégrines différentes

(Figure 1.8) (Hynes 1992; Meenan, Spaans et al. 1997; Plow, Haas et al. 2000).

Figure 1.8 - La famille des intégrines. Chacune des 24 intégrines représentées en hétérodimère composé d'une sous-unité a et une sous-unité ~. Les intégrines exprimées dans l'œil sont illustrées à l'intérieur du schéma oculaire. Orange: sous-unité ~; Vert: ligand ~ fibronectine; Rouge: ligand ~ collagène; Jaune: ligand ~ laminine; Violet: ligand ~ ténascine; Bleu: récepteur spécifique aux leucocytes (image tirée de Vigneault, 2007).

19

Les intégrines peuvent être divisées en famille selon leurs similarités fonctionnelles. On

retrouve donc les récepteurs RGD, les récepteurs des collagènes, les récepteurs des

laminines et les récepteurs des leucocytes (Hynes 2002). On peut regrouper les intégrines

selon la nature de leur sous-unité B. La famille BI est la plus importante et les intégrines

qui appartiennent à celle-ci ont principalement pour ligand des protéines de la MEC et sont

impliquées dans les interactions cellule-cellule (Alb~lda 1991).

1.3.4.1.1 Sous-unité a

Les sous-unités u représentent, le plus souvent, la partie la plus volumineuse de

l'hétérodimère. Elles ont une taille se situant entre 120 et 180 kDa et contiennent plus de

940 résidus (Petruzzelli, Takami et al. 1999; Berman et Kozlova 2000) (Figure 1.7). Il

existe non seulement beaucoup de variations inter-espèces, mais également intra-espèces du

point de vue de la séquence des ces sous-unités (Berman et Kozlova 2000).

Ces sous-~nités possèdent un domaine en forme d'hélice à sept lames, un domaine

« thigh », deux domaines «calf» et certaines possèdent également un domaine uA (ou

domaine 1) (Figure 1.7) (Arnaout, Mahalingam et al. 2005). Le premier de ces domaines

semble avoir un rôle à jouer dans la liaison de l'intégrine à son ligand, mais aussi dans

1 'hétérodimérisation du récepteur (Shimaoka, Takagi et al. 2002; Humphries, McEwan et

al. 2003). De plus, il contient des sites potentiels de liaison pour des cations divalents

comme le calcium, permettant ainsi son activation. (Hum_phries, McEwan et al. 2003). Le

domaine l, lorsque présent sur la sous-unité, semble lui aussi être impliqué dans la liaison

du ligand (Shimaoka et Springer 2003). Pour les sous-unités ne contenant pas ce domaine,

la sous-unité B ainsi que le domaine à sept lames semblent compenser pour cette absence

lors de la liaison du ligand (Kuphal, Bauer et al. 2005). La queue des sous-unités u contient

un domaine « thigh» homologue à l'immunoglobuline suivi de deux domaines, calf-l et

calf-2, disposés en feuillets-B qui correspondent au site de clivage protéolytique (Amaout,

Mahalingam et al. 2005). Finalement, près du domaine transmembranaire, on retrouve chez

toutes les sous-unités u la séquence particulière KXGF-FKR/X où X sont des résidus non­

polaires (Berman et Kozlova 2000). Cette séquence, essentielle à l 'hétérodimérisation,

20

maintient les intégrines dans un état inactif et est très importante pour l'activation de ces

dernières (van der Flier et Sonnenberg 2001).

1.3.4.1.2 Sous-unité Il Les sous-unités ~ sont généralement plus petites que les sous-unités u et possèdent une

taille variant entre 90 et 115 kDa avec environ 640 résidus (Petruzzelli, Takami et al. 1999;

Shimaoka et Springer 2003) (Figure 1.7). Contrairement à sa sous-unité complémentaire,

cette sous-unité possède une séquence plus conservée entre les espèces (Albelda 1991 ;

Berman et Kozlova 2000).

La portion extracellulaire de la sous-unité ~ peut être subdivisée en 8 domaines

différents qui, bien que toutes leurs fonctions ne soient pas connues encore aujourd'hui,

semblent néanmoins importants compte tenu de leur grande conservation entre les espèces

(Figure 1.7) (Berman et Kozlova 2000). Le premier domaine consiste en un domaine

globulaire .dénommé ~A et inséré en partie dans le second domaine, le domaine hybride. Le

domaine ~A sert à compenser l'absence du domaine uA de la sous-unité u pour la liaison

du ligand (Shimaoka, Takagi et al. 2002; Shimaoka et Springer 2003). Le domaine hybride,

homologue à l'immunoglobuline, serait impliqué dans l'activation de l'intégrine (Arnaout,

Mahalingam et al. 2005). Le troisième domaine, le domaine PSI, riche en résidus cystéines,

semble être responsable du maintien de la position inactive de l'intégrine, contrairement au

second domaine (Shimaoka, Takagi et al. 2002). Les quatre domaines suivants surnommés

1 -EGF 1 à 4, sont également riches en résidus cystéines et semblent être importants au

niveau de la signalisation (Shimaoka, Takagi et al. 2002). Le dernier domaine de la portion

extracellulaire est le domaine ~TD dont la fonction est encore mal définie à ce jour

(Arnaout, Mahalingam et al. 2005). Finalement, deux séquences très conservées semblent

aussi impliquées dans l'activation de l'intégrine. Il y a tout d'abord la séquence de

localisation des plaques d'adhésion focales NPXY et une séquence située près de la queue

cytoplasmique de la sous-unité ~ (Dedhar and Hannigan 1996).

La queue cytoplasmique de la sous-unité ~ possède la capacité de lier plusieurs protéines

cytoplasmiques dont la taline, la filamine et l' a-actinine, qui pennettent un lien direct entre

21

les intégrines et le cytosquelette d' actine, les protéines F AK et ILK liées à la signalisation

et finalement, la paxilline et la GRB2 qui sont des protéines adaptatrices également

importantes dans la signalisation (Juliano et Haskill 1993; Schaller et Parsons 1994;

Giancotti et Ruoslahti 1999).

1.3.4.2 Ligands des intégrines

Les différentes combinaisons des sous-unités d'intégrines démontrent la capacité

d'induire diverses voies de signalisation, et ce, selon le ligand auquel elles se lient. Une

intégrine peut non seulement être reconnue par plusieurs ligands, mais plusieurs intégrines

peuvent également lier ce même ligand (Elner et Elner 1996). La plupart de leurs ligands

sont des protéines de la MEC impliquées dans l'adhésiori cellule-substrat (Vigneault,

Zaniolo et al. 2007). Toutefois, les intégrines peuvent également lier leurs contre-récepteurs

connus, des membres de la grande famille des immunoglobulines (ICAM et VCAM),

permettant ainsi l'adhésion cellule-cellule (Hynes 1992). La liaison du ligand à une

intégrine permet le passage de la forme inactive à la forme activée de celle-ci.

1.3.4.2.1 Matrice extracellulaire

La MEC fournit un support mécanique aux ·cellules et représente un réseau

tridimensionnel entrecroisé constitué de plusieurs macromolécules (Bosman et

Stamenkovic 2003). Le contact entre les cellules et la matrice permet la création d'une

barrière perméable en plus de maintenir l'intégrité tissulaire (Albelda 1991). Ce~e matrice

interagit avec les cellules afin d'activer et de réguler certaines fonctions cellulaires

importantes telles que la migration, l'adhésion, la prolifération, la différenciation ainsi que

la morphogenèse (Adams et Watt 1993; DeSimone 1994; Roskelley, Srebrow et al. 1995).

Plus précisément, la MEC est constituée de glycoprotéines, de collagènes, de

glycosaminoglycanes et de protéoglycan~s qui forment un enchevêtrement de fibres de

collagènes et de glycoprotéines (Zagris 2001). La MEC est une entité dynamique dont la

composition change . constamment . dans le but de permettre la modification du

comportement cellulaire via la signalisation par les récepteurs situés à la surface cellulaire

(Streuli 1999).

22

La MEC contient une variété de glycoprotéines connues sous le nom de fibronectine,

tenascine, entactine et laminine. Ces demièrés auront un rôle à jouer dans l'adhésion entre

la cellule et ' le tissu à un moment ou l'autre du développement (Zagris 2001). Les )

collagènes contenus dans la MEC (types l à XIX) en constituent quant à eux la composante

la plus abondante (Olsen 1995). Les glycosaminoglycanes comme l'acide hyaluronique, le

sulfate de chondroïtine, le sulfate d 'héparane et le kératane sulfate sont impliqués dans le

contrôle de la prolifération, de la migration, de la différenciation ainsi que dans le maintien

des structures morphqgéniques (Zagris 2001). Pour leur part, les protéoglycanes présents

dans la MEC peuvent être divisés en trois groupes distincts: les protéoglycanes de la

membrane basilaire (perlécan, bamacan, agrine), les hyalectanes (aggrécan, versican) et les

lectines (décorine, biglycan). Ces derniers peuvent notamment avoir un rôle à jouer dans la

prolifération cellulaire, mais aussi dans la maturation des tissus spécialisé~ (Iozzo 1998).

1.3.4.3 Rôles des intégrines

Les fonctions des intégrines traduisent par elles-mêmes l'importance qu'elles occupent

chez l'humain. Elles jouent non seulement un rôle dans la migration et dans l'adhésion des

cellules, mais elles affectent également, par signalisation intracellulaire, l'expression de

plusieurs gènes qui sont importants pour la différenciation; la prolifération et dans

l'organisation du cytosquelette (Hotchin et Hall 1995). Par des interactions cellule-cellule 1

ou cellule-MEC (Hynes 1992), les intégrines peuvent permettre la transduction de signaux

de l'extérieur vers l'intérieur de la ,cellule (<< outside-În signaling ») ou de l'intérieur vers

l'extérieur (<< inside-out signaling ») (Vigneault, Zaniolo et al. 2007). L'activation et la

signalisation des intégrines surviennent suite à un changement de conformation de ces

dernières (Giancotti 2003). En d'autres mots, le lien étroit entre l'extérieur et l'intérieur de

la cellule permet de répondre adéquatement aux changements par les intégrines qui

participent activement à des processus clés du cycle cellulaire tels que la survie et la mort

cellulaire. L' anoïkose, par exemple, est un phénomène qui traduit bien leur importance

dans la mort cellulaire. Il survient lorsque les interactions des cellules avec la matrice sont

instables ou absentes provoquant en retour la transmission d'un signal qui enclenc~e

l'apoptose (Frisch et Ruoslahti 1997). Les intégrines empêchent cette mort des cellules par

23

apoptose (anoïkose) lorsque celles-ci sont liées à la MEC dans l'environnement approprié

(Stupack et Cheresh 2002).

1.3.4.4 Signalisation par les intégrines

Les intégrines ont la capacité d'effectuer une signalisation bi-directionnelle (Danen et

Sonnenberg 2003). La liaison de la MEC provoque l'association des intégrines avec le

cytosquelette et active une cascade de signalisation à l'intérieur de la cellule (Figure 1.9)

(Giancotti et Ruoslahti 1999). Inversement, les signaux intracellulaires peuvent induire la

liaison entre les intégrines et la MEC (Liddington et Ginsberg 2002).

F Paxil line FSAK

J / rc ~ CAS !

CrK / PI31K ~ .~

DOC K 180 AKT! P ~ , KB

R,ac

~ PAK

~ JNK

'-.. Soc

/ Grb2-Sos

~ Ras ~

Raf-1

~ EK

~ ErK

Figure 1.9 - Signalisation par les intégrines. Lorsqu'elles sont activées par les protéines de la MEC, les intégrines activent diverses voies de signalisation dans la cellule (image adaptée de Hynes, 2002).

Les queues cytoplasmiques des intégrines jouent un rôle fondamental dans la

signalisation par les intégrines. Toutefois, étant donné qu'elles sont dépourvues d'activité

catalytique, elles doivent se lier à plusieurs protéines adaptatrices afin d'effectuer une

cascade de signalisation. Ces queues correspondent donc aux sites d'interaction de

24

plusieurs protéines cytoplasmiques et du cytosquelette d'actine (Hynes 2002). Seules, c ' est­

à-dire lorsqu'elles ne sont pas liées à leur ligand, les intégrines diffusent librement dans la

membrane plasmique. Lorsqu'une intégrine se lie à la MEC, il survient une réorganisation

des filaments d'actine suivie d'une boucle de rétroaction positive qui amène d'autres

intégrines à s'assembler en liant plus fortement la MEC (Jockusch, Bubeck et al. 1995;

Aplin, Howe et al. 1998). Cette aggrégation de plusieurs intégrines au niveau de la

membrane cellulaire se nomme « complexe d'adhésion focal». La propagation du signal

implique plus de 50 protéines différentes qui provoquent une cascade de signalisation

spécifique (Romer, Birukov et al. 2006). Certains facteurs influencent le taux

d'assemblage, la taille et la signalisation qui résultent de l' assemblage des complexes

d'adhésion. De ces facteurs, on compte notamment les propriétés de la MEC, l'activation et

l'avidité des intégrines, l'état de contraction du cytosquelette et la spécificité tissulaire et

cellulaire du milieu où se déroulent les évènements (Romer, Birukov et al. 2006).

La signalisation par les intégrines survient via un grand nombre de seconds messagers

intracellulaires (Figure 1.9). Les protéines adaptatrices comme la taline, la paxilline, la

vinculine, l' a-actinine, la filamine, l 'ILK ainsi que la « focal adhesion kinase» ou F AK

(N obes et Hall 1995), peuvent se lier à la queue cytoplasmique de la sous-unité B (Lee et

Juliano 2004; Wiesner, Legate et al. 2005). La F AK, en s' autophosphorylant, s' associe

fréquemment à une kinase membre de la famille Src qui enclenche diverses voies de

signalisation comme la voie des PI3K (AKT/PKB), la voie de Crk/CAS et la voie des

MAPK (Giancotti 2003; Schatzmann, Marlow et al. 2003). Il existe également d'autres

protéines capables de se lier à la protéine F AK dont la phospholipase C-y (PLC-y), la

protéine Grb7 et Shc qui activeront à leur tour d'autres voies de signalisation (Schatzmann,

Marlow et al. 2003; Wiesner, Legate et al. 2005). Il arrive également que des intégrines

activent les membres de la famille Src sans la liaison préalable de la F AK. Ces intégrines

couplées à des membres de la famille Src tels que Fyn et Yes vont recruter Shc pour

s'associer au complexe Grb2/S0S et provoqueront l'activation de Ras et de la voie des

MAPK (Giancotti 2003).

25

-1.3.5 La progression tumorale

Comme d'autres molécules d'adhésion cellulaire, les intégrines sont également

reconnues pour avoir un rôle à jouer dans le cancer. Étant des récepteurs d'adhésion

cellulaire, on peut facilement les associer à la progression tumorale. La transformation

cellulaire, qui mène à la formation d'une cellule cancéreuse, est justement caractérisée par

une rupture dans l'intégrité du cytosquelette et une diminution de la capacité d ' adhésion

cellulaire (Mizejewski 1999; van der Flier et Sonnenberg 2001). De plus, le bris des liens

entre les intrégrines et la MEC serait impliqué dans le processus métastatique, ce qui

permettrait aux cellules cancéreuses d'envahir un ou des orgaries secondaires (Wehrle­

Haller et Irnhof 2003). Par ailleurs, plusieurs évidences suggèrent également que les

cellules cancéreuses auraient la capacité de modifier le patron d'expression de certaines

intégrines à leur surface (Giancotti et Mainiero 1994). Le niveau d'expression de certaines

intégrines serait, de ce fait, augmenté alors que celui d'autres intégrines serait diminué afin

de permettre l'invasion, la progression et la migration des cellules cancéreuses (Mizejewski

1999; Kuphal, Bauer et al. 2005). Notons plus particulièrement l'intégrine a4B1 qui semble

jouer un rôle notamment dans la croissance tumorale et dans les processus métastatiques

lorsque sur-exprimée (Bao, Pigott et al. 1993) et l'intégrine a5B1 connue pour être associée

à un phénotype plus agressif lorsqu'elle est soit sur-exprimée (Gong, Wang et al. 1997) ou

encore réprimée (Sanders, Mainiero et al. 1998) chez certains types de cancer.

De plus, plusieurs études ont rapporté l'expression de certaines intégrines associées au

mélanome uvéal dont l'intégrine avB3 (Seftor, Seftor et al. 1999) qui est fortement

exprimée chez les cellules au profil fusiforme provenant d'un mélanome uvéal. Certaines

intégrines pourraient également être fonctionnellement impliquées dans la progression de

ce cancer et dans le processus métastatique (Przybylo, Pochec et al. 2008) bien qu'il soit

encore difficile de déterminer précisément par quels mécanismes elles y parviendraient.

Néanmoins, des travaux récemment publiés par Woodmard et collaborateurs (Woodward,

Rennie et al. 2005) associent l'expression des intégrines al, a4 et a6 à un phénotype plus

agressif du mélanome uvéal. Il devient donc intéressant d'étudier le patron d'expression des

intégrines chez le mélanome uvéal compte tenu de leur fonction probable dans le

développement de cette forme de cancer.

26

1.3.6 L'intégrine a4pl

L'intégrine a4Bl est également connue sous le nom de « very-Iate antigen-4 » (VLA-4)

ou encore CD49d/CD29 et constitue l'une des deux seules intégrines portant la sous-unité

a4, l'autre étant l'intégrine a4~7 (Zhang et al. 1991; Vigneault, Zaniolo et al. 2007).

Contrairement à d'autres intégrines, l'intégrine a4Bl ne présente pas un patron

d'expression ubiquitaire (exprimé par presque tous les tissus). Elle est, entre autre,

exprimée à la surface des fibroblastes du derme (Gailit, Pierschbacher et al. 1993), des

cellules des muscles squelettiques en développement (Rosen, Birkenmeier et al. 1991), des

neurones (Dufour, Duband et al. 1988), de l'épithélium cornéen (Lauweryns, van den Oord

et al. 1991) ainsi qu'à la surface des cellules provenant de lignées hématopoïétiques

(Remler, Elices et al. 1990; Ager et Rumphries 1991; Rosen, Barks et al. 1994). En effet,

l'intégrine VLA-4 semble jouer un rôle dans l'adhési<?,n des lymphocytes, des monocytes,

des éosinophiles, des basophiles, des cellules NK et quelques cellules de mélanome

(Kassner, Teixido et al. 1992) via notamment son contre-récepteur VCAM-l présent à la

surface des cellules endothéliales (Remler, Elices et al. 1990; Allavena, Paganin et al.

1991). Cette intégrine possède aussi la capacité de lier un second ligand: la fibronectine, un

constituant important de la MEC, au niveau de sa région IIICS contenant le motif RGDS

(Arg-Gly-Asp-Ser) et EILDV (Glu-Ile-Leu-Asp-Val). L'interaction entre cette dernière et

l'intégrine a4Bl est essentielle à la localisation des lymphocytes antigène-spécifiques au

site de l'antigène (Ferguson, Mizutani et al. 1991). De plus, cette interaction permet de

faciliter la co-stimulation des lymphocytes T (Davis, Oppenheimer-Marks et al. 1990;

Nojima, Humphries et al. 1990; Shimizu, van Seventer et al. 1990), semble avoir une

importante fonction dans la maturation des cellules ' progénitrices de la moelle osseuse

(Williams, Rios et al. 1991) et finalement, semble être importante dans , la migration des

cellules de la crête neurale durant l'embryogenèse (Dufour, Duband et al. 1988).

L'intégrine a4B 1 est également impliquée dans de nombreuses pathophysiologies comme

l'inflammation, l'asthme, les allergies, l'arthrite, l'athérosclérose et la cicatrisation (Laffon,

Garcia-Vicuna et al. 1991; Striz et Costabel 1992; Walsh et Murphy 1992; Jaspers, Wu et

al. 1995; Lobb, Abraham et al. 1996). Finalement, cette intégrine semble exercer un rôle

27

dans la progression du cancer compte tenu de son implication dans des processus tels que la

croissance des cellules tumorales et la propagation métastatique (Bao, Pigott et al. 1993).

1.3.6.1 Structure de l'intégrine a4pl

L' intéwine u4~ 1 possède certaines caractéristiques structurales spécifiques. Par

exemple, sa sous-unité u4 constituante est la seule sous-unité u connue pour subir un

clivage protéolytique variable près du milieu de la molécule; produisant ainsi des fragments

de 70 et 80 kDa (Hemler, Elices et al. 1990). Il semble que les différentes formes de la

molécule générées par ce phénomène possèderaient également différentes capacités

fonctionnelles (Wayner, Garcia-Pardo et al. 1989). La queue cytoplasmique de cette même

sous-unité semble cependant très conservée d'une espèce à l'autre suggérant un rôle

important exercé par ce segment (Kassner, Teixido et al. 1992). Elle ·est toutefois très

différente des autres sous-unités u, conférant ainsi une ' fonction unique à cette sous-unité

(Kassner, Teixido et al. 1992). La queue cytoplasmique de la sous-unité ~ joue, quant à

elle, un rôle critique dans la signalisation de l'intégrine (O'Toole, Katagiri et al. 1994).

1.3.6.2 Régions régulatrices du .gène a4

La présence de nombreux éléments agissant en cis a été identifiée sur le promoteur et la

région 5' du gène a4 (Figure 1.10). Ceux-ci incluent, entre autre, des sites pour les facteurs

de transcription (FT) AP-1 et AP-2 (<< Activator Protein ») à -377 et +590 respectivement,

un site de liaison pour MyoD à -274 et un site probable pour Mitf dans la région s'étendant

de -89 à -84 (Rosen, Birkenmeier et al. 1991; Planque, Leconte et al. 2001; Vigneault,

Zaniolo et al. 2007). De plus, on remarque également la présence de sites de liaison pour le

facteur de transcription ZEB dans les régions -400 et -130 (Vigneault, Zaniolo et al. 2007).

La région promotrice contient aussi des sites de liaison (boîtes PU) pour des FTs membres

de la grande famille Ets localisés à -67, -54 et -50 et pour le FT Pax-6 dans les régions

situées entre -953 et -936 et aux environs de -96 et de -45 (Rosen, Barks et al. 1994;

Zaniolo, Leclerc et al. 2004).

28

· ~~ B Oites < PU ) a4.1 a4.2

Figure 1.10 - Région régulatrice du gène (14 humain. Représentation schématique de la . région promotrice du gène de l'intégrine a4. On peut y observer les principaux sites de liaison pour des facteurs de transcription (image adaptée de Vigneault, 2007).

Des travaux réalisés dans notre laboratoire ont permis de mettre en évidence deux

régions homologues agissant en cis requises à différents niveaux afin de moduler l'activité

de base du promoteur a4 (Audet, Masson et al. 1994). Ces éléments, désignés a4.1 et a4.2

(Figure 1.11), sont compris entre les régions -51 à -30 et -27 à -6, respectivement (Audet,

Masson et al. 1994). Des étu~es antérieures nous ont permis d'identifier des protéines

nucléaires pro,:,enant de cellules épithéliales de cornée de lapin capables de lier les régions

régulatrices du promoteur a4 (Larouche, Leclerc et al. 1996). Ces protéines, désignées Bp 1

à Bp5 (<< Binding Protein» 1 à 5), possèdent des poids moléculaires allant de 91 kDa pour

BpI à 39 kDa pour Bp5 (74 kDa pour Bp2, 59 kDa pour Bp3 et 45 kDa pour Bp4)

(Larouche, Leclerc et al. 1996). Elles pourraient avoir un rôle à jouer dans la modulation de

l'expression du gène de l'intégrine a4 (Larouche, Leclerc et al. 1996). Plus récemment,

nous avons identifié un de ces facteurs, Bp5, comme étant le FT Pax -6 (Zaniolo, Leclerc et

al. 2004). L'identité des autres protéines du complexe demeure toutefois encore inconnue à

ce jour (Larouche, Leclerc et al. 1996).

a4 .. 1 .1-67 ... GGAAGTGTGGGGAGGAAGGAAGTGGGTATAGAAGGGTG ... - 3 0 . 1 1 Il . 1 1 r r Il Il Il 1 I l 1 t l' ,. Il' Il r

«4.2 1-43 ... GGTATAGAAGGGTGC TGAGATGTGGGTCTTGAAGAGAA ... - 6

Figure 1.11 - Éléments régulateurs. Représentation schématique des éléments régulateurs a4.1 et a4.2 identifiés dans le promoteur du gène a4. Les caractères en gras indiquent les résidus conservés entre les deux réglons (image tirée de Larouche, 1996).

29

1.3.6.3 Le facteur de transcription Pax-6

1.3.6.3.1 La famille des gènes PAX

Les gènes PAX font partie d'une famille de gènes (Figure 1.12) contenant neuf membres

chez l'humain (Pax-l à Pax-9) qui codent pour des facteurs de transcription nucléaires

impliqués dans le développement précoce ainsi que dans le maintien de l'intégrité tissulaire

de certains organes (Strachan et Read 1994; Macdonald et Wilson 1996). Ces gènes sont

classés selon leur similitude de séquence: tous les membres de la famille PAX ont la

particularité d'avoir un domaine «Paired », certains possèdent un motif octapeptide et

certains ont un homéodomaine (Strachan et Read 1994).

Gène Local isation Groupe Structure

PAX 1 20pll -PAX 9 14q12 -PAX 2 2q35 -PAX 5 9p13 Il -PAX 8 2q12 -PAX 3 2q35

III -PAX 7 lp36 -PAX 4 7q32 IV

PAX 6 I1p13

Figure 1.12 - Famille des gènes Pax. Représentation schématique de la structur~ des gènes Pax selon leurs domaines structuraux (image adaptée de Ewan, 2006).

1.3.6.3.2 Pax-6

Un des membres de la famille PAX, Pax-6, est notamment exprimé dans l'oeil pendant

le développement, mais également au niveau de,s voies nasales, du pancréas, de

l'hypophyse ainsi que du système nerveux central (Zaniolo, Leclerc et al. 2004). Pax-6

possède également des rôles chez l'adulte et continue d'être exprimé, par exemple, dans la

rétine, l'épithélium cornéen, le cerveau et le pancréas (Mathers et lamrich 2000; Zaniolo,

Leclerc et al. 2004).

Le gène Pax-6, localisé sur le chromosome I1p13 (Callaerts, Halder et al. 1997),

comporte 12 exons et encode un ARN messager de 2,7 kb qui produira une protéine avec

30

un poids moléculaire de 46 kDa (P AX-6) (Callaerts, Halder et al. 1997). La protéine

contient un domaine «Paired», un homéodomaine ainsi qu'un domaine PST riche en

prolines, sérines et thréonines (Callaerts, Halder et al. 1997) (Figure 1.13). Le domaine

« Paired» est un domaine de liaison à l'ADN constitué de 128 acides aminés (Bopp, Jamet

et al. 1989; Xu, Rould et al. 1999). Il se subdivise lui-même en deux parties distinctes, soit

le domaine « PAl », en position amino-terminale, qui permet la stabilité du contact entre la

protéine et l'ADN et le domaine « RED » en position carboxy-terminale, qui augmente la

spécificité de la protéine en contribuant à la reconnaissance du site de liaison à l'ADN

(Callaerts, Halder et al. 1997; Xu, Rould et al. 1999). L'homéodomaine situé au centre de

la protéine est séparé du domaine «Paired» par une région liante comportant une forte

proportion de résidus glycines et glutamines (Callaerts, Halder et al. 1997). Il est constitué

de 60 acides aminés assemblés en trois hélices a qui sont suivies d'un petit domaine

globulaire. Il s'agit également d'un domaine de liaison à l'ADN, qui, par coopération avec

le domaine «Paired», permet la reconnaissance par la protéine d'une séquence d'ADN

pouvant aller jusqu'à 40 pb, lui conférant ainsi une forte affinité et une grande spécificité de

liaison à l'ADN (Callaerts, Halder et al. 1997; S trachan et Read 1994; Duncan, Cvekl et al.

2000). Finalement, le domaine PST est le plus imposant domaine de la protéine avec 152

acides aminés. Étant un domaine de transactivation, il peut être phosphorylé par des

protéines kinases comme les MAP kinases et exercerait un rôle clé dans plusieurs processus

cellulaires (Mikkola, Bruun et al. 1999).

422 .......... ------w

Sa

Figure 1.13 - PAX6 et PAX6 (Sa). Représentation schématique des différents domaines de PAX6 et PAX6 (5a) (image adaptée de Bharesh, 2004).

Il existe cependant certains isoformes de cette protéine issues d'un épissage alternatif.

La plus connue est PAX-6(5a), une protéine de 48 kDa qui possède un exon supplémentaire

31

( 5 a) de 14 acides aminés dans le domaine « Paired » de la protéine (Epstein, Glaser et al.

1994) (Figure 1.13). Il existe également des variants de 43, 32 ou 33 kDa (Carriere, Plaza et

al. 1993) résultant de l' épissage alternatif du transcrit Pax -6 et bien qu'elles demeurent

encore aujourd'hui beaucoup moins caractérisées que PAX-6 et PAX-6(5a), on soupçonne

néanmoins qu'elles possèdent des fonctions particulières et contrôlent des gènes distincts

(Carriere, Plaza et al. 1993). L'isoforme de 32/33 kDa ne possède pas de domaine

« Paired » tandis que l'isoforme de 43 kDa ne possède pas le cinquième exon, créant ainsi

un nouveau domaine de liaison à l'ADN (Carriere, Plaza et al., 1993).

Les mutations dans le gène Pax -6 évoquent elles-mêmes l'importance des rôles que ce

FT détient. Ainsi, la majorité des mutations identifiées dans ce gène provoquent une perte

de fonction de la protéine (van Heyningen et Williamson 2002). Chez la souris, ces

mutations provoquent un phénotype présentant des yeux plus petits ou l'absence totale des

yeux (Tsonis et Fuentes 2006). Plusieurs anomalies ou désordres oculaires sont liés à un

défaut d'expression de Pax-6 chez l'humain: l'aniridie (hypoplasie de l'iris ou l'absence de

cette dernière) survient par transmission autosomique dominante par haplo-insuffisance du

gène Pax-6 muté; l'hypoplasie fovéale (des cataractes préséniles) due à une mutation

hétérozygote du gène Pax-6; le syndrome de Peter's (défaut de la chambre antérieure de

l' œil et opacité centrale de la cornée) qui se transmet de façon autosomique récessive (van

Heyningen et Williamson 2002; Tsonis et Fuentes 2006).

1.3.7 L'intégrine «SpI

. L'iiltégrine a5~1 représente le seul récepteur qui contient la sous-unité a5. Néanmoins,

cette intégrine est exprimée dans beaucoup de tissus du corps humain notamment la peau,

les reins, le foie, le pancréas, la rate, les intestins, les amygdales, le cœur, les nerfs

périphériques, le cortex cérébral, les vaisseaux sanguins ainsi que dans plusieurs parties du

globe oculaire (rétine, cornée, choroïde, cristallin, conjonctive) (Sincock, Mayrhofer et al.

1997; Brem et al. 1994; Sherry, Proske 2001).

1

1

32

Via son interaction avec son principal ligand, la fibronectine, l'intégrine a5Bl semble

jouer un rôle au niveau de plusieurs processus cellulaires importants. En effet, la liaison

entre la fibronectine et cette intégrine semble être essentielle à la cicatrisation cornéenne,

l' intégrité tissulaire ainsi que l' assemblage de la matrice de fibronectine et la survie '

cellulaire (Stepp, Spurr-Michaud et al. 1993; Pulai, Del Carlo et al. 2002; Danen et

Sonnenberg 2003; Robinson, Zazzali et al. 2003). De plus, cette même intégrine semble

impliquée au niveau de la prolifération, de la migration et de l'adhésion cellulaire

(Akiyama, Yamada et al. 19?9; Kim, Zhang et al. 1992; Loeser 1994; Robbins, Brem et al.

1994; Symington 1995; Urbich, Dernbach et ,al. 2002). L'intégrine a5Bl semble également

jouer un rôle au niveau du cancer. En effet, plusieurs évidences indiquent que la

surexpression ou la répression de cette intégrine serait associée à un phénotype plus

agressif des cellules cancéreuses (Vigneault, Zaniolo et al. 2007; Gong, Wang et al. 1997).

Une étude portant sur des cellules de carcinomes du .côlon semble démontrer que plus

l'expression de l'intégrine a5Bl est élevée, plus les cellules cancéreuses démontrent un

haut potentiel invasif (Gong, Wang et al. 1997). Cependant, d'autres études démontrent que

la diminution de l'expression de cette intégrine est également associée à certains types de

ca~cers comme l'adénocarcinonie ou le carcinome du pancréas (Stallmach, von Lampe et

al. 1992; Sanders, Mainiero et al. 1998).

1.3.7.1 Régions régulatrices du gène aS

Le promoteur du gène a5, très riche en Guanine-Cytosine (G-C), ne possède ni boîte

TATA, ni de boîte CCAAT (Birkenmeier, McQuillan et al. 1991; Vigneault, Zaniolo et al.

2007). De plus, on remarque la présence de .deux sites majeurs d'initiation de la

transcription soit à -45 et + 1, ces derniers étant situés dans une séquence initiatrice (lnr)

(Birkenmeier, McQuillan et al. ,1991). On signale également l'existence de plusieurs sites

de liaison pour les facteurs de transcription suivants sur .la région promotrice (Figure .1.14) :

SpI, entre les positions -117 et -101 (site distal) et entre -60 et -52 (site proximal); AP-l,

entre les positions -51 et -45; AP-2, entre les positions +77 et +84; Ets, entre les positions -

302 et -297; C/EBPa et C/EBPB (<< CCAAT/enhancer binding prote in »), entre les positions

-73 et -66; Pax -6, entre les positions -701 et -672 et finalement, NFI (<< Nuclear Factor» l),

entre les positions -71 et -67 (Corbi, Jensen et al. 2000; Gingras, Larauche et al. 2003;

33

Vigneault, Zaniolo et al. 2007). Les facteurs de transcription AP-1, Sp1/Sp3 et Pax-6

semblent tous contribuer positivement à l'activité du promoteur a5 (Corbi, Jensen ~t al.

2000; Duncan, Kozmik et al. 2000; Larouche, Leclerc et al. 2000; Gingras, Larouche et al.

2003). Les membres de la famille Ets semblent également exercer un effet positif sur

l'activité du promoteur a5, bien que l'endroit exact où se lient ces protéines sur le

promoteur n'ait pas encore été identifié (Kita, Takino et al. 2001). Les facteurs de

transcription C/EBP semblent exercer une influence différentielle selon le type cellulaire

étudié. En effet, ils activent le promoteur a5 dans des cellules d'hépatome alors qu'ils le

répriment dans des kératinocytes humains (Corbi, Jensen et al. 2000). Finalement, NFI

semble exercer une influence négative sur l'activité du promoteur (Gingras, Larouche et al.

2003; Gingras et al. 2008).

-702 __ -672

~ lm

Figure 1.14 - Région régulatrice du gène aS humain. Représentation schématique de la région promotrice du gène de l' intégrine a5. On peut y observer les principaux sites de liaison pour des facteurs de transcription (image adaptée de Vigneault, 2007).

34

1.4 Objectifs des travaux de recherche

Le mélanome uvéal n'est pas le cancer ayant la plus forte incidence dans la population.

Toutefois, il demeure le cancer intraoculaire le plus fréquent chez l'individu adulte et son

agressivité est telle qu'un patient sur deux décèdera des suites de cette maladie (Diener­

West, Hawkins et al. 1992). Certaines tumeurs provenant de patients différents semblent

démontrer des niveaux d'agressivité variables et ne semblent pas toutes posséder la capacité

de produire des métastases secondaires~ Nous savons déjà que les intégrines pourraient

avoir un rôle prépondérant à jouer, notamment dans les processus métastatiques, mais

également dans l'agressivité de la tumeur (potentiel tumorigène). Il devient donc important

d'étudier ces récepteurs cellulaires dans le contexte du mélanome uvéal afin d'identifier les

différences entre les tumeurs uvéales de patients qui décèdent rapidement et celles de

patients toujours en vie.

De récentes études réalisées dans notre laboratoire ont permis de démontrer que le

patron d'expression de certaines intégrines différait d'une lignée tumorale (provenant d'une

tumeur uvéale primaire ou de métastases hépatiques secondaires) à une autre (Figures 1.15

et 1.16). En effet, dans une lignée cellulaire dérivée des métastases hépatiques d'un patient

ayant développé un mélanome uvéal primaire (H79), nous avons remarqué une hausse de

l'expression de l'intégrine a4~1 en comparaison à des lignées tumorales dérivées de

mélanomes uvéaux primaires n'ayant pas encore produit de métastases au foie (SP6.5,

TP31, SP8.0, T97, T98, T108, Tl15). De plus, nous avons également remarqué un patron

d'expression particulier pour l'intégrine a5~1 entre des lignées non métastatiques (Figures

1.15 et 1.16). Celui-ci pourrait donc être lié à l'agressivité tumorale variable de ces

différentes lignées.

35

Lignee Sous-~nités des intégrines Cellulaire

a l a2 a3 a.4 a5 a6 av ~ 1 ~3 ~4 ~5

MeN ++ + - T +

SP6.5 ++ - ++

SP8 .0 ++ - + .. +++ - -

TP31 - - - -H79 ++++ +++ +++ ~ +++ +++ + ' ++ -

T97 -

T98 - +0+

TiOS - +++

Tl 15 -

Figure 1. 15 - Analyse en cytométrie de flux. Niveau d 'expression de certaines sous-unités d ' intégrines à la surface de cellules dérivées de mélanome uvéal. MeN: mélanocytes normaux; H79: lignée dérivée de métastases hépatiques provenant d 'un patient ayant développé un mélanome uvéal; SP6.5, SP8. 0, TP31, T97, T98, Tl 08, T 115: lignées cellulaires dérivées de mélanomes uvéaux primaires. (-): aucune expression; (+): faible expression; (++): expression modérée; (+++): forte expression; (++++): très forte expression (d' après S. Landreville, 1. Gagné et M. Bergeron).

500

200

500

200

~·'''~ - 11 8S

- a4

-188 - (X4

....... 0> 1-

ex) lO CO 0 ~

0> ...... ...... ..... 1-' t-

- 18S

-0.5

...... CO 0> œ 1-1-

co 0 ~

l-

Ln ,...-~

I-

- 18S

- a6

1:88 aS

Figure 1.16 - Expression des gènes encodant les sous-unités d'intégrines a4, a5, et a6. Analyse par RT-PCR semi-quantitatif de l 'expression des gènes des sous-unités a4, a5 et a6 dans des lignées de mélanome uvéal. UVM: mélanocytes normaux; H79: lignée dérivée de métastases hépatiques provenant d'un patient ayant développé un mélanome uvéal; SP6.5, T97, T98, Tl 08, Tl15: lignées cellulaires dérivées de mélanomes u'véaux primaires; Jurkat: lignée immortalisée de lymphocytes . T (d'après S. Landreville et J. Gagné).

36

Ces différentes observations ont permis d'élaborer plusieurs objectifs quant à l'étude de la

régulation de l'expression des gènes des intégrines a4~ I et a5 ~ I en relation avec les

propriétés métastatiques et tumorigènes du mélanome uvéa!.

1.4.1 Influence de Pax-6 sur l'activité du promoteur de la sous-unité a4 .

Dans un premier temps, et puisque nous avons déjà démontré que la transcription du

gène a4 (Zaniolo, Leclerc et al. 2004) est sous l'influence régulatrice du FT Pax-6 (Zaniolo,

Leclerc et al. 2004), nous étudierons le rôle de ce facteur par l'entremise de trois sections

présentées au chapitre 2 de cet ouvrage. Premièrement, nous allons tenter d'évaluer les

niveaux d'expression du facteur Pax -6 dans un éventail de lignées de mélanome uvéal. En

second lieu, il sera question d'évaluer la capacité de liaison du même FT à la séquence du

promoteur a4. Finalement, nous tenterons de déterminer quelle influence possède Pax-6 sur

l'activité transcriptionnelle du promoteur du gène a4.

1.4.2 Influence de la sous-unité aS dans les propriétés tumorigènes du

mélanome uvéal

Le chapitre ' 3 de ce mémoire sera consacré à l' intégrine a5 ~ I en relation avec

l'agressivité tumorale et se divise lui-même en trois parties. Tout d'àbord, nous allons

tenter de déterminer qualitativement le potentiel de ces lignées à générer des tumeurs.

Ensuite, nous allons évaluer les niveaux d'activité du promoteur du gène de l'intégrine a5

dans des lignées ciblées du mélanome uvéal. Finalement, nous évaluerons les niveaux

d'expression des principaux FTs qui modulent l'activité du promoteur a5 (SpI, AP-I et

NFI) afin de déterminer les facteurs qui pourraient être impliqués dans l'expression

différenti~lle de cette intégrine dans les lignées de mélartome uvéal.

37

2. Influence du facteur de transcription Pax-6 sur l'activité du promoteur du gène a4 dans le mélanome uvéal

2.1 Introduction

Les métastases issues d'un mélanome uvéal primaire réduisent l'espérance de vie des

patients à seulement quelques mois (Leyvraz, Spataro et al. 1997). Les intégrines pourraient

contribuer à ce processus en modifiant les propriétés adhésives et migratrices des cellules

cancéreuses. De récentes études réalisées par notre groupe ont démontré que le niveau

d'expression de certaines intégrines différait d'une lignée tumorale à une autre. En effet,

chez une lignée cellulaire dérivée des métastases hépatiques d'un patient ayant développé

un mélanome uvéal primaire (H79), nous avons remarqué une hausse de l'expression de

l'intégrine a4p 1 en comparaison à des lignées tumorales dérivées de mélanomes uvéaux

primaires n'ayant pas entraîné la formation de métastases au foie (SP6.5, TF31, SP8.0, T97

et T98). Plus récemment, on a démontré ' que la transcription du promoteur a4 était sous

l'influence régulatrice du FT Pax-6 (Zaniolo, Leclerc et al. 2004). Pax-6 est notamment

exprimé pendant le développement des structures oculaires et il est responsable de

l'intégrité de l'œil chez les vertébrés (Mathers et larnrich 2000; Zaniolo, Leclerc et al.

2004). Ceci nous a donc amené à 1) comparer les niveaux d'expression de Pax-6 chez

différents types cellulaires provenant de tumeurs métastatiques et non-métastatiques du

mélanome uvéal, 2) vérifier la capacité de liaison de ce FT à la ·séquence du promoteur a4

et finalement, 3) évaluer l'activité transcriptionnelle du promoteur du gène a4 dans ces

mêmes lignées afin de mettre en évidence des différences susceptibles d'expliquer la

progression métastatique de certaines tumeurs.

38

2.2 Matériel et méthodes

2.2.1 Culture cellulaire

Les lignées cellulaires SP6.5, SP8.0, TP31, T97 et T98 sont dérivées de tumeurs

primaires différentes isolées de patients ayant développé un mélanome uvéal (Beliveau,

Bérubé et al. 2000) alors que la lignée H79 est dérivée de métastases secondaires obtenues

du foie d'un patient atteint d 'un mélanome uvéal (Bérubé, Talbot et al. 2005). Nous avons

également mis en culture des mélanocytes (MCN) provenant de la choroïde d'yeux 1

humains sains. Les cellules ont été cultivées dans le milieu de culture DMEM (Dulbecco ' s

modified Eagle's medium) additionné de 10% de sérum de veau fœtal, de 1 mM de

glutamine et de 15 Jlg/JlI de gentamicine à 37°C sous une atmosphère de 5% de CO2. Le

milieu a été changé environ deux fois par semaine afin de permettre aux cellules de

proliférer jusqu'à la densité souhaitée (recouvrement d'environ 80% de la surface du

flacon) à des fins d'extraction des protéines nucléaires.

2.2.2 Extraits nucléaires et immunobuvardage de type western

Les extraits nucléaires ont été préparés à partir des lignées de mélanomes (H79, SP6.5,

SP8.0, TP31, T97 et T98) cultivées à 80% de confluence cellulaire selon la ,procédure

développée antérieurement dans le laboratoire du Dr Guérin. (Roy, Gosselin et al. 1991).

Les extraits nucléaires des différentes lignées cancéreuses provenant de mélanomes

uvéaux (25 Jlg) ont été fractionnés sur gel SDS-PAGE (75 Volts) et ~ransférés sur une

membrane de nitrocellulose (50 Volts). Ces membranes ont été lavées avec du tampon TS

(150 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI pH 7,4) et TSM (tampon TS auquel on ajoute 5% de lait

sans gras et 0,1% de Tween 20) pour ensuite être incubées avec un anticorps primaire dirigé

contre le FT Pax -6 (Santa Cruz Biotechnology ; dilution 1 : 1000) ou un anticorps dirigé

contre l'actine (Jackson Immuno Research laboratories inc. ; diluti9n 1 : 35 000) pendant

Ih30. Les membranes ont ensuite été lavées avec du TSM et -incubées avec un anticorps

secondaire dirigé contre les IgG de lapin couplé à la péroxydase pendant 1 heure (Jackson).

39

Les complexes immunoréactifs ont été révélés par chimiluminescence (<<western blot

detection kit»; Amersham Biosciences).

2.2.3 Retard sur gel (EMSA)

Un oligonucléotide synthétique double-brin (50 ng) correspondant à la séquence de la

région régulatrice a4.1 située entre les positions -62 et -28 par référence au site d ' initiation

de la transcription du gène a4 (5'-GATCTGTGGGAGGAAGGAAGTGGGTATAG

AAGGGTGCT -3 ' ; Audet, Masson et al. 1994) a été radiomarqué au 32p et utilisé en guise

de sonde dans les essais de retard sur gel de la façon suivante: 7,0 ,.d de tampon kinase

10X, 3,0 }.lI d'ATP radiomarqué (y32p ATP; PerkinElmer precise/y, Boston) et 1,0 }.lI

d'enzyme T4 PNK (polynucléotide kinase; 10,000 U/ml) ont été ajoutés à l 'ADN. Le

volume total a été complété à 50 ,.1I avec de l'eau. Le mélange réactionnel a été incubé à

37°C pendant 90 minutes. Un volume de 90 }.lI de Tris 10 mM a été ajouté et la sonde a

ensuite été purifiée sur Elutip-D (BioAmerica Inc.), tel que recommandé par le fournisseur.

L'ADN marqué a été précipité par l'ajout de 1/10 du volume de NaOAC 3 M et 2,5

volumes d'éthanol 95%, à -20°C pendant 2 heures. La radioactivité totale de l'échantillon a

été mesurée à l'aide d'un compteur Bêta (Wallac, « WinSpectral : 1414 Liquid Scintillation

Counter ») et le culot re-suspendu dans du Tris 1 0 mM à raison de 40 000 cpml}.lI. Les

sondes ont été conservées à -20°C pour une période maximale de deux semaines.

Les essais de retard sur gel ont été réalisés selon une technique déjà éprouvée dans le

laboratoire du Dr Guérin (Schneider, Gander et al. 1986). Des gels de polyacrylamide natifs

6% et 8% ont été utilisés (acrylamide 40%; 39: 1) afin de séparer les complexes ADN­

protéine. Le gel a préalablement été soumis à une tension de 120 volts à 4°C pendant 1

heure avant d'y déposer les échantillons. Chaque échantillon contenait 16 000 cpm de

sonde Pax 6, 200 à 500 ng de poly dIdC, ,10 }.lg d'extrait nucléaire, 12 }.lI de Tampon D2X

(20 mM Hepes pH 7,9 + 20% glycérol + 0,2 mM EDTA +O,5mM PMSF), 1,2 mM de KCI

et le volume est complété avec de l'ea jusqu'à 24 }.lI. La migration du gel a été réalisée à

120 volts à 4°C pendant environ 4-5 heures pour un gel à 6% ou 6-8 heures pour un gel à

8% contre une solution de Tris-Glycine IX (0,25 M Tris + 2 M Glycine). Le gel a ensuite

40

été autoradiographié pendant 16 heures à -80°C. Des super-rétentions ont également été

réalisées par l'ajout d'un anticorps spécifique (2 JlI et 4 JlI) dirigé contre Pax-6.

2.2.4 Transfections transitoires

Les plasmides a4-7 6CA T et a4-1 OOOCA T couplés au gène rapporteur CA T

(chloramphénicol acétyl transférase) (Birkenmeier, McQuillan et al. 1991) dans le vecteur

pskCAT ont été utilisés pour les transfections. Les différentes lignées cancéreuses (H79,

SP6.5, SP8.0 et TP31) ont été transfectées de façon transitoire avec les différents vecteurs

(1 Jlg par puits) dans des plaques à 6 puits contenant 200 000 cellules, à l'aide d'un lipide

polycationique (Lipofectamine; Invitrogen). Le plasmide pXGH5 (0,5 Jlg), qui code pour

un variant sécrété de l'hormone de croissance humaine (hGH), a été ajouté à chaque

échantillon. L'activité CAT a été évaluée par dosage enzymatique (Pothier, Ouellet et al.

1992) et la transféction a été normalisée par rapport à la quantité de GH sécrétée dans le

milieu de culture (ImmuChem Double antibody hGH 1251 RIA Kit; ICN Phatmaceuticals

Inc.) ainsi qu'à la quantité de protéine utilisée (dosée par la technique de Bradford;

Fermentas, Life Science). Les activités CAT devaient être au moins trois fois supérieures

au bruit de fond causé par le mélange réactionnel seul pour être considérées significatives.

Les valeurs représentent la moyenne d'au moins trois transfections effectuées en triplicata.

Des analyses statistiques (Test Student) ont été réalisées et les différences ont été

considérées statistiquement significatives lorsque p < 0,05.

41

2.3 Résultats

2.3.1 Expression du facteur de transcription Pax-6 dans le mélanome

uvéal

Les essaIS d'immunobuvardage de type western ont permIS d'évaluer les nIveaux

d'expression de Pax-6 dans les lignées métastatiques et non-métastatiques provenant de

patients atteints d'un mélanome uvéa!. La présence de l'isoforme Pax-6 (5a) de 48 kDa est

évidente dans toutes les lignées tumorales (Figure 2.1). On remarque également que la

protéine Pax-6 de 46 kDa est exprimée seulement dans les mélanocytes normaux (MeN) et

semble absente chez les lignées cancéreuses (Figure 2.1).

H79 8P6_5

48 kDa ::p,..rr .... ' 46 kDa

A.ctine

TP3 l T97 T98

Psx~ Ca) - Psx~

Figure 2.1 - Niveau d'expression du facteur de transcription Pax-6 dans les lignées de mélanomes. Analyse d' immunobuvardage de type western réalisée avec 25 Jlg de protéines nucléaires de chacune des lignées. Les extraits ont été fractionnés sur gel, transférés sur membrane de nitrocellulose et incûbés avec des anticorps dirigés contre le facteur de transcription Pax-6" et contre l'actine. La position des marqueurs de poids moléculaire (kDa) est indiquée sur la figure.

2.3.2 Le facteur de transcription Pax-6 peut lier la séquence de la région

promotrice «4.1

Afin d'évaluer l'activité de lîaison de Pax-6 à la séquence de la région promotrice a4.1,

nous avons réalisé des essais de retard sur gel (EMSA). Dans un premier temps, ces essais

ont été réalisés avec les lignées cancéreuses H79, SP6.5, SP8.0 ainsi que TP31 dans le but

de comparer la lignée métastatique et les lignées non-métastatiques. La sonde utilisée

correspond à la région promotrice a4.1 marquée au 32p. Il est possible d'observer un patron

42

de liaison identique pour les quatre lignées indépendamment de leur pouvoir métastatique

(Figure 2.2 A).

B. A. 1·

~

u

Figure 2.2 - Capacité de liaison de Pax-6 à la séquence régulatrice a4.1. A) Essais de retard sur gel réalisés avec 10 Ilg de protéines nucléaires de chacune des lignées. Ces extraits ont été incubés avec une sonde radiomarquée correspondant à la séquence régulatrice a4.1. B) Afin de vérifier la spécificité des complexes obtenus, des anticorps dirigés spécifiquement contre Pax-6, Ets-l (2 III et 4 Ill) et Sp 1 (4 Ill) ont été ajoutés. Les complexes ADN-protéines ont été séparés sur gel de polyacrylamide (8%) et révélés par autoradiographie. U : sonde libre.

Dans un deuxième temps, des essais de super-rétention en gel ont été réalisés afin de

s'assurer de la spécificité du signal avec la lignée métastatique H79 et une lignée non­

métastatique, SP6.5, en utilisant la même sonde radiomarquée ainsi qu'un anticorps dirigé

contre Pax-6. L'ajout de l'anticorps Pax-6 entraîne la disparition du signal spécifique

produit par ce facteur (Figure 2.2 B). Ce phénomène s'observe autant dans la lignée

métastatique (H79) que dans la lignée non-métastatique (SP6.5). La disparition du signal,

plutôt que sa super-rétention, est due au fait que l'anticorps dirigé contre Pax-6 se lie au

domaine de liaison à l'ADN de la protéine l'empêchant ainsi de lier la sonde. Cependant,

lorsqu'un anticorps dirigé contre les FTs Ets-l ou Sp 1 est ajouté au mélange réactionnel, on

43

ne remarque aucune disparition du signal ni aucune formation d'un super-complexe quel

qu'il soit avec les extraits H79 ou SP6.5 (Figure 2.2 B). Ces résultats démontrent ainsi la

spécificité du signal correspondant à Pax-6. La présence de la bande correspondant au

signal spécifique de Pax-6 dans les quatre lignées cancéreuses (Figure 2.2 A) suggère que

Pax-6 possède la capacité de lier la séquence de la région promotrice a4.1 autant dans la

lignée métastatique H79 que dans les lignées non-métastatiques SP6.5, SP8.0 et TP31.

2.3.3 Pax-6 est un répresseur de l'activité du promoteur a4

Des essais en transfection transitoire ont été réalisés afin de définir l'influence

régulatrice de Pax-6 sur le promoteur du gène a4. Les résultats obtenus permettent

d'affirmer que l'activité dirigée par le plasmide portant le plus long segment du promoteur

a4 (-1 000a4CAT) est plus iinportante dans la lignée métastatique H79 que dans les lignées

non-métastatiques SP6.5, SP8.0 et TP31 (Figure 2.3). Bien qu'une activité moindre que

celle observée dans les H79 ait été mesurée dans la lignée SP6.5, cette dernière demeure

tout de même facilement mesurable comparativement à SP8.0 et TP31, toutes deux étant

incapables d'assurer une transcription dirigée par le plasmide recombinant -1000 a4CAT.

H79

TP3l

....... o o o cr

1

~ 16 =211

A'ctivité CAT (%CAI/hGH) t-J o o o

~

o o o

9

~ o o o 9

----t 3 659:: 14

18 841 = 334

!

Figure 2.3 - Activité transcriptionnelle du promoteur du gène a4. Le plasmide -IOOOa4CAT a été transfecté dans les lignées de mélanome uvéal H79, SP6.5, SP8.0 et TP31. Le graphique représente la moyenne des activités CA T (normalisées par rapport à la GH) obtenues suite à trois transfections réalisées en triplicata.

44

De plus, des essais ont été réalisés en transfectant de petits ARN interférents (iARN) de

21 à 25 pb dirigés contre le transcrit Pax-6 conjo~ntement avec les vecteurs contenant soit le

plus court (-7 6a4CA T) ou le plus long (-1 000a4CA T) segment du promoteur a4 dans la

lignée métastatique H79 et dans la lignée non-métastatique SP6.5. Par l'ajout d'iARN, il est

possible de diminuer considérablement l'expression de Pax-6 en stimulant l'élimination de

son transcrit dans le but de définir son influence sur l'activité du promoteur a4. On

remarque que les iARN Pax-6 dans la lignée H79 (Figure 2.4 A) provoquent une

augmentation de l'activité du promoteur a4 d'environ 2,4 fois lorsque transfectés avec lé

plasmide -76a4CAT et d'environ 3,6 fois avec le plasmide -1000a4CAT en comparaison

avec l'activité initiale mesurée en absence d'iARN (correspondant à 100%). Une tendance

similaire, mais d'amplitude accrue, est également observée dans la lignée non-métastatique

SP6.5 (Figure 2.4 B). En effet, en présence d'iARN, on remarque une augmentation plus

prononcée de l'activité du promoteur a4 dans la lignée SP6.5 pour le plasmide -76a4CAT

(environ 4 fois) et pour le plasmide -1000a4 CAT (près de 9 fois) par rapport à l ' activité

obtenue sans iARN (100%).

Afin de confirmer le rôle du FT Pax-6 dans les lignées de mélanome, nous avons

également transfecté transitoirement un vecteur sur-exprimant la protéine Pax -6 dans les

lignées H79 et SP6.5 simultanément avec les mêmes vecteurs utilisés pour l'interférence à

l' ARN. Ainsi, la transfection du vecteur Pax -6 dans la lignée .H79, entraîne une diminution

de 3 fois de l'activité du promoteur contenu sur le plasmide -76a4CAT et de 2 fois avec

celui porté par ~ 1000a4CAT (Figure 2.4 A) en référence à l'activité initiale du promoteur

ayant été transfecté avec le vecteur vide (pUCI9). Ce même phénomène s'observe

également dans la lignée non-métastatique SP6.5 dans laquelle une diminution de près de 2

fois l'activité initiale du promoteur est observée, tant avec le plasmide -7 6a4CAT, qu'avec

le plasmide -1000a4CAT (Figure 2.4 B).

Selon les résultats obtenus, dans chacun· des cas, Pax-6 semble jouer un rôle de

répresseur de l'activité du promoteur a4, tant dans la lignée métastatique H79 que dans la

lignée non-métastatique SP6.5.

45

A. ACÜ'l'i é CAT rela ti\ i'e

0.4-6

a. - 6+ iARN

0.4-1 000

a -1000 + iARN

04-1 000 + V~ctellr

B.

a4- 6

,a4-16 + iARN

,0.4-1000

'M-l 000 + iARN 1---+---...-...----4 989 = 11].4-1000 + v ecteur

Figure 2.4 - Influence de Pax-6 sur l'activité du promoteur du gène a4. Les plasmides -76a4CAT (a4-76) et -lOOOa4CAT (a4-1000) ontété transfectés eJans la lignée métastatique R79 (A) ou dans la lignée non-métastatique SP6.5 (B) cultivées à confluence. Les transfections ont également été réalisées en présence d'ARN interférent ciblant le facteur de transcription Pax-6 (iARN) ou en présence d'un vecteur sur-exprimant Pax-6 (Vecteur). Le graphique représente la moyenne relative des activités CAT (normalisées par rapport à la GR) obtenues suite à trois transfections réalisées en triplicat.

46

2.4 Discussion

Il est maintenant admis que la fonnation de métastases résulte de la migration des

cellules cancéreuses d'un mélanome uvéal primaire vers d'autres organes cibles du corps,

principalement le foie (dans près de 90% des cas; Diener-West, Hawkins et al. 1992). Ce

phénomène pourrait être dicté par l' intégrine a4 puisqu'elle est responsable, entre autre, de

la migration cellulaire (Aplin, Howe et al. 1998) et qu'elle est surexprimée dans la lignée

H79. Nous savons également, par de récentes études, que le gène encodant cette intégrine

voit sa transcription modulée par le FT Pax-6 (Zaniolo, Leclerc et al. 2004) et l'expression

aberrante de ce dernier pourrait donc être la cause du développeinent d'une tumeur à un

foyer secondaire.

Nos résultats d'immunobuvardage de type western démontrent cependant que Pax-6

(46kDa) est exprimé seulement dans les mélanocytes nonnaux (Figure 2.1) alors que

l'isoforme Pax-6 (5a) (48 kDa) est exprimé dans toutes les lignées cancéreuses

. indépendamment de leur pouvoir métastatique (Figure 2.1). De plus, on remarque que Pax-

6 (5a) semble autant exprimé dans toutes les lignées cancéreuses et aucune différence

significative n'a été observée entre les lignées. Selon la littérature sur ce sujet, les isoformes

de Pax-6 semblent, à ce jour, exercer la même fonction que Pax-6 de 46kDa (Epstein,

Glaser et al. 1994; Kozmik, Czerny et al. 1997; Chauhan, Reed et al. 2002), ce qui pennet

de croire que Pax-6 (5a) pourrait agir de manière similaire à Pax-6 sur le promoteur du gène

de l'intégrine a4.

Même si le niveau de Pax-6 (5a) semble identique dans toutes les lignées cancéreuses, la

présence de la protéine ne nous renseigne aucunement sur la capacité de ce facteur à se lier

au promoteur a4 et d'agir ainsi en tant que FT. Cependant, les résultats obtenus suite aux

analyses de retard sur gel permettent de confinner que l'isofonne Pax-6 (5a) est capable de

lier la séquence régulatrice a4.1 dans toutes les lignées cancéreuses, métastatiques ou non

(Figure 2.2 A). De plus, nos résultats confinnent non seulement l'identité de Pax-6, mais

également la spécificité de sa liaison à la sonde et ce, grâce au signal obtenu in vitro pour

Pax-6 (Pax-6 (5a) correspondant au même signal) dans les lignées H79, SP6.5, SP8.0 et

47

TP31 (Figure 2.2 B-C). Nous savons maintenant que non seulement Pax-6 (5a) est présent

dans toutes les lignées cancéreuses, mais qu'il est également abilité à lier la séquence a4.1

autant dans la lignée métastatique que dans les lignées non-métastatiques.

Les résultats des transfections transitoires démontrent qu'effectivement, l'activité du

promoteur a4 est plus élevée dans la lignée métastatique H79 que dans les lignées SP6.5,

SP8.0 et TP31 (Figure 2.3). L'inhibition de l'expression de Pax-6 par iARN ou sa sur­

expression avec le vecteur sur-exprimant Pax-6 (Figure 2.4 A-B), ont permis de confirmer

le rôle de Pax-6 sur l'activité transcriptionnelle du promoteur du gène a4. Considérant que

les isoformes de Pax-6 possèdent sensiblement les mêmes fonctions et que, par analyse

d'immunobuvardage de type western, seul Pax-6 (5a) semble exprimé dans nos lignées, ce

dernier pourrait donc vraisemblable~ent exercer une influence négative sur l '·activité du

promoteur a4. En effet, en inhibant l'expression de Pax-6 par l'ajout de petits ARNs

. interférents, nous obtenons une augmentation de l'activité du promoteur (Figure 2.4 A)

comparativement à une diminution lorsque ce FT est sur-exprimé dans ces cellules (Figure

2.4 B). Ainsi, Pax-6 ne semble pas être l'élément déterminant qui permettrait d'expliquer

l'expression aberrante de la sous-unité a4 puisqu'il est présent dans toutes les lignées,

qu'elles soient métastatiques ou non. De plus, cet isoforme (Pax-6 (5a)) semble être un

puissant répresseur de l'activité dirigée par le promoteur a4 dans les lignées cancéreuses

dérivées d'un mélanome uvéal, ce qui corrobore une étude qui a rapporté Pax-6 comme

étant un répresseur de la transcription (Duncan, Haynes et al. 1998).

Ces résultats suggèrent donc qu'un autre facteur pourrait également se lier à la séquence

du promoteur a4 et moduler l'expression aberrante de ce gène contribuant ainsi à la

migration des cellules cancéreuses des vaisseaux sanguins vers le foie. Nous croyons qu'il

pourrait se produire une compétition entre les protéines se liant aux régions régulatrices

a4.1 et a4.2, empêchant ainsi Pax-6 de se lier à sa séquence cible dans le promoteur a4

dans la lignée métastatique H79, empêchant de surcroît Pax-6 de réprimer l'activité de ce

promoteur. De plus, puisque le FT. Pax-6 fait partie du complexe protéique Bp5 (Zaniolo,

Leclerc et al. 2004), il se pourrait donc qu'un autre facteur présent dans l'un ou l'autre des

complexes Bp puisse compétitionner directement avec la liaison de Pax-6. En effet, certains

48

travaux visant à caractériser les protéines Bp 1 à Bp5 appuient nos résultats (Larouche,

Leclerc et al. 1996). Ainsi, lorsque le complexe protéique Bp2 est mis en présence du

complexe Bp5, on observe la compétition pour le site de" liaison commun qui entraîne une

baisse du signal de Bp5. De plus, certains travaux ont permis de démontrer la présence du

complexe Bp2 dans la lignée non-métastatique SP6.5 (Larouche, Larouche et al. 1998).

Ceci suggère que malgré la présence de Pax-6 (5a) dans cette lignée, une compétition entre

" les complexes Bp2 et Bp5 pour la liais?n sur le promoteur du gène a4 pourrait survenir.

Ainsi, si le même phénomène survient également dans les autres lignées, Pax -6 ne pourrait

interagir avec l'élément a4.1 afin de réprimer le promoteur a4 dans la lignée H79.

Alternativement, un activateur fort pourrait présenter plus d'affinité pour la séquence du

promoteur a4 dans cette lignée et ainsi activer plus fortement ce promoteur éclipsant, par le

fait même, l'influence négative de Pax-6.

Il importe également de souligner" la présence de sites de liaison pour d'autres facteurs

de transcription dans la région promotrice du gène a4. En effet, la présence de sites pour

des FTs appartenant à la famille Ets près de la région a4.1 a été rapportée par Rosen et ses

collaborateurs (Figure 1.9) (Rosen, Birkenmeier et al. 1991; Rosen, Barks et al. 1994).

Cette famille de facteurs de transcription contient plus de 30 membres dont la plupart sont

de puissants activateurs. Sachant qu'il existe des sites de liaison près des séquences

régulatrices a4.1 et a4.2, la protéine constituant le complexe Bp2 pourrait fort bien

appartenir à la famille Ets.

Il est également possible que Pax-6 puisse subir des modifications post-traductionnelles,

telles que la phosphorylation ou la glycosylation, l'empêchant ainsi d'agir en tant que

répresseur dans la lignée métastatique H79. En effet, plusieurs études démontrent que ces

modifications peuvent changer et moduler les fonctions de Pax -6 (Lefebvre, Planque et al.

2002; Yan, Liu et al. 2007) ce qui pourrait expliquer la diffé~ence observée entre les lignées

métastatiques ou non.

En résumé, les résultats obtenus nous indiquent qu'un évènement additionnel survient

afin d'activer le promoteur a4 dans la lignée métastatique H79 et que le FT Pax-6 ne peut

49

être le responsable de cette expreSSIon aberrante puisqu'il semble réprimer l 'activité

transcriptionnelle du promoteur a4 dans les lignée~ cancéreuses dérivées de mélanomes

~véaux primaires ou de métastases hépatiques secondaires. Suivant les hypothèses

mentionnées précédemment afin d'expliquer ce phénomène, il serait intéressant

premièrement de déterminer si Pax-6 subit"des modifications post-traductionnelles dans la

lignée métastatique H79, car celles-ci pourraient notamment changer la nature de son

influence sur l'activité transcriptionnelle du promoteur a4 ou, tout simplement, l ' empêcher

de lier la séquence du promoteur et d'agir en tant que répresseur. Toutefois, la sur­

expression de Pax-6 dans les lignées H79 et SP6.5 entraînant un effet (répression)

d'amplitude similaire, il est donc improbable que des différences dans d'éventuelles

modifications post-traductionnelles soient en cause dans l'expression différentielle du gène

a4. De plus, il serait important d'approfondir l'étude des facteurs de transcription membres

de la famille Ets afin de définir si un de ceux-ci pourrait activer le promoteur du gène a4,

permettant ainsi aux cellules cancéreuses d'acquérir un pouvoir métastatique leur

permettant d'établir de nouveaux foyers cancéreux au foie.

50

3. Influence de la sous-unité aS dans les propriétés tumorigènes du mélanome uvéal

3.1 Introduction

La plupart des individus atteints d'un mélanome. uvéal ne développeront aucune

complication métastatique liée à cette forme de cancer. Toutefois, dans un certain nombre

de cas, la maladie évoluera plus rapidement et causera le décès du patient dans les dix

années suivant le diagnostic (Kincaid 1998) en raison de l'apparition de métastases au foie

des individus atteints. Des variations dans l'agressivité des cellules de ces tumeurs

pourraient expliquer la différence entre survie et mort chez les patients atteints d'un

mélanome uvéal. Des études réalisées dans notre laboratoire ont démontré que d'après le

suivi de plusieurs patients atteints d'un mélanome uvéal, ceux démontrant une plus forte

expression de la sous-unité d'intégrine a5 semblaient survivre plus longtemps que les

patients démontrant une plus faible expression (Tableau 3.1).

T bl a eau 3 1 R' 'd esume es cas d' ' ou provlennen tl r es 12nees cancereuses Lignée

Origine Âge, Date de Date de Suivi

Histologie cellulaire Sexe l'énuclation l'invasion au foie (mois)

SP6.5 TP 77,F 01/26/88 - 111 Mixte

SP8.0 TP 48,M 04/05/88 01101196 138* Mixte

TP31 TP 62,M 10/08/91 10/13/94 38* Mixte T97 TP 69,M 05/06/02 - 75 Mixte

T98 TP 32,M OS/27/02 - 69 Mixte T108 TP 44,M 04/20/04 - 44 Mixte

Tl15 TP 30,F 02/03/06 - 65 Mixte . Les lignées cellulaires sont dérivées de tumeurs uvéales primaires (TP). L'âge correspond à l'âge des patients au moment du diagnostic de la tumeur primaire. Le suivi débute suite au diagnostic du mélanome uvéa!. On a perdu la trace du patient duquel la lignée SP6.5 a été dérivée. Aucune métastase au foie n'avait été décelée lors de sa dernière visite. L'astérisque indique la fin du suivi après la mort du patient suite à des métastases secondaires.

Nous avons donc supposé que la sous-unité a5 pouvait jouer un rôle dans l'agressivité

tumorale chez les patients atteints d'un mélanome uvéal. Des lignées cellulaires dérivées de

51

différentes tumeurs uvéales primaires (T97, T98, T108 et T115) ont été utilisées en guise

de modèle pour l'étude de l'agressivité tumorale. Selon des analyses réalisées en cytométrie

de flux dans notre .laboratoire, les lignées T97 et T98 expriment des niveaux très faibles de

la sous-unité a5 à leur surface cellulaire tandis qu'elle est fortement exprimée dans les

lignées Tl 08 et T 115 (Figure 1.15). La différence entre les lignées se dénote également à

l'analyse du transcrit a5 par RT -PCR (Figure 1.16). Compte tenu de ces résultats, nous

avons évalué qualitativement le potentiel tumorigène . de ces lignées puisque celles-ci

n'avaient encore jamais été caractérisées. Par la suite, nous avons évalué les niveaux

d'activité transcriptionnelle du promoteur du gène a5 dans ces mêmes lignées. Finalement,.

sachant, par des études antérieures réalisées dans notre laboratoire, que le promoteur du

. gène a5 est principalement sous l'influence régulatrice des facteurs de transcription Sp 1,

AP-1 et NFI (Gingras, Larouche et al. 2003), nous avons déterminé les niveaux

d'expression et l'influence de chacun de ces facteurs dans les quatre lignées tumorales

ciblées (T97, T98, T108 et Tl15).

52

3.2 Matériel et méthodes

3.2.1 Culture cellulaire

Les lignées cellulaires T97, T98, TI08 et T115 sont dérivées directement de tumeurs

primaires isolées de patients ayant été diagnostiqués avec un mélanome uvéal. Les cellules

ont ~té cultivées dans le milieu de culture DMEM (Dulbecco's modified Eagle ' s medium)

additionné de 10% de sérum de veau fœtal, de 1 mM de glutamine et de 15 JlgIJlI de

gent~micine et incubées à 37°C sou~ une atmosphère de 5% de CO2. Le milieu a été changé

environ à tous les deux jours afin de permettre aux cellules de proliférer jusqu'à la densité

souhaitée (recouvrement d'environ 80% de la surface du flacon) à des fins d' extraction des

protéines nucléaires.

3.2.2 Culture cellulaire en agar mou

Les essais d'indépendance à l'ancrage ont ' été réalisés en mélangeant de l' agarose 2%

liquéfié à un volume égal de DMEM 2X sans sérum supplémenté de 15 Jlg/JlI de

gentamicine. Un millilitre de ce mélange a été versé çlans des pétris de 35 mm de diamètre

afin de créer une base d'agarose à 1 %. De l'agarose 0,6% liquéfié a ensuite été mélangé à

un volume égal de DMEM 2X et 1 ml de cette solution a été mélangé à 100 JlI de cellules

en suspension (correspondant à 104 cellules/ml) dans du milieu DMEM complet. Cette

suspension cellulaire de 0,27% d'agarose a ensuite été étendue sur la base d'agarose 1 %

gélifiée et 1 ml de DM~M complet contenant 10% de sérum de veau fœtal y a été ajouté

par-dessus cette préparation. Les pétris ont é,té incubés à 37°C sous une atmosphère de 5%

de CO2 pendant 7 jours et ont été photographiés en contraste de phase en utilisant un

microscope (Nikon TE 2000-S Eclipse) équipé d'une caméra numérique (Qimaging Retiga

1300) (Desprez, Lin et al. 1998).

53

3.2.3 Transfections transitoires

Les plasmides -92a5-CAT, -132a5-CAT et -954a5-CAT, qUI contiennent

respectivement la séquence du promoteur a5 comprise entre les positions -92 à +23 , - 132 à

+23 et -954 à +23, couplée au gène rapporteur de la chloramphénicol acétyle transférase

(CAT) ont été utilisés pour les transfection transitoires (Birkenmeier, McQuillan et al.

1991). Ces séquences contiennent ou non des mutations dans les sites de liaison pour les

facteurs de transcription SpI (dans les sites proximal et distal; -132a5-CAT/Mp, -132a5-

CAT/Md, -132a5-CAT/Mp+d), AP-1 et NFI (introduites par mutagenèse dirigée ; -92a5-

CAT/AP-1m+NFIm, -92a5-CAT/NFIm+SP1m, -92a5-CAT/SP1m+AP-1m, -92a5-

CAT/SP1m+AP-1m+NFIm (triple mutants)). Les différentes lignées de mélanome uvéal

(T97, T98, T108 et Tl15) ont été transfectées de façon transitoire avec les différents

vecteurs (1 flg par puits), dans des plaques à 6 puits contenant 200 000 cellules, à l'aide

d'un lipide polycationique (Lipofectamine; Invitrogen). Le plasmide pXGH5 (0,5 flg) , qui

code pour un variant sécrété de l'hormone de croissance humaine (hGH), a été ajouté à

. chaque puits. L'activité CAT a été évaluée par dosage enzymatique (Pothier, Ouellet et al.

1992) et la transfection a été normalisée par rapport à la quantité de GH sécrétée dans le

milieu de culture (ImmuChem Double antibody hGH 1251 RIA Kit; ICN Pharmaceuticals

Inc.) ainsi qu'à la quantité de protéine utilisée pour chaque mesure (dosage Bradford). Les

activités CAT devaient être au moins trois fois supérieures au bruit de fond, causé par le

mélange réactionnel seul, pour être considérées significatives. Les valeurs représentent la

moyenne d'au moins trois transfections effectuées en triplicata. Des tests statistiques (test

Student) ont été réalisés et les différences ont été considérées statistiquement significatives

lorsque p < 0,05.

3.2.4 Extraction d'ARN et analyse en RT-PCR

L'ARN total des lignées T97, T98, T108 et Tl15 a été isolé par l'ajout de la solution

d'extraction Tri Reagent (Molecular Researchcenter, Inc) à partir des cellules cultivées à

80%. La transcription inverse de l' ARN isolé a été réalisée en utilisant la trousse ­

«Superscript II Transcriptase» (Invitrogen Gibco) (Gingras, Larouche et al. 2003). L'ADN

complémentaire nouvellement transcrit a été purifié sur une colonne «QIAquick nucleotide

54

removal kit» (Qiagen) et utilisé pour l'amplification PCR du transcrit a5, des transcrits

encodant les facteurs de transcription SpI, AP-I et NFi et des enzymes HMBS et GAPD.

Les amorces utilisées pour l'amplification (Tableau 3.2) ont été dérivées à partir du logiciel

GenBankTM. Les amplifications PCR ont été réalisées avec la Taq polymérase PlatÏnum

(Invitrogen) en utilisant les paramètres suivants: 30 secondes à 95°C (dénaturation), 30

secondes à 58°C (hybridation) et 30 secondes à 72°C (élongation) pendant une période de

25 à 40 cycles selon le gène (a5 et GAPD : 25 cycles ; SpI, c-Fos, Fra-2 et NFI: 27 cycles ;

SP?: 35 cycles ; membres de la famille Jun, FosB, Fra-I et HMBS : 40 cycles). Les

produits PCR ont été révélés sur un gel d'agarose (1,6%) coloré au bromure d 'éthidium

(0,5 Jlg/ml).

Tableau 3.2 Séquences des amorces utilisées pour le RT-PCR semi-quantitatif Brin Sens Référence

Brin Anti-sens Produit PCR (bp) Genbank Gène

. _______________________________ i~~l'l _______________________________________ ~_______ Accession

a5

SpI

Sp3

NFI-A

NFI-B

NFI-C

NFI-X

c-Jun

JunB

JunD

c-Fos

FosB

Fra-l

Fra-2

GAPD

HMBS

CCAGGATGGCTACAATGATG CCCACAATCAGATCAGGATA

ATTGAGTCACCCAATGAGAACAG CAGCCACAACATACTGCCC

TCTCATACCACAGACTGGTCAA TTTATCAAATGTCCGTCGGCAT

ACGCTGAAAGAATTTGTCCAACT GGGGTCAGGTGGTCTGTCT

TATTCGCCAGGAGTATCGAGAG CTAGATCCAGACGCCAGACTT

TACCTGGCCTACTTCGTGC AGTTGGGTCCTGTTCCAGTCA

GAAGCCCGAGATCAAGCAGAA GAGGCGACTTGTAGAGCCG

TGGAAACGACCTTCTATGACGA GTTGCTGGACTGGATTATCAGAA

TACCACGACGACTCATACACA CGCTTTGAGACTCCGGTAGG

AAACACCCTTCTACGGCGATG GTCAGCGCGTCCTTCTTCAT

GTCTCCAGTGCCAACTTCATT CCTCCTGTCATGGTCTTCACA TTTCCCCGGAGACTACGACTC

CTGGTTGTGATCGCGGTGA TTCCGAGACTTCGGGGAAC

CCCCAGGAAATGAGGCTGTA AGAAATTCCGGGTAGATATGCCT

GGTATGGGTTGGACATGGAGG ATGCAACGGATTTGGTCGTAT TCTCGCTCCTGGAAGATGGTG

GGCAATGCGGCTGCAA GGGTACCCACGCGAATCAC

222 NM_002205

241 NM 138473

216 AF494280

300 NM 005595

149 NM_005587

205 NM_005597

275

242 NM 002228

129 NM_002229

148 .NM 005354

191 . NM_005252

180 NM_006723

177

129 NM 005253

220 NM 002046

64 NM 000190

55

3.2.5 Extraits nucléaires et immunobuvardage de type western

Les extraits nucléaires ont été préparés à partir des lignées de mélanomes (T97, T98,

T108 et Tl15) cultivées entre 80-90% de confluence cellulaire selon la procédure

développée antérieurement dans le laboratoire du Dr Guérin (Roy, Gosselin et al. 1991).

Les extraits nucléaires des différentes lignées cancéreuses provenant de mélanomes

uvéaux (25 Jlg) ont été fractionnés sur un gel SDS-PAGE (75 Volts) et transférés sur une

membrane de nitrocellulose (50 Volts). Ces membranes ont été lavées avec du tampon TS

(150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI pH7,4) et TSM (tampon TS auquel on ajoute 5% de lait

sans gras et 0,1% de Tween 20) pour ensuite être incubées avec un anticorps primaire dirigé

contre les FTs Sp 1, Sp3 et NFI (Santa Cruz ~iotechnology ; dilution 1 :2000) ainsi flue

contre les sous-unités JunB, c-Jun, JunD, FosB, c-Fos, Fra-1 et Fra-2 du facteur AP-1

(Santa Cruz Biotechnology ; dilution 1: 1000) ou avec un anticorps dirigé contre l' actine

(Jackson Immuno Research Laboratories Inc. ; dilution 1 :35 000) pendant 2 heures. Les

membranes ont ensuite été lavées avec du TSM et incubées avec un anticorps secondaire

dirigé contre les IgG de lapin couplé à la péroxydase pendant 1 heure. Les complexes

immunoréactifs ont été révélés par chemiluminescence (<<Western blot detection kit»;

Amersham Biosciences).

3.2.6 Retard sur gel (EMSA)

Les analyses de retard sur gel ont été réalisés selon le protocole décrit précédemment

(Chapitre 2; Section 2.2.3) en utilisant, en guise de sonde radiomarquée, des

oligonucléotides à haute affinité pour: SpI (5'GATCATATCTGCGGGGCGGGGCAG

ACACAG-3') (Dynan et Tjian 1983), NFI (5'-GATCTTATTTTGGATTGAAGCC

AATATGAG-3') (de Vries, van Driel et al. 1987) et AP-1 (5'-GATCCCCGCGTTGAGTC

ATTCGCCTC-3') (Coibi, Jensen et al. 2000). Les complexes ADN-protéines ont été

séparés sur un gel de polyacrylamide natif 8% en utilisant le tampon Tris-Glycine (50 mM

Tris, 2,5 mM EDT A, 0,4 M glycine) pour la migration (Schneider, Gander et al. 1986). Les

gels ont été séchés et les complexes ADN/protéine ont été révélés par autoradiographie.

Pour les compétitions, des oligonucléotides non-marqués ont été ajoutés au mélange

56

réactionnel en excès molaire à raison de I DOX ou 250X par rapport à la sonde. Des super­

rétentions ont également été réalisées par l'ajout d'un anticorps spécifique dirigé contre

chacun des facteurs de transcription (SpI , Sp3, NFI et AP-I; Santa Cruz Biotechnology).

57

3.3 Résultats

3.3.1 Potentiel tu morigène et capacité des cellules 'à générer des colonies

en agar mou

Les images générées par microscopie en contraste de phase des différentes lignées

cancéreuses ont permis de déterminer à quel type morphologique (épithélial, fusiforme ou

mixte) appartenaient les cellules cancéreuses. En effet, en comparaison aux mélanocytes

normaux de la choroïde (MeN) (Figure 3.1), les lignées cancéreuses T97, T98, TI08 et

T115 (Figure 3.1) présentent toutes un patron mixte contenant néanmoins beaucoup de

cellules de type épithélioïde.

Figure 3.1 - Morphologie cellulaire. Microscopie en contraste de phase de cultures en monocouche des lignées cellulaires T97, T98, TI08 et Tl15 dérivées de mélanomes uvéaux primaires humains. MeN: Mélanocytes non-néoplasiques. Grossissement: 100X.

58

Les essais d'indépendance à l'ancrage réalisés en agar mou ont permis de déterminer si

les lignées cellulaires utilisées (T97, T98, Tl 08 et T 115) étaient réellement des cellules

cancéreuses. En effet, les cellules dites normales sont incapables de s'ancrer à ce type de

substrat, celles-ci entrant en apoptose, tandis que les cellules cancéreuses prolifèrent de

façon à former de petites colonies. L'expérience a été réalisée avec des mélanocytes

normaux de l' œil (MCN) en guise de contrôle négatif ainsi qu'avec les quatre lignées

provenant de tumeurs uvéales primaires (T97, T98, T108 et Tl15). Nous avons pu observer

l'absence complète de colonie avec les MCN (contrôle négatif) (Figure 3.2).

MeN

l00x 200x

'.

97

'. T108

Figure 3.2 - Indépendance à l'ancrage sur substrat d'agar mou. Les mélanocytes non-néoplasiques de l'œil humain (A) et les lignées dérivées de mélanomes uvéaux primaires T97 (B) et TI08 (C) ont été cultivés sur agar mou. Les cultures ont été photographiées 7 jours plus tard en microscopie en contraste de phase. Grossissement: lOOX et 200X.

59

Cependant, bien que les quatre lignées cancéreuses présentaient plusieurs colonies sur

agar mou, nous avons choisi d'illustrer les pétris ensemencés avec les lignées T97 (Figure

3.2 B) et T108 (Figure 3.2 C) puisque ces deux lignées représentent à la fois une lignée qui

sous-exprime la sous-unité a5 à sa surface cellulaire (T97) et une lignée qui exprime

davantage cette même sous-unité (T108) (Figure 1.15). Ces r~sultats confirment ainsi le

phénotype cancéreux des lignées de mélanome T97, T98, T108 et Tl15.

3.3.2 Activité transcriptionnelle du promoteur du gène aS

Des essais en transfections transitoires ont été réalisés afin de définir les nIveaux

d'activité transcriptionnelle dirigés par le promoteur du gène a5 dans les lignées T97, T98,

T108 et T 115. Des plasmides recombinants portant le gène rapporteur CAT fusionné à

différents segments du promoteur a5 (-92a5CAT, -132a5CAT et -954a5CAT) ont été

transfectés afin d'observer les différences entre ces lignées. Nous avons remarqué une plus

forte activité du promoteur a5 dans les lignées T108 et Tl15 comparativement aux lignées

T97 et T98 et ce, pour tous les segments du promoteur utilisées (Figure 3.3). Toutefois,

cette différence est davantage marquée lorsque les cellules sont transfectées avec le

plasmide portant le plus long segment du promoteur a5 (-954a5CAT). En effet, il est

possible d'observer une différence 'd'au moins dix fois dans l'activité du promoteur a5 dans

les lignées T108 et Tl15 comparativement aux lignées T97 et T98 lorsque le plus court

segment (-92a5CAT) est utilisé. Cette différence s'accroît à près de dix-huit fois avec le

plasmide -954a5CAT par rapport aux résultats obtenus dans la T98. Qui plus est, il s'agit

du segment du promoteur se rapprochant le plus de la version endogène du gène a5. Ceci

confirme donc que le gène a5 est plus fortement transcrit dans les lignées T108 et Tl15 que

dans les lignées T97 et T98.

-92(15

-132u5

-954(15

Act ivité CAT ( oCAT/hGR)

[-9 2a5 --13 0.5 ~ -950.5]

...... 00 0

0 0 0

f f 9 0 0

......

.t>.­o o

60

~================================~~ ____ -. ____ -.~+---~ 169 ±~

.T9 .T98 DT1 0B DTl1 5

Figure 3.3 - Activité transcriptionnelle du promoteur du gène aS. Les plasmides -92a5CAT, -I32a5CAT et -954a5CAT ont été transfectés dans les lignées de mélanome uvéal T97, T98, TI08 et T II5. Le graphique représente la moyenne des activités CA T (normalisées par rapport à la GH) obtenues suite à trois transfections réalisées en triplicata. N.D.: Non détectable.

3.3.3 Niveau d'expression des transcrits encodant les facteurs de

transcription SPI, SP3, AP-I et NFI dans les lignées de mélanomes

Les essais réalisés par RT -PCR semi-quantitatif ont permis de confirmer la sous­

expression de la sous-unité a5 dans les lignées T97 et T98 comparativement à T108 et

T 115. En effet, nous avons remarqué une diI?inution considérable du transcrit a5 dans ces

deux lignées après 25 cycles d'amplification par PCR (Figure 3.4). De plus, nous avons

noté plusieurs différences au niveau des transcrits des différents facteurs de transcription

qui modulent l'activité du promoteur a5 soit SpI ,' Sp3, NFI et plusieurs membres de la

61

famille AP-l. Ainsi, des différences ont été observées au niveau du transcrit Sp 1, plus

abondant dans la T97, et le transcrit Sp3 qui, au contraire, semble plus abondant dans les

lignées TI08 et T115 (Figure 3.4).

- - -----

5 ~ ............

\....; 1 1 j

- - -

Sp1 ' p

c Jun

JunB, 1 ~

-------

Fa 1 ~

Fr -1 ........... ~ -.. --. "

NFI B

N tC

F X

GAPD

- - - - -

'-. ...... l---.j'

-- -- -----

~~ . - - -- -- -- --- - --

L.) II. 1. \

--Fl

Cris

Figure 3.4 - Niveaux des transcrits endogènes encodant la sous-unité aS et les facteurs de transcription Spl, Ap-l et NFI. L'ADN complémentaire a été produit par transcription inverse de l'ARN total isolé de différentes lignées dérivées de mélanomes uvéaux primaires et ensuite amplifié par PCR en utilisant des amorces spécifiques pour a5 (25 cycles); pour SpI (27 cycles) et Sp3 (35 cycles); pour les sous­unités AP-l: membres Jun, FosB et Fra-I (40 cycles), c-Fos et Fra-2 (27 cycles); pour NF! (27 cycles); et pour les contrôles GAPD (25 cycles) et HMBS ( 40 cycles).

Les transcrits pour les sous-unités Jun du FT AP-I (c-Jun, JunB et Jun D) semblent

également plus fortement exprimés dans les lignées TI08 et Tl15 (Figure 3.4). Cependant,

les autres membres de la famille AP-I ne semblent pas suivre la même tendancé, exception

faite du transcrit Fra-l, qui est également plus élevé dans les lignées TI08 et Tl15 (Figure

3.4). Le transcrit de c-Fos semble moins abondant dans ces deux lignées (TI08 et T115)

62

alors que ceux de FosB ét Fra-2 ne démontrent aucune différence entre les quatre lignées

(Figure 3.4).

Finalement, il importe de souligner que des différences importantes dans l'expression de

certains isoformes de NFI, et plus particulièrement NFI-A et NFI-X ont été observées entre

ces lignées. En effet, nous avons noté l'absence complète du transcrit NFI-A ·dans la lignée

T98 et une forte expression de celui-ci dans la lignée 1'108 (Figure 3.4). Le transcrit de

NFI-X est plus fortement exprimé dans les lignées T97 et T98 que dans les lignées Tl08 et

Tl15 (Figure 3.4). La transcription des isoforriles NFI-B et NFI-C semble comparable entre

les quatre lignées de mélanome uvéal (Figure 3.4). En conclusion, plusieurs différences

dans l'expression des transcrits de certains facteurs de transcription importants pour

l'expression du gène a5 ont été .observées, ce qui pourrait contribuer à conférer les

propriétés qui caractérisent les lignées T97-T98 et Tl08-Tl15.

3.3.4 Niveau d'expression des facteurs de transcription SPI; SP3, AP-I et

NFI dans les lig~ées T97, T98, TI08 et Tl15

Par des essais d'immunobuvardage de type Western, nous avons évalué les niveaux

d'expression des FTs SpI, Sp3, AP-l et NFI dans les lignées cancéreuses T97, T98, Tl08

et T 115 . Nous avons ainsi ·observé que le niveau d'expression des facteurs de transcription

ciblés diffère d'une lignée cancéreuse à l'autre (Figure 3.5). On observe généralement un

pairage entre les lignées T97 et T98 par rapport aux lignées ·Tl08 et Tl15. En effet, le

niveau d'expression des facteurs semble varier selon le duo (T97-T98 ou Tl08-Tl15), mais

demeure toutefois identique au sein du même duo. En premier lieu, les différences notées

pour les FTs SpI et Sp3, bien que minimes, semblent indiquer une plus forte expression de

ces protéines dans les cellules Tl08 et Tl15 (Figure 3.5 A). Une variation contraire

survient cependant au niveau de l'expression de NFI, qui semble beaucoup plus fortement

exprimé dans les lignées T97 et T98 (Figure 3.5 B). Finalement, pour les membres de la

famille AP-l, tous semblent varier, mais demeurent néanmoins semblables au sein d'un

même duo. En effet, pour la famille Jun, nous avons remarqué que c-Jun et JunB sont

exprimés plus fortement dans les cellules T97 et T98, JunB étant très fortement exprimé

63

dans ces deux lignées (Figure 3.5 C). Cependant, JunD démontre une plus forte expression

dans les lignées TI08 et Tl15 que dans les T97 et T98 (Figure 3.5 C). Pour les autres

membres de la famille AP-I , nous avons observé une plus faible expression de tous les

facteurs chez T97 et T98 sauf pour Fra-2 qui semble, au contraire, beaucoup plus fortement

exprimé chez ces lignées (Figure 3.5 C). En effet, c-Fos, FosB et Fra-l sont tous les trois

moins exprimés chez T97 et T98 que dans les lignées TI08 et TIl5 (Figure 3.5 C). Les

différences observées chez chacun des duos pourraient également influencer de façon

différentielle l'activité du promoteur a5 et, par conséquent, le niveau d'expression de cette

sous-unité à la surface de la cellule.

A. c.

B.

1

Actine Actine

Figure 3.5 - Niveau d'expression des facteurs de transcription SpI, NFI et AP-I dans les lignées de mélanomes. Analyse d'immunobuvardage de type western réalisée avec 15Jlg de protéines nucléaires provenant de chacune des lignées. Les extraits ont été fractionnés sur gel, transférés sur membrane de nitrocellulose et incubés avec des anticorps dirigés contre les facteurs de transcription Sp 1, Sp3 (A), NFI (B), c-Jun, JunB, JunD, c-Fos, FosB, Fra-l ~ Fra-2 (C) et contre l'actine. La position des marqueurs de poids moléculaire (kDa) est indiquée sur la figure.

64

3.3.5 Capacité de liaison des facteurs de transcription SPI, AP-I et NFI

dans les lignées T97, T98, TI08 et Tl15

Afin de vérifier la capacité de liaison des facteurs de transcription dans les lignées de

mélanomes, nous avons réalisé des essais de retard sur gel. Dans un premier temps, des

essais ont été réalisés afin de déterminer la capacité de liaison à l'ADN de Sp 1 dans nos

quatre lignées cancéreuses: T97, T98, T108 et Tl15 (Figure 3.6). Ces résultats permettent

d'évaluer, par le fait même, la capacité de liaison à l'ADN de Sp3 puisque ce dernier

possède la capacité de se lier à la séquence çible également reconnue par Sp 1 (Philipsen et

Suske 1999; Scohy, Gabant et al. 2000). Nous avons observé que Sp3 possède une capacité

de liaison nettement supérieure dans les lignées T108 et Tl15 comparativement aux

cellules T97 et T98 (Figure 3.6). Nous avons également noté la formation d'un complexe

Sp1/Sp3 plus prononcé dans les lignées T108 et Tl15. Nous avons ensuite réalisé des

analyses en compétition et de super-rétention en gel afin de s'assurer de la spécificité des

signaux obtenus. Les essais de compétitions en gel ont permis de démontrer clairement la

spécificité du signal dans la lignée T108 puisque l'ajout de 250X en excès molaire d'un

oligonucléotide SpI non-marqué empêche complètement la formation du complexe

Sp1/Sp3 et réduit considérablement la formation du complexe Sp3 (Figure 3.6). Les

analyses de super-rétentions ont permis d'identifier les composantes protéiques du

complexe Sp1/Sp3 et de s'assurer de sa spécificité. On remarque que l'ajout d'une quantité

déterminée d'anticorps SpI ou Sp3, selon le cas, entraîne la formation d'un super-complexe

(SSC) autant dans la lignée T97 que dans la lignée TI08 (Figure 3.6) démontrant ainsi que

les anticorps spécifiques correspondants à ces facteurs se sont accrochés aux complexes

protéines-sonde. Il est important de noter qu'en dépit de l'ajout de la même quantité d'un

anticorps dirigés contre NFI, ,aucun super-complexe n'est produit dans les lignées T97 et

T108 (Figure 3.6). Nous sommes donc assurés de la spécificité de nos signaux etpouvons

confirmer que bien que Sp 1 ne semble pas varier beaucoup entre les lignées, Sp3 apparaît

avoir une plus forte capacité de liaison à l'ADN dans les lignées Tl 08 et T 115.

65

SpI

1

Figure 3.6 - Capacité de liaison des facteurs de transcription SpI et Sp3 dans les lignées de mélanomes. Analyses de retard sur gel réalisées avec 5,0 f..lg de protéines nucléaires obtenues de chacune des lignées. Ces extraits ont été incubés avec une sonde radiomarquée correspondant à un oligonucléotide consensus pour SpI. Afin de vérifier l'identité et la spécificité des complexes obtenus, des oligonucléotides non-marqués portant des sites à haute affinité pour Spi et AP-I ont été ajoutés (250x d'excès molaire) en guise de compétiteurs. Des anticorps dirigés contre les FTs Sp l, Sp3 et NFI (4 fll) ont également été utilisés en combinaison avec une sonde Sp 1 dans des essais de super-rétention en gel. Les complexes ADN/protéines ont été séparés sur gel de polyacrylamide (8%) et révélés par autoradiographie. U : sonde libre; SSC: Super­complexe, SpllSp3: complexe Spl-Sp3.

Dans un deuxième temps, nous avons aussi réalisé des essais de retard sur gel afin de

vérifier la capacité de liaison à l'ADN du FT AP-l dans nos quatre lignées cancéreuses

(Figure 3.7).

66

ssc

Figure 3.7 - Capacité de liaison du facteur de transcription Ap-l dans les lignées de mélanomes. Analyses de retard sur gel réalisées avec 5,0 f..lg de protéines nucléaires préparées de chacune des lignées. Ces extraits ont été incubés avec une sonde radiomarquée correspondant à un oligonucléotide consensus pour Ap-l. Afin de vérifier l'identité et la spédficité des complexes obtenus, des oligonucléotides non-marqués portant des sites à haute affinité pour AP-I et pour NFI ont été ajoutés (IOOx ou 250x d'excès molaire) en guise de compétiteurs. Des anticorps dirigés contre les membres de la famille Jun (JunB, c-Jun, JunD) et NFI (4 J..lI) ont également été utilisés en combinaison avec une sonde Ap-I dans des essais de super­rétention en gel. Les complexes ADN/protéines ont été séparés sur gel de polyacrylamide (8%) et révélés par autoradiographie. U : sonde libre; SSC: Super-complexe; NS: Non-spécifique.

Ainsi, nous avons observé des différences dans la liaison dè ce facteur entre les lignées

T97 et T98 versus TI08 et Tl15. En effet, AP-l possède la capacité de lier l'ADN

seulement dans les lignées T97 et T98 (Figure 3.7). Par l' ajout de compétiteurs (de 100X .à

250X d'excès molaire d'un oligo AP-l non-marqué), il a été possible de distinguer les

complexes ADN/protéine dont la formation est spécifique c'est-à-dire, ceux produits par

67

AP-1, de ceux non-spécifiques (signal observé dans les lignées T108 et Tl15) (Figure 3.7).

De plus, nous avons réalisé des essais de super-rétention à l'aide d'anticorps dirigés contre

certains membres spécifiques de la famille AP-1 dont JunB, c-Jun et JunD et que l'on

soupçonnait varier entre les lignées de rriélanome (l'anticorps NFI étant utilisé comme

contrôle négatif). Les résultats semblent démontrer que le signal observé correspond

davantage à JunB et à JunD puisque l'addition individuelle de ces anticorps entraîne la

fomation d'u? super-complexe, mais n'empêche que partiellement la formation du

complexe AP-1 alors qu'en combinaison, les anticorps JunB et JunD empêchent

complètement sa formation (Figure 3.7). Il est important de noter. que le super-complexe ne

représente pas la bande très intense observée à la limite supérieure des puits, mais une

petite bande plutôt diffuse tout juste en dessous. Ce super-complexe n'apparaît que lors de

l'ajout des anticorps JunE et JunD et non avec les anticorps c-Jun et NFI (Figure 3.7). Ces

données confirment que AP-1 possède la capacité de lier l'ADN seulement dans la lignée

T97 et aussi dans la lignée T98 (non montré) et que les membres JunB et JunD semblent les

comp<?santes Jun majeures de ce facteur.

En dernier lieu, nous avons également effectué des essais de retard 'sur gel afin de

vérifier, cette fois-ci, la capacité de liaison à l'ADN de NFI dans ces mêmes lignées. Nous

avons encore une fois observé une nette différence entre les lignées T97 et T98 et les

lignées Tl 08 et TIl 5'. En effet, un signal beaucoup plus intense est observé pour NFI avec

les extraits nucléaires des lignées T97 et T98, ce signal étant à peine détectable dan·s les

extraits provenant des deux autres lignées (T108 et Tl15) (Figure 3.8). Les essais de

compétition dans des essais de retard sur gel nous ont permis de confirmer que la protéine

produisant le complexe apparaissant à la figure 3.8 appartient à la famille NF!. En effet,

l' oligonucléotide non-marqué portant la séquence cible NFI empêche totalement la

formation de ce complexe alors qu'un oligonucléotide portant la séquence cible AP-1 en est

incapable. Les essais de super-rétentions confirment également la spécificité du signal

correspondant à NF!. En effet, la formation d'un super-complexe n'est observée qu'avec

l'ajout d'un anticorps dirigé contre NFI, autant dans la lignée T97 que dans la lignée T108

(Figure 3.8) et non avec l'anticorps contrôle dirigé contre SpI. Nous sommes donc assurés

de la spécificité du signal observé dans nos quatre lignées cancéreuses et avons pu ainsi

68

identifier le signal correspondant à NF!. Nous pouvons également affirmer que NFI

possède une plus grande capacité de liaison à l'ADN dans les lignées T97 et T98

comparativement aux lignées Tl 08 et T 115.

Figure 3.8 Capacité de liaison du facteur de transcription NFI dans les lignées de mélanomes. Analyses de retard sur gel réalisées avec 5,0 /-lg de protéines nuCléaires préparées de chacune des lignées. Ces extraits ont été incubés avec une sonde radiomarquée correspondant à un oligonuc1éotide consensus pour NF!. Afin de vérifier l'identité et la spécificité des complexes obtenus, des oligonuc1éotides non-marqués portant des sites à haute affmité pour NFI et AP-I ont été ajoutés (IOOX ou 250X d'excès molaire) en guise de compétiteurs. Des anticorps dirigés contre NFI et Sp 1 (4 /-lI) ont également été utilisés en

. combinaison avec une sonde NFI dans des essais de super-rétention en gel. Les complexes ADN/protéines ont été séparés sur gel de polyacrylamide (8%) et révélés par autoradiographie. U : sonde libre; SSC: Super­complexe; NS: Non-spécifique.

~~---- --- ~-~ ~--

69

3.3.6 Influence des facteurs SPI, AP-I et NFI dans les lignées T97 et TI08

Les transfections transitoires réalisées ont permis de déterminer plus précisément

l'influence des facteurs de transcription SpI , AP.-1 et NFI sur l'activité transcriptionnelle

du promoteur de gène de la sous-unité a5. À cette fin, des mutations ont été introduites, par

mutagénèse dirigée, dans les sites pour ces FTs dans le promoteur a5. Une première série

de transfections a été réalisée avec le promoteur -132a5 afin de déterminer séparément

l'influence spécifique de chacun des sites Sp 1 : proximal (situé entre les positions -60 et -

52) et distal (situé entre les positions -117 et -101). Les plasmides recombinants contenant

la séquence du promoteur et portant ou non un des deux sites Sp 1 muté (ou la combinaison

des deux sites mutés) ont été transfectés dans les lignées T97 et TI08 (Figure 3.9).

L'activité CAT du promoteur a5 a été rapportée en activité relative en référence à l 'activité

de base obtenue avec le plasmide -132a5CAT ne portant aucune mutation dans le

promoteur a5 (correspondant à 100%) (Figure 3.9). Lorsque les deux sites SpI sont mutés,

une chute considérable d~ l'activité du promoteur est obtenue autant dans la lignée T97 que

dans la lignée T108 (baisse de 65% et de 75%, respectivement) (Figure 3.9) démontrant

clairement que SpI est un activateur du promoteur a5. Toutefois, la mutation individuelle

des sites Sp 1 n' entaîne aucune modification statistiquement valable à l'exception d'une

légère augmentation dans la lignée T108 observée lorsque le site Sp 1 distal est muté

(Figure 3.9). Les résultats obtenus par mutation des sites Sp 1 individuellement pourraient

s'expliquer par la redondance des sites Sp 1. En effet, lorsqu'un site est muté, Sp 1 se lie au

second site afin de maintenir l'activité de base du promoteur a5 (Bergeron et al. 1997). En

conclusion, on peut affirmer . que SpI est un activateur de l'activité du promoteur a5 dans

les lignées T97 et T108.

Nous avons ensuite réalisé des transfections avec un plasmide recombinant portant un

segment plus court du promoteur a5 (-92a5) et dans lequel nous avons introduit des

mutations dans l~s sites Sp 1, AP-1 et NFI, individuellement ou en combinaison. Ces

plasmides recombinants ont été transfectés dans les lignées T97 et T108. Étant donné que le

promoteur -92a5 possède une très faible activité dans la lignée T97 (Figure 3.3), il a été

difficile de mettre les résultats en perspective d'autant plus que les lignées T97 et Tl 08

semblent varier différemment. Il a néanmoins été possible. de tirer certaines conclusions

70

intéressantes pour la suite du projet. Tout d'abord, comme on s'y attendait, nous n 'avons

observé aucune activité du promoteur a5 dans la lignée T97 et une faible activité, mais

détectable, dans la lignée T108 lorsque le promoteur est intact (sans mutation) (Figure

3.10).

Activité relative CAT (%) [-132a5 ]

Vl Q

o o

-1 32u5CAT 1----""""------1

-1 32u5/Mp I-----...J.....---..., I

Vl

?

99 ±8 1.

-1 32u51Md I-----.....:....-------i..---.l---.,

-1 32a 5/Mp+d f 19 *

tv o

?

167 ±33 *

D TI 08

Figure 3.9 - Influence des sites Spl proximal et distal sur le promoteur a5. Le plasmide -132a5CAT portant ou non des mutations dans le site SpI proximal et/ou distal a été transfecté dans les lignées cancéreuses T97 et TI08. Le graphique représente la valeur relative de" la moyenne des activités CAT (normalisées par rapport à la GR) obtenues suite à trois transfections réalisées en triplicat. Mp: mutation dans le site proximal; Md: mutation dans le site distal; Mp+d: mutation dans les sites distal et proximal.

-92a5 CAT

-92a5 /SpIm+APlm . j

o 7 t O,l: *

Activité CAT (%CAT GH)

[-92a5]

N o

w o

-9 a5/API m+NFIm t----....:......-------,

VI o

-92a5/NFIm Spim t--__ ....l.-______ .l...-__ "'"""--__ ~ __ ___.:.....,

71

t----...,.-------,----.,..----....,....-------~I---+-----I 61 t 15 *

N .D . -92a5/Splm APlm NF1m t----....i-.------'----"'------,

!----'----i 37 t 11 *

D T108

Figure 3.10 - Influence des FTs SpI, AP-I et NFI sur le promoteur basal aS. Le plasmide -92a5CAT portant ou non des mutations dans les sites SpI, AP-I ou NFI a été transfecté dans les lignées cancéreuses T97 et TI08. Le graphique représente la valeur moyenne des activités CAT (normalisées par rapport à la GH) obtenues suite à trois transfections réalisées en triplicat. Splm+APlm: mutations dans les sites SpI et AP-I ; APlm+NFIm: mutations dans les sites AP-I et NFI; NFIm+Splm: mutations dans les sites NFI et SpI du promoteur -92a5; N.D.: Non détectable.

Lorsque seul le site NFI est intact (dans le plasmide -92a5/SpIm+AP-Im), une chute

presque complète de l'activité dans la lignée TI08 est observée (la lignée T97 ne présentant

aucune activité notable) (Figure 3.10). Ces résultats indiquent que NFI serait

vraisemblablement un répresseur de l'activité du promoteur a5, ce qui est en accord avec

d'autres résultats obtenus précédemment dans notre laboratoire (Gingras, Larouche et al.

2003). Lorsque seul le site SpI est intact (dans le plasmide -92a5/AP-Im+NFIm), une

augmentation de près de trois fois de l'activité initiale du promoteur est observée dans la

lignée TI08 (Figure 3.10). Ces résultats semblent en accord avec ceux obtenus avec la

mutation du site SpI. pro~imal (Figure 3.9). Toutefois, aucun changem~nt n'a été observé

dans l'activité du promoteur lorsque transfecté dans la lignée T97 (Figure 3.10). Cependant,

lorsque le seul site AP-I est conservé intact (dans le plasmide -92a5/NFIm+SPIm), une

augmentation considérable de l'activité du promoteur est observée dans les lignées T97 et

72

Tl08 (augmentation de plus de 9 fois) (Figure 3.10). AP-l semble donc être un FT très

important dans la lignée T97 et représente sans aucun doute un activateur puissant du

promoteur a5 autant dans la lignée T97 que dans la lignée Tl08. Finalement, lorsque les

séquences cibles des trois FTs sont mutées simultanément (dans le plasmide

-92a5/SPlm+AP-lm+NFlm), aucune activité n 'est observée dans la lignée T97 tandis

qu'une hausse de plus de 5 fois dans l' activité du promoteur est mesurée dans la lignée

Tl08 (Figure 3.10). Ces résultats portent à croire qu'un autre facteur, un activateur, pourrait

contribuer à l'augmentation de l'activité du promoteur a5 observée dans la lignée Tl08.

Prenant en considération que la lignée T98 suit la même tendance que la lignée T97 et Tl15

avec Tl08, on pourrait penser que cette observation expliquerait en partie la dichotomie qui

existe entre les paires de lignées cancéreuses (T97 -T98 versus Tl 08-T 115).

73

3.4 Discussion

Les données cliniques que nous avons répertoriées provenant des patients atteints d'un

mélanome uvéal semblent indiquer une certaine tendance suggérant que les patients qui

expriment plus fortement la sous-unité d'intégrine aS soient encore en vie ou du moins

qu'ils ne soient pas décédés des suites du mélanome uvéal. Toutefois, plusieurs patients

. dont les lignées cellulaires dérivées des tumeurs primaires démontrent une plus faible

expression à leur surface de la sous-unité aS sont décédés des suites de l'apparition de

métastases hépatiques. Nous avons concentré' notre étude sur quatre lignées dérivées de

tumeurs primaires de patients atteints d'un mélanome uvéal, T97, T98, T108 et T11S. Nous

avons choisi ces lignées puisque nous possédions des informations sur le suivi de ces quatre

patients, toujours en vie, et qu'elles semblaient agir en paire bien qu'elles proviennent

toutes de tumeurs uvéales différentes. En effet, les lignées T97 et T98 semblent réagir de la

même manière et expriment peu la sous-unité d'intégrine a5 (Figure 1.15). Les lignées

T108 et T 115 partagent également plusieurs de leurs propriétés et à la différence .des

lignées T97 et T98, elles expriment plus fortement la sous-unité a5 (Figure 1.15). Ces

nouvelles lignées non encore caractérisées ont donc fait l'objet de plusieurs expériences

afin d'établir leurs caractéristiques respectives.

Ainsi, ces lignées démontrent plusieurs des propriétés typiques des cellules cancéreuses :

elles présentent non seulement une morphologie épithélioïde très distincte de la

morphologie fusiforme des mélanocytes normaux de l'œil (Figure 3.1), mais présentent

également, la capacité de croître en agar mou (Figure 3.2), une caractéristique que ne

partagent pas les cellules non-transformées.

Les premiers résultats obtenus en transfection (Figure 3.3) ainsi que par RT-PCR semi­

quantitatif réalisés avec les amorces a5 (Figure 3.4) confirment également que l'activité du

promoteur a5 est plus élevée dans les lignées Tl 08 et T 115 et que le transcrit endogène a5

y est également plus abondant. Suivant cette confirmation, nous avons déterminé plus

p~écisément qu' elle( s) pourrait( ent) être la ou les causee s) de la diminution d'expression de

la sous-unité a5 ou de son augmentation selon le cas. Les facteurs de transcription SpI, Ap·

74

1 et NFI ont été ciblés pour la présente étude. En effet, d'autres travaux réalisés dans notre

laboratoire avaient permis d'identifier ces facteurs de transcription comme jouant un rôle

prépondérant dans l'activation ou la répression de l'activité du promoteur a5 (Gingras,

Larouche et al. 2003; Gingras et al. 2008). Des différences ont été observées au niveau de

ces facteu~s chez les lignées et pourraient potentiellement expliquer pourquoi la sous-unité

a5 est sous-exprimée dans les lignées T97 et T98.

De celles-ci, certaines s'inscrivent premièrement au niveau de Sp 1. On remarque de

légères différences au niveau du transcrit SpI (Figure 3.4) qui semble plus fortement

exprimé dans la lignée T97. Ce résultat va à l'encontre des résultats obtenus en ·

immunobuvardage western où la protéine Sp 1 semble plus fortement exprimée dans les

lignées T108 et Tl15 (Figure 3.5). Cette différence n'est cependant que très faible et

l'incohérence qui semble survenir entre ces résultats peut s'expliquer notamment par le fait

qu'il y a une très grande nuance à faire entre l'expression d'un ARNm et l'expression de sa

protéine. En effet, il se peut que l'ARNm SpI soit plus instable dans les lignées T98, T108

et T 115 ce qui pourrait expliquer cette légère variation. Il faut également noter que .la

technique utilisée, le RT-PCR, demeure une technique semi-quantitative. Les résultats

obtenus avec les essais de retard sur .gel ne démontrent pas non plus une différence

importante entre les lignées (Figure 3.6) et suggèrent que SpI aurait la même capacité à lier

l'ADN dans les quatre lignées. Finalement, des différences entre les lignées T97 et Tl 08

ont été observées suite aux transfections réalisées. Les résultats obtenus démontrent que .

Sp 1 est un activateur du promoteur a5 dans nos lignées. Il est cependant important de noter

que Sp3 peut également lier la même séquence que SpI sur le promoteur a5. Nous validons

présentement ces résultats par la transfection de petits ARN interférents qui ciblent

spécifiquement l'un ou l'autre des FTs (Sp 1 ou Sp3) afin de vérifier lequel peut avoir le

plus d'influence sur l'activité du promoteur. De plus, étant donné les minimes différences

qui existent entre les lignées (immunobuvardage western ou RT-PCR), il est peu probable

que Sp 1 soit le principal FT responsable de la forte expression de la sous-unité a5 dans les

lignées Tl 08 et T115.

75

Pour le FT Sp3, les résultats indiquent un meilleur potentiel en tant que FT candidat

dans la régulation de l'expression du gène a5. En effet, les résultats obtenus en R T -PCR

ont révélé une légère augmentation du transcrit Sp3 dans les lignées T108 et Tl15 (Figure

3.4). Il serait intéressant de reprendre cette analyse en PCR quantitatif ou PCR en temps

réel afin de confirmer ce résultat. Les analyses en immunobuvardage de type western

indiquent un niveau protéique de Sp3 plus élevé dans les lignées T108 et Tl15. De plus,

suite aux essais de retard sur gel réalisés, nous avons observé une plus forte activité de

liaison de Sp3 dans ces mêmes lignées (T108 et Tl15). Dans les transfections· réalisées

avec la version courte du promoteur a5 (-92a5CAT), une très forte augmentation de

l'activité CAT (Figure 3.10) a été observée dans la lignée T108 lorsque le site Sp1/Sp3 est

intact et que les sites NFI et AP-1 sont mutés. Plusieurs études démontrent notamment que

Sp3 peut agir en tant qu'activateur de la transcription (Gingras, Larouche et al. 2003;

Oguariri, Brann et al. 2007; Xu et Shu 2007; Xu, Zhang et al. 2007). Les transfections

réalisées avec le plasmide -132a5CAT vont également dans le même sens: que ce soit Sp 1

ou Sp3 qui se lie sur le site du promoteur a5, ce dernier ag~t en tant qu'activateur de la

transcription autant dans la lignée T97 que dans la lignée Tl 08 puisque la mutation des

deux sites Sp 1/Sp3 (sites proximal et distal), entraîne une diminution considérable de

l'activité du promoteur a5 (Figure 3.9). L'absence d'effet négatif observable suite aux

transfections réalisées avec les mutations simples (-132a5CAT/Mp et -132a5CAT/Md) est

probablement due à la répétition des sites de liaison. En effet, lorsque les sites Sp 1/Sp3 sont

mutés individuellement, le site intact compense afin de maintenir l'activité du promoteur a5

(Bergeron et al. 1997; Gaudreault et al. 2007). Finalement, étant donné que Sp3 semble

plus abondant dans les lignées T108 et Tl15, il pourrait être responsable de l'expression

différentielle de la sous-unité a5 dans ces lignées.

On remarque également des différences au niveau de NF!. Ce facteur, reconnu comme

un répresseur de l'activité du promoteur a5, notamment dans le contexte de la cicatrisation

cornéenne (Gingras, Larouche et al. 2003), pourrait également s'avérer être un répresseur

dans nos lignées cancéreuses. En premier lieu, des différences au niveau des transcrits

encodant les isoformes NFI-A et NFI-X ont été observées (Figure 3.4). En effet, nous avons

noté une plus forte expression de NFI-A dans les lignées TI08 et TII5 et une absence

-- -------- -------- ----,

76

complète du transcrit correspondant dans la lignée T98. De plus, le transcrit NFI-X semble

à première vue, plus abondant dans les lignées T97 et T98. En effet, selon les résultats

obtenus en immunobuvardage western, qui ne fait aucune distinction entre les isoformes de

NFI puisque l'anticorps utilisé est dirigé contre un épitope du domaine de liaison à l'ADN

partagé par les quatre isoformes, nous avons noté une très forte expression de ce FT dans

les lignées T97 et T98 comparativement aux lignées T108 et Tl15 (Figure 3.5). Cette

même tendance se remarque aussi dans les essais de retard sur gel. En effet, NFI semble

avoir une plus forte capacité à lier l'ADN dans les lignées T97 et T98, un très faible signal

étant néanmoins généré par les extraits nucléaires provenant des lignées Tl 08 et T 115

(Figure 3.7). En dernier lieu, les résultats obtenus suite aux transfections réalisées avec le

plasmide portant la version courte du promoteur a5 (-92a5), ont révélé une influence

négative exercée par NFI sur l'activité du promoteur a5 dans la lignée T108 lorsque le site

NFI est intact alors qu'une augmentation de l'activité du promoteur est observée chaque

fO,is que ce site est muté (Figure 3.10). Bien que la fonction de NFI n'ait pu être confirmée '

dans la lignée T97 étant donné que l'activité du promoteur basal mesurée est nulle, les

résultats obtenus dans la lignée T108 démontrent clairement l'influence négative que peut

avoir NFI sur l'activité du promoteur aS. Néanmoins, on peut supposer qu'étant beaucoup

plus abondant dans les lignées T97 et T98, NFI demeure le candidat le plus probable pour

jouer le rôle de répresseur de l'activité du promoteur a5 dans ces lignées, NFI contribuant

ainsi à maintenir un niveau très faible de la sous-unité a5 dans ces lignées. De surcroît, les

différents isoformes de NFI ont été rapportées pour agir en, tant que répresseur ou activateur

selon le type et le contexte cellulaire (Gronostajski 2000). Ainsi, il est possible que

l'isoforme NFI-A, qui semble plus abondant dans les lignées T108 et Tl15, ne soit pas un

répresseur, mais bien un activateur de l'activité du promoteur aS et que l'isoforme NFI-X

soit, quant à lui, un répresseur dans les lignées T97 et T98. Afin de confirmer cette

hypothèse, il serait intéressant de réaliser des transfections transitoires à l'aide de petits

ARN interférents qui cibleraient chacun des isoformes dans le but de vérifier l'influence

qu'aurait l'inhibition d'un isoforme particulier sur l'activité du promoteur a5.

Le FT AP-1 est plus complexe que les FTs Sp 1 et NFI puisque celui-ci est un dimère

résultant de l'association entre une sous-unité de la famille Jun (c-Jun, JunB et JunD) et

77

d'une sous-unité de la famille Fos (c-Fos, FosB, Fra-1 et Fra-2). Des différences au niveau

du transcrit ont été observées pour JunB, JunD et Fra-1 qui semblent exprimés à un niveau

plus élevé dans les lignées Tl 08 et T 115" alors que c-Fos est plus fortement exprimé dans

les lignées T97 et T98 (Figure 3.4). Ces résultats ne s'accordent cependant pas tout à fait

avec ceux obtenus en immunobuvardage western, l'instabilité des ARNs AP-1 pouvant

expliquer en partie ces différences. Du point de vue de la protéine, nous avons remarqué

que certains facteurs semblent prépondérants chez les lignées T97 et T98. En effet, c-Jun,

JunB et Fra-2, qui sont fortement exprimés dans ces lignées, ne sont pas (JunB et Fra-2) ou

peu (c-Jun) exprimés dans les T108 et Tl15 (Figure 3.5). D'autres sous-unités semblent

cependant prépondérantes dans les lignées Tl 08 et T 115. De la famille Jun, seul JunD est

plus fortement exprimé dans ces lignées alors que la majorité des membres de la famille

Fos l'est, à l'exception de Fra-2 (Figure 3.5). L'absence d'une sous-unité peut empêcher

notamment AP-I d'être actif et de pouvoir lier l'ADN. Cette possibilité pourrait expliquer

pourquoi, malgré la présence de plusieurs sous-unités, aucun signal AP-I n'a pu être

observé suite aux essais de retard sur gel dans les lignées TI08 et Tl15 (Figure 3.7). Ce

signal est cependant présent dans les lignées T97 et T98 et nous indique que l 'hétérodimère

AP-I exprimé dans ces lignées (probablement constitué des sous-unités JunB/Fra-2)

possède la capacité de lier l'ADN. De plus, les analyses de super-rétention nous informent

que la sous-unité JunB est présente dans le complexe AP-I (Figure 3.7). Finalement,

sachant que AP-I est très souvent reconnu pour être un activateur de la transcription

(Bames 2006; Rosskothen, Hirschmuller-Ohmes et al. 2008), les résultats obtenus en

transfection confirment · également une telle fonction pour ce FT dans nos lignées

cancéreuses. En effet, autant dans la lignée T97 que dans la lignée Tl 08, l'activité

transcriptionnelle du promoteur a5 augmente considérablement lorsque seul le site AP-I est

intact (Figure 3.10). Toutefois, les résultats obtenus en retard sur gel n'indiquaient aucun

signal AP-I dans les TI08 et Tl15 alors que le FT est actif dans ces lignées (résultats

obtenus en transfections lorsque seul le site AP-I est intact). Ceci peut s'expliquer par la

quantité de protéines utilisées lors des essais en retard sur gel. Il est possible que la quantité

de protéines utilisée (5Jlg) était trop faible pour voir le complexe malgré qu'il soit tout de

même présent dans les lignées TI08 et T115, mais en très faible quantité. De plus, les

résultats obtenus en transfection suggèrent que cet hétérodimère AP-! n'est pas un

78

activateur suffisamment puissant pour lever la répression observée dans la lignée T97

lorsque le promoteur ne contient aucune mutation. Nous pouvons ainsi conclure que malgré

qu'AP-I soit présent dans les lignées T97 et T98, il ne semble pas suffisant pour activer la

transcription du promoteur aS peut-être parce qu'il entre en compétition avec un autre FT

(un répresseur fort) qui l'empêcherait de se lier sur le promoteur et d'en activer la

transcription ou encore, l 'hétérodimère JunB/Fra-2 est peut-être un faible activateur de la

transcription du promoteur aS.

En guise de · conclusion, il est certain que ces facteurs agissent de façon dynamique et

dans un contexte cellulaire. On doit donc tenir compte non seulement de l'environnement

cellulaire, mais également du rôle que peuvent exercer plusieurs facteurs agissant de

concert ou en compétition. Certaines études réalisées précédemment ont permis de

démontrer que certains FTs étaient capables de se lier simultanément sur le promoteur aS

alors que d'autres en étaient incapables (Gingras et al. 2008). En effet, les FTs SpI et AP-I

semblent aptes à se lier simultanément sur le promoteur tout comme NFI et AP-I.

Cependant, lorsque NFI se lie sur le promoteur, il empêche SpI de s'y lier (Gingras et al. .

2008). Suite aux différences observées entre les lignées T97-98 et TI08-IIS, il est possible

de formuler une hypothèse plausible pour expliquer la sous-expression de la sous-unité aS

dans' les lignées T97 et T98 qui pourrait, rappelons-le, être la cause de leur comportement

plus agressif. En premier lieu, Sp l ne semble pas constituer un élément déterminant,

contrairement à Sp3. En effet, ce dernier, étant abondant dans les lignées TI08 et Tl15,

pourrait entrer en compétition avec NFI, qui lui, présent en faible quantité dans ces lignées,

ne pourrait lier le promoteur pour en réprimer sa transcription et permettrait à Sp3 de s'y

lier pour l'activer. Le phénomène contraire pourrait survenir dans les lignées T97 et T98.

En effet, puisque NFI est très abondant dans ces lignées, il pourrait notamment empêcher la .

liaison de Sp3 sur le promoteur et inhiber l'effet activateur que pourrait avoir AP-I. Il en

résulterait une répression très forte de l'activité du promoteur dans les lignées T97 et T98.

Un FT autre que NFI, AP-l, Sp l ou Sp3 pourrait également lier le promoteur aS et agir de

concert avec NFI dans la répression du promoteur aS observée dans les lignées T97 et T98,

ce qui expliquerait qu'en dépit de la mutation du site NFI, il n'y ait aucune augmentation

dans l'activité du promoteur en transfections dans la lignée T97. En effet, on remarque la

79

présence d'un site de liaison pour le FT CEBP dans la région promotrice a5 (Figure 1.14).

Selon certaines études, ce FT peut agir en tant que répresseur, notamment sur le promoteur

de l' intégrine a Il (Lopez-Rodriguez, Botella et al. 1997) et sur le promoteur de CIIT A

(transactivateur du complexe majeur d'histocompatibilité classe II) (Pennini et al. 2007). Il

se pourrait que son influence s'avère également négative sur l'activité transcriptionnelle du

promoteur a5 dans nos lignées cancéreuses. Il serait donc intéressant d'approfondir l'étude

de ce FT afin de déterminer également son influence sur l'activité du promoteur a5.

Les résultats obtenus lors de cette étude ont fourni un certain nombre de pistes qUI

permettraient d'expliquer la faible expression de la sous-unité a5 dans les lignées T97 et

T98. De plus, certains résultats préliminaires non présentés lors de cette étude démontrent

qu'effectivement, ces lignées seraient plus agressives que les lignées T108 et Tl15. En

effet, nous avons injecté sous-cutané des cellules de chacune des lignées (T97, T98, T108

et Tl15) dans des souris immunosupprimées (CD1 : nude). Après seulement deux semaines

post-injections, nous avons pu observer la présence de tumeurs d'un diamètre de plus de

1cm dans les souris injectées avec les lignées T97 et T98 ·.alors qu'aucune tumeur n 'était

détectable dans les souris injectées avec les lignées T108 et Tl15. Il semble donc que les

lignées sous-exprimant la sous-unité a5 soient ainsi plus agressives in vivo que celles

. exprimant un haut niveau de cette intégrine. Ces résultats doivent cependant être confirmés

afin de s'assurer de leur reproductibilité. Pour donner suite à ce projet, nous avons prévu

réaliser des expériences de transfections stables avec des lentivirus exprimant des shARN

visant à réduire l'expression des FTs NFI, Sp 1, Sp3 et AP-1 dans les lignées T97, T98,

T108 et Tl15. Ces transfections auront pour but d'évaluer l'effet exercé par l'inhibition de

ces FTs sur l'activité du promoteur a5. Ces cellules seront ensuite injectées dans les flancs

de souris immunosupprimées dans le but de vérifier si la progression tumorale est modifiée

selon le type cellulaire en réponse à une modification dans l'expression des niveaux

endogènes de a5. Ces expériences permettront de vérifier s'il existe une corrélation entre la

sous-expression de la sous-unité a5 et l'agressivité tumorale des lignées utilisées.

Finalement, des expériences d'immunoprécipitation de la chromatine pourraient également

permettre de comparer le recrutement · ~es différents facteurs de transcription aux

promoteurs des sous-unités des intégrines, entre les différentes lignées cellulaires.

80

4. CONCLUSION

4.1 Résumé

Les objectifs de ce mémoire consistaient, dans un premier temps, à déterminer si le FT

Pax-6 est responsable de l'expression aberrante de la sous-unité d'intégrine a4 dans une

lignée dérivée de métastases secondaires provenant d'un patient atteint d'un mélanome

uvéal afin de déterminer si une corrélation existe entre l'expression de ce facteur et la

capacité qu'ont les cellules à migrer vers d'autres organes. Dans un deuxième temps, et

dans un tout autre ordre d'idées, nous avons voulu déterminer si la sous-expression de la

sous-unité d'intégrine a5 était reliée à un phénotype plus agressif des cellules cancéreuses

et définir quelles pouvaient être les conséquences de cette sous-expression dans des cellules

dérivées de tumeurs primaires de patients atteints d'un mélanome uvéa!.

4.1.1 Influence de Pax-6 sur le promoteur du gène «4

En guise de conclusion pour la première partie de l'étude, nous avons démontré que

l'activité du promoteur a4 est effectivement plus élevée dans la lignée H79 dérivée de

métastases hépatiques d'un patient atteint d'un mélanome uvéa!. Toutefois, nous avons

également démontré que Pax -6 n'est pas l'élément déterminant dans l'expression aberrante

de cette sous-unité dans cette lignée. En effet, ce dernier semble davantage réprimer

l'activité transcriptionnelle du promoteur a4 chez les lignées de mélanome étudiées. Des

candidats potentiels pourraient quant à eux être responsables de la trans-activation du

-promoteur a4, notamment certains membres de la famille Ets reconnue pour être une

famille ·d' activateurs puissants de la transcription génique.

Cependant, étant donné que cette intégrine est très impliquée dans la migration

cellulaire, il demeure encore à déterminer si ces observations pourraient corréler avec le

pouvoir métastatique de la lignée H79 par, et ceci n'est qu'un exemple, des essais

. d'implantation in vivo de tumeurs intraoculaires des cellules cancéreuses des différentes

81

lignées marquées au GFP chez des souris immunosupprimées afin de suivre l'atteinte du

foie (et des a~tres organes) par les métastases associées à ce type de cancer.

4.1.2 Influence de la sous-unité aS dans les propriétés tumorigènes du

mélanome uvéal

Les conclusions obtenues suite à la seconde partie de l'étude ont également ouvert des

portes pour des études a posteriori. Tout d'abord, nous avons confirmé le potentiel et le

phénotype cancéreux de nos quatre lignées utilisées pour l'étude: T97, T98, TI08 et TII5.

Nous avons ensuite démontré que l'activité du promoteur a5 était plus faible dans les

!ignées T97 et T98 comparativement aux lignées TI08 et TII5. Ces résultats étaient en

accord avec les résultats obtenus précédemment par analyse en cytométrie de flux (Figure

1.15). De plus, nous avons observé plusieurs différences au niveau de l'expression des FTs

SpI, Sp3, AP-I et NF! et avons pu discriminer ceux qui pourraient influencer (soit de façon

positive ou de façon négative) l'expression de la sous-unité a5 de ceux qui ne semblent

exercer aucune influence importante dans cette régulation. Selon les résultats obtenus, les

conclusions possibles suite à cette étude démontrent que NF! pourrait être le candidat

responsable de la répression de l'expression du gène a5 dans les lignées T97 et T98 tandis

que Sp3 pourrait être le candidat responsable de son expression dans les lignées TI08 et

TII5. Les résultats préliminaires obtenus suite à l'injection d'une quantité déterminée de

ces cellules cancéreuses dans des souris immunodéficientes permettent clairement

d'associer les lignées T97 et T98 à des phénotypes cancéreux beaucoup plus agressifs que

les lignées TI08 et TII5.

Finalement, afin de vérifier les nouvelles hypothèses formulées suite à cette étude,

l'injection de cellules cancéreuses ayant préalablement été transfectées de façon stable par

des lentivirus exprimant, par exemple, des shARN dans le but d'inhiber le FT NF! ou

encore, en sur-exprimant ce même FT selon le type cellulaire, pourrait permettre de

confirmer le rôle de NF! in vivo et démontrer s'il est indirectement responsable du

phénotype plus agressif chez certains types de cancers . . En dernier lieu, nos résultats

semblent appuyer l'hypothèse de départ qui voulait que les lignées qui sous-expriment la

82

sous-unité a5 à leur surface cellulaire, en l'occurrence T97 et T98, présentent un potentiel

plus agressif. Le suivi de l'expression de la sous-unité a5, dans les cellules dérivées des

tumeurs primaires de patients atteints de cette forme de cancer, pourrait se révéler être un

marqueur de dépistage intéressant afin d'identifier les patients à haut risque de développer

des métastases secondaires au foie dans le but d'assurer un meilleur suivi de ces individus.

83

4.2 Perspectives de recherche

Une somme de travail considérable demeure encore à réaliser afm de déterminer quel

facteur est responsable de l'expression aberrante de la sous-unité a4 dans la lignée

métastatique H79 ou afin d'évaluer si le FT NFI est le seul répresseur responsable de la

faible expression d' a5 dans les lignées T97 et T98 résultant ainsi d'une augmentation de

leur potentiel d'agressivité. La perspective la plus intéressante dans la suite logique du

projet est sans l'ombre d'un doute les analyses in vivo dans des souris immunosupprimées,

car elles permettront d'étudier le comportep1ent de ces cel~ules dans un contexte cellulaire

plus près de la réalité. Ces analyses, présentement en cours de réalisation, permettront donc

de confirmer in vivo les résultats obtenus in vitro, assurant ainsi la suite tant du projet a4

que du projet a5.

Il serait également intéressant d'établir un lien entre la recherche clinique et la recherche

fondamental~ chez les patients atteints d'un mélanome uvéa!. Ainsi, un suivi plus strict et

plus complet du patient à des intervalles réguliers serait non seulement bénéfique pour le

patient, mais fournirait également un complément d'informations très riche pour nos

futures études. En effet, s'il était possible de relier nos conclusions et nos observations, tel

que le profil cellulaire de la tumeur (épithélioïde ou fusiforme) et le profil d'expression des

intrégrines à la surface des cellules cancéreuses, aux données cliniques récoltées, c'est-à­

dire l'âge au diagnostic de la tumeur uvéale, l'âge à l'apparition des métastases hépatiques

s'il y a lieu, l'âge et la cause du décès, la présence de boucles vas~ulogéniques etc., il en

ressortirait une quantité d'informations précieuses quant au choix du traitement à

privilégier et de la stratégie à adopter pour tenter d'augmenter le plus possible la qualité de

vie des patients atteints et éventuellement, permettre de sauver la vie d'un plus grand

nombres de ceux-ci.

Pour conclure, bien que ces deux parties du projet soient de natures complètement

différentes, elles ont en commun la compréhension de certaines complications qui peuvent

survenir dans les cas de mélano~e uvéa!. Connaître davantage les mécanismes sous-jacents

à l'agressivité tumorale et les processus qui modulent la progression du cancer vers la

84

métastasie donneront au médecin les outils nécessaires afin d'adapter les soins prodigués

selon le profil personnalisé ou plutôt « cellularisé » de chaque patient, ce qui augmentera

les chances de réussite du traitement et finalement, d'extrapoler les connaissances acquises

chez d'autres cancers à plus forte incidence.

85

Références bibliographiques

Adams, J. C. et F. M. Watt (1993). "Regulation of development and differentiation by the extracellular matrix." Development 117(4): 1183-98.

Ager, A. et M. J. Humphries (1991). "Integrin alpha 4 beta 1: its structure, ligand-binding specificity and role in lymphocyte-endothelial cell interactions." Chem Immunol 50: 55-74.

Ahmad, A. et I. R. Hart (1997). "Mechanisms of metastasis." Crit Rev Oncol Hematol 26(3): 163-73.

Akiyama, S. K., S. S. Yamada, et al. (1989). "Analysis of fibronectin receptor function with monoclonal antibodies: roles in cell adhesion, migration, matrix assembly, and cytoskeletal organization." J Cell Biol 109(2): 863-75.

Albelda, S. M. (1991). "Endothelial and epithelial cell adhesion molecules." Am J Respir Cell Mol Biol 4(3): 195-203.

Allavena, P., C. Paganin, et al. (1991). "Molecules and structures involved in the adhesion of natural killer cells to vascular endothelium." J Exp Med 173(2): 439-48.

Aplin, A. E., A. Howe, et al. (1998). "Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins." Pharmacol Rev 50(2): 197-263.

Arnaout, M. A., B. Mahalingam, et al. (2005). "Integrin structure, allostery, and bidirectional signaling." Annu Rev Cell Dev Biol 21: 381-410.

Audet, J. F., J. Y. Masson, et al. (1994). "Multiple regulatory elements control the basal promoter activity of the human alpha 4 integrin gene." DNA Cell Biol 13(11): 1071-85.

Bao, L., R. Pigott, et al. (1993). "Correlation of VLA-4 integrin expression with metastatic potential in various human tumour celllines." Differentiation 52(3): 239-46.

Bames, P. 1. (2006). "Transcription factors in airway diseases." Lab Invest 86(9): 867-72. Bechrakis, N. E. et W. R. Lee (1991). "Dedifferentiation potential of iris melanomas."

Fortschr OphthalmoI88(6): 651-6. Beckner, M. E., H. C. Krutzsch, et al. (1995). "Identification of a new immunoglobulin

superfamily protein expressed in blood vessels with a heparin-binding consensus sequence." Cancer Res 55(10): 2140-9.

Beliveau, A., M. Bérubé, et al. (2000). "Expression of integrin alpha5betal and MMPs associated with epithelioid morphology and malignancy of uveal melanoma." Invest Ophthalmol Vis Sci 41(8): 2363-72.

Bergeron, MJ et al. (1997). "Transcriptional regulation of the rat Pbly(ADP-ribose) polymerase gene by Sp1." Eur J Biochem 250(2):342-53.

Berman, A. E. et N. I. Kozlova (2000). "Integrins: structure and functions." Membr Cell , Biol 13(2): 207-44.

Bérubé, M., M. Talbot, et al. (2005). "Role of the extracellular matrix proteins in the resistance of SP6.5 uveal melanoma cells toward cisplatin." Int J Oncol 26(2): 405-13. '

Birkenmeier, T. M., 1. 1. McQuillan, et al. (1991). "The alpha 5 beta 1 fibronectin receptor. Characterization of the alpha 5 gene promoter." J Biol Chem 266(30): 20544-9.

Bock, E. (1991). "Cell-cell adhesion molecules." Biochem Soc Trans 19(4): 1076-80.

86

Boissy, R. E. (1988). "The melanocyte. Its structure, function, and subpopulations in skin, eyes, and hair." Dermatol Clin 6(2): 161-73.

Bopp, D., E. Jamet, et al. (1989). "Isolation of two tissue-specific Drosophila paired box genes, Pox mesa and Pox neuro." Embo J 8(11): 3447-57.

Bosman, F. T. et 1. Stamenkovic (2003). "Functional structure and composition of the extracellular matrix." J Pathol 200(4): 423-8.

Brem, R.B., S.G. Robbins et al. (1994). "Immunolocalization of integrins in the human retina." Invest Ophtalmol Vis Sci 35: 3466-74.

Brodt, P., L. Fallavollita, et al. (1997). "Liver endothelial E-selectin mediates carcinoma cell adhesion and promotes liver metastasis." Int J Cancer 71(4): 612-9.

Callaerts, P., G. Halder, et al. (1997). "PAX-6 in development and evolution." Annu Rev Neurosci 20: 483-532.

Carriere, C., S. Plaza, et al. (1993). "Characterization of quail Pax-6 (Pax-QNR) proteins expressed in the neuroretina." Mol Cell Biol 13(12): 7257-66.

Char, D. H. (1989). "Current treatments and trials in uveal melanoma." Oncology eWilliston Park) 3(9): 113-21; discussion 122, 124, 127-8.

Chauhan, B. K., N. A. Reed, et al. (2002). "Identification of genes downstream of Pax6 in the mouse lens using cDNA microarrays." J Biol Chem 277(13): 11539-48.

Corbi, A. L., U. B. Jensen, et al. (2000). "The alpha2 and alpha5 integrin genes: identification of transcription factors that regulate promoter activity in epidermal keratinocytes." FEBS Lett 474(2-3): 201-7.

Damato, B. (2006). "Treatment of primary intraocular melanoma." Expert Rev Anticancer Ther 6(4): 493-506.

Danen, E. H. et A. Sonnenberg (2003). "Integrins in regulation of tissue development and function." J PathoI201(4): 632-41.

Davidorf, F. H. et J. R. Lang (1975). "The natural history of malignant melanoma of the choroid: small vs large tumors." Trans Sect Ophthalmol Am Acad Ophthalmol Otolaryngol 79(2): OP31 0-20.

Davis, L. S., N. Oppenheimer-Marks, et al. (1990). "Fibronectin promotes proliferation of naive and memory T cells by signaling through both the VLA-4 and VLA-5 integrin molecules." J ImmunoI145(3): 785-93.

De Potter, P., C. L. Shields, et al. (1996). "New treatment modalities for uveal melanoma." Curr Opin Ophthalmol 7(3): 27-32.

de Vries, E., W. van Driel, et al. (1987). "Contactpoint analysis of the HeLa nuclear factor l recognition site reveals symmetrical binding at one side of the DNA helix." Embo J 6(1): 161-8.

Dedhar, S. et G. E. Hannigan (1996). "Integrin cytoplasmic interactions and bidirectional transmembrane signalling." Curr Opin Cell Biol 8(5): 657-69.

DeSimone, D. W. (1994). "Adhesion and matrix in vertebrate development." Curr Opin Cell Biol 6(5): 747-51.

Desprez, P. Y., C. Q. Lin, et al. (1998). "A novel pathway for mammary epithelial cell invasion induced by the helix-Ioop-helix protein Id-1." Mol Cell Biol 18(8): 4577-88.

Diener-West, M., B. S. Hawkins, et al. (1992). "A review of mortality from choroidal melanoma. II. A meta-analysis of 5-year mortality rates following enucleation, 1966 through 1988." Arch Ophthalmoll10(2): 245-50.

87

Dolin, P. J., A. J. Foss, et al. (1994). "Uveal Il)elanoma: is solar ultraviolet radiation a risk factor?" Ophthalmic Epidemiol1(1): 27-30.

Dufour, S., J. L. Duband, et al. (1988). "Attachment, spreading and locomotion of avian neural crest cells are mediated by multiple adhesion sites on fibronectin molecules. " Embo J 7(9): 2661-71.

Duncan, M. K., A. Cvekl, et al. (2000) .' "Truncated forms ofPax-6 disrupt lens morphology in transgenic mice." Invest Ophthalmol Vis Sci 41(2): 464-73.

Duncan, M. K., Z. Kozmik, et al. (2000). "Overexpression of PAX6(5a) in lens fiber cells results in cataract and upregulation of (alpha)5(beta)1 integrin expression." J Cell Sci 113 ( Pt 18): 3173-85.

Duncan, M.K., JI Haynes et al. (1998). "Dual roles for Pax-6: a transcriptional repressor of lens fiber cell-specific beta -crystallin genes." Mol Cell Biol 18(9):5579-86.

Dynan, W. S. et R. Tjian (1983). "The promoter-specific transcription factor Sp 1 binds to upstream sequences in the SV40 ear1y promoter." Ce1l35(1): 79-87.

Elner, S. G. et V. M. Elner (1996). "The integrin superfamily and the eye." Invest Ophthalmol Vis Sci 37(5): 696-701.

Epstein, J. A., T. Glaser, et al. (1994). "Two independent and interactive DNA-binding subdomains of the Pax6 paired domain are regulated by alternative splicing." Genes Dev 8(17): 2022-34.

Eskelin, S., S. Pyrhonen, et al. (2000). "Tumor doubling times in metastatic malignant melanoma of the uvea: tumor progression before and after treatment." Ophthalmology 107(8): 1443-9.

Ferguson, T. A., H. Mizutani, et al. (1991). "Two integrin-binding peptides abrogate T cell­mediated immune responses in vivo." Proc Nad Acad Sci USA 88(18): 8072-6.

Fidler,I. J. (1991). "Cancer metastasis." Br Med Bull 47(1): 157-77. Flocks, M., J. H. Gerende, et al. (1955). "The size and shape of malignant melanomas of

the choroid and ciliary body in relation to prognosis and histologic characteristics; a statistical study of 210 tumors." Trans Am Acad Ophthalmol Otolaryngol 59(6): 740-58.

Fraunfelder, F. T., F. W. Boozman, et al. (1977). "No-touch technique for intraocular malignant melanomas." Arch OphthalmoI95(9): 1616-20.

Frenette, P. S. èt D. D. Wagner (1996). "Adhesion molecules--Part 1." N Engl J Med 334(23): 1526-9.

Frisch, S. M. et E. Ruoslahti (1997). "Integrins and anoikis." CUIT Opin Cell Biol 9(5): 701-6.

Gailit, 1., M. Pierschbacher, et al. (1993). "Expression of functional alpha 4 beta 1 integrin by human dermal fibroblasts." J Invest Dermatol100(3): 323-8.

Gaudreault, M. et al. (2007). "Laminin reduces expression of the human alpha6 integrin subunit gene by altering the level of the transcription factors Sp 1 and Sp3." Invest Ophtalmol Vis Sci 48(8):3490-505.

Giancotti, F. G. (2003). "A structural view of integrin activation and signaling." Dev Cell 4(2): 149-51.

Giancotti, F. G. et F. Mainiero (1994). "Integrin-mediated adhesion and signaling in tumorigenesis." Biochim Biophys Acta 1198(1): 47-64.

Giancotti, F. G. et E. Ruoslahti (1999). "Integrin signaling." Science 285(5430): 1028-32.

88

Gingras, M.E., et al. (2008). "The Transcriptional Activity Directed by the Human alpha5 Integrin Gene Promoter is Detennined through an Spl/NFI/AP-l Composite Element." Invest Ophtalmol Vis Sci (en préparation).

Gingras, M. E., K. Larouche, et al. (2003). "Regulation of the integrin subunit alpha5 gene promoter by the transcription factors Sp I/Sp3 is influenced by the cell density in rabbit corneal epithelial cells." Invest Ophthalmol Vis Sci 44(9): 3742-55.

Gonder, J. R., J. A. Shields, et al. (1982). "Uveal malignant melanoma associated with ocular and oculodennal melanocytosis." Ophthalmology 89(8): 953-60.

Gong, 1., D. Wang, et al. (1997). "Role of alpha 5 beta 1 integrin in determining malignant properties of colon carcinoma cells." Cell Growth Differ 8(1): 83-90.

Gronostajski, R. M. (2000). "Roles of the NFI/CTF gene family in transcription and development." Gene 249(1-2): 31-45.

Guenel, P., L. Laforest, et al. (2001). "Occupational risk factors, ultraviolet radiation, and ocular melanoma: a case-control study in France." Cancer Causes Control 12(5): 451-9.

Gumbiner, B. M. et P. D. McCrea (1993). "Catenins as mediators of the cytoplasmic functions of cadherins." J Cell Sci Suppl 17: 155-8.

Hakulinen, 'T., L. Teppo, et ~l. (1978)~ "Cancer of the eye, a review of trends and differentials." World Health Stat 0 31(2): 143-58.

Hanahan, D. et R. A. Weinberg (2000). "The hallmarks of cancer." Cell100(1): 57-70. Hatta, K., S. Takagi, et al. (1987). "Spatial and temporal expression pattern of N-cadherin

cell adhesion molecules correlated with morphogenetic processes of chicken embryos." Dev Biol 120(1): 215-27.

Hemler, M. E., M. J. Elices, et al. (1990). "Structure of the integrin VLA-4 and its cell-cell and cell-matrix adhesion functions." Immunol Rev 114: 45-65.

Hotchin, N. A. et A. Hall (1995). "The assembly of integrin adhesion complexes requires both extracellular matrix and intracellular rho/rac GTPases." J Cell Biol 131(6 Pt 2): 1857-65.

Humphries, M. J., P. A. McEwan, et al. (2003). "Integrin structure: heady advances in ligand binding, but activation still makes the knees wobble." Trends Biochem Sci 28(6): 313-20.

HungerJord, J. L. (1995). "Management of ocular melanoma." Br Med Bull 51(3): 694-716. Hynes, R. O. (1992). "Integrins: versatility, modulation, and signaling in cell adhesion."

CeIl69(1): 11-25. Hynes, R. O. (2002). "Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines." Cell 110(6):

673-87. lozzo, R. V. (1998). "Matrix proteo.glycans: from molecular design to cellular function."

Annu Rev Biochem 67: 609-52. Jaspers, M., R. R. Wu, et al. (1995). "Localization of alpha 4m integrin at sites of

mesenchyme condensation during embryonic mouse development." Differentiation 59(2): 79-86.

Jockusch, B. M., P. Bubeck, et al. (1995). "The molecular architecture of focal adhesions." Annu Rev Cell Dev Biol 11: 379-416.

Johnson, J. P., B. G. Stade, et al. (1989). "De nova expression of intercellular-adhesion mole cule 1 in melanoma correlates with increased risk of metastasis." Proc Nad Acad Sci USA 86(2): 641-4.

89

Joseph-Silverstein, J. et R. L. Silverstein (1998). "Cell adhesion molecules: an overview." Cancer Invest 16(3): 176-82.

Journee-de Korver, J. G. et J. E. Keunen (2002). "Thermotherapy in the management of choroidal melanoma." Prog Retin Eye Res 21(3): 303-17.

Juliano, R. L. et S. Haskill (1993). "Signal transduction from the extracellular matrix." l Cell Biol 120(3): 577-85.

Juliano, R. L., SK. AlaHari et al. (2002. "Biological aspects of signal transduction by cell adhesion receptors." Int Rev Cytol 220: 145-84.

Kassner, P. D., J. Teixido, et al. (1992). "Analyses ofVLA-4 structure and function." Adv Exp Med Biol 323: 163-70.

Kersten, R. C., D. T. Tse, et al. (1985). "Iris melanoma. Nevus or malignancy?" SUry OphthalmoI29(6): 423-33.

Khatib, A. M., L. Fallavollita, et al. (2002). "Inhibition of hepatic endothelial E-selectin expression by C-raf antisense oligonucleotides blocks colorectal carcinoma liver metastasis." Cancer Res 62(19): 5393-8.

Kim, J. P., K. Zhang, et al. (1992). "Mechanism of human keratinocyte migration on fibronectin: unique roles of RGD site and integrins." J Cell PhysioI151(3): 443-50.

Kincaid, M. C. (1998). "Uveal Melanoma." Cancer Control 5(4): 299-309. Kita, D., T. Takino, et al. (2001). "Expression of dominant-negative form of Ets-l

suppresses fibronectin-stimulated cell adhesion and migration through down­regulation of integrin alphaS expression in U251 glioma cell line." Cancer Res 61(21): 7985-91.

Kozmik, Z., T. Czerny, et al. (1997). "Alternatively spliced insertions in the paired domain restrict the DNA sequence specificity ofPax6 and Pax8." Embo J 16(22): 6793-803.

Kuphal, S., R. Bauer, et al. (2005). "Integrin signaling in malignant melanoma." Cancer Metastasis Rev 24(2): 195-222.

Laffon, A., R. Garcia-Vicuna, et al. (1991). "Upregulated expression and function ofVLA-4 fibronectin receptors on human activated T cells in rheumatoid arthritis." J Clin Invest 88(2): 546-52.

Larouche, K., S. Leclerc, et al. (1996). "Multiple nuclear regulatory proteins bind a single cis-acting promoter element to control basal transcription of the human alpha 4 integrin gene in comeal epithelial cells." DNA Cell Biol 15(9): 779-92.

Larouche, K., S. Leclerc, et al. (2000). "Expression of the alpha 5 integrin subunit gene promoter is positively regulated by the extracellular matrix component fibronectin through the transcription factor Sp 1 in corneal epithelial cells in vitro." J Biol Chem 275(50): 39182-92.

Larouche, N., K. Larouche, et al. (1998). "Transcriptional regulation of the alpha 4 integrin subunit gene in the metastatic spread of uveal melanoma." Anticancer Res 18(5A): 3539-47.

Lauweryns, B., J. J. van den Oord, et al. (1991). "Distribution of very late activation integrins in the human comea. An immunohistochemical study using monoclonal antibodies." Invest Ophthalmol Vis Sci 32(7): 2079-85.

Lee, J. W. et R. Juliano "(2004). "Mitogenic signal transduction by integrin- and growth factor receptor-mediated pathways." Mol Cells 17(2): 188-202.

Lefebvre, T., N. Planque, et al. (2002). "O-glycosylation of the nuclear forms of Pax-6 products in ·quail neuroretina cells." J Cell Biochem 85(1): 208-18.

90

Leyvraz, S., V. Spataro, et al. (1997). "Treatment of ocular melanoma metastatic to the liver by hepatic arterial chemotherapy." J Clin OncoI15(7): 2589-95.

Liddington, R. C. et M. H. Ginsberg (2002). "Integrin activation takes shape." J Cell Biol 158(5): 833-9.

Lobb, R. R., W. M. Abraham, et al. (1996). "Pathophysiologic role of alpha 4 integrins in the lung." Ann N Y Acad Sci 796: 113-23.

Loeser, R. F. (1994). "Modulation of integrin-mediated attachment of chondrocytes to extracellular matrix proteins by cations, retinoic acid, and transforming growth factor beta~" Exp Cell Res 211(1): 17-23.

Lopez-Rodriguez, C., L. Botella, et al. (1997). "CCAA T -enhancer-binding proteins (C/EBP) regulate the tissue specific activity of the CD Il c integrin gene promoter through functional interactions with SpI proteins." J Biol Chem 272(46): 29120-6.

Lutz, 1. M., 1. Cree, et al. (2005). "Occupational risks for uveal melanoma results from a case-control study in nine European countries." Cancer Causes Control 16(4): 437-47.

Macdonald, R. et S. W. Wilson (1996). "Pax proteins and eye development." CUIT Opin NeurobioI6(1): 49-56.

Maio, M., A. Pinto, et al. (1990). "DifferentiaI expression of CD54/intercellular adhesion molecule-l in myeloid leukemias and in lymphoproliferative disorders." Blood 76(4): 783-90.

Mareel,· M. et A. Leroy (2003). "Clinical, cellular, and molecular aspects of cancer invasion." Physiol Rev 83(2): 337-76.

Marshall, 1. F., D. C. Rutherford, et al. (1995). "Alpha v beta 1 is a receptor for vitronectin and fibrinogen, and acts with alpha 5 beta 1 to mediate spreading on fibronectin." l Cell Sci 108 ( Pt 3): 1227-38.

Mathers, P. H. et M. Jarnrich (2000). "Regulation of eye formation by the Rx and pax6 homeobox genes." Cell Mol Life Sci 57(2): 186-94.

McCartney, A. C. (1995). "Pathology of ocular melanomas." Br Med Bull 51(3): 678-93. McLean,L W., D~ Berd, et al. (1990). "A randomized study of methanol-extraction residue

of bacille Calmette-Guerin as postsurgical adjuvant therapy of uveal melanoma." Am J Ophthalmolll0(5): 522-6.

McLean, M. J., W. D. Foster, et al. (1977). "Prognostic factors in small malignant melanomas of choroid and ciliary body." Arch Ophthalmol 95( 1): 48-58.

Meenan, J., J. Spaans, et al. (1997). "Altered expression of alpha 4 beta 7; a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation." Gut 40(2): 241-6.

Mikkola, L, J. A. Bruun, et al. (1999). "Phosphorylation of the transactivation domain of Pax6 by extracellular signal-regulated kinase and p38 mitogen-activated protein kinase." J Biol Chem 274(21): 15115-26.

Mizejewski, G. J. (1999). "Role of integrins in cancer: survey of expressionpattems." Proc Soc Exp Biol Med 222(2): 124-38.

Moan, J., A. C. Porojnicu, et al. (2008). "Ultraviolet radiation and malignant melanoma." Adv Exp Med Biol 624: 104-16.

Moles, J. P. et F. M. Watt (1997). "The epidermal stem cell compartment: variation in expression levels of E-cadherin and catenins within the basal layer of human . epidermis." J Histochem Cytochem 45(6): 867-74.

91

Nobes, C. D. et A. Hall (1995). "Rho, rac, anq cdc42 GTPases regulate the assembly of multimolecular focal complexes associated with actin stress fibers, lamellipodia, and filopodia." Ce1l81(1): 53-62.

Nojima, Y., M. J. Humphries, et al. (1990). "VLA-4 mediates CD3-dependent CD4+ T cell activation via the CS 1 altematively spliced domain of fibronectÏn." J Exp Med 172(4): 1185-92.

O'Toole, T. E., Y. Katagiri, et al. (1994). "Integrin cytoplasmic domains mediate inside-out signal transduction." J Cell Biol 124(6): 1047-59.

Oguariri, R. M., T. W. Brann, et al. (2007). "Hydroxyurea and interleukin-6 synergistically reactivate HIV -1 replication in a latently infected promonocytic cell line via SP1/SP3 transcription factors." J Biol Chem 282(6): 3594-604. .

Ohene-Abuakwa, Y. et M. Pignatelli (2000). "Adhesion Molecules as Diagnostic Toois in Tumor Pathology." Int J Surg PathoI8(3): 191-200.

Olsen, B. R. (1995). "New insights into the function of collagens from genetic analysis." Curr Ooin Cell Biol 7(5): 720-7.

Oosterhuis, J. A., L. N. Went, et al. (1982). "Primary choroidal and cutaneous melanomas, bilateral choroidal melanomas, and familial occurrence of melanomas." Br J Ophthalmo166( 4): 230-3.

Park, C. C., M. J. Bissell, et al. (2000). "The influence of the microenvironment on the malignant phenotype." Mol Med Today 6(8): 324-9.

i Passlick, B., J. R. Izbicki, et al. (1994). "Expression of major histocompatibility class 1 and class II antigens and intercellular adhesion molecule-Ion operable non-small cell lung carcinomas: frequency and prognostic significance." Eur J Cancer 30A(3): 376-81.

Pennini ME., Y. Liu et al. (2007). "CCAAT/enhancer-binding protein beta and delta binding to CIIT A promoters is associated with the inhibition of CIIT A expression in response to Mycobacteriu~ tuberculosis 19-kDa lipoprotein." J ImmunoI179(10): 6910-8.

Petruzzelli, . L., M. Takami, et al. (1999). "Structure and function of cell adhesion molecules." Am J Med 106(4): 467-76.

Philipsen, S. et G. Suske (1999). "A tale of three fingers: the family of mammalian Sp/XKLF transcription factors." Nucleic Acids Res 27(15): 2991-3000.

Planque, N., L. Leconte, et al. (2001). "Specific Pax-6/microphthalmia transcription factor interactions involve their DNA-binding domains and inhibit transcriptional properties ofboth proteins." J Biol Chem 276(31): 29330-7.

Plow, E. F., T. A. Haas, et al. (2000). "Ligand binding to integrins." J Biol Chem 275(29): 21785-8.

Pothier, F., M. Ouellet, et al. (1992). "An improved CAT assay for promoter analysis in either transgenic mice or tissue culture cells." DNA Cell Biol 11(1): 83-90.

Przybylo, M., E. Pochec, et al. (2008). "Betal-6 branching of cell surface glycoproteins may contribute to uveal melanoma progression by up-regulating cell motility." Mol Vis 14: 625-36.

Pulai, 1. I., M. Del Carlo, Jr., et al. (2002). "The alpha5betal integrin provides matrix survival signaIs for normal and osteoarthritic hum an articular chondrocytes in vitro." Arthritis Rheum 46(6): 1528-35.

Robbins, S. G., R. B. Brem, et al. (1994). "Immunolocalization of integrins in proliferative retinal membranes." Invest Ophthalmol Vis Sci 35(9): 3475-85.

92

Robinson, E. E., K. M. Zazzali, et al. (2003). "Alpha5beta1 integrin mediates strong tissue cohesion." J Cell Sci 116(Pt 2): 377-86.

Romer, L. H., K. G. Birukov, et al. (20.06). "Focal adhesions: paradigm for a signaling nexus." Circ Res 98(5): 606-16.

Rosen, G. D., 1. L. Barks, et al. (1994). "An intricate arrangement of binding sites for -the Ets family of transcription factors regulates activity of the alpha 4 integrin gene promoter." 1 Biol Chem 269(22): 15652-60.

Rosen, G. D., T. M. Birkenmeier, et al. (1991). "Characterization of the alpha 4 integrin gene promoter." Proc Nat! Acad Sci USA 88(10): 4094-8.

Roskelley, C. D., A. Srebrow, et al. (1995). "A hierarchy of ECM-mediated signalling regulates tissue-specific gene expression." Curr Opin Cell Biol 7(5): 736-47.

Rosskothen, N., 1. Hirschmuller-Ohmes, et al. (2008). "AP-1 activity rises by stimulation­dependent c-Fos expression in auditory neurons." Neuroreport 19(11): 1091-3.

Roy, R. J., P. Gosselin, et al. (1991). "A short protocol for micro-purification of nuclear ' proteins from whole animal tissue." Biotechnigues 11(6): 770-7.

Sanders, R. 1., F. Mainiero, et al. (1998). "The role of integrins in tumorigenesis and metastasis." Cancer Invest 16(5): 329-44.

Schaller, M. D. et 1. T. Parsons (1994). "Focal adhesion kinase and associated proteins." CUIT Opin Cell Biol 6(5): 705-10.

Schatzmann, F., R. Marlow, et al. (2003). "lntegrin signaling and mammary cell function." J Mammary Gland Biol Neoplasia 8(4): 395-408.

Schneider, R., 1. Gander, et al. (1986). "A sensitive and rapid gel retenti on assay for nuclear factor 1 and other DNA-binding proteins in crude nuclear extracts." Nucleic Acids Res 14(3): 1303-17.

Schraermeyer, U., K. Addicks, et al. (1998). "Capillaries are present in Bruch's membrane at the ora serrata in the human eye." Invest Ophthalmol Vis Sci 39(7): 1076-84.

Scohy, S., P. Gabant, et al. (2000). "Identification of KLF13 and KLF14 (SP6), novel members of the SP/XKLF transcription factor family." Ge~omics 70(1): 93-101.

Scotto, 1., J. F. Fraumeni, Ir., et al. (1976). "Melanomas of the eye and other noncutaneous sites: epidemiologic aspects." J Nat! Cancer Inst 56(3): 489-91.

Seftor, R. E., E. A. Seftor, et al. (1999). "Molecular role(s) for integrins in human melanoma invasion." Cancer Metastasis Rev 18(3): 359-75.

Seregard, S. (1996). "Posterior uveal melanoma. The Swedish perspective." Acta Ophthalmol Scand 74(4): 315-29.

Seregard, S. (1999). "Long-term survival after ruthenium plaque radiotherapy for uveal melanoma. A meta-analysis of studies including 1,066 patients." Acta Ophthalmol Scand 77(4): 414-7.

Shammas, H. F. et F. C. Blodi (1977). "Prognostic factors in choroidal and ciliary , body melanomas." Arch OphthalmoI95(1): 63-9.

Sherry, D.M., P.A. Proske (2001). "Localization 'of alpha integrin subunits in the neural retina of the tiger salamander." Graefes Arch Clin Exp Ophtalmol239: 278-87.

Shields, C. L., 1. A. Shields, et al. (1998). "Transpupillary thermotherapy for choroidal melanoma: tumor control ,and visual results in' 100 consecutive cases." Ophthalmology 105(4): 581-90.

Shields, J. A., W. H. Annesley, Jr., et al. (1977). "Necrotic melanocytoma of iris with secondary glaucoma." Am J Ophthalmo184(6): 826-9.

93

Shields, J. A., C. L. Shields, et al. (1991). "Management of posterior uveal melanoma." SUry OphthalmoI36(3): 161-95.

Shimaoka, M. et T. A. Springer (2003). "Therapeutic antagonists and conformational regulation of integrin function. " Nat Rev Drug Discov 2(9): 703-16.

Shimaoka, M., J. Takagi, et al. (2002). "Conformational regulation of integrin structure and function." Annu Rev Biophys Biomol Struct 31: 485-516.

Shimizu, Y. , G. A. van Seventer, et al. (1990). "Costimulation of proliferative responses of resting CD4+ T cel~s by the interaction of VLA-4 and VLA-5 with fibronectin or VLA-6 with laminin." J ImmunoI145(1): 59-67.

Sincock, P. M., G. Mayrhofer, et al. (1997). "Localization of the transmembrane 4 superfamily (TM4SF) member PETA-3 (CD151) in normal human tissues: comparison with CD9, CD63, and alpha5beta1 integrin." J Histochem Cytochem 45(4): 515-25.

Singh, A. D. (2001). "Uveal melanoma: implications of tumor doubling time." Ophthalmology 108(5): 829-31.

Singh, A. D. et A. Topham (2003). "Incidence of uveal melanoma in the United States: 1973-1997." Ophthalmology 110(5): 956-61.

Sisley, K., D. W. Cottam, et al. (1992). "Non-random abnormalities of chromosomes 3, 6, and 8 associated with ·posterior uveal melanoma." Genes Chromosomes Cancer 5(3): 197-200.

Sorensen, F. B., 1. W. Gamel, et al. (1993). "Prognostic value of nucleolar size and size pleomorphism in choroidal mela~omas." Apmis 101(5): 358-68.

Stallmach, A., B. von Lampe, et al. (1992). "Diminished expression of integrin adhesion molecules on human colonic epithelial cells during the benign to malign tumour transformation." Gut 33(3): 342-6.

Stepp, M. A., S. SpuIT-Michaud, et al. (1993). "Integrins in the wounded and unwounded stratified squamous epithelium of the comea." Invest Ophthalmol Vis Sci 34(5): 1829-44.

Strachan, T. et A. P. Read (1994). "PAX genes." CUIT Opin Genet Dev 4(3): 427-38. Streuli, C. (1999). "Extracellular matrix remodelling and cellular differentiation." CUIT

Opin Cell Biol 11(5): 634-40. Striz, 1. et U. Costabel (1992). "The role of integrins in the immune response.!1 Sarcoidosis

9(2): 88-94. Stupack, D. G. et D. A. Cheresh (2002). "Get a ligand, get a life: integrins, signaling and

cell survival." J Cell Sci 115(Pt 19): 3729-38. Symington, B. E. (1995). "Growth signalling through the alpha 5 beta 1 fibronectin

receptor." Biochem Biophys Res Commun 208(1): 126-34. Tsonis, P. A. et E. J. Fuentes (2006). "Focus on molecules: Pax-6, the eye master." Exp Eye

Res 83(2): 233-4. Urbich, C., E. Dembach, et al. (2002). "Shear stress-induced endothelial cell migration

involves integrin signaling via the fibronectin receptor subunits alpha( 5) and beta(l)." Arterioscler Thromb Vasc Biol 22(1): 69-75.

van der Flier, A. et A. Sonnenberg (2001). "Function and interactions of integrins." Cell Tissue Res 305(3): 285-98.

van Heyningen, V. et K. A. Williamson (2002). "PAX6 in sensory development." Hum Mol . Genet 11(10): 1161-7.

94

Vidal, 1. L. , F. Bacin, et al. (1995). "["Melanoma 92". epidemiological study of uveal melanoma in France J." J Fr OphtalmoI18(8-9): 520-8.

Vigneault, F. , K. Zaniolo, et al. (2007). "Control of integrin genes expression in the eye." Prog Retin Eye Res 26(2): 99-161.

Walsh, L. 1. et G. F. Murphy (1992). "Role of adhesion molecules in cutaneous inflammation and neoplasia." J Cutan PathoI19(3): 161-71.

Wayner, E. A., A. Garcia-Pardo, et al. (1989). "Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an altem"ative ceU attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin." J CeU Biol 109(3): 1321-30.

Wehrle-HaUer, B. et B. A. Imhof (2003). "Actin, microtubules and focal adhesion dynamics during cell migration." Int J Biochem Cell Biol 35(1): 39-50.

Wiesner, S. , K. R. Legate, et al. (2005). "Integrin-actin interactions." Cell Mol Life Sci 62(10): 1081-99.

Williams, D. A. , M. Rios, et al. (1991). "Fibronectin and VLA-4 in haematopoietic stem cell-microenvironment interactions." Nature 352(6334): 438-41.

Wolff, J. M., R. N. Stephenson, et al. (1995). "Levels of circulating intercellular adhesion molecule-1 in patients with metastatic cancer of the prostate and benign prostatic hyperplasia." Eur J Cancer 31A(3): 339-41.

Woodward, J. K. , 1. G. Rennie, et al. (2005). "Invasive and noninvasive uveal melanomas have different adhesive properties." Eye 19(3): 342-8.

Xu, H. E., M. A. Rould, et al. (1999). "Crystal structure of the hum an Pax6 paired domain­DNA complex reveals specific roles for the linker region and carboxy-terminal subdomain in DNA binding." Genes Dev 13(10): 1263-75.

Xu, K. et H. K. Shu (2007). "EGFR activation results in enhanced cyclooxygenase-2 expression through p38 mitogen-activated protein kinase-dependent activation of the Sp1/Sp3 transcription factors in hum an gliomas." Cancer Res 67(13): 6121-9.

Xu, R., P. Zhang, et al. (2007). "SpI and Sp3 regulate bas,}! transcription of the survivin gene." Biochem Biophys Res Commun 356(1): 286-92.

Yan, Q., W. B. Liu, et al. (2007). "Prote in phosphatase-1 modulates the function of Pax-6, a transcription factor controlling brain and eye development." J Biol Chem 282(19): 13954-65.

Yap, A. S., C. M. Niessen, et al. (1998). "The juxtamembrane region of the cadherin cytoplasmic tail supports lateral clustering, adhesive strengthening, and interaction with p120ctn." J Cell Biol 141(3): 779-89.

Young, RW. (1976). "Visual cells and the concept ofrenewal." Invest OphtalmoI15:700-25.

Zagris, N. (2001). "Extracellular matrix in development of the early embryo." Micron 32(4): 427-38.

Zaniolo, K., S. Leclerc, et al. (2004). "Expression of the alpha4 integrin subunit gene promo ter is modulated by the transcription factor Pax-6 in comeal epithelial ceUs." Invest Ophthalmol Vis Sci 45(6): 1692-704.

Zimmerman, L. E., 1. W. McLean, et al. (1978). "Does enucleation of the eye containing a malignant melanoma prevent or accelerate the dissemination of tumour cells." Br J OphthalmoI62(6): 420-5.

Zhang, Z.H., S. Vekemans et al. (1991). "The gene for the alpha4 subunit of the VLA-4 integrin maps to chromosome 2Q31-32. Blood 78: 2396-99.