des protéines aux gènes … (première partie)
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Des Protéines aux Gènes … (Première partie). Jérôme GARIN Laboratoire de Chimie des Protéines CEA/INSERM/UJF (Génopole Rhône-Alpes). L’avènement de la Post-Génomique. ARNm. PROTEINES. GENES. Génomique (33.000 gènes). Transcriptomique. Protéomique (10 6 formes protéiques ?). - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
IN’Tech 2003
Des Protéines aux Gènes …Des Protéines aux Gènes …
(Première partie)(Première partie)
Jérôme GARINLaboratoire de Chimie des ProtéinesCEA/INSERM/UJF(Génopole Rhône-Alpes)
IN’Tech 2003
L’avènement de la Post-GénomiqueL’avènement de la Post-Génomique
GENESGENES
GénomiqueGénomique(33.000 gènes)(33.000 gènes)
• MaturationMaturation• Modif. Post-Trad.Modif. Post-Trad.• Demi-vieDemi-vie• LocalisationLocalisation• PartenairesPartenaires
ARNmARNm PROTEINESPROTEINES
TranscriptomiqueTranscriptomique ProtéomiqueProtéomique(10(1066 formes protéiques ?) formes protéiques ?)
IN’Tech 2003
Les outils de la ProtéomiqueLes outils de la Protéomique
IN’Tech 2003
TrypsineTrypsine
LysLys ArgArg LysLys
PeptidesPeptides
LysLys
LysLys
ArgArg
Digestion des protéines par la trypsineDigestion des protéines par la trypsineLes outils de la protéomique
IN’Tech 2003
Cellule de collisionFragmentationFragmentation
Analyseur ToF
Détecteur
Source nano-electrospray Quadrupole
Sélection des ionsSélection des ions
Spectrométrie de masse en mode tandem : sélection et fragmentation des peptidesSpectrométrie de masse en mode tandem : sélection et fragmentation des peptidesLes outils de la protéomique
NanoESI-MS/MS
IN’Tech 2003
R P Q G P M W E
100 200 300 400 500 600 700 800 900 10000
100
%
554.33159.09
288.14272.17
685.37
871.461000.49
Banques Protéiques ou Banques Protéiques ou GénomiquesGénomiques
BLASTPBLASTP tBLASTNtBLASTN
EWMPGQPR....VGRRHGSRVSKSAEWMPGQPRPPHLDGSAPGD....
Séquençage des peptides par nanoESI-MS/MSSéquençage des peptides par nanoESI-MS/MSLes outils de la protéomique
IN’Tech 2003
Analyses nanoLC-nanoESI-MS/MS (« Shot gun Proteomics »)Analyses nanoLC-nanoESI-MS/MS (« Shot gun Proteomics »)
Les outils de la protéomique
Spectres MS/MSSpectres MS/MSSéparation Peptides + concentrationSéparation Peptides + concentration
(profil UV)(profil UV)
nanoLC
Colonne capillaire RP(75 µm x 15 cm)
MS/MS
IN’Tech 2003
Données expérimentalesDonnées expérimentales
Masse du peptide trypsique (m)Masse du peptide trypsique (m)
Spectre MS/MSSpectre MS/MS
+
200 400 600 800 1000 12000
100
%
554.33159.09
288.14272.17
685.37871.46
1000.49
n spectres MS/MS théoriquesn spectres MS/MS théoriques
MASCOT
Interprétation des données (haut débit)Interprétation des données (haut débit)Les outils de la protéomique
Données théoriquesDonnées théoriques
Digestion trypsique Digestion trypsique in silicoin silico des des banques protéiquesbanques protéiques
Sélection des n protéines pourSélection des n protéines pourlesquelles on attend un peptidelesquelles on attend un peptide
trypsique de masse mtrypsique de masse m
IN’Tech 2003
ProtéomeProtéome(spectres (spectres MS/MS)MS/MS)
Banques de donnéesBanques de donnéesprotéiquesprotéiques
Interprétation des données (haut débit)Interprétation des données (haut débit)Les outils de la protéomique
IN’Tech 2003
1996 : Séquençage d’Edman
« Haut débit » : 1 protéine/jour …« Haute sensibilité » : 20
picomoles/protéine
2003 : nanoLC-MS/MS
« Haut débit » : 100 - 1000 protéines/jour
« Haute sensibilité » : 20 femtomoles/protéine
Quelques chiffres …Quelques chiffres …
IN’Tech 2003
La Protéomique : un outil d’annotation La Protéomique : un outil d’annotation fonctionnelle des Génomesfonctionnelle des Génomes
IN’Tech 2003
Pi/TriosePPi/TrioseP
CaCa2+2+
ADPADP
ATPATPPorinPorin
ATP/ADPATP/ADP
PEP/PiPEP/Pi
2-OG/Malate2-OG/Malate
ProteinsProteins
Amino acidsAmino acids
Characterized activityCharacterized activity(known sequence)(known sequence)
ClCl--/NO/NO--22
HCOHCO33--
PorinPorin
PorinePorine
KK++/Na/Na++
CaCa2+2+
ATPATP
ADPADP
HH++
SOSO442-2-
HPOHPO442+2+
Glycerate/GlycolateGlycerate/Glycolate
Glu/GlnGlu/Gln
OAA/MalOAA/Mal
Mal/GluMal/Glu
PyrophosphatePyrophosphate
GlucoseGlucoseCOCO22
NONO22--
Characterized activityCharacterized activity(unknown sequence)(unknown sequence)
MetalsMetalsVitaminsVitamins
Amino acidsAmino acids
Fatty acidsFatty acidsHH22OO
Predicted activity(unknown sequence)
Identification de nouveaux transporteurs chloroplastiquesIdentification de nouveaux transporteurs chloroplastiquesProtéomique et annotation fonctionnelle des génomes
IN’Tech 2003
Envelope chloroplaste
Peptides trypsiques
Trypsine
NanoLC-MS/MS
Protéines très hydrophobes(solubles en chloroforme/méthanol)
SDS-PAGE
Identification de nouveaux transporteurs chloroplastiquesIdentification de nouveaux transporteurs chloroplastiquesProtéomique et annotation fonctionnelle des génomes
• 3 Transporteurs déjà connus• 22 Transporteurs hypothétiques• Nombreux spectres MS/MS non attribués
MASCOT
IN’Tech 2003
ProtéomeProtéome(spectres (spectres MS/MS)MS/MS)
Banques de donnéesBanques de donnéesprotéiquesprotéiques GénomeGénome
Protéines hypothétiquesProtéines hypothétiques
Gènes hypothétiquesGènes hypothétiques
Exons hypothétiquesExons hypothétiques
GénomeGénome
ProtéomeProtéome(spectres (spectres MS/MS)MS/MS)
Identification de nouveaux transporteurs chloroplastiquesIdentification de nouveaux transporteurs chloroplastiquesProtéomique et annotation fonctionnelle des génomes
IN’Tech 2003
Yves VANDENBROUCK
Myriam FERRORomain CAHUZAC
Gilles ANDREJérôme GARIN
Jacques JOYARDNorbert ROLLAND
Erwan RÉGUEREstelle NUGUES
Alain VIARI