des protéines aux gènes … (première partie)

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IN’Tech 2003 Des Protéines aux Gènes … Des Protéines aux Gènes … (Première partie) (Première partie) Jérôme GARIN Laboratoire de Chimie des Protéines CEA/INSERM/UJF (Génopole Rhône-Alpes)

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Des Protéines aux Gènes … (Première partie). Jérôme GARIN Laboratoire de Chimie des Protéines CEA/INSERM/UJF (Génopole Rhône-Alpes). L’avènement de la Post-Génomique. ARNm. PROTEINES. GENES. Génomique (33.000 gènes). Transcriptomique. Protéomique (10 6 formes protéiques ?). - PowerPoint PPT Presentation

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Page 1: Des Protéines aux Gènes … (Première partie)

IN’Tech 2003

Des Protéines aux Gènes …Des Protéines aux Gènes …

(Première partie)(Première partie)

Jérôme GARINLaboratoire de Chimie des ProtéinesCEA/INSERM/UJF(Génopole Rhône-Alpes)

Page 2: Des Protéines aux Gènes … (Première partie)

IN’Tech 2003

L’avènement de la Post-GénomiqueL’avènement de la Post-Génomique

GENESGENES

GénomiqueGénomique(33.000 gènes)(33.000 gènes)

• MaturationMaturation• Modif. Post-Trad.Modif. Post-Trad.• Demi-vieDemi-vie• LocalisationLocalisation• PartenairesPartenaires

ARNmARNm PROTEINESPROTEINES

TranscriptomiqueTranscriptomique ProtéomiqueProtéomique(10(1066 formes protéiques ?) formes protéiques ?)

Page 3: Des Protéines aux Gènes … (Première partie)

IN’Tech 2003

Les outils de la ProtéomiqueLes outils de la Protéomique

Page 4: Des Protéines aux Gènes … (Première partie)

IN’Tech 2003

TrypsineTrypsine

LysLys ArgArg LysLys

PeptidesPeptides

LysLys

LysLys

ArgArg

Digestion des protéines par la trypsineDigestion des protéines par la trypsineLes outils de la protéomique

Page 5: Des Protéines aux Gènes … (Première partie)

IN’Tech 2003

Cellule de collisionFragmentationFragmentation

Analyseur ToF

Détecteur

Source nano-electrospray Quadrupole

Sélection des ionsSélection des ions

Spectrométrie de masse en mode tandem : sélection et fragmentation des peptidesSpectrométrie de masse en mode tandem : sélection et fragmentation des peptidesLes outils de la protéomique

NanoESI-MS/MS

Page 6: Des Protéines aux Gènes … (Première partie)

IN’Tech 2003

R P Q G P M W E

100 200 300 400 500 600 700 800 900 10000

100

%

554.33159.09

288.14272.17

685.37

871.461000.49

Banques Protéiques ou Banques Protéiques ou GénomiquesGénomiques

BLASTPBLASTP tBLASTNtBLASTN

EWMPGQPR....VGRRHGSRVSKSAEWMPGQPRPPHLDGSAPGD....

Séquençage des peptides par nanoESI-MS/MSSéquençage des peptides par nanoESI-MS/MSLes outils de la protéomique

Page 7: Des Protéines aux Gènes … (Première partie)

IN’Tech 2003

Analyses nanoLC-nanoESI-MS/MS (« Shot gun Proteomics »)Analyses nanoLC-nanoESI-MS/MS (« Shot gun Proteomics »)

Les outils de la protéomique

Spectres MS/MSSpectres MS/MSSéparation Peptides + concentrationSéparation Peptides + concentration

(profil UV)(profil UV)

nanoLC

Colonne capillaire RP(75 µm x 15 cm)

MS/MS

Page 8: Des Protéines aux Gènes … (Première partie)

IN’Tech 2003

Données expérimentalesDonnées expérimentales

Masse du peptide trypsique (m)Masse du peptide trypsique (m)

Spectre MS/MSSpectre MS/MS

+

200 400 600 800 1000 12000

100

%

554.33159.09

288.14272.17

685.37871.46

1000.49

n spectres MS/MS théoriquesn spectres MS/MS théoriques

MASCOT

Interprétation des données (haut débit)Interprétation des données (haut débit)Les outils de la protéomique

Données théoriquesDonnées théoriques

Digestion trypsique Digestion trypsique in silicoin silico des des banques protéiquesbanques protéiques

Sélection des n protéines pourSélection des n protéines pourlesquelles on attend un peptidelesquelles on attend un peptide

trypsique de masse mtrypsique de masse m

Page 9: Des Protéines aux Gènes … (Première partie)

IN’Tech 2003

ProtéomeProtéome(spectres (spectres MS/MS)MS/MS)

Banques de donnéesBanques de donnéesprotéiquesprotéiques

Interprétation des données (haut débit)Interprétation des données (haut débit)Les outils de la protéomique

Page 10: Des Protéines aux Gènes … (Première partie)

IN’Tech 2003

1996 : Séquençage d’Edman

« Haut débit » : 1 protéine/jour …« Haute sensibilité » : 20

picomoles/protéine

2003 : nanoLC-MS/MS

« Haut débit » : 100 - 1000 protéines/jour

« Haute sensibilité » : 20 femtomoles/protéine

Quelques chiffres …Quelques chiffres …

Page 11: Des Protéines aux Gènes … (Première partie)

IN’Tech 2003

La Protéomique : un outil d’annotation La Protéomique : un outil d’annotation fonctionnelle des Génomesfonctionnelle des Génomes

Page 12: Des Protéines aux Gènes … (Première partie)

IN’Tech 2003

Pi/TriosePPi/TrioseP

CaCa2+2+

ADPADP

ATPATPPorinPorin

ATP/ADPATP/ADP

PEP/PiPEP/Pi

2-OG/Malate2-OG/Malate

ProteinsProteins

Amino acidsAmino acids

Characterized activityCharacterized activity(known sequence)(known sequence)

ClCl--/NO/NO--22

HCOHCO33--

PorinPorin

PorinePorine

KK++/Na/Na++

CaCa2+2+

ATPATP

ADPADP

HH++

SOSO442-2-

HPOHPO442+2+

Glycerate/GlycolateGlycerate/Glycolate

Glu/GlnGlu/Gln

OAA/MalOAA/Mal

Mal/GluMal/Glu

PyrophosphatePyrophosphate

GlucoseGlucoseCOCO22

NONO22--

Characterized activityCharacterized activity(unknown sequence)(unknown sequence)

MetalsMetalsVitaminsVitamins

Amino acidsAmino acids

Fatty acidsFatty acidsHH22OO

Predicted activity(unknown sequence)

Identification de nouveaux transporteurs chloroplastiquesIdentification de nouveaux transporteurs chloroplastiquesProtéomique et annotation fonctionnelle des génomes

Page 13: Des Protéines aux Gènes … (Première partie)

IN’Tech 2003

Envelope chloroplaste

Peptides trypsiques

Trypsine

NanoLC-MS/MS

Protéines très hydrophobes(solubles en chloroforme/méthanol)

SDS-PAGE

Identification de nouveaux transporteurs chloroplastiquesIdentification de nouveaux transporteurs chloroplastiquesProtéomique et annotation fonctionnelle des génomes

• 3 Transporteurs déjà connus• 22 Transporteurs hypothétiques• Nombreux spectres MS/MS non attribués

MASCOT

Page 14: Des Protéines aux Gènes … (Première partie)

IN’Tech 2003

ProtéomeProtéome(spectres (spectres MS/MS)MS/MS)

Banques de donnéesBanques de donnéesprotéiquesprotéiques GénomeGénome

Protéines hypothétiquesProtéines hypothétiques

Gènes hypothétiquesGènes hypothétiques

Exons hypothétiquesExons hypothétiques

GénomeGénome

ProtéomeProtéome(spectres (spectres MS/MS)MS/MS)

Identification de nouveaux transporteurs chloroplastiquesIdentification de nouveaux transporteurs chloroplastiquesProtéomique et annotation fonctionnelle des génomes

Page 15: Des Protéines aux Gènes … (Première partie)

IN’Tech 2003

Yves VANDENBROUCK

Myriam FERRORomain CAHUZAC

Gilles ANDREJérôme GARIN

Jacques JOYARDNorbert ROLLAND

Erwan RÉGUEREstelle NUGUES

Alain VIARI