techniques de culture cellulaire. année 2006-2007 Équipe pédagogique du lycée jean moulin...

TECHNIQUES DE CULTURE TECHNIQUES DE CULTURE CELLULAIRECELLULAIRE

Année 2006-2007Année 2006-2007 Équipe pédagogique du Lycée Jean MOULIN (ANGERS)Équipe pédagogique du Lycée Jean MOULIN (ANGERS)

POCHETPOCHET 22

Techniques de culture Techniques de culture cellulairecellulaire

Les cellulesLes cellules Les milieux de cultureLes milieux de culture Les contenantsLes contenants L’environnementL’environnement L’entretienL’entretien


POCHETPOCHET 33

Les cellulesLes cellules

Cellules normalesCellules normales À nombre de repiquages limitéÀ nombre de repiquages limité

ObtentionObtention À partir d’un prélèvement tissulaire : avec ou sans À partir d’un prélèvement tissulaire : avec ou sans

dissociationdissociation Dissociation des liaisons fortes entre cellulesDissociation des liaisons fortes entre cellules

Mécanique : broyage, vortexage …Mécanique : broyage, vortexage … Enzymatique essentiellementEnzymatique essentiellement

Mise en culture : culture primaireMise en culture : culture primaire Repiquage ou « passage » : culture secondaireRepiquage ou « passage » : culture secondaire


POCHETPOCHET 44


Cellules transformées (ou éventuellement Cellules transformées (ou éventuellement embryonnaires)embryonnaires) À nombre de passages illimité donnant une lignée continueÀ nombre de passages illimité donnant une lignée continue

les plus utilisées en culture cellulaire et virologie médicale :les plus utilisées en culture cellulaire et virologie médicale :Cellules Vero,Cellules Vero, cellules rénales de singe vert africain ( cellules rénales de singe vert africain (Cercopithecus Cercopithecus aethiopsaethiops)) Aspect de fibroblaste : fusiformeAspect de fibroblaste : fusiforme Adhérant rapidement au support de verre ou plastique grâce Adhérant rapidement au support de verre ou plastique grâce

aux ions Caaux ions Ca2+2+ ou Mg ou Mg2+2+.. Autres cellulesAutres cellules

Cellules tumorales : Cellules tumorales : HeLa (tumeur utérine) ; HeLa (tumeur utérine) ; KB (carcinome oral humain)KB (carcinome oral humain)

Cellules embryonnaires : Cellules embryonnaires : MRC-5 (poumon de foetus humain) ; MRC-5 (poumon de foetus humain) ; 3T3 (embryon de souris) 3T3 (embryon de souris)


POCHETPOCHET 55


Cellules non transforméesMort programmée = apoptose

Log n cellules

Temps

Culture primaire

Culture secondaire

Cellules transforméesLignée continue

Premier passage Deuxième passage


POCHETPOCHET 66


Division : environ 25 à 30 heuresDivision : environ 25 à 30 heures Si cellules adhérentesSi cellules adhérentes

Formation d’un tapis (« à confluence ») pour Formation d’un tapis (« à confluence ») pour une densité 10une densité 1055 / cm / cm2 2

Puis détachement et mortPuis détachement et mort Nécessité d’un changement de milieu Nécessité d’un changement de milieu

tous les 2 à 3 jourstous les 2 à 3 jours


POCHETPOCHET 77

Les milieux de cultureLes milieux de culture Exigences cellulaires minimalesExigences cellulaires minimales

eaueau ions minérauxions minéraux donnant une osmolarité identique à celle du donnant une osmolarité identique à celle du

sérum physiologique sérum physiologique source de carbone et d'énergiesource de carbone et d'énergie (glucose par exemple) (glucose par exemple) source d'azotesource d'azote : acides aminés : acides aminés source d’acides grassource d’acides gras pHpH constant 7,4 (indicateur de pH : rouge de phénol) grâce un constant 7,4 (indicateur de pH : rouge de phénol) grâce un

système tampon COsystème tampon CO22/HCO/HCO33-- ou phosphates. ou phosphates.

Base commune (milieux Hanks, Earl, PBS, Gey) :Base commune (milieux Hanks, Earl, PBS, Gey) : Sels minéraux : NaCl, KCl, CaClSels minéraux : NaCl, KCl, CaCl22, MgCl, MgCl2, 2, NaHNaH22POPO44…… Sucre : glucose Sucre : glucose

Compléments variables selon les milieux (RPMI, MEM, Compléments variables selon les milieux (RPMI, MEM, DMEM…)DMEM…) Acides aminésAcides aminés Vitamines et cofacteursVitamines et cofacteurs Bases azotées, ribose et désoxyriboseBases azotées, ribose et désoxyribose


POCHETPOCHET 88

Les milieux de cultureLes milieux de culture Compléments à ajouterCompléments à ajouter extemporanément : extemporanément :

Mélanges d’antibiotiquesMélanges d’antibiotiques au taux final de au taux final de 1 %1 % Pénicilline G, Pénicilline G, Streptomycine, Streptomycine, Amphotéricine B (antifongique)… Amphotéricine B (antifongique)…

GlutamineGlutamine à à 1% 1% (acide aminé instable)(acide aminé instable) Sérum de veau fœtalSérum de veau fœtal (S.V.F. ou F.C.S. Fœtal Calf Serum)(S.V.F. ou F.C.S. Fœtal Calf Serum)

entre 1,5 et entre 1,5 et 10 % 10 % prélevé stérilement et décomplémenté prélevé stérilement et décomplémenté apportant apportant

facteurs de croissance cellulairefacteurs de croissance cellulaire EGF (facteur de croissance épidermique), EGF (facteur de croissance épidermique), FGF (facteur de croissance fibroblastique) FGF (facteur de croissance fibroblastique) PDGF (facteur de croissance dérivé des plaquettes)PDGF (facteur de croissance dérivé des plaquettes)

Facteurs de différenciation comme Facteurs de différenciation comme fibronectine (ancrage fibronectine (ancrage des cellules).des cellules).

InhibiteursInhibiteurs comme l’alpha1 antitrypsine (neutralisation de comme l’alpha1 antitrypsine (neutralisation de l’action enzymatique de la trypsine)l’action enzymatique de la trypsine)


POCHETPOCHET 99

Les contenantsLes contenants FlaconsFlacons

En polystyrène optiquement clair stérileEn polystyrène optiquement clair stérile Traités ou non pour adhérenceTraités ou non pour adhérence De contenance et surface variable par ex :De contenance et surface variable par ex :

25 cm25 cm2 2 contenance totale 60 mL / vol 5 mLcontenance totale 60 mL / vol 5 mL 75 cm75 cm2 2 contenance totale 250 mL / vol 10 mLcontenance totale 250 mL / vol 10 mL 150 cm150 cm2 2 contenance totale 60 mL / vol 20 mLcontenance totale 60 mL / vol 20 mL

Plaques multipuitsPlaques multipuits En polystyrène optiquement clair En polystyrène optiquement clair

stérilestérile Traités ou non pour adhérenceTraités ou non pour adhérence À fond plat et couvercleÀ fond plat et couvercle Nombre de puits et contenance Nombre de puits et contenance

variablevariable 6, 12, 24, 48, 966, 12, 24, 48, 96

BoitesBoites En polystyrène optiquement clair En polystyrène optiquement clair

stérilestérile Traités ou non pour adhérenceTraités ou non pour adhérence Diamètre allant de 35 à 150 mmDiamètre allant de 35 à 150 mm


POCHETPOCHET 1010

L’environnement durant l’incubationL’environnement durant l’incubation

Respectant certains paramètres physico-chimiques Respectant certains paramètres physico-chimiques nécessaires à la culture cellulairenécessaires à la culture cellulaire

la température : 37 °C la température : 37 °C l'hygrométrie : 84 à 85 % d’humidité l'hygrométrie : 84 à 85 % d’humidité le pH 7,4 maintenu grâce aux systèmes tamponle pH 7,4 maintenu grâce aux systèmes tampon

du milieudu milieu renforcés par à l’atmosphère enrichie à 5% de COrenforcés par à l’atmosphère enrichie à 5% de CO22 (système (système

tampon avec HCOtampon avec HCO33--) )


POCHETPOCHET 1111

L’incubateur à COL’incubateur à CO22

5 %37°C

Incubateur fermé avec

Voyants de Pression en CO2 et température

Bonbonne d’anhydride carbonique

Ses manomètres de pression

Son système d’injection

Double porte avec verrouillage

Bac d’eau stérilisée pour maintien d’un taux d’humidité suffisant

Clayettes perforées pour circulation d’air


POCHETPOCHET 1212

L’environnement durant le repiquageL’environnement durant le repiquage

Respectant la stérilité Respectant la stérilité Sensibilité des cellules aux infections Sensibilité des cellules aux infections

Bactériennes (en particulier les mycoplasmes), Bactériennes (en particulier les mycoplasmes), Fongiques,Fongiques, Virales.Virales.

Utilisation de façon adéquate d’une enceinte à Utilisation de façon adéquate d’une enceinte à atmosphère stérile :atmosphère stérile : PSM Poste de Sécurité MicrobiologiquePSM Poste de Sécurité Microbiologique

Indicateur de pH : Rouge de phénol rose à pH 7,4 rouge si alcalinisation (infection fongique) jaune si acidification (contamination bactérienne ou mort cellulaire)


POCHETPOCHET 1313

Le PSMLe PSMEnceinteEnceinte

une paillasse inox (parfois une paillasse inox (parfois perforée)perforée)

des grilles d’aspirationdes grilles d’aspiration un écran transparentun écran transparent un ventilateurun ventilateur

créant une aspiration d’air par les créant une aspiration d’air par les grilles d’aspirationgrilles d’aspiration

une zone de filtration d’air par une zone de filtration d’air par deux filtres HEPAdeux filtres HEPA retenant toute particule de retenant toute particule de

diamètre >0,3 µmdiamètre >0,3 µm redistribuant l’air filtréredistribuant l’air filtré

dans l’enceinte de travail 65 % dans l’enceinte de travail 65 % d’air stériled’air stérile

dans l’atmosphère les 35% dans l’atmosphère les 35% restantsrestants

35%

65%

100%


POCHETPOCHET 1414

L’entretienL’entretienSuivi de la culture cellulaireSuivi de la culture cellulaire

Aspect macroscopiqueAspect macroscopique Observation du milieu de culture limpide et rose pouvant Observation du milieu de culture limpide et rose pouvant

devenir trouble et/ou rouge ou jaunedevenir trouble et/ou rouge ou jaune Au microscope inverséAu microscope inversé

sous la platine : les objectifs sous la platine : les objectifs au dessus de la platine : l’éclairage au dessus de la platine : l’éclairage avec contraste de phase : meilleure visualisation des avec contraste de phase : meilleure visualisation des

prolongements cytoplasmiques, organites et vacuolesprolongements cytoplasmiques, organites et vacuoles Vacuolisation et présence de cellules arrondies en Vacuolisation et présence de cellules arrondies en

suspension = souffrance et perte d’adhésionsuspension = souffrance et perte d’adhésion Nécessité de changer le milieu tous les 2 ou 3 joursNécessité de changer le milieu tous les 2 ou 3 jours


POCHETPOCHET 1515

L’entretienL’entretien

Microscope inverséMicroscope inversé

sous la platine : les objectifs sous la platine : les objectifs

au dessus de la platine : au dessus de la platine : l’éclairage l’éclairage

avec contraste de phaseavec contraste de phase


POCHETPOCHET 1616


Installation du Poste (PSM)Installation du Poste (PSM) Nettoyage des mains et avant brasNettoyage des mains et avant bras Désinfection à l’alcool Désinfection à l’alcool

du plan de travaildu plan de travail de tout le matériel nécessairede tout le matériel nécessaire

Pipettes stériles, portoirs, auxiliaire de pipetage ou Pipettes stériles, portoirs, auxiliaire de pipetage ou pipettes automatiques avec filtres et cônes stériles, pipettes automatiques avec filtres et cônes stériles, tubes stériles…tubes stériles…

de tous les récipients contenant les réactifs de tous les récipients contenant les réactifs stérilesstériles

Milieu complémenté (ou réactifs pour le constituer)Milieu complémenté (ou réactifs pour le constituer) TrypsineTrypsine


POCHETPOCHET 1717


Lavage des mains et des avant-bras

Désinfection du matériel

Installation sous PSM après désinfection du

plan


POCHETPOCHET 1818


Élimination du milieu ancien

Rinçage en tampon sans Ca2+

Ajout de trypsine


POCHETPOCHET 1919


Action de la trypsine

surveillée au microscope


POCHETPOCHET 2020


Inaction de l’activité enzymatique de ta trypsine par ajout de milieu complémenté

Prélèvement d’une fraction de la suspension pour dénombrement après une série d’aspirations refoulements prolongée pour détacher les

cellules


POCHETPOCHET 2121

L’entretienL’entretienDénombrement en présence d’un colorant pour estimation de la viabilité cellulaire : Par exemple, Bleu de Funk (ou Trypan) exclus des cellules vivantes et pénétrant dans les cellules mortes

Calcul du volume de suspension cellulaire (cellules viables) à introduire dans le milieu neuf pour une nouvelle incubation de 2 à 3 jours

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