STRATiGlE DE DiPISTAGE PAR PCR DES INFECTIONS

A PAPILLOMAVIRUS HUMAIN (HPV) SUR LES PRiLiVEMENTS CERVICO-VAGINAUX

Dominique Pepina, Johanne Le Bihan-Le Beyec a, Daniele Hugo1 b, Jacques Diebold b, Anne Gompel c,

Jean Chambaz a, Jean-Marc Lacorte a,*

R&urn6

Des arguments epidemiologiques et biologiques placent I’infection a

papillomavirus (HPV) comme un facteur determinant dans I’etiologie

des cancers du col de I’uterus. Une detection precoce du genome

viral par biologie moleculaire chez des femmes presentant un frottis

normal en cytologic pourrait s’inscrire dans une politique de depis-

tage et ameliorer la prevention. Dans cet objectif, nous avons deve-

loppe une strategie pour detecter par PCR I’ADN des virus HPV a

haut risque oncogenique tel que les types 16, 18 et 33 a partir de la

cytobrosse ayant servi a l’etalement des cellules cervico-vaginales.

Nous avons applique ce protocole a 358 femmes de 19 a 41 ans

consultant dans le cadre d’un bilan. La detection par PCR du

genome viral, comparee & I’analyse cytologique, presente une plus

grande sensibilite pour la detection d’infection & HPV. La prevalence

g&&ale d’infection a HPV et la frequence des types 16 et 18 se

rapprochent des resultats publies par d’autres etudes et nous

conduisent e proposer ce protocole en complement de I’examen

cytologique des frottis cervico-vaginaux,

HPV - PCR - frottis cervico-vaginal.

Summary

Epidemiological and biological arguments have established that

infection by a subset of human papillomaviruses (HPV) is an

essential etiologic agent for cervical carcinoma. It has been sug-

gested that ear/y detection of viral DNA by molecular biology in

cytologically normal smears could improve screening of cervical

neoplasia. With this aim, we have designed a strategy to detect by

PCR high-oncogenic-risk HPV (type 16, 18 and 33) on cells

remaining from the cytobrush after the smear have been per-

formed. 358 women were included in this study, aged 19 - 4 1

and consulting for a check-up. We have found that detection by

PCR was more sensitive than cytological analysis. Prevalence of

a Laboratoire de biochimie medicale b Laboratoire d’anatomie et cytologic pathologiques c Service de gynbcologie HBtel-Dieu 1, place du Parvis Notre-Dame 75161 Paris cedex 04

l Correspondance.

article recu le 26 mai, accept& le 19 octobre 1999.

0 Elsevier. Paris.

Revue Franqaise des Laboratoires, dkembre 1999, N” 318

HPV (all types) and prevalence of high-risk HPV types were simi-

lar to previous studies and led us fo recommend application of our

protocol in addition to cervical cytologic smear.

HPV - PCR - cervical smear.

1. Introduction

L

e cancer du col de I’uterus est, apres le cancer du sein, la cause

la plus frequente des cancers chez la femme. Des arguments epi-

demiologiques et biologiques montrent qu’il existe une relation etroite

entre I’infection par certains types de papillomavirus et les cancers ano-

genitaux. Ainsi un editorial recent reprenant les resultats de plusieurs

etudes internationales soulignait que plus de 95 O/o des cancers cer-

vicaux presentaient une infection par HPV [19].

Les papillomavirus sont des virus a ADN d’environ 8000pb ayant un

tropisme cutaneo-muqueux. Ils infectent de nombreuses especes ani-

males avec une specificite d’espece. Aujourd’hui, plus de 80 types de

papillomavirus infectent I’homme, mais seulement une vingtaine est

retrouvee dans la sphere ano-genitale. Parmi ces derniers, on distingue

ceux a fort risque oncogenique comme les types 16,18,31,33,45,46

presents dans les lesions intra-epitheliale de haut grade et dans les can-

cers invasifs de ceux a faible risque oncogenique comme les types 6,

11,42,43,44 que l’on retrouve dans les condylomes par exemple [14].

Le genome viral est schematiquement organise en trois regions : une

region qui controle la replication virale et la transcription (upstream

regulatory region), une region traduite precocement (early region) et

codant pour les proteines El, E2, E4, E6 et E7, necessaires s la repli-

cation virale et enfin une region traduite tardivement (late region) codant

pour les proteines de capside, Ll et L2. Les papillomavirus infectent

les cellules en division et I’infection peut rester latente ne conduisant

a aucune modification morphologique. Puis le virus peut rentrer dans

une phase replicative ou apparaissent les criteres cytologiques d’in-

fection HPV avec la presence de ko’rlocytes. Enfin, en fonction de fac-

teurs non encore clairement elucides, I’ADN viral peut s’integrer dans

le genome de I’hote alors qu’il etait present jusque-la sous forme epi-

somale. Cette integration induit une deregulation des proteines virales

E6 et E7 qui vont interferer avec le cycle cellulaire et etre responsables

de I’engagement dans des processus de proliferation [171.

Le diagnostic d’infection par HPV ne peut ni se faire par culture car

le virus ne se multiplie pas, ni par serologie car les trousses actuel-

lement disponibles sont de sensibilite et de specificite insuffisante. En

consequence, plusieurs techniques ont ete developpees pour diag-

nostiquer la presence du genome d’HPV. On peut distinguer d’une part

celles qui conservent les structures cellulaires comme I’hybridation ou

la PCR in situ [201 et d’autre part celles qui isolent I’ADN avec ou sans

amplification [5, 91.

Le lien entre infection par HPV et cancer du col, et la possibilite de

detecter par des techniques de biologie moleculaire la presence d’une

23

Lesions prg-can&reuses du col

infection a HPV a haut risque oncogenique, conduit a suggerer que

la recherche de I’ADN viral associee a I’analyse cytologique pourrait

ameliorer la sensibilite des programmes de prevention en permettant

une meilleure surveillance [14]. C’est pourquoi nous avons developpe

un test permettant ti partir de la cytobrosse ayant serv au frottis, de

rechercher par PCR la presence d’HPV puis dans un deuxieme temps

d’identifier les types a haut risque oncogenique les plus frequents,

c’est-a-dire 16, 18 et 33. Nous avons mesure la sensibilite de ce pro-

tocole et suivi sur 4 annees des femmes ayant eu, au tours d’une

consultation, un frottis cervico-vaginal systematique dans le service de

gynecologie de I’HBtel-Dieu de Paris.

2. Matckiels et mkthodes

2.1. Population

Cetude Porte sur une population constituee de 358 femmes de 19 a

41 ans (age moyen 29,8 ans) consultant dans le service de gyneco-

logie de I’hbpital de I’HBtel-Dieu entre 1995 et 1998. Ces patientes,

sans antecedent de pathologie cervicale, ont eu au tours de la consul-

tation un frottis cervico-vaginal de dopistage. Au total, 454 preleve-

ments cervico-vaginaux ont ete examines.

2.2. Examen cytologique standard

Le frottis endocervical est realise a I’aide d’une cytobrosse qui per-

met de ramener un nombre satisfaisant de cellules du canal cervical.

Les cellules sont etalees sur une ou deux lames, fixees puis etudiees

apres coloration de Papanicolaou. Le diagnostic d’une infection virale

a HPV a ete porte sur la presence de kdlocytes (figures 4 et 5). Ont

ete retenus comme tres evocateurs d’une infection a HPV les examens

presentant les caracteres suivants : augmentation de la taille du noyau,

plurinucleation, densification chromatinienne et angulation nucleaire,

para et dyskeratose (figures 6, 7, 8 et 9 ).

Cytobrosse

1 L Cytologie

Extraction d’ADN

Ddtection HPV amorces consensus

lL Positif .

Nkgatif

PCR I PCR II

Ghotypage 16,18,6/11,33 Amorces spkifiques

Gel B 2 % en bromure d’&hidium. 10 pi de produii dkmplificatmn ant 6th depos& ; M : marqueur de 100 pb, 2 : cellules C33A, 3 : cellules CaSKi, 4 : Bchantillon.

24 Revue Frarqaise des Laboratoires, dkembre 1999, N” 31 S

A

100 -

80 -

#

% 2 60-

5 2 z a 40 -

20 -

0 .

B

HP” x 16 18 16 et 18 6/l, 33 Types HPV

4 : fre+quence de d&ection par PCR avec /es amorces consensus. t : powbf, : n@ga-

‘If. B : frkquence de d&xtion par PCR avec /es amorces spkifiques : HPVX: non ‘ypables 16, 18, 33, 6/l 1.

2.3. Extraction d’ADN

Apres Btalement sur lame, la cytobrosse est conservee dans un tam-

pon PBS. Les cellules cervico-vaginales sont recuperees apres agi-

tation et centrifugation puis resuspendues dans 400 1.11 de PBS. La

suspension est chauffee & 100°C pendant 15 min puis refroidie dans

la glace. Le lysat est centrifuge 15 min a 12 000 trlmin. et le surna-

geant recupBr& CADN est precipite avec 1 ml d’ethanol froid, lave,

s&he et resuspendu dans 100 pl d’eau.

2.4. Dktection par PCR de I’ADN viral d’HPV

avec des amorces consensus

La detection de I’ADN viral est real&e par deux etapes de PCR. La

PCR primaire (PCR I) est effect&e a partir de 500 ng d’ADN dans

un tampon contenant 10 mM Tris-HCI, pH 9, 2,5 mM MgCI,, 50 mM

KCI, 0,10/o Triton Xl 00, 0,Ol O/o gelatine, 200 uM dNTP, 1 uM de cha-

tune des amorces HPVl et HPV2 et 0,25U de SUPERTAQ (ATGC

Biotechnologie) dans un volume final de 25 f.11. Apres une &ape de

denaturation de 5 min a 94’C, 35 cycles sont realises (94°C 1 min,

L&ions prk-canckreuses du col

1 2 3 4 Groupes

Groupe 1 : reste &g&if, grwpe 2 : rate posHif, groupe 3 : se sent n6gabv&, groupe 4 : se sent positi&.

3. Rbultats 45% 2 min, 72’C 1 min 30 s) dans un appareil Perkin Elmer Cetus

480. La PCR secondaire (PCR II) est realisee a partir de 2 ul dune

dilution au 1/200e du produit d’amplification de la PCR I dans les

memes conditions de tampon que la PCR I mais avec les amorces

HPV3 et HPV4. Les conditions d’amplification sont les suivantes : 5

min de denaturation a 95°C puis 25 cycles realises (94°C 1 min, 45°C

2 min, 72°C 1 min 30 s). Chaque serie d’amplification comporte des

controles negatifs (lignee C33A) et positifs (lignaes CaSKi ou HeLa).

Camplification est verifiee sur un gel d’agarose a 2 % en presence de

bromure d’ethidium. La qualite de I’extraction est verifiee en amplifiant

le gene controle bglobine 1161.

3.1, Stratbgie et sensibiliti, des PCR

2.5. Ghotypage des HPV par PCR avec des d’amorces spkifiques

Les types 16, 18 et 6/l 1 sont recherches par ’ nested PCR ” avec

les amorces HPV16-Al et HPV16-A2, HPVl8-Al et HPV18-A2, HPV

6/l 1 -Al et HPV 6/l 1 -A2 respectivement en PCR I puis HPVl6-A3

etHPV16-A4,HPVl8-A3etHPVl8-A2,HPV6/11-A3etHPV6/11-

A2 pour la PCR II. La PCR I est realisee a partir de 500 ng d’ADN dans

un tampon contenant 10 mM Tris-HCI, 1,5 mM MgCI,, 50 mM KCI,

200uM dNTP, 250 uM de chacune des amorces 1,25U de Tao DNA

Polymerase (Amersham Pharmacia Biotech) dans un volume final de

25 pl. Apres une &ape de denaturation de 5 min a 94”C, 35 cycles

sont realises (94°C 1 min, 55°C 1 min, 72°C 1 min 30 s) dans un appa-

reil Perkin Elmer Cetus 480. La PCR II est realisee a partir de 2 ul d’une

dilution au 200e du produit d’amplification de la PCR I dans les mkmes

conditions de tampon que la PCR I. Les conditions d’amplification sont

les suivantes : 5 min de denaturation a 95% puis 20 cycles sont rea-

Ii&s (94% 1 min 30 s, 55°C 1 min 30 s, 72°C 2 min). Dans chaque

serie d’amplification sont places des controles negatifs (lignee C33A)

et positifs : lignees CaSKi pour HPV16, HeLa pour HPV18, ADN

extrait d’un condylome pour HPV 6/l 1 (Biosoft Argene).

Afin de limiter le nombre de reactions PCR, nous avons choisi de

rechercher les HPV a haut risque oncogenique en deux &apes.

D’abord, avec un test de criblage utilisant des amorces consensus

capables d’amplifier de nombreux types d’HPV, puis en utilisant des

amorces specifiques pour identifier les types 16, 18 et 33. Le proto-

cole d’analyse est resume sur la figure 7. La detection des virus HPV

est realisee grace a deux PCR successives utilisant des amorces

consensus (tableau /) sit&es dans la region Ll , tres conservee entre

les differents types. II a ete montre que ces amorces permettaient la

detection des types 6, 11, 16, 18,31,33 et 35 1211. Par sequencage

des produits d’amplification obtenus a partir des prelevements de

patientes infect&es, nous avons montre que ces amorces consensus

detectaient egalement les types 42,44,55 et 61. La sensibilite de ce

test a eta evaluee en utilisant les lignees CaSKi et HeLa qui contien-

nent respectivement environ 5.1 O* copies d’HPV16 par cellule et 10

a 50 copies d’HPV18 par cellule [6]. Par dilutions successives de

I’ADN extrait de ces cellules, nous avons determine que la limite de

detection de notre protocole est de 10 copies pour HPV 16 et de 2

a 10 copies pour HPV18. Lorsque la presence d’HPV est detectee,

le genotypage des types 16, 18, 33 et 6/l 1 est realise avec des

amorces specifiques (tableau /). Les fragments amplifies se situent

dans la region E6 pour les types 16, 18, 6/l 1, et El pour le type 33.

La sensibilite de ces tests, determinee comme ci-dessus, est de 1

copie pour HPV16 et de 2 a 10 copies pour HPV 18. Les controles

positifs d’amplification sont les cellules CaSKi pour le type 16, HeLa

pour le type 18, un condylome genotype, fourni par la societe Biosoft

Argene, pour les types 6/l 1 et une tumeur pour le type 33.

3.2. Analyse cytologique

HPV 33 est recherche par une seule PCR a partir de 500 ng d’ADN 454 prelevements cervico-vaginaux ont Bte examinas, provenant de 358

dans un tampon contenant 10 mM Tris-HCI, 2,5 mM MgCI,, 50 mM KCI, femmes Bgees de 19 a 41 ans, consultant entre 1995 et 1998 a I’Hotel-

500 uM dNTP, 150 uM de chacune des amorces HPV 33 et HPV 33C, Dieu dans le service de gynecologie pour un bilan systamatique. Lors

1,25U de Tao DNA Polymerase (Amersham Pharmacia Biotech) dans de leur consultation, ces patientes ont eu un frottis cervical standard.

un volume final de 25 ul. La reaction d’amplification se realise dans les Selon les criteres morphologiques retenus, au total, environ 3 s/o des frot-

memes conditions que la PCR I pour les types 16, 18 et 6/l 1. tis cervicaux standards sont en faveur d’une infection virale a HPV.

Revue Fran&e des Laboratoires, dhxmbre 1999, N” 318 25

#an PC03

23&ewma w+ 33 w- ACACAACTGTGTTCACTAGC [t 61

PC04 HPVI

HPV2 HPV3

HPV4 HPV 16-Al

HPV 16-A2

H PV 16-A3

HPV 16”A4

HPV 18-Al

HPV 18-A2 HPV 18-A3

HPV 6/l 1 -Al

HPV 6/l 1 -A2

HPV6/11A3

HPV 33

HPV 33C

CAACl-fCATCCACGl-TCACC

CAGGATGGfT,G,C)GA(T,C)ATGGGT

CAT(A,G)ll(A,T,G)GTACTGCG(A,T)G TG(T,C)AAATATCC(A,T)GATlAT(T,A)T

GTACTG(C,G)G(T,A)GTGGTATC AAGGGCGTAACCGAAATCGGT

CACATACAGCATATGGATTCC

GAAAGT-TACCACAGTTATGC

CACGTCGCAGTAACTGTTGC

CACTTCACTGCAAGACATAGA

GAT-TCAACGGTTTCTGGCAC ATTCAGACTCTGTGTATGGAG

GCTCAGAAGATGAGGTGGAC T-fAAACAATGCCTGTGCllCC

TGACCTGTTGCTGTGGATGTG AGTCAAAATGGCGACACAAA

ACTAATI-TCCTGCAACGTAA

1161 El1 [211 f211

[211

131

[31

[31

[31

[31

131

[31

[31

[31

[31 [I81

[t 81

Ldsions prh-cancereuses du co/

26 Revue Fran&e des Laboratolres. dkembre 1999, No 3113

3.3. Dbtection et gbnotypage par PCR

Une fois l’etalement fait, la cytobrosse est recuperee et I’ADN des cel-

lules restantes est extrait et utilise pour la detection du virus HPV par

PCR. Comme le montre la figure 2A, 59 prelevements sur 454, soit

13 %, se sont rev&s positifs lors de la detection du genome d’HPV

avec les amorces consensus. Apres typage des prelevements posi-

tifs a I’aide d’amorces specifiques, 17 (28,8 O/o) sont de type 16, 4

(6,80/o) de type 18, 2 (3,4 O/o) presentent une co-Infection a 16 et 18,

et 2 (3,4 O/o) sont de type HPV 6/l 1. Aucun n’est de type 33. Au total

34 (57,6 O/o) prelevements positifs n’ont pu etre types a I’aide des

amorces specifiques.

3.4. Suivi de I’infection par PCR

78 femmes ont ete revues 1 a 3 fois au tours des 4 an&es (fjgure

3). Parmi elles, 86 O/o ont garde leur statut initial concernant la presence

d’HPV, c’est-a-dire que 58 femmes (74,3 O/o) sont restees negatives

et 9 (1 1,5 O/o) positives. 14,3 o/o ont change de statut au tours de la

surveillance : 6 femmes (7,9 O/o) sont devenues negatives et 5 (6,4 O/o)

se sont positivees. En fait, si l’on considere les 15 femmes dont les

prelevements etaient positifs lors de la premiere consultation, 40 %

sont devenues negatives au tours de l’etude.

4. Discussion

Canalyse morphologique des frottis cervico-vaginaux de femmes asymp-

tomatiques a permis d’estimer a 3 O/o le nombre de prelevements pre-

sentant des lesions evocatrices dune infectron a HPV alors que la

recherche par PCR de I’ADN viral revele une prevalence de 13 O/o. Cette

difference, deja d&rite precedemment [71, entre les deux examens peut

s’expliquer par deux types d’arguments. Dune part, les deux examens n’ob-

servent pas les memes &apes de I’infection par le virus HPV. Canalyse

cytologique met en evidence les effets cytopathogenes provoques par

I’infection virale, alors que I’analyse par biologie moleculaire met en evi-

dence la presence du genome viral a un stade qui peut p&ceder les

lesions cytologiques. D’autre part, si I’on considere que seulement 20%

des cellules prelevees avec la cytobrosse sont etales sur lame, 80% du

prelevement demeurent, en theorie, disponibles pour I’extraction d’ADN.

La confrontation des resultats entre les deux examens et le suivi de ces

patientes devra permettre de preciser la correlation entre ces deux tech-

niques et evaluer le caractere predictif de I’analyse par PCR.

La prevalence de 13 % de frottis cervico-vaginaux dans lesquels sont

detect& la presence du genome viral d’HPV, dans une population

asymptomatique, est du mbme ordre que les resultats publies dans

d’autres etudes et utilisant des amorces differentes mais toujours

sit&es dans la region Ll 11, 1 1, 131. Des variations de la prevalence

de I’infection a HPV dans diverses populations sont liees a un certain

nombre de facteurs, comme I’age, le nombre de partenaires ou la

contraception utilisee [lo, 12, 131. En particulier, la frequence de detec-

tion des HPV est plus grande chez les femmes de moins de 30 ans

qu’apres, ce qui suggere une elimination spontanee du virus 1131. Cette

donnee est a rapprocher de nos resultats, ou dans la population etu-

dice, 40% des femmes positives sont devenues negatives dans un

intervalle de 3 ans. A I’inverse, les femmes presentant une positivite

a plusieurs examens successifs doivent faire I’objet d’une surveillance

attentive car II a ete etabli que la persistance d’une infection a HPV,

surtout de type oncogenique, meme avec des frottis normaux, precede

la survenue d’un carcinome cervical 14, 81.

Le choix des types 16, 18,33 et 6/l 1, recherches par PCR avec les

amorces specifiques, n’a pas permis de typer 57,6 % des HPV. Les

types 16, 18 et 33 representent au total en Europe pres de 80 O/odes

HPV retrouves dans les cancers cervicaux [21. On peut done penser

que les HPV non types appartiennent a des types a faible potentiel

oncogene. Le sequencage systematique, actuellement en tours dans

notre laboratoire, de ces HPV non types, confirme cette hypothese a

I’exception du type 31, in risque oncogenique eleve, dont la

recherche devra a l’avenir etre incluse dans le protocole de typage.

Un certain nombre de publications [13, 151 suggerent la generalisa-

tion du depistage du genome viral, en association a l’examen cytolo-

gique pour ameliorer la prevention des cancers du col. Cependant ces

recommandations se heurtent, aujourd’hui, a la difficult& de mettre en

route ces techniques de PCR dans les laboratotres de routine et au

cotit de I’analyse qui en limite I’application. Notre strategie, utilisant

les cellules demeurees sur la cytobrosse apres l’etalement sur lame,

permet d’alleger I’etape de prelevement. D’autre part I’extraction d’ADN

par lyse thermique permet deja de reduire les couts mais des gains

de productivite, indispensables a un test de depistage, devront etre

obtenus. Ceci sera rendu possible lorsque des automates de prepa-

ration d’ADN et d’amplification seront disponibles a des couts mode-

res et que des trousses diagnostiques standardiseront les resultats.

Cependant, on peut proposer d’ores et deja, au vu des arguments epi-

demiologiques, une detection et un genotypage d’infection a HPV par

PCR sur les frottis cervico-vaginaux des femmes a risques.

Kfbrences [I I Astori G., Anese A., Pipan C., de V. E., Botta G. A., Characterization of a putative new HPV genomic sequence from a cervical lesion using Ll consensus primers and restriction fragment length polymorphism, virus Res. 50 (1) (1997) 57. 63.

[!I Bosch F X., Manos M. M., Munoz N., Sherman M., Jansen A. M., Peto J., Schiffman M. H., Moreno V., Kurman R., Shah K. V., Prevalence of human papillomavirus in cervical cancer: a worldwide perspective. International biological study on cer- vical cancer (IBSCC) Study Group, J. Natl. Cancer Inst. 87 (11) (1995) 796-802.

[31 Charlotte F., Olivier J. L., Chypre C., Beuret T., Sadoul G., Chatelet F., Luboinski J., Marchand J.,

Bereziat G., Detection and typing of human papil- lomaviruses in cervical smears by an original appli- cation of the polymerase chain reaction, Mol. Cell. Probes 5 (6) (I 991) 445-450.

141 Chua K. L., Hjerpe A., Persistence of human papillomavirus (HPV) infections preceding cervi- cal carcinoma, Cancer 77 (1) (1996) 121-l 27.

151 Clavel C., Masure M., Putaud I., Thomas K., Bory J. P., Gabriel R., Quereux C., Birembaut P., Hybrid capture II, a new sensitive test for human papillomavirus detection. Comparison with hybrid capture I and PCR results in cervical lesions, J. Clin. Pathol. 51 (10) (1998) 737-740.

I61 Contomi M., Leoncini P., Typing of human papillomavirus DNAs by restriction endonu- clease mapping of the PCR products, J. Viral. Methods 41 (1) (1993) 29-36.

[71 Gjoen K., Sauer T., Olsen A. O., Orstavik I., Correlation between polymerase chain reaction and cervical cytology for detection of human papil- lomavirus infection in women with and without dysplasia, APMIS 105 (I) (1997) 71-75.

[81 Hildesheim A., Schiffman M. H., Gravitt P. E., Glass A. G., Greer C. E., Zhang T., Scott D. R., Rush 8. B., Lawler f?, Sherman M. E., Persistence of type-specific human papillomavirus infection among cytologically normal women, J. Infect. Dis. 169 (2) (1994) 235-240.

[91 Jacobs M. V., Snijders P J., van, den, Brule, Aj, Helmerhorst T. J., Meijer C. J., Walboomers J. M., A general primer GPS+/GPG(+)-mediated PCR- enzyme immunoassay method for rapid detection of 14 high-risk and 6 low-risk human papilloma- virus genotypes in cervical scrapings, J. Clin. Microbial. 35 (3) (1997) 791-795.

Revue Fran&e des Laboratoires, dkembre 1999, N” 318 27

L&ions pr&can&reuses du col

[lo] Koutsky L., Epidemiology of genital human papillomavirus infection, Am .J. Med. 102 (5A) (1997) 3-8.

[l 11 Kurz J., Mitra K., Adam R., Miao X., MacKay J. S., Isa N. N., Coombs D. H., Krause M. O., PCR detection and typing of genital papillomavirus in a New Brunswick population, Int. J. Cancer 55 (4) (1993) 604-608.

[121 Ley C., Bauer H. M., Reingold A., Schiffman M. H., Chambers J. C., Tashiro C. J., Manos M. M., Determinants of genital human papillomavirus infection in young women, J. Natl. Cancer Inst. 83 (14) (1991) 997-1003.

[13] Melkert P. W., Hopman E., van, den, Brule, Aj, Risse E. K., van D. P, Bleker 0. P., Helmerhorst T., Schipper M. E., Meijer C. J., Walboomers J. M., Prevalence of HPV in cytomorphologically normal cervical smears, as determined by the polymerase chain reaction, is age-dependent, Int. J. Cancer 53 (6) (1993) 919-923.

1141 Richart R. M., Masood S., Syrjanen K. J., Vassilakos P., Kaufman R. f-l., Meisels A., Olszewski W. T., Sakamoto A., Stoler M. H., Vooijs G. P., Wilbur D. C., Human papillomavirus. International academy of cytology task force sum- mary, Diagnostic cytology towards the 21st Century, An international expert conference and tutorial, Acta Cytol. 42 (1) (1998) 50-58.

[I 51 Rozendaal L., Walboomers J. M., van, der, Linden, Jc, Voorhorst F. J., Kenemans P., Helmerhorst T. J., van B. M., Meijer C. J., PCR- based high-risk HPV test in cervical cancer scree- ning gives objective risk assessment of women with cytomorphologically normal cervical smears, Int. J. Cancer 68 (6) (1996) 766-769.

[161 Saiki R. K., Scharf S., Faloona F., Mullis K. B., Horn G. T., Erlich H. A., Arnheim N., Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia, Science 230 (4732) (1985) 1350. 1354.

[171 Southern S. A., Herrington C. S., Molecular events in uterine cervical cancer, Sex. Transm. Infect. 74 (2) (1998) 101-l 09.

[18] Vincent S. A., de, la, Rochefordiere, A, Salmon R., Validire P., Zafrani B., Sastre G. X., Frequent association of human papillomavirus 16 and 18 DNA with anal squamous cell and basa- loid carcinoma, Mod. Pathol. 9 (6) (1996) 614- 620.

[19] Walboomers J. M., Meijer C. J., Do HPV- negative cervical carcinomas exist?, J. Pathol.181 (3) (1997) 253-254.

[201 Wiedorn K. H., Kuhl H., Galle J., Caselitz J., Vollmer E., Comparison of in-situ hybridization, direct and indirect in-situ PCR as well as tyramide signal amplification for the detection of HPV, Histochem. Cell. Biol. 111 (2) (1999) 89-95.

[211 Williamson A. L., Rybicki E. P., Detection of genital human papillomaviruses by polymerase chain reaction amplification with degenerate nes- ted primers, J. Med.Virol.33 (3) (1991) 165-l 71.

28 Revue Franpise des Laboratoires, dkcembre 1999, N” 318