sphingomyélines tissulaires chez le poussin : analyse et métabolisme in vivo

BIOCHIMIE, 1974, 56, 131-143.

Sphingomydlines tissulaires chez le poussin • Analyse et mdtabolisme in rico.

Georges SOULA, Cather ine CHAMPANET et Anne FOUREADE.

Laboratoire de Biochimie de l'Unit~ d 'Enseignement et de Recherche des Sciences Pharmaceutiques, 31 alldes J. Guesde. 31400 Toulouse.

(20-8-1973).

Summary. - - After isolation by silicie acid column chromatography and by thin-layer chromatography on silicagel two kinds of sphingomyelins were separated from chick lung, sp]een, liver, kidney, heart and brain.

The two fractions were analysed for their fatty acid content which demonstrate a high degree of saturation ; one of them is essentially constituted of long chain fatty acids : lignoeeric and nervonic acids and the other of palmitic and stearic acids.

While chick brain sphingomyelin contained a high level of stearic acid, spleen and brain sphingomyelin show very little proportions of behenic acid. The other chick tissues studied containing higher levels of this acid, behenic acid is essentally an extraneural sphingomyelin compound.

Regarding their different fatty acid composition we studied after injection of 32P-orthophosphate the turnover of the isotope in the two sphingomyelin fractions of the different tissues of the chicks.

While brain sphingomyelin turns over very slowly the two sphingomyelin fractions in other tissues exhibit marked differences in the extent to which they are labelled. This suggests the possibility of an exchange reaction betwen sphingomyelin molecules, or, more likely, between their phosphorylcholine moiety.

INTRODUCTION.

Plusieurs t ravaux ont montr6 la possibil i t6 de sdparer par ch romatograph ie sur eouebe mince deux groupes de sphingomydl ines dans le plasma sanguin [,1-6], les globules rouges r~7, 8] et d ivers tissus chez le ra t [9]. Ces deux groupes migren t de facon diffdrente 6rant donnd, leur composi t ion diffdrente en acides gras [!10].

Leurs p ropor t ions var ien t notablement selon les tissus ; Sato et Fuj i i [111 ont montr6 que des diffdrenees existent dans les globules ronges de mammifdres entre l 'homme, le b~euf, le pore et le mouton.

Dans un t ravai l antdr ieur [~12] nous avons nous-mdmes iso16 ces deux groupes du plasma et des globules rouges chez l ' homme et indiqu6 leurs diffdrences de composi t ion en acides gras. Aprbs sdparat ion par ch romatograph ie sur eolonne d 'ae ide s i l ic ique puts une conche mince des sphingomy61ines globulaires de poulet [,1~]~ nous avons montr6 qu 'en dehors des diff6rences de composi t ion en acides gras, les deux groupes prd- sentent des activitds m6tabol iques assez dissem- blables que nous envisagions en fonct ion de lenrs in te r re la t ions avec les sphingomy61ines plasma- tiques.

Au cours de ce travail , aprbs in ject ion de 32P-orthophosphate au poulet , nous envisageons en fonct ion du temps l 'dtude de l ' i nco rpo ra l ion du radiodldment dans les deux groupes de sphin- gomy61ines de quelques tissus : cerveau, poumon, foie, rein, rate et coeur. Les p ropor t ions des deux groupes et leur composi t ion en aeides gras nous permet ten t d 'envisager leur eomparaison.

TECHNIQUES.

Des poussins de quinze jours (300 h 400 gram- mes) de race wh i t e Leghorn reco iven t pa r vote in t rapdr i tondale 0,5 mCi d 'une solution i so lonique de Na2H 32PO 4. Quatre an imaux sont utilisds pour ehaque temps de l ' expdr imenta t ion . Ceux-ci sont sacrifids au ch lo ro fo rme et aussitdt ddpecds. Les organes dbs le prdl6vement sont lards au sdrum physiologique, sdchds et pesds.

Ils sont ensuite ddeoupds en morceaux et broyds dans un appare i l de type Virtis 45 (Gdndlab) dans un peu d ' i sopropanol . Les l ip ides sont extrai ts par un mdlange d ' i sopropanol et de ch lo ro fo rme puts purifids selon Rose et Oklander [14].

L e s : p h o s p h o l i p i d e s sont sdpards par chromatographie sur eolonne d 'ac ide s i l ic ique et d 'hyflo-

132 G. Soula, C. Champane l et A. Fourcade.

supercel (2 p./1 p.) dans des condi t ions dSj/~ d6- crites [!1i33 et 61u6s par un m61ange de chloroforme et de m6thanol (1:1, v /v) .

Le phosphore l ip id ique est d6termin6 sur les extraits totaux ou apr~s r6cup6rat ion du silicagel sur les chromatogrammes par la mOhode de Chen et coll. [15].

Les chromatographies sur touche mince sont effeetu6es sur silicagel G Merck (6paisseur : 0,25 ram) :

- - en double dimension pour l '6tude des sphin- gomy61ines totales dons les solvants :

ch loroforme-m6thanol -ammoniaque h 28 p. cent :

(65:35:5, v /v) premibre d imens ion ,

chloroforme-m6thanol-eau : (65:25:4, v/v) deuxibme dimension.

- - e n monodimension, pour l 'Oude des deux groupes de sphingomy61ines, dons les sol-

r an t s :

chloroforme-m6thanol-acide ae6tique-eau : (50:30:8:4, v/v) et (60:30:1:6, v/v)

ou ehloroforme-m6thanol-eau : (100:40:6, v /v) ,

en deux migra t ions suecessives, selon [11].

Les activit6s sp6cifiques sont d6termin6es dans un compteur h sc int i l la t ion Packard Tr i ca rb mod ble 3320 en plagant le silicagel dans 10 ml de m61ange sc in t i l lant pr6par6 selon El6].

Pour l ' analyse des acides gras, les sphingo- my61ines sont r6v616es sur les chromatogrammes par pulv6r isa t ion d 'une solution de 2'-7' dichloro- fluoresc6ine h 0,2 p. cent dans l '6thanol a 50 ° et examen en lumibre ultraviolette.

Le silicagel cor respondan t aux sphingomy61ines totales et aux deux fractions, r6eup6r6 sur les chromatogrammes est trait6 par H2SO 4 h 10 p. cent dans le m6thanol au ba in-mar ie h 70°C h reflux pendan t 10 heures.

Aprbs t r ansmOhyla t ion , les esters d 'acides gras sont extraits par agitation h trois reprises

avec de l '6ther de p6trole, purifi6s par chromatographie sur couche mince de silicagel G Merck dans le benzbne, 61u6s par de l 'hexane et chroma- tographi6s en phase gazeuse dans un apparei l In te rsmat type IGC 12 DFL, sur colonne inox h 10 p. cent de R6oplex 400 sur chromosorb WA~V 80/I00, en p rogramlna t ion de temp6rature entre 170 et 195 °, d6bit d'azote : 50 ml / mi n .

Les esters m6thyliques d 'acides gras sont iden- tifi6s en ut i l i sant dans les m6ines condi t ions de chromatographie des m~langes t6moins Sigma.

Pour l ' ident i f icat ion de cer ta ins compos~s des 6talons in ternes d'esters m6thyliques Merck ont 6t6 utilis6s en surcharge dans nos 6chanti l lons.

Les pourcentages sont d6termin~s par planim~- trie des pics.

RESULTATS ET DISCUSSION.

1. Composition en sphingomydlines.

Par chromatographie b id imens ionne l le sur cou- the mince des phosphol ip ides des divers tissus de poulet (fig. 1, 2 et 3) les sphingomy61ines totales ont 6t6 isol6es et leurs propor t ions ont pu Ore d6termin6es par rappor t aux ]ipides totaux et aux phosphol ip ides (tableau I).

Les phosphol ip ides repr6sentent de 51 h 58 p. cent des l ipides t o t a ux ; le coeur (62 p. cent) et la rate (71 p. cent) mont ren t des valeurs plus 6lev6es.

L e s propor t ions des sphingomy6!ines par rapport aux phosphol ip ides totaux (tableau II) sont 6galement assez diff6rentes, les tissus les plus r iches sont par ordre le rein, la rate el le poumon.

La s6parat ion des deux groupes de sphingo- my61ines est effectu~e par chromatographie mono- d imens ionnel le en solvant soit acide, soit neutre selon [!11].

Leurs RF en solvant acide sont de 0,40 pour le groupe I e t de 0,35 pour l e groupe I I ; les deux phosphol ip ides r6agissent avec le r6actif de Draggendorff.

TABLEAU I.

Teneur en lipides totaux et en phospholipides des divers organes de poulet (en m9/100 9 de tissu [rais).

Phospholipides = P lipidique X 25.

_ _ _ _ P ° u m ° n Foie ~ C c e u r Rate

Lipides totaux . . . . . . . . . . . . . . 1 850 4 380 ] 3 360 ] 1 765

Phospho l ip ides . . . . . . . . . . . . . . I 1 265

Rein

3 060

1 800

Cerveau

5 960

3 260

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.

A n a l y s e el m d l a b o l i s m e des s p h i n g o m y d l i n e s t i ssu la ires de pous s in .

TABLEAU II.

Pourcentages des sphingomydlines des divers organes de poulet par rapport aux phosphoIipides totaux.

133

Poumon Foie C~ur Rate Rein Cerveau

10,5 + 0,5 4,2 ~+ 0,8 5,9 -I- 0,6 12 -~- 0,8 14,2 -i-- 0,6 6 --4- 0,5

Les p r o p o r t i o n s des d e u x t r o u p e s v a r i e n t d ' u n t i s su h u n au t r e ( t ab leau III) avec p r e d o m i n a n c e du g r o u p e I p o u r le to te , le cceur et le r e i n pr6- d o m i n a n c e du g r o u p e II p o u r le p o u m o n , la r a te et le ce rveau .

D a n s des c o n d i t i o n s d ' i s o l e m e n t et de s 6 p a ra - t i on v o i s i n e s de cel les de Mi n a r i et coll . [1.7] e t b i e n qu ' i l s ' ag i s se d ' e s p b c e s d i f f6 r en l e s , nos r6sul- ta ts s o n t assez p r o c h e s de c e n x de ces au t eu r s , s au l p o u r ce qu i c o n c e r n e le c e rv eau .

TABLEAU III.

Pourcentages des deux groupes de sphingomy~lines des divers organes tie poulet par rapport aux sphingomydlines totales.

Poumon Foie C~eur

r r Groupe ! . . . . . . . . . . . . . ! 43 65 55

Gronpe I I . . ~ ~ _.~... 5 ~ - - 35 45

Rate ! Rein I Cerveau

43 ~ 11

57 89

: : ' : : : i

A B

Fl6. 1. - - Autoradiogrammes apr~s chromatographie bidimensionnelle sur couche mince tte silicagel G Merck (~paisseur : 0,25 ram) des phospholipides du poumon (A) el du foie (B) de poulet ~8 heures apr~s l'injeelion de 3eP-orthophosphate.

D6p6t de phosphore : 50 ~g au centre et 30 !tg sur chaque piste lat6rale. Les condit ions de chromatographic sont d6crites au chapitre des ¢ techniques >>. Dur6e d 'exposi t ion des films : 4 jours.

Lisle des abrdviations : PC = Phosphat idylehol ines ; PE = Phosphat idv l6 thanolamines ; PS = Phosphat idyls6r ines ; PI = Phos-

phat idyl inosi to ls ; SP = Sphingomy61ines ; PG =~ Phosphatidylglyc~rol ; LPC = Lysophosphat idylchol ines ; DPG = Diphosphatidylglyc~rol ; AP : Aeides phosphat idiques .

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.

1 3 4 G. S o u l a , C. C h a m p a n e t e l A . F o u r c a d e .

A B

FxG. 2. - - Autoradiogrammes aprOs chromatographie b id imens ionnel le sur couche mince de silicagel G Merci: (dpaisseur : 0,25 ram) des phosphol ip ides spldniques (A) et cardiaques (B) de poule l /~8 heures apr~s l ' injec t ion de s2p-orlhophosphate.

DdpSt de p h o s p h o r e : 50 ~tg au centre eL 30 ug su r chaque piste lat~rale. Les condi t ions de c h r o m a t o g r a p h i e sont ddcrites all chap i t re des << t echn iques >>. Durde d ' expos i t i on des fi lms : 4 jours .

A B

FIG. 3. --- Auloradiogrammes apr~s chromatographie b id imens ionnel le sur couche mince de silicagel G Merck (dpaisseur : 0,25 ram) des phosphol ip ides du rein (A) et du cerveau (B) de poule t ~8 heures apr~s l ' injec- t ion de 3~P-orthophosphate.

Ddp6t de p h o s p h o r e : 50 ,tLg au centre et 30 ;ug su r chaque pis te latdrale. Les cond i t ions de c h r o m a t o g r a p h i e son t ddcrites au ehap i t r e des << t echn iques 7>. Durde de l ' expos i t i on des fi lms : 4 jou r s .

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.

Analyse el mdtabol i sme des sph ingomydl ines t issulaires de poussin. 135

2. Composition en acides gras.

La s6parat ion des sphingomy61ines en deux groupes pr6sente l ' avantage de permet t re une 6tude plus s61ective de leur compos i l ion en acides gras. Elle se r6v61e plus s imple que les techniques

nhauser et coll. [28, 29], nous trouVons des propor t ions inf6r ieures d 'ac ides l ignoc6r ique et n e r - vonique. Comme le s ignalent Svennerho lm et coll. [30] les sphingomy61ines c6r6brales ne con- t iennent , par r appor t aux autres tissus, que de

TABLEAU IV.

Composition cenl~simale des esters m~lhyliques d'acides gras des sphingomrldlines totales et des tractions I et II isol~es du cerveau de poussin (moyenne de quatre experiences).

1 2 : 0 1 4 : 0 1 6 : 0 16; 1 1 7 : 0 1 3 : 0 1 8 : 1 1 8 : 2 20 : 0 2(I : 3 2 0 : 4 2 2 : 0 2 2 : 1 2 2 : 2 23; 0 2 3 : 1 2 4 : 0 2 4 : 1 2 5 : 0

Satur6s . . . . . . . . . . .

Insatur~s . . . . . . . . . .

Sphiogomydlines Fraction I Fraction I1 totales

0,7 -+- 0,1 8,5 -4- 0,2 1,8 -4- 0,1 1,2 "4- 0,1

6 9 , 2 ~___ 1 2 . 3 -+- 0,2 0,5 -~- 0,1 2,7 -t- 0,2 0,3 -4- 0,1 0,4 --I- 0,1 3,5 --i- 0,2 0.5 ~ 0.1 0,7 "+- 0,2 0,4 -t- 0 , I o,2 -4- 0,1 1,7 -4- 0,2 4,8 -t- 0,2 0,1

88

12

1,9 -Jr- 0.1 2.8 __ 0,2

12,7 -+- 0,2 2.6 -+" 0,2 0,8 --~ 0,2

36.6 -t- 1 12,0 -+- 1

3.4 +- 0,2 2,0 -+- 0,2 1 , 8 -~- 0,2 5,6 -+- 0,2 2,6 -t- 0,2

0,6 -I- 0,2 0.3 -~- 0,1 3 , 6 -4- 0,2

10,7 -[- 0,2 traces

68

32

0,6 ~- 0,2 1,5 ~ 0,2 5,2 -t- 0,2 0,8 ~ 0.2 0,4 ~ 0,2

87,3 ~ 1 traces

0,4 + 0,2 1,6 ~___ 0,2 1,2 ~ 0 , 2

t r a c e s 0,4 ~- 0,1 0,6 4 0,1

traces traces

97

de sdparat ion des cdramides l ibres selon Karlsson et Steen [!19], des diacdtates de c6ramides par ch romatograph ic sur couche mince impr6gu6e de ni t ra te d ' a r g e n t : Hi rv i sa lo et Renkonen [20], Renkonen [~l], ou de borate : Morrison [22] ou que la ch romatograph ic des cdramides en phase vapeur : Samuelsson et Samuelsson [23], Caspa- r in i et coll. [24].

La composi t ion en acides gras des sphingomydlines c6r6brales totales chez le poussin (tableau IV) compte tenu des var ia t ions dues h l'fige indiqu6es par Svennerho lm [25] mont re comme chez l ' h o m m e : Stal lberg-Stenhagen et Svenner- ho lm [26], Pilz et Jatzke~vitz [27] la pr6domi- nance d 'ac ide stdariquc (70 p. cent). Le r appor t des acides pa lmi t ique h st6arique de 1 h 10 pour les sphingomydl ines du cerveau humain est ici bien plus 61ev~. Par contre, par r appor t aux sphingomy61ines c6rdbrales humaines : Than-

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.

faibles pourcentages d 'ac ide bdh6nique (3,5 p. cent).

La f rac t ion I r iche en acides stdarique, ol6ique et pa lmi t ique confi rme la pauvret6 des sphingo- my61ines cdr6brales en acides en C2~.

La fract ion II par contre, cont ient 87 p. cent d ' ac ide stdarique et pas du tout d 'ac ides gras h longue chaine.

Les sphingomydl ines totales de cceur (tableau V) sont coustitu6es de quatre acides majeurs : palmit ique, st6arique, b6hdnique et nervonique . Les deux dern iers sont surtout rassembl6s, comme t o u s l e s compos6s h chaine longue, dans la frac- t ion I, alors que la f rac t ion II r en fe rme 80 p. cent des acides pa lmi t ique et st6arique.

On re t rouve darts le re in pour les sphingo- my61ines totales (tableau VI) une plus grande r ichesse en acides gras /~ longue chaine : 53 p.

136 G. Soula, C. Champane t et A. Fourcade.

c e n t des a c i d e s g ras t o t a u x d o n t 26 p o u r c e n t d ' a e i d e s l i g n o c 6 r i q u e et b 6 h 6 n i q u e . Ces d e r n i e r s loca l i s6s d a n s la f r a c t i o n I y r e p r 6 s e n t e n t 60 p ,

c e n t des a c i d e s g ras de l ' e n s e m b l e off l ' on ne no te que d e f a ib les p r o p o r t i o n s d ' a c i d e s h c h a l n e m o y e n n e .

TABLEAU V.

Composition centdsimale des esters mdthyliques d'acides #ras des sphingomydlines totales et des fractions I el II isol~es de coeur de poussin (moyenne de quatre experiences).

i2 : 0 1 4 : 0 1 6 : O 1 6 : 1 1 6 : 2 1 7 : 0 1 8 : 0 1 8 : 1 18: 2 20 : 0

2 0 : 3 2 0 ! 4 2 2 : 0 23 ~i:~0 24:: 0 2 4 : 1 25 : 0 2 6 : 0

Saturds ./,~..:~ . . . . .

InsaturJs . . . . . . . . . .

Sphingomy61ines Fraction l Fraction II totales . . . .

0,8 -~- 0,2 1,4 -~- 0,2

27,6 ~- 1 traces ~

2,0 ' : 0,9 ~___ 0.2

19.3 ~- 1: 3,6 ' ~ - 0,2 2,8 ~q- 0,2 6,2--_~ 0,4 %8 ~ 0,2

traces 11;8 +_

3 ,6 -4 - 0,2 6,9 T= 0~4: 9,8 -+- 0 , 4 1,5 -~- 0,2

3,3 -+- 0,2 3,1 -+- 0,2

10,8 ~ 0,4

2,4 -I- 12,5-4-

5,0 -t- 2,6 -~-

3,9 -4- 0,2 2,5 _____ 0,2

51,2 ~- 1 traces

0,2 2,6 + 0,2 0,4 23,6 ~__ 1 0,5 4,7 ~- 0,2 0,2 4,7 -4- 0 ,2

5,0:~--~- 0,5 2,7 ':-+- 0,2

traces 17,2 -+- 0,5

7,7 -t- 0,4 9,6 -~- 0,4

14,7 _____ 0,5 2,0 -+- 0,2 1,4 -~- 0,2

80 I 75 ! ~; 3 "

20 ,~ [ 2 5

2,1 ~__ 0,2 3 ,6-+- 0,2

0 , 9 - { - 0,2

87

13

TABLEAU VL

Composition cent~simale des esters mdthgliques d'acides gras des sphingomg~lines totales et des fractions I e t II isol~es dn rein de poussin (moyenne de quatre experiences).

14: 0 1 6 : 0 1 6 : 2 1 7 : 0 18: 0 18: 1 1 8 : 2 2 0 : 0 2 0 : 3 2 0 : 4 2 2 : 0 2 3 : 0 2 4 : 0 2 4 : 1 2 5 : 0 26- 0

Satur6s . . . . . . . . . . .

Insatur6s . . . . . . . . . .

Sphingomy61inbs Fraction I Fraction I1 totales

0,6 q- 0,2 36,3 "Jr- 0,2

0,7 -~ 0,1 1,3 ± 0,2 5,4 -~ 0,2 1,0: -~- 0,2 0,3 -+- 0,1 5,8 + 0,2 0,7 ----¢-__ 0,2 0,5 ___~ 0.2

15,5 ! 0,5 2,8 -t- 0,2

14,1 -H 0,5 12,1 ~ 0,5

2,0 ~- 0,2 0,8 ~- 0,2

85

15

3,7 _~_ 0,2

0,5 -4- 0,1 2,5 -4- 0,2 1,7 q- 0,2 0,4 -4- 0,2 4,0 -I- 0,2 1,2 -t- 0,2

18,3 -+- 0,5 4,6 ----t- 0,2

30,0 ___~ 1 29,7 -~ 1

2,8 q- 0,2 0,6 q - 0,2

67

33

1,0 ! 0,2 73,0 ____. 1

1,6 ~- 0,2 6,9 -~- 0,5 2,3 -+ 0,2 0,7 -~- 0,2 5,3 -~- 0,2 2,2 ___~ 0,2

traces 3,1 -t- 0,2 1,1 -4-- 0,2 2,0 _____ 0,2 0,8 -~- 0,2

94

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.

Analyse et mdtabol isme des sphingomydl ines tissulaires de poussin. 137

La • f rac t ion I I r6na le , p a r c o n t r e , r a s s e m b l e 73 p. c e n t d ' a c i d e p a l m i t i q u e et 94 p. c e n t d ' a c i d e s gras sa tur6s .

Les s p h i n g o m y 6 1 i n e s to ta les du foie ( t ab leau VII) r e n f e r m e n t d a v a n t a g e d ' a c i d e s p a l m i t i q u e et s t 6 a r i q u e que d ' a c i d e s gras h l o n g u e c h a i n e off

TABLEAU VII.

Comp9sition cenl~simale des esters mdlhyliques d'acides gras des sphingomy~lines lotales el des [ractions I el II isol~es du [oie de pOussin (moyenne de quatre expdriences).

1 2 : 0 14: 0 1 6 : 0 1 6 : 1 1 6 : 2 1 7 : 0 t 8 : 0 18: 1 18. 2 2 0 : 0 2 0 : 3 2 0 : 4 2 2 : 0 23 : 0 2 4 : 0 2i1: 1 2 5 : 0

Saturds . . . . . . . . . . .

Insatur~s.

Sphingomydlines Fraction I Fraction II totales

0,6 -4- 0,2 1 , 7 -~- 0,2

47,5 _____ 1 2 ,1 + 0,2 2.5 -t- 0,2 1,2 -4- 0,2

11,8 -t- 0,4 2,4 -I- 0,2 1,5 4- 0,2 1,5 + 0,2 0,9 + 0,2

12,0 + O,5

2,3 ~ 0,2 2,8~___ 0 ,2

20,4 ~_~ 0,4 0,3 -~- 0,2

0,8 -4- 0,2 16,3 ~ 0 , 5

5,4 ~_~ 0,2 3,8 + 0,2 2,2 ~ 0,2 1,3 __~ 0,2 1,4 ~ 0,2

14,2 - t 0,4

4,1 + 0,2 4,0 -~- 0,2

64,2 ~- 1 0,5 _~. 0,2

1,4 -4- 0,2 14,7 -I- 0,5 4,0 -}- 0,2 1,0 _____ 0,2 1 ,6 + 0,2 1,5 ~ 0,2 1,0 -4- 0,2 1 ,8 -I- 0,2

2,9 4,1 4,6 2,7

-+- 0,2 -t- 0,2 -+-0 ,2 ~___ 0,2

86

7,2 ~-~ 0,2 8,8:_+. 0,2

12,8 ~___ 0,4 traces

,- 75 I

traces

92

'14 25

TABLEAU VIII.

Composition cent~simale des esters m~thyliques d'acides gras des sphingomy~lines totales el des [raclions I et II isol~es du poumon de poulet (moyenne de quatre experiences).

Sphingomy61ines totales

Fraction I

12 : 0 0,5 "+ 0,2 0,6 ~___ 14: 0 1,0 -I- 0,2 1,2 --I- 1 6 : 0 52,4 --I- 1 14,3 --t- 16 : 1 traces 1,5 -+- 1 6 : 2 0,4 -t- 0,2 1,0 ~__ 17: 0 0,8 --t- 0,2 0,5 --t- 18 : 0 11,7 -3- 1 8 , 2 ~_ 1 8 : 1 1 8 : 2 2 0 : 0 2 0 : 3 2 0 : 4 2 2 : 0 2 2 : 1 2 3 : 0 2 4 : 0 24: 1 2 5 : 0 2 6 : 0 [ I

3,0 -i- 0 ,4 1,0 + 0,2 3,8 -4- 0,4 0,8 __ 0,2 0,5 ----4-__ 0,1 8,6 + 0,4 0,8 -I- 0,2 1,6 -I- 0,2 6,2 -4- 0,5 5,5 -~- 0,5 1,4 --I- 0,2

Satur6s . . . . . . . . . . . ,

traces

88

12

0,2 0,2 1 0,2 0,2 0,2 0,2

4,2 ~__ 0,2 1,3 ~___ 0,2 4,5 -+- 0,5 0,6 ~___ 0.1 0,8 ~__ 0,1

18,6 4- 1 1,2 + 0,2 2,9 ~ 0,2

16,6 ~ 1 17,2 ~- 1

4 , 5 ~ 0,5 traces

72

28

Fraction II

0,9 -+" 0,2 1,2 -~- 0,2

81,0 + 1 traces

0,7 -4- 0,2 0,6 "+" 0,2 8,4 -Jr" 0,5 2,0 ___~ 0,2 0,8 --4- 0,2 1,2 -I- 0,2 0,8 -L-_ 0,2 0,5 -t- 0,2 1,4 -¢- 0,2 0,2

0,1 traces

95

Insatur~s . . . . . . . . . . . ! 5

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.

138 G. Soula, C. Champane t et A. Fourcade.

les aeides en C24 sont en faible p ropor t ion . La r6par t i t ion des acides gras dans les deux frac- t ions est assez p roche de celle des autres tissus ; la f rac t ion II r en fe rme 78 p. cent d 'ac ides palmi- t ique et st6arique.

Dans le poumon, les sphingomy61ines totales (tableau VIII) r6v61ent un tr6s fort pourcen tage d 'ac ide pahni t ique que l 'on re t rouve en majo- rit6 (81 p. cent) dans la f rac t ion II. Les p ropor - t ions d 'ac ides gras h longue chaine : b6h6nique,

rein, sont en grande major i t6 concentr6s darts la f rac t ion de Rf le plus 61ev6 ; les f ract ions II rassemblent soit l ' ac ide pa lmi t ique seul soit un m61ange d 'ac ide pa lmi t ique et d ' ae ide st6arique.

Nous conf i rmons les t r avaux ant6rieurs [26, 30] d6montrant la grande r ichesse des sphingo- my61ines c6r6brales en acide st6arique et l 'opposi - t ion entre les sphingomy61ines du cerveau et celles des autres tissus quant h leur teneur en acide b6h6nique.

TABLEAU IX.

Composition cent~simale des esters mdthyliques d'acides gras des sphingomy~lines totales et des [ractions I e t II isol~es de rate de poulet (moyenne de quatre expdriences).

1 4 : 0 1 6 : 0 1 6 : 1 1 6 : 2 1 7 : 0 1 8 : 0 1 8 : 1 1 8 : 2 2 0 : 0 2 0 : 3 2 2 : 0 2 2 : 1 2 3 : 0 2 4 : 0 2 4 : 1 25:0 26 :0

Satur~s . . . . . . . . . . .

Sphingomydlines Fraction 1 Fraction It totales

3,3 -~- 0,2 57,5 ~- 1 3,4 ~___ 0,2 2,2 + 0,2 1 , 3 ~___ 0,2

13 ,5 -~- 1 4,8 "4- 0,2 0,6 -~- 0,2 2,4 ~___ 0,2

5,0 -~- 0,5 traces traces

2,0 -4- 0,5 4,0 -4- 0,5

traces traces

2,7 ~___ 0,2 12,5 ~ 0,5

traces 1,5 -}- 0,2

7,9 ~ 0,5 6,9 ~___ 0,5 1,8 ~___ 0,2 2,9 -~ 0,2 2,9 ~--~ 0,2

11,8 ___~ 0,5 Ira ces

3,8 ~ 0,5 12,4 ~-~ 1 26,9 ~ 1

6,0 ~___ 0,5 traces

60

3,7 --i- 0,2 6 6 , 1 - ' ~ 1

traces 2,3 ~- 0,2 2,0-~- 0,2

12,5 -~- 0,5 4,0 -+- 0,2 0,8 -I- 0,2 1,8 _____ 0,2 1,6 -~- 0,2 2,8 ~ 0,2

traces

0,5 -t- 0,1 1,3 -t- 0,2

9O 85 I

Insaturds . . . . . . . . . . 15 ' 40 10

l ignoc6r ique et ne rvonique sont plus faibles que dans les autres tissus de poussin.

l l en est de m6me dans les sphingomy61ines totales de la rate (tableau IX) et l 'on note dans les deux f ract ions la m6me r6par t i t ion que dans les autres tissus avec 64 p. cent d 'ac ides gras "h longue chaine dans la f rac t ion I.

D 'une manibre g6n6rale, les sphingomy6l ines totales r en fe rmen t de 80 h 88 p. cent d 'ac ides gras satur6s, ceux-ci sont en major i t6 localis6s dans la f rac t ion de Rf le plus faible off leur pour- centage est toujours sup6rieur h 90 p. cent, saul dans le occur.

Les acides gras h longue chaine, dont les pourcentages les plus 61ev6s se r encon t ren t dans le

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.

Les sphingomy61ines du cerveau mont ren t un taux faible de cet acide, ainsi que celles de la rate, ators que dans les autres tissus et surtout dans le rein son taux exc6de 10 p. cent faisant de l ' ac ide b6h6nique surtout un const i tuant des sphingo- my61ines extraneurales .

3. Etude m~tabolique.

L'6tu:de m6tabol ique des deux groupes de sphin- gomy61ines t issulaires de poulet, purifi6es sur colonne d 'ac ide si l icique, est effectu6e apr6s r6cu- p6rat ion des f ract ions isol6es par chromatogra - phie sur couche mince. Celle-ci est effectu6e aussi bien grfice ~ des solvants contenant de l ' ac ide ac6tique qu 'en solvant neutre (fig. 4, 5, 6, 7 et 8).

Les sphingomy61ines mont ren t nn marquage re la t ivement faible par r appor t aux autres phos-

A n a l y s e e t m d t a b o l i s m e d e s s p h i n g o m y d l i n e s l i s s u l a i r e s de p o u s s i m 139

phol ipides , ce qui justifie le choix des temps s '6chelonnant entre 24 et 120 heures. Par rappor t aux r6sultats de Minari et coll. [17] qui n '6 tudient

gomy61ines s 'effectuait de fa~on trbs lente, mSme h pa r t i r de pr6curseurs d i rects comme l 'a montr6 Nilsson [31] dans la muqueuse intest inale.

DPG

PG

PI

FIG. 4. - - A utoradioqrammes apr~s sdparation sur couche mince de silicagel G Merek (dpaisseur 0,0-5 ram) des phospholipides de rate de poulet en solvant aeide (A) et en solvant neutre (B) eomme indiqu~ au chapilre des techniques, 24, 48, 55 el 120 heures aprbs injection de ~2p- orthophosphate.

D6p6ts de phosphore : 25 ~g. Dur6e d'exposition des films : 4 jours.

A B

D I ~

PG .

PI PE

p s ¸ Jl !i~:!!i!i~i!ii! = : ~ i ! ! ~ ! ! ! ! i i !i~ ~

DPG PC PG

PC SP PS

SP LPC LPC

) . . . . . . . . . . . . . . . .

A B

FIG. 5. - - Autoradiogrammes apr6s sdparation sur couche mince de silieagel G Merck (dpaisseur : 0,25 mm) des phospholipides de eozur de poulet en solvant acide (A) et en solvant neutre (B) eomme indiqud all chapitre des techniques, 24, 48, 55, 120 heures apr~s injection de s2p- orthophosphate.

D6p6ts de phosphore : 25 ug. Dur6e d'exposition des films : 4 jours.

chez le rat l ' i nco rpora t ion qu 'au bout de 24 heures, nous avons pr6f6r6 pro longer l '6tude du renouvel- lement h plusieurs jours pour mieux suivre l '6vo- lut ion des deux sphingomy61ines. Les activit6s sp6cifiques ne d6passent gubre 500 fi 600 dpm/ctg de P, elles sont m6me net tement inf6r ieures dans le cerveau off Freysz et coll. E18] ont montr6 chez ]e rat que l ' i ncorpora t ion de 32p dans les sphin-

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.

On note des diff6rences impor tan tes dans le pouvoi r m6tabol ique des deux groupes de sphin- gomy61ines, sauf pour la rate (fig. 9 B) oll les acti- vit6s sp6cifiques tr6s vois ines d~s 24 heures s'61b- vent, pr6sentent un m a x i m u m h 48 heures puts d6croissent jusqu'h 120 heures.

Dans le rein (fig. 9 A), les deux sphingomy6l ines ont des activit6s sp6cifiques tr~.s vois ines h

140 G. S o l d a , C. C h a m p a n e t e t A . F o u r c a d e .

24 heures , cel le du g r o u p e I s '6l~ve ensu i te r ap i - d e m e n t a lo rs que ce l le du g r o u p e I 1 s ' aba i s se et les d e u x g roupes p r~sen t en t h 120 h e u r e s sens ib le - m e n t ]es m~mes va leurs .

Des r6sul ta t s p r a t i q u e m e n t oppos6s son t obser - v6s dans le p o u m o n (fig. 10 B) of 1 l ' a c t i v i t 6 du g r o u p e I I p r 6 d o m i n e avec un m a x i i n u m 48 h e u r e s pu i s d6c ro l t r a p i d e m e n t a lors que cel le

DPG

PE PG

PI

PS

PC

SP

LPC

PE

DPG

PG

PC PS SP LPC

FIG. 6; - - Au torad iogrammes apr~s sdparation sur couche mince de silicagel G Merck (dpaisseur : 0,25 ram) des phosphol ipides de poum on d e poulet en solvant acide (A) et en solvant neutre (B) comme indiqud au chapitre des techniques, 26, 68, 55 et 1~20 heures apr~s inject ion de 3~P-orthophosphate.

D6p6ts de phosphore : 25 :pg, Dur~e d'exposit ion des films : 4 jours.

DPG

PE PG

PI

PS

PC

SP LPC

PE

DPG PG PC PS SP LPC

FIc,. 7. - - Au lorad iogrammes aprbs sdparation sur couche mince de silicagel G Merck (dpaisseur : 0,25 ram) des phosphol ip ides de rein de poulet en solvant acide (A) et en solvant neutre (B) comme indiqud azz chapitre des techniques, 26, 68, 55 et 120 heures aprks in ject ion de sep- orthophosphaie .

D~p6ts de phosphore : 25 I~xg. Dur6e d'exposit ion des films : 4 jours.

A B

Dans le cceur (fig. 10 A), le g r o u p e I p r~sen te des ac t iv i t6s c ro i s s an t e s en t r e 24 et 48 heu res , ee l les -e i d i m i n u e n t ensu i te a lors que l ' a c t iv i t~ du g r o u p e ]I s'61~ve n o t a b l e m e n t au-del5 de 48 heures . Les ac t iv i t6s sp~c i f iques des d e u x g roupes , tr~s d i f f6 ren tes au bou t de 120 h e u r e s sont n e t t e m e n t en f a v e u r du g r o u p e II.

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.

du g r o u p e I a u g m e n t e p r o g r e s s i v e m e n t p o u r a t t e i n d r e au bou t de 120 h e u r e s une ac t iv i t6 sp6- e i f ique qu i s emble e n c o r e s '61ever.

Au n i v e a u du foie, (fig. 11 A), les m a x i m a d ' ac t i - vi t6s sp6c i f iques des d e u x g r o u p e s se s i t uen t a v a n t 48 h e u r e s p o u r ]e g r o u p e I, au delh p o u r le g r o u p e I I ; ~t p a r t i r de 55 h e u r e s les ac t iv i t6s sp6-

A n a l y s e e t m d t a b o l i s m e d e s s p h i n g o m y d l i n e s t i s s u l a i r e s d e p o u s s i n . 141

eifiques des deux groupes se re joignent et dimi- Enfin, pour le cerveau (fig. 11 B), les deux grou- nuent , pes de sphingomy61ines mon t ren t des activit~s

DPG

PE PG

PI

PS

PC

SP

LPC

A B

800

600 6

2 400.

200"

J

8: O.

600.

E ~400

2 0 0

A

24 48 55 Heures 120 ~

B

FIG. 9. - - Actioi tds spdci[iques en fonct ion dit temps des deux t roupes de sphin~lomydlines du rein (A) et de la rate (B) de poule t apres in jec t ion de z~P in vivo.

• Groupe 1 ; © Groupe 2.

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.

FIG. 8. - - Autoradiogrammes apr~s sdparation sur couche mince de silicagel G Merck (Epais- senr : 0,25 ram) des phosphol ip ides de [oie de ponle t en soloant acide (A) et en so lvant nentre (B) comme indiqud an chapitre des techniques,

PE 2#, ~8, 55 et 120 heures, aprbs in jec t ion de aep- orthophosphate.

DI~ D~pbts de phosphore : 25 tag. PG Dur~e d'exposition des films : 4 jours. PC PS $P LPC

m6taboliques tr6s faibles~ le groupe I a t te ignant h peine 100 dpm/~g de P au bout de 120 heures. En accord avec les t ravaux de Minari et coll. [17], nos r6sultats mon t ren t que l 'activit6 des sphingo- my61ines c6r6brales 6volue trbs len tement avec le temps.

Ces courbes d 'activit6s peuvent para i l re pour cer ta ins tissus tout au moths, tels le rein, le foie, le cceur et le poumon en faveur d '~changes entre les deux groupes de sphingomy61ines. Mats ces 6changes ne semblent pas favoriser dans t o u s l e s cas la synth6se du m~me groupe de sphingo- my61ines aux d6pens de l 'autre puisque c'est tantSt le groupe I qui a la plus grande activit6, tant6t le groupe tI.

Ces 6changes ont $t6 d6montr6s par Sakagami et coll. [8, 32] et nous-m6mes [33] entre plasma et globules rouges ; ils se r6v61ent m~me relative- ment rapides et pour ra ien t s 'effectuer mol6cule h mol6cule, l '6change de phosphory lchol ine par un m6canisme enzymat ique n ' ayan t jamais 6t6 d6- montr6.

Minari et coll. [17] pensent que ces 6changes constat6s entre plasma et globules rouges sont bas6s sur les s t ructures diff6rentes des diverses c6ramides.

Au niveau des tissus, et bien que l '6change s'effectue par l ' in te rm6dia i re des l ipaprot6ines , il semble plus vraisemblable que les 6changes

142 G. Soula, C. Champanet et A. Fourcade.

s 'effectuent au niveau des mol6cules de phosphory lcho l ine en faisant i n t e rven i r la c6ramide cho- l ine phosphot ransf6rase dont il res tera i t h prou- ver l 'act ivi t6 t issulaire.

800

u 6 0 0 .

6~

E "o 4 0 0 .

2 0 0 .

~ 800 I

600 6,

E 400

200

2~ 413 6'5 H ~ . ~ . 1~o >

A

2'4 48 6'5 Heur¢5 120

B

Fro . 10: - - Activitds sp~cifiques en fonetion du temps des deux groupes de sphingomydlines du coeur (A) et du poumon (B) de ponlet aprbs injection de 3~p i n v i v o .

• G r o u p e I ; © G r o u p e 2.

Plusieurs t ravaux : Sr ibney et Kennedy [34], Gatt [35], Barnholz et coll. [36] ont montr6 que l 'act ivi t6 des divers enzymes du m6tabolisme des sphingomy61ines dont la sphingomy61inase et la c6ramidase Oai t for tement influenc6e par la na ture des acides gras consti tut ifs des c6ramides.

Puisque nous d6cr ivons dans leS divers tissus 6tudi6s des sphingomy61ines de composi t ions en acides gras ne t tement diff6rentes il est vra isem- blable que l 'act ivi t6 des enzymes impliqu6s dans leur m6tabol isme peut Ore p ro fond6ment influen- c6e par la s t ructure elle-m6me de la sphingo- my61ine.

Les r6sultats m6tabol iques que nous rappor tons , re la t ivement complexes d 'une mani~re g6n6rale,

doivent Ore consid6r6s comme la r~,sultante de r6act ions de biosynthbse, de d6gradat ion influen- c6es par la configurat ion s t ructurale des mol6- cules, et de r6act ions d '6change soit des sphingo- my61ines elles-m6mes soit de cer ta ines par t ies de celles-ci.

Par ai l leurs et selon les organes ces m6canismes sont susceptibles de var ie r selon la local isat ion cel lulaire ou subcel lula i re des sphingomy61ines

6 0 0 .

-~ 600 6,

E ~ 400

200

A

600

600

E "o ~ 400-

200-

2~ 4~ 5~ Heures 1~0 >

B

FIG. 11. - - Activitds spdcifiques en fonction du temps des deux gronpes de sphingomydlines du foie (A) et du cerveau (B) de poulet apr~s injection de 32p i n v i v o .

• G r o u p e 1 ; © G r o u p e 2.

d 'autant plus que nous n 'envisageons pas dans cette 6tude la nature satur6e [37], insatur6e [23] ou de longueur var iable [38! de la base des sphin- gomy61ines, celle-ci pouvant 6galement jouer un r61e impor tan t dans le m6tabol isme de ces phosphol ipides .

R~suM~.

Apr~s isolement par chromatographie sur colonne d'acide silicique et sur couche mince de silieagel unidi- mensionnelle en solvant neutre ou acide, deux groupes de sphingomy~lines sont isol~s de quelques tissus chez le poussin : foie, poumon, cceur, rein, cerveau et rate.

BIOCHIMIE, 1974 , 56, n ° 1.

A n a l y s e et m d t a b o l i s m e des s p h i n g o m y ~ l i n e s l i s su la ires de p o u s s i n . 143

L'~tude de la composi t ion en acides gras des deux fract ions montre uu for t degr~ de saturat ion ; l 'nne des deux fract ions est essent ie l lement constitude par les acides gras h longue chalne : acides lignocdrique et nervonique tandis que l 'autre est fortune des acides palmit ique et st6arique.

Tandis que les sphingomySlines du cerveau de poussin renferment de fortes proport ions d'acide stSarique, les sphingomydlines du eerveau et de la rate mont ren t un taux faible d'acide b~h6nique. Les autres t issus de poussin contenant de fortes proport ions de eet acide, l 'acide b~h~nique est essent ie l lement un const i tuant des sphingomydlines extraneurales .

Apr~s dtude de leur composi t ion en acides gras, qui se r~v~le tr~s diff~rente entre les deux groupes, nous ~tudions apr~s inject ion de 32P-orthophosphate au poussin, le turnover des deux groupes de sphingomy~lines duns les divers tissus.

Alors que les sphingomy61ines e~r~brales ont un renouvel lement tr6s lent, les deux fractions des autres t issus pour lesquels le marquage se rSv~le assez diff6- rent sugg~rent la possibilit~ de r6actions d'6change qui pourra ient s'effectuer soit au niveau des molecules de sphingomy61ines elles-m6mes soit au niveau de la phosphorylcholine.

BIBLIOGRAPHIE.

1. Wood, P. D. S., Imaichi, K., Knowles, J., Michaels, G. ~ Kinsell, L. W. (1964) J. Lipid Bes., 5, 225- 231.

2. Karlsson, K. A. (1964) Biochem. J., 92, 39P-40P. 3. Haberman, E., Bandtl~w, G. ~ Krusche, B. (1961)

Klin. Woschen., 39, 816-817. 4. Wood, P. D. S. ~ Kinsell, L. W. (1963) Proc. Soc.

Exp. Biol. Med., 114, 225-226. 5. Eldin, A. K. ~ Sl(~ane-Stanley, G. H. (1964) Bio-

chem. J., 92, 40P-4]P. 6. Nelson, G. J. (1967) Lipids, 2, 323-328. 7. Sakagami, T., Minari, O. & Orii, T. (1964) J. Bio-

chem. (Tokyo), 56, 294-297. 8. Sakagami, T., Minari, O. ~ Orii, T. (1965) Biochim.

Biophys. Acla, 98, 356-364. 9. Minari, G., Tsubono, H., Akixama, M. ,¢ Sakagami,

T. (1967) J. Biochem. (Tol~yo), 62, 618-620. 10. Wood, P. D. S., ~ Holton, S. (1964) Proc. Soc. Exp.

Biol. Med., l l5, 990-992. 11. Sato, T. ~ Fnji i , T. (1971) Chem. Pharm. Bull., !19,

377-384.

12. Soula, G., Valdigui~, P. ,¢ Douste-Blazy, L. (1968) Bull. Soc. Chim. Biol., 50, 887-896.

13. Soula, G. ~ Gard, C. (1972) Biochimie, 54, 1213- 1216.

14. Rose, H. G. & Oklander, M. (1965) J. Lipid Res., 6, 428-431.

15. Chen, P. S., Toribara, T. Y. & Warner, M. (1956) Anal. Chem., 28, 1756-1758.

16. Soula, G., Souillard, C. & Douste-Blazy, L. (1972) Biochimie, 54, 401-407.

17. Minari, O., Tsubono, H., Akiyama, M. • Sakagami, T. (1968) J. Biochem. (Tokyo), 54, 275-278.

18. Freysz, L., Nussbaum, J. L., Bieth, R. a Mandel, P. (1963) Bull. Soc. Chim. Biol., 45, 1019-1029.

19. Karlsson, K. A. ,~ Steen, G. O. (1968) Biochim. Bio- phys. Acta, 152, 798-800.

20. Hirvisalo, E. L. a Rer~konen, O. (1970) J. Lipid Res., 11, 54-59.

21. Renkonen, O. (1965) J. Am. Oil Chem. Soc., 42, 298- 304.

22. Morrison, W. R. (1969) Biochim. Biophys. Acta, (176, 537-546.

23. Samuelsson, B. a Samuelsson, K. (1969) J. Lipid Res., 10, 47-55.

24. Casparini, G., Horning, E. C. & H o r n i n g , M. G. (1969) Chem. Phys. Lipids, 3, 1-10.

25. Svennerholm, L. (1964) J. Neurochem., 11, 839-853. 26. Stallberg-Stenhagen, S. ,¢ Svennerholm, L. (1965)

J. Lipid Res., 6, 146-155. 27. Pilz, H. a Jatzkewitz, H. (1964) J. Neurochem., 11,

603-611. 28. Thannhauser , S. J., Benotti, J. & Boncoddo, N. F.

(1946) J. Biol. Chem., 166, 677-681. 29. Thannhauser , S. J. ,~ Boneoddo, N. F. (1948) J. Biol.

Chem., 1:72, 141-147. 30. Svennerholm, E., Stallberg-Stenhagen, S. & Sven-

nerholm, L. (1966) Biochim. Biophys. Acta, 125, 60-69.

31. Nilsson, A. (1968) Biochim. Biophys. Acta, 164, 575-584.

32. Sakagami, T., Minari, O. a Orii, T. (1965) Biochim. Biophys. Acta, 98, 111-116.

33. Soula, G., Valdigui6, P. & Douste-Blazy, L. (1967) Bull. Soc. Chim. Biol., 49, 1317-1330.

34. Sribney, M. a Kennedy, E. P. (1958) J. Biol. Chem., Z33, 1315-1322.

35. Gatt, S. (1966) J. Biol. Chem., 24~1, 3724-3730. 36. Barnholz, Y., Roi tmann, A. a Gatt, S. (1966) J. Biol.

Chem., 2zH, 3731-3737. 37. Sweeley, C. C. a Moscatelli, E. A. (1959) J. Lipid

Res., 1, 40-47. 38. Klenek, E. ,¢ Huang, R. T. C. (1968) Hoppe Seyler's

Z. Physiol., 349, 451-454.

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.

sphingomyélines tissulaires chez le poussin : analyse et métabolisme in vivo

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