spectrométrie de masse

Spectrométrie de Masse Principe et applications en Biologie Clinique

Dr Abdellah TEBANI

12 janvier 2017

Laboratoire de Biochimie Métabolique

CHU de Rouen

La spectrométrie de masse (SM)

Définir les concepts de base de la SM

Expliquer le principe de fonctionnement

Connaître les modes d'acquisition MS et MS/MS

Applications en Biologie Clinique

Objectifs

2 Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3

Spectrométrie de Masse 12/01/2018

Spectrométrie de masse / Etat de l’art



Thomas M. Annesley et al. Clin Chem 62:1 1–3 (2016)

12/01/2018 Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3

Spectrométrie de Masse 4

Spectrométrie de masse / Etat de l’art

Paul J. Jannetto et al. lin Chem 2016;62:92–8

La spectrométrie de masse

Aspects méthodologiques



Concept 1 : Spectromètre de masse

Un spectromètre de masse est un instrument utilisé pour

peser des molécules.

Une balance à l'échelle moléculaire !



Un spectromètre de masse est utilisé pour :

Identifier des molécules présentes dans des échantillons

solides, liquides ou gazeux

Déterminer la quantité de chaque molécule (Quantitatif)

Déterminer la structure de chaque molécule (Qualitatif)

Concept 2 : utilité d’un spectromètre de masse



Une molécule doit être chargée pour être

analysée par un spectromètre de masse.

Un spectromètre de masse "pèse" les

molécules électroniquement par attraction et

répulsion des ions.

Concept 3 : ions et charge


Spectrométrie de Masse

«L’ionisation permet aux molécules d’être mobiles

dans un spectromètre de masse."

12/01/2018

Trier puis compter

Mélange de molécules

Molécules de différents PM et structures

Séparation par spectres de masse

3

8

5

4

2

Valeur (m/z)

Quanti

té (

Inte

nsi

té)

Concept 4 : Analyse des masses



Combien ?

Un spectromètre de masse

mesure la masse de molécules isolées

Le spectromètre de masse doit : 1- Volatiliser Séparer les molécules les unes des autres : on passe de

l’état de matière condensée à un état gazeux. 2- Ioniser Transformer les molécules en ions, car un spectromètre de

masse fonctionne grâce à des champs électriques 3- Mesurer les rapports m/z La masse moléculaire est calculée à partir du rapport : masse (m)/nombre de charges de la molecule (z)

Spectromètre de masse : principe



Ionisation

Spectrométre de masse

Ionisation des molécules

Séparation des ions par m/z

Analyse quantitative/qualitative

Séparation Spécificité

Détection Mesure

Déconvolution Analyse des spectres

Interprétation Biologie




Méthode de mesure des rapports masse/charge (m/z) de molécules

individuelles et ionisées

Echantillon Spectromètre de masse Signal

Spectromètre de masse



Echantillon Source d’ions

Analyseur de masse

Détecteur Signal




Ion Source

Type de sources d’ions

Electrospray (ESI, DESI)

Matrix-Assisted Laser

Desorption Ionization

(MALDI)

Chemical Ionization

(CI, APCI)

Electron Ionization (EI)

Rapid Evaporation

Ionization (REIMS)

Fast Atom Bombardment SS TI

GD TS

DESI DART




Analyseurs de masse

Quadripole (Q)

Time of Flight (ToF)

Ion Trap

Trappe d’ions linéaire

Secteur magnétique

Fourier Transform Ion

Cyclotron Resonance

(FT-ICR)




Detecteurs

Détection d’ions

Amplification

Conversion en signal

digital




« ionisations dures » génèrent des

ions moléculaires qui se fragmentent

parfois même totalement avant

d’avoir eu le temps de sortir de la

source.

Ionisation à Impact électronique (IE)

Ionisation Chimique (IC)

Les « ionisations douces » génèrent

des ions moléculaires qui sont

stables et qui ont des durées de vie

suffisantes pour traverser

l’analyseur, arriver jusqu’au

détecteur, et donc être mesurés.

Ionisation par électronébullisation

(ESI)

Désorption Ionisation Laser assistée

par Matrice (MALDI)

Sources d’ions



Pic Moléculaire

m/z

Nombre d’ions

m/z

Pic Moléculaire

Fragments

Nombre d’ions

Spectrométrie de masse : définitions

Informations La masse moléculaire d’un composé La masse des fragments de ce composé (empreinte) Une mesure de la quantité



Echantillon Source

d’ions Mass

Analyzer Detector Signal

Molécules en phase Gazeuse

CI / EI

Sources d’ions



Ionisation en phase gazeuse

12/01/2018

Echantillon Source Mass Analyzer

Detector Signal

ESI APCI

Ionisation en phase liquide

Sources d’ions



Techniques d’ionisation de surface

Sample Ion

Source Mass


http://histoloblog.blogspot.co.uk/

Surface solide

(Tissues) ?



Sources d’ions

http://histoloblog.blogspot.co.uk/

Sample Ion

Source Mass


DESI Surface solide

(Tissues)



Sources d’ions


Ifa DR et al. Clin chem 62:111-123

Sample Ion

Source Mass


MALDI Surface solide

(Tissues)

http://kenickbiochem09.wikispaces.com/How+does+MALDI-TOF+work%3F



Sources d’ions


http://kenickbiochem09.wikispaces.com/How+does+MALDI-TOF+work?



Sample Ion

Source Mass


SIMS Surface solide

(Tissues)

Jiangjiang Liu et al. Anal Bioanal Chem. 2013 Jul; 405(17): 5645–56533



Sources d’ions


Sample Ion

Source Mass


REIMS In vivo Tissues



Sources d’ions


Balog J et al. Angew Chem Int Ed Engl 2015 Sep 14;54(38):11059-62

Ionisation par Electrospray (ESI)

Royal Society of Chemistry

Sources d’ions



Q : Déflexion par un champ quadripolaire

IT : Confinement dans un piège à ion (Ion Trap)

TOF : Mesure d’un temps de vol (Time Of Flight)

FT-ICR : Résonnance Cyclotronique d’Ions à

Transformée de Fourrier

Différents types d’analyseurs.

Principes physiques différents, mais tous mesurent des valeurs m/z.

Un vide suffisant indispensable pour que les ions puissent atteindre le

détecteur.

L’analyseur de masse (rapports m/z)



Caractéristiques génériques des analyseurs

L’analyseur des rapports m/z



Quadripôle Piège à ions Q-TOF OrbiTrap FTMS

Justesse (ppm) 100 100 <10 <5 <5

Résolution 3000 - 5000 4000 - 2000 10 000 - 60 000 100 000 –

240 000

750 000 -

2 500 000

Gamme (m/z) < 4000 6000 20 000 10 000 10 000

Vitesse de

balayage

~ second ~ second milliseconds ~ second ~ second

Tandem MS MS2 (QQQ) MSn MS MS2 MSn

L’analyseur quadripolaire



http://www.chemicool.com/definition/quadrupole_mass_spectrometry.html

L’analyseur quadripolaire



Mode SIM (Single Ion Monitoring)

342 Da

342.1 Da

342.12 Da

342 Da

342.1 Da

342.13 Da

Sucrose Coniferine

Spécificité et résolution de l’analyseur



http://www.genome.jp/ligand-bin/strsearch_view_compound?ENTRY=C00089

3-Phenoxypropionic acid Formule : C9H10O3

Tropic acid Formule : C9H10O3

Isopenol Formule : C9H10O3

166.0630

166.0630

166.0630

Spécificité : Quand la résolution ne suffit plus !



3-Phenoxypropionic acid Formule : C9H10O3

Tropic acid Formule : C9H10O3

Isopenol Formule : C9H10O3

150.0310

93.0331

103.0550




MS 1 Fragmentation MS 2

Trier les

molécules

Casser les

molécules

Trier et compter

les pièces

2

1

1

2

1

1

Concept 6 : spectrométrie en tandem



Fragmentation Moléculaire

Parent selection m/z = 166

Collision-induced dissociation (CID)

Fragment selection m/z = 103

Quadrupole (Q1)

Quadrupole (Q2)




Analyseurs de masse à basse résolution mais multiples

Modified from : http://www.mrmatlas.org/mrmassays.php

Sélection ion Parent m/z = 166

Collision-induced dissociation (CID)

Sélection ion Fragment m/z = 103

Quadripôle (Q1)

Quadripôle (Q2)




http://www.mrmatlas.org/mrmassays.php

Les modes d’acquisition MS/MS



Couplage avec les méthodes séparatives

39 12/01/2018 Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3


Ajouter une 2ème dimension à l'analyse MS

Maximiser la spécificité : la séparation d'espèces moléculaires de masse

similaire ou identique dans les Matrices complexes

Critères supplémentaire pour l'identification moléculaire (tR)

Améliorer la sensibilité (Meilleur rapport Signal/Bruit)

Time1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00

%

0

100

ACD_120307_NestleP1_NEG_QC01_minusb03 TOF MS ES- TIC

9.03e4

3.76212.0065

2.98261.0087

1.75191.02210.73

149.0142 1.90129.0311

3.85212.0049

4.56187.0133

5.29204.0728

5.64186.1170

8.61371.2094

6.44415.1971

6.82569.3440

8.81344.1531

Time (minutes)

m/z Total signal

intensity

Profile LC-MS d’un échantillon urinaire

40 12/01/2018 Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3


Couplage avec les méthodes séparatives

Mobilité ionique et SM



Chouinard CD, Wei MS, Beekman CR, Kemperman RH, Yost RA. Ion Mobility in Clinical Analysis: Current Progress and

Future Perspectives. Clin Chem. 2016 Jan;62(1):124-33

Une dimension séparative supplémentaire !!

Mobilité ionique et SM



Chouinard CD, Wei MS, Beekman CR, Kemperman RH, Yost RA. Ion Mobility in Clinical Analysis: Current Progress and

Future Perspectives. Clin Chem. 2016 Jan;62(1):124-33

Séparation des isomères !!

Analyse multidimensionnelle



C1

C4

C3

C2

Concentration Area

A1

A2

A3

A4

C1 C2 C3 C4

A1

A2

A3

A4

Concentration

Air

e d

e p

ic

Courbe de calibration

Calibration sans standard interne

Quantification / Etalonnage Externe



C1

C4

C3

C2

Concentration Aire

A1

A2

A3

A4

C1/CIS C2 /CIS C3 /CIS C4 /CIS

A1/AIS

A2 /AIS

A3 /AIS

A4 /AIS

Concentration de l’analyte /

Concentration du standard interne

Air

e d

e l’a

naly

te /

Air

e d

u s

tandard

inte

rn

Courbe de calibration Analyte Standard

Interne

CIS

CIS

CIS

CIS

AIS

AIS

AIS

AIS

Calibration avec standard interne



Quantification / Etalonnage interne

Le résultat n’est pas affecté par les fluctuations des volumes injectés.

10 µL injectés

9 µL injectés

CX / CIS

AX / AIS

X IS

X IS

Même

ratio

Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3 Spectrométrie de Masse

46 14/01/2016


Avantages du standard interne

47

Rendement100%

CX / CIS

X IS

X IS

Le résultat n’est pas affecté par le rendement d’extraction et de traitement d’echantillon (Dérivatization).

Avantages du standard interne

Rendement90%

AX / AIS

Même

ratio

Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3 Spectrométrie de Masse

14/01/2016


La spectrométrie de masse

Applications cliniques



Applications : Hormonologie



Applications : Protéines



Sylvain et al. Clinica Chimica Acta Volume 467, April 2017, Pages 51-58

http://www.sciencedirect.com/science/journal/00098981





Applications : MHM / Acides aminés



Séparation chromatographique

(LC)

Détection MS/MS Quantification

Applications : MHM / Acides organiques




(GC)

Détection MS

Identification

(Bases de Données)

Quantification

Applications : MHM / Acides organiques



Applications : MHM / Acylcarnitines



Introduction directe

ou


(LC)

Détection MS

ou

MS/MS

Profile

Quantification

Ion précurseur

TransitionsMRM



Sci Transl Med 17 July 2013: Vol. 5, Issue 194, p. 194ra93

Applications : Diagnostic en temps réel



The iKnife – Real time mass spectrometry based diagnosis


Applications : Diagnostic en temps réel



The iKnife – Real time metabolomics


Applications

Applications



Example Oncologie

Imagerie Anatomie Pathologique : iKnif

Applications : Biologie Délocalisée (POCT)



Ferreira CR, Yannell KE, Jarmusch AK, Pirro V, Ouyang Z, Cooks RG (2016) Ambient Ionization Mass Spectrometry for Point-of-Care Diagnostics and

Other Clinical Measurements. Clinical chemistry 62:99-110

Applications



Mobility Ionique : BreathOmics

Bos LD, Sterk PJ, Fowler SJ. Breathomics in the setting of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. J Allergy Clin Immunol. 2016 Oct;138(4):970-976

Conclusion



La spectrométrie de masse est une technique qui permet de mesurer

les molécules dans la phase gazeuse

Un spectromètre de masse possède trois parties principale :

la source d'ions (ionisation)

analyseur de masse

détecteur

Analyseurs de masse varient en spécificité, la sensibilité, coût et

facilité de utilisation

Choisis en fonction de des applications souhaitées

Formation technique spécifique ++++++

spectrométrie de masse

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