Cours Spectrométrie de Masse

L’ionisation par électropray : l’ESI

Cours ESBS

Oct 2010

Sarah CIANFERANI

Institut Pluridisciplinaire Hubert Curien (IPHC)Laboratoire de Spectrométrie de Masse BioOrganique

Dir : Alain Van DorsselaerUMR 7178 CNRS - Université de Strasbourg

Tel: 03 68 85 26 79sarah.cianferani@unistra.fr

Les Sources d’Ionisation les plus utilisées

Ionisation à Impact électronique (IE)

Ionisation Chimique (IC)

Ionisation par bombardement d’ions ou d’atomes rapides(LSIMS ou FAB)

Petites molécules volatiles et thermostables

molécules < 6000 Da

Biomolécules (1 300 kDa) et complexes non-covalents, protéomique

Ionisation par électronébullisation (électrospray ES ou ESI)

Désorption/Ionisation Laser assistée par Matrice (MALDI)

DURES

DOUCES

ASSEZ DOUCES

Deux méthodes d’ionisation des biomolécules particulièrement efficaces et sensibles ont été inventées dans les années 90 et constamment améliorées : le MALDI et l’ESI (ElectroSpray Ionisation).

L’ESI a les caractéristiques suivantes :- nécessite une introduction de l’échantillon en solution- génère des ions multichargés (analyse de protéines)- fonctionne à pression atmosphérique- souvent associée à un analyseur quadrupolaire, à temps de

vol ou à trappe d’ions.

L’ionisation par électropray : l’ESI

La source ES : historique

- jusqu’en 1987 : limite de poids moléculaire des composés analysables par MS : 35000 Da dans les cas les plus favorables- depuis 1988-89 : apparition de la technique d’ionisation par électronébulisation (electrospray) et possibilité d’analyser des composés de plusieurs centaines a plusieurs millions de Da) - 2002 :John. B. FENN : Prix Nobel pour le développement de la technique d’ionisation pour l’analyse des biomolécules

(1) Electrospray interface for liquid chromatographs and mass spectrometers

Whitehouse C.M., Dreyer R.N. Yamashita M. and Fenn J.B.

Anal. Chem. 57, 675-679 (1985)

2) Interpreting mass spectra of multiple charged ions

Mann M., Meng C.K. and Fenn J.B. Anal. Chem. 61, 1702-1708, (1989)

Principe de l’ionisation Electrospray (ES)

L’ionisation ES repose sur l’introduction d’une solution aqueuse du composé à analyser par un capillaire métallique très fin porté à un haut potentiel

Cette tension crée des charges dans la solution

A la sortie du capillaire, on a un « nébulisat » (spray) de gouttelettes (1 m) favorisé par une assistance pneumatique

L’ionisation par électrospray: ESI- génère des ions multichargés- souvent associée à un analyseur quadrupolaire, à temps de vol ou à trappe d’ions.

Structure d’une source d’ionisation Electrospray (ES)

Une source d’ionisation par ES est composée : - d’un capillaire dans lequel est injecté l’échantillon à analyser en solution- d’un ensemble de lentilles électrostatiques permettant de transférer les ions de la zone à

pression atmosphérique vers la zone dans laquelle règne un vide poussé

V = 3000V

3 à 5 l/min

cap. métal (75 m)+ +

+ ++

+ ++

+ ++

+ ++ TOF D

Electrospray:Formation de gouttelettes chargéescontenant la protéine

Zone de désolvatation

Zone de focalisation des ions

Analyse des produits en fonction de leur rapport m/z

L’ionisation ES est un processus qui a lieu : - à température ambiante- à pression atmosphérique (ambiante)- sous l’action d’un champ électrique

L’ionisation ES génère des ions multichargés

Elle est basée sur un processus électrolytique de : H2O H+ + OH-

Elle se fait à pression atmosphérique, à température ambiante

L’ionisation par électronébulisation (electrospray): ES+

Solution

Capillaire métallique(appauvri en électrons)

++++

++++++

++

++++++

++ ++ -------- -- -- -- --

--++

++++++ ++

Générateur de

haute tension

++ --

-- +++

+++ ++

e-

D

Contre électrode

SM

Cône

Cône de Taylor

Certains OH - sont attirés, puis neutralisés par le capillaire métallique: OH - OH.

Avec un voltage positif sur le capillaire on génère donc des gouttelettes chargées positivement à cause d’un excès de protons qui se fixent les sites protonables.

L’ionisation électrospray : principe de la production du spray

Débit imposé

par une pompe

Tube capillaire

0 volt

+ 2000 volts

+ 3000 volts

…………

Emission d’un spray visible à la loupe. Ces gouttelettes sont expulsées, sèchent, entament des fissions, et génèrent des ions désolvatés.

Le volume électronébulisé doit être égal au volume apporté par la pompe.

Effet de pointe qui entraîne

la déformation du liquide

en gouttelettes chargées

Champ électrique qui agit sur le liquide chargé

Electrospray: Formation de gouttelettes chargées

sous l’effet d’un champ électrique

L’ionisation électrospray : mécanisme de formation des ions

Émission d’un spray visible à la loupe.

Ces gouttelettes sont expulsées,

sèchent, entament des fissions,

et génèrent des ions désolvatés

L’ionisation / désorption par ESI génère des ions en phase gazeuse en 3 étapes:

1- production de gouttelettes chargées à partir de l’électrolyte en solution

2- fissions des gouttelettes chargées en gouttelettes plus petites

3- « transfert » des ions en phase gazeuse 

Réduction de taille, mais nombre

de charges électriques constant

(explosions coulombiennes)

…………

+ +

+ ++ ++ +

++++

Evaporation du solvant

+

L’ionisation électrospray : mécanisme

Au cours du trajet des ions dans le spectromètre de masse, il y a évaporation du solvant des gouttelettes.

- diminution de la taille de la gouttelette- et augmentation parallèle de la densité de charges au sein de la gouttelette

Il y a un équilibre entre tension de surface de la gouttelette et forces de répulsions coulombiennes. Plus le solvant s’évapore, plus les forces de répulsion coulombiennes sont importantes.

lorsque forces de répulsion coulombiennes > tension superficielle il y a explosion de la gouttelette en une gouttelette plus petite

Au delà d’un certaine limite appelée limite/diamètre de Rayleigh, on observe une fission des gouttelettes en gouttelettes de plus petites taille.

Après plusieurs étapes de fissions/explosions, la densité de charge dans la gouttelette devient telle que le champ électrique local très intense conduit à le désorption des ions par effet de champ.

Il se forme alors des ions solvatés constitués de l’ion analyte entouré de molécules de solvant et de nombreuses charges. L’évaporation des dernières molécules de solvant permet d’obtenir un ion désolvaté contenant n charges, i.e. nH+ : on parle d’ions multichargés

L’ionisation électrospray : importance du débit pour la sensibilité

…………Débit de la pompeDébit du spray

•Le débit auquel un électrospray fonctionne a une importance capitale pour la sensibilité.

•L’intensité du courant d’ions produit dépend de la concentration de la solution et non pas du débit auquel la solution est injectée

•Il vaut donc mieux injecter une solution concentrée au débit le plus faible possible

L’électrospray est concentration – dépendant

L’ionisation électrospray : débit élevés et débits faibles

…………Débit de la pompeDébit du spray

• DEBITS ELEVES (1 - 200 microlitres par minute)

En « électrospray pur », il est difficile de dépasser débit de plus de 1 microlitre par minute. Pour des débits supérieurs, il faut une assistance pneumatique à la nébulisation.

• DEBITS FAIBLES (moins de 1 microlitre par minute)

Plus l’orifice qui émet le spray est petit, plus le débit du spray est faible.

Aux très faibles débits (moins de 200 nanolitres par minute), il n’est même plus nécessaire de pousser avec une pompe; l’aspiration électrostatique suffit à assurer le débit (nano spray)

Pour avoir un spray stable, le volume électronébulisé doit être égal ou volume de solution apporté par la pompe.

L’ionisation électrospray : pour les débits de spray élevés, il faut une assistance à la

nébulisation (1 à 200 microlitres /min.)

Pour dépasser un débit de 1 microlitre par minute, il faut une assistance pneumatique à la nébulisation.

…………

Flux

d’azote comprimé

…………

Capillaire d’environ 100 micronsde diamètre intérieur

Débit de la pompe

Débit de la pompe

Des gouttelettes sont arrachées

à la surface du cône de liquide.

Le système de "canne" d'introduction ESI

Extrémité de canne d'introduction MICROMASS, montrant le capillaire en quartz qui amène le solution (75 microns de diamètre intérieur).

Le gaz de nébulisation(azote) est améné de façon concentrique par le tube en métal. La tension de 3 à 4000 volts est appliquée sur le métal.

Le tube de quartz ne doit dépasser que de 0,5mm.

Le système de "canne" d'introduction ESI

L’ESI convient bien aux débits inférieurs à 1 µL/min.

Débit de la pompe …………Débit du spray:

de 0,1 à 1 µL/minMICRO SPRAY : capillaire de faible diamètre

(20 à 75 microns)

…….…………

Orifice réduit (1 à 3 microns)

NANO-SPRAY : selon Mann et al.

D’autres nano-systèmes automatisés permettent des débits de quelques nano-litres par minutes (Advion,…)

(Nano LC-MS)

Débit du spray:

de 1 à 200 nanoL/min

1 - 4 m

E trop faible E

spray instable

E correct

spray stable

Capillaire nanospray vide

L’ESI convient bien aux débits inférieurs à 1 µL/min.

Features

•400 identical microfabricated nozzles

•Integrated grounded silicon electrode provides a high, uniform electric field equivalent to a 2-mm pulled capillary

Des puces microfluidiques de nanoES : ESI Chip™(Advion)

Avec une source ESI, l'analyseur peut être:

• Un quadrupôle Le moins cher et le plus facile

• Une trappe d'ions MS-MS facile et pas cher

• Un temps de vol Meilleure résolution qu'un quadrupôle

• Un appareil magnétique Difficile et cher, mais 20000 de résolution

• Un FT-ICR Cher, difficile et lent, mais très haute résolution

Avantages de l’électrospray

- fonctionne à basse T°C, à pression atmosphérique,

donc peu d ’énergie interne communiquée aux ions

pas de dégradation, les liaisons covalentes ne sont pas rompues

- mesure précise de la masse moléculaire (0.1%) soit ± 1 Da sur M = 10000 Da

- permet d ’extraire des ions de large masse moléculaire (polymère, biomolécule)

- sensible (C M)

- permet d’extraire des molécules polaires

Inconvénients de l’électrospray

- fournit peu d’information sur la structure, sauf si on effectue de la MS/MS

- très sensible à la présence de sels ou additifs suppression du signal

dessalage impératif

Effet d’agents contaminants pour l’analyse par ES-MS

Le signal en ES est très sensible à la présence, même à faible concentration, d’agents contaminants tels que :

- les sels inorganiques (Na, K, etc…) > 1mM

- les tampons non volatils (Tris, CHAPS, HEPES, phosphates, citrates, etc…)

- les surfactants et les détergents (SDS, Triton, Tween, NP40, etc…) > 0.05%

- les agents chaotropes (urée, sels de guanidine, etc…)

- les solvants non volatils (glycérol, etc…)

Effet d’agents contaminants pour l’analyse par ES-MS

- Phénomène de compétition à l’ionisation : la présence de ces agents induits une suppression de l’analyte

- Formation d’adduits pour les contaminants faiblement volatils

- Neutralisation de la charge portée par l’analyte (ex : SDS)

- Modification de la tension de surface de la solution (détergents, glycérol)

I mes A

kA [A+]

kA [A+] + kB [B+] = I

Courant mesuré pour A

k : efficacité d’ionisation

Courant ionique produit en source

Effet d’agents contaminants pour l’analyse par ES-MS

400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500m/z0

100

%

0

100

%

z15978ss 1 (0.067) TOF MS ES+ 60.2477.25

475.23

411.44

499.23

737.36

715.38500.24 738.36

975.45

z16040ss 1 (0.067) TOF MS ES+ 213A5

1027.99

A6856.77

A41284.791034.18

Ncp7 (10 M) dans un tampon HEPES

Ncp7 (10 M) dans H2O

Na+

Na+

Na++ HEPES

238 Da

+ HEPES

(HEPES)2

+ HEPES

L’ionisation par électrospray permet la mesure de masse de molécules très grosses.

• Mesurer des masses moléculaires très élevées est possible grâce à une caractéristique unique de l'ESI : ce mode d'ionisation génère des ions multichargés.

• Pour mesurer des masses moléculaires élevées, il n'est donc pas nécessaire de disposer d'un analyseur à gamme de balayage m/z élevée.

• La résolution de l'analyseur sera une caractéristique importante pour la mesure, soit des masses moyennes (chimiques) soit des masses monoisotopiques.

m/z

500.5

501.5

502.5

m/z=1

La différence de masse apportée par la présence d’1 isotope est de 1 Da

donc le rapport m/z varie de 1/z

Si z=1 m/z=1

z=2 m/z=0.5

z=3 m/z=0.33 etc

m/z0

100

%

z charges

Comment déterminer l’état de charge du composé étudié à partir du spectre de masse ES

On se sert des profils isotopiques

m/z

500.5

501.5

502.5

m/z=1

Si z=1 alors au niveau du profil isotopique m/z=1/1 = 1

z=2 m/z=1/2 = 0.5

z=3 m/z=1/3 = 0.33 etc …..

Comment déterminer l’état de charge du composé étudié à partir du spectre de masse ES

Entre 2 isotopes, m/z = 1

12C1H16O14N35Cl79Br

13C15N

18O37Cl81Br

m/z

500.0

501.0

502.0

m/z=1

Ici m/z= 1 : on en déduit que ce pic est 1x chargé (monochargé)

Comment déterminer l’état de charge du composé étudié à partir du spectre de masse ES

On en déduit la masse monoisotopique du composé

M= (500.0x1) – 1 = 499 Da

m/z

500.0

500.5

501.0

m/z=0.5

Ici m/z= 0.5 : on en déduit que ce pic est 2x chargé (dichargé)

Comment déterminer l’état de charge du composé étudié à partir du spectre de masse ES

On en déduit la masse monoisotopique du composé

M= (500.0x2) – 2 = 998 Da

600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500 2600 2700 2800 2900m/z0

100

%

670 671 672 673m/z0

100

%

671.32

671.84

672.35

1341 1342 1343 1344 1345 1346m/z0

100

%

1341.65

1342.62

1343.58

Spectre ESI d’un peptide de masse monoisotopique 1340,6 Daavec résolution isotopique sur les ions à une et deux charges

[M + H] +

Massif isotopique

monochargé

[M + 2H] 2+

Massif isotopique

Dichargé (différence de 0,5 m/z)

17+

Si réso

Si pas de réso

997 998 999 1000m/z0

100

%

La détection du profil isotopique dépend de la résolution de l’analyseur (Ex de la myoglobine)

On mesure la

masse moyenne

R = 2000

R = 30000

On mesure la

masse

monoisotopique

Détermination de la masse moléculaire par ESI-MS: L'ESI génère des ions multichargés

myo

500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800m/z0

100

%

l1801np 7 (1.028) TOF MS ES+ 9.32e3A20

848.604A21

808.225

A22771.511

A23738.042

A24707.297

616.164

A19893.205 A18

942.742

A17998.161

A161060.454

999.875

A151131.120

A141211.838 A13

1304.991A10

1696.147A11

1542.033A12

1413.609

A: 16951.47 ± 0.28 DaLa masse M et le nombre de charge z sont d’abord calculés à partir de 2 pics.

Ensuite, M est calculée à partir de chacun des pics de la série d’ions multichagés.

Dans cet exemple on observe 15 états de charges différents (10 à 24 charges).

La masse mesurée sera donc le résultat de la moyenne de ces 13 mesures, d’où la grande précision obtenue.

Série d’ions multichargés.

Tous ces pics correspondent à la même molécule, mais avec un nombre de protons différents.

Détermination de la masse moléculaire par ESI-MS:Il faut d’abord déterminer les valeurs de z

myo

500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800m/z0

100

%

l1801np 7 (1.028) TOF MS ES+ 9.32e3A20

848.604A21

808.225

A22771.511

A23738.042

A24707.297

616.164

A19893.205 A18

942.742

A17998.161

A161060.454

999.875

A151131.120

A141211.838 A13

1304.991A10

1696.147A11

1542.033A12

1413.609

A: 16951.47 ± 0.28 Da

m/z

X1 X2

X2 - 1z1 =

X2 - X1

z2 = z1 - 1

X1 =M + z1 mH

z1

X2 =M + z2 mH

z2

Système de 2 équations

à 2 inconnues

Deux pics consécutifs permettent de déterminer M et Z1

Calcul de Z:

Détermination de la masse moléculaire par ESI-MS:Il faut d’abord déterminer les valeurs de z

myo

500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800m/z0

100

%

l1801np 7 (1.028) TOF MS ES+ 9.32e3A20

848.604A21

808.225

A22771.511

A23738.042

A24707.297

616.164

A19893.205 A18

942.742

A17998.161

A161060.454

999.875

A151131.120

A141211.838 A13

1304.991A10

1696.147A11

1542.033A12

1413.609

A: 16951.47 ± 0.28 Da

X1 X2

X2 - 1z1 =

X2 - X1

Calcul de Z:

X1 =M + z1

z1

X2 =M + z2

z2

= 893.205

= 942.742

=942.742 - 1

942.742 – 893.205= 19.01 z1 = 19

m/z z Masse

679,12 25 16953,00

707,31 24 16951,44

737,99 23 16950,77

721,5 22 15851,00

808,28 21 16952,88

848,53 20 16950,60

893,24 19 16952,56

942,67 18 16950,06

998,18 17 16952,06

1060,41 16 16950,56

1130,95 15 16949,25

1211,81 14 16951,34

Moyenne : 16951,65 +/- 0,17 Da

Calcul de la masse moléculaire de la myoglobineà partir de la série d’ions multichargés du spectre ESI

Une fois que les valeurs de z sont déterminées (en résolvant le système d’équation à 2 inconnues M et z), la masse moléculaire de la protéine est recalculée à partir de chaque pic.

La moyenne des valeurs trouvées pour la masse moléculaire est calculée avec une déviation standard.

Plus il y a d’ions multichargés, plus la masse pourra être mesurée avec précision

Les masses calculées sont des masses chimiques et non pas des masses monoisotopiques car la résolution n'est pas suffisante pour séparer les pics isotopiques

L’ionisation ESI est compatible avec une introduction directe ou par chromatographie de l’échantillon

Source Interface Analyseur

Introduction de l ’échantillon:- direct (infusion)- couplage LC

Obtention d ’ions en phase gazeuse

Focalisation et transmission des ions

Séparation des ions en fonction du rapport m/z

Le couplage LC-MS : avec ou sans split

HPLC

rp

DiviseurSM

Détecteur UVCollecte des pics Edman

Mesure de la masse moléculaire

de chaque pic élué10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00

Time0

100

%

0

100

%

1.75

6.63

43.13

31.8524.73

18.43 37.85

41.20

45.98 58.6951.16 63.97

1.75

25.85

21.38

15.89

33.58

30.02

46.0837.85

41.30

51.16

62.1458.6954.11

71.40

Trace UV

Chromatogramme d’ions

400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700

0

100

%

A2

706.3

B2

487.6

452.0

B

973.7707.0

A

1410.9

A: 1410.2 0.4B: 972.9 0.2

m/z

Spectre

Exemples d’instruments ES-MS ou ES-MS/MS

ESI-Q-TOF Synapt with IMS (Waters)

nanoESI-TOF (Waters)

with Triversa nanomate (Advion)

ESI-Q-TOF II (Waters)

ESI-Q-TOF (Bruker)

Applications en ESI-MS

Vérification de structure et de pureté de molécules naturelles ou synthétiques

Contrôle du suivi d’une molécule au cours du temps

Détection et identification de modification

Couplage LC-MS

Complexes non covalents

Informations structurales par MSMS

1- L’ESI permet de mesurer des masses très élevées par ce qu’elle génére des ions multichargés (plusieurs millions de Daltons).

2- L’ESI est très douce. On observe que les ions moléculaires qui ne fragmentent pas.

3- L’ESI permet l’analyse des petites molécules et les massifs isotopiques permettent de déterminer l’état de charge des différents ions.

4- L’ESI est compatible avec le couplage LC-MS

A retenir à propos de l’ionisation par électrospray (ESI):