Revue des protocoles

utilisant des animaux

modifiés par génie génétique

Michelle Letarte, PhD

Directeur du comité CPA

Hospital for Sick Children

University of Toronto, Toronto

Définition d’un animal

modifié par génie génétique (GG)

• Tout animal chez qui une modification d’une certaine partie de

l’ADN nucléaire ou mitochondrial a été réalisée par une

intervention technologique humaine volontaire.

• La modification peut être une addition, suppression

ou substitution, soit aléatoire ou ciblée,

d'une certaine portion du matériel génétique.

• Sont inclus les animaux résultant d’un croisement entre un animal

modifié par GG et un animal non-modifié par GG.

• Le term “modifié par GG” reflète mieux la terminologie actuelle

et inclut tous les animaux générés par manipulations génétiques.

Exemples d’animaux modifiés par GG

• Animaux Transgéniques produits par insertion d’ ADN

avec un vecteur viral ou par microinjection pronucléaire.

• Animaux “Knock-out” et “Knock-in” générés par

mutagénèse à l’aide de cellules souches embryonnaires ou

cellules germinatives.

• Animaux générés par Mutation Non-sélective.

Grands projets de mutagénèse chez la souris ou le “poisson

zebra, Danio rerio”. Animaux ou leurs gamètes sont exposés à

des mutagènes avant leur reproduction. Ceci augmente le taux

de mutation naturel pour produire des phénotypes correspondant

à des maladies, par exemple.

Raisons pour considérations

particulières concernant les animaux

dérivés par GG

• La génération, le maintien et l’usage des animaux dérivés par GG pausent des questions d’éthique.

• Possibilité d’effets imprévisibles des phénotypes générés qui pourraient compromettre le bien-être des animaux

- utilisés pour produire la souche modifiée (donneuses d’ovules, mères porteuses ou reproducteurs mâles) à cause des techniques invasives nécessaires.

- de la progéniture des animaux modifiés.

• Nombre élevé d’animaux excédentaires qui doivent être produits pour obtenir un petit nombre avec phénotype désiré.

• Ces animaux doivent être traités en accordance à des règlements fédéraux.

Effets imprévisibles sur le bien-être

de la progéniture des animaux

modifiés par GG

• une perturbation des processus physiologiques des

animaux peut être provoquée

• la nouvelle souche animale peut être mal adaptée à

son environnement

• des modifications imprévues du génotype ou du

phénotype peuvent se produire

• des techniques invasives sont nécessaires pour

déterminer le génotype (p. ex., les échantillons de

tissu).

Bien-être Animal:

“Accorder aux animaux la dignité naturelle qui leur est due en tant que créatures vivantes et conscientes”

De Hollands (1980) et des Lignes directrices et politiques du CCPA sur les protocoles d'utilisation d'animaux d'expérimentation

• Des évaluations formelles du bien-être animal doivent faire

partie de la caractérisation du phénotype des animaux modifiés par GG. Un protocole d'évaluation du bien-être d'un animal modifié par GG permettra de :

• révéler des besoins spécifiques ou des problèmes chez la souche;

• déterminer des besoins pour la manipulation, l'hébergement et l'élevage;

• contribuer au raffinement du modèle en recommandant des points limites éthiquement acceptables et pertinents;

• prévenir la répétition de modèles déjà développés.

L'évaluation du bien-être

des animaux modifiés par GG

Les animaux modifiés par GG

doivent être traités en accord

avec le Guide de Recherche des trois R

• Alternatives de Remplacement, Réduction, et Raffinement (de Russell & Burch) sont les trois principes de base des bonnes pratiques animales en science, couverts par CCPA.

• Les comités de protection des animaux (CPA) et les chercheurs doivent considérer les particularités de chaque animal modifié par GG, qui pourraient affecter leur bien-être.

• Ils doivent être sensibilisés aux questions d’éthique et aux changements technologiques dans un domaine qui évolue rapidement. (Experts sur les CPA).

Lorsque les chercheurs envisagent l'utilisation de ces animaux,

ils doivent considérer les alternatives suivantes:

1) utiliser des embryons modifiés par GG in vitro plutôt que les implanter

chez des animaux receveurs (Réduction)

2) tester in vitro les effets du GG sur la différenciation cellulaire et

tissulaire dans les cellules souches embryonnaires, en utilisant la

génomique et la protéomique, ainsi que d'autres technologies

émergentes (Réduction et Remplacement)

3) effectuer des études pilotes afin de démontrer que les animaux

modifiés par GG proposés répondent aux fins scientifiques (Réduction)

Les stratégies des Trois R

et la production d'animaux modifiés par GG

Lorsque les chercheurs envisagent l'utilisation de ces animaux,

ils doivent considérer les alternatives suivantes:

4) utiliser des couples d'animaux reproducteurs homozygotes afin de

réduire le nombre de petits qui ne possèdent pas la mutation voulue

ou qui sont stériles (Réduction)

5) utiliser des reproducteurs hétérozygotes lorsque les taux de

morbidité ou mortalité sont inacceptables chez les homozygotes,

ou que ces derniers sont atteints de maladies chroniques

(Raffinement)

6) recourir à des techniques améliorées de prélèvement de tissus,

de détermination du génotype, et d'identification individuelle des

animaux (Raffinement)

Les stratégies des Trois R

et la production d'animaux modifiés par GG

Les stratégies des Trois R

et la production d'animaux modifiés par GG

Lorsque les chercheurs envisagent l'utilisation de ces animaux, ils doivent considérer les alternatives suivantes: 7) utiliser des systèmes d'induction de knock-out ou de knock-in,

de sorte que l'expression du phénotype puisse être contrôlée et seulement induite pour une période d’étude précise

(Réduction et Raffinement)

8) recourir à des stratégies qui maximisent l'utilisation d'animaux excédentaires (Réduction et Raffinement)

9) utiliser des approches complémentaires, comme l'informatique, les puces à ADN, les études de population, les organismes inférieurs, les embryons et les cultures de cellules, de tissus et d'organes (Remplacement, Réduction et Raffinement)

Considérations pour les comités de

protection des animaux (CPA)

• Est-il adéquat de générer par GG les animaux proposés?

• Les animaux sont-ils testés de façon optimale,

incluant le génotype?

• Le bien-être des animaux est-il considéré de façon adéquate?

• La génération d’animaux est-elle gérée de façon efficace?

Est-il adéquat de générer par GG

les animaux proposés?

• As-t’on discuté d’ Alternatives possibles? In vitro?

• Est-ce que la génération d’une nouvelle souche est nécessaire? (Justification et objectifs du protocole)

• Est-ce que la nouvelle souche va répondre à une question biologique ou clinique importante ?

• Revue de littérature pour s’assurer que la souche n’est pas déjà

disponible ?

• Checheurs devraient publier la disponibilité et les caractéristiques

des animaux modifiés par GG dans des banques de données

internationales The International Mouse Strain Resource (IMSR)

(http://www.informatics.jax.org/imsr/index.jsp)

Les animaux sont-ils testés

de façon optimale?

• Les constructions d’ ADN ont-elles été vérifiées in vitro pour s’assurer de leur qualité et exactitude?

• Quelles méthodes ont été proposées pour déterminer

le phénotype pendant la croissance et chez les

animaux adultes?

• A-t’on considéré des méthodes non-effractives (“non-invasive such as imaging”) qui évitent de sacrifier les animaux et permettent de surveiller l’évolution des phénotypes?

Est-ce que le génotype est testé

de façon optimale?

• Les méthodes les plus “humaines” et le nombre minimal d’animaux requis pour générer les données nécessaires.

• Balance entre moins d’animaux et collections répétées; la réduction du nombre d’animaux ne doit pas impliquer plus de douleurs infligées à moins d’animaux.

• Minimiser le tissu nécessaire en se servant de prélèvements pour identification (ear punching, fin clipping).

• Utiliser le PCR autant que possible (< Southern blot).

• Queue de souris à 3 ou 4 semaines, < 5 mm, avec analgésique.

Le bien-être des animaux est-il

considéré de façon adéquate?

• Le comité CPA doit peser:

-les douleurs infligées aux animaux contre

les bénéfices potentiels pour les humains et autres espèces de l’étude de la nouvelle souche.

• Le bien-être des animaux dérivés par GG doit être considéré en tout temps.

-Ceci couvre plus que l’absence de douleur et détresse.

Il faut évaluer le fonctionnement biologique,

le comportement naturel,

les états positifs et négatifs du bien-être physique et mental.

• Les mesures nécessaires utilisées pour améliorer les effets négatifs de la modification génétique?

Reproduction

Phénotype

Génération

Procédures

Expérimentales

Evaluation du bien-être

Surveillance des animaux modifiés par GG

- Toute information pertinente au phénotype doit être partagée

avec le CPA et le personnel du vivarium afin que les soins

appropriés soient dispensés.

- Indiquer la bonne catégorie de techniques invasives,

considérant les effets du GG sur le phénotype et les

procédures expérimentales.

Evolution du phénotype dans les générations

successives d’animaux modifiés par GG

demande une surveillance continue

Comment gérer les colonies d’animaux

modifiés par GG?

• De façon efficace en suivant les principes nécessaires de réduction et raffinement pour maintenir au minimum le nombre d’animaux générés et testés.

• Reproduction des Homozygotes versus Hétérozygotes.

• Il faut être très vigilant car de grands nombres d’animaux modifiés par GG sont générés, créant de larges colonies et demandant beaucoup d’espace.

Les comités ACP doivent s’assurer

que les animaux générés par GG

soient traités de façon humaine

dans leur utilisation en recherche,

enseignement et tests réglementaires

- GG génère un surplus d’animaux qui doivent être contrôlés de façon rigoureuse

- Douleur et détresse causées par les nouveaux phénotypes peuvent compromettre le bien-être animal

- N’oubliez pas les 3 R