pourquoi un diagnostic du paludisme ?

Pourquoi un diagnosticdu paludisme ?

Bénéfice pour le maladeBénéfice pour la communauté Adaptation du traitement Maîtrise des résistances

Comment ?

Diagnostic de présomptionDiagnostic direct

MicroscopieQBCTest rapide ou «dipstick»PCR

Diagnostic indirect ou sérologique

1 . Diagnostic présomptif

CirconstancesEléments d’orientation

EpidémiologiquesCliniques Biologiques

AvantagesInconvénients

2. Diagnostic direct

Se fait à partir du sang

Quand effectuer le prélèvement ?Combien de prélèvements ? Procédure et précautions

Au moment du prélèvement : gants, matériel jetable, etc.Transport des prélèvements Traitement au laboratoire

1 Mise en évidence du parasite :MicroscopieQuantitative Buffy Coat (QBC)Cytométrie de flux

2 Mise en évidence d’ag parasitaireTest rapide sur bandelette (dipstick)ELISA, RIA

3 Mise en évidence d’ADN parasitairePCRSondes nucléiques

2. Diagnostic direct

2.1.a Microscopie

La goutte épaisse et le frottisRéalisation pratique

La colorationGiemsaAutres colorations

Points techniques importants

2.1.a Microscopie

La lecture au microscopeSensibilité de la méthode et expression de la densité parasitaire

Pour 100 champs de microscope soit 10 min. de lecture nb de GR nb de GB volume examiné sensibilité

Frottis 5x 10 4 60 0,01 µl 100-200 para /µl

Goutte épaisse 1x 10 6 1200 0,2 µl 10-20 para /µl

1 µl de sang il y a environ 5 000 000 de GR et 6000 GB

2.1.a Microscopie

La lecture au microscopeLes formes parasitaires

2.1.a Microscopie

La lecture au microscope

Les espèces parasitaires Pf, Pv, Po, Pm

Distribution hétérogène

Diagnostic d’espèce sur la base de critères morphologiques

2.1.a Microscopie

AvantagesFaible coût

Morphologie (stades, espèces)

Bonne sensibilité

Quantitatif

Lecture rétrospective

2.1.a Microscopie

InconvénientsDélai

Personnel expérimenté

Equipement

Problème des infections mixtes

2.1.b QBC

PrincipeSang au bout du doigt Tube capillaire+Acridine OCentrifugation Lecture microscope UV

FLUORESCENCE

SensibilitéVolume examiné : 60 µl vs 0.2 µl GESensibilité 1 para/µl

2.1.b QBC

P vivax P falciparum

P falciparum P vivax+ granulocytes Pf gametocyte

2.1.b QBC

AvantagesRapidité Bonne sensibilité

InconvénientsToxicité de l’acridine, coût élevé Equipements Personnel expérimenté Pas approprié au terrainPas quantitatif, espèces ?

2.1.c Cytométrie

Marquage des cellules avec un colorant fluorescent : Hoechst ou thiazole orange Tri des cellules en fonction de la fluorescence et de la taille Evaluation de la parasitémie. Très bonne sensibilité mais bruit de fond important dû aux réticulocytes Utilisée couplée avec immunofluorescencede surface pour analyse phénotypique GRP

2.2.a Test Rapid «Dipstick»

Principe : Détection d’antigènes parasitaires par immunochromatographie

Récolte du sang au bout du doigtLyse du sang Migration des antigènes libérés Détection avec un ou plusieurs Acmx marqués


Quels antigènes ?

HRPIIP.falciparum (ICT, ParaSight, ParaCheck) Trophozoites et jeunes gamétocytesFonction de détoxification de l’hème ?

pLDHAntigène non spécifique (OptiMal)Tous les stades

Autres utilisationsAlternative aux méthodes isotopiques


Sensibilité

>95% (comparé à la microscopie 100%) 100 % pour Pf pour des densités >300

p/µl Sensibilité moindre pour Pv (autres

espèces ?)


Spécificité Autour de 90%

Faux positifs (HRPII essentiellement)


Avantages

Rapide : 5 min.Peut être réalisé sans expérience Bonne sensibilité et bonne spécificité Ne nécessite pas d’équipements

spécifiquesAdapté au terrain


Inconvénients

Coût : 1-2 USD.Pas quantitatif Ne distingue pas Pv des autres espèces Stabilité des réactifs sur le terrain ?Nombre important de faux positifsNe donne pas d’indication sur la

viabilité des parasites

2.2.a Test Rapid«Dipstick»

2.2.b RIA et ELISA

Principe : Détection d’antigènes para-sitaires

Utilisation d’anticorps monoclonaux

Technique en « sandwich »

Pas d’intérêt réel pour le diagnostic

Utilisables pour la détection de sporozoites chez les vecteurs

2.3 Diagnostic Moléculaire

Principe

ADN du parasite

PCR et /ou hybridation

Choix de séquences cibles avec régions polymorphes et conservées

Analyse

2.3.a Diagnostic Moléculaire

SSUrRNA genes

1

2

Spécifiquesde genre

Spécifiques d’espèces

P . falciparum

P. vivax

P. malariae

P. ovale

P. sp

PRIMAIRE

SECONDAIRES

DIAGNOSTIC PAR PCR


1. Amplification spécifique de genre

Pf Pv Po PM

Sec

1 2 3 4 5 6

Pri

V M F O


2. Amplifications spécifiques d’espèce


Avantages Petit prélèvement : «blood spot» ADN utilisable pour génotypage, clonage … Caractérisation fine par séquençage Bonne sensibilité : 1-3 parasites par µlBonne spécificité : proche de 100 %Détection de formes parasitaires atypiques Etudes rétrospectivesPartiellement automatisable Semi-quantitatif


Inconvénients

Temps nécessaire pour l’analyse Coût Equipement Bonne technicité (contaminations)

2.3.b Sondes Moléculaires

Principe Extraction ADN «Spotting »Dénaturation / neutralisation Hybridation avec des sondes

marquéesLecture

CommentairesSéquences répétées SSurRNA, rep 20

ou Tel Quantités importantes d’ADN

Parasites Ag parasitaires ADN Méthodes Microscopie QBC HRPII pLDH PCR Expertise +++ ++ - - ++++ Equipement + +++ - - ++++ Temps ++ + - - ++++ Diagnostic d'espèce +++ + Pf Pf /non Pf ++++Adaptation terrain + - ++++ ++++ - Enquêtes +++ - - - ++++Quantification ++++ + - - + +Sensibilité +++ +++ ++ ++ ++++Spécificité +++ + + ++ ++++Standardisation Meth +++ ++ ++ ++ + Coût (USD) 0,05 2,0-4,0 2 2 2

Comparaison des méthodes

Points forts Points faibles Intermédiaire

Principe :

Recherche d’anticorps spécifiques

Détection du complexe ag/ac par 1 . Immunofluorescence indirecte 2 . Elisa3 . Radioimmunoanalyse 4 . Test sérologique sur bandelette

3. Diagnostic sérologique

Parasites fixés à l’airou à l’acétone

Dilutions du sérum

Anti-anticorps fluorescent

Mesure de l’extinction de la fluorescence : titre en Ac spécifiques

3.1 IF indirecte

Ag parasitaire brut, ou fraction purifiée, ou peptide synthétique

Dilutions du sérum

Anti-anticorps marqué par un enzyme

Révélation de l’activité enzymatique

Mesure des DO

Titre en anticorps spécifiques parrapport à un seuil.

3.2 ELISA

3. 3 ELISA

Exemple d’inhibitionde la réactivitéd’anticorps spécifiquesAnti-CSP par le peptidesynthétique homologue Pf et par le peptide hétérologue Pm correspondant

Comparable aux autres tests dans la conception :

Gamme de dilutions des sérums

Anti-anticorps marqué avec isotope *

Mesure des cpm

Titre en Ac spécifiques par rapportà un seuil

3. 3 RIA

Format « dipstick »

Détection qualitative des Ac spécifiques dans le sang, plasma ou sérum.

Spécifique pour Pv et Pf

Sensibilisation du support avec les Ag CSP et MSP1

Enquêtes épidémiologiques

3.3 Dipsticks pour sérologie

Pas d’intérêt pour le diagnostic sauf :

Criblage des donneurs de sang

Complément d’information chez un patient suspecté de paludisme mais avec gouttes épaisses négatives

Diagnostic d’espèce rétrospectif

3.4 Utilité de la sérologie ?

PISTES DE RECHERCHE

Améliorations possibles

Tests rapides

Lecture quantitativeCaractérisation des espècesAméliorer la sensibilité et la spécificité Instaurer un contrôle qualitéDévelopper une banque de réactifs pour

tester la qualité des « dispticks »Combiner sur la même bandelette un

diagnostic paludisme et Dengue

PISTES DE RECHERCHE

Améliorations possibles

PCR

Standardiser la méthode Développer un kit PCR de diagnostic Automatiser la méthode pour des

études à grande échelle

PISTES DE RECHERCHE

Recherche

Tests rapides

Etudier la persistances des antigènes HRPII et pLDH après le traitement.

Etudier le polymorphisme HRPII et pLDHchez des parasites sauvages.

Développer d’autres systèmes antigéniques pour la détection spécifique des stades asexués et sexués

PISTES DE RECHERCHE

Recherche

Tests rapides

Evaluer la possibilité de mise au point d’un test rapide pour déterminer la sensibilité d’un isolats à un médicament

Etudier la durée de validité des « dipsticks » dans les conditions du terrain

pourquoi un diagnostic du paludisme ?

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