partiel n° 2 techniques d’analyses spectrale &...

T.A.S.S. 2BIO 24/04/2014

ETSL, 95 rue du Dessous des Berges, 75 013 PARIS 1/7

Partiel n° 2

Techniques d’Analyses Spectrale & Séparative (2h00)

Documents non autorisés - Calculatrice autorisée Justifier les calculs

Séparer calcul littéral et numérique

Technique d’analyse spectrale Questions de cours : (6 points) 1) Dans un spectre IR, préciser à quelle grandeur physique correspond l'abscisse ? Même question pour l'ordonnée. 2) Dans un spectre IR, comment apparaissent les bandes d'absorption ? 3) Quel est le domaine du MIR (en nombre d'onde) ? Préciser le nom particulier de la région spectrale située en-dessous de 1300 cm-1. 4) On peut décrire la vibration moléculaire entre deux atomes, à l'aide du modèle classique de l'oscillateur harmonique. - a - Rappeler en quoi consiste ce modèle. - b - Le nombre d'onde de vibration entre deux atomes de carbone dans la fonction alcène est σ0 = 1650 cm-1. Déterminer la constante de force correspondante kC=C. Comment évolue cette constante de force entre les deux atomes de carbone dans la fonction alcane et dans la fonction alcyne ? Données : nombre d'Avogadro : NA = 6,02.1023 mol-1 Masse molaire du carbone : M(C) = 12,0 g.mol-1 Célérité de la lumière : c = 3,00.108 m.s-1. 5) Dans la pratique, la plupart du temps les échantillons à analyser sont analysé à l'aide d'un spectrophotomètre IRTF.

- a - Indiquer ce que veut dire l'acronyme IRTF. Quel type de signal brut fourni ce type d'appareil (donner son nom) ?

- b - Quel est l'intérêt de la transformée de Fourier ? - c - Compléter le synoptique d'un tel appareil (rendre l'annexe n° 1), en indiquant l'endroit où se trouve la source IR, la séparatrice, le miroir mobile, le miroir fixe, le compartiment échantillon et le détecteur. (entourer clairement sur l'annexe, l'interféromètre de Michelson)

T.A.S.S. 2BIO 24/04/2014


Exercice 1 : Synthèse du chlorobenzène à partir de l'aniline (5 points)

Le chlorobenzène est préparé en deux étapes à partir de l’aniline : diazotation de l’aniline puis réaction de Sandmeyer. La réaction précédente permet d'obtenir le chlorobenzène. Pour purifier ce dernier, on effectue une hydrodistillation.

Figure.1 Aniline

Figure.2 Chlorobenzène

1/ L'aniline est sous forme d'un liquide transparent. Indiquer deux techniques expérimentales permettant de réaliser le spectre de ce composé en spectrophotométrie infrarouge, en précisant le mode opératoire. 2/ Le chlorobenzène se présente sous forme de poudre blanche. Indiquer deux techniques expérimentales permettant de réaliser le spectre de ce composé en spectrophotométrie infrarouge, en précisant le mode opératoire. 3/ Les spectres de l’aniline et du chlorobenzène ont été obtenus, à l'aide d'un spectrophotomètre IRTF (cf figures ci-après). L'expérimentateur a omis de noter le nom des composés sur les spectres A et B. Attribuer chacun des spectres au composé qui lui revient.

Figure 3 : Spectre IR du composé A

T.A.S.S. 2BIO 24/04/2014


Figure 4 : Spectre IR du composé B 4/ Repérer sur les spectres de l’aniline et du chlorobenzène fournis les bandes dont la disparition ou l’apparition permettent de montrer que la réaction a bien eu lieu. 5/ On veut déterminer le rendement de la synthèse. Pour cela, on solubilise le chlorobenzène dans un solvant organique, ce qui constituera l'inconnue à doser. On réalise ensuite une gamme d'étalonnage, à l'aide de chlorobenzène commercial. Indiquer simplement comment vous effectueriez les mesures au spectrophotomètre et sur quelle bande particulière vous feriez la lecture d'absorbance afin de réaliser la droite d'étalonnage.

T.A.S.S. 2BIO 24/04/2014


Extrait de table IR

T.A.S.S. 2BIO 24/04/2014


Technique d’analyse séparative

Questions de cours : (5,5 points) 1) Citer les 4 grands types de chromatographie en phase liquide. 2) La chromatographie liquide-liquide est la plus utilisée en HPLC. - a - Pourquoi appelle-t-on cette chromatographie, la chromatographie liquide- liquide ? - b - Il existe deux modes de chromatographie liquide-liquide, la chromatographie dite à phase normale et celle à phase inverse. Dans quel cas, travaillons-nous, si l'analyte le moins polaire est élué en premier ? 3) Expliquer le principe de la chromatographie échangeuses d'ions utilisant une résine de type acide sulfonique (R-SO3

-; H+). Écrire l'équilibre d'échange correspondant. 4) Expliquer le principe de la chromatographie d'exclusion diffusion. 5) Dans le cadre de la comparaison des deux grandes techniques chromatographique, indiquer les principaux avantages de l'HPLC, et ceux de la CGL.

Exercice 2 : Chromatographie ionique (2,5 points)

Nous desirons séparer des acides aminés à doser d'un mélange de composition connue par chromatographie d'échanges d'ions. Nous utilisons dans ce but une résine sulfonique (R-S03

-). 1/ Comment doit être réalisé le gradient de pH pour éluer tous ces acides aminés ? (2 points) 2/ Donner l'ordre d'élution des acides aminés. Justifier. 3/ Critiquer la séparation réalisée. Données: pH isoélectronique des acides aminés :

Acides aminés pHi Acide aspartique 2,95

Asparagine 5,47 Lysine 9,7 Proline 6,35

On rappelle que : Lorsque pH = pHi, le groupement correspondant est neutre ; Lorsque pH < pHi, le groupement correspondant est chargé positivement ; Lorsque pH > pHi, le groupement correspondant est chargé négativement ;

T.A.S.S. 2BIO 24/04/2014


Exercice 3 : Chromatographie d'exclusion-diffusion (5 points) Dans le cadre du dosage du L-aspartate par voie enzymatique, nous désirons déterminer le poids moléculaire de l'Aspartate Amino Transférase (ASAT) par chromatographie d'exclusion diffusion. Pour cela, nous montons en série 5 colonnes de 25 cm de long chacune. Le débit de la phase mobile (tétrahydrofurane) est de 1 mL.min-1. La détection utilisée est la spectrophotométrie UV-Visible. Les résultats obtenus sont donnés par le tableau n°1 ci-après. Tableau n°1 : Résultats de la chromatographie d'exclusion-diffusion.

PM (g.mol-1) tr (min) 2 000 000 26,5 1 040 000 26,9 390 000 28,8 110 000 31,3 10 200 36,4 3 100 39,3 680 42,8

1/ Dans les conditions opératoires, quel autre nom peut-on donner à cette technique ? Justifier. 2/ Pour faire le dépôt de 1 mL d' ASAT en tête de colonne, nous disposons : ♦ d'une pipette graduée en verre de 1mL, de tolérance ± 0,007 mL, ♦ d'une pipette automatique (de type Pipetman P1000) présentant une erreur relative de ±

0,8% pour des prélèvements de 1 000 µL. Quelle pipette faut-il alors utiliser pour faire le moins d'erreur sur le prélèvement ? 3/ A quelle longueur d'onde faut-il travailler pour détecter la présence de protéine(s) ? Quel(s) type(s) de cuve peut-on alors utiliser ? 4/ Faire un gaphe, sur papier millimétré, de la courbe d'étalonnage nécessaire à la détermination du poids moléculaire. 5/ Déterminer, en expliquant la méthode utilisée, le poids moléculaire de l'ASAT sachant que son temps de rétention est de 31 minutes.

FIN DE L'ÉPREUVE

T.A.S.S. 2BIO 24/04/2014


ANNEXE à RENDRE avec la COPIE