corrigé du dst 2 techniques spectrales et...

T.A.S.S. 2BIOPHY 27/02/2015

ETSL, 95 rue du Dessous des Berges, 75 013 PARIS 1/5

Corrigé du DST 2 Techniques Spectrales et Séparatives

(1h00)

Documents non autorisés - Calculatrice autorisée Justifier les calculs

Séparer calcul littéral et numérique Questions de cours : (3 points) 1/ Que veut dire quenching de la fluorescence ? (0,5 point) On parle aussi de désactivation, c'est la diminution de la fluorescence d'un réactif causée par sa réaction avec analyte donné. 2/ En CPL, faire la distinction entre chromatographie de partage et chromatographie d'adsorption ? Quelle est celle qui est la plus utilisée et pourquoi ? (1,5 points) La chromatographie de partage ou encore chromatographie liquide-liquide est une chromatographie qui utilise une phase mobile liquide et une phase stationnaire liquide immobilisée sur un support solide. La chromatographie d'adsorption ou encore chromatographie liquide-solide est une chromatographie qui utilise une phase mobile liquide et une phase stationnaire purement solide. La plus utilisée est la chromatographie de partage car ses applications sont plus nombreuses, la chromatographie d'adsorption étant peu reproductible. 3/ Il existe deux modes de chomatographie de partage, préciser lesquels ainsi que leur différence. (1 point) On distingue la chromatographie en mode normal (ou classique) et la chromatographie en mode inverse. La première utilisant une phase stationnaire plutôt polaire et une phase mobile plutôt apolaire, c'est le contraire pour la seconde. Exercice 1 : (12 points) Vous étudiez la fluorescéine de couleur jaune, à l’aide d’un spectrophotomètre et d’un spectrofluorimètre. Le spectrophotomètre a un monochromateur qui permet de balayer les longueurs d’onde de 200 à 900 nm. Le spectrofluorimètre a un monochromateur d’excitation et un monochromateur d’émission, qui permettent, chacun de balayer les longueurs d’onde de 220 à 900 nm. 1/ Dans un premier temps, vous réalisez un spectre d’absorbance de la molécule avec le spectrophotomètre. Quelle plage de longueur d’onde avez-vous balayé ? Quel type de cuve avez-vous utilisé ? (1 point)

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La fluorescéine étant de coleur jaune, elle absorbe préférentiellement dans le visible, on peut donc réaliser une spectre dans le visible de 400 à 800 nm, à l'aide d'une simple cuve plastique. 2/ Vous déterminez que sa longueur d’onde d’absorption maximale est de 496 nm. Calculez l’énergie correspondante à un rayonnement de 496 nm. (1 point) Données : h = 6,63.10-34 J.s c = 3,00.108 m.s-1

E = h. cλ =

6,63. 10!!" x 3,00. 10!

496. 10!! = 4,01. 10!!" J 3/ La fluorescéine a la propriété de fluorescer. Vous réalisez alors son spectre de fluorescence avec le spectrofluorimètre afin de déterminer sa longueur d’onde d’émission maximale λ1. Quelle plage de longueur d’onde avez-vous balayé ? Justifier votre réponse. (1,5 points) Le spectre de fluorescence est toujours décalé vers les plus grandes longueurs d'onde, on balaye donc, dans la plage de longueur d'onde [501 ; 800 nm]. En effet, Eexc > Eem ⇒ λem > λexc. 4/ Vous réalisez le spectre d’excitation de la fluorescéine avec le spectrofluorimètre. Comment réglez-vous l’appareil ? Par ce spectre, vous déterminez sa longueur d’onde d’excitation maximale à une longueur d’onde λ2. (1 point) Le spectre d'excitation est toujours décalé vers les plus petites longueurs d'onde, on balaye donc, dans la plage de longueur d'onde [220 ; λ1 - 5 nm]. En effet, Eexc > Eem ⇒ λem > λexc. 5/ Vous devez doser cette molécule par fluorimétrie. Quelles longueurs d’onde choisissez-vous pour le dosage ? Justifier. (1,5 points) Il faut exciter la molécule à la longueur d'onde d'excitation maximale, c'est-à-dire à λexc = λ2. Il faut mesurer les intensités de fluorescence à la longueur d'onde d'émission maximale, c'est-à-dire à λem = λ1. La fluorescéine est utilisée dans certains collyres à utilisation ophtalmique à une concentration de 20 % (p/v) dans de l’eau stérile. Le collyre est vendu sous forme d’unidoses stériles de 0,4 mL. Vous devez vérifier la concentration de ce fluorophore dans le collyre avant la libération du lot. Ce dosage se fait par gamme d’étalonnage. La gamme d’étalonnage est lue contre le blanc dans les conditions prédéterminées et donne les résultats donnés dans le tableau n° 1 ci-dessous.

Tableau 1 : Intensités de fluorescence des points de la gamme.

[Fluoréscéine] (g.L-1) 10 20 30 40 50 60 Intensité 95 193 280 380 472 574 6/ Proposer un protocole de préparation des solutions étalons présentées dans le tableau ci-dessus. Vous disposez initialement d’une solution de fluorescéine à exactement 100 g.L-1, ainsi que de 6 fioles de 20 mL. Il est déconseillé de faire des dilutions en cascade. Précisez le diluant choisi. (1 point)

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[Fluorescéine] (g.L-1) 10 20 30 40 50 60 Vsolution mère (mL) 2 4 6 8 10 12 Veau (mL) 18 16 14 12 10 8 Le solvant utilisé est l'eau stérile. Exemple de calcul sur la concentration en fluorescéine à 30 g.L-1 : Cmère.Vprélévement = [Fluorescéine].Vfiole ⇒ [Fluorescéine] = !!è#$.!!"é$é%&'&()

!!"#$% = !"" ! !

!"

[Fluorescéine] = 30 g.L-1. 7/ Faire un graphique conforme permettant son utilisation lors du dosage. (2 points)

8/ Une unidose de collyre est transvasée totalement dans une macrocuve. Pourquoi est-il nécessaire de rajouter 3,6 mL d’eau distillée dans la cuve avant de réaliser la mesure ? (1 point) Pour que le faisceau lumineux puisse passer à travers la solution, il faut que la macrocuve soit remplie entre 2 et 4 mL, le fait de rajouter 3,6 mL à l'unidose déjà présente, permet d'effectuer une mesure tout-en effectuant une dilution d'un facteur 10. 9/ Cette mesure donne une intensité de 198 contre le blanc adéquat. En déduire la concentration dans le collyre. (1 point) La concentration de la fluorescéine dans la macrocuve est obtenue par lecture directe sur le graphique soit Cinc = 20,84 g.L-1. Cela correspond à une concentration de 208,4 g.L-1 de fluorescéine dans le collyre, soit une concentration de 20,84 % (p/v).

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10/ Sachant que le collyre peut être mis en vente avec une tolérance de ± 1% du titre théorique, préciser si le collyre testé est conforme. (1 point) On calcule l'écart relatif entre les 2 valeurs : ER = !" ! !",!"

!" x 100 = 4,2 % > 1 %

Le collyre testé n'est donc pas conforme. Exercice 2 : (5 points) Nous étudions la séparation de trois composés par chromatographie haute performance. L’expérience a lieu à 20 °C avec une pression en tête de colonne de 49 bar. Le débit de la phase mobile est de 1 mL.min-1 et la longueur de la colonne est de 15 cm. Le temps mort est de 41 s. La séparation chromatographique a donné les résultats présentés dans le tableau 2 : Tableau 2 : Résultats de la séparation par HPLC de trois composés.

Composés Symbole tR (min) w (min) Toluène T 1,83 0,14 Diéthylphtalate E 2,62 0,34 Diméthylphtalate M 3,23 0,42

1/ La chromatographie utilise une colonne C18 et un mélange de solvant d'élution ethanol/hexane. Préciser le type de chromatographie utilisé ? (0,5 point) C'est une chromatographie de partage en phase inverse. 2/ Calculez pour chaque composé :

2-1/ Le facteur de rétention k’

k′ = t! − t!t!

2-2/ Le nombre de plateaux théoriques (les pics sont supposés gaussiens). (1,5 points)

N = 16.t!w

!

D'où le tableau de résultats :

Composés Symbole k' N Toluène T 1,68 2734 Diéthylphtalate E 2,83 950 Diméthylphtalate M 3,73 946

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3/ Calculez pour les couples toluène/diéthylphtalate et diéthylphtalate/diméthylphtalate : 3-1/ Le facteur de sélectivité α

α = t!" − t!t!" − t!

= k′!k′!

3-2/ La résolution Rs (2 points)

R! = 2(t!" − t!")w! + w!

D'où le tableau de résultats :

Composés α RS Toluène/ Diéthylphtalate 1,68 3,29 Diéthylphtalate/ Diméthylphtalate 1,31 1,61

4/ Conclure sur la séparation des composés. (1 point) α > 1 et RS > 1,5 : tous les composés sont correctement séparés.

FIN DE L'ÉPREUVE