corrigé du partiel n° 1 techniques d’analyses spectrale...

T.A.S.S. 2BIO 10/12/2014

ETSL, 95 rue du Dessous des Berges, 75 013 PARIS 1/10

Corrigé du Partiel n° 1

Techniques d’Analyses Spectrale & Séparative (sur 30 points)

(2h00)

Documents non autorisés - Calculatrice autorisée Justifier les calculs

Séparer calcul littéral et numérique

Technique d’analyse spectrale Questions de cours : (6 points) 1) Donner l'expression de la loi de Beer-Lambert, en précisant le nom et l'unité de chaque grandeur physico-chimique employée dans l'écriture de la loi. (1 point)

A = ε(λ).b.C Où A représente l'absorbance (sans unité) d'une espèce chimique donnée, ε(λ) son coefficient d'absorption molaire (L.mol-1.cm-1), b la longeur du chemin optique (cm) parcouru par la lumière et C la concentration (mol.L-1) de l'espèce chimique. 2) En quoi consiste le principe d'additivité des absorbances ? (1 point) Si plusieurs espèces sont absorbantes, l'absorbance totale mesurée est la somme des absorbances de chacunes des espèces :

𝐀𝐭𝐨𝐭𝐚𝐥𝐞 = 𝐀𝐢𝐢

3) Indiquer les 5 caractéristiques principales de la spectrophotométrie d'absorption moléculaire UV-Visible. (1,25 points) Les caractéristiques les plus importantes de la spectrophotométrie UV/Visible sont les suivantes : � Un vaste champ d'application : un très grand nombre d'espèces inorganiques, organiques et biochimiques absorbent le rayonnement UV/Visible et peuvent donc faire l'objet d'étude qualitative et quantitative. � Une sensibilité moyenne à grande : les limites de détection en spectroscopie d'absorption UV/Visible sont comprises entre 10-4 et 10-5 mol.L-1. � Une sélectivité moyenne à grande : si l'on trouve une longueur d'onde où l'analyte étudié est le seul absorbant, il n'est pas nécessaire d'effectuer de séparation préliminaire. De plus, lorsqu'il y a recouvrement de pics d'absorption, des mesures

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complémentaires à d'autres longueurs d'onde permettent d'éviter, parfois, la nécessité d'une étape de séparation préalable. � Une bonne exactitude : lors d'un dosage spectrophotométrique, les erreurs relatives sur la concentration sont de l'ordre de 1 à 5 %. � La facilité de mise en oeuvre. 4) On donne ci-dessous 3 spectres du benzène �, �, et � obtenus avec un spectrophotomètre monofaisceau pour des largeurs de fente de 0,5 nm, 1 nm et 2 nm. Figure 1 : Spectres du benzène pour différentes largeurs de fentes

Attribuer la largeur de fente utilisée pour obtenir chacun de ces 3 spectres. (0,75 point) Plus la largeur de fente sera faible et plus la Bande Passante sera faible, donc plus on observera de détails dans le spectre, donc : � correspond à une largeur de fente de 2 nm ; � correspond à une largeur de fente de 1 nm ; � correspond à une largeur de fente de 0,5 nm. 5) Si l’on veut épargner du temps ou de l’échantillon, il est possible d’effectuer une analyse d’addition connue en n’utilisant que deux prélèvements d’échantillon. Ces deux échantillons présentent un volume Vx de solution inconnue de concentration Cx. On effectue une seule addition connue VS d’étalon de concentration CS au deuxième échantillon. Ces deux échantillons sont ensuite placés dans deux fioles jaugées de volume Vt que l’on complète jusqu’au trait de jauge par un solvant approprié.

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- a - Écrire les expressions littérales des absorbances A1 du premier échantillon et A2 du deuxième échantillon. (on utilisera comme notation, ε le coefficient d’absorption molaire de la solution et b l’épaisseur des cuves de mesure utilisées). (1 point)

Dans le 1er échantillon, il n'y a que l'inconnue et le solvant, donc : 𝐀𝟏 =

𝛆.𝐛.𝐂𝐱.𝐕𝐱𝐕𝐭

Dans le 2nd échantillon, il y a l'inconnu, l'étalon et le solvant, donc : 𝐀𝟐 =

𝛆.𝐛.𝐂𝐱.𝐕𝐱𝐕𝐭

+ 𝛆.𝐛.𝐂𝐒.𝐕𝐒𝐕𝐭

- b - En déduire l’expression littérale de la concentration de l’inconnue Cx. (1 point)

Faisons le rapport A2/A1 : !!!! =

!.!.!!.!!!!

! !.!.!!.!!!!!.!.!!.!!

!!

= 1 + !!.!!!!.!!

Donc finalement, !!.!!

!!.!! = !!

!! ! !! ⇒ 𝐂𝐱 = 𝐂𝐒.

𝐕𝐒𝐕𝐱. 𝐀𝟏𝐀𝟐 ! 𝐀𝟏

Exercice 1 : Détermination de la concentration d'un additif (2 points)

Les peinture et vernis extérieurs doivent être protégés de l'effet des radiations du soleil afin de ralentir leur dégradation par photolyse ou réaction photochimique. On leur ajoute donc des additifs qui absorbent les rayonnements ultraviolets, par exemple la molécule M. Quelle doit être la concentration Cm, en gramme par litre de l'additif M pour que 90 % du rayonnement soit absorbé sur une épaisseur de 0,30 mm ? Remarque : Vous n'ometterez pas de déterminer la transmittance T avant d'utiliser la loi adéquate. Données : MM = 500 g.mol-1 et εM = 15000 L.mol-1.cm-1. On sait que 90 % du rayonnement est absorbé, donc 10 % du rayonnement est transmis, ainsi T = 0,1 et A = - logT = 1. D'autre part, d'après la loi de Beer-Lambert, A = εM.b.C = εM.b.!!

!!

Finalement, C! =

!.!!!!.!

= ! ! !""!"### ! !,!"

⇒ Cm = 1,1 g.L-1

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Exercice 2 : Dosage d'une solution de NAD+ et NADH+H+ (7 points)

On réalise le dosage d'une solution de NAD+ (solution n° 1) et d'une solution de NADH+H+ (solution n° 2) par spectrophotométrie de différence.

Les mesures d'absorbance sont réalisées avec une cuve unique d'épaisseur b = 1,00 cm, les résultats sont donnés dans le tableau n°1 :

Tableau 1 : valeurs d'absorbance mesurée.

longueur d'onde (nm)

zéro effectué sur absorbance mesurée

260 solution n° 2 + 0,983 340 solution n° 2 - 0,324

On donne les spectres d'absorbance des deux espèces chimiques étudiées, ci-dessous :

Figure 2 : Spectres d'absorption du NAD+ et du NADH+H+.

1/ Pour faire les mesures d'absorbance on utilise un spectrophotomètre multicanaux.

- a - Indiquer le type de cuve qu'il faut utiliser pour faire les mesures. (0,5 point) Les mesures s'effectuent dans l'UV, il faut donc utiliser des cuves quartz. - b - Quel type de source lumineuse faut-il sélectionner dans le spectrophotomètre pour faire les mesures ? (0,5 point) Il faut utiliser une lampe au deutérium ou au Xénon.

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- c - Indiquer le principe de fonctionnement de ce spectrophotomètre. Quel est l'avantage principal et l'inconvénient principal de cet appareil ? (2 points) Contrairement aux spectrophotomètres classiques, cette appareil n'effectue pas de balayage en longueur d'onde. Le réseau disperse la lumière provenant de la source et irradie la barrette de diodes. Chacunes des diodes, détectant une bande de longueur d'onde étroite qui s'apparente à une lumière monochromatique, fournie le spectre instanément. Avantage : le spectre est obtenu de façon très rapide (< s) ; Inconvénient : cet appareil est très coûteux, ou il n'est pas très résolu. 2/ Compléter les 4 légendes de l'annexe 1 que vous rendrez avec votre copie. (1 point)

3/ Expliquer pourquoi, dans le tableau 1, la mesure obtenue à 260 nm est positive, et celle obtenue à 340 nm est négative. (1 point)

Amesure = Aéchantillon - Ablanc = A1 - A2 Où A1 est l'absorbance de la solution n° 1, et A2 celle de la solution n° 2. Or d'après la figure 2 : à 260 nm, A1 > A2 ⇒ Amesure > 0 et à 340 nm, A1 < A2 ⇒ Amesure < 0.

Réseau

Cuve

Barrette de diodes

Source lumineuse

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4/ Calculer les concentrations en NAD+ et en NADH+H+, à exprimer en µmol.L-1. (2 points)

Données : coefficients d'absorption molaire :

a260 nm(NAD+) = a260 nm(NADH+H+) = 18,0.103 L.mol-1.cm-1 ;

a340 nm(NAD+) = 0 et a340 nm(NADH+H+) = 6,3.103 L.mol-1.cm-1 ;

Il faut résoudre le système de deux équations à deux inconnues suivant :

𝐴!"# = 𝐴!!"# − 𝐴!!"#

𝐴!"# = 𝐴!!"# − 𝐴!!"#

𝐴!"# = 𝑎!"#(𝑁𝐴𝐷!). 𝑏. 𝑁𝐴𝐷! − 𝑎!"#(𝑁𝐴𝐷𝐻 + 𝐻!). 𝑏. 𝑁𝐴𝐷𝐻 + 𝐻!

𝐴!"# = − 𝑎!"#(𝑁𝐴𝐷𝐻 + 𝐻!). 𝑏. 𝑁𝐴𝐷𝐻 + 𝐻!

Soit numériquement,

0,983 = 18000 𝑥 𝑁𝐴𝐷! − 18000 𝑥 𝑁𝐴𝐷𝐻 + 𝐻!

− 0,324 = − 6300 𝑥 𝑁𝐴𝐷𝐻 + 𝐻!

Finalement,

𝑁𝐴𝐷𝐻 + 𝐻! = 51,4 𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝐿!!

𝑁𝐴𝐷! = 106 𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝐿!!

Technique d’analyse séparative Questions de cours : (7 points) 1) Préciser les 3 types de méthodes chromatographiques sur colonne. (1,5 points) On trouve les CPL (Chromatographie en Phase Liquide), la CPG (Chromatographie en Phase Gazeuse) et la CFS (Chromatographie en Fluide Supercritique). 2) Indiquer en quoi consiste un chromatogramme, en précisant les grandeurs classiquement rencontrées en ordonnée et en abscisse. Dans un chromatogramme, quelle est la grandeur physico-chimique qui permet d'identifier une espèce chimique, et celle qui permet de déterminer sa quantité dans un échantillon donné. (2 points) Un chromatogramme est une courbe sous forme de pics représentant la séparation de deux ou plusieurs espèces chimiques. La grandeur en ordonnée est le signal mesuré par le détecteur et celle en abscisse est le temps, exprimé généralement en minute. La grandeur physico-chimique permettant l'identification d'une espèce chimique est le temps de rétention tR, celle permettant de déterminer sa quantité est généralement l'aire sous le pic.

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3) Qu'appelle-t-on coefficient de distribution en chromatographie ? Pour quelle valeur du coefficient de distribution une espèce chimique donnée sera plus retenue dans la colonne ? (1 point) Le coefficient de distribution D ou K représente la constante de l'équilibre chimique suivant :

CM = CS Où CM représente la concentration analytique de l'espèce chimique à séparer se trouvant dans la phase mobile, et CS représente la concentration analytique de l'espèce chimique à séparer se trouvant dans la phase stationnaire. Comme tout équilibre chimique, l'équilibre précédent sera d'autant plus déplacé vers la droite que le coefficient de distribution est grand, ce qui correspond à une espèce chimique plus retenue le long de la colonne. 4) Comment évalue-t-on quantitativement l'efficacité d'une colonne ? Donner la relation entre la hauteur équivalente à un plateau théorique H et le nombre N de plateaux théoriques. (1 point) On évalue quantitativement l'efficacité d'une colonne par la valeur de la HEPT ou par son nombre de plateaux théorique N. Plus H est petit, ou N grand, plus l'efficacité de la colonne sera importante.

H = L/N 5) Rappeler l'expression statistique de la hauteur équivalente à un plateau théorique H. En considérant que les pics sont d'allure gaussienne, en quoi l'efficacité d'une colonne est liée à l'expression statistique de H ? (1,5 points)

H = σ!

L Où σ représente l'écart-type par rapport à L, longeur de la colonne utilisée. L'efficacité d'une colonne est liée à la largeur des pics chromatographiques obtenus, plus ceux-ci seront fins et plus l'écart-type sera faible donc H sera faible.

Exercice 3 : Optimisation du débit d'une méthode chromatographique (8 points)

Ici, on cherche à analyser le propranolol (médicament β-bloquant servant dans les troubles du rythme cardiaque), sur une colonne C18 (interactions hydrophobes) de 15 cm, avec une phase mobile constituée d’eau acidifiée (avec 0,12% d’acide trichloracétique : TFA) et d’acétonitrile (ACN). L’élution se fait en mode gradient (linéaire) de la façon suivante : Tableau 2 : Programme du gradient linéaire.

temps (min) % (H2O + 0,12 % TFA) % ACN 0 100 0 1 100 0

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11 0 100 12 0 100 13 100 0

En répétant l’analyse du propranolol (50 µL injectés à une concentration de 0,6 mg/mL, mesure de l’absorbtion à 290 nm en sortie de colonne) à plusieurs débits, on obtient les résultats suivants : Tableau 3 : Débit de phase mobile, temps de rétention, hauteur et aire de pics.

Débit D de phase mobile (mL/min)

Temps de rétention (min)

Hauteur h du pic (µV)

Aire A du pic (µV.s)

0,25 13,932 670928 1,01054.107 0,4 11,4 614024 6,9134.106 0,6 10,124 715452 6,02142.106 1 8,287 618548 4,10206.106

1,25 9,293 520217 4,25033.106 1,5 8,733 578001 4,75557.106 1,75 10,071 1,16294.106 1,1834.107

1/ Quel type de chromatographie est utilisé ici (indiquer la nature de la phase stationnaire et celle de la phase mobile) ? (0,5 point) C'est une HPLC qui utilise une phase mobile polaire liquide, et une phase stationnaire apolaire liquide immobilisée sur un support solide. 2/ À l'aide du tableau n° 2, tracer l'allure des composés de la phase mobile en fonction du temps ? (1 point)

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3/ Si on considère que la forme des pics chromatographiques est proche de celle d'un triangle, en déduire à l'aide du rapport Aire/Hauteur, les largeurs à la base w des 7 pics obtenus. Rappel : l'aire A d'un triangle est déterminée comme étant le produit de la moitié de sa hauteur h par sa largeur à la base w. (1 point) Exemple de calcul pour le 1er pic : h = 670928 µV et A = 1,01054.107 µV.s, Or A = !

!.w ⇒ w = !"

! = ! ! !,!"!#$.!"

!

!"#$%& = 30,1236 s

4/ - a - Rappeler la relation entre N, tR et w. (0,5 point)

N = 16.t!w

!

- b - Calculer la valeur de N pour chacun des 7 pics. (1 point)

Exemple de calcul pour le 1er pic : N = 16 x !",!"# ! !"!",!"#$

! = 12326

- c - Déterminer la HEPT H pour chacun des 7 pics. (1 point) Exemple de calcul pour le 1er pic : H = !"

!"#"$ = 1,2. 10!! cm

Nous présentons tous les résultats sous forme d'un tableau : Tableau 4 : Débit de phase mobile, largeur à la base w, N et H.

Débit D de phase mobile (mL/min)

Largeur à la base (s)

Nombre de plateaux théoriques

HEPT H (cm)

0,25 30,1236 12326 1,2.10-3 0,4 22,5183 14763 1,0.10-3 0,6 16,8325 20837 0,72.10-3 1 13,2635 22485 0,67.10-3

1,25 16,3406 18629 0,81.10-3 1,5 16,4552 16223 0,93.10-3 1,75 20,3519 14105 1,1.10-3

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5/ Courbe de Van Deemter, c'est-à-dire ici la courbe H = f(D), réalisée sous Regressi : (1,5 points)

Rappeler l'équation historique de Van Deemter et indiquer à quoi correspondent chacun des 3 termes de l'équation. (1 point)

H = A + !! + C.D avec un écart théorie-expérience de 6,8 % sur H.

Le terme A = - 133.10-3 cm correspond au terme de diffusion turbulente ; Le terme B = 311.10-3 cm.mL.min-1 correspond au terme de diffusion longitudinal ; Le terme C = 574.10-3 cm.mL-1.min correspond au terme de diffusion transversal. 6/ Déterminer le débit optimal d'analyse du médicament en chromatographie. (0,5 point) Le débit optimal est le débit pour lequel la HEPT est minimale c'est-à-dire ici pour 0,73 mL/min.

FIN DE L'ÉPREUVE