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P. Schellenbaum – Equipe RDP du LVBE – RVVS 01 juillet 2013

Amélioration des défenses de la vigne contre ses maladies- équipe « Résistance Dérivée du Pathogène » (RDP)

C. Demuyter,

S. Bruisson, J. Ocaña,

L. Deglène-Benbrahim, C. Le Jeune, P. Maillot, P. Schellenbaum, L. Valat, B. Walter Université de Haute Alsace, Laboratoire Vigne, Biotechnologies et Environnement, EA-3991, BP50568, 68008 Colmar cedex

2 programmes :

I. Résistance Dérivée du Pathogène (RDP) contre le GFLV, agent du court-noué de la vigne

II. Programme CLOVIS : « CLOnes de VIgneS », nouveaux plants de vigne assainis, moins

sensibles aux pathogènes et améliorant la qualité des vins


Lutte contre le GFLV : concept de Résistance Dérivée du PathogèneStratégie des microARNs artificiels

I. Résistance Dérivée du Pathogène contre le GFLV

2 axes

Validation de la stratégie sur N. benthamiana

Validation de la stratégie sur Vitis vinifera

Jelly 2011, d'après Antonio Garcia & Simon-Mateo 2008

Constructions (Jelly, 2011)

1A 1DPro1BHel 1EPol 2AHP 2BMP 2CCP

amiR-MP1

amiR-MP4 amiR-CP3

amiR-CP1amiR-RDR1

amiR-RDR3

GFLV-ARN1 GFLV-ARN2

Positions des cibles des amiARNs sur les 2 ARNs génomiques du GFLV


- 21 lignées transgéniques obtenues

Agro-infiltration de la cible pour vérifier la dégradation de la cible

Inoculation mécanique du GFLV pour mettre en évidence l’inhibition de la réplication virale

Efficacité lors de l’établissement de la maladie

- Insertion du transgène vérifiée

- Expression de l’amiRNA vérifiée

Détection des amiRNAs dans les lignées transgéniques de N. benthamiana (par sl-RT-PCR)

Axe 1 : Validation de la stratégie sur Nicotiana benthamiana


(Jelly, 2011)


Co-culture d’embryons (Chardonnay) avec Agrobacterium tumefaciens

Transformation transitoire in vitro de la vigne

Axe 2 : Validation de la stratégie sur Vitis vinifera

Infiltration de vitroplants (Syrah) avec Agrobacterium tumefaciens

Analyses moléculaires- sl-RT-PCR- 5’RACE PCR- GUS-sensor

Culture produisant des embryons somatiques Isolement de 10-20

embryons somatiques dans une boîte de Pétri

Dépôt d’une goutte de suspension d’agrobactéries

sur chaque embryon

Repiquage sur un milieu contenant des antibiotiques

pour éliminer les agrobactéries

Analyses moléculaires, 24h à 72h après

Jelly N S, Schellenbaum P, Walter B, Maillot P (2012) Transgenic Research 21:1319-1327.


Pour vérifier la dégradation de la cible

Valat L, Maillot P, Gadat M, Schellenbaum P, Jelly N S, Walter B (2013) 14° Rencontres de Virologie Végétales, 13-17 Janvier, Aussois, France.


Transformation stable de la vigne

Axe 2 : Validation de la stratégie sur Vitis vinifera

- Différentes lignées transgéniques obtenues

- I-PCR, TAIL-PCR, RSE-PCR (insertion du transgène)

- sl-RT-PCR (expression de l’amiRNA)

- 5’RLM-RACE PCR (dégradation de la cible)Détection des amiRNAs exprimés dans 1 lignée transgénique de vigne (par sl-RT-PCR)


Analyses moléculaires

Posters RVVS :

Laure Valat, Pascale Maillot, Noémie S. Jelly, Paul Schellenbaum, Bernard Walter. Validation par expression transitoire dans la vigne d’amiRNAs dirigés contre le GFLV : tests GUS-sensor.

Laurence Deglène-Benbrahim, Noémie Jelly, Paul Schellenbaum, Christine Le-Jeune, Bernard Walter, Pascale Maillot. Transformation stable de porte-greffes de vigne pour l’expression d’amiRNAs dirigés contre le GFLV.

(Jelly, 2011)


Projet (2010-2014) :

- labellisé par le pôle de compétitivité VITAGORA (Dijon)

- soutenu par le Fonds Unique Interministériel & OSEO

Consortium regroupant :- Pépinières Viticoles Guillaume (Charcenne, 71)- SEDIAG - Anticorps et Diagnostics (Dijon, 21)- Association Technique Viticole de Bourgogne (ATVB, Beaune, 21)- Equipe RDP du LVBE

II. Programme CLOVIS« CLOnes de VIgneS », nouveaux plants de vigne assainis,moins sensibles aux pathogènes et améliorant la qualité des vins


3 objectifs d’innovation stratégique :- développer une méthode plus sensible de diagnostic des pathologies de la vigne

- produire des plants assainis et moins sensibles aux pathogènes : mycorhizés et/ou producteurs de resvératrol

- accroître la diversité de l’offre accessible aux viticulteurs en développant et produisant de nouvelles vignes

Deux axes de recherche – développement pour notre équipe

Axe 1 : Sélection clonale et sanitaire de la vigne (Pinot Noir)

Axe 2 : Effet de la mycorhization sur la stimulation des défenses de la vigne

II. Programme CLOVIS


Origine de la diversité génétique chez la vigne :- altérations génétiques (changements dans la séquence d’ADN)

- altérations épigénétiques (variations non codées par la séquence d’ADN modifiant

l’expression des gènes) Clone 1 AACCAGTAACCAGT-------AATGCTGCCGGATGC

Clone 2 AACTAGTAACCAGTGATCGATAATGCTGCCGGATGC

SNP Insertion/Délétion Méthylation (C)

Me


But : étude de la variabilité génétique et épigénétique de clones de Pinot Noir

- évaluer la diversité de clones (marqueurs moléculaires « neutres »)

- définir des technique(s) fiable(s) et informative(s) pour visualiser les variations et permettant la

distinction clonale (« technique de routine »)



Technique de marquage moléculaire :MSAP : Methylation Sensitive Amplified Polymorphism

(Etude réalisée sur 40 clones, agréés et nouvelles obtentions)



Résultats- Présence de bandes polymorphes stables et instables

- 9 combinaisons d’amorces; 23 marqueurs polymorphes stables

- 38 profils distincts (37 uniques et 1 partagé par 3 clones)

Þ distinction épigénétique des clones

Ocaña et al, 2013, Molecular Biotechnology, DOI 10.1007/s12033-013-9675-3


Symbioses mycorhiziennes arbusculaires

- tolérance aux stress biotiques et abiotiques

But :

=> Produire des plants de vigne mycorhizés moins sensibles aux pathogènes


Etudes réalisées :

- contrôle de l’installation de la mycorhization

- analyse de l’expression de gènes marqueurs de défense

* après élicitation

* suite à l’inoculation de pathogènes

- mesure de l’évolution des teneurs en stilbènes


Suivi de la mycorhization :

Inoplant Dijon

Champignon mycorhizogène à arbuscules dans un système racinaire



Recherche de gènes potentialisés par la mycorhization (marqueurs de « priming »)

- Éliciteurs chimiques (voie SA et voie JA/ETH)

- Infection par des micro-organismes pathogènes (biotrophes et nécrotrophes)

- Analyse de l’expression de gènes de défense par qPCR


Expression de gènes de défense dans des feuilles de plants de Pinot Noir mycorhizés ou non, traités avec du Bion®


Etude de l’expression de gènes marqueurs de défense - Persistance du « priming » dans le temps

- Suivi du taux de mycorhization

- Maintien du priming de gènes de défense

Etude de l’effet protecteur des mycorhizes vis-à-vis de bioagresseurs

- Infection par Plasmopara viticola et Botrytis cinerea

II. Programme CLOVISAxe 2 : Effet de la mycorhization sur la stimulation des défenses de la vigne

Sébastien Bruisson, Pascale Maillot, Laurence Benbrahim, Armelle Gollotte, Bernard Walter, 2012. Journées francophones des mycorhizes 2012, 5-7 sept, Nancy, France.

Sébastien Bruisson, Pascale Maillot, Laurence Benbrahim, Armelle Gollotte, Bernard Walter, 2012. 1st world congress on the use of biostimulants in agriculture, 26-29 nov, Strasbourg, France.

Feuille de Pinot Noir infectée par Botrytis cinerea



Poster RVVS

Axe 1 : Sélection clonale et sanitaire de la vigne (Pinot Noir)Juan Ocaña, Bernard Walter, Paul Schellenbaum. Distinction of Vitis vinifera cv Pinot noir clones by stable MSAP markers.

Axe 2 : Effet de la mycorhization sur la stimulation des défenses de la vigneSébastien Bruisson, Pascale Maillot, Laurence Deglène-Benbrahim, Armelle Gollotte, Bernard Walter. Effet de la mycorhization sur l’expression des gènes de défense de la vigne après élicitation chimique ou inoculation de pathogènes.

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